Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е, и создание на их основе диагностических тест-систем

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е, и создание на их основе диагностических тест-систем"

На правах рукописи

РГБ ОД

1 3 ДЕК 7ПМ

Алаторцева Галина Ивановна

Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е, и создание на их основе диагностических тест-систем

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Алаторцева Галина Ивановна

Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е, и создание на их основе диагностических тест-систем

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вирусных препаратов им. О.Г. Анджапаридзе РАМН

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАМН Зверев В.В.

кандидат биологических наук Гольцов В.А.

доктор медицинских наук, Горбунов М.А.

доктор биологических наук Ляпустин В.Н.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Защита состоится « 2000 г. на заседании

диссертационного совета Д. 0i.27.01 института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу: 142782 Москвская область, п/о Институт полиомиелита.^ //"¿-¿Яг

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИ вирусных препаратов им. О.Г. Анджапаридзе РАМН.

Автореферат разослан « ¿2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Медведкина О.А.

ЕсМ-М, о

> С П?'

I. Общая характеристика работы.

Актуальность работы. Вирусные гепатиты в настоящее время являются 1ной из важнейших проблем инфекционной патологии человека. В первую 1ередь это относится к парентеральным вирусным гепатитам В и С, однако и ггеральные гепатиты А и Е вносят существенный вклад в эту проблему. Так, (пример, в развивающихся странах с жарким климатом доля гепатита Е ютавляет более 50% всех случаев острого гепатита (Purcell R.H. et al. 1988).

Гепатит Е, ранее известный как энтеральный гепатит ни А ни В, в качестве 1мостоятельной нозологической формы был открыт в 1983 году М.С. Балаяном в 1ытах с самозаражением (Balayan M.S. et al. 1983). Несмотря на сходство инических проявлений с другими вирусными гепатитами, заболевание, взываемое этим вирусом, характеризуется рядом особенностей. В их числе рывной характер эпидемических вспышек, которые могут охватывать десятки и оке сотни тысяч человек, отсутствие хронических форм заболевания, поражение основном лиц молодого и среднего возраста, выраженная сезонность подъема ¡болеваемости. Заражение наиболее часто происходит через употребление нтаминированной воды и значительно реже, чем при гепатите А, при контакте с [болевшими, поэтому редкими являются случаи семейной очаговости ¡болевания в эндемичных районах, и при завозе инфекции в неэндемичные тоны не происходит ее распространения. Особенностью гепатита Е является !кже высокая частота развития фульминантного гепатита у беременных со чертностью достигающей 20-40% (Bradley D.W. 1990). Гепатит Е выявляется в >лее, чем 60% всех случаев фульминантного гепатита ни А ни В ( Nanda S.K. et al. !94).

Недостаточно изучено присутствие антител к возбудителю инфекции -ipycy гепатита Е (ВГЕ) - у населения развитых стран с умеренным климатом, гносительно высокая (1-3%) частота серопозитивности при отсутствии 1идемической заболеваемости не имеет аналогии с другими энтерально ¡редающимися вирусными инфекциями. Кроме того, антитела к этому вирусу ютаточно часто обнаруживаются у регулярных доноров крови, отстраненных от жорства в связи с повышением уровня трансаминаз, медицинских работников, (ркоманов, больных хроническими гепатитами В и С, первичной гепатоклеточной [рциномой, циррозом печени. Необычно высокая частота обнаружения антител к

ВГЕ у больных хроническим аутоиммунным гепатитом (до 46%) сочетается тяжелым поражением печени, быстро прогрессирующим в цирроз, что позволя предположить, что заражение ВГЕ может быть пусковым механизм! аутоиммунного процесса.

В последние годы участилась миграция населения из районов, эндемичн! по гепатиту Е, в центральные области России, и вследствие этого возрос рк завоза этой инфекции. Этот факт, а также случаи обнаружения антител к вирусу лиц, проживающих в неэндемичных районах в условиях отсутств эпидемиологического процесса, свидетельствуют о необходимости изучен распространения вируса на территории России и природы феномена присутств антител в различных группах населения неэндемичных районов. Данные вопро невозможно изучать без надежных и доступных в экономическом отношен диагностических препаратов.

Отсутствие в нашей стране тест-систем для выявления антител к ВГЕ момент начала данной работы обусловило необходимость наших исследований.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разраб01 тест-систем для выявления антител к ВГЕ, предназначенных для диагносту вызываемой этим вирусом инфекции и проведения сероэпидемиологическ исследований.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

- провести анализ антигенной структуры белков вируса гепатита Е определить в их составе антигенно-значимые участки, способные индуцировг образование антител;

- синтезировать олигонуклеотиды, соответствующие фрагментам вируснс генома, кодирующим выбранные участки вирусных антигенов;

- клонировать собранные из синтезированных олигонуклеотидов фрагмен генома ВГЕ в бактериальной системе;

- создать и запатентовать векторную систему экспрессии рекомбинантн генов в клетках Е.соН для получения препаративных количеств рекомбинантн антигенов;

- используя разработанную векторную систему, получить бактериальн штаммы - продуценты рекомбинантных белков, содержащих антигенн

герминанты ВГЕ, и выделить рекомбинантные антигены в препаративных пичествах;

- иммунологическими методами подтвердить специфичность полученных комбинантных антигенов и изучить их диагностическую значимость;

- создать на основе рекомбинантных антигенов диагностические тест-;темы для обнаружения антител к вирусу;

- провести, используя разработанные тест-системы, сероэпидемилогические зледования в эндемичных и неэндемичных по гепатиту Е районах.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Сконструирована и запатентована новая векторная система экспрессии комбинантных генов в клетках Escherichia coli, которую можно применять для пучения препаративных количеств рекомбинантных белков.

Получены бактериальные штаммы - продуценты рекомбинантных пипептидов, содержащих антигенные детерминанты белков, кодируемых ORF2 и ?F3 вируса гепатита Е штамма Бирма.

Изучена способность полученных рекомбинантных полипептидов язываться с антителами, содержащимися в сыворотках крови больных острым русным гепатитом из эндемичного района. Отобраны полипептиды с наиболее раженной антигенной активностью. Специфичность взаимодействия комбинантных полипептидов с антителами подтверждена с помощью нтетических пептидов - аналогов антигенов ВГЕ.

На основе отобранных полипептидов созданы первые отечественные агностические тест-системы «ВГЕ-скрин» и «ВГЕ-скан» для определения антител вирусу гепатита Е в сыворотках крови. Сравнительные испытания этих тест -стем и коммерческой тест - системы фирмы "Abbott" показали высокую зствительность и специфичность разработанных препаратов.

При помощи разработанных диагностических тест-систем впервые оведены серо-эпидемиологические исследования в районе, эндемичном по 1атиту Е (южный Узбекистан), и в неэндемичных районах (г. Москва, г. Сургут, г. айкоп). Получены новые данные об уровне заболеваемости гепатитом Е на цемичной территории и определена доля этой инфекции в этиологической эуктуре острых вирусных гепатитов в этом регионе.

Внедрение результатов в практику. С помощью тест-системы «ВГЕ скрин» обследованы все больные острым вирусным гепатитом (ОВГ), поступивц в течение 1993 года и в ноябре 1998 года в инфекционную больш Дехканабадского района Кашкадарьинской области Узбекистана. Таким образ< дифференциальная диагностика ОВГ была дополнена обследованием на гепати в этом неблагополучном по данной инфекции районе.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная векторная система пригодна для экспресс рекомбинантных генов в клетках E.coli, и её использование упрощает выделени* очистку рекомбинантных белков.

2. Синтезированные рекомбинантные антигены, содержащие антигенн детерминанты вируса гепатита Е, способны связываться с антителами к виру содержащимися в крови больных.

3. Разработанные диагностические препараты пригодны для диагностк гепатита Е и проведения сероэпидемиологических исследований.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 11'' Международном вирусологическом симпозиуме (Sydney, 1999), на симпозиу FEMS (Стамбул, 2000), на VII съезде Всероссийского Общества эпидемиолоп микробиологов и паразитологов (Москва, 1997), на общероссийской конференц "Острые кишечные инфекции вирусной и бактериальной природы" (Москва, 199 на Всероссийской конференции "Проблемы инфекционной патологии в регион Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 1998), международной конференции «Вирусные инфекции на пороге XXI Bei эпидемиология и профилактика» (Санкт-Петербург, 1999), на конференц посвященной 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова "Актуальные проблеи медицинской вирусологии" (Москва, 19SS).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано две статьи и тези< семи докладов, получено четыре патента Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена i 107 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литератур

писания материалов и методов, шести глав собственных исследований, аключения, выводов, списка цитируемой литературы из 138 источников и эдержит 7 таблиц и 13 рисунков.

II. Содержание работы

Материалы и методы.

В работе использовали охарактеризованные в коммерческих тест-системх 49 ^[вороток больных гепатитом Е и здоровых людей, которые были предоставлены абораторией эпидемиологии и диагностики гепатита Института полиомиелита и ярусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН. Сыворотки крови больных острым ярусный гепатитом (ОВГ) и сыворотки здоровых доноров собирали в нфекционной больнице Дехканабадского района Кашкадарьинской области збекистана. Сыворотки крови от пациентов с серологически подтвержденным иагнозом гепатита А, В, С и здоровых доноров были получены из инфекционной эльницы N1 и родильного дома N4 г. Москвы при обследовании в НИИ вирусных эепаратов РАМН. Синтетические пептиды - фрагменты белков ВГЕ и ВИЧ1 были элучены из Лаборатории вирусных нуклеиновых кислот и белков НИИ вирусологии м. Д.И.Ивановского РАМН.

Эксперименты по конструированию и анализу рекомбинантных молекул ДНК эоводили по ранее описанным методам (Sambrook Y.et.al.,1989). лигодезоксирибонуклеотиды были синтезировали фосфитным триэфирным етодом (Gait M.Y. 1984). Компьютерный анализ последовательностей белков и ^клеиновых кислот проводили с помощью программных пакетов PC/Gene, эр.6.30, и GenePro, вер.2.3.

Очистку рекомбинантных полипептидов осуществляли методом гель -ильтрации. Взаимодействие рекомбинантных полипептидов с антителами зучали методом твердофазного непрямого иммуноферментного анализа в знкурентном и неконкурентном вариантах а также методом Вестерн - блоттинга.

Результаты исследований и их обсуждение.

1. Получение векторов экспрессии вирусных генов.

Для конструирования новых векторов pEL5a, pEL5b, pEL5c использовали ^ответственно плазмиды рЕХ1, рЕХ2, рЕХЗ, позволяющие получать большие

количества рекомбинантных белков, слитых с ß - гапактозидазой E.coli (Stanley Luzio J.P. 1984). Плазмиды гидролизовали рестриктазой Xba I и достраивали по нуклеотида в липких концах с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимераз E.coli. Параллельно получали Ват Hl-рестрикт размером 0,6 т.п.н. из плазмь pLysS ( Studier F.W. 1991), содержащий ген лизоцима бактериофага 17 и так достраивали три нуклеотида в липких концах. Фрагменты плазмид рЕХ лигировапи с фрагментом ДНК, содержащим ген лизоцима бактериофага Лигазной смесью трансформировали клетки штамма PLT90 E.coli, содержащи составе генома температурочувствительный ген clts857 бактериофага X (Пат 2043409 РФ). Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, в которых ге лизоцима и /?-галактозидазы имеют одинаковую полярность, отбирали с помои анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. В кпоь продуцирующих лизоцим, при добавлении хлороформа происходил лизис кпет который обнаруживался по осветлению и увеличению вязкости бактериалы культуры. Из отобранных клонов стандартным способом выделяли плазму pEL5a, pEL5b, pEL5c (Пат. 2071501 РФ, Пат. 2043415 РФ, Пат. 2071503 РФ), структура показана на Рис. 1.

Лизаты культур клеток, трансфомированных плазмидами pEL5a, pEL5b, pEL после термоиндукции белкого синтеза обрабатывали хлороформ центрифугировали и осадок анализировали с помощью электрофореза в SI полиакриламидном геле. В качестве контрольных образцов использов; аналогичным образом обработанные клетки E.coli РОР2136, трансформировав плазмидами рЕХ1, рЕХ2 или рЕХЗ. Электрофорез показал, что при деист! синтезируемого в клетках лизоцима происходит разрушение клеточной оболочк высвобождение водорастворимых белков в среду. Это проявлялось значительном ослаблении соответствующих полос. В случае использова! плазмид рЕХ1-3, такого эффекта не было. Количество /3-галактозида содержащейся в водонерастворимой фракции, при использовании обеих вектсрь систем оставалось неизменным.

2. Синтез и клонирование фрагментов ДНК, кодирующих участки бел*

ВГЕ.

Выбор фрагментов вирусного генома для клонирования в бактериальной

LAMBDA P(R)

0 d Min dill (111)

lacz

Sal i (3213) батш (3207)j Sma i (3204 polyunker

EL5a AlaArgGlySer ValAspLeu GlnProSar LeuLouIleAsp ***

Sma I

BamHI Sali PstI Hindlll 3196 GCCCGGGGAT CCGTCGACCT GCAGCCAAGC TTGCTGATTG ATTGAC CGGGCCCCTA GGCAGCTGGA CGTCGGTTCG AACGACTAAC TAACTG

EL5b GluPheProGly IlaArgArg ProAlaAla LysLeuAlaAsp ***

Smal

EcoRI BamHI Sail PstI Hindlll

3196 GAATTCCCGG GGATCCGTCG ACCTGCAGCC AAGCTTGCTG ATTGATTGAC CTTAAGGGCC CCTAGGCAGC TGGACGTCGG TTCGAACGAC TAACTAACTG

EL5c GluLeuIlePro GlyAspPro SerThrCy3 SerGlnAlaCys ***

Smal

BamHI Sail PstI Hindlll 3196 GAATTAATTC CCGGGGATCC GTCGACCTGC AGCCAAGCTT GCTGATTGAT CTTAATTAAG GGCCCCTAGG CAGCTGGACG TCGGTTCGAA CGACTAACTA

ис. 1. Векторы серии pEL5. А). Структура плазмиды pEL5a: LAMBDA P(R) -равый промотор фага LAMBDA, LACZ - открытая рамка считывания ß-шактозидазы, LYS - последовательность ДНК, кодирующая лизоцим фага 7, TERM - терминатор транскрипции. В). Структура полилинкеров ллазмид EL5a, pEL5b и pELSc (соответствуют полилинкерам плазмид рЕХ1-3 (К.К. tanley and J.P. Luzio, 1984)). Стоп-кодоны обозначены звездочками.

системе осуществляли, используя результаты проведенного пептиднс картирования антигенных детерминант белков - продуктов ORF2 и OR (Khudyakov Y.E. et al. 1993) и результаты компьютерного анализа профи гидрофильности белка - продукта ORF2 ВГЕ штамма Бирма. Были отобра! фрагмент ORF2, который соответствует домену в области 633-659 аминокислота остатков (НЕ40), и фрагмент ORF3, соответствующий участку с 92 по 1 аминокислотные остатки (НЕ60). По результатам компьютерного анализа д клонирования также были отобраны содержащие предполагаемые антигенн детерминанты фрагменты ORF2, соответствующие участкам белка в области с 2 по 344 (НЕ170) и с 403 по 461 (НЕ70) аминокислотные остатки.

Для получения фрагментов ДНК, комплементарных отобранным по результат пептидного картирования участкам геномной РНК, были синтезирова олигонуклеотиды d1, d2, г1, г2 для фрагмента НЕ40, олигонуклеотиды Ы, Ь2, с1, для фрагмента НЕ60 (Рис. 2). Каждые четыре олигонуклеотида cMeuiHBaj кинировали с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 и затем обрабатывали ДЬ лигазой фага Т4. Полученные фрагменты ДНК НЕ40 и НЕ60 клонировалгг-участкам узнавания рестриктазами Ват Н1 и Pst 1 в плазмиду pUC Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов Д показало их соответствие участку ORF2, кодирующему фрагмент белка-проду| ORF2 с 633 по 659 аминокислотные остатки, и участку ORF3, кодирующе фрагмент белка-продукта ORF3 с 92 по 123 аминокислотные остатки (Рис. Затем Ват Н1 - Pst 1- фрагменты были клонированы в плазмиду pEL5a в par считывания уЗ-галактозидазы для получения слитного с ^-гапактозида: рекомбинантного полипептида. Полученные плазмиды рНЕ40 и рНЕбО кодирова гибридные белки с расчетными мол. массами 121,90 кД и 121,91 кД, состоящие 1049 аминокислотных остатков р-галактозидазы и 27 аминокислотных остат! продукта ORF2 и 1046 аминокислотных остатков /?-галактозидазы и аминокислотных остатков продукта ORF3, соответственно. В результ, трансформации клеток штамма E.coli PLT90 рекомбинантными плазмидами рНЕ и рНЕбО получены рекомбинантные штаммы E.coli - продуценты гибридных бел НЕ40 и НЕ60.

Для сборки фрагмента ORF2 НЕ70, кодирующего белок с 403 по < аминокислотные остатки, сначала кинировали и сшивали лигазой отдельно смес

а) СЖР2:

фрагмепт ДНК НЕ40

с!1 5'-САТСССТТСС ССТТСААССС ТССЙСТТТСС АСТСТАС-З'

г1 -З'-ССААСС ССААСТТССС АССССАААСС ТСАСАТСАСА СССАСТСОААС Т-5'

й2 5'-ТСТСССТСАС СТТСАССССС ТТААСАТСАА ССТАССТАЛА АСТСОАСАСС ТССА-З' г 2 З'-ССССС ААТТСТАСТТ ССАТССАТТТ ТСАССТСТСС-5'

фрагмент ДНК НЕ70

а1 5' -САТССССТАА ТССАСААССТ АСТЕТТАААС ТТТАТАСТАС Т6ТТ-3' д1 З'-СССАТТ АССТСТТССА ТСАСААТТТС АААТА-5'

3.2 5'-СААААТ ССТСАССАСС АТАААСйААТ СССТАТСССТ САТСАТАТС-З'

д2 З'-ТСАТС АСААСТТТТА ССАСТССТСС ТАТТТССТТА СССАТАСССА-5'

аЗ 5'-С АТСТТССАСА ААСГССАСГТ СГТАТССАСС АТТАТСАТАА ТСАССАТ-З'

дЗ З'-СТАСТАТАСС ТАСААССТСТ ТТСАССТСАА СААТАССТСС ТААТАСТА-5'

а4 5'-САА САССАТССАС СТАСТССТАС ТССТССТССТ АСТАСАТСТССА-З*

д4 З'-ТТ АСТСетАСТТ СГССТАССТС САТСАССАТС АСвАССАССА ТСАТСТАС-5'

фрагмент ДНК НЕ170

е1: 5'- ААТТССТАТА СТААТАСАСС СТАТАССОСТ ССССТССССС ТОТТССАСТТ-З' £1: 3'- ТТААССАТАТ вАТТАТСТСС САТАТССССА ССБСХСССС5-5'

е2: 5'- ТССССТССАС СТТСАСТТТС ССААССТТАС СССС-3'

£2:3'- АСААССТСАА АССССАССТв СААСТСАААС ССГТЗСААТС СССССССТТС ТССГТ-5'

еЗ: 5'-СССААС АССААТАССС СССГСТСССС ТТАТТССАСС АСССТССССА СССССТТСС-З' £3: З'-ТАТССв СССАСАСССС ААТААССГСС ТСАСАССС-5'

е4 : 5'-Т СССССТСССС АССССАСТСС ССАССТСАСС АССАССТАА-З'

£4: З'-СТ ССССЙААССА СССССАСССС ТССССТСАСБ ССТССАСТСС ТССТССАТТ-5'

Ь) (ЖРЗ:

фрагмент ДНК НЕ60

Ы 5'-САТССААТСС АССАСАССАС ТСАССТССАС ТТЙСАСТСАС САС-З'

с1 З'-етТАСС ТССГСТСЗТС АСГССАССТС ААССТСАСГС СГСТССТТСС ССТССТССГ-Б1

Ь2 5' -АССААСС ССАССАССАТ ТСССТСАССТ ССТАСАССТА ССАСАССТАС с2 З'-А АСССАСТбСА ССАТСТССАТ ССТСТССАТС

САССАССССС СТССА-З' СТССТССССС С-5'

Рис. 2 Структура олигонуклеотидов, предназначенных для сборки и клонирования фрагментов ДНК (ЖР2 и ОЯРЗ ВГЕ.

а) НЕ40:

Ват Н1

5'- ЕАТСССТТбСССТТСААСССТССССТТТССЛСТСТАСТСТСССТеАБСТТСАСССССТТ ЬСЬОЗСАРОЗТУАЕЪОЕЬ бЗЗаа ->

т 1

ААСАТСААССТАССТААААСТССАСАССТ(ЗСА-3' (01^2) КМКУСКТИЕ

->659аа

б) НЕ70:

Ва^ Н1

5' -(^ТССССТААТССАСААССТАСТСТТАААСТТТАТАСТАСТСТТСААААТССТСАССАССАТ АЛ'СЕРТУКЬУТЗУЕЫАООО 403аа -.

АААССААТСССТАТСССТСАТСАТАТССАТСТТССАСАААСТССАСТТСТТАТССАССАТТА К61А1РНВ1БЬСЕЗНУУ100У

Т 1

ТСАТААТСАССАТСАЛСАССАТССАССТАСТССТАСТССТССТССТАСТАСАТСТСЗСА-З ' (01^2) ОЫОНЕООКРТРЗРАРЭНР

->461аа

в) НЕ170:

5' - ААТТССТАТАСТААТАСАСССТАТАССССТССССТСССССТСТТССАСТТТССССТССАССТТбАЙТТТ ЫБУТМТРУТСАЬСЬЬОГАЬСЬЕГ 286аа-У

СССААССТТАСССССССЙААСАССААТАСССССетсТССССТТАТТССАССАСТССГССССАСССССТТССТ КМЬТРСМТНТНУЕКУБЗТАКНКЬК

СССССТССССАССССАСТССССАССТСАССАССАССТАА -3' (ОЕГ2) ИСАОСТАЕЬТТТ

->344аа

г) НЕ60:

ва^ Н1

5'- САТССААТССАССАСАССАСТСАССТССАСТТССАСТСАССАСАССААССССАССАССА ЫРРОНЗАРЬбУТИРЗАРР 92аа->

Т 1

ТТСССТСАССТССТАСАССТАССАСАССТАССАССАСОССССТССА-З' (ОВ.РЗ) ЬРНУУВЬРОЬСРКК

->123аа

Рис. 3. Структура клонированных фрагментов ДНК и вирусспецифических участков рекомбинантных полипептидов.

эагментов а1, gl, a2, g2 и a3, g3, a4, g4 (Рис. 2). Затем два полученных тагмента двунитевой ДНК лигировали в один более протяженный фрагмент (182 ры оснований), который клонировали по участкам узнавания рестриктазами Ват и Pst 1 в плазмиду pl)C18. Полученной рекомбинантной плазмидой ансформировали клетки E.coli JM109. Затем Ват Hl - Pst I - фрагмент был онирован в плазмиду pEL5a для в рамку считывания /f-галактозидлзи тучсннои рекомбинантной плаэмидои. кодирующей гибридныи белок к счетной молекулярной массой 124 кР. трансформировали клетки штамма I coli Т90.

Для клонировали фрымсны OKf-2 НЕ£ 170 были синтезированы йюнуклеотиды е1, е2 ,еЗ .е4. f1. f2. f3. f4 (Рис. 2) Полученный после кинированин шгаэной обработки фрагмент ДНК НЕ170 клонировали по тупым концам в Sma 1 :айт плазмиды pEL5c в ориентации, при которой направления считывания ß-шктозидазы и фрагмента белка-продукта гена ORF2 совпадают. Полученная азмида рНЕ170 кодировала рекомбинантный полипептид с расчетной пекулярной массой 124,61 kD, состоящий из 1041 аминокислотных остатков /(-1актозидазы и 59 аминокислотных остатков, кодируемых клонированным агментом ORF2. Отбор клонов клеток E.coli, экспрессирующих данный участок ома. проводили по результатам электрофореза белковых лизатов клеток Г mh Г90, содержащих рекомбинантные плазмиды В клетках, содержащих плазмиду Е170, синтезировался гибридный белок НЕ170 с молекулярной массой около 125 Определение нуклеотидных последовательностей клонированных фрагментов К НЕ70 и НЕ170 показало их соответствие участкам ORF2 ВГЕ, кодирующим згменты белка-продукта ORF2 с 403 по 461 и с 286 по 344 аминокислотные атки (Рис. 3).

3. Получение рекомбинантных белков ВГЕ в клетках E.coli.

Была проведена оценка эффскшнности синтеза рекомбинантных ипептидов в культуре клеток E.coli PLT90, трансформированных содержащими )гменты генома ВГЕ рекомбинантными плазмидами на основе векторов pEL5a и 5с. Для этого провели сравнительное исследование накопления эмбинантных полипептидов НЕ60, НЕ40, НЕ70 в бактериальных культурах на эве данной системы экспрессии и в клетках E.coli РОР2136,

трансформированных рекомбинантными плазмидами на основе векторов рЕХ рЕХЗ. Анализ результатов электрофореза лизатов культур клеток по( термоиндукции синтеза белка показал, что использование обеих исследуен векторных систем обеспечивает примерно одинаковую суперпродукь рекомбинантных белков.

При использовании плазмид серии рЕ1.5 клетки лизировапи при поме обработки хлороформом, затем лизат центрифугировали для получе! водонерастворимой фракции, содержащей рекомбинантный бег Электрофоретический анализ полученного осадка, показал резкое уменьше! содержания в препарате примесей белков кишечной палочки (Рис. 4).

Далее рекомбинантные антигены выделяли по стандартной метод (Гловер Д. 1989), используя метод гель-фильтрации. Наличие во фракцк собираемых с колонки, рекомбинантных полипептидов определяли метсу электрофореза в полиакриламидном геле по присутствию белковых по. соотвествующих молекулярных масс. Полученные препараты использовал; качестве антигенов при проведении иммуноферментного анализа.

4. Изучение антигенной специфичности полученных рекомбинанти белков.

' Из-за отсутствия к моменту получения рекомбинантных белков сыворо-охарактеризованных в отношении антител к ВГЕ, первичный анализ антиген активности рекомбинантных полипептидов проводили с использованием сыворс больных ОВГ из эндемичного по гепатиту Е района Узбекистана. Исследова антигенной активности рекомбинантных белков осуществляли методом непрям твердофазного иммуноферментного анализа. В реакции с полипептидами НЕ4( НЕ60 антитела 1дв выявлены соотвественно в 54 (12,5%) и в 97 из 430 (22,! тестированных сывороток. С рекомбинантным полипептидом НЕ70 прореагиров; 82 (19%) сыворотки. В то же время с полипептидом НЕ170 из 110 сыворс прореагировали только две. Рекомбинантные полипептиды НЕ40, НЕ60 и Н1 были отобраны для дальнейшей работы.

Для подтверждающего анализа использовали метод иммуноблоттинга, помощи которого изучали взаимодействие положительно прореагировавши; первичном скрининге сывороток с полипептидами, содержащимися в лиза клеток штаммов-продуцентов. Как видно из результатов, представленных на Ри

•1 г з ''

• ..¡"V ■• »

Рис. 4. Электрофорез:клеток штамма-94кО продуцента белка НЕ40 до (1) и после

(2) обработки хлороформом; Р-43кЭ галактозидазы (3); маркеров молекулярных масс (4).

ЗОкО

20 кР

Рис.5. Анализ рекомбинантных белков: а) электрофорез полипептида НЕ40 до (1) и после очистки (2), и полипептида НЕ60 до (3) и после (4) очистки; б) иммуноблоттинг с сывороткой больного ОВГ из эндемичного района: полипептиды НЕ40 (1)и НЕ60 (2) и лизат клеток Р1.Т90, трансформированных векторной плазмидой (3); Стрелкой указано положение р-галактозидазы

Рис. 6. Электрофорез (а) и | иммуноблоттинг с сывороткой больного ОВГ из эндемичного района (б): полипептида НЕ70 (1); лизата клеток штамма-продуцента белка НЕ60 (2); р-галактозидазы (3).

и Рис. 6, на нитроцеллюлозной мембране с иммобилизованными рекомбинантныл полипептидами НЕ40, НЕ60 и НЕ70 окрашивание имеет место и 301 соответствущих молекулярных масс и отсутствует в препарате клеток / coli CLIS трансформированных векторной плазмидой без вставки вирусспецифическ последовательностей ДНК, и в случае использования в качестве отрицательно контроля /3-галактозидазы.

Несмотря на то, что отобранные рекомбинантные полипепти;

S- -

взаимодействовали с достаточно большим количеством сывороток больных OBI эндемичного района, на основе полученных результатов невозможно было сдсла заключение о специфичности этого взаимодействия, так как в ириисдс.иш исследованиях отсутствовал адекватный контроль, который мог бы исключи возможность неспецифического реагирования, связанного с качеством очист антигенов или их структурой.

Для изучения антигенной специфичности рекомбинантных полипептид были проведены сравнительные исследования с использованием синтетическ пептидов. В этих экспериментах в качестве положительного контроля использова ранее охарактеризованный в коммерческой тест-системе синтетический лепту являющийся фрагментом белка-продукта ORF3 ВГЕ штамма Бирма с 99 по 1 аминокислотные остатки (Семилетов Ю.А. и др. 1995). Исследования проводи методом ИФА на 62 сыворотках больных ОВГ из эндемичного района Узбекистан: использованием иммуносорбентов на основе рекомбинантных полипептидов синтетического пептида. В качестве отрицательного контрольного антиге использовали выделенный из клеток Е.соЧ препарат /J-галактозидазы. Оказало что 93% и 32% сывороток, прореагировавших с рекомбинантными полипептида НЕ60 и НЕ40 соответственно, являются положительными и по отношению синтетическому пептиду. Из 30 сывороток, прореагировавших с полипептид НЕ60, 20 оказались положительными по отношению к содержащему фрагм£ ORF2 рекомбинантному полипептиду НЕ40. Две из тридцати НЕ60 - положительн сывороток оказались отрицательными в реакции с синтетическим пептидом. Кро того, наблюдалась более высокая интенсивность сигнала при использован иммуносорбента на основе рекомбинантного антигена НЕ60, чем г использовании в качестве антигена синтетического пептида. Два последних фа1 могут объясняться большей протяженностью рекомбинантного белка НЕ60 v

/чшей передачей рекомбинантным антигеном конфигурации эпитопов при эрбции на планшетах.

Антигенную специфичность полипептида НЕ60 изучали также методом жкурентного ИФА, используя в качестве конкурирующих антигенов синтетические гптиды - фрагменты белка-продукта СЖРЗ с 99 по 119 аминокислотные остатки ГЕ штаммов Бирма и Мексика. В качестве отрицательных конкурирующих ггигенов использовали выделенную из клеток Е.соН /3-гапактозидазу и штетический пептид - фрагмент белка \/рг ВИЧ-1. При увеличении концентрации >нкурирующего антигена в виде пептида - фрагмента белка штамма Бирма или гкомбинантного полипептида НЕ60 подавление связывания антител с гкомбинантным антигеном, сорбированном в лунках планшет, происходило »актически одинаково. Добавление к сывороткам синтетического пептида -рагмента белка штамма Мексика лишь незначительно ингибировапо связывание |тител. Присутствие в растворе для инкубации с сыворотками /З-галактозидазы и ¡нтетического пептида, не содержащего последовательностей ВГЕ, не влияло на аимодействие сывороток с рекомбинантным полипептидом НЕ60 (Рис. 7).

Для подтверждения этих результатов была изучена эффективность йтрализации синтетическими пептидами связывания антител с полипептидом Е60 на 15 сыворотках, положительных в отношении полипептида НЕ60 и пептида фрагмента белка штамма Бирма (Рис. 8). В присутствии синтетического пептида -загмента белка штамма Бирма происходило подавление сигнала в среднем на ,6±3,4%, а в присутствии пептида мексиканского типа сигнал снижался на ,3±3,9%. При добавлении к сывороткам в качестве конкурирующего антигена епарата рекомбинантного белка НЕ60 оптическая плотность снижалась в еднем до 13,9±2,9%, то есть, до значений соответствующих отрицательному итролю (9,9±2,9%). Возможное неполное подавление синтетическим пептидом язывания антител с рекомбинантным белком по-видимому связано с наличием полнительных эпитопов в составе белка НЕ60. Поскольку в исследовании пользовались сыворотки среднеазиатского происхождения, более высокая зпень подавления сигнала пептидом бирманского типа по сравнению с пептидом ксиканского типа согласуется с ранее полученными данными о антигенном здстве бирманского и среднеазиатского вариантов ВГЕ и их отличии от ксиканского штамма.

■ёктдетрвцштсзрфртащоашлт

ш ш | 1 (а> щхтд ба м л и о СВГ ю Уйаа с 1 ¡ни): -4-папвд"В|Ля" шпод' Мята'' -А-пшвдИН -в-белкН

2 С

сч о

■ч-п

0 к с:

1

о. и

120 100 80 60 40 20

100

74 ,5±3 ,9

Щх

23 ,4±3 ,4

13 ,912 ,9 9 9±2 $

: ;

-'-Г- - Ч-

1

2

3

4

5

Ри с . 8. Нвйтрал и зация взаимодействия рокомбинантного полипептида НЕ60 с сыворотками больных ОВГ из Узбекистана (п = 15): 1 - без конкурирующих антигенов, 2-е пептидом Бирма, 3 - с пептидом Мексика, 4 - с белком НЕ60, 5 ■ реакция с.0 - галактозидазой без конкурирующих антигенов.

целью исключения вероятности неспецифического реагирования экомбинантных полипептидов с сыворотками больных ОВГ исследовали их заимодействие в ИФА с сыворотками ОВГ из неэндемичного региона, а именно с ыворотками от 40 пациентов инфекционной больницы N1 г. Москвы слабораторно одтвержденным диагнозом гепатита А, В или С. Исследовано 8 сывороток от ольных с хроническими гепатитами В и С, 8 - от больных с острым гепатитом В, 4 -т больных с острым гепатитом С, 18 - от больных с гепатитом А и 2 сыворотки, не эдержащих маркеров гепатитов А, В и С. Ни в одной из 40 сывороток больных ОВГ э обнаружено антител к рекомбинантным полипептидам.

Кроме того, исследовано взаимодействие с рекомбинантными антигенами зшороток здоровых людей из различных регионов. В сыворотках 88 пациентов, эоходивших обследование в роддоме N4 г. Москвы в августе 1997 г., и в элученных в 1995 г. 68 сыворотках безвозмездных доноров из станции эреливания крови республики Адыгея антител к рекомбинантным белкам не ыявлено. В двух из пятидесяти исследованных сывороток безвозмездных эноров, полученных из городской станции перешвания крови г. Сургут, Знаружены антитела к полипептиду НЕ60 в низких титрах.

Таким образом, проведенные исследования показали, что частота ^явления с помощью рекомбинантных антигенов антител к ВГЕ в сыворотках ольных ОВГ из Узбекистана, собранных в период ожидаемого сезонного подъема аболеваемости, соответствует прогнозируемым для данного региона показателям Jalayan M.S. et а/. 1994). В опытах по сравнительному изучению взаимодействия э!вороток больных ОВГ из эндемичного района с синтетическими и экомбинантными антигенами доказана специфичность связывания экомбинантных полипептидов с антителами к ВГЕ. Эти результаты позволили делать вывод о возможности использования полученных рекомбинантных нтигенов для создания иммуноферментной тест-системы для выявления антител ¡G к ВГЕ в сыворотках крови.

5. Создание тест-систем для выявления антител к ВГЕ.

Для создания тест-систем «ВГЕ-скрин» и «ВГЕ-скан» использовали имуносорбент, который представляет собой эквимолярную смесь экомбинантных полипептидов "НЕ40", "НЕ60", "НЕ70", иммобилизованных в /нках полистироловых или полихлорвиниловых планшет для иммунологических

реакций (по ТУ 6-06-1609-77, ТУ 42-2-42883, ТУ 64-2-375-86) (АгВГЕ),. В тес системе «ВГЕ-скрин» используется также контрольный антиген (Каг), которь представляет собой синтезированный в E.coli полипептид, содержащ! аминокислотную последовательность /3-галактозидазы. В качестве конъюга использованы моноклональные антитела к IgG человека, связанные пероксидазой хрена. В качестве положительного контрольного образца (К+) в тес системы включена сыворотка крови человека, содержащая антитела к виру гепатита Е, в качестве отрицательного контрольного образца (К-) - сыворотка кро человека, не содержащая антител к вирусу гепатита Е. Индикатор! иммуноферментной реакции является раствор ортофенилендиамина с перекис! водорода. Подготовлены экспериментально-производственный регламент временная фармакопейная статья на тест-системы.

Для контроля качества тест-системы брали не менее 20 образцов сыворот больных ОВГ из эндемичного района, содержащих антитела к ВГЕ, и не менее образцов отрицательных сывороток, в качестве которых использованы сыворот больных ОВГ из неэндемичного района.

При учете результатов реакции в тест-системе «ВГЕ-скрин», предназначена для анализа 46 образцов сывороток, для каждой испытуемой сыворотки определяют величину отношения оптической плотности при 492 нм (ОП492нм) по АгВГЕ к ОП492нм этой же сыворотки по Каг. Результат испытания считают положительным, если отношение составляет не менее 2. Результат испытания считают отрицательным, если отношение не превышает 2.

В тест-системе «ВГЕ-скан», предназначенной для анализа 92 образи сывороток, определяют величину критической оптической плотности (ОПпор). С эт целью для всех отрицательных сывороток панели, включающей сыворотки больн ОВГ и здоровых доноров из неэндемичного района, вычисляют среднее значен оптической плотности (ОПср) и среднеквадратичное отклонение (а). Порогов значение оптической плотности определяют по следующей формуле: ОППор = Ol + За (Щиголев Б.М. 1969; Канев А.Н. и др. 2000).

Результат учитывают как положительный, если соответствующее значение ( в лунке не меньше ОПп0р- Результат учитывают как отрицательный, если значен меньше ОПп0р.

Для выявления стабильности специфической активности препарата следовано 5 экспериментальных серий тест-систем. В результате этих следований был установлен срок годности тест-систем - не менее 6 месяцев. В чение этого срока воспроизводились значения ОП492нм положительного и рицательного контрольных образцов по каждому из антигенов (АгВГЕ и Kar), 1492нм контроля конъюгата и специфичность реакции.

Для оценки адекватности использования разработанных тест-систем для оведения сероэпидемиологичеких исследований изучали сыворотки, ранее арактеризованные в тест-системе производства фирмы «Abbott-Diagnostica» в боратории эпидемиологии и диагностики гепатита Института полиомиелита и эусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН. В исследование также были иочены сыворотки больных острым вирусным гепатитом из эндемичного района Зекистана и положительные сыворотки пациентов с неустановленным диагнозом г. Москвы. Для проведения этих испытаний была выбрана тест-систем «ВГЕ-ин» как содержащая контрольный антиген. Результаты исследования совпали 28 из 30 положительных и по 18 из 19 отрицательных образцов в тесте "Abbott gnostics". В одном случае оба теста показали сомнительный результат. 1трольная положительная сыворотка (К+) из Национального института шогических стандартов и контроля (Великобритания) обоими тестами шляется как положительная. В двух из трех позитивных в тесте «ВГЕ-скрин» юроток пациентов из неэндемичного региона (г. Москва) без клинических знаков гепатита антитела обнаруживались также и с помощью теста "Abbott gnostics".

6. Использование тест-системы «ВГЕ-скрин» для эпидемиологических ледований.

Для поведения клинических испытаний была выбрана тест - система «ВГЕ-1н», так как использование в ней наряду со специфическими антигенами -щательного контрольного антигена создает возможность дополнительного гверждения специфичности реакции. Для оценки пригодности разработанных -систем для проведения сероэпидемиологических исследований тест - система Е-скрин» была использована при изучении этиологической структуры ОВГ в гмичном по гепатиту Е районе в периоды сезонного подъема и спада

заболеваемости и при оценке иммунного статуса населения эндемичного райоь период спада заболеваемости гепатитом Е. Исследована также частота выявле с помощью данной тест-системы антител к ВГЕ среди здорового населе неэндемичного района.

В частности, тест-систему «ВГЕ-скрин» использовали для расшифрс этиологической структуры вирусных гепатитов, зарегистрированных в течение 1 года в Дехканабадском районе Узбекистана. Исследовали сыворотки крови е 376 больных острым вирусным гепатитом, поступивших в инфекционную больь Дехканабадского района в период с 1 января по 31 декабря 1993 года. У 30,3 37% больных этой группы был серологически подтвержден диагноз гепатита острого гепатита В соответственно. 5,1% больных были серопозитивным отношении вируса гепатита С. Антитела к ВГЕ обнаружены у 23% обследован лиц, включая 36 случаев микст-инфекции: гепатита А и гепатита Е (9,5%) (Рис.! соответствии с эпидемиологическими особенностями гепатита Е отмечена i выраженная сезонность заболеваемости: более 80% случаев этого заболевг зафиксировано в период с августа по декабрь. В целом доля гепатита Е состэе 23% от общего числа случаев острого вирусного гепатита и 76,9% от слу* гепатита ни А ни В, что соответствует прогнозируемым показате заболеваемости в эндемичных по гепатиту Е районах, которые по дан нескольких авторов в зависимости от эпидемической ситуации составляю' 22,2% до 70-85% (Balayan M.S. et al. 1994) случаев острого вирусного гепатита 92% от общего количества случаев гепатита ни А ни В. Более 70% слу обнаружения антител к ВГЕ среди больных ОВГ пришлось на лиц старше 15 что также согласуется с эпидемиологическими особенностями гепатите Рассчитанный показатель заболеваемости гепатитом Е составил 51,7 на 10i человек населения.

Исследовано также 192 образца сывороток больных ОВГ, собраннь период предполагаемого подъема заболеваемости гепатитом Е на этой территории в ноябре 1998 года, и 392 образца сывороток здоровых доне собранных в период спада заболеваемости - в мае - июне 1999 года. У 48 бол (24%) выявлены антитела к ВГЕ. Обращает на себя внимание неравномерь территориального распределения случаев выявления антител к ВГЕ. Так, из о кишлака в ноябре 1998 года поступил 71 больной с диагнозом ОВГ, у 28 (39,4е которых выявлены антитела к ВГЕ. Полученные данные свидетельствуют не тс

ГВ+ГА (4,0%)

б/м (1,5%)

ГА (30,3%)

ГС (5,1%)

ГВ (37,0%)

ГА+ГЕ (9,5%)

ГВ+ГЕ (0,8%) ГЕ (11,7%)

Рис. 9. Доля гепатита Е в этиологической структуре острых вирусных гепатитов в Дехканабадском районе Узбекистана в 1993 г.: ГА - гепатит А, ГВ - гепатит В, ГС - гепатит С, ГЕ - гепатит Е, б/м - гепатит неустановленной этиологии

наличии очаговых случаев заболевания гепатитом Е, но и о значительном эльном весе этой инфекции в структуре ОВГ в этом районе.

Антитела к ВГЕ были обнаружены в 37 из 392 (9,4%) сывороток здоровых норов, собранных в том же районе в мае-июне 1999 года. Этот показатель ласуется с данными ВОЗ о величине иммунной прослойки населения в }емичных районах, которая может достигать 10-15%, а иногда 25%. (Балаян 2.1995). Такая частота обнаружения антител к вирусу - невысокая по сравнению этой величиной для гепатита А (100%) - также является характерной для Секции, вызываемой ВГЕ.

При исследовании сывороток 407 пациентов из г. Москвы, проходящих зновое обследование в НИИ вирусных препаратов РАМН, антитела к ВГЕ чаружены в 10 (2,45%) случаях. Ни у одного из этих людей не было клинических эявлений гепатита в момент обследования. Обнаружение антител к вирусу у ;еления неэндемичного района не является неожиданным, так как по данным /гих исследователей число серопозитивных в отношении ВГЕ лиц может

достигать 1 -3% среди здорового населения неэндемичных районов (Федорова О 1999).

Выводы

1. Сконструирована и запатентована новая векторная система экспресс рекомбинантных генов в клетках Escherichia coli, предназначенная для синтез? выделения рекомбинантных белков.

2. Синтезированы и клонированы фрагменты ДНК, кодируют иммунодоминантные эпитопы белков - продуктов ORF2 и ORF3 вируса гепатитг штамма Бирма.

3. Получены бактериальные штаммы - продуценты рекомбинантн полипептидов, содержащих антигенные детерминанты белков pORF2 и pOF вируса гепатита Е штамма Бирма.

4. Исследована диагностическая значимость полученных рекомбинантн полипептидов. Из них отобраны полипептиды с наиболее выраженной антиген активностью. На их основе созданы иммуноферментные тест-системы «ВГЕ-скр1. и «ВГЕ-скан» для определения антител к вирусу гепатита Е в сыворотках кро Разработанные диагностические препараты обладают высокой чувствительное! и специфичностью.

5. При помощи тест-системы «ВГЕ-скрин» проведены се эпидемиологические исследования острого вирусного гепатита на террито[ Дехканабадского района Кашкадарьинской области Узбекистана. Определена дс гепатита Е в этилогической структуре острых вирусных гепатитов и рассчи показатель заболеваемости, который составил 51,7 на 100 тыс. населения.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Вектор pELe, предназначенный для экспреа чужеродной ДНК. Пат. 2043415 РФ от 10.9.95. Приоритет от 18.2.92.

2. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Штамм бактерий Escherichia с используемый для получения рекомбинантных белков. Пат. 2043409 РФ от Ю.£ приоритет от 18.2.92.

3. Алаторцева Г.И., Гринев А.А., Гольцов В.А, Титаев А.В., Карасева Е Дементьева Е.В., Зверев В.В. Создание тест-системы для диагностики гепатит на основе рекомбинантных белков. Материалы VII съезда Всероссийск

Общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 1997, т. 2:204-!05.

Алаторцева Г.И., Гринев А.А., Гольцов В.А, Титаев А.В., Кузин С.Н., Дементьева Е.В., Суханова Л.Л., Семилетов Ю.А.,Зверев В.В. Использование рекомбинантных штигенов для диагностики вируса гепатита Е. В сб. "Актуальные проблемы (иагностики и терапии инфекционных заболеваний." 1997. Москва, т. 2:43.

Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Вектор pELa, предназначенный для экспрессии |ужеродной ДНК. Пат. 2071501 РФ от 10.1.97. Приоритет от 18.2.92.

Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И Вектор pELc, предназначенный для экспрессии |ужеродной ДНК. Пат. 2071503 РФ от 10.1.97. Приоритет от 18.2.92.

Зверев В.В., Алаторцева Г.И., Гольцов В.А., Гринев А.А., Титаев А.В., Суханова 1.Л., Кузин С.Н., Применение тест-системы на основе рекомбинантных антигенов (ля определения антител к вирусу гепатита Е при исследовании этиологической ;труктуры острых вирусных гепатитов в эндемичном районе Узбекистана. В сб. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Срайнего Севера." Новосибирск, 1998:88.

Алаторцева Г.И., Гринев А.А., Амиантова И.И., Нестеренко Л.Н., Суханова Л.Л., "итаев А.В., Зверев В.В., Гольцов В.А. Получение рекомбинантных полипептидов, юдержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е. Вопросы вирусологии, 998, 43(6):266-269.

Алаторцева Г.И., Амиантова И.И., Гринев А.А., Нестеренко Л.Н., Суханова Л.Л., "итаев А.В., Дементьева Е.В., Семилетов Ю.А., Кузин С.Н., Гольцов В.А., Зверев J.B. Антигенная специфичность рекомбинантных антигенов, содержащих фрагменты белков вируса гепатита Е. Вопросы вирусологии, 1999,44(2):61-64.

Zverev V.V., Kuzin S.N., Alatortseva G.I., Buriev A.Y., Umirov S.E., Goltsov V.A., Cuzina L.E., Shakhgildyan I.V. Hepatitis E in the epidemiological structure of viral lepatitis in the South Uzbekistan. XI th Intern. Congress of Virology 1999, Sydney. /.1:630.

Алаторцева Г.И., Гринев A.A., Кузин C.H., Федорова О.Е., Буриев А.Я., Умиров 1.Э., Хасанов А.Х., Гольцов В.А., Зверев В.В., Балаян М.С. Иммуноферментная ест-систем на основе рекомбинантных антигенов для диагностики гепатита Е. Материалы научной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения И.П.Чумакова "Актуальные проблемы медицинской вирусологии." Москва,23-25 юября 1999, М. 1999,том 1:58.

12. Кузин С.Н., Алаторцева Г.И., Буриев А.Я., Хасанов А.Х., Умиров С. Жантемиров Б.У., Тайманов Т., Гольцов В.А., Кузина Л.Е., Шахгильдян И.В., 3eef B.B. Удельный вес гепатита Е в структуре острых вирусных гепатитов южн( Узбекистана. Научная конференция «Вирусные инфекции на пороге XXI ве эпидемиология и профилактика». Санкт-Петербург. 1999:77.

13. Sukhanova L„ Alatortseva G., Kuzin S., Grinev A., Volynskaya E., Goltsov V. Zverev V.V. Antigenic activity and specifity of the recombinant polypeptides contain hepatitis С virus fragments. FEMS symposium 2000, Istanbul: 99.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алаторцева, Галина Ивановна, Москва

Научно-исследовательский институт вирусных препаратов им. О.Г. Анджапаридзе

На правах рукописи УДК 616.36-002.14: 578.891] -078.33

Алаторцева Галина Ивановна

Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е, и создание на их основе диагностических тест-систем.

03.00.06. - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАМН Зверев В.В.

кандидат биологических наук Гольцов В.А.

Москва - 2000

1 'Л

qy

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...............................................51

4.1. Получение векторов экспрессии вирусных генов..........................51

4.1.1. Конструирование векторов серии pEL5, несущих ген

лизоцима.................................................................................52

4.1.2. Получение рекомбинантных белков в виде водонерастворимых агломератов.............................................................................54

4.2. Синтез и клонирование фрагментов ДНК, кодирующих

участки белков ВГЕ...................................................................56

4.2.1. Клонирование фрагментов ДНК ORF2 вируса гепатита Е............56

4.2.1.1. Синтез и клонирование фрагмента ДНК НЕ40........................56

4.2.1.2. Синтез и клонирование фрагмента ДНК НЕ70........................61

4.2.1.3. Синтез и клонирование фрагмента ДНК НЕ170.......................63

4.2.2. Клонирование фрагмента ДНК ORF3 вируса гепатита Е..............64

4.3. Получение рекомбинантных белков ВГЕ в клетках E.coli..............65

4.3.1. Сравнительное изучение синтеза рекомбинантных полипептидов

в использованных векторных системах..........................................65

4.3.2. Выделение и очистка рекомбинантных полипептидов................66

4.4. Изучение антигенной специфичности полученных рекомбинантных

белков....................................................................................68

4.4.1. Анализ сывороток больных острым вирусным гепатитом из района, эндемичного по гепатиту Е.........................................................68

1. ВВЕДЕНИЕ

Вирусные гепатиты в настоящее время являются одной из важнейших проблем инфекционной патологии человека. В первую очередь это относится к парентеральным вирусным гепатитам В и С, однако и энтеральные гепатиты А и Е вносят существенный вклад в эту проблему. Так, например, в развивающихся странах с жарким климатом доля гепатита Е составляет более 50% всех случаев острого гепатита (Purcell R.H. el al. 1988).

Гепатит Е, ранее известный как энтеральный гепатит ни А ни В, в качестве самостоятельной нозологической формы был открыт М.С. Балаяном в 1983 году в опытах с самозаражением (Balayan M.S. et al. 1983). Несмотря на сходство клинических проявлений с другими вирусными гепатитами, заболевание, вызываемое этим вирусом, характеризуется рядом особенностей. В числе этих особенностей взрывной характер эпидемических вспышек, которые могут охватывать десятки и даже сотни тысяч человек, отсутствие хронических форм заболевания, поражение в основном лиц молодого и среднего возраста, выраженная сезонность подъема заболеваемости. Заражение наиболее часто происходит через употребление контаминированной воды и значительно реже, чем при гепатите А, при контакте с заболевшими, поэтому редкими являются случаи семейной очаговости заболевания в эндемичных районах и при завозе инфекции в неэндемичные районы не происходит ее распространения. Особенностью гепатита Е является также высокая частота развития фульминантного гепатита у беременных со смертностью достигающей 20-30%.

Гепатит Е диагносцируется в более, чем 60% всех случаев фулминантного гепатита ни А ни В (Ыапс1а 8.К. е/ а1. 1994).

Неизученным является факт присутствия антител к вирусу у населения развитых стран с умеренным климатом. Относительно высокая (1-3%) частота серопозитивности при отсутствии эпидемической заболеваемости не имеет аналогии с другими энтерально передающимися вирусными инфекциями. Кроме того, антитела к этому вирусу достаточно часто обнаруживаются у регулярных доноров крови, отстраненных от донорства в связи с повышением уровня трансаминаз, медицинских работников, наркоманов, больных хроническими гепатитами В и С, первичной гепатоклеточной карциномой, циррозом печени. Необычно высокая частота обнаружения антител к вирусу гепатита Е у больных хроническим аутоиммунным гепатитом (до 46%) сочетается с тяжелым поражением печени быстро прогрессирующим в цирроз, что позволяет предположить, что заражение вирусом гепатита Е может быть пусковым механизмом аутоиммунного процесса.

В последние годы участилась миграция населения из районов эндемичных по гепатиту Е в центральные области России и вследствие этого возрос риск завоза этой инфекции. Этот факт, а также случаи обнаружения антител к вирусу у лиц, проживающих в неэндемичных районах, в условиях отсутствия эпидемиологического процесса свидетельствуют о необходимости изучения распространения вируса на территории России и природы феномена присутствия антител в различных группах населения неэндемичных районов. Эти вопросы невозможно изучать без надежных и доступных в экономическом отношении диагностических препаратов.

К моменту начала данной работы в нашей стране тест-систем для выявления антител к вирусу гепатита Е не было, поэтому целью настоящей работы была разработка тест - систем для выявления антител к ВГЕ, предназначенных для диагностики вызываемой этим вирусом инфекции и проведения сероэпидемиологических исследований.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

- провести анализ антигенной структуры белков вируса гепатита Е и определить в их составе антигенно-значимые участки, способные индуцировать образование антител;

синтезировать олигонуклеотиды, соответствующие фрагментам вирусного генома, кодирующим выбранные участки вирусных антигенов;

клонировать собранные из синтезированных олигонуклеотидов фрагменты генома ВГЕ в бактериальной системе;

создать патентно-чистую векторную систему экспрессии рекомбинантных генов в клетках Е. coli для получения препаративных количеств рекомбинантных антигенов;

- используя разработанную векторную систему, получить бактериальные штаммы - продуценты рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты ВГЕ, и выделить рекомбинантные антигены в препаративных количествах;

- иммунологическими методами подтвердить специфичность полученных рекомбинантных антигенов и изучить их диагностическую значимость;

- создать на основе рекомбинантных антигенов диагностические тест-системы для обнаружения антител к вирусу;

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Особенности эпидемиологии и этиологии гепатита Е. 2.1.1.Эпидемиология гепатита Е.

Гепатит Е, ранее известный как энгеральный гепатит ни А ни В, занимает особое место среди вирусных гепатитов. Как и гепатит А, это заболевание относится к кишечным инфекциям, однако имеет ряд специфических отличий. Эпидемические вспышки заболевания носят взрывной характер и могут достигать крупных масштабов, таких как, например, первая документированная эпидемия в Дели, Индия, в 1955 году, охватившая десятки тысяч человек (Viswanathan R. 1957), и эпидемия в Китае в 1986-88гг., во время которой было зарегистрировано сотни тысяч случаев заболевания (Zhuang Н. et ей.. 1991). В настоящее время установлено, что вирус гепатита Е отвечает за крупные вспышки энтерального гепатита в странах с жарким климатом: Индии, странах центральной и юго-восточной Азии, Африки и на территории Мексики (Bradley D.W. 1992, Wong D.C. et ей.. 1980). Более 50% случаев острого гепатита в развивающихся странах относят на долю гепатита Е (Таблица 1). Замечен факт практически одновременного возникновения масштабных эпидемий на разных территориях: вспышки в Киргизии и Казахстане в 1955-1956 гг. произошли одновременно с эпидемией в Индии, крупная эпидемия в Ташаузской области Туркменистана в 1977 году - почти одновременно с крупными эпидемиями в Хорезмской области Узбекистана и Кызыл-Ордынской и Чимкентской областях Казахстана (Фаворов М.О. и др. 1996). Отмечен ряд крупных эпидемий заболевания в среднеазиатских странах - бывших республиках СССР, являющихся гиперэндемичными по гепатиту Е: вспышки в 1955-56 гг. (10812 случаев) и 1987г. (32000 случаев) в Киргизии, в 1985-86гг. (около 20000 случаев) в Ташаузской области Туркмении, в 1986 г. в Кашкадарьинской области Узбекистана (7000 случаев) (Wong D.C., et al.. 1980, Фаворов М.О. и др. 1996).

Таблица 1. Частота обнаружения антител к ВГЕ при обследовании больных ОВГ (Балаян М.С. 1994)

Страна Отношение числа серопозитивных к числу обследованных лиц Диагноз

Индия, Кашмир 32/45 71% Подозрение на гепатит Е

Индия 52/227 22,9% Острый гепатит

Индонезия 79/89 88% Подозрение на гепатит Е

Тайвань 6/27 22,2% Гепатит ни А ни В ни С

Египет 17/140 12,1% Спорадический острый гепатит

Сомали 46/181 25% Гепатит среди французских солдат

Судан 29/32 90,6% Подозрение на гепатит Е

Турция 4/63 6,3% Спорадический острый гепатит

Таджикистан 64/64 100% Подозрение на гепатит Е

Туркмения 69/76 90,7% и

Киргизия 70/80 87,5% и

Мексика 82/101 81,2% и

Кения 118/151 78,1% и

Узбекистан 18/23 78,3% и

Россия 14/88 15,9% Острый гепатит у военнослужащих

Характерной чертой эпидемиологии гепатита Е является выраженная сезонность подъема заболеваемости. В жарких странах максимальный подъем заболеваемости приходится на сезон дождей или вскоре после него, что связывают с возможностью попадания нечистот в источники водоснабжения (Солодовников Ю.П., Гасанов И.Ю. 1995). Для Средней Азии и северного Китая характерен подъем заболеваемости в осенне-зимний период (Балаян М.С. 1995). В межэпидемический период в эндемичных районах спорадические случаи регистрируются в течение всего года. По некоторым данным в Африке более 60% спорадических случаев острого энтерального гепатита ни А ни В приходится на долю гепатита Е (ШосЬе М.

et al. 1995). В Индии доля спорадических случаев гепатита Е составляет 44% всех случаев острого гепатита у взрослых и 24% - у детей ( Tandon B.N. et al. 1984).

В развитых странах Европы и в США регистрируются отдельные случаи заболевания, которые, как правило, являются результатом завоза инфекции из эндемичных очагов (Tandon B.N. et al.. 1994, Johansson P.J.H., Mushawar I.K. 1995, Skidmore S.J . et al. 1991). Описаны завозные из Азии случаи заболевания в Норвегии (Skaug К. et al. 1994), случаи острого гепатита Е в Германии у людей заразившихся во время пребывания в тропических странах (Trautwein С. et al.. 1995). В Бельгии гепатит Е в основном диагностируется у лиц, часто совершающих поездки в эндемичные страны и у рабочих и дипломатов из развивающихся стран (Vrackx R. 1995). Клиническая картина завозных случаев заболевания, зарегистрированных в индустриально развитых странах, была типичной для инфекции, вызываемой ВГЕ, случаев контактной передачи не отмечено. Неожиданным было выявление в неэндемичных странах довольно значительного числа серопозитивных в отношении ВГЕ лиц( Таблица 2). Антитела IgG к ВГЕ регулярно обнаруживаются у здоровых людей с частотой 1-3%. Такая относительно высокая частота выявления антител к вирусу при отсутствии даже спорадических случаев заболевания не имеет аналогии с другими энтерально передающимися вирусными инфекциями. Более высокая частота обнаружения антител к ВГЕ наблюдается среди больных с различной патологией печени (Федорова O.E. 1996), а также при некоторых заболеваниях не связанных с первичным поражением печени, у регулярных доноров крови, у медицинских работников и у больных, подвергавшихся гемодиализу или длительному лечению препаратами крови. Чрезвычайно высокой (46%) оказалась частота выявления антител IgG к ВГЕ у больных с хроническим аутоиммунным гепатитом, быстро прогрессирующим в цирроз (Sylvan P.E. et al. 1995). Полагают, что в определенных случаях инфекция ВГЕ может быть пусковым

Таблица. № 2. Частота обнаружения антител к ВГЕ у населения различных регионов (Balayan M.S. 1997).

Регион Количество обследованных Серопозитивность,

образцов сывороток %

Эндемичные страны:

Китай 2112 20,2

Тайвань 384 10,7

Индия 250 4,0

Тайланд 783 2,8

Гонг Конг 355 16,1

Таджикистан 934 8,5

Киргизия 173 4,6

Турция 1350 5,9

Чили 594 7,4

Бразилия 61 4,9

Неэндемичные

страны:

Великобритания 1500 1,0

Германия 972 2Д

Франция 1007 0,9

Испания 775 2,2

Нидерланды 1275 1Д

Бельгия 394 1,5

Италия 1889 2,6

Россия 168 1,2

Украина 1721 0,5

США 386 2,1

Австралия 279 0,4

Израиль 1416 2,6

механизмом развития аутоиммунного процесса. Существует несколько гипотез объяснения наличия антител к ВГЕ в здоровой популяции и у больных с различными

заболеваниями, но при отсутствии острого гепатита. Полагают, что этот феномен может объясняться циркуляцией нераспознанного инфекционного агента, способного индуцировать образование антител, дающих перекрестные реакции с ВГЕ, или наличием ситуации, когда один и тот же вирус способен вызывать разные патологические состояния в разных климатических зонах (Федорова O.E. 1999).

При определении иммунной прослойки среди населения эндемичных стран установлено, что даже в странах с высокой заболеваемостью она редко превышает 15% ( Таблица 2), что ниже этого показателя (100%) для гепатита A (Balayan M.S. et al.. 1994).

К настоящему времени установлено, что фекально-оральный механизм передачи возбудителя является основным способом распространения этой инфекции среди людей. Заражение наиболее часто происходит через употребление контаминированной воды или пищи и значительно реже, чем при гепатите А, при контактах с заболевшими, поэтому при заносе инфекции в неэндемичные районы не происходит ее распространения. Отсутствие контактной передачи в эндемичных районах может объясняться низкой выживаемостью вируса, в неэндемичных районах - высоким уровнем санитарно-гигиенического состояния, исключающим возможность распространения инфекции (Balayan M.S. 1997). Однако при очевидной водной природе эпидемий гепатита Е, динамика и территориальное распределение этой инфекции часто не совпадают с аналогичными характеристиками таких типично водных по главному пути передачи инфекций, как дизентерия Флекснера и брюшной тиф. В ходе расследования масштабной эпидемии гепатита Е в 1985 году в Ташаузской области Туркменистана не было отмечено повышения заболеваемости этими бактериальными инфекциями. Полагают, что этот факт объясняется высокой фильтрующейся способностью возбудителя гепатита Е - вируса гепатита Е, которая позволяет ему, в отличие от бактерий, легко проникать через слои почвы,

являющиеся естественным бактериальным фильтром, в грунтовые воды, используемые в качестве питьевых источников (Солодовников Ю.П. 1987).

В ходе изучения крупных эпидемических вспышек выявлена еще одна особенность инфекции: в отличие от гепатита А заболевание преимущественно регистрируется не у детей, а у лиц молодого и среднего возраста (15-40 лет) при наличии у них иммунитета к вирусу гепатита А. Случаи распространения инфекции среди детей и пожилых людей выявляются реже. Редкими также являются случаи семейной очаговости заболевания.

Особенностью гепатита Е является также высокая частота развития фульминантного гепатита у беременных со смертностью, достигающей 20-40% (Bradley D.W. 1990). Обследование детей, родившихся от матерей, инфицированных в третьем триместре беременности, показало наличие вертикальной передачи ВГЕ с высокой частотой заболеваемости и смертности новорожденных (Khuroo M.S. et al. 1995). Показано, что гепатит Е является причиной более, чем 60% всех случаев фульминантного гепатита ни А ни В (Nanda S.K. et al. 1994).

Эндемичными по гепатиту Е являются регионы жаркой климатической зоны с низким санитарно-гигиеническим уровнем, в частности, с отсутствием центрального водоснабжения и канализации. Заболеваемость выше у сельского населения, чем у городского, выше в низменных районах, чем в высокогорных (Балаян М.С. 1995, Pujol F.H. et al.. 1994). Вопрос о существовании природного резервуара инфекции является одним из невыясненных вопросов эпидемиологии гепатита Е. Есть данные о возможном вовлечении диких грызунов (Каретный Ю.В. и др. 1993) и обезьян (Arankalle V.A. et al.. 1994) в распространение гепатита Е. Обнаружение у домашних свиней в ряде районов США вируса гепатита Е, а также чувствительность многих лабораторных животных (крыс, свиней, овец, различных приматов) к вирусу,

показанная в опытах по экспериментальному инфицированию, позволяют предположить о существовании животных-переносчиков этой инфекции (Balayan M.S. et al. 1990, BradleyD.W. et al 1987, Clayson E.T. et al. 1996, Mannerat Y. et al. 1996, Meng X.J. et al. 1997). Это предположение подтверждается обнаружением большого количества серопозитивных особей в популяциях крыс городских и сельских ареалов на территории США, которое достигает 90% на Гавайях, 77% в штате Мэриленд и 44% -в штате Луизианна (Kabrane-Lazizi Y. et al. 1999).

2.1.2. Этиология гепатита Е

Доказательство фекально-орального способа передачи инфекции и идентификация возбудителя заболевания - вируса гепатита Е - были осуществлены в 1983 году М.С.Балаяном с соавторами в опытах по самозаражению материалом от больных из Средней Азии (Balayan M.S. et al. 1983). При этом наблюдалась клиническая картина острого гепатита без появления антител к вирусу гепатита А. Электронно-микроскопическое исследование фекали