Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ структурной организации капсидных белков и идентификация антигенных детерминант вируса гепатита А

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ структурной организации капсидных белков и идентификация антигенных детерминант вируса гепатита А"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ имени Д. И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи УДК 578.74.835 547.96.057

П ЕЛЕЦКАЯ Елена Николаевна

АНАЛИЗ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КАПСИДНЫХ БЕЛКОВ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУСА ГЕПАТИТА А

03.00.03 — Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА, 1988

Работа выполнена в институте Вирусологии имени

Д. И. Ивановского АМН СССР

Научный руководитель — доктор биологических наук Ме-

сянжинов В. В.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук Вязов С. О.

доктор химических наук Шибнев В. А.

Ведущая организация: Межфакультетская проблемная

научно-исследовательская лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии имени А. Н. Белозерского МГУ имени М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится ^00 /£¿¡(¿л&^урл 1988 года на заседании специализированного Совета в Институте вирусологии имени Д. И. Ивановского АМН СССР (Москва, ул. Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии имени Д. И. Ивановского АМН СССР

Автореферат разослан_МХ/-Я с-/?^_ 1988 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат медицинских наук

ЖУКОВСКИЙ А. М.

.^^ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

",ол I

Актуальность проблемы.

Вирус гепатита А человека (ВГА), вызывающий инфекционый гепатит А,- представитель большого семейства Picornaviridae, отнесенный на основе морфологических, биохимических и биофизических свойств к группе энтеровирусов [Berkoff,1986].

В настоящее время основные меры профилактики гепатита А, помимо санитарно- гигиенических, основаны на пассивной иммунизации иммунным сывороточным альбумином. Низкая продуктивность при выращивании вируса в культуре клеток и отсутствие надежных^маркеров аттенуиро-вания создают трудности в использовании традиционных методов разработки вакцинных препаратов. Применение убитой вакцины будет несомненно сдерживаться высокой стоимостью препаратов. Установлено также, что интактный вирион существенно отличается по антигенной специфичности от всех видов предшественников, участвующих в сборке ВГА, и отдельных капсидных белков. Поэтому, генноинженерные. подходы, использующие клонирование и экспрессию как отдельных белков, так и участка вирусного генома, кодирующего все капсидные белки ВГА, по-видимому, малоперспективны. В качестве альтернативы для наработки протективных антигенов рассматривается возможность использования подходов белковой инженерии для конструирования эпитопов, отвечающих за нейтрализацию ВГА.

В данной работе была предсказана структурная организация капсид- , ных белков ВГА и отмечены участки полипептидных цепей, которые могут входить в состав нейтрализующих антигенных детерминант. Затем были синтезированы олигопептиды, ряд из которых проявил способность индуцировать вирусспецифические антитела к ВГА.

1.2. Цели и задачи исследования.

Основной целью данной работы явился анализ структурной организации капсидных белков ВГА на основе имеющихся данных об их аминокислотных последовательностях и результатов рентгеноструктурного исследования ряда родственных пикорнавирусов. Таким путем мы хотели определить участки полипептидных цепей, которые могут находится на поверхности капсида и входить в состав нейтрализующих детерминант.

В процессе работы предстояло также осуществить химический синтез . ряда олигопептидов, соответствующих предсказанным поверхностным

эпитопам, получить коньюгаты этих олигопептйдов с высокополимерными носителями и провести их иммунологическое тестирование.

Работа выполнена в рамках научного проекта Всемирной Организации Здравоохранения "Идентификация антигеннных детерминант и экспрессия доменов структурных белков вируса гепатита А в составе гибридных белков" (грант N 24/181/11 на 1987-1989 г.г., научный руководитель - В.В.Месянжинов).

1.3.Научная новизна работы.

На основе компьютерных и стереохимических расчетов структуры с учетом выравнивания аминокислотных последовательностей белков ВГА и большого числа других пикорнавирусов впервые показано, что вторичная структура белков ВГА хорошо вписывается в общую схему строения бета-структурных белков пикорнавирусов, установленную рентгенострук-турным анализом для полиовируса 1 типа, риновируса человека, тип 14, и вируса Менго. Построение модели пространственной организации белков ВГА дало возможность указать участки белков, которые должны находиться на поверхности решетки капсида.

Основываясь на данных гомологии упорядоченных участков капсидных белков и изучении локальной супервторичной структуры участка автокаталитического расщепления белка VP0 сделано заключение о возможности выделения ВГА в самостоятельный род сем. Picornaviridae.

При исследовании взаимодействия синтетических олигопептидов с антителами против ВГА из сывороток реконвалесцентов был локализован один из участков VP3, который, вероятно, входит в состав сложного иммунодоминантного эпитопа вируса. Впервые было обнаружено, что антитела против олигопептида, соответствующего предсказанному эпитопу VP3 ВГА способны связывать нативный вирус гепатита А.

1.4. Научная и практическая ценность работы.

Использованные в данной работе подходы к исследованию структурной организации белков ВГА могут быть использованы для изучения структуры полипептидов других вирусов и предсказания их антигенных детерминант. Полученные данные о наличии специфического взаимодействия анти-ВГА иммуноглобулинов с синтетическими олигопаптидами и антител против соответствующих пептидов с нативным вирусом гепатита А могут быть использованы в дальнейшем для разработки доступных средств диагностики гепатита А на основе химически синтезированных пептидов или с помощью белковой инженерии.

- 5 -

1.5.Основные положения, выносимые на защиту.

1. Капсидные белки ВГА являются типичными представителями обширного класса белков с двухслойной бета-структурной организацией и во многом сходны с соответствующими белками других пикорнавирусов, что следует из компьютерных и стереохимических расчетов их вторичной структуры и анализа локальных гомологий белковых последовательностей ВГА с другими пикорнавирусами.

2. Исходя из анализа множественных выравниваний аминокислотных последовательностей капсидных белков пикорнавирусов с учетом вторичной структуры и особенностей локальной супервторичной структуры участка автопротеолиза белка VF0, вирус гепатита А может быть выделен в самостоятельный род семейства Picornaviridae.

3. По данным РИА обнаружено взаимодействие синтетических олиго-пептидов, соответствующих участку аминокислотной последовательности белка VP3 ВГА (остатки 80-85 и 76-85) и их конъюгагов с БСА с антителами против ВГА из сывороток реконвалесцентов. Обнаружено также специфическое взаимодействие соответствующих противопептидных антител из сывороток кроликов с вирусом гепатита А с помощью РИА.

1.6. Апробация работы.

Результаты работы доложнены на конференции молодых ученых в декабре 1987 в ин-те Вирусологии на тему: "Структурный анализ капид-ных белков ВГА", на VII Всесоюзной конференции по химии белков и пептидов в г.Таллине, октябрь 1987, на тему "Модель пространственной структуры капсидных белков Еируса гепатита А и распределения поверхностных антигенных детерминант"; на международном симпозиуме по молекулярной биологии пикорнавирусов, Москва, май 1988, "The analysis of the HAV capsid proteins structure"; на международной конференции по молекулярной вирусологии СПИД, гриппа и гепатитов, Суздаль, сентябрь 1988, на тему: "Структурный анализ и иммунологические свойства капсидных белков вируса гепатита А". По теме диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы 5 докладов.

1.7. Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, разделов "Теоретическая часть", "Экспериментальная часть", "Обсуждение", выводов и списка цитируемой литературы. Литературный обзор содержит данные о молекулярной организации пикорнавирусов, в том числе ВГА,

и их антигенной структуре. Раздел "Теоретическая часть" посвящен структурному анализу капсидных белков ВГА и выявлению предполагаемых антигенных детерминант. "Экспериментальная часть" состоит из двух глав: "Материалы и методы" и "Результаты работы", в них описан химический синтез ряда олигопептидов, соответствующих поверхностным участкам капсидных белков ВГА и их иммунологическое тестирование. В главе "Обсуждение" изложено обсуждение и анализ результатов работы. В конце диссертации сделаны краткие выводы.

II. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

II.1. Анализ структурной организации капсидных белков ВГА.

На основе расчетов вторичной структуры аминокислотных последовательностей с помощью компьютерного и стереохимического анализа мы впервые показали, что капсидные белки вируса гепатита А (ВГА) являются типичными представителями большого семейства белков с антипараллельной бислойной бета-структурой. Автор благодарен за помощь при расчетах сотрудников института Белка АН СССР А.В.Ефимова и А.В.Финкельштейна.

Аминокислотные последовательности белков ВГА были'выравнены по вторичной структуре с капсидными белками полиовируса 1 типа (Mahoney), риновируса человека, тип 14 и вируса Менго, для которых известны данные рентгеноструктурного анализа. Использование родственных белков в качестве матрицы для выравнивания позволило нам: во-первых, локализовать расположение каждого из альфа- и бета-участков в архитектуре белковых молекул ВГА и, во-вторых,- обнаружить гомологии аминокислотных последовательностей соответствующих участков вторичной структуры. Полученные данные позволили нам представить модель пространственной организации для белков ВГА и отметить последовательности, являющиеся потенциальными кандидатами на нейтрализующие эпитопы вируса.

Анализ распределения элементов вторичной структуры вдоль полипептидных цепей капсидных белков различных пикорнавирусов позволил сделать следующие заключения:

во-первых, у каждого белка с высокой достоверностью выявляется не менее 8 протяженных бета-структурных тяжей, содержащих около трети всех аминокислотных остатков; альфа-спиральных участков мало (Рис. 1);

во-вторых, у каждого из белков примерно в середине полипептид-

ной цепи выявляется мощный альфа-спиральный участок, что особенно свойственно вышеупомянутым вирусам человека и растений. Указанная альфа-спираль, обозначаемая как аА, обычно располагается.после второго бета-тяжа С. Учитывая расположение данной маркерной альфа-спи-Рисунок 1. Компьютерные графики расчета вторичной структуры кап-свдных белков: a-VPl ВГА; b-VPl полиовируса (тип 1, Mahoney); с-VP1 HRV-14; d - VP3 ВГА; е - VP0 ВГА. Графики получены при помощи программы "ALB" на ЭВМ ЕС-1040.

-О- --С20 • ■ -_—-...p...... -. <3

рали, мы предварительно идентифицировали бета-тяжи "структурных ядер" белков ВГА согласно установленной номенклатуре.

Выравнивание последовательностей базировалось на сопоставлении соответствующих альфа- и бета-структурных участков (предсказанных для белков ВГА и других пикорнавирусов и полученных из рентгеност-руктурного анализа для белков полио- и риновирусов, вируса Менго). При выравнивании белков по вторичной структуре выявились прямые го-■■j.-'.ui'ini лервичншХ структур многих упорядоченных участков селков ВГл и соответствующих им упорядоченных участков белкой других сравниваемых вирусов (Рис.2).

Расчеты показали, что имеется разная степень гомологии структурированных участков капсидных белков ВГА с соответствующими им белками других пикорнавирусов. Для VP1 наибольшая гомология.наблюдается с белками кардиовирусов, для VP2 и VP3 - примерно одинаково гомологичны белкам энтеро- и риновирусов, гомология же с VP3 афто-и кардиовирусов выражена значительно слабее.

Таблица 1. Сравнение гомологий аминокислотных последовательностей капсидных белков ВГА и других пикорнавирусов.

|\белок I \ I \ |род \ 1 гомология с соответствую- | щим белком ВГА,% | _ ._ 1

VP1 | VP2 1 VP3 | 1

|Entero 36,08% | 39,27% 44,00% |

|Rhino 35,65% | 39,18% 45,50% |

|Aphto 37,82% | 31,05% 34,00% |

|Cardio 1-------- 39,13% | 38,35% 40,80% | ---------1

На основе предсказаний вторичной структуры и рентгеноструктурных данных для родственных вирусов была построена схематическая модель пространственной организации капсидных белков ВГА.

Исходя из предполагаемой двухслойной структуры белков ВГА, и ' принимая в расчет данные о расположении антигенных детерминант других пикорнавирусов, можно указать на несколько участков, которые потенциально могут находиться на поверхности вирусного капсида. В перечень возможных антигенных детерминант мы включаем:

Рис.2. Выравнивание аминокислотных последовательностей пикорна-вирусов для белка УРЗ в области бета-тяжей В и С.

11111) 1111 M 1111111111111

HAV IpTlaaqfpfNasdsvgqqlkVipv------KYFfqmtntripDQkc- iTaLaalcQ 106

------ ------ ----- ###** *********

PV lM nHMPfdlsaTKMJt^YrV^^ 105 X-ray -----------------******** *******

PV IS IOTinlWdlsakXkHtMemYrVrl^dk^ 105 ----- -------******** *******

PV 2LaIETmIPlnltiiqrkNtmroYrVeL^^ 105 ----- -------******** *******

FV 23 XOTmlPlnltsqrrHtiUmYrVel^tahsdtP^^ 105 ----- -------******** *******

FV 3LeIOTmIPlnlesTRrNtMdmYrVtL6dsa^ 105 ----- -------******** *******

FV 3F IOTmIPlnlefrnCrNtmdmYrVrLGds;mlE 105 ----- -------******** *******

FV 3S IOTinlPlnlesTKrtitniiinYrVtLsdsadlBqPilcls^ 105 ----- -------******** *******

CV B1 vBsrinrl^mntdrmvffelkaYqii^ 105

CT B3 vDsvvPvqnvBeKvtfemeaYqipvrBnegsgtqvFgftiqRgyESvfsrTIljGEILN 105 ***---- ------ ~~-------- ***************

I-T------n----------V---------dp-£--------dq---T-L—I-q

B1 B2 C aA

I I I I I I 14+1 I I I I I I I I I I I I I I I

HAV ipTLaaqipfnasDsVagqikVUV------DpyFfqmTntnpDQkc-iTaLasIcQ 105

-------- ------ ----- ***** *********

IIRV2 VDsLvPiffinUtyijiserwisVvlq^ 104 — ***** ---- ------- *******

HRV14 VDTLiRnNNThtkDeVn—syllPltiani^neqvFgtnl-fi^BvfkwIjrjGEIvQ 102 X-ray — ***** —"" --------------*******

HRV89 WrLiPv№TrgGnvrnnmytvdlmvdl'akevFgipv-diasQplatTLiGE^ 103 — ***** ---- ------- *******

-TL--------d-v----vip------d—F--1----dQ---T-L—I-q

B1 B2 C aA

HAV xPTlazKjfpfnasdav&iqikVipvDpyffqratnt--npdQkciTaLAsIcQmf 108

EMDVAlOCPTFLrFdd------(MWVTrAMtrlLAkFDVSLAAKhMSNTyLGQIAQYY 99

FMDVA12CFIiT>cFdd-------GadVm-rtlHtrlLAkFDVSIiAAKhMSfflVLeQIASlYY 99

SMOTOlKCPTFLrFag-------GvFYVtTktDsdr»LAqEfti£LAAKQMSNTfLAQlAQYY 99

SSnuc -FT-------------G----V—D---------------q—T-La-I-Q—

B1 B2 C aA

11111 n 111111111111111 HAV IFTlaaqfpfNABctevgqqllrvipvdP---yffqmtnT-npdqkclTaLAsioqmF 108

my HTFiGNkmpNA---vFYIoAsN tavkTqpLa tYQVTTjSfSClAfrrfLMlGRNF 118

— ----- ----*********************

Mango IPTFiGMkmpNA--vFYIeAENtavkTqplavYQVTLSi^lANTfLAAlGEtlF 118

TMEBe lITFlG^tNnkr--ymsAtNs^aT-6im^QVaX£GSCtaANsmLAAvaI№ 119 — ----- —"*********************

cons IFT---------NA-------1------p--------T-------T-LA----F

B1 B2 C aA

а)участки полипептидных цепей, расположенные между двумя верхними бета-тяжами всех трех белков вируса. Из-за неоднозначности идентификации верхнего бета-тяжа В белка VP3 мы отметили два возможных района;

б)петли между бета-тяжами Н и I всех трех капсидных белков ВГА;

в)петли, соединяющие бета-тяжи Е1 и альфа-спирали аВ белков VP1 и VP3.

II.1.2.Особенности локальной супервторичной структуры участка автопротеолиза белка УРО.

Расщепление структурного полипептида VP0 на капсидные белки VP4 и VP2 у всех пикорнавирусов является завершающей стадией формирования вириона и осуществляется внутри собранного предшественника вири-она. Протеолиз VP0 индуцирует трансформацию предшественника вириона в зрелую вирусную частицу, которая сопровождается большими структурными перестройками капсидных белков, в том числе и изменениями анти-* генности поверхностных участков.

По-видимому, расщепление VP0 происходит автокаталитически с участием геномной РЖ вируса, которая, как полагают, может выступать акцептором протонов при разрыве пептидной связи. Очевидно, что для расщепления необходима высокая структурированность района протеолиза для обеспечения фиксированное™ аминокислотных остатков, между которыми осуществляется разрыв пептидной связи и их доступность для взаимодействия с РНК.

В связи с важностью проблемы автокатализа протеолиза белков представляется интересным понять структурные особенности участка расщепления VP0. Для трех пикорнавирусов (полиовирус тип 1, риновирус человека тип 14 и вирус Менго) установлена трехмерная структура на атомном уровне. Однако, ни белок VP4, ни аминоконцевая часть белка . VP2, находящиеся внутри капсида в неупорядоченном состоянии, не были разрешены и их структура осталась невыясненной. Поэтому, в данной работе мы с помощью стереохимического анализа изучили возможную вторичную структуру белков VP0 всех известных последовательностей пикорнавирусов вблизи участка расщепления. Результаты анализа и сравнения локальных гомологий последовательностей VP0 позволили нам сделать следующие заключения:

во-первых, очевидно, что в данном районе полипептидная цепь может формировать три сравнительно коротких альфа-спирали - al, а2, аЗ

- и -

СТЯЖАЮ ttntQшкiwFsklassaFtgl fgalLa

РШ)УА12 1; 1; 1^0ти1*Г5к1assaFtg1fgalLa

ИЯ)У01Б ttntQnndwFsklassaFsglfgalLa

ЕМСУ иу-(ЗГзп1Рзб-аУпаР5пт1-Р11,а

Mengo tyg-QfsnlLsg-aVnaFsшni-PlLa

ТМЕВеАН tIlg-glsniLgg-aanaFatma-PlLa

НАУСг326 gifqtvgsgldhilsLa

РоПоШ qdfsQdpskFte-pIkdVl iktaPmLn

РоПо1Б qdfsQdpskFte-pIkdУliktsPmLIl

Ро11о2Ьа qdfaQdpskFte-pIkdУl1к£аРШ1

Ро1 Ю2Б qdfaQdpskFte-pIkdVl 1к1аРтЬп

Ро11оЗЬе qdysQdpskFte-pLkdV11к1аРаЬп

РоИоЗК qdysQdpskFte-pLkdVl 1к1аРаЬп

Ро11оЗБ qdysQdpskFte-pLkdVliktaPaLn

СохВ1 qdftQdpqkFte-pУkdImiksmPaLn

СохВ1 qdftQdpqkFte-pVkdImikslPaLn

ВЕУ qdftQdpqkFtq-pIadViketavpLk

Ш2 leftQdpskFtd-pVkdУlekgiPtLq

Ш14 qs 1 smdpskFte-pVkdLml kgaPaLn НОТ89

а1

dkktEettlleDRI 1 игпСНгТзТПЗ акк*Ее**11ет11 игпОИТзТТд 1еБН1 ттСШ/ТвЩ dqntEemenlSDRVsqdTaGNtvtnTQ dqntEemenlSDRУsqdTaGNtvtnTQ dqntEemenlSDRVasdkaGNSatnTQ dieeEqmiqsvvRtavtgasyfTsvdQ 5ршЕас^уБтУЦ1Т1СК5'ПЩ 5рп1Еас-йуЯЖУЦ1Т1СНЗ,ПТТС5 5ршЕас-£у5уРУлк1тС№5'ПТТ<2 зршЕас^уЯЖУгщтСИЗ'ПТТСЗ зрпуЕас^уЗБНУИтСЫБ'П'Щ зрпуЕас-ЯуЯЖУи1Т1СНЗТПТ<5 ■ зрпуЕас^уЯЖУЦП'ЮНЗ'ПГПЗ 5рзаЕес-£у5тУг51Т1СНЗ:ПТТ13 sptvEec-gySDRarsiTlGNSTiTTQ spsaEec-gySDRVaqlTlGNSTiTTQ sptvEac-gySDRIiqiTrGDSTiTsQ spnvEac-gySDRVqqiTlGNSTiTTQ sptvEac-gySDRLiqiTrGDSTiТэ<3 а2 аЗ

Рис.4. Выравнивание аминокислотных последовательностей пикорнави русов вблизи участка расщепления белка УРО (пробел обозна чает сайт расщепления).

(Рис.3). У вируса ящура в спирали al находится 15 аминокислотных остатков, по 16-ти остатков с характерным профилем гидрофобных остатков содержится у вирусов Менго, энцефаломиокардита и вируса Тейлера. У остальных пикорнавирусов (ВГА, полиовирусы, вирусы Коксаки и эн-теровирус крупного рогатого скота) спираль al сформирована 12-ю остатками. Спираль а2 у вирусов ящура, Менго, энцефаломиокардита, вируса Тейлера и ВГА содержит 6 аминокислотных остатков, а у остальных вирусов в ней содержится 9 остатков. В спирали аЗ ВГА 10 остатков, a-у остальных пикорнавирусов - 8;

во-вторых, у всех пикорнавирусов протеолиз VP0 на VP4 и VP2 осуществляется между первым и вторым аминокислотными остатками средней спирали а2. В ней имеется строго консервативный остаток Glu для всех вирусов, а остатки Pro-Ala-Cys-Gly являются консервативными для по-лио- , рино-, Коксаки и энтеровируса крупного рогатого скота;

в-третьих, у всех пикорнавирусов между спиралями al и а2 находятся 3 аминокислотных остатка. Третий из них - Leu - является строго консервативным.

Не исключено, что указанные три альфа-спирали могут формировать элемент супервторичной структуры, который известен .в литературе под названием альфа-альфа уголок, часто встречающийся в белках (Ефимов, 1984).

Таким образом, локальная супервторичная структура участка проте-олиза УРО вируса гепатита А, также как и выше отмеченная гомология аминокислотных последовательностей, занимает некое промежуточное положение в ряду остальных пикорнавирусов, обнаруживающих сходство по этому признаку согласно их таксономическому родству. Поэтому, вирус гепатита А можно выделить в самостоятельный род семейства Picornavi-riöae.

II.2.Экспериментальная часть.

II.2.1.Материалы и методы.

Химический синтез олигопептидов был осуществлен в лаборатории химии пептидов Института Белка АН СССР (зав.лаб. д.х.н. Митин Ю.В.). -Автор признателен Запеваловой Н.П. и Медведкику В.Н. за помощь в работе.

В работе использовали производные аминокислот фирмы Reanal и Fluka, пентафторфенол отечественного производства. Тонкослойную хро-

матографию проводили на пластинках Silufol UV-254 (ЧССР) и Merck 60F 254 (ФРГ) в системах растворителей А-Е (см. табл.1). Температуру плавления определяли на приборе Boetius (ГДР) (не исправляли) ; элементный анализ проводили на С,Н,Н-анализаторе Perkin-Elmer 240В (США); Удельное вращение измеряли на поляриметре Perkín-Elmer 141А (США); аминокислотный анализ проводили на анализаторе Durrum D500 (США)- Высоковольтный электрофорез на бумаге осуществляли на приборе ОЕ-201 (Венгрия) в 30% уксусной кислоте, колоночную хроматографию выполняли на силикагеле L40/100 (Chemapol, ЧССР), на сефадексе G-25(fine, Serva). Пентафторфениловые эфиры В-защищенных аминокислст получали по методике с применением карбодиимида а также с использованием дипентафторфенилкарбоната (Медведкин, 1987). Большинство пептидов были получены по типовой методике с пентафторфениловыми эфира-ми (Kischfaludy et al, 1978).

Для временной защиты альфа-аминогрупп использовали Вос-группу. В качестве постоянных защитных групп боковых функций использовались бензильные группы, e-аминогруппу лизина защищали карбобензоксигруп-пой (Z), глутамин защищали метоксибензгидрильной (МВН) группой, предотвращающей дегидратацию амидных групп.

Для защиты концевых карбоксильных групп пептидов, участвующих в последующей конденсации фрагментов, использовали фенацильную группу, которая может быть избирательно удалена в условиях стабильности бензилоксикарбонильной (В0С-), карбобензокси (-Z) и бензильной (-OBzl) групп. Для других концевых СООН-групп использовали бензильные защиты.

Деблокирование пептидов, защищенных Z- и OBzl-группами, проводили по стандартной методике гидрированием над палладиевой чернью (кроме пептидов, содержащих Cys и Met). Как правило, все пептиды после обычной обработки реакционной смеси и перекристаллизации или переосаждения получались вполне чистыми. Однако, в некоторых случаях была необходима их хроматографическая очистка на колонке с силикате лем.

Свободные полипептиды были очищены гельфильтрацией на колонке с сефадексом G-25 и на HW-40 Toyopearl. Чистота пептидов контролировалась по ТСХ, злектрофоретически и при помощи ВЭЖХ.

Для исследования иммунологических свойств синтезированных пептидов были получены кокъюгаты пептидов с БСА двумя разными способами : 1) с использованием глутаральдегида 2) сукцинимидным методом

(Atassi et al., 1981).

Для определения способности пептидов взаимодействовать с антителами к вирусу гепатита А были использованы поликлональные антитела из сыворо-'ток реконвалесцентов, меченные 1-125, любезно предоставленные Н.В.Дорошенко, поликлональные антитела из сыворотки "Chulay ", и моноклональные антитела КЗ-4С8 и В5-ВЗ, полученные от д-ра С.Лемона (США). Последние были также мечены 1-125 и использовались для прямого и конкурентного изучения связывания свободных олигопеп-тидов. В качестве положительного контроля использовали вирус гепатита А, выделенный от больных (Московская обл.), а также выращенный в культуре клеток (штамм CR-326 получен от д-ра С.Лемона).

Взаимодействие пептидов и их конъюгатов с антителами определялось методом РИА с использованием нитроцеллюлозных фильтров для сорбции антигена. Применялись мембранные фильтры фирмы Schleicher& Schuell, диаметр пор 0,45 мкм; для работы использовали Bio-Dot аппарат фирмы Flow; результаты регистрировались способом радиоавтографии.

Для получения гипериммунных сывороток кроликов против соответствующих пептидов использовали двукратную иммунизацию с интервалом в 15 суток с полным адъювантом Фрейнда. Эти сыворотки тестировали методом конкурентного и непрямого РИА.

II.2.2. Результаты

В данной работе описан химический синтез 6 олигопептидов, соответствующих некоторым из предсказанных поверхностных зпитопов ВГА.

Это участки 148-15? белка VP1, 72-79 белка VP2, 67-75, 80-85, 76-85 и 96-105 белка VP3. Октапептид 72-79 VP2 был получен конденсацией двух пептидов (схема 1). Пептиды 80-85, 80-89 и 96-105 VP3 получали ступенчатым присоединением аминокислот с помощью пентаф-торфениловых эфиров (см. схемы 2,3,6). Нонапептид 67-75 VP3 получали конденсацией гептапептида с дипептидом (схема 4), декапептид 148-157 YP1 - конденсацией октапептида с дипептидом (схема 5). Конденсация проводилась с использованием соответствующих пентафторфе-ниловых эфиров.

Октапептид VDKPSSKK (N36) был получен конденсацией двух тет-рапептидов обработкой эквивалентных количеств N- и С- компонентов карбодиимидом в присутствии гидроксибензотриазола. Реакцию проводили в ДМФА при 0°С в течение 3 часов. Выход 85%. Аминокислотный ана-

лиз: Asp 1,16 (1), Ser 1,99(2), Pro 1,32(1), Val 1,06(1), Lys 3,29(3).

Пептиды 36 (схема 4) и 47 (схема 5) были получены конденсацией фрагментов с использованием пентафторфениловых эфиров по обычной методике (см. выше).

Защитные группы пептида 36 удалялись гидрированием над палладием после предварительного освобождения от кислотолабильных МВН-групп обработкой ТФУ (1час при 20*С).

Декапептид 20 был получен обработкой пептида 19 2N раствором трис-трифторацетата бора в трифторуксусной кислоте в присутствии ти-оанизола (2 часа при 0°С). Выделить его в очищенном виде, к сожалению, не удалось (по результатам хроматографии, полученная смесь продуктов содержит 70% свободного пептида).

Декапептид 48 был получен обработкой тетраметилсилил-трифторме-тансульфонатом в присутствии тиоанизола в ТФУ .

II.2.3. Иммунологические свойства синтезированных пептидов.

Полученные пептиды и их коньюгаты с БСА были проверены на способность взаимодействовать с антителами к ВГА из сывороток реконва-лесцентов. В качестве положительного контроля использовали интакт-ный вирус, выделенный из экстракта фекалий больных гепатитом А. Полученные данные свидетельствуют о наличии способности к связыванию анти-ВГА антител у двух пептидов и их коньюгатов с БСА - это гекса-пептид Pro-Val-Asp-Pro-Tyr-Phe, соответствующий участку 80-85 белка VP3 ВГА и декапептид Ile-Lys-Val-Ile-Pro-Val-Asp-Pro-Tyr-Phe (участок 76-85 белка VP3).

При использовании сыворотки Chulay для прямого и конкурентного взаимодействия со свободными пептидами обнаружено значительное прямое связывание пептида 150-157 из VP3 с анти-ВГА антителами, зависящее от разведения пептида. Но проверка блокированием неспецифическими сыворотками показала, что это связывание не является специфическим. В экспериментах по конкурентному взаимодействию показана активность пептидов 96-105, 80-85 и 150-157 белка VP3 ВГА. Конкурентное связывание зависит от pH раствора пептида и увеличивается в кислой среде.

Были получены гипериммунные сыворотки от кроликов против БСА-коньюгатов пептидов, соответствующих аминокислотным последовательностям 67-75, 80-85 и 76-85 белка VP3, 72-79 белка VP2, а также против гетерополимера, состоящего из пептидов 72-79 VP2 и 76-85 VP3

Рис.5. Радиоавтограф прямого связывания пептидов и их БСА-конъюга-тов с анти-ВГА антителами из сывороток реконвалесцентов в РИА (К1 конъюгаты, полученные глутаральдегидным методом, К2 - сукпинимид-ным, П - свободные пептиды, В - вирус; антиген в концентрации 100 мкг на лунку; ГА - сорбция с 0,1% глутаральдегидом).

стивтет « &

МАТЮТЮМА г

кбрчур

•ШСРЗЗКК

■ Щ: # ' №

■0Г

« т .

Рис.6. Диаграмма РИА для непрямого связывания ВГА с противопептид-ными антителами из сывороток кроликов. 6

4

1

О

гчдЬ 1 гаЬ 2 гиЬ 3 гиЬ 4 гиЬ 5 шЬ ё гиЬ 7 иНАУ

Результаты исследования этих сывороток прямым и непрямым взаимодействием с вирусом гепатита А методом РИА (см. рис. 6) достоверно обнаруживают специфическое взаимодействие с вирусом для кроличьих сывороток против пептида IKVIPYDPYF ( участок 76-85 белка VP3) и гетерополимера, состоящего из пептидов 72-79 VP2 и 76-85 YP3 (кролики 5 и 6 на рис. 6).

III. ОБСУЖДЕНИЕ

Ниже приведены схемы синтезов шести олигопептидов. При синтезе пептида 148-157 VP1 существует опасность образования побочного продукта - производного сукцинимида из-за наличия в последовательности пары аминокислот Asp(OBzl)-Gly. Мы проверили синтезированный пептид 48 на присутствие примеси сукцинимидного кольца с помощью ИК-спект-роскопии (Юнг Р. и др.,1987) и показали, что в данном случае образованием сукцинимидного кольца можно пренебречь (отсутствие поглощения при 1750 см ). Поэтому синтез этого пептида был проведен по схеме 5. Для пептидов, содержащих цистеин и метионин, были использованы различные способы удаления защитных групп. Выбор этих способов обусловлен, в основном, стремлением получить максимально чистые продукты.

Таблица 2.Свойства синтезированных пептидов.*

NN | Способ очистки | Выход, %\ [a] D| Rf Система |

10| XpG-25 50% МеОН | 58 | -14» 0 j 0,11 E |

201Хр HW-40(50%MeOH)| 83 j ¡О,68 E I

26| Хр,система Е | 77 | •136,0| 0,38 E I

37| К, вода/эфир | 64 | -20,0 ¡0,22 E I

48| Хр, HW-40 МеОН | 57 | -97,Ol 0,25 E I

53j Хр, Е' | 56 | -6,0 |0,27 E ' |

Результаты аминокислотного анализа пептидов совпадают с рассчитанными величинами.

«•* К - кристаллизация, Хр - колоночная хроматография на силикате ле (если не указано иначе).

•-:•** Для ТСХ использовались системы растворителей следующего состава:

Е - хлороформ-метанол-уксусная к-та-вода (8:2:2:1)

Е'- хлороформ-метанол-уксусная к-та-вода (8:4:1:0,5).

1. Q¡eki сисеза скитнлин, ооашгшшжщго учзсжу 72-79 VFE НА Val Açp Lyz Bp Ssr Sör Lyz

i-CFäc i-crac

Bx-Eßc-Bx-Bx-Bx-H-

Bx-Itc-ЧРфН-

Bx-

Bx-ŒE1 -CPfptb ŒE1

CBzi

OBzl

ŒE1 CBzl (Й1

Boc

Z

-СРфН-

z

-ста;

<Pac -CPac

-CFac Bx--CB=c Bv-

-<н H-

BX-

Bx-Ecl

-mpH-Ш

aa

Bzl

ва

Bx-Bx-

ш

<PfpH-Bzl

BZl

ш Bzl

EEl Bzl

Bx-

z

-CFfpH-z

Lyz

■ z <Ргс z

<Pac Z

-era: z

-Œ9c

z

-crac z

-CFa; Z

-œc z

-Cfac z

-СЙС

z

-Ш --CH

9

10

£ CSsmi сипеза даашщ аответслЕэетрго учзел-у 96-105 Еельа. VP3 НУ» Cys Ile Иг Ala Leu Ala Ser Ile Çys

Bx-Bx--CPfpH- Bx- ЕЙ1 -CPfpIf Bzl ■

Bx-Bx- Bzl -CPfpH-Bzl Bzl

Bzl

Bx-Bx--CPfp»- Bzl

Bzl

Bx-Bx--CRpH- Bzl Bzl -------- Bzl Bzl

Bdc-Bdc--CPfpH- Bzl Bzl

Bzl Bzl

Bx-Bx- Bzl -CPfpH-Bzl Bzl Bzl

Bzl Bzl

Bx-Bx--СРфН- Bzl Bzl

Bzl ВЦ

BX-BX- Bzl -CPfpIi- ва Bzl Bzl B2l

Bzl Bzl Bzl

Bzl Bzl Bzl

Bzl EEl Bzl

Bzl EEl Bzl Bzl

Tyr ' Ш

:-стас Bzl ;-Œr Bzl :-(Rc и

Bzl i-CRac B2l ;-CRc 12 Bzl

, Bzl ¡-CTac 13

Bzl ;-CРас Bzl

i4

Bzl :-Œac Bzl ;-<Pac 15 EEl

!-Œac Bzl ¡-Œac 16

Bzl !-Œac Bzl ;-œx 17

ва

',-СРэс ; Ki ',-СРэс 18 , EEl

I-cex Bzl \<Paс 19

-CH 19a

-CH 3D

1 9 -

S С5еш сипеза гасшивд 80-S5 vra

Val

Asp

Pro

ТУГ

Вх-Вх--CRfp Н-

Bx-Bx- ЧРФН- Bx- Bx-CBzl -СИрН-CBzl Bx-Bx--CPfpH- Bx- Bzl -CPfpH-Bzl EK1

Bzl Eel

Bzl

CBzl CBzl Bzl

Bzl

-------- ста Bzl

CBzl -------- Bzl

Ehe j-CBzl j-CBzl I -œzi 2i ¡-CBzl j-CBzl 22 j-OBzl j-CBzl 23

j-СШ 24

:-cbzi

j-CBzl 25

:<н

25

6 Схсга си-пеза даопяшда 76-65 VPS Ile Lyz Val Ile Его

Val

Вх-Вос-

-CPÍPH-

ВХ-Вх-

Z

Вх-Вх~ -СРфН-

Вх-Вэс--CPfpH-

Вх-Вх--CPfpH-

Asp

Вх-Вх--СРфН-

R-o

Вх-

Вх-CBZl -CPft>H-CBzl

œa

CBzl

OBzl œzl CBzl CBzl CBzl

CBzl

CBzl

CBzl CBzl

CBzl

Bx-Dx--CFfpH-

Bx-

Bzl

-CPfpH-Bzl

Bzl Bzl

Bzl Bzl

Bzl Bzl

Bzl Bzl Bzl

Bzl Bzl Bzl Bzl Bzl

Bzl

Bzl

Bne -CBzl -ŒE1 -CBzl 21 <Bzl -СШ1 22 -CBzl -CBzl 23 -CBzl -CBzl 24 -CBzl -CBzl 25 -CBzl <Bzl 49 -CBzl

-Œa ao

-CBzl -CBzl 51 -CBzl •Ш 52 —ai 53

- 20 -

t Qcmí сдагоза гснапетии, сссяшкл^кк^го учзту 67-75 VP3, Aza Ala Ser Asp Ser Val Gly Gln - Gln i ¡ i ! i ! Bx-i-Œâc ¡ i

i i i i í Бэс-;чРфн-;-стас ; ;

» ' ai 1 '

i Вэс-:-СРфН-!--------|-CPac

: ; ai ; :

; bdc-:--------;-----:-CRÍ;

; caí ¡ Bai : :

вэс-;-скьн-:-------;-------i-сйс

: cezü : Eai : ;

ВЭС-;-------;-------;--------I4TÖC

ai ; cía ; ai ; ;

ai ; caí ; ai

ЕЙ : CBzi ; M

: : : Bzi : caí ; a¿ : ; ¡ ;

зе ; Re-;-------;-------;----— ¡-----;-----!<Pac : ;

: : : ai : caí : bzí : ¡ ; : ген

z-:4Pfpfr;----------;--------:--------;--------;--------;-сгас : BDC-¡<H

: : ¡.Bzi : esa : ва ; ; ; ми ; m¡

33Z-:----—;-------;---------:--------:--------;------¡-crac z-:-cpfpH-:-Œ

; : ¡ ai ; caí : ш : : ; tm : mj

Жг\------;--------:--------:-----;-------;---------:-<н s-:------¡-сн zr

: ; : ai ; aa ; ва : : : œi ¡ mi

33Z-;--------;---------;---------;--------;-------;--------;-CPfpH-!--------|-<H

: ; ; ш i cai ; ai : ; : mi : œi Z-;-------;-------;---------;-------;------;--------j--------;--------;-<н ж

it i-------------------------------------------------------------------------CH SI

5 Ctoa. aínaа даагешвдз, ссхлнгплщсирго учзепку 14Ô-157 VP1.

Их Gly Ala Ирг Asp Val Asp Gly №t Ala

i i i i i i i Bx-i-Ήc : ;

caí ; ; ;

';::;:: bx-:-<P^H-;<RÏ; ; :

- : ; : : : : : caí ; ; :

39 ; : : ; : : вэс-i--------;-сва: ; :

::::::: caí ; ; :

; : . : ; ; Eoc-;-cpft)H-;-------;-cre ; ;

caí : ; ;

40 ; : : : ¡ вое-;------:--------:-crc : :

: : : : i caí ; ; caí : ; ;

: : : ; в*;-:-снрн-:-------:-------:-cpac ; :

; : : ; ; аза ; : caí : : :

41 : : : ; вх-;-----:------;------\-cpac : ;

: : : ; ai : aai : : caí : : ;

: ; : ВХ-:-срц?Н-;-------:-------:-------:-crac ; :

; ! : ¡ ai ! caí : : caí : ; ;

¿12 ; ; ; Взс-:-------;-------1--------1------\<Взс ; !

: : : : ai : caí : ; caí ; ; ;

! : BX-;-CF®>H-;-------:---;--------;--------\<pac : :

: : : ; ai : caí ; ; caí : ! :

43 i ; йк-;-------;-------:-------:-----—;--------;-скс ; :

: : : : ш : caí : ; caí ; : :

; B3c-:-cpíph-;---------:--------:--------;--------:--------:-crac ; ;

: ; : : ai : caí ; : caí : : :

44 ; Bx-:------;--------:------;------:-------;--------;-cra; : :

: ai : : ; ai : cea ; ; caí ; : ;

взс-:-сирн-:-------;--------:------;--------;-------;—.----:-а=эс : Bx-:-cai

: ai ; : : ai ; caí ; : caí ¡ : :

45 bdc-:-------:--------:-------:--------:------:--------;--------;-cPac вх-;-сю?н-:-са1

; ai ; : : ai : caí ; : caí ; ; :

Bx.;-----;-------;-------;------;--------;--------;--------;-ÇH ВЭС-!---33--|-Cai

; ва ¡ : : ai : caí ; : caí : ; :

46 bx-:-------:--------;---------:------:---------;--------:--------:-cpíp h-¡—------:-cai

; ва ; : : Bzi ; caí : : cea : ; :

47 m>;---------:-------:--------;--------;-------:--------:—-—;---------:---------¡-caí

48 h-;-------i---------:-------i--------i--------i--------i-------i---------:--------\<ti

На основе сравнения аминокислотных последовательностей капсидных белков ВГА с белками пикорнавирусов с учетом их вторичной структуры мы сделали вывод о сходстве пространственной организации всех этих полипептидов. Взаимное расположение белковых субъединиц в составе решетки капсида также, по-видимому, одинаково. Различия могут состоять в небольших отклонениях в удаленности поверхностных участков от геометрического центра капсида, что, по-видимому, и обусловливает особенности антигенной структуры ВГА.

У полиовирусов, риновирусов и вирусов ящура имеется четыре основных нейтрализующих антигенных сайта на поверхности капсида в расчете на одну грань икосаэдра (Бйеггу.В.,е1.а1.,1986). Эти антигенные сайты у всех исследованных вирусов расположены в примерно одинаковых участках структуры капсидных белков и могут отчасти перекрываться. Кроме того, у разных вирусов различные эпитопы являются иммунодоминантными. Так, у полиовирусов доминантным считается линейный эпитоп, локализованный между В и С бета-тяжами белка УР1, у ящура - участок 140-160 последовательности УР1, для риновирусов все четыре эпитопа примерно равноценны (три из них полностью являются конформационными).

У ВГА имеются значительные вставки и делеции в аминокислотных последовательностях капсидных белков по сравнению с остальными пи-корнавирусами. Так, например, в белке УР1 имеется большая делеция в верхней петле между бета-тяжами В и С. Эта петля у многих других пикорнавирусов содержит аминокислотные остатки, формирующие одну из иммуногенных зон. ВГА, по-видимому, представляет собой исключение и не содержит в указанной области антигенных сайтов. Судя по нашим даннным, соответствующий участок белка УР2 также не является антигенным (был исследован участок 72-79).

Полученные нами данные по взаимодействию пептидов 80-85 и 76-85 из УРЗ с поликлональными антителами против ВГА и соответствующих противопептидых антител из гиперимунных сывороток кроликов с нативным вирусом гепатита А подтверждают предположение, что этот участок может быть частью конформационного эпитопа на поверхности ВГА.

Интересно, что олигопептид, соответствующий участку 67-75 белка УРЗ (и, соответственно, содержащий Аэр-70) не связывается сам по себе с

анти-ВГА антителами.

У ВГА, по данным иммунологических исследований с применением му-

тантов, устойчивых к нейтрализации, обнаружен всего один нейтрализующий эпитоп, он же является иммунодоминантным (Lemon et al., 1987). В последнее время появились данные (Lemon,1988), что замена Asp70 из VP3 на His приводит к потере .чувствительности ВГА к одной из групп нейтрализующих МКА, использованных в опыте.

Недавно в лаборатории С. Лемона были получены МКА-устойчивые мутанты ВГА с заменой в положении 276 VP1 и мутанты, содержащие обе замены (Asp-70 VP3 и 276 VP1). Но ни один из них не был полностью устойчив к нейтрализации поликлоньльными антителами к ВГА. Это указывает на наличие дополнительного нейтрализующего зпитопа у ВГА.

Таким образом, на основе литературных данных и результатов наших исследований можно заключить, что основной нейтрализующий иммуно-генный зпитоп ВГА включает аминокислотные остатки белка VP3, расположенные между верхними бета-тяжами В и С и, вероятно,является кон-формационным. По-видимому, бета-тяж В2 в структуре этого белка отсутствует, а петля между В и С бета-участками состоит из 16 аминокислотных остатков (Asn-Ala-Asn-Asp-Ser-Val-Gly-Gln-Gln-1le-Lys-Val -Ile-Pro-Val-Asp), которые и входят в состав конформационного антигенного эпитопа ВГА. По-видимому, данный участок имеет несколько линейных эпитопов, которые сами по себе не являются нейтрализующими.

IV.ВЫВОДЫ

1. На основе компьютерного и стереохимического анализа проведены расчеты вторичной структуры капсидных белков ВГА и других пикор-навирусов и выравнивание их аминокислотных последовательностей. Эти данные позволили нам :

- предложить модель пространственной организации белков ВГА, которая хорошо укладывается в общую схему строения двуслойных белков с антипараллельной бета-структурой, установленную для полиовиру-са, риновируса типа 14 и вируса Менго с помощью рентгенострук-турного анализа;

- указать на участки полипептидных цепей капсидных белков ВГА, которые могут входить в состав нейтрализующих эпитопов.

2. Анализ возможной локальной супервторичной структуры участка автокаталитического расщепления белка VP0 всех пикорнавирусов, включая ВГА, свидетельствует о сходном принципе организации этого участка по типу альфа-альфа-уголка, построенного из 3-х аль-

фа-спиралей. На основе данных, полученных при анализе локальных гомологий аминокислотных последовательностей пикорнавирусов и исследовании особенностей строения участка расщепления белка VP0 ВГА можно выделить в самостоятельный род семейства Picorna-viridae.

3. Осуществлен химический синтез, деблокирование и очистка олиго-пептидов, соответствующих аминокислотным последовательностям ВГА 148-15? VP1 (Thr-Gly-Ala-Thr-Asp-Val-Asp-Gly-Met-Ala), 72-79 VP2 (Val-Asp-Lys-Pro-Ser- Ser-Lys-Lys), 67-75 YP3 (Asn-Ala-Ser-Asp-Ser-Val-Gly-Gln-Gln), 80-85 VP3 (Pro-Val-Asp-Pro-Tyr-Phe), 76-85 VP3 (Ile-Lyz-Val-Ile-Pro-Val-Asp-Pro-Tyr-Phe) и 96-105 VP3 (Cys-Ile-Thr-Ala-Leu-Ala-Ser-Ile-Cys-Tyr), получены их конъюгаты с БСА.

4. Результаты иммунологического тестирования с использованием метода РИА позволили установить, что гексапептид Pro-Val-Asp-Pro-Tyr-Phe и декапептид Ile-Lyz-Val-Ile-Pro-Val-Asp-Pro-Tyr-Phe, а также их конъюгаты с БСА, полученные разными способами, избирательно взаимодействуют с поликлональными антителами против ВГА из сывороток реконвалесдентов. Обнаружена способность специфического связывания ВГА антителами из гиперимунных противопептидных сывороток, полученных при иммунизации кроликов БСА-коньюгатом декапептида 76-85 из VP3 и гетерополимером, содержащим пептиды 76-85 и 67-75 из белка VP3. Эти результаты указывают на поверхностную локализацию участка 67-85 белка VP3 в капсиде ВГА и возможность участия данной области в формировании нейтрализующего эпитопа ВГА.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Mesyanzhinov V.V..Peletskaya E.H..Zhdanov V.M.Efimov A.V., Finkelstein A.V., 1987, Prediction of secondary structure, spatial organization and distribution of antigenic determinants . for hepatitis A virus proteins. Journal of Biomolecular structure & Dinamics, vol.5,_N 2, 447-458,

2. Месянжинов B.B. Неплюев И.В.Пелецкая E.H., 1987, Модель структурной организации капсидных белков вируса гепатита А. В Сб. Актуальные вопросы диагностики эпидемиологии и профилактики вирусного гепатита А. Военно-Медицинская Академия им. С.М.Кирова, стр. И.

3. Селиванов Н.А., Дорошенко Н.В..Ананьев В.А., Пелецкая Е.Н., Ме-сянжинов В.В.Подход для идентификации антигенных детерминант вируса гепатита А Там же, стр.15.

4. Месянжинов В.В.,Пелецкая Е.Н.,1987, Модель пространственной структуры капсидных белков вируса гепатита А и распределения поверхностных антигенных детерминант Материалы YII Всесоюзного Симпозиума по химии белков и пептидов, Таллин, 198?, стр.82.

5. Пелецкая Е.Н. Месянжинов В.В. Препринт Института Вирусологии имени Д.И.Ивановского АМН СССР. Москва.1983. Подготовлено для WHO. Alignments of the Hepatitis A capsid proteins with picornavirus polypeptides.

6. Peletskaya, E.H., Mesyanzhinov, V.V., The analysis of the HAV capsid proteins structure , The 3-rd International symposium on the molecular biology of Picornaviruses, Moscow, 1988.

7. Mesyanzhinov, V.V., Peletskaya, E.N., Structure and immunological properties of HAV capsid proteins, Suzdal Int Symph on the molecular virology of AIDS, influenza and viral hepatites, Sept. 1988.

^ГЦг-