Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация антигенных детерминант вируса гепатита С с помощью синтетических пептидов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация антигенных детерминант вируса гепатита С с помощью синтетических пептидов"

•'С

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ имени Д. И. ИВАНОВСКОГО

РГ & од

'I О /!Ы1 1904

на правах рукописи

Ф И Р СО ВА Татьяна Владимировна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУСА ГЕПАТИТА С С ПОМОЩЬЮ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ

Специальность 03.00.03—молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —

1995 г.

Работа выполнена в лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и пептидного синтеза НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор химических наук, профессор В. А. Шибнев кандидат химических наук, ст. научн. сотр. Ю. А, Семилетов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор А. А. Кущ

доктор химических наук, вед. научн. сотр. О. М. Вольпина

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ

Защита диссертации состоится 16 января 1995 г. в 14 часов на заседании специализированного совета Д.001.20.01 при НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан 16 декабря 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

А. М. Ж у к о в с к и й

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Гепатит С -. одно из наиболее опасных заболеваний человека, в основном, поражающее печень, развивающееся вследствие передачи с кровью этиологического агента инфекции - вируса гепатита С (НСУ). Специфическая диагностика вирусного гепатита С является актуальной проблемой здравоохранения во всем мире, в особенности, чрезвычайно важной для ограничения распространения ПСУ-инфекции посредством зараженных продуктов крови.

Одним из путей создания эффективных диагностических препаратов против вирусных инфекций является конструирование их на основе искусственных антигенов, в качестве которых могут использоваться как рекомбинантные белки, так и синтетические пептиды - фрагменты вирусных белков.

Использование синтетических пептидов в качестве антигенов в диагностических системах создает широкие возможности для специфического скрининга анти-НСV-антител. Идентификация антигенных детерминант в составе вирусных белков является первым этапом в конструировании диагностику'мов нового поколения, основанных на синтетических пептидных антигенах.

Дели и задачи исследования. В настоящей работе мы поставили своей целью поиск пептидных антигенов - фрагментов белков НСУ - для анализа структурной организации вирусных В-зпитопов и создания им-муноферментной диагностической тест-системы для определения в крови антител к НСУ. '

Поставленная цель подразумевала решение следующих задач:

- предсказание вероятных В-эпитопов в составе белков НСУ на основе компьютерного анализа гидрофильности и расчета вторичной структуры;

- химический синтез выбранных пептидных фрагментов твердофазным методом, очистка полученных пептидов с помощью гель-хроматографии и обращенно-фазовой ВЭЖХ;

- сравнительное исследование антигенной активности синтетических пептидов в непрямом твердофазном ИФА путем изучения антигенного профиля сывороток крови пациентов с НСУ-инфекцией и определение сайтов связывания со специфическими анти-НСУ-антителами;

- разработка способа иммуноферментной диагностики вирусного гепатита С, основанного на использовании наиболее перспективных в

антигенном отношении пептидов в качестве сорбируемых на твердую фазу антигенов.

Научная новизна. В диссертационной работе, представленной к рассмотрению, впервые были синтезированы и охарактеризованы В-эпи-топы HCV в составе белка нуклеокапсида и неструктурных белков NS3 и N35, которые имеют гомологию в аминокислотной последовательности и обладают идентичной вторичной структурой.

Изучена антигенная структура районов, ограниченных аминокислотными остатками (а.о.) 20-34 и 39-75 белка core и а.о. 1689-1732, соответствующими области 5-1-1 белка NS4 HCV. Продемонстрированы возможности выявления анти-HCV-антител с помощью пептидов - фрагментов исследованных областей.

Епервые идентифицирована антигенная детерминанта в С-концевой части белка NS4 на участке, частично перекрывающемся с областью ре-комбинантного антигена с100-3 и показана высокая диагностическая значимость данного района.

Впервые был установлен характер влияния аминокислотных замен па участках 110-116 и 1711-1732 на антигенную активность соответствующих пептидов и получену данные о возможности серотипирования HCV-инфекции.

Разработан новый способ иммуноферментной диагностики гепатита С с использованием синтетических пептидов из состава белка NS4 HCY как дополнительных антигенов к рекомбинантному HCcAg, позволяющий выявлять сыворотки, не содержащие анти-core-антител. В настоящее время данная разработка внедряется в производство.

Направленность и ценность работы. Выполняя диссертационную ра-, боту, мы преследовали цели как фундаментального, так и прикладного характера. К первому направлению можно отнести идентификацию анти-телосвязывающих сайтов в составе белков вируса, играющих роль в формировании антигенной структуры HCV. Изучение предполагаемой вторичной структуры этих сайтов и определение роли отдельных аминокислотных остатков является базисом в дальнейших исследованиях по молекулярной иммунологии HCY.

Практическая ценность данной работы состоит в получении пептидных антигенов - фрагментов белков HCV для создания иммуноферментной диагностической тест-системы для определения в крови антител к HCV. ,

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Твердофазным методом синтезированы 28 пептидов из состава

белка core и неструктурных бзлков NS3, NS4 и NS5, из них 26 ранее не были описаны.

2. Исследованы антигенное свойства пептидов в твердофазном ИФА на панелях HCV-положительных и HCY-отрицательных сывороток и выявлены пептиды, позволяющие с высокими чувствительностью и специфичностью выявлять антитела к HCV.

3. Изучена антигенная структура районов, ограниченных а.о. 20-34 и 39-75 белка core и а. о. 1689-1732, соответствующего области 5-1-1 белка NS4 HCV. Продемонстрированы возможности выявления анти-HCV-антител с помощью пептидов - фрагментов исследованных областей. Показано, что сайты узнавания анти-HCY-антителами локализуются по всей длине области 5-1-1, а наибольшей антителосвязывающей способностью обладает олигопептид, соответствующий изолятам HCV с субтипом lb и ограниченный а.о. 1711-1732.

4. Продемонстрирована высокая диагностическая значимость района, ограниченного а. о. 1930-1940, не входящего в область сЮО-З. Показано, что с помощью пептида, соответствующего а.о. 1921-1940, и его фрагментов можно определять в крови анти-HCY-антитела, которые не выявляет рекомбинантный антиген сЮО-З.

5. Локализованы не описанные ранее В-зпитопы, соответствующие районам 110-116 белка core, 1274-1280 белка NS3 и 2665-2671 белка NS5, которые содержат консенсусный мотив -Asp-Pro-X-Y-Arg- в первичной последовательности и обладают идентичной вторичной структурой. Установлены отличия в'антигенной активности пептидов 110-116 и 1274-1280, соответствующих различным субтипам HCV.

6. Разработан новый способ диагностики HCV-инфекции на основе использования в качестве антигена для иммуноферментного скрининга анти-НСУ-антител смеси рекомбинантного HCcAg и синтетических олиго-пептидов, соответствующих а.о. 1711-1732 и 1921-1940 белка NS4 HCV.

Апробация работы. Результаты работы представлены на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию Института им. Пастера в г. Санкт-Петербурге (1993 г.), на Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики" в г. Перми (1993 г.), на Научной конференции молодых ученых России, посвященной 50-летию Академии медицинских наук в г. Москве (1994 г.) и на Международном симпозиуме по вирусным гепатитам и болезням печени (1993 г., Токио). Результаты работы доложены и обсуждены на совместной Конфе-

рецции Отдела молекулярной вирусологии и Совета по предварительной экспертизе диссертаций НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 1 декабря 1994 г.

Объем и структура работы. Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Объем диссертационной работы составляет 4ЬО стр. машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы /V таблицами, рисунками и /•/ схемами. Список литературы включает /Л? наименований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ аминокислотных последовательностей белков HCV с помощью компьютерных методов.

Анализ гидрофильности аминокислотной последовательности (Норр and Woods, 1981) и расчет вторично? структуры (Chou and Fasimn, 1978; Rose, 1978) белков core, NS3, NS4 и NS5 (рис. 1) проводили с использованием программы "PR0SIS". В качестве кандидатов в В-эпито-пы рассматривались участки,, обладая щие повышенной гидрофильностью, вторичная структура которых предполагает образование ^-изгибов.

ni 342 914 1490 2522 3356

I---1.

•I-

•I-

■I-

£183 I-

6377 -I-

9347 9401

5'ntl С I El IE2/1JS11 NS2 I

I---,----,------j-----j

NS3

I NS4 I

NS5

■I_

I3'nt •1

720 I

I .

------I-------1-------------

aa 1 192 304 720 1006 1615 2013 3011

nonstructural proteins I

1569ii*******i930 I

clOO-3 1£89***1740 5-1-1 1001**********1616 сззс ;

карта HCV с указанием стартовых позиций для генов, белков, нетранслируемых (nt) областей и рекомбинантных антигенов, используемых в диагностике. При анализе белков core, NS3, NS5 в их составе были обнаружены гидрофильные последовательности, содержащие консенсусный мотив -D-P-X-Y-R-. Недавно было показано, что гексапептиды, содержащие последовательность D-P-X-Y-R-, являются минимальными антителосвязы-

1 192 304 I structural I proteins

1***120 С22-3

Рис.1. Геномная

вающими сайтами белков preSl (Прокуронова с соавт., 1991) и core (Семилетов с соавт., 1994) вируса гепатита В. Для синтеза и иммунологических исследований были выбраны фрагменты белков core (а.о. 110-116), NS3 (а.о. 1269-1282, 1273-1280, 1274-1280) и NS5 (а. о. 2665-2671), включающие консенсус -D-P-X-Y-R-.

Из С-концевой части белка NS4, граничащей с областью антигена сЮО-З, был выбран фрагмент, соответствующий а.о. 1921-1940, С-кон-цевая часть которого (а.о. 1931-1940) выходит за рамки области сЮО-З. N-концевая часть участка 1921-1940 гидрофобна, в то время как С-концевые остатки высоко гидрофильны. Вторичная структура неупорядоченного участка 1921-1940, расположенного между протяженными <£- и yf-структурами, предполагает возможность образования трех ^-поворотов в районе остатков Gly, Pro , Pro /ss*.

Следует учитывать сложности, связанные с предсказанием пространственной структуры белка нуклеокапсида, поскольку часть а.о. (прежде всего положительно заряженных) в нативном белке вовлечена во взаимодействие с геномной РНК, что существенно ограничивает достоверность компьютерных расчетов. Выбор, пептидов_ 20-34 и 39-75 из состава белка core был основан, прежде всего, на анализе литературных данных (Salberg et al., 1992; Takahashl et al., 1992).

Твердофазный синтез пептидов.

В соответствии с данными компьютерного расчета и анализа литературы осуществлен синтез 28 пептидных фрагментов из состава белков core, NS3, NS4 и NS5 (рис. 2). Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов соответствовали изолятам вируса, идентифицированным в различных странах мира и относились к изолятам HCV с субтипами la, lb, 2а и 2b (Slmmonds et al., 1993). Синтез выбранных пептидных фрагментов проводился твердофазным методом (ТФС) на основе двух наиболее распространенных схем образования пептидной связи (Вое- и Fmoc-схемы).

Синтез пептидов по Вос-схеме предусматривает использование трег-бутилоксикарбонильной (Вое) группы для временного блокирования N^-аминогрупп. Пептиды синтезировали вручную. В качестве полимерного носителя использовался хлорметилированный тефлон с радиационно привитым полистиролом (107.). В отдельных случаях применяли МВНА-по-лимер (Biosearch, США), позволяющий получать пептиды в виде амидов.

1 Белок Пептиды 1 Район 1

1 1 И- QDVKFPGGGQIV6GV- Cys (Асш)-ОН 1 1 1 20-34 1

1 И-DYKFPGGGQ1VGGV-Cys(Acm)-ОН 1 21-34 1

1 Н-VKFPGGGQIVGGV-Cys(Асш)-ОН 1 22-34 1

1 сого Н-RRGPRLGVRATRKTSERSEPRGRRQP1PKARRPEGRT-ОН 1 39-75 1

1 H-GVRATRKTSERSEPRGRRQPIPKARRPEGRT-ОН 1 45-75 1

1 Н-KTSERSEPRGRRQPIPKARRPEGRT-ОН 1 51-75 1

1 Н-EPRGRRQPIPKARRPEGRT-ОН 1 58-75 1

1 H-QPIPKARRPEGRT-OH 1 63-75 1

1 H-TDPRRRS-OH, 1 110-116 1

1 H-NDPRHRS-Cys(Асш)-ОН 1 110-116 1

1 Н- TDPRHRS-Cys(Acm)-ОН 1 110-116 1

1 Н-5КAHGIDPN1RTGV-Cys(Acm)-ОН 11269-12821

1 H-GIDPNIRTGV-Cys(Acm)-ОН 11273-12821

INS3 H-G1EPN1RTGV-Cys(Acm)-NHz 11273-12321

1 H- lEPNIRT-WH^ 11274-12801

1 H-1DPNIRT-OH 11274-12801

H- IDPN1RT-WH/. 11274-12801

1 область 5-1-1 1 • 1

1 H-SGKPA11PDREVLYREFDE-Cys(Acm)-OH 11689-17071

1 Н-ЛIIPDREVLYREFDE-Cys(Acm)-OH 11693-16071

1 H-VLYREFDEMEEC-OH 11700-17111

1 H-(Acm)CSQHLPY1EQGMMLAEQFKQKA-OH 11711-17321

1 H-(Acm)CSSHLPYIEQGMQLAEQFKQKA-OH11711-17321

INS4 H-SHLPYIEQGMQLAEQFKQK-OH 11713-17321

1 С-концевая часть 1 1

1 H-AFASRGNHYSPTHYVPESDA-Cys(Acm)-OH 11921-19401

1 H- GNHVSPTHYVPESDA-Cys (Acrn)-OH 11926-19401

H-SPTHYVPESDA-Cys(Acm)-OH 11930-19401

1 H-AFASRGNHVSP-Cvs(Acm)-OH 11921-19311

INS5 H-LDPOARV-OH 12665-26711

Рис. 2. Синтезированные пептиды из состава core, NS3, NS4 и NS5 белков HCV. Аминокислотные остатки приведены в однобуквен-ном обозначении. Дополнительные остатки Cys(Acm) вводили с целью последующей конъюгации пептидов с белками-носителями. Выделенным шрифтом указаны вариабельные а.о.

Присоединение стартовой глшнокислоты к хлорметилированному полимеру проводили с использованием йодистого натрия в'качестве катализатора (Даванков о соавт., 1967). Содержание Вос-аминокислоты на полимере составляло 0,2-0,5 ммоль/г.

Удаление Вое-группы проводилось 507. раствором трифторуксусной кислоты (TFA) в хлористом метилене (DCM) с последующей нейтрализацией аминокомпонента 10% раствором этилдиизопропиламина в DCM. Дополнительные активные группы трифункциональных Вос-аминокислот бло-I кировали бензилоксикарбонильной (Lys), бензильной (Ser, Thr, Туг), нитрогруппой (Arg), бензилоксиметильной (His), ацетамидометильной (Cys) группами. Boc-Glu-OH и Boc-Asp-OH вводили в реакцию конденсации в виде О-бензиловых эфиров.

Для проведения реакции конденсации использовали 4-кратные по отношению к исходной концентрации аминогрупп на полимере избытки 1-оксибензотриазольных эфиров или 2-кратные избытки симметричных ангидридов Вос-аминокислот в диметилформамиде (DMF). Boc-Asn и Boc-Gln вводили в реакцию конденсации в виде активированных л-нит-рофениловых эфиров.

Полноту реакции образования пептидной связи контролировали с помощью нингидринового теста. В случае неполного прохождения реакции проводили повторную конденсацию с половинным количеством реагентов или ацетилирование непрореагировавших аминогрупп.

Синтезированные пептиды отщепляли от носителя действием триф-торметансульфокислоты в TFA в присутствии тиоанизола. Одновременно происходило деблокирование боковых групп аминокислот, за исключением Аст-защиты цистеина.

Синтез пептидов по Finoc-схеме предусматривает использование флюоренилметилоксикарбонильной группы (Fmoc-группы) для временного маскирования N"1-аминогрупп. Fmoc-группа стабильна в кислой среде, но отщепляется основаниями: пиперидином, морфолином и др. Пептиды синтезировали в форме свободной кислоты на РАС-полимере и в виде амидов на PAL-полимере фирмы MilliGen/ Biosearch (США).

Активные боковые группы трифункциональных Fmoc-аминокислот блокировали трет- бутильной группой - Thr (BuAsp (Bu ¿), Glu(Bu¿), Вос-группой - Lys(Boc), 4-метокси-2,3,6-триметилбензилсульфонильной группой - Arg(Mtr).

Реакция конденсации осуществлялась методом симметричных ангидридов. Полноту реакции образования пептидной связи контролировали с

- 8 -

помощью нингидринового теста Кайзера.

Отщепление пептидов от полимера проводили смесью TFA-фенол (95:5). В случае присутствия остатков Arg(Mtr) в пептидилполимере применяли смесь TFA-тиоанизол-этандитиол-анизол (90:5:3:2).

Очистка пептидов.

Для обессиливания и отделения низкомолекулярных продуктов пептидной природы использовали метод гельхроматографии на сефадексах 6-10 или G-15. Образцы пептидов, предназначенные для анализа и иммунологических исследований дополнительно очищали полупрепаративной ВЭЖХ в градиенте концентрации водного ацетонитрила. Индивидуальность синтетических пептидов была доказана данными аминокислотного анализа и аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Идентификация антителосвязывающих сайтов в составе белков HCV.

Антигенные свойства синтезированных пептидов оценивались по эффективности их взаимодействия в непрямом неконкурентном твердофазном ИФА с сыворотками крови пациентов с диагнозом гепатит С. Ан-тителосвязывающая способность пептидов в ИФА- рассматривалась в сравнении с активностью'соответствующих рекомбинантных и синтетических антигенов HCV из коммерческих тест-систем "0RTH0-1" (Германия), "RIBA-II" (Chiron Corporation, USA) и "INNO-LIA HCV Ab III" (Бельгия).

Панели сывороток от пациентов с гепатитом С подбирались в зависимости от цели каждого эксперимента. В качестве отрицательного контроля во все панели входили сыворотки здоровых доноров и больных гепатитами А и В.

В ходе работы были подобраны оптимальные условия сорбции пептидов (температурный режим, концентрации компонентов, pH) и инкубации с антителами на каждой стадии ИФА.

Результаты ИФА оценивали количественно по величине S/N в "+" по отношению поглощения образца (S) к среднему арифметическому сигналов (N) в лунках с отрицательными сыворотками, где 2.1 « 1+ < 3.5; 3.5 <; 2+ < 5.0; 5.0 3+ < 10.0; 4+ 10.0. Негативными по тестируемым антигенам считали сыворотки,, для которых значение S/N было меньше 2.1.

Анализ антигенных областей внутри белка core.

Антигенная активность синтетических пептидов 20-34, 21-34 и

22-34 изучалась методом непрямого твердофазного ИФА по степени их взаимодействия с анти-с100-3+ -сыворотками ("01?ТН0-1") больных хроническим гепатитом С. В качестве положительного контроля антигенов использовался рекомбинантный полноразмерный нуклеокапсидный белок (НСсАе), предоставленный ст. научн. сотр. НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, к.б.н. Калининой Т. И.

Таблица 1.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕС1СИХ ПЕПТИДОВ С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С

1 1 СЫВ0Р0Т1Ш* 1

1 1 количество 1 1 АНТИГЕНЫ 1 анти-HCV 1 1 (сывороток 1 количество 1 прореагировавших 1 с пептидами сывороток 1

I 1 1 абс. 1 в г 1

120-34 corel 18 1 18 1 100 1

121-34 corel 18 1 14 1 78 1

122-34 corel 18 1 13 1 72 1

1 HCCAR 1 18 1 18 1 100 1

* 5 образцов сывороток здоровых доноров и 9 образцов сывороток больных гепатитом А с исследованными пептидами и HCcAg не взаимодействовали.

Результаты ИФА (табл. 1) показали, что пептид 20-34 реагировал со всеми исследоваными сыворотками, а его "укороченные" варианты 21-34 и 22-34 - с частью из них. Эти данные предполагают, что пептид 20-34 включает в себя иммунодоминантный сайт, структура которого, видимо, нарушается при удалении двух аминокислотных остатков с N-конца цепи.

Антигенная активность пептида 20-34 исследовалась в сравнении с активностью рекомбинантного антигена с22-3 из тест-системы "RIBA-И" на панели анти-НСУ+ -сывороток ("0RTH0-1", "RIBA-II") больных с острым (ОГС) и хроническим (ХГС) гепатитом С.

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что антигенная активность пептида 20-34 коррелировала с активностью в иммуноблоте рекомбинантного антигена с22-3. Пептид 20-34 взаимодействовал в ИФА с 19 из 23 анти-НСУ-позитивных сывороток, что составило 83Z.

Таблица 2.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДА 20-34 И РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА с22-3 С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С ПО ДАННЫМ ИФА И ИММУНОБЛОТИНГА*

I Антигены 1 Сыворотки больных 0ГС1 Сыворотки больных ХГС 1

1 11 2 3 4 5 1 6 7 8 9 10 11 12 131

1 20-34 1 4+ 3+ 1+ 4+ +/- 1 1+ 4+ отр 4+ 4+ 4+ +/- 4+1

1 С22-3 1 4+ 4+ отр 4+ 2+ 1 4+ 4+ 1+ 4+ 4+ 4+ отр 4+1

1 Антигены! Сыворотки больных ХГС 1

i 1 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 I

1 20-34 1+/- 4+ 2+ 4+ 4+ 3+ 4+ 4+ 1+ 1+ 1

1 с22-3 1 1+ н/а н/а н/а н/а н/а н/а н/а н/а н/а!

* количественная оценка результатов исследования сывороток в "RIBA-II"-тесте проводилась согласно рекомендациям фирмы "Chiron Corporation".

Высокая антигенная активность г.ептида 20-34 подтвердилась другой серией опытов по изучению способности ряда синтетических пептидов из состава белка core HCV взаимодействовать в ИФА с анти-НСУ+ -сыворотками ("RIBA-II", "INNO-LIA АЬ III") (табл. 3).

Таблица 3.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДА 20-34 С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С.

1 Сыворотки 1

! общее 1 количество 1 количество I

1 количество 1 антп-core- 1 позитивных 1

! сывороток 1 позитивных 1 с пептидом !

1 17 1 14/17 (827.) 1 11/17 (65/01

Полученные нами результаты согласуются с данными, представленными в работах Nasoff et al. (1991), Chiba et al. (1991) и Salberg el al. (1992), в которых продемонстрирована реактивность большинства antl-HCV-позитивных сывороток с первыми 38 а.о. белка core.

С целью идентификации сайтов узнавания внутри области 39-75 был осуществлен синтез серии пептидных фрагментов, отвечающих а.о. 39-75, 45-75, 51-75, 58-75 и 63-75. Антигенная активность получен-

ных пептидов была исследована в ИФА по их взаимодействию с ан-ти-НСУ-позитивными сыворотками ("RIBA-11", "INNO-LIA Ab III").

Таблица 4. ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИ-HCV-АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С С ПОМОЩЬЮ ПЕПТИДОВ ИЗ ОБЛАСТИ 39-75 БЕЛКА CORE HCY

1 Пептиды — 1--------------1 JРезультаты ИФА1

1 39-75 I 11/15 (64.7%)1

1 45-75 1 11/15 (64.72)1

1 51-75 1 9/15 (60.02)1

1 58-75 i 2/15 (13.32)1

1. 63-75 1 0/15 (0.02) 1 -1--------------1

Из данных, представленных в таблице 4, следует, что наибольшей, причем, равной в процентном отношении (73.3%) активностью обладают пептиды 39-75 и 45-75. Это может говорить о том, что участок 39-44 не содержит индивидуального сайта связывания с ан-ти-core-антителами. Поскольку пептид 63-75 не прореагировал ни с одной из анти-HCcAg-позитивных сывороток, то можно сделать вывод, что область а.о. 63-75 не участвует в формировании антигенной структуры соге-белка HCV. • Таким образом, наиболее перспективным в антигенном отношении, на наш взгляд, представляется район 45-58 нуклеокапсид-ного белка HCV.

Еще один иммунодоминантный В-зпитоп в составе HCcAg был идентифицирован с помощью синтетических пептидов, отвечающих а.о. 110-116, соответствующих изолятам HCV с субтипом la (TDPRRRS-OH) и 2а (NDPRHRS-Cys(Acm)-OH). Антигенная активность пептидов изучалась в ИФА с анти-HCV-позитивными сыворотками ("R1BA-1Í", "INNO-LIA АЬ III") (табл. 5).

Таблица 5.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДОВ 110-116 (1а) И 110-116 (lb) С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С.

J_Сыворотки_[

1 общее 1 количество 1 количество 1 количество 1

1 количество 1 анти-соге- 1 позитивных 1 позитивных 1

1 сывороток 1 позитивных 1с пептидом 11с пептидом III

1 17 I 14/17 (822) 1 8/17 (472) 1 8/17 (472)1

Примечание: 6 сывороток из 17 взаимодействовали только с пептидом 110-116 (субтип 1а), либо с пептидом 110-116 (субтип 2а). Результаты, представленные в таблице 5, позволяют сделать вывод о том, что участок 110-116 НСсАв соответствует одному из анги-

генных эпитопов белка core. Это заключение согласуется с данными, полученными Salberp et al. (1992), которые показали, что участок 101-118 является одним из иммунодоминантных районов HCcAg.

Интересным представляется вопрос о том, чем обусловлено различие во взаимодействии пептидов TDPRRRS-OH (1а) и NDPRHRS-Cys(Acm)-OH (2а) с теми или иными сыворотками панели и, в то же время, одинаковый суммарный процент выявления анти-HCV-антител. Можно предположить, что аминокислотные замены замены Thr на Asn и Arg на His в положениях 110 и 114, соответственно (рис. 2), являются типоспецифичными и для серотипирования HCV-инфекции можно использовать пептиды, отвечающие а.о. 110-116 соге-белка HCV и относящиеся к различным генотипам.

Идентификация антителосвязывающих сайтов в составе неструктурных белков NS3 и NS5.

При анализе литературы мы не обнаружили конкретных данных о локализации линейных В-зпитопов в составе белков NS3 и NS5 HCV. Поэтому выбор пептидных фрагментов для синтеза и иммунологических исследований был обусловлен исключительно уникальностью их аминокислотных последовательностей, содержащих консенсусный мотив -DP-X-Y-R-, и идентичной вторичной структурой, предполагающей образованиеу?-изгиба в районе остатка Pro, приводящего к формированию квазициклической структуры, стабилизированной за счет противоположно заряженных боковых ионогрупп Asp (-) и Arg (+).

На панелях анти-HCV-позитивных сывороток ("INNO-LIA Ab III", "ORTHO-1", "RIBA-II"), содержащих, соответственно 17, 18 и 20 сывороток, исследовалась антигенная активность пяти пептидных фрагментов белка NS3 - SKAHGlDPNIRTGV-Cys(Acm)-OH, GlDPNIRTGY-Cys(Acm)-ОН, GIEPNIRTGY-Cys(Acm)-NH2, IEPNIRT-NHj, IDPNIRT-OH, IDPNIRT-NH,, пептида LDPQARV-OH из состава белка NS5 и двух пептидов TDPRRRS-OH и NDPRHRS-Cys(Acm)-ОН, отвечающих а.о. 110-116 белка core HCV (суб. типы 1а и 2а, соответственно). Результаты ИФА представлены в таблице 6.

Из данных, представленных в таблице 6, следует, что все пептиды антигенно активны, причем, было отмечено, что замена остатка Asp на Glu в положении 1275, соответствующая японскому изоляту HCV-J приводит к снижению иммунореактивности в пептидах одинаковой длины. В ходе эксперимента было показано, что использование амидов пептидов позволяет добиваться более высокого сигнала в ИФА. По-видимому,

амиды пептидов лучше имитируют соответствующие участки белковой последовательности, а отсутствие отрицательного заряда на С-конце молекулы усиливает их сорбционную способность, что особенно важно при использовании коротких пептидов в качестве антигенов п твердофазном ИФА. Так, пептид ЮРНШТ-НН^ реагировал с 13/20 сывороток, а его "кислый" аналог ЮРЫШТ-ОН - с 7/20. Пептиды 1269-1282 и 1273-1282 оказались менее иммунореактивны в отношении анти-НСV-антител, чем их короткие аналоги (а.о. 1274-1280). Можно предположить, что длина пептидов в 7 а.о., включающих структуру -О-Р-Х-У-И-(-Е-Р-Х-У-И-), является предпочтительной для данного рода антигенных детерминант.

Таблица б.

ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИ-НСУ-АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С С ПОМОЩЬЮ ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ КОНСЕНСУСНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

-Азр-Рго-Х-У-Агг-

1БЕЛОК 1 ПЕПТИДЫ СЫВОРОТКИ 1

1 СОКЕ 1 ЮР!?1Ж5-0Н 8/17 47.07. 1

1 1 NDPRHRS-Cvs(Acm)-OH 8/17 47.02 1

1 N53 1 КАН31БРШКТ6У-Суз(Аст)-0Н 6/18 33.37. 1

1 1 С1ПРЫ1ЮТУ-Суэ(Аст)-ОН 4/18 22.27. 1

1 1 С1ЕРЫ1ЮТУ-Сув(Аст)- 2/18 11.17. 1

1 1 1ЕРМКТ-ЫН2 5/20 25.07. 1

1 1 ЮРЫ 1ИТ-0Н 7/20 35.07. 1

1 1 ЮРЫНГГ-МНд. 13/20 65.ОХ 1

1 N55 1 ЬБРОА1*У-ОН 9/20 45.07. 1

В отношении пептида 2665-2671 из состава белка N55, взаимодействующего с 9/20 сывороток панели В, можно сделать предположительный вывод о том, что он является одним из В-эпитопов в белке N55, который требует дальнейшей характеристики.

Идентификация антигенных детерминант в белке N54.

С целью детального изучения антигенной композиции области 5-1-1, ограниченной а.о. 1689-1740 (рис. 1), были синтезированы пептидные фрагменты 1689-1707, 1693-1707, 1700-1711 из Ы-концевой и 1713-1731, 1711-1732 (1а) , 1711-1732 (1Ь) из С-концевой частей об-, ласти 5-1-1. Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов соответствовали изоляту-прототипу НСУ-1 (субтип 1а), исключе-

пие составляли пептиды 1713-1731 и 1711-1732 (lb), синтезированные по секвенсу изолята HCV-J (субтип lb) (рис. 2).

Антигенная активность синтетических пептидов оценивалась в ИФА по степени их взаимодействия с анти-Ю+ -сыворотками ("0RTH0-1", "RIBA-II") больных ОГС и ХГС. Все пептиды проявили значимую антигенную активность. В таблице 7 представлены результаты ИФА для наиболее активных пептидов.

Таблица 7.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ ИЗ ОБЛАСТИ 5-1-1 HCV С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С ПО ДАНИИЛ ИФА

i--------------------------1---------------1

I АНАЛИЗ I АНТИГЕНЫ I СЫВОРОТКИ I

I----------1-----------------1-------1-------J

I I 1689-1707 I 14/29 1 48.3% I

I ИФА I 1700-1711 I 16/29 I 55.2% 1

I I 1711-1732 (la) 1 21/29 I 72.4% 1

I I 1711-1732 (lb) Г 24/29 I 02.8% I

I----------1-----------------1-------1-------1

1ИММУНОБЛОТI 5-1-1 (RIBA—II) I 29/29 I 100.0%1

I----------1-----------------1-------1-------1

Полученные результаты позволяют заключить, что индивидуальные сайты узнавания специфическими анти-HCV-антителами локализуются по всей длине области 5-1-1, а наибольшей антителосвязывающей способностью обладает пептид, отвечающий аминокислотной последовательности 1711-1732 HCV с субтипом lb.

Наши результаты согласуются с данными, полученными Cerlno et al. (1991), Salberg et al. (1992), Nemecek et al. (1993).

Изучалось влияние аминокислотных замен на участке 1711-1732-на специфическую антигенную активность соответствующих пептидов в ИФА на панели анти-НСУ+ -сывороток ("ORTHO-I"), генотипированных с использованием метода PCR (генотипирование проводил д.б.н. Вязов С.О.). Из данных, представленных в таблице 8, следует что использование пептидов с вариабельными а.о. в положениях 1713 (Gln/Ser) и 1723 (Met/Gin) лишь в отдельных случаях позволяет серотипировать сыворотки, содержащие вирус с субтипами 1а и lb. Учитывая тот факт, что процент гомологии между субтипами значительно выше, чем между отдельными типами HCV, можно предположить, что с помощью инвариантных по аминокислотной последовательности пептидных фрагмен-

тов 1711-1732, соответствующих различным типам Ю, можно будет с большей эффективностью различать генотипические варианты вируса, определяемого в сыворотках крови.

Таблица 8.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДОВ С ГЕНОТИП-СПЕЦИФИЧЕСКИМИ СЫВОРОТКАМИ БОЛЬНЫХ ОГС.

I I___Сыворотки_

I Пептиды I с субтипом HCY la I с субтипом HCV Ib

I_IвсегоIкол-во позитивных!всего!кол-во позитивных

11711-1732 (la)1 5 1 2 1 11 1 7 1

11711-1732 (1Ь)1 5 1 0 1 11 1 8 1

На панели анти-НСУ+ -сывороток ("RIBA-II") исследовалась в ИФА антигенная активность пептида 1921-1940 и его N- и С-концевых фрагментов 1921-1940, 1926-1940 и 1930-1940.

Таблица 9.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С ПО ДАННШ ИФА

IАнтигены IСыворотки больных ОГС! Сыворотки больных ХГС I

1 112 3 4 5 1 1 6 7 8 9 10 11 12 1

11921-19311отр 3+ отр 2+ отр ! 1 отр отр отр отр отр 3+ 2+ 1

11926-19401 4+ 3+ отр 4+ отр 1 1 отр 4+ отр 4+ отр 4+ отр!

11930-19401 4+ 2+ отр 3+ отр 1 1 отр 4+ отр 4+ отр 4+ отр!

11921-19401 4+ 4+ отр 4+ 4+ 1 1 отр 4+ отр 4+ отр 4+ 31- 1

1 ClOO-3* 1 4+ отр 1*■ 4+ отр 1 1 отр 4+ отр 4* отр 4+ 1+ 1

IАнтигены J_ Сыворотки больных ХГС_[

J_I 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 I

11921-19311 отр отр отр 3+ отр отр 3+ отр отр 2+ отр! 11926-19401 1+ отр 4+ 4-ь отр отр 4+ отр отр 4+ 4+ I 11930-19401 отр отр отр 4+ отр отр 4+ отр отр 3+ 2+ I 11921-19401 отр отр 4+ 4+ отр 4+ 4ч- отр отр 3+ 4+ I I clOO-3* 1 1+ отр н/а н/а н/а н/а н/а н/а н/а н/а н/а!

* Данные иммуноблотинга сывороток с рекомбинантным антигеном с100-3 из тест-системы "RIBA-II".

Результаты исследования (табл. 9) показали, что активность синтетических пептидов достаточно высока и сравнима с активностью

рекомбинантного антигена с100-3. Было отмечено, что антителосвязы-вающая способность С-концевых фрагментов участка 1921-1940 выше, чем N-концевого фрагмента 1921-1931, хотя в одном случае имеется исключение - с сывороткой 12 взаимодействует полноразмерныР (1921-1940) и N-концевой (19.21-1931) пептиды, в то время как фрагменты 1926-1940 и 1930-1940 демонстрируют негативную реакцию. Полученные данные позволяют предполагать наличие на участке 1921-194С белка NS4 HCV по крайней мере двух индивидуальных сайтов связывания с анти-НСУ-антителами. Положительная реакция с пептидами сывороток 2 и 5, не взаимодействующих в иммуноблотинге с антигеном сЮО-З, свидетельствует о диагностической значимости С-концевой части белкг NS4, не входящей в область сЮО-З, оканчивающейся 1930-м а.о., к предполагают участие фрагмента 1931-1940 в формировании антигенной структуры белка NS4.

Конструирование диагностикума HCV-инфекции на основе использования синтетических пептидных антигенов.

Идея создания нового диагностикума HCV-инфекции на основе рекомбинантного полноразмерного нуклеокапсидного белка (HCcAg) и синтетических пептидов заключалась в получении антигенной смеси, сохраняющей свойства как HCcAg, так и пептидов специфически, но с более высокой эффективностью взаимодействовать с антителами к HCV, чем отдельно взятые антигены. Учитывая результаты исследований, описанные выше, в качестве потенциальных компонентов новой антигенной смеси использовали пептиды из состава белка NS4 (как из обласп 5-1-1, так и из С-концевой части, граничащей с областью с100-3).

Были подобраны оптимальные условия (концентрации компонентов, температурный режим, рН) инкубации антигенной смеси на твердой фазе (полистирольные планшеты).

Скрининг проводился на панели, намеренно составленной из сывороток, негативных или слабо положительных в иммуноблоте с отдельными антигенами из тест-системы "RIBA-II" с целью продемонстрировав преимущества использования новой антигенной смеси перед монокомпонентными антигенами и оценить вклад каждого компонента.

Было показано, что смесь пептидов 1711-1732 (Ib) и 1921-194С может быть использована в ИФА с большей эффективностью, чем антигены 5-1-1 и сЮО-З в иммуноблоте для выявления анти-HCV-антител i

сыворотках данной панели (табл. 10), а исследование свойств трех-компонентной антигенной смеси позволило сделать вывод о том, что при добавлении к рекомбинантному HCcAg синтетических пептидов значительно повышается эффективность системы скрининга, поскольку становится возможным выявлять сыворотки, негативные, либо слабо положительные по одному НСсАе (табл. 11).

Таблица 10.

ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К БЕЛКУ N34 НСУ С ПОМОЩЬЮ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ I И II И. РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ 5-1-1 И сЮО-З

1 Сыворотки 1 Иммуноблотинг ИФА 1

1 Ш 1Шифр1 Рекомбинантные Пептид I Пептид II Пептидная 1

1 1 1 антигены ("МВА-П") 1711-1732 1921-1940 смесь 1

1 1 1 5-1-1 1 сЮО-З (1Ь) 1

1 1 1 1ВВ1 отр 1 4+ отр 4+ 4+ 1

I 2 1 ЗВВ1 отр 1 +/- отр 1+ 1+ 1

1 3 110ВВ1 отр 1 отр 1+ 3+ 2+ 1

1 4 113ВВ1 4+ 1 4+ 2+ 3+ 3+ 1

1 5 115ВВ.1 4+ 1 4+ 4+ 4+ 4+ 1

1 6 117ВВ1 4+ 1 +/- 1+ 4+ 4+ 1

1 7 122ВВ1 4+ 1 4+ 1+ 4+ 4+ 1

1 8 125ВВ1 2+ 1 2+ 2+ 3+ 4+ 1

1 9 131ВВ1 4+ 1 4+ 4+ 4+ 3+ 1

110 1 1531 3+ 1 +/- 1+ 4+ 3+ 1

111 1 1611 3+ 1 3+ 1+ 4+ 4+ 1

112 1 1641 3+ 1 1+ 4+ 4+ 4+ 1

113 1 2111 1+ 1 1+- 1+ 3+ 3+ 1

Таблица il.

ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К БЕЛКАМ HCY С ПОМОЩЬЮ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ* 1 И II И РЕКОМБИНАНТНОГО HCcAg**

IClJBOpOTKHl Иммуноблотинг "RIBA- II" ИФА 1

1 №1 1 1 Шифр 1 Рекомбинантные антигены HCcAg 1Антигенная! 1 смесь***I

1 1 5-1-1 lclOO-3 1 сЗЗс C22-3

1 1 1 1BBI отр 1 4+ 1 4+ отр отр 1 4+ 1

1 2 1 3BBI отр 1 +/- 1 2+ отр отр 1 1+ 1

1 3 I10BBI отр 1 отр 1 +/- +/- 1+ 1 3+ I

1 4 I13BBI 4+ 1 4+ 1 4+ ' 4+ 2+ 1 3+ . 1

1 5 I15BBI 4+ 1 4+ 1 4+ 4+ 4+ 1 4+ 1

1 6 I17BBI отр 1 +/- 1 4+ 4+ 4+ 1 4+ I

1 7 I22BBI 4+ 1 4+ 1 4+ отр +/- 1 4+ 1

1 8 I25BBI 2+ 1 2+ 1 2+ +/- отр 1 3+ 1

1 9 I31BBI 4+ 1 4+ 1 4+ 2+ 2+ 1 4+ 1

НО 1 1531 3+ 1 +/- 1 3+ 3+ 1+ 1 3+ 1

111 1 1611 3+ 1 3+ 1 4+ 4+ 2+ 1 4+ 1

112 1 1641 3+ 1 1+ 1 4+ отр 1+ 1 4+ 1

113 1 2111 1+ 11+ 1 2+ отр +/- 1 4+ !

* Пептид I - 1711-1732, соответствующий изолятам HCV с субтипом Ib,

Пептид II - 1921-1940. ** HCcAg - рекомбинантный полноразмерный (1-192 а.о.) белок con

вируса гепатита С. *** Оптимальная рабочая смесь пептидов и HCcAg.

Таким образом, для практического использования в скрининге ан ти-НСУ-антител была предложена антигенная смесь, содержащая рекомбинантный HCcAg и синтетические олигопептиды, отвечающие а. о 1711-1732 и 1921-1940 белка NS4 HCV. По проделанной работе подан авторская заявка в Патентное ведомство Российской Федерации с прио ритетом от 20.10.1994 г.

ВЫВОДЫ.

1. Твердофазным методом синтезированы 28 пептидов из состава белка core и неструктурных белков NS3, NS4 и NS5, аминокислотная последовательность которых соответствует изолятам HCV с субтипами la, lb, 2а, 2Ь, из них 26 ранее не были описаны.

2. Исследованы антигенные свойства пептидов в твердофазном ИФА на панелях HCY-положительных и HCV-отрицательных сывороток и выявлены пептиды, позволяющие с высокими чувствительностью и специфичностью определять антитела к HCV.

3. Изучена. антигенная структура районов, ограниченных а.о. 20-34 и 39-75 белка core и а.о. 1689-1732, соответствующего области 5-1-1 белка NS4 HCV. Продемонстрированы возможности выявления анти-НСУ-антител с помощью пептидов - фрагментов исследованных областей. Показано, что сайты узнавания анти-НСУ-антителами локализу-. ются по всей длине области 5-1-1, а наибольшей антителосвязыващей способностью обладает олигопептид, соответствующий изолятам HCV с субтипом lb и ограниченный а.о. 1711-1732.

4. Продемонстрирована высокая диагностическая значимость района, ограниченного а.о. 1930-1940, не входящего в область с100-3. Показано, что с помощью пептида, соответствующего а.о. 1921-1940, и его фрагментов можно определять в крови анти-HCV-антитела, которые не выявляет рекомбинантный антиген с100-3.

5. Локализованы не описанные ранее В-зпитопы, соответствующие районам 110-116 белка core, 1274-1280 белка NS3 и 2665-2671 белка NS5, которые содержат консенсусный мотив -Asp-Pro-X-Y-Arg- в аминокислотной последовательности и обладают идентичной вторичной структурой. Установлены отличия в антигенной активности пептидов 110-116 и 1274-1280, соответствующих различным субтипам HCV.

6. Разработан новый способ диагностики HCV-инфекции на основе использования в качестве антигена для иммуноферментного скрининга анти-НСУ-антител смеси рекомбинантного HCcAg и синтетических олиго-пептидов, соответствующих а.о. 1711-1732 и 1921-1940 белка NS4 HCV.

- го -

Список научных трудов по теме диссертации.

1. Семилетов Ю.Л., Фирсова Т.В., Кузин С.Н., Шибнев В.А., Вязов С. О. Антигенная активность синтетических пептидов - фрагментов белков вируса гепатита С. //Докл. Акад. Наук. 1993. Т. 333. N 3. С. 395-397.

2. Семилетов Ю.А., Фирсова Т.В., Шибнев В.А., Вязов С.О. Синтез и антигенная активность пептидов из состава core- и NS3- белков вируса гепатита С. //Биоорган, химия. 1993. Т. 19. N 1. С. 126-129.

3. Семилетов Ю.А., Фирсова Т.В., Кузин С.Н., Худяков Ю.Е., Шибнев В. А. Синтез и антигенная активность пептидов из С-концевой части неструктурного И34-белка вируса гепатита С. //Биоорган, -химия, 1993, Т. 19, No. 11, С. 1136-1139.

4. Semtletov Yu., Vlazov S., Firsova Т., Lvov D. Identification of an Immunodominant epitope In NS3 protein of HCV. //International Symposium on Viral Hepatlties and Liver Desease. Abstract Volum. 1993. Tokyo. P. 185.

5. Семилетов Ю. A., Фирсова T.B. Эпитопное картирование области 5-1-1 белка NS4 вируса гепатита С. //Тезисы докладов Научно-практической конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии". Санкт-Петербург, май 1993 г. , ч. 2, С. 111.

6. Фирсова Т.В., Семилетов Ю.А., Кузин С.Н. Возможности использования синтетических пептидов в диагностике вирусного гепатита С. //Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики". Пермь, 3993 г. С. 128-129.

7. Семилетов Ю.А., Фирсова Т.В. Идентификация антигенных сайтов области 5-1-1 вируса гепатита С. //Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы разработки препгфатов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики". Пермь, 1993 г. С. 112-113.

S. Фирсова Т.Е. Синтез и исследование иммунологических свойств пептидов из состава CORE и NS3 белков вируса гепатита С. //Тезисы докладов Научной конференции молодых ученых России, посвященной 50-летию Академии медицинских наук. Москва, 1994 г. С. 451-452.

т.,. Ю.

д.«- v<*j

р.№. ■ »■«• Ц tj.iU,

WifH Xflllclllnn*H упрмдгкяя Мш1д;ш Гк»1