Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Специфический гуморальный иммунитет при вирусном гепатите С
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Специфический гуморальный иммунитет при вирусном гепатите С"
На правах рукописи НИКОЛАЕВА ЛЮДМИЛА ИВАНОВНА
СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ ПРИ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С
03.00.06 - вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва-2006
Работа выполнена в ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН и ГУ НИИ биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН
Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Михайлов Михаил Иванович.
Официальные оппоненты: д. б. н., профессор, академик РАМН Зверев Виталий Васильевич; д. б. н., профессор, член-корр. РАН Тоневицкий Александр Григорьевич; д. м. н., профессор Ильченко Людмила Юрьевна.
Ведущая организация - ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Защита состоится,,^? СШ?&£)и?- 2006 г. в -Ю ^ часов на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова Российской Академии медицинских наук по адресу: 142782, Московская обл., Ленинский район, п/о Институт полиомиелита.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова Российской Академии медицинских наук.
Автореферат разослан £/9 tejim xJJtx- 2006 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук /J I Медведкина O.A.
tl Ah/
Актуальность проблемы
В настоящее время в Российской Федерации, как и в большинстве стран, отмечается неблагоприятная эпидемиологическая ситуация по парентеральным вирусным гепатитам: к 2015-2020 годам ожидается удвоение количества инфицированных людей на нашей планете [Armstrong G.L. et al., 2000; Tanaka Y. et al., 2002; Официальная информация по материалам аналитической записки, подготовленной Департаментом ГСЭН МЗ РФ для межведомственной комиссии Совета Безопасности Российской Федерации, по вопросу «Распространение вирусных гепатитов как угроза национальной безопасности», 2003]. Около 1,4-2,4% граждан РФ имеют маркеры инфицирования вирусом гепатита С (ВГС), причем в подавляющем большинстве случаев у людей выявляется хронический гепатит С [Селиванов Е.А. и др., 2003; Шляхтенко Л.И., 2003]. Для персистентной ВГС-инфекции характерно прогрессирующее течение, приводящее к формированию цирроза печени в 20-30% случаев, к первичной гепатоклеточной карциноме - в 8-15%, к терминальному поражению печени - в 0,5-1%, к внепеченочным проявлениям -в 11-62% [Alter M.J. et al., 1999; Memon M.I. et al., 2002; Hadziyannis S. J., 1997; Игнатова E. M. и др., 1998].
Несмотря на интенсивное изучение ВГС-инфекции в течение последних 16 лет нет четких данных о механизме элиминации вируса при остром гепатите С (ОГС), что в свою очередь сдерживает создание профилактической вакцины. Антигены ВГС способны индуцировать В- и Т-клеточный ответ, который в 1525% случаев острого гепатита С достаточен для элиминации вируса [Giuberti Т. et al., 1992; Villano S.A. et al., 1999; Armstrong G.L. et al., 2000]. Но в подавляющем большинстве случаев острая инфекция заканчивается развитием хронического гепатита С (ХГС) на фоне более или менее выраженного адаптивного иммунного ответа [Cramp М.Е. et al., 1999; Bowen D.G., Walker C.M., 2005]. Вирус гепатита С - уникальный патоген, который способен ускользать от иммунного контроля, создавая новые генетические и антигенные варианты, задерживать формирование Т-хелперного и Т-киллерного ответа при
остром гепатите С, вызывать повторную реинфекцию у выздоровевших людей. Изучение ВГС-инфекции и специфического иммунитета началось после идентификации вируса в 1989 г. и в первую очередь преследовало главную цель - создание профилактической вакцины [Choo Q.-L. et al., 1989; Choo Q.-L. et al., 1994]. К концу 90-х годов прошлого века после неудачных попыток создания протективной вакцины на основе рекомбинантных белков оболочки вируса основной акцент в изучении специфического иммунитета при гепатите С был смещен в область анализа антивирусного Т-клеточного иммунитета [Раре G.R. et al, 1999; Lechner F. et al, 2000].
Изучение специфического иммунитета при ВГС-инфекции во многом сдерживается отсутствием доступной лабораторной модели инфекции, вирус поражает только людей и шимпанзе. Как показали A. Basset и соавторы, у ВГС-инфицированных шимпанзе течение инфекции легче и выздоровление происходит чаще, чем у людей [Basset S.E. et al., 1998]. Поэтому анализ специфического иммунитета у людей, больных гепатитом С или перенесших его с выздоровлением, - актуальная задача, решение которой позволит понять механизм успешного иммунного ответа, обеспечивающего естественную элиминацию вируса, разработать подходы к созданию профилактической вакцины, а также расшифровать клинико-диагностическую значимость В- и Т-клеточного ответа на индивидуальные антигены вируса.
К началу данного исследования были установлены отдельные качественные (только наличие антител) параметры ВГС-специфического гуморального иммунитета, не выявлены различия в направленности и количественных характеристиках специфических антител при остром и хроническом гепатите С, не изучена динамика содержания антивирусных иммуноглобулинов при естественно текущей острой и хронической инфекции и при проведении противовирусной терапии. Эти сведения необходимы для разработки профилактических и терапевтических вакцин против гепатита С, для ранней диагностики инфицирования, для определения фазы инфекции и для выбора оптимального курса противовирусной терапии.
Цель исследования - изучить специфический гуморальный иммунитет
при вирусном гепатите С и установить закономерности В-клеточного ответа,
характерные для основных фаз инфекции и представляющие диагностическую
значимость.
Задачи исследования:
1. Определить прогностическое значение выявления специфических иммуноглобулинов М в острую и хроническую фазы ВГС-инфекции, исследовать корреляционную зависимость между величинами титра этих антител, активностями аланин- и аспартат-аминотрансфераз и наличием вирусной РНК в крови.
2. Изучить гуморальный ответ на участки оболочечных белков ВГС, содержащие линейные В-эпитопы, при остром и хроническом гепатите С, при элиминации вируса и проведении специфической терапии интерфероном-альфа.
3. Исследовать динамику уровня иммуноглобулинов О на отдельные антигены ВГС в острую фазу инфекции и выявить их прогностически значимые изменения.
4. Установить титры иммуноглобулинов в к капсидному антигену и неструктурным белкам при острой и хронической инфекции, определить их значение для установления фазы инфекции, выявить взаимосвязь с активностями аланин- и аспартат-аминотрансфераз и наличием вирусной РНК в крови.
5. Определить направленность и уровень ВГС-специфических антител при элиминации вируса, произошедшей более 3-х лет назад.
6. Изучить изменения специфического гуморального иммунитета при проведении терапии интерфероном-альфа у людей с хроническим гепатитом С и оценить прогностическое значение этих изменений.
7. Исследовать специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом Сиу новорожденных детей, матери которых имеют маркеры ВГС-инфекции.
8. Установить критерии специфического гуморального ответа, которые можно использовать при определении исхода острого гепатита С, оценке эффективности противовирусной терапии, инфицированности новорожденных детей, матери которых имеют маркеры ВГС-инфекции, и при дифференцировании острой и хронической фазы инфекции.
Научная новизна работы. Впервые обнаружено, что для хронической ВГС-инфекции характерно более частое выявление специфических антител класса М (вторичных), чем для острой инфекции. Частота определения и титры анти-ВГС 1§М у людей с разными исходами ОГС в первые два месяца инфекции не различаются. Впервые установлена позитивная корреляция между величинами титра анти-ВГС 1£М и наличием вирусной РНК в крови.
Показано, что при остром и хроническом гепатите С вырабатываются антитела к 8-ми линейным В-эпитопам оболочечных белков ВГС. Впервые обнаружено, что исход ОГС не зависит от наличия антител на анализируемые В-эпитопы, хотя на 3 из них образуются вируспейтрализующие антитела. Впервые установлено, что при ХГС достоверно чаще определяются иммуноглобулины в к СООН-концевому В-эпитопу первого гипервариабельного региона (ГВР) белка Е2, которые считаются вирус-нейтрализующими. Показано, что при остром и хроническом гепатите С формируются антитела, способные взаимодействовать с консенсусной последовательностью первого ГВР. Установлена динамика уровня антител, направленных на восемь линейных В-эпитопов оболочечных белков, при разных исходах ОГС, при хроническом гепатите С и при проведении терапии интерфероном-альфа.
Определена последовательность как появления иммуноглобулинов О к вирусным антигенам при ОГС, так и их исчезновения в случае элиминации ВГС. Впервые выявлены количественные различия между уровнем иммуноглобулинов в к капсидному антигену при остром и хроническом гепатите С. Установлен диапазон титров антител класса О к неструктурным (N8) антигенам вируса при остром и хроническом гепатите С, показана
динамика уровня этих антител при естественном и индуцированном интерфероном-альфа ограничении виремии.
Впервые установлены титры специфических антител у людей, перенесших ОГС более трех лет назад с элиминацией вируса, наступившей либо самопроизвольно, либо вследствие терапии интерфероном-альфа.
Исследован специфический гуморальный иммунитет у детей с ХГС, обнаружены его особенности по сравнению с гуморальным ответом у взрослых больных. Впервые установлены два варианта динамики уровня иммуноглобулинов в к капсидному антигену у новорожденных детей, матери которых имели маркеры ВГС-инфекции, и показано диагностическое значение контроля этих антител для выявления инфицированных новорожденных.
Научно-практическая значимость работы. Полученные данные о гуморальном ответе на 8 линейных В-эпитопов оболочечных белков свидетельствуют о раннем появлении антител на ИНг-концевые детерминанты антигенов Е1 и Е2 при ОГС, о частом выявлении иммуноглобулинов в к вируснейтрализующему СООН-концевому эпитопу первого ГВР. Как при острой, так и при хронической инфекции у большинства больных обнаружены антитела, взаимодействующие с консенсусной аминокислотной последовательностью 1-ого ГВР. Эти данные актуальны для разработки вакцин против гепатита С с учетом вируснейтрализующих В-эпитопов оболочечных белков.
Определены последовательности появления и исчезновения иммуноглобулинов О, направленных на структурные и неструктурные антигены вируса, при разных исходах ОГС, а также показана динамика уровня этих антител, что позволило разработать прогностические критерии развития персистентной инфекции или элиминации вируса при острой фазе инфекции.
Показана высокая иммуногенность вирусных белков, особенно калсидного белка и сериновой протеазы/келиказы. Установлено, что титры иммуноглобулинов в к капсидному белку при острой и хронической инфекции имеют разный диапазон значений. Предложен иммуноглобулиновый критерий, облегчающий и уточняющий дифференциальную диагностику острого и
хронического гепатита С, что особенно актуально при выборе оптимального курса терапии интерфероном-альфа.
Обнаружена позитивная корреляция между уровнем анти-ВГС IgM и выявлением вирусной РНК в крови, между величинами титров антител класса G к капсидному антигену и к NS-белкам, определением РНК ВГС в крови и повышенным уровнем аланин-аминотрансферазы.
Мониторинг уровня ВГС-специфических иммуноглобулинов М и G в процессе противовирусной терапии, а также после ее окончания позволяет проводить контроль за эффективностью лечения и длительностью позитивного результата терапии.
Специфический гуморальный иммунитет у детей с ХГС характеризуется меньшими титрами антител, чем у взрослых больных. У новорожденных детей, матери которых имели маркеры ВГС-инфекции, обнаружены два варианта изменения уровня антител класса G к капсидному белку. Динамика титров этих антител является дополнительным иммуноглобулиновым критерием при выявлении инфицированных вирусом гепатита С новорожденных детей.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты работы частично включены в пособие для врачей «Диагностика и лечение хронических гепатитов В, С и D у детей», выпущенное Министерством здравоохранения Российской Федерации (Москва, 2003) и представлены на общедоступном ресурсе Интернет «Гепатит С: молекулярно-биологические и медико-социальные аспекты проблемы» (http: // www.ibmc.msk.rii/hepatitis/).
Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций и на практических занятиях для студентов 5-ых и 6-ых курсов кафедры детских инфекционных болезней с курсом вакцинопрофилактики ФУВ Российского государственного медицинского университета.
Результаты диссертации используются врачами 2-ой Клинической инфекционной больницы г. Москва в комплексе диагностических и прогностических критериев при ведении больных гепатитом С.
По данным, полученным при исследовании гуморального ответа на оболочечные белки, капсидный и неструктурные антигены, сконструирован лабораторный вариант иммуноферментной тест-системы. Оформляется патент «Нанодиагностическая система для выявления вирусов гепатита».
Основные положения, выносимые на защиту
1. Специфические антитела класса М (вторичные) при гепатите С определяются как в острую, так и в хроническую фазу инфекции, но с разной частотой. Не обнаружены различия в течение первых двух месяцев острой фазы в частоте выявления и титрах специфических иммуноглобулинов М при разных исходах острой фазы. Установлена позитивная корреляция между величинами титра этих антител и обнаружением вирусной РНК в крови.
2. Антитела класса в к восьми линейным В-эпитопам обол очечных белков Е1 и Е2 выявляются у людей с острым и хроническим гепатитом С. Исход ОГС не зависит от наличия антител к этим В-эпитопам оболочечных белков, хотя на 3 из них образуются вируснейтрализующие антитела. При хронической инфекции достоверно чаще, чем при острой, обнаруживаются иммуноглобулины в на СООН-концевой эпитоп 1-ого ГВР, антитела на который нейтрализуют связывание вируса с клеткой.
3. Специфические антитела класса в на оболочечные, капсидный и неструктурные антигены ВГС при острой инфекции появляются и исчезают, в случае элиминации вируса, в определенной последовательности. Обнаружены два варианта динамики уровня специфических иммуноглобулинов О к капсидному и неструктурным белкам вируса в зависимости от исхода острого гепатита С.
4. Антитела класса О к нуклеокапсидному антигену выявляются при ХГС в более высоких титрах, чем в острую фазу инфекции. Титры антител к неструктурным белкам при ХГС имеют широкий диапазон значений. Для антигенов вируса гепатита С характерна высокая иммуногенность. Установлена позитивная корреляция между величинами титров
иммуноглобулинов С к калсидному и неструктурным белкам, наличием вирусной РНК в крови и повышенным уровнем алаяин-аминотрансферазы.
5. Специфический гуморальный иммунитет после острого гепатита С, завершившегося элиминацией вируса, характеризуется отсутствием специфических иммуноглобулинов М, более узкой направленностью антител класса в, титры которых имеют низкие значения.
6. При проведении терапии интерфероном-альфа у людей с хроническим гепатитом С обнаружено снижение титров специфических антител класса М иСв случае позитивного биохимического и вирусологического результата
■ лечения.
7. Специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом С имеет отличия от гуморального иммунитета взрослых больных. У детей, рожденных матерями с маркерами ВГС-инфекции, выявлено два варианта динамики титров антител класса в к калсидному белку в первый год жизни.
8. При ВГС-инфекции специфический гуморальный иммунитет (наличие антител на индивидуальные антигены вируса, их титр и динамика уровня) имеет определенную информационную значимость.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на XXVII и XXVIII научной конференции ЦНИИ гастроэнтерологии (РФ, Москва, 1999, 2000); на II Всероссийской научно-практической конференции "Интернет и современное общество" (РФ, С.-Петербург, 1999); на V и IX конференции 'Тепатология сегодня" (РФ, Москва, 2000, 2004); на 10-ом Международном симпозиуме по вирусным гепатитам и болезням печени (США, Атланта, 2000); на III научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консенсус)" (РФ, Москва, 2000); на конференции по Межведомственной научно-технической программе «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» (РФ, Геленджик, 2000); на 2-ом международном пептидном симпозиуме (США, Сан Диего, 2001); на IV и на V Российской научно-практической конференции "Гепатит В, С и Б - проблемы диагностики, лечения и профилактики" (РФ, Москва, 2001, 2003); на 5-ом
Конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (РФ, Москва, 2002); на VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (РФ, С.-Петербург, 2002); на II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы. Биотехнология и медицина» (РФ, Москва, 2003); на IV конгрессе детских инфекционистов России (РФ, Москва, 2005).
Диссертация апробирована на заседании межлабораторного Ученого совета ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (протокол № 2 от 13 декабря 2005 г.) и на заседании межлабораторного совета по предварительной экспертизе диссертационных работ в ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (протокол 7 от 31 марта 2006 г.)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 48 научных работ (в том числе 19 статей, из них 13 в центральных отечественных и зарубежных журналах, 23 тезиса докладов в журналах, материалах и сборниках тезисов и 6 тезисов) и одно пособие для врачей.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 260 страницах, содержит 58 табл. и 28 рис. Она состоит из введения, обзора литературы (три главы), собственных исследований (шесть глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Список литературы включает 442 источников (25 отечественных и 417 зарубежных).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования
Сыворотки людей с маркерами ВГС-инфекции и без маркеров (контрольная группа) были собраны в Консультативном специализированном гепатологическом центре при 1-ой Клинической инфекционной больнице, в Гематологическом научном центре, на кафедре инфекционных болезней с курсом эпидемиологии Российского Университета дружбы народов при 2-ой Клинической инфекционной больнице и на кафедре детских инфекционных болезней с курсом вакцинопрофилактики ФУВ Российского государственного медицинского университета при 26-ой детской инфекционной больнице (табл.1).
Таблица 1. Характеристика обследованных групп людей.
Группы людей Количество Пол Возрастной диапазон (годы) Средний возраст (годы)
мужской женский
Больные ХГС 160 112 48 17-60 27
Пациенты с ОГС 21 18 4 18-55 28
Выздоровевшие 10 4 6 14-45 26
Дети с маркерами гепатита С 82 58 24 1 мес. -12 лет 5
Пары мать-дитя 10 8 2 1 мес. -9 мес. -
Здоровые люди 32 26 6 19-35 24
Диагноз ОГС выставлялся врачами-инфекционистами, если имелись: (1) клиническая картина гепатита (желтуха, гепато- и спленомегалия, интоксикационный и диспепсический синдромы), (2) впервые были обнаружены лабораторно-диагностические маркеры (анти-ВГС IgM и IgG, вирусная РНК и повышенные в 8-10 раз активности АлАТ и АсАТ), (3) был выявлен риск инфицирования по эпиданамнезу. Всегда проводился динамический контроль и верификация диагноза. Максимальная продолжительность острой фазы не превышала 6 месяцев (по рекомендации ВОЗ). Критерием выздоровления после ВГС-инфекции считалось отсутствие в течение не менее чем 3-х лет клинических, биохимических и вирусологических проявлений гепатита С (отсутствие РНК ВГС в плазме и лейкоцитах крови). Диагноз ХГС выставлялся, если клинические, вирусологические и биохимические маркеры гепатита С сохранялись более б месяцев, учитывалась и стабильность титров специфических иммуноглобулинов G. Всего исследовано 313 образцов крови людей, при этом выполнено около 1550 тестов.
Сорбция антигенов для твердофазного ИФА выполнялась в 96-луночных полистирольных планшетах (ЗАО <<ВНИИМЕДПРОМ», РФ; «Costar», США). В работе были использованы синтетические пептидные антигены оболочечных белков, содержащие как известные линейные В-эпитопы (табл. 2), так и потенциальные В-клеточные детерминанты из консервативных зон белков El и Е2 по данным B.N. Sobolev и соавт. [Sobolev B.N. et al, 2000]. Сорбция пептидов проводилась 16 часов при плюс 4°С. Для ориентированной посадки пептиды были модифицированы биотином по МН2-концевому аминокислотному остатку спейсера-вставки S-G-S-G- и проинкубированы со
стрептовидиновым покрытием лунок планшета в течение 16 часов при плюс 4°С.
Синтез пептидов выполняли к.х.н. М.П. Финогенова и д.х.н. В.А. Шибнев в ГУ Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН твердофазным методом путем наращивания пептидной цепи с СООН-конца на полимере Ванга по Fmoc/Boc, Ви'-стратегии. Пептиды для ориентированной посадки были синтезированы асп. JL В. Олениной на DKP-иглах (Mitokor Mimotopes, Австралия) по методике фирмы-производителя. Корректность аминокислотной последовательности у пептидов была проверена масс-спектрометрическим анализом на MALDI-TOF масс-спектрометре Bruker Daltonics Reflex III (Bruker, Германия).
Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) после сорбции синтетических пептидов выполняли по стандартной методике. Учет оптической плотности (ОП) проводили при длине волны 450 нм. Величину пороговой ОП, выше которой сыворотки расценивались как положительные, вычисляли как среднюю арифметическую ОП от 32-х сывороток здоровых людей плюс 3-кратноё стандартное отклонение, вычисленное по общепринятым формулам. Коэффициент позитивности (КП) рассчитывали как отношение ОП сыворотки к пороговому значению ОП.
Выявление и титрование специфических антител класса М к суммарным антигенам (кор, NS3, NS4ab, NS5a) ВГС выполнялось методом твердофазного ИФА в сертифицированной коммерческой тест-системе РекомбиБест анти-ВГС-IgM (ЗАО "Вектор-Бест", РФ, Новосибирская обл.) В процедуру титрования образцов внесены небольшие авторские изменения, связанные с удобством титрования.
Выявление и титрование специфических антител класса G к отдельным антигенам'ВГС (кор, NS3, NS4ab, NS5ä) выполнялось в сертифицированных коммерческих тест-системах ImmunoComb II HCV ("Orgenics" Ltd., Израиль) и РекомбиБест анти-ВГС - спектр (ЗАО "Вектор-Бест", РФ, Новосибирская обл.). Первоначально сыворотки тестировались в тест-системе ImmunoComb П HCV, которая позволяла выявлять антител класса G к белкам кор, NS3 и NS4ab в течение 40 мин. Позитивные образцы затем титровались в тест-системе РекомбиБест анти-ВГС — спектр. При предварительном титровании сывороток шаг разведения равнялся 1/10. Дальнейшие этапы анализа и расчет порогового значения ОП выполнялись в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. После определения предварительного титра образца осуществлялось его точное титрование с шагом разведения 1/2.
Определение антител к капсидному белку методом оптического биосенсора было выполнено на двухканальном приборе типа "резонансное зеркало" IAsys plus и аминосилановых кюветах (Affinity Sensors, Labsystems, Англия). Анализ выполнен в ГУ НИИ биомедицинской химии им. В Л. Ореховича РАМН совместно с м.н.с. О.В. Гнеденко, асп. Н.И. Константиновой и д.б.н. Ю.Д. Ивановым. Для контрольного тестирования были использованы моноклональные антитела к капсидному белку ВГС, любезно предоставленные д.б.н., проф. П.Г. Свешниковым (ВНЦ молекулярной диагностики и лечения).
Определение фрагментов генома ВГС и генотипирование РНК в плазме и лейкоцитах крови выполнялось сотрудниками диагностических лабораторий ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, НГЦ и СТУЛ НИИ эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН с использованием сертифицированных наборов и тест-систем "РИБО-сорб" (АмплиСенс ПЦР-тест-системы), "PEBEPTA-L-100" (АмплиСенс ПЦР-тест-системы), "АмплиСенс-100-R для вируса гепатита С" и "АмплиСенс-50-R для амплификации участков кДНК вируса гепатита С генотипов la, lb, 2а, За" (все наборы ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, Москва) по инструкции производителя.
Активность аланин- и аспартат-аминотрансфераз определяли сотрудники биохимических лабораторий 1-ой и 2-ой Клинической инфекционной больницы г. Москва, под руководством к.м.н. Д.М. Брагинского и д.м.н. И.М. Рослого. Был использован кинетический метод определения активностей аланин- и аспартат-аминотрансфераз. Диапазон нормальных значений активностей данных ферментов от 3 до 40 МЕ/л.
Количественные данные выражались как среднее арифметическое значение (М) со средней ошибкой среднего арифметического (in). Среднее разведение сыворотки с учетом средней ошибки (Pip) рассчитывалось по формулам и таблицам, описанным И.П. Ашмариным и A.A. Ворбьевым [Ашмарин И.П., Ворбьев A.A., 1962]. Среднее геометрическое титра вычисляли по общепринятым формулам.
Достоверность различий параметров, характеризующих специфический гуморальный иммунитет в разных группах пациентов, рассчитывалась по критерию Пирсона. Результаты считались достоверными при Р<0,05. Если один из параметров выборки был меньше 10, использовалась формула для расчета х2 с учетом поправки Иетса. В случае если один из параметров выборки был равен или меньше 5, применялась формула Фишера для точного расчета Р. Достоверность различий параметров при альтернативном варьировании вычислялась с учетом t-критерия Стьюдента.
Коэффициент корреляции (rs) для оценки связи между количественными данными (рядами) сравниваемых параметров рассчитывался по методу рангов Спирмепа.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Специфический гуморальный иммунитет при естественном течении острого гепатита С 1.1. Вирусспецифичсские антитела класса М
При инфицировании вирусом гепатита С самым ранним (обычно на 2-4-ую неделю после заражения) выявляемым в крови маркером является вирусная РНК, через одну-две недели после которой начинает определяться капсидный антиген, и на 6-8-ую неделю появляются специфические иммуноглобулины
[Farci P. et al, 1991; Netski D.M. et al., 2005]. Первые ВГС-специфические антитела относятся к классу М, через 5-7 дней после которых определяются специфические антитела класса G.
В нашем исследовании анти-ВГС IgM (первичные и вторичные) были обнаружены у 9 человек из 17 больных ОГС. Четыре человека с этим же диагнозом по иммуноглобулиновым критериям, обсуждаемым в разделах 1.3 и 6.3, должны быть отнесены к пациентам с хронической ВГС-инфекцией. Поэтому специфический гуморальный иммунитет этих людей будет разобран в разделе 6.3. Все больные ОГС не применяли антивирусные препараты, т.е. имели естественное течение инфекции.
Как установлено нами частота обнаружения анти-ВГС IgM в острую фазу инфекции составляет почти 53% (52,9%), по результатам других авторов -64,3%; 45,0%; 54,5%; 58,2% (55,5±4,0%) [Quiroga J.A. et al., 1991; Chen P.-J. et al., 1992; Yamaguchi N. et al., 2000; Бузина А.Б., 2004]. Титры анти-ВГС IgM, которые были определены впервые при ОГС, имели невысокие значения от 1/5 до 1/20. В период до 2-х месяцев острой фазы специфические антитела класса M выявлялись чаще, чем в последующие 4 месяца. Снижение частоты обнаружения анти-ВГС IgM к 3-ему месяцу острой фазы инфекции было отмечено также А.Б. Бузиной [Бузина А.Б., 2004]. Можно предположить, что в период с 2-ого по 4-ый месяц ОГС происходит ограничение репликации вирусной РНК и, соответственно, уменьшение образования новых антигенных вариантов вируса, о чем свидетельствует более редкое определение анти-ВГС IgM. Действительно, факт снижения частоты обнаружения вирусной РНК у большинства больных после 3-его месяца острой фазы подтверждает исследование A. Lavilette и соавт. [Lavilette A. et al., 2005].
Титры анти-ВГС IgM у людей с разными исходами ОГС были одинаковыми (1/5-1/20). Продолжительность обнаружения этих антител в группе людей с элиминацией ВГС не превысила 2-х первых месяцев ОГС, что подтверждает данные С.Н. Соринсона [Соринсон С.Н., 1998].
1.2. Иммуноглобулины G к оболочечным антигенам
Для выявления иммуноглобулинов G к белкам El и Е2 были использованы синтетические пептиды, моделирующие следующие В-эпитопы: ЫНг-концевой, срединный и СООН-концевой из консенсусной последовательности 1-ого ГВР (пептиды I-III) [Clayton R.F. et al., 2002; Sobolev B.N. et al, 2000], два нейтрализующих связывание вируса с гепатоцитами (пептиды IV и V) [Clayton R.F. et al., 2002; Drummer H.R. et al., 2002; Garcia J.E. et al., 2002], три иммунодоминантных из белка El (пептиды VI-VIII) [Ray R. et al., 1994; Zibert A. et al., 1999; Wang Y.F. et al., 1996] и 13 пептидов из консервативных участков, выявленных B.N. Sobolev и соавт. [Sobolev B.N. et al, 2000]. У 9 (53%) из 17 больных были обнаружены антитела к синтетическим пептидам I-VIII (табл. 2). К консервативным областям белков El и Е2 иммуноглобулины G были обнаружены только у одного больного на 6-ом месяце ОГС и только к пептиду с аминокислотными остатками 424-438 (белок Е2).
Таблица 2. Локализация синтетических пептидов в оболочечных белках
и частота их взаимодействия с сыворотками больных ОГС.
№№ Вирусные белки и локализация синтетических пептидов Иммунореактивность (доля позитивных
сывороток в %)
I *Е1-Е2:381 -394 35,3%
II Е2: 389 - 403 17,6%
III Е2: 400-411 23,5%
IV Е2: 408 - 422 11,8%
V Е2: 432 - 446 11,8%
VI El: 212-224 23,5%
VII El: 244 - 260 11,8%
VIII El: 313-324 17,6%
* Структура пептидов I, II и III выведена из консенсусной последовательности 1-ого ГВР [Sobolev B.N. et al., 2000].
Частота обнаружения иммуноглобулинов в к анализируемым пептидам не зависела от наличия анти-ВГС Динамика уровня антител к этим
пептидам в течение длительного времени наблюдения после начала острой фазы инфекции представлена в табл. 3. Таблица 3. Изменение содержания антител к синтетическим пептидам у
людей с острым гепатитом С и после его завершения.
Шиф- Время анализа Номе{ за пептидов из оболочечных белков
ры I II III IV V VI VII VIII
29-2 1 мес. 5 мес. 8 мес. (1/10)* 1,571 1,338 1,255 (1/5) 1,200 1,116 (1/5) 1,268 1,044 (1/10) 1,575 1,373 1,192 (1/5) 1,339 1,014 (1/5) 1,197 1,004 (1/5) 1,237 (1/5) 1,247 1,009
71-2 3 нед. 4 мес. 9 мес. - - - - - (1/Ю) 2,037 2,011 1,843 - (1/5) 1,005 1,029 1,036
80-2 1 мес. 6 мес. - - - - - - - (1/5) 1,011 1,020
84-2 1 мес. 2-12 мес. - (1/5) 1,010 (1/5) 1,018 - (1/5) 1,010 (1/5) 1,013 - -
4-2 1,5 мес. 3 мес. - - (1/10) 1,785 1,143 - - - - -
Г-20 2 нед. 2,14 мес. (1/5) 1,484 - _ - (1/5) 1,009 -
100-1 1 мес. 4 мес. (1/5) 1,162 - - - - (1/5) 1,113 - -
П-99 2 мес. 4 мес. 6 мес. 10,12 мес (1/5) 1,018 1,012 1,004 (1/5) 1,002 (1/5) 1,308 1,052 (1/5) 1,190 - - - -
К-01: 2 нед. 4 мес. (1/5) 1,418 1,143 - - - - - - -
* В скобках указаны титры антител, под ними - величины КП, при отсутствии антител поставлен прочерк. У 2-х человек (шифры 84-2 и П-99) ОГС завершился элиминацией вируса, у пациента 100-1 исход острой фазы неизвестен, у остальных - развился ХГС.
Первые иммуноглобулины в к пептидам из оболочечных антигенов были направлены на ЫН2- и СООН-концевой эпитопы 1-ого ГВР (пептид I и III) и ИНг-концевой эпитоп белка Е1 (пептид IV). Данные по частому выявлению В-эпитопов из 1-ого ГВР антителами людей, находящихся на поздних сроках ОГС, были получены ранее [гЛеП А., Ме1зе1 Н. ег а1., 1997; Яау К. е1 а1., 1994]. В нашем исследовании установлено появление антител к этим пептидам в начальном периоде острой фазы инфекции, начиная со 2-3-ей недели, что совпадает с результатами М. ЬадиНа^з и соавт. и К. Р. Дудиной [Ьа§иНап1з М. е1 а1., 2002; Дудина К.Р., 2003]. Но частота выявления этих антител у названных выше авторов составила 57,1%, что выше, чем в нашем исследовании (29,4%). Такое расхождение связано с разной структурой модельных пептидов.
Исследуя динамику содержания анти-пептидных нам удалось
обнаружить, что наивысший уровень этих антител наблюдался в первый месяц ОГС. Затем происходило снижение содержания антител у большинства
(77,8%) людей. М. ЬадиНа^з и соавт. обнаружили постепенное увеличение
Хч
уровня к МН2- и СООН-концевым пептидам из 1-ого ГВР в период с 6 недель до 7 месяцев у всех больных, кроме пациентов с элиминацией вируса, у которых отмечалось снижение содержания этих антител [ЬазиНа^Б М. ег а1., 2002]. Как показали А. ЬауИе«е и соавт., с 3-его месяца ОГС происходит уменьшение вирусной нагрузки у большинства больных [ЬауПейе А. й а1., 2005]. Поэтому логично ожидать снижения содержания антител к белкам Е1 и Е2, так как известно, что эти антитела определяются при выраженной виремии [Ье81^£>1а Я. е1 а1., 19954; Сеппо А. ег а1., 1997].
Не обнаружено зависимости между исходом ОГС и наличием антител класса О к анализируемым пептидам. Из 4-х человек с естественной
элиминацией вируса только у 2-х больных эти антитела были обнаружены. Причем они были направлены к пяти пептидам: I - V. Пептиды III, IV и V моделируют вируснейтрализуклцие В-эпитопы. У 66,7% больных, у которых острая инфекция перешла в хроническую, также обнаружены антитела к анализируемым пептидам. Два человека, у которых ОГС завершился развитием персистентной инфекции, в острую фазу не имели антител к анализируемым пептидам. У этих больных наблюдалось разное клиническое течение ХГС: у первого - на 7-8-ой месяц после начала острой фазы произошло усиление цитолиза гепатоцитов и увеличение вирусной нагрузки, через несколько недель появились анти-пептидые IgG. У второго пациента с легким течением ХГС антитела к 1-ому ГВР появились через 14 месяцев после начала ОГС.
Таким образом, по наличию или отсутствию антител к восьми иммунодоминантным В-эпитопам оболочечных белков нельзя предсказать исход острой фазы инфекции и течение ХГС, что противоречит заключению А. Zibert и соавт. и Т.А. Ветрова [Zibert A., Meisel Н. et al., 1997; Ветров Т.А., 2003]. A. Zibert и соавт. обнаружили, что ранний гуморальный ответ на NH2-концевой эпитоп 1-ого ГВР встречается только у людей с естественной элиминацией ВГС [Zibert A., Meisel Н. et al., 1997]. Но по нашим данным (табл. 3) ранее появление антител на МН2-концевой эпитоп 1-ого ГВР наблюдается и у больных (шифры 29-2, Г-20 и К-01), у которых впоследствии развился ХГС.
Впервые нами показано, что исход ОГС не зависит от гуморального ответа на восемь линейных В-эпитопов белков Е1 и Е2, три из которых являются вируснейтралгоующими, и после 2-ого месяца острой фазы у большинства больных людей происходит снижение уровня антител класса G к этим В-эпитопам оболочечных белков.
1.3. Появление антител класса G к капсидному белку и неструктурным антигенам и изменение их содержания при развитии
хронической инфекции Исследуя сыворотки больных ОГС от 2-х недель после начала желтухи до 3-х месяцев, удалось установить последовательность появления антител к
19
структурным и неструктурным антигенам (табл. 4.) Первые выявляемые специфические антитела класса О в этой группе антигенов направлены на белки капсидный и N83, что подтверждает данные других авторов рЗшЬегй Т. е1 а1„ 1992; Тапака К. е1 а!., 1993; Уаша^сЫ N. ег а1., 2000; О.М. et а!., 2005]. Но у 2-х пациентов (шифр Г-20 и К-01) до появления этих антител были обнаружены иммуноглобулины в к пептиду I из белка Е2. Одинаково часто выявлялись антитела либо к капсидному белку, либо к антигену N53. Временной интервал, в который определялся только один маркер, составлял одну-две недели. Постепенно набор антител (т.е. их направленность) расширялся, и на 4-ой неделе в 14,3% сывороток выявлялись все анализируемые маркеры.
Таблица 4. Появление иммуноглобулинов в к капсидному (кор)
и неструктурным антигенам.
Варианты выявляемых антител 2 недели 3 недели 1 месяц 2 месяца 3 месяца
IgG к NS3 33,3% 16,6% нет нет нет
IgG к кор 33,3% 33,3% 23,6% нет нет
IgG к кор HNS3 33,3% 33,3% 42,8% 12,5% нет
IgG к кор, NS3 и NS4ab нет 16,6% 14,3% 62,5% 62,5%
IgG к кор, NS3, NS4ab и NS5a нет нет 14,3% 25,0% 37,5%
К 6-му месяцу ОГС, завершающегося развитием персистентной инфекции, усредненные титры антител класса G к белкам кор и NS3 достигали значения 1/640, к антигену NS4ab — 1/80, к белку NS5a — 1/10 (рис. 1). Иммуноглобулины к капсидному антигену методом оптического биосенсора определялись через 5 мин после внесения сыворотки в кювету, но с титра 1/20:
В работах начала 1990-х гг. сообщалось, что первые ВГС-специфические иммуноглобулины G направлены к неструктурным белкам NS4ab и NS5a [Van
Der Poel C.L. et al., 1991; McHutchison J.L. et al., 1992]. Недавно D.M. Netski и соавт. опубликовали данные о том, что первые ВГС-специфические антитела направлены на антиген NS3 [Netski D.M. et al., 2005]. У 33,3% больных ОГС в нашем исследовании тоже эти антитела были первыми. Последним по времени появления оказались aHTH-NS5a IgG.
Известно, что капсидный белок является наиболее иммуногенным антигеном ВГС, имеющим "несколько кластеров консервативных В-эпитопов [Chien D.Y. et al., 1994]. Титры антител класса G к белкам кор и NS3 в нашем исследовании имели близкие значения. Очевидно, белок NS3 так же, как и капсидный, содержит высокоиммуногенные консервативные В-эпитопы.
Разведения А (хитры)
9(1/1280) 7(1/320) 5 (1/80) 3(1Я0) 1(1/5)
■у
•ïf ^-"f ^
-Г -г-
анти-соге, aHm-NS3
-Hjr"" imH-NS4ab
amn-NS5a
1 i i
2 4
-1-1-1-1-1—?
8 10 12
Время, месяц
Рис. 1. Динамика уровня антител к антигенам кор, N83, №4аЬ, N853 при остром гепатите С, переходящем в ХГС. Титры иммуноглобулинов в к белкам кор и N83 имеют очень близкие значения.
1.4. Изменение титров иммуноглобулинов С к капсидному и неструктурным антигенам при элиминации вируса
■ У 4-х пациентов из 17 больных острый гепатит С завершился элиминацией вируса, что подтверждается данными контрольных исследований в течение 3-5 лет. У этих 4-х человек к 2-ому месяцу ОГС нормализовались активности АлАТ и АсАТ и перестала определяться РНК ВГС в крови и лейкоцитах. Максимальные титры ВГС-специфических антител у этих больных наблюдались к 2-3-ему месяцу. Затем их содержание уменьшилось, и у 2-х пациентов к 12-ому месяцу специфические антитела перестали определяться. Изменение уровня иммуноглобулинов О к капсидному белку изображено на рис. 2.
Разведения А (титры)
9(1/1280) 7 (1/320) 5(1/80) Я (1Я0) 1(1/5)
/
'А
/
/
ОГС-
переход в ХГС
[Л
огс-
злиминация ВГС
I I I I I 1111 2 4 6 8
-1-1-Г—>
10 12
Время, месяц
Рис. 2. Динамика титров иммуноглобулинов в к капсидному белку при разных исходах острого гепатита С. . .
Наиболее высокие титры специфических иммуноглобулинов в при ОГС наблюдались к 6-ому месяцу в случае, если острая фаза завершалась развитием персистентной инфекции (рис.1). С 4-ого месяца были выявлены первые различия в величинах титров иммуноглобулинов О к капсидному белку, которые отражали исход острой фазы инфекции (рис. 2). У всех людей, у которых ОГС завершился элиминацией вируса, наблюдалось снижение титров иммуноглобулинов О к капсидному и неструктурным белкам. У остальных больных (у них острая инфекция перешла в хроническую) титры этих иммуноглобулинов увеличились на 2 разведения в период с 4-ого по 12-ый месяц (рис. 1).
Ранее М. ВеЫ и соавторы сообщили, что при ОГС, завершающемся элиминацией вируса, происходит значительное снижение уровня антител к белкам ИБЗ и №5а [ВеЫ М. е! а!., 1999]. Исследуя течение ВГС-инфекции у шимпанзе, Б. Е. ВавБеи с соавт. обнаружили, что слабо выраженный гуморальный ответ на белки N53 и КБ4аЬ и быстрое исчезновение антител к белку НБ5а происходит у обезьян с начинающейся элиминацией вируса [Вазве« Б.Е. е1 а1., 1998]. Вероятно, на неструктурные белки ВГС формируется непродолжительный гуморальный ответ, поэтому уменьшение титров антител к этим белкам (особенно к N55а) может быть маркером снижения вирусной нагрузки. В нашем исследовании установлена последовательность исчезновения специфических антител класса в в случае элиминации вируса: анти-оболочечные, анти-К85а, анти-К84аЬ, аити-ЫБЗ, анти-капсидные.
Впервые нами установлены титры антител класса в к индивидуальным антигенам вируса при ОГС, определены наивысшие титры, характерные для этой фазы, обнаружены закономерности изменения титров специфических антител при разных исходах острой фазы. Анализ титров иммуноглобулинов О к капсидному и неструктурным антигенам в 1-ый, 2-ой, 4-ый и 6-ой месяцы дает информацию об исходе ОГС.
2. Специфический гуморальный иммунитет при естественном течении хронического гепатита С 2.1. Частота выявления и титры специфических иммуноглобулинов М
При анализе образцов крови от 160 пациентов с естественным течением ХГС было обнаружено, что 128 человек (80,0%) имеют анти-ВГС 1§дУ1, что достоверно чаще, чем у больных ОГС. Частота обнаружения этих антител по данным другах авторов составляет 71,0%; 90,0%; 72,0%; 83,3% (79,1 ±4,6%) [Уик! N. « а1., 1995; Тгап А. ег а1., 1997; Тошийо Р. е1 а1., 1999; Уата^сЫ N. а а1., 2000]. Результаты определения титров анти-ВГС 1§М, активностей трансаминаз и выявления РНК вируса в крови больных представлены в табл. 5.
Таблица 5. Титры анти-ВГС ^М, наличие вирусной РНК в крови и активности трансаминаз у пациентов с ХГС.
Величины титров Относительное содержание титра антител Наличие РНК Активности* АлАт Активности* АсАТ
Антитела не обнаружены 20,0% 56,3% 1,5±0,1 1,2±0,1
1/5 26,2% 75,0% 1,8±0,2 1,6±0,1
1/10 20,0% 74,1% 2,4±0,4 1,6±0,1
1/20 16,2% 92,3% 2,2±0,3 1,6+0,2
1/40 19,4% 100% 3,0±0,7 2,1 ±0,4
1/80 8,7% 100% 2,4±0,4 1,7±0,2
1/160 1,9% 100% 2,4+0,2 2,7±0,2
* Здесь и далее в таблицах активности трансаминаз представлены как превышение верхней границы нормы.
: При мониторинговом тестировании сывороток этих людей в течение 3-8 лет у 90 пациентов (56,2%) установлена динамика титров (снижение и увеличение на 1-2 разведения) анти-ВГС ^М. Обнаружена зависимость между частотой определения РНК ВГС в крови и величиной титра анти-ВГС 1цМ (г8=0,886; Р=0,01). Факт существования зависимости между выявлением специфических анти-кор 1°М и наличием РНК ВГС в крови отмечен ранее несколькими коллективами ученых [ВгШапй Б. е1 а1., 1993; РаЬпг1 Р. е1 а1., 1996;
Тошийо Р. с1 а!., 1999]. По данным Р. ТошиИо и соавт. у 86% людей, имеющих анти-кор 1§М, в крови выявлялась РНК ВГС, а по данным Б. РаЬпг! и соавт. -только у 33% больных |ТаЬпа Б. ег а!., 1996; Тошийо Р. е1 а!., 1999]. Такое расхождение вызвано тем, что частота обнаружения вирусной РНК зависит от величины титра специфических иммуноглобулинов М. В нашем исследовании показано, что при титрах анти-ВГС 1/40 и выше РНК ВГС выявляется во всех образцах. Между активностями АлАТ и АсАТ и величиной титра анти-ВГС ^М корреляционная зависимость не обнаружена.
Впервые нами установлены титры специфических (вторичных) иммуноглобулинов М при ХГС, показано, что частота их выявления выше, чем при острой инфекции, установлена корреляционная зависимость между наличием РНК в крови и титрами этих иммуноглобулинов.
2.2. В-клеточный ответ на оболочечные антигены вируса.
В сыворотках крови 23-х больных ХГС (74,2%; всего 31 человек) были обнаружены иммуноглобулины в к восьми пептидам, моделирующим линейные В-эпитопы оболочечных белков. На рис. 3 представлены данные по выявлению антител класса в к этим пептидам у больных острым и ХГС.
60
I II III IV V VI VII VIII
Номера пептидов ¡
Рис. 3. Частота обнаружения иммуноглобулинов G к синтетическим пептидам из белков El и Е2 у больных острым и хроническим гепатитом С.
Различия в частоте выявления антител класса G к анализируемым пептидам у людей с острым и хроническим гепатитом С статистически недостоверны. T.F. Baumert и соавт., используя вирусоподобные частицы (ВПЧ) с нативной конформацией белков El и Е2, обнаружили, что при ХГС чаще чем при острой инфекции обнаруживаются антитела на оболочечные белки [Baumert T.F. et al-, 2000]. Как впервые показано в нашем исследовании, при ХГС достоверно (Р=0,04) чаще выявлялись иммуноглобулины G к пептиду III (СООН-концевой эпитоп 1-ого ГВР), на который образуются антитела, предотвращающие связывание вируса с клеткой.
2. 3. Титры антител класса G к нуклеокапсидному белку
Результаты выявления антител к капсидному белку у 160 пациентов с естественным течением ХГС представлены в табл. 6, где приведены также данные по определению РНК ВГС и активностей трансаминаз.
Таблица б. Выявление анти-кор IgG, РНК ВГС в крови и активностей трансаминаз у пациентов с естественным течением ХГС.
Величины титров антикор IgG Относительное содержание титра Наличие РНК Активности АлАТ Активности АсАТ
Менее 1/800 2,5% 25,0% 1,3±0,3 норма
1/800 2,5% 50,0% 1,2±0,1 1,1±0,1
1/1000 16,9% 64,0% 1,8±0,2 1,4±0,1
1/2000 18,8% 78,6% 1,8±0,2 1,6±0,2
1/4000 26,3% 78,6% 2,6±0,3 1,9±0,2
1/8000 15,6% 93,8% 2,7±0,4 1,8±0,2
1/16000 11,3% 96,0% 2,2±0,3 1,8±0,3
1/32000 3,8% 100% 2,7±0,3 2,0±0,2
1/64000 1,9% 100% 4,6+2,2 2,3±0,6
1/128000 0,6% РНК обнар. 3,1 2,2
У подавляющего большинства (97,5%) больных ХГС титры анти-кор имели значения больше 1/800. Частота выявления анти-кор в титрах менее 1/800 с учетом ошибки, вычисленной по формуле шп х Рп): (п - 1), равна 1,2. Возможное присутствие сывороток с титрами менее 1/800 составляет от 1,2% до 3,7% (наивысшее целочисленное значение равно 4%).
Ни у одного пациента с ОГС на 2-3-ю неделю после начала желтухи не обнаружены анти-кор в титрах выше 1/20. Поэтому четверо людей с диагнозом ОГС (2-3-я неделя желтухи), имевших антитела к капсидному белку в титрах 1/2000 и более, должны быть отнесены к пациентам с ХГС.
Самые высокие титры иммуноглобулинов О к капсидному антигену были обнаружены в образцах крови людей с естественным течением ХГС. Наивысшие значения титров этих антител составили 1/64000 и 1/128000, что свидетельствует о высокой иммуногенности капсидного белка. Учитывая, что острая ВГС-инфекция имеет ограниченный временной интервал, очевидно, что титры анти-кор также должны иметь верхнее предельное значение в острой фазе инфекции. Действительно, на 6-ом месяце ОГС наибольшая величина титра анти-кор составила 1/832 (разведение 7,8±0,5), наиболее часто встречающийся титр 1/640. Величины титров анти-кор 1§0 можно использовать как дополнительный маркер, позволяющий проводить дифференциальную серодиагностику острого и хронического гепатита С. Достоверность того, что при ОГС титры анти-кор будут ниже 1/800, а при хронической инфекции выше этого значения составляет Р<0,0001. (Можно использовать разведение 1/1000, а не 1/800.) После антивирусной терапии у некоторых больных ХГС обнаруживаются низкие титры анти-кор Снижение уровня специфических антител при интерферонотерапии будет разобрано в разделе 3.3.
При мониторинговом тестировании образцов крови от 25 людей с ХГС в течение 5-7 лет была обнаружена стабильность титров антител к капсидному белку, что подтверждает результаты Я. Регшо1а и соавт. [Регпю1а Я. е1 а!., 1999]. Чем больше величина титра анти-кор тем за более длительный
промежуток времени происходит увеличение титра.
: Между величинами титров анти-кор IgG и наличием РНК ВГС выявлена позитивная корреляционная зависимость, rs=0,985 (Р<0,001). Факт существования зависимости между обнаружением анти-кор IgG и наличием РНК ВГС в крови ранее отмечали S. Kawano и соавт. [Kawano S. et al., 1994]. Но Y.M. Park и соавт. не обнаружили такой зависимости [Park Y.M. et al., 1999]. Эти расхождения вызваны тем, что при низких титрах анти-кор IgG вероятность выявление РНК меньше, чем при высоких титрах. Тестируя образцы от больных с разными титрами антител к капсидному белку, эти авторы сделали противоположные заключения. В представленном нами исследовании при титрах анти-кор IgG равных 1/32000 и выше РНК ВГС обнаруживалась во всех образцах крови. Между уровнем активности АлАТ (но не АсАТ) и величиной титра анти-кор IgG была выявлена позитивная корреляционная зависимость (rs=0,927; Р<0,001).
Впервые нами предложен еще один маркер дифференциальной диагностики острого и хронического гепатита С — величина титра анти-кор IgG (1/1000). Установлена корреляционая зависимость между титрами иммуноглобулинов G к капсидному белку, выявлением РНК ВГС в крови и активностью АлАТ.
2.4. Частота обнаружения и уровень иммуноглобулинов G к неструктурным антигенам
При анализе частоты обнаружения иммуноглобулинов G к NS-антигенам у 160 больных с естественным течением ХГС были выявлены следующие закономерности: антитела класса G к антигенам NS3 и NS4ab обнаруживались наиболее часто (95,5% и 96,3%, соответственно); эти же иммуноглобулины имели самые высокие титры до 1/16000; реже всего определялись антитела к белку NS5a (81,3%).
В отличие от анти-кор IgG величины титров антител класса G к NS-белкам при ХГС имеют широкий диапазон значений, с двумя максимами при титрах 1/5-1/10 и 1/200-1/2000. Хотя чаще всего не выявлялись антитела к белку NS5a, но у 15,1% людей на этот антиген по сравнению с остальными NS-
28
белками формировался самый высокий титр антител. Если человек инфицирован вирусом субтипа За, а иммуносорбент содержит антиген субтипа 1а, то выявление aHTH-NS5a IgG наблюдается реже [Neville J.A. et al., 1970J. Большинство иммуноферментных тест-систем содержат в качестве иммуносорбента фрагменты белка NS5a субтипа 1а.
В табл. 7 представлена зависимость между титром к одному из неструктурных белков ВГС, имевшим наивысшее значение в сыворотке, наличием РНК ВГС в крови и активностями АлАТ и АсАТ. Максимальные титры антител на NS-антигены были выше у больных с естественным течением ХГС, чем у больных с острым гепатитом (Р<0,05). Но титры антител на эти антигены имели общий диапазон низких значений. Ahth-NS3 IgG чаще всего выявлялись в титрах 1/400-1/2000 и 1/5; aHm-NS4ab IgG - в 1/200-1/2000. Анти-NS5a IgG имели 2 кластера наиболее часто встречающихся титров 1/5 и 1/4001/1000.
Таблица 7. Титры анти-NS IgG*, наличие РНК ВГС и активности
АлАТ и АсАТ у больных ХГС.
Величины Содержание Наличие Активности Активности
титров отдельного титра РНК АлАТ АсАТ
1/5 2,5% 4 сыв. 50,0% 1,2±0,1 1,0±0,1
1/10 3,8% 6 сыв. 50,0% 1,1±0,1 1,0±0,1
1/20 3,2% 5 сыв. 66,7% 2,0+0,3 1,5±0,2
1/40 3,2% 5 сыв. 48,6% 1,7±0,4 1,5±0,4
1/100 7,6% 12 сыв. 75,0% 2,1±0,4 1,8±0,3
1/200 7,6% 12 сыв. 66,7% 1,б±0,3 1,5±0,2
1/400 15,0% 24 сыв. 61,1% 1,7±0,4 1,5±0,3
1/1000 19,6% 31 сыв. 78,3% 1,8±0,3 1,5±0,4
1/2000 15,8% 25 сыв. 84,0% 2,4±0,5 1,7±0,3
1/4000 16,5% 26 сыв. 88,5% 2,0±0,6 1,5±0,3
1/8000 3,8% 6 сыв. 100% 1,8±0,5 2,0±0,6
1/16000 2,5% 4 сыв. 100% 2,3±0,7 2,0+0,3
* В каждой сыворотке среди титров антител к трем №-белкам учитывался только один титр, имевший наивысшее значение.
В представленном исследовании показана высокая иммуногенность белков ВГС, особенно кор и N83; обнаружена прямая корреляционная зависимость между величинами титров анти-ИЗ 1§(3, наличием РНК ВГС в крови (1у=0,906; Р<0,001) и активностью АлАТ (г5=0,615; Р<0,01).
3. Динамика показателей специфического гуморального иммунитета при этиотропиой терапии больных хроническим гепатитом С 3.1. Изменения титров вирусспецифических антител класса М
Исследованы сыворотки 25 человек, прошедших годовой курс комбинированной терапии реафероном и рибомидилом. Двенадцать человек закончили , лечение с позитивным вирусологическим и биохимическим результатом, 11 — безуспешно по этим двум параметрам, у 2-х пациентов — наблюдалась только нормализация биохимических показателей. Пациенты двух последних подгрупп объединены в одну группу с безуспешным результатом лечения по основному критерию - наличие РНК вируса в крови. Данные по выявлению анти-ВГС 1§М, РНК и активностей трансаминаз перед началом терапии представлены в табл. 8. Хотя анти-ВГС ^М у людей с позитивным результатом терапии обнаруживались в 2 раза реже, чем в группе с безуспешным лечением, различия статистически не достоверны. Группы пациентов различались по средним показателям содержания РНК ВГС в крови.
Таблица 8. Результаты выявления анти-ВГС ^М, РНК ВГС и активности печеночных трансаминаз перед терапией.
Титр анти-ВГС ^М Пациенты (13 чел) с безуспешной терапией Пациенты (12 чел) с позитивным итогом лечения
Нет антител 7,7% 16,7%
1/5 38,5% 25,0%
1/10 38,5% 41,7%
1/20 15,4% 16,7%
Среднее разведение 1,62±0,58 1,58+0,55
Диапазон количественных значений РНК (МЕ/мл) 5,0x10'-7,2 х107 1,2x10'-6,9 хЮ6
Среднее содержание РНК (МЕ/мл) (2,37±2,51) х 107 (1,98±1,09) х 106
Средняя активность АлАТ 2,9+0,6 2,2±0,5
Средняя активность АсАТ 1,7±0,3 1,3±0,2
Динамика уровня анти-ВГС 1£М у пациентов с позитивным результатом терапии имела следующие закономерности: снижение титра в 1-ый месяц лечения наступило у 40% больных, с 3-10-ого - еще у 50%. Антитела перестали определяться с 1-6-ого месяца терапии у 70% больных. У остальных пациентов сохранились стабильные титры анти-ВГС 1§М. У 2-х человек эти антитела перед терапией не обнаруживались. У 5 пациентов с безуспешной терапией к концу лечения тоже наблюдались позитивные изменения: у 2-х человек нормализовались АлАТ и АсАТ (перед началом терапии активности ферментов незначительно превышали норму), у 3-х (23,1%) перестали определяться анти-ВГС Но при контрольном анализе на 6-ой и 12-ый месяц после окончания лечения у этих трех пациентов вновь появились анти-ВГС IgM. У людей с позитивным результатом терапии при контрольном анализе на 6-ой месяц не обнаружено изменений в содержании этих антител, но на 12-ый месяц специфические иммуноглобулины М выявились у одного больного. Появление анти-ВГС после окончания терапии - неблагоприятный показатель.
Различия по выявлению ВГС-специфических иммуноглобулинов М у пациентов с позитивным и негативным результатом терапии к 6-ому месяцу были статистически достоверны (Р<0,05 по точному методу Фишера). В нашем наблюдении, так же как и в исследовании Б. 2еш.ет, у пациентов с позитивным результатом лечения уровень вирусной нагрузки был ниже, чем у участников с безуспешной терапией [гешйт Б., 2001]. У людей с позитивным биохимическим результатом лечения исходно перед началом терапии активности АлАТ и АсАТ имели самые низкие значения.
3.2. Динамика содержания иммуноглобулинов G к оболочечным белкам вируса
Антитела класса G к 8-ми синтетическим пептидам, моделирующим иммунодоминантные В-эпитопы оболочечных белков, были обнаружены у 83,3% больных с успешным результатом лечения и у 69,2% участников с безуспешной терапией. Достоверных различий в частоте обнаружения антител к пептидам у этих групп больных перед началом лечения не установлено.
В процессе терапии уровень антител к анализируемым пептидам из оболочечных антигенов ВГС у 88,9% пациентов с безуспешным лечением не менялся. У 90% больных с успешным результатом лечения обнаружены изменения в содержании анти-пептидных IgG в процессе терапии. В этой группе людей антитела к пептиду II перестали выявляться у 50% больных через один месяц лечения, у остальных - сохранились стабильные уровни. Титры антител к пептиду Ш уменьшились со значений 1/20-1/80 до 1/5 с 6-ого по 9-ый месяц лечения у всех, у кого они были выявлены перед началом терапии. Иммуноглобулины G к пептиду VI перестали определяться с 6-9-ого месяца лечения у 85,7% пациентов, у остальных - снизились. Антитела к пептидам VII и VIII перестали определяться к 3-10-ему месяцу лечения. Однако через 12 месяцев после окончания терапии титры антител к пептидам III и VI увеличились у 66,7% пациентов.
Таким образом, обнаружена динамика уровня иммуноглобулинов G к линейным В-эпитопам белков El и Е2 ВГС у людей с успешным результатом терапии в отличие от пациентов с безуспешным лечением (Р <0,05).
3. 3. Изменение титров антител класса G к капсидному антигену
Диапазон титров анти-капсидных IgG в группах людей с разным результатом лечения был одинаковым 1/1000-1/64000, средние величины титров имели близкие значения: 1/8000 и 1/6400. В процессе терапии у некоторых пациентов обнаружены изменения содержания антител класса G к капсидному белку (табл. 9).
Таблица 9. Динамика титров антител класса в к капсндному белку у больных ХГС с разными результатами лечения.
Группы пациентов Стабильные титры Снижение титров Время начала снижения титров
Безуспешная терапия 84,6% 15,4% 10-ый мес. —15,4%
Успешное лечение нет 100% 1-ый мес. -16,7% 3-6-ой мес. - 58,2% 10-ый мес.-33,3%
Через б и 12 месяцев после окончания лечения титры антител класса G к капсидному белку сохранили свое значение в группе больных с успешным результатом лечения. У 2-х пациентов с безуспешной терапией, у которых наблюдалось снижение уровня анти-кор IgG, на 6-ой месяц после окончания лечения титры этих антител увеличились до прежних значений.
В начале 1990-х годов N. Yuki и соавт. и S. Kawano и соавт. обнаружили зависимость между снижением титров анти-кор IgG и позитивным результатом терапии интерфероном-альфа [Yuki N. et al., 1993; Kawano S. et al., 1994]. Позже Y.M. Park с соавт. проводили изучение динамики титров антител против химерного рекомбинантного белка, содержащего фрагмент капсидного антигена и белка NS3, перед интерферонотерапией и через год после ее окончания [Park Y.M. et al., 1999]. Авторы обнаружили статистически значимое снижение титров aHTH-(Kop+NS3) IgG у пациентов с успешным лечением (по биохимическому и вирусологическому критерию). Как показали наши исследования, изменения в титрах антител класса G к отдельным белкам ВГС наблюдаются при позитивном результате терапии уже с 1-10-ого месяца.
3. 4. Динамика содержания иммуноглобулинов G к неструктурным антигенам вируса
Титры иммуноглобулинов G к неструктурным белкам, определенные перед началом лечения, в группах больных с разными результатами терапии имели близкие значения (1/20-1/4000 и 1/5-1/4000). Динамика уровня антител
класса в. к №-антигенам ВГС у пациентов при проведении терапии представлена в табл. 10.
Таблица 10. Динамика титров иммуноглобулинов С к ^-антигенам у людей с ХГС при проведении интерфероиотерапии.
Антитела У пациентов с безуспешным лечением У пациентов с успешным результатом лечения
Стабильные показатели Снижение титров Стабильные показатели Снижение титров
Анти-БЗ 92,3% 7,7% с 6-го мес. нет у всех: с 1 по 10-ый мес.
Анти-Н84аЬ 180 84,6% 15,4% с 6-10-го мес. нет у всех: с 1 по 10-ый мес.
Анти-МБ5а 76,9% 23,1% с 6-10-го мес. нет у всех *: с 1 по 8-ой мес.
* У 33,2% больных этой группы анти-К85а не обнаружены.
У 23,1% больных с безуспешным результатом терапии наблюдались изменения титров анти-КБ 1£С, а в группе больных с позитивным результатом лечения - у всех участников. Наиболее стабильными оказались титры анти-№3 наиболее изменчивыми — анти-Ы85а ^О. Например, у одного пациента с позитивным результатом лечения титры анти-№5а стали снижаться с 3-его месяца, а антитела класса в к белкам N83 и №4аЬ с 10-ого месяца.
Изменение ВГС-специфического гуморального иммунитета при позитивном результате лечении наблюдалось уже в 1-ый месяц. В процессе терапии у 75,0% пациентов в течение 1-3-его месяца лечения также нормализовались активности АлАТ и АсАТ, в это же время произошло снижение вирусной нагрузки на 1-2 порядка и уменьшение титров специфических иммуноглобулинов М и & У оставшихся 25% участников активности АлАТ и АсАТ нормализовались к 6-ому месяцу, вирусная РНК перестала определяться в крови к 10-ому месяцу, наблюдалось постепенное снижение титров специфических антител. Снижение анти-ВГС 1£>М началось с 1-3-его месяца и продолжалось до конца терапии, к 3-6-му месяца уменьшались
титры анти-кор IgG и хотя бы к одному NS-белку, к 6-му месяцу снизился уровень иммуноглобулинов G против 2-4 вирусных антигенов.
Различия в изменении титров специфических антител в двух группах людей на 6-ой месяц были достоверными по иммуноглобулинам G к белкам кор, NS3, NS4ab и NS5a (Р<0,05). Снижение титров антител класса M и G к структурным и неструктурным белкам ВГС является дополнительным (иммуноглобулиновым) критерием эффективности этиотропной терапии. Наиболее информативным для контроля текущей терапии является определение титров специфических антител классов M и G в 1-ый, 3-ий и 6-ой месяцы лечения.
4. Вирусспецифический гуморальный иммунитет у людей, перенесших острую инфекцию с выздоровлением
Факт выздоровления после ОГС подтверждается длительным как минимум в течение 3-х лет отсутствием всех клинических, биохимических и вирусологических проявлений инфекции. Реконвалесценция, которая в разной степени выражена у больных после острой фазы инфекции, может смениться через некоторое время (от нескольких месяцев до нескольких лет) типичным признаками ХГС или внепеченочными проявлениями ВГС-инфекции. Под реконвалесценцией после ОГС понимается исчезновение клинических симптомов [Балаян М.С., Михайлов М.И., 1999].
Чаще всего выздоравливают те больные ОГС, у которых в ранний период острой фазы незначительно повышены печеночные ферменты, отсутствует или слабо выражена желтуха, РНК ВГС обнаруживается в низких титрах, и в течение первого года после ОГС резко уменьшается уровень всех специфических антител [Farci P. et al., 1991; Chen P.-J. et al., 1992; Mattsson L. et al., 1993; Tan D. et al., 1994; Hiño K. et al., 1994; Beld M. et al., 1999; Okayama A. et al., 2002].
В нашем исследовании при анализе сывороток 8 людей, перенесших ОГС с выздоровлением 3 и более лет назад, не удалось выявить ни в одном образце анти-ВГС IgM, антител класса G к пептидам из оболочечных белков и у 37,5%
(—40%) участников анти-кор У пята человек произошла самопроизвольная элймйнадия ВГС, еще у 3-х участников она наступила после интерферонотерапии, проведенной в острый период болезни. У 2-х из этих 3-х больных наблюдалось исчезновение антител ко всем антигенам ВГС.
У одного пациента были выявлены только анти-Ы84аЬ в титре 1/5 через 1 год после успешного курса интерферонотерапии, проведенного в острую фазу инфекции. Еще через год у этого пациента анти-№4аЬ исчезли. Еще у одного пациента с самопроизвольным выздоровлением антйтела к ЫЗ-антигенам определялись в течение 2-х лет, первыми перестали выявляться антй-Ы85а, затем апти-Ы84аЬ и последними анти-ЫБЗа.
Антитела к капсидному антигену были обнаружены у 5 из 8 пациентов (62,5%). Среднее разведение сывороток 2,6+0,8, наиболее вероятные в этой группе пациентов титры анти-кор имеют значения 1/10-1/20. Величины титров анти-кор не менялись в течение 3—8 лет наблюдения.
5. Специфический гуморальный иммунитет у детей с маркерами ВГС-инфекции 5.1. Частота выявления специфических иммуноглобулинов М у детей старше 2-х лет больных хроническим гепатитом С
При исследовании образцов крови от 49 детей с хроническим гепатитом С было установлено, что в 57,1% образцов имеются антитела класса М к ВГС, что достоверно меньше, чем у взрослых больных. Величины титров анти-ВГС у детей не превышали 1/20, что ниже, чем у взрослых пациентов с аналогичным диагнозом (табл. 11).
При длительном наблюдении за уровнем ВГС-специфических иммуноглобулинов М было установлено изменение титров этих антител в 12,2% сывороток, что меньше чем у взрослых больных. Величины титров анти-ВГС у детей снижались, увеличивались и в ряде случаев возвращались к первоначальным значениям. • '
Таблица 11. Данные по выявлению анти-ВГС 1ёМ, вирусной РНК в крови и активностей печеночных трансаминаз у детей с ХГС.
Величины титров Относительное содержание величин титров Наличие РНК Активность АлАТ Активность АсАТ
Антитела не выявлены 42,9% 51,6% 1,4±0,2 1,2±0,1
1/5 25,4% 53,4% 1,5±0,2 1,2±0,1
1/10 18,8% 66,7% 1,5±0,1 1,2±0,2
1/20 15,6% 80,0% 1,9±0,5 1,8±0,4
5.2. Антитела класса в к капсидному антигену у детей старше 2-х лет больных хроническим гепатитом С
При исследовании образцов крови этой группы детей установлено, что антитела к капсидному антигену определялись в титрах, не превышающих значение 1/4000 (табл. 12), что достоверно меньше, чем у взрослых больных.
Таблица 12. Выявление анти-кор 1§С, РНК ВГС и активностей
печеночных ферментов у детей с ХГС.
Титры антител Относительное содержание титра Наличие РНК Активность АлАТ Активность АсАТ
Антитела не выявлены 4,1% 50,0% 1,0±0,1 1,0±0,1
1/20 4,1% 50,0% 1,2±0,2 1,2±0,1
1/40 8,2% 45,3% 1,2±0,1 1,2±0,2
1/100 14,3% 42,8% 1,6±0,2 1,4±0,2
1/200 12,2% 50,0% 1,2±0,2 1,1±0,1
1/400 38,8% 84,2% 1,6±0,2 1,4±0,1
1/1000 10,2% 80,0% 1,7±0,3 1,5±0,3
1/2000 4,1% 100% 2,2±0,2 1,7+0,4
1/4000 2,0% РНК обнар. 1,8 1,4
В большинстве сывороток (75,5%) титры антител к капсидному белку составили 1/100-1/1000. Между уровнем антител класса О к капсидному антигену и наличием вирусной РНК в крови обнаружена положительная
корреляция (г5=0,988; Р<0,0005). Между титрами анти-кор 1§С и активностью АлАТ (но не АсАТ) тоже установлена положительная корреляция (г8=0,785; Р<0,003). У детей с ХГС в образцах крови всегда определялась РНК ВГС, если выявлялись анти-кор 1§С в титрах 1/2000 и выше.
5.3. Иммуноглобулины в к неструктурным антигенам вируса у детей старше 2-х лет больных хроническим гепатитом С
При исследовании образцов крови детей с ХГС установлена частота обнаружения иммуноглобулинов О к отдельным ^-белкам вируса, данные представлены в табл. 13.
Таблица 13. Результаты обнаружения иммуноглобулинов в к неструктурным антигенам вируса у детей с ХГС.
Титры антител Анти-ШЗ ДО Анти-№4аЬ ДО Анти-Ы85а ДО
Антитела 13,3% 20,0% 55,6%
не обнаружены
1/5 8,9% 11,1% 15,6%
1/10 6,7% 6,7% 2,2%
1/20 6,7% 22,2% 13,3%
1/40 7,7% 11,1% 8,9%
1/100 10,1% 8,9% 2,2%
1/200 15,6% 8,9% 2,2%
1/400 17,8% 7,9% Не обнаружены
1/1000 4,4% 6,7% Не обнаружены
1/2000 2,2% 4,4% Не обнаружены
1/4000 Не обнаружены 2,2% Не обнаружены
У детей, так же как и у взрослых больных, наиболее высокие титры специфических иммуноглобулинов в были направлены к белкам N83 и №4аЬ. Однако наивысшие значения титров этих антител были ниже, чем у взрослых пациентов. Частота обнаружения иммуноглобулинов О к антигену N83 у детей с ХГС составила 87,8%; к Ш4аЬ - 81,6%; к N853 - 53,1%. У детей этой группы реже, чем у взрослых больных, выявлялись антитела к белку N853 (53,1% против 81,3%).
Установлена зависимость между титрами анти-НБ наличием
вирусной РНК в крови и активностями АлАТ (табл. 14).
Таблица 14. Титры антител к №-антигенам, выявление РНК ВГС в крови и активности трансаминаз.
Титры анти-КБ Наличие РНК Активности АлАТ Активности АсАТ
Антитела не обнаружены 33,3% 1,1±0,1 1,0±0,1
1/5 50,0% 1,3±0,1 1,1±0,1
1/10 53,3% 1,4±0,2 1,2±0,1
1/20 55,3% 1,9±0,4 1,5±0,2
1/40 66,7% 1,7+0,2 1,3 ±0,2
1/100 75,0% 1,8±0,3 1,4+0,3
1/200 77,8% 1,5±0,2 1,3±0,2
1/400 88,9% 1,8±0,4 1,5±0,3
1/1000 100% 2,7±0,1 2,1 ±0,4
1/2000 100% 2,5±0,3 2,0±0,3
1/4000 100% 2,6±0,2 2,2±0,3
За титр анти-ЫБ принималось то значение среди 3-х величин: анти-N83 анти-Ы84аЬ анти-Ы85а ^О, - которое имело наивысшее
значение. Между уровнем антител класса С к ^-белкам и наличием вирусной РНК в крови установлена положительная корреляция (г5=0,994; Р<0,001). Между титром анти-КЭ и активностью АлАТ (но не АсАТ) тоже обнаружена положительная корреляция (г5=0,848; Р=0,005). У детей с ХГС в образцах крови выявлялась вирусная РНК, если обнаруживались анти-кор в титре 1/2000 и выше и антитела к любому из Ж-белков в титре 1/1000 и выше.
Впервые нам удалось определить количественные характеристики специфического гуморального иммунитета у детей старше 2-х лет с ХГС, обнаружить отличие показателей гуморального иммунитета по сравнению с взрослыми больными, установить позитивную корреляцую между титрами специфических антител, выявлением РНК ВГС в крови и активностью АлАТ.
5.4. Изменения титров специфических антител у детей до 2-х лет, рожденных матерями с маркерами ВГС-инфекции
Факт инфицирования вирусом гепатита С детей первых месяцев жизни при наличии материнских ВГС-специфических антител, низкой виремии и с кратковременными повышениями активности печеночных трансаминаз установить трудно. Поэтому было выполнено изучение динамики антител к отдельным антигенам ВГС с целью обнаружения дополнительного критерия, позволяющего выявлять инфицированных новорожденных детей.
При первичном тестировании сывороток 32-х детей, которое обычно происходило во 2-3-ий месяцы жизни, обнаружены анти-кор ^О в титрах 1/201/640. Дети, инфицированные ВГС, имели более высокие титры анти-кор чем неинфицированные, но различия статистически не достоверны. В период с 3-его по 6-ой месяц в динамике содержания анти-кор ^О у детей были обнаружены две тенденции, представленные на рис. 4.
9(1/1280) 7(1/320) ' 5 (1ДГО) 3(1/20) 1(1®)
Разведение ' (титры)
«
* * *
*ч* *
ч
• N • •
• • •
__
• S- —
I I I I I I Т I I I—Щ—I—Ч—)-1 Т I I I I I I I I >
О 2 4 б 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Бремя, месяцы
Рис. 4. Изменение содержания иммуноглобулинов G к капсидному белку у инфицированных ВГС (*) и неинфицированных детей (•) в возрасте 2-24 мес.
У инфицированных детей с 4-х месяцев наблюдалось увеличение титров этих антител до среднего значения 1/640 (на 5-ый мес.), что связано с
появлением собственных детских анти-кор 1§С, которые до этого момента были скрыты высоким уровнем материнских антител к капсидному антигену. У неинфицированных новорожденных в этот же период наблюдалось снижение титров анти-кор Таким образом, анализ динамики уровня антител к капсидному белку позволяет выявлять инфицированных новорожденных детей к 4-5-ому месяцу.
У 10 детей ВГС-специфические антитела исследованы одновременно с антителами их матерей и обнаружено сходство в направленности специфических антител. В табл. 15 представлены данные по 3 парам мать-дитя.
Таблица 15. Титры антител к ВГС у 2-3-месячных детей и их матерей.
Пациенты Анти- Анти-кор Ahth-NS3 Анти- Анти-NSSa
ВГС IgM IgG IgG NS4ab IgG IgG
Дитя/526 Нет 1/40 нет 1/20 нет
Мать/526 Нет 1/640 1/10 1/160 нет
Дитя/776 Нет 1/160 1/40 1/10 нет
Мать/ 776 Нет 1/2560 1/640 1/320 1/10
Дитя/903 Нет 1/80 1/5 нет нет
Мать/903 1/10 1/1280 1/80 нет нет
Различия в титрах специфических иммуноглобулинов у детей и их матерей составили по разным антигенам от 3 до 5 разведений. В дальнейшем различия увеличились и к 9-ому месяцу по анти-кор IgG составили 8-9 разведений у неинфицированных детей и их матерей. Это явление связано с постепенным снижением материнских антител у детей, не зараженных ВГС. У инфицированных детей в период с 2-ого по 5-ый месяца уровень анти-кор IgG увеличился на 2 титра. Полное исчезновение материнских антител класса G к капсидному антигену у неинфицированных детей наступило в период с 7-ого по 16-ый месяц. Чем выше титры материнских анти-кор IgG, тем дольше они определялись в крови детей. Результаты, полученные в представленном исследовании, по времени исчезновения материнских анти-кор IgG у неинфицированных детей сходны с данными, полученными S. Ferrero и соавторами [Ferrero S. et al,, 2003].
Впервые нами установлено два варианта динамики уровня иммуноглобулинов в к капсидному антигену у новорожденных детей, матери которых больны ХГС. Наиболее информативными месяцами определения титров анти-кор у новорожденных детей являются 2-ой, 3-ий, 5-ый и 6-ой.
Подводя итог всему изложенному, отметим, что анализ специфического гуморального иммунитета при вирусном гепатите С (наличие антител к индивидуальным вирусным антигенам, их титр и динамика уровня) позволяет получить информацию о напряженности взаимоотношений между вирусом и организмом инфицированного человека и решить ряд проблем практической диагностики гепатита С, что представлено в выводах.
ВЫВОДЫ
1. Специфические иммуноглобулины М (вторичные) определяются чаще при хроническрм гепатите С (80%), чем при острой инфекции (53%). Не обнаружено различий в частоте обнаружения и титрах специфических антител класса М у людей с разными исходами острого гепатита С в первые два месяца острой фазы. Установлена позитивная корреляция между титрами анти-ВГС
и наличием вирусной РНК в крови.
2. Обнаружены антитела класса О к восьми линейным В-эпитопам оболочечных белков Е1 и Е2 при остром и хроническом гепатите С. Исход острой фазы инфекции не зависит от выявления антител к анализируемым В-эпитопам оболочечных белков, хотя на три из них образуются вируснейтрализующие антитела. При хроническом гепатите С достоверно чаще, чем при остром гепатите, определяются иммуноглобулины О к СООН-концевбму эпитопу первого гипервариабельного региона, антитела на который препятствуют связыванию вируса с клеткой.
3. Специфические иммуноглобулины в на антигены ВГС при острой инфекции появляются в определенной последовательности: анти-оболочечные, анти-
капсидные и/или анти-ИБЭ, анти-КБ4аЬ, анти-№5а. Если острая инфекция завершается элиминацией вируса, то специфические иммуноглобулины в исчезают обычно в следующем порядке: анти-оболочечные, анти-№5а, анти-Ы84аЬ, анти-ЫБЗ, анти-капсидные.
4. Установлено два варианта динамики титров специфических антител класса в в острой фазе ВГС-инфекции. Первый вариант характерен для острого гепатита С, завершающегося развитием хронического гепатита, когда титры иммуноглобулинов О постоянно увеличиваются, достигая наивысших значений к 6-ому месяцу. Второй вариант наблюдается при остром гепатите С, завершающемся элиминацией вируса, когда с 4-ого месяца начинается снижение уровня специфических иммуноглобулинов й к капсидному и неструктурным антигенам.
5. При хроническом гепатите С антитела к капсидному антигену выявлятся в более высоких титрах (1/800-1/128ООО), чем при остром гепатите С (1/5-1/800), что можно использовать при разграничении острой и хронической инфекции. Титры антител к неструктурным белкам при хроническом гепатите С имеют широкий диапазон значений (1/5-1/64000). Белки вируса гепатита С обладают хорошей иммуногенностыо. Обнаружена позитивная ' корреляция между титрами антител класса в к капсидному и неструктурным антигенам и наличием РНК ВГС в крови.
6. Специфические иммуноглобулины в у людей, перенесших острый гепатит С с выздоровлением более 3-х лет назад, ограничен: не определяются анти-ВГС
антитела к восьми линейным В-эпитопам белков Е1 и Е2, к неструктурным антигенам, в 40% сывороток не обнаруживаются антитела к капсидному антигену. Если анти-капсидные иммуноглобулины в выявляются, то в низких титрах (1/5-1/80).
7. Обнаружены изменения в специфическом гуморальном иммунитете при проведении интерферонотерапии. При позитивном результате лечения к 6-ому месяцу терапии у 75% больных перестали определяться специфические
антитела класса М и снизились титры иммуноглобулинов в к пептидам из оболочечных белков, к капсидному и неструктурным антигенам. Установлен дополнительный иммуноглобулиновый критерий, позволяющий контролировать эффективность лечения.
8. Специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом С выражен менее интенсивно, чем у взрослых больных. Частота определения специфических антител класса М и максимальные титры иммуноглобулинов в к капсидному и неструктурным белкам у детей достоверно ниже, чем у взрослых больных.
9. Обнаружено два варианта динамики титров антител класса в к капсидному антигену у детей, матери которых имели маркеры гепатита С. В случае вертикальной передачи вируса в крови новорожденных детей в период с 3-его по 5-ый месяц жизни наблюдалось увеличение титров иммуноглобулинов в к капсидному антигену. В это же время у неинфицированных детей происходило резкое снижение уровня этих антител, которые переставали определяться в период с 7-ого по 16-ый месяц.
10. Установлены показатели ВГС-специфического гуморального иммунитета, которые можно использовать при определении исхода острого гепатита С к 4-ому месяцу, при анализе эффективности противовирусной терапии, при дифференциальной диагностике острого и хронического гепатита С и при раннем выявлении инфицированных.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Ежемесячный контроль выявления и титров специфических антител класса М и G к капсидному и неструктурным антигенам у больных острым гепатитом С в период со 2-ого по 4-ый месяц позволяет установить исход острой фазы инфекции. Обнаружение анти-ВГС IgM после 2-ого месяца и увеличение титров антител класса G к капсидному и неструктурным антигенам после 4-ого месяца свидетельствует о хронизации ВГС-инфекции.
2. При дифференциальной диагностике острого и хронического гепатита С можно использовать значение титра антител класса G к капсидному антигену. В случае острой инфекции титры этих антител ниже 1/1000. Исключение го этой закономерности составляет около 4% больных людей. В этом случае надо учитывать наивысший титр иммуноглобулинов G к любому NS-антигену, имеющему наибольший титр, он должен быть ниже 1/1000.
3. Эффективность этиотропной терапии можно контролировать по титрам анти-ВГС IgM и титрам антител класса G к капсидному и неструктурным антигенам. Показателем эффективности терапии в первые три месяца лечения является снижение уровня специфических антител класса М и снижение титров иммуноглобулинов G к капсидному и неструктурным антигенам, хотя бы к одному антигену.
4. У детей, рожденных матерями с маркерами ВГС-инфекции, в период с 3-его по 5-ый месяц жизни в случае инфицирования ребенка наблюдается увеличение титра антител класса G к капсидному белку. Желательно сравнивать 3-4 образца (2-ой мес., 3-ий мес., 5-ый мес. и б-ой мес.).
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Níkolaeva L.I., Olenina L.V., Kolesanova E.F. Immunity in different types of hepatitis C. // Russian J. Immunology (Российский журнал иммунологии). -1999. - V. 4 (№ 2). - P. 91-112.
2. Соболев Б.Н., Оленина Л.В., Николаева Л.И., Колесанова Е.Ф., Арчаков А.И. Разработка лабораторно-экспериментальных образцов синтетических вакцин против вируса гепатита "С". Поиск антигенных пептидных фрагментов белков вируса для создания вируснейтрализующей вакцины. // Аллергология и иммунология. - 2000. - Т. 1 (№3). - С. 84-85.
3. Колесанова Е.Ф., Оленина Л.В., Соболев Б.Н., Николаева Л.И., Блохина Н.П., Воронкова Н.В., Цурикова H.H., Арчаков А.И. Антигенная активность
■ консервативных областей оболочечных белков вируса гепатита С. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 2001. — № 1. — С. 31 -33.
4. Olenina L.V., Nikolaeva L.I., Sobolev B.N., Kolesanova E.F., Archakov A.I. Mapping and characterization of B-cell linear epitopes in the conservative regions of hepatitis С virus envelope glycoproteins. // J. Viral. Hepatitis. — 2002. - V. 9. -P. 174-182.
5. Nikolaeva L.I., Blokhina N.P., Tsurikova N.N., Voronkova N.V., Miminoshvili M.I., Braginsky D.M., Yastrebova O.N., Booynitskaya O.V., Isaeva O.V., Michailov M.I., Archakov A.I. Virus-specific antibody titers in different phases of Hepatitis С virus infection. // J. Viral. Hepatitis. - 2002. - V. 9. - P. 429-437.
6. Баранов A.A., Каганов Б.С., Учайкин В.Ф., Корсунский A.A., Горелов A.B., Потапов- A.C., Баликин В.Ф., Ильин А.Г., Конова С.Р., Котович М.М., Лыткина И.М., Михайлов М.И., Никитин И.Г., Николаева Л.И., Рейзис А.Р., Сичинава И.В., Строкова Т.В., Талалаев А.Г., Тамазян Г.В., Туманова Е.Л., Чередниченко Т.В., Шиляев P.P., Шувакова Н.И., Яценко Е.А. Диагностика и лечение хронических вирусных гепатитов В, С и D у детей. // Пособие для врачей. Под ред. Е.Б. Лаврентьева. — Москва. — 2003. — 84 с.
7. Чередниченко Т.В., Николаева Л.И., Молочкова О.В., Горошанская М.Н. Клинико-патогенетическое значение обнаружения антител к различным белкам вируса гепатита С при HCV-инфекции у детей. // Матер. II конгр. детских инфекционистов России. - Москва. — 2003. - С. 208.
8. Арчаков А.И., Иванов Ю.Д., Говорун В.М., Учайкин В.Ф., Николаева Л.И., Гнеденко О.В., Константинова Н.И., Ковалев О.Б., Конев В.А. Разработка новых методов диагностики гепатитов В и С. // Аллергия, астма и клиническая иммунология, - 2003.- № 9.- С. 175-178.
9. Николаева Л.И., Михайлов М.И., Блохина H.A., Цурикова H.H., Воронкова Н.В., Чередниченко Т.В., Молочкова О.В., Чаплыгина Г.В., Миминошвили М.И. Титры специфических антител в разные фазы гепатита С. // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2004.- № 5.- С. 37-42.
10. Чередниченко Т.В., Николаева Л.И., Молочкова О.В., Горошанская М.Н. Клиническое значение определения антител к различным белкам вируса гепатита С у детей первого года жизни. // Матер. III конгр. детских инфекционистов России. — Москва. — 2004. — С. 256.
11. Горошанская М.Н., Чередниченко Т.В., Николаева Л.И., Молочкова О.В., Учайкин В.Ф. Клиническое значение определения антител к различным антигенам HCV у детей первого года жизни. // Детские инфекции.- 2Ó05. -Т. 4 (№2).-С. 11-15.
12. Николаева Л.И., Петрова Е.В., Макашова В.В., Флоряну А.И., Лковенко М.А., Шипулин Г.А., Малиновская В.В., Токмалаев А.К., Михайлов М.И. Изменения специфического гуморального иммунитета у пациентов с хроническим гепатитом С при противовирусной терапии. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2005. - № 5. - С.44-49.
13. Николаева Л.И., Горошанская М.Н., Чередниченко Т.В., Учайкин В.Ф., М.И.Михайлов. Динамика антител к отдельным антигенам вируса гепатита С у детей первых лет жизни. // Детские инфекции. - 2005. - Т.4 (№4). — С. 1517.
14. Николаева Л.И., Чередниченко Т.В., Молочкова О.В., Горошанская М.Н., Учайкин В.Ф., Михайлов М.И. Зависимость между антителами к вирусу гепатита С и маркерами патологических изменений печени. // Матер. IV конгр. детских инфекционистов России. - Москва. — 2005. — С. 132-133.
15. Николаева Л.И., Петрова Е.В., Финогенова М.П., Шибнев В.А., Токмалаев А.К., Михайлов М.И. Антитела к обол очечным белкам El и Е2 у людей, инфицированных вирусом гепатита С. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2006. - № 1. - С. 37-41.
16. Николаева Л.И., Финогенова М.П., Шибнев В.А. Выявление антител к консенсусной последовательности первого гапервариабельного региона белка Е2 в зависимости от фазы инфекции. // Вопрос, вирусол. - 2006. - №4. -С. 16-19.
Список сокращений
АлАТ - аланин-аминотрансфераза,
АКО — аминокислотный(-ые) остаток (остатки),
АсАТ - аспартат-аминотрансфераза,
ВГС - вирус гепатита С,
ВПЧ - вирусоподобные частицы,
ГВР - гипервариабельный регион,
IgM (G) - immunoglobulin М (G), иммуноглобулин М (G),
ИФА — иммунноферментный анализ,
КП — коэффициент позитивности,
NS - nonstructural protein, неструктурный белок,
N — нормальное значение,
ОГС — острый гепатит С,
ОТ-ПЦР - обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция,
ОП - оптическая плотность,
ПЦР - полимеразная цепная реакция,
ХГС - хронический гепатит С.
Автор выражает искреннюю благодарность научному консультанту проф. М.И. Михайлову, сотрудникам 1-ой и 2-ой Клинической инфекционной больницы, РУДЫ, РГМУ, НГЦ, ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского и ГУ ИБМХ им. В.Н. Ореховича, которые принимали участие в выполнении отдельных фрагментов диссертационной работы, за их помощь и научные дискуссии.
Автор выражает искреннюю благодарность руководству институтов, в которых выполнялась работа, во главе с академиками РАМН А.И. Арчаковым и С.Г. Дроздовым, а также руководителю кафедры детских инфекционных болезней академику РАМН В.Ф. Учайкину и всем коллегам за добрые советы и поддержку при выполнении диссертационной работы.
Особую признательность автор выражает ВГС-инфицированным людям, согласившимся участвовать в длительном тестировании.
Заказ №78. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз.
Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палиха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Николаева, Людмила Ивановна
Список сокращений и условных обозначений.
Введение.
Иммунный ответ на антигены вируса гепатита С (обзор литературы).
Глава 1. Вирус гепатита С.
1.1 .Организация генома вируса.
1.2. Строение вириона.
1.3. Вирус гепатита С как представитель семейства Иау;мпс1ае.
Глава 2. Основные антигены вируса гепатита С.
2.1. Структура и эпитопы оболочечных белков вируса.
2.2. Нуклеокапсидный антиген и его детерминанты.
2.3. Биологическая роль и эпитопы белка N83.
2.4. Полипептиды ЫБ4а и ЫБ4Ь и их детерминанты.
2.5. Биологическое значение и эпитопы белков №5а и ЫБ5Ь.
Глава 3. Роль иммунной системы в ограничении ВГС-инфекции.
3.1. Основные факторы иммунной системы, влияющие на элиминацию вируса в острой фазе инфекции.
3.2. Специфический Т-клеточный ответ при гепатите С.
3.3. Гуморальный ответ на антигены вируса.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Специфический гуморальный иммунитет при вирусном гепатите С"
В настоящее время в Российской Федерации, как и в большинстве стран, отмечается неблагоприятная эпидемиологическая ситуация по парентеральным вирусным гепатитам: к 2015-2020 годам ожидается удвоение количества инфицированных людей на нашей планете [Официальная информация, 2003; Armstrong G.L. et al., 2000; Tanaka Y. et al., 2002]. Начиная с 2001 года, в РФ отмечается тенденция к снижению показателей заболеваемости острыми парентеральными вирусными гепатитами, тем не менее ежемесячно за последние три года регистрируется около 5,7-6,1 тыс. впервые выявленных людей с хроническими вирусными гепатитами [Официальная информация, 2003; Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь-сентябрь 2004 г., 2005; Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь-февраль 2005 г.; 2005]. До настоящего времени в нашей стране продолжается рост выявления детей больных гепатитом С. Около 1,4-2,4% граждан Российской Федерации инфицированы вирусом гепатита С (ВГС) [Селиванов Е.А. и др., 2003; Шляхтенко Л.И., 2003]. Подавляющее большинство этих людей имеет хронический гепатит С. Для персистентной ВГС-инфекции характерно прогрессирующее течение, приводящее к формированию цирроза печени в 20-30% случаев, к первичной гепатоклеточной карциноме - в 8-15%, к терминальному поражению печени - в 0,5-1%, к внепеченочным проявлениям - в 11-62% [Alter M.J. et al., 1999; Memon M.I. et al., 2002; Hadziyannis S. J., 1997; Игнатова E. M. и др., 1998].
Несмотря на интенсивное изучение ВГС-инфекции в течение последних 16 лет до сих пор не удалось установить механизм развития персистентной инфекции, особенности успешного иммунного ответа при естественной элиминации вируса в острой фазе, роль неспецифического иммунитета в ограничении инфекции, значение специфического гуморального и Т-клеточного ответа, создать профилактическую вакцину против гепатита С.
Антигены ВГС способны индуцировать В- и Т-кпеточный ответ, который в 15-25% случаев острого гепатита С достаточен для естественной элиминации вируса [Giuberti Т. et al., 1992; Villano S.A. et al., 1999; Armstrong G.L. et al., 2000]. Но в подавляющем большинстве случаев острая инфекция заканчивается развитием хронического гепатита С на фоне более или менее выраженного адаптивного В- и Т-клеточного ответа [Cramp М.Е. et al., 1999; Bowen D.G., Walker C.M., 2005, (Nature)]. Несомненно, вирус гепатита С -уникальный патоген, который способен ускользать от иммунного контроля, создавая новые генетические и антигенные варианты, задерживать формирование Т-хелперного и Т-киллерного ответа при остром гепатите С, вызывать повторную реинфекцию у выздоровевших людей. Изучение ВГС-инфекции и специфического иммунитета началось после идентификации вируса в 1989 г. и в первую очередь преследовало главную цель - создание профилактической вакцины [Choo Q.-L. et al., 1989; Choo Q.-L. et al., 1994]. К концу 90-х годов прошлого века после неудачных попыток создания протективной вакцины на основе рекомбинантных оболочечных белков вируса основной акцент в изучении специфического иммунитета при гепатите С был смещен в область анализа антивирусного Т-клеточного ответа [Pape G.R. et al, 1999; Lechner F. et al, 2000].
Изучение специфического иммунитета при ВГС-инфекции во многом сдерживается отсутствием доступной лабораторной модели инфекции, вирус поражает только людей и шимпанзе. Как показали A. Basset и соавторы, у ВГС-инфицированных шимпанзе течение инфекции легче и выздоровление происходит чаще, чем у людей [Basset S.E. et al., 1998]. Поэтому анализ специфического иммунитета у людей больных гепатитом С или перенесших его с выздоровлением - актуальная задача, решение которой позволит понять механизм успешного иммунного ответа, обеспечивающего естественную элиминацию вируса, разработать подходы к созданию профилактической вакцины, а также расшифровать клинико-диагностическую значимость В- и Т-клеточного ответа на каждый (индивидуальный) антиген вируса.
К моменту начала данного исследования были установлены отдельные качественные параметры противовирусного гуморального иммунитета, не выявлены различия в направленности и количественных характеристиках специфических антител при острой и хронической ВГС-инфекции, не изучены количественные изменения антивирусных иммуноглобулинов при естественно текущей острой и хронической инфекции и при проведении противовирусной терапии. Эти сведения необходимы для разработки профилактических и терапевтических вакцин против гепатита С, для ранней диагностики инфицирования, для определения острой и хронической фазы инфекции и для выбора оптимального курса противовирусной терапии.
Цель исследования
Изучить специфический гуморальный иммунитет при вирусном гепатите С и установить закономерности В-клеточного ответа, характерные для основных фаз инфекции и представляющие диагностическую значимость.
Задачи исследования:
1. Определить прогностическое значение специфических иммуноглобулинов М в острую и хроническую фазы ВГС-инфекции, исследовать корреляционную зависимость между величинами титра этих антител, активностями аланин- и аспартат-аминотрансфераз и наличием вирусной РНК в крови.
2. Изучить гуморальный ответ на участки оболочечных белков ВГС, содержащие линейные В-эпитопы, при остром и хроническом гепатите С, при элиминации вируса и проведении специфической терапии интерфероном-альфа.
3. Исследовать динамику уровня иммуноглобулинов в на отдельные антигены ВГС в острую фазу инфекции и выявить их прогностически значимые изменения.
4. Установить титры иммуноглобулинов в к капсидному антигену и неструктурным белкам при острой и хронической инфекции, определить их значение для установления фазы инфекции, выявить взаимосвязь с активностями аланин- и аспартат-аминотрансфераз и наличием вирусной РНК в крови.
5. Определить направленность и уровень ВГС-специфических антител при элиминации вируса, произошедшей более 3-х лет назад.
6. Изучить изменения специфического гуморального иммунитета при проведении терапии интерфероном-альфа у людей с хроническим гепатитом С и оценить прогностическое значение этих изменений.
7. Исследовать специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом Сиу новорожденных детей, матери которых имеют маркеры ВГС-инфекции.
8. Установить критерии специфического гуморального ответа, которые можно использовать при определении исхода острого гепатита С, оценке эффективности противовирусной терапии, инфицированности новорожденных детей, матери которых имеют маркеры ВГС-инфекции, и при дифференцировании острой и хронической фазы инфекции.
Научная новизна работы
Впервые обнаружено, что для хронической ВГС-инфекции характерно более частое выявление специфических антител класса М (вторичных), чем для острой инфекции. Частота определения и титры специфических иммуноглобулинов М у больных с разными исходами острого гепатита С в первые два месяца инфекции были одинаковыми. Впервые установлена позитивная корреляция между величинами титра ВГС-специфических иммуноглобулинов М и наличием вирусной РНК в крови.
Показано, что как при остром, так и при хроническом гепатите С вырабатывают антитела к восьми линейным В-эпитопам оболочечных белков ВГС. Впервые обнаружено, что исход острого гепатита С не зависит от наличия антител на анализируемые эпитопы, хотя на три из них образуются вируснейтрализующие антитела. Впервые установлено, что при хроническом гепатите С достоверно чаще определяются иммуноглобулины в к СООН-концевому В-эпитопу первого гипервариабельного региона (ГВР) белка Е2, которые считаются вируснейтрализующими. Показано, что при остром и хроническом гепатите С формируются антитела, способные взаимодействовать с консенсусной последовательностью первого ГВР. Установлена динамика уровня антител, направленных на восемь линейных В-эпитопов оболочечных белков, при разных исходах острого гепатита С, при хроническом гепатите С и при проведении терапии интефероном-альфа.
Определена последовательность как появления иммуноглобулинов в ко всем вирусным антигенам при остром гепатите С, так и их исчезновения в случае при элиминации вируса. Впервые выявлены количественные различия между уровнем иммуноглобулинов в к капсидному антигену при остром и хроническом гепатите С. Установлен диапазон титров иммуноглобулинов в к неструктурным антигенам вируса при остром и хроническом гепатите С, показана динамика уровня этих антител при естественном и индуцированном интерфероном-альфа ограничении виремии.
Впервые установлены титры специфических антител у людей, перенесших острый гепатит С с элиминацией вируса более трех лет назад, наступившей либо самопроизвольно, либо вследствие терапии интефероном-альфа в острой фазе инфекции.
Исследован специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом С, обнаружены его особенности по сравнению с гуморальным ответом у взрослых больных. Впервые установлены два варианта динамики уровня анти-капсидных иммуноглобулинов в у новорожденных детей, матери которых имели маркеры ВГС-инфекции, и показано диагностическое значение контроля уровня этих антител.
Научно-практическая значимость работы
Полученные данные о гуморальном ответе на линейных В-эпитопы оболочечных белков свидетельствуют о раннем появлении антител на ННг-концевые детерминанты антигенов Е1 и Е2 при ОГС и о частом выявлении иммуноглобулинов в к вируснейтрализующему СООН-концевому эпитопу первого гипервариабельного региона. Как при острой, так и при хронической инфекции у большинства больных обнаружены антитела, взаимодействующие с консенсусной аминокислотной последовательностью 1-ого гипервариабельного региона. Эти данные актуальны для разработки вакцин против гепатита С с учетом вируснейтрализующих В-эпитопов оболочечных белков.
Определены последовательности появления и исчезновения иммуноглобулинов в против всех структурных и неструктурных антигенов вируса при разных исходах острого гепатита С, а также показана динамика уровня этих антител, что позволило разработать прогностические критерии развития персистентной инфекции или элиминации вируса.
Показана высокая иммуногенность вирусных белков, особенно капсидного антигена и сериновой протеазы/геликазы. Установлено, что титры иммуноглобулинов в к капсидному белку при острой и хронической инфекции имеют разный диапазон значений. Предложен иммуноглобулиновый критерий, облегчающий и уточняющий дифференциальную диагностику острого и хронического гепатита С, что особенно актуально при выборе оптимального курса терапии интерфероном-альфа.
Обнаружена позитивная корреляция между уровнем ВГС-специфических иммуноглобулинов М и наличием вирусной РНК в крови, между величинами титров антител класса G к капсидному антигену и к неструктурным белкам, определением вирусной РНК в крови и повышенным уровнем аланин-аминотрансферазы.
Мониторинг уровня ВГС-специфических иммуноглобулинов М и G в процессе противовирусной терапии, а также после ее окончания позволяет проводить контроль (более дешевый и более информативный, чем диагностика по вирусной нагрузке) за эффективностью лечения и длительностью позитивного результата.
Специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом С характеризуется меньшими титрами антител, чем у взрослых больных. У новорожденных детей, матери которых имели маркеры ВГС-инфекции, обнаружены два варианта динамики уровня антител класса G к капсидному белку. Динамические изменения титров этих антител можно использовать как дополнительный иммуноглобулиновый критерий при выявлении инфицированных вирусом гепатита С новорожденных детей.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты работы были частично включены в пособие для врачей «Диагностика и лечение хронических гепатитов В, С и D у детей», выпущенное Министерством здравоохранения Российской Федерации (Москва, 2003), и представлены на общедоступном ресурсе Интернет «Гепатит С: молекулярно-биологические и медико-социальные аспекты проблемы» (http: // www.ibmc.msk.ru/hepatitis/).
Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций и на практических занятиях для студентов 5-ых и 6-ых курсов кафедры детских инфекционных болезней с курсом вакцинопрофилактики ФУВ Российского государственного медицинского университета.
Результаты диссертации используются врачами 2-ой Клинической инфекционной больницы г. Москва в комплексе диагностических и прогностических критериев при ведении больных гепатитом С.
По данным, полученным при исследовании гуморального ответа на оболочечные белки, капсидный и неструктурные антигены, сконструирован лабораторный вариант иммуноферментной тест-системы. Оформляется патент «Нанодиагностическая система для выявления вирусов гепатита».
Основные положения, выносимые на защиту
1. Специфические антитела класса М (вторичные) при гепатите С определяются как в острую, так и в хроническую фазу инфекции, но с разной частотой. В течение первых двух месяцев острого гепатита С не обнаружены различия в частоте выявления и титрах специфических иммуноглобулинов М при разных исходах острой фазы. Установлена позитивная корреляция между величинами титра этих антител и обнаружением вирусной РНК в крови.
2. Антитела класса в к восьми линейным В-эпитопам оболочечных белков Е1 и Е2 выявляются у людей с острым и хроническим гепатитом С. Исход острого гепатита С не зависит от наличия антител к этим В-эпитопам оболочечных белков, хотя на 3 из них образуются вируснейтрализующие антитела. При хронической инфекции достоверно чаще, чем при острой, обнаруживаются иммуноглобулины в на СООН-концевой эпитоп 1-ого гипервариабельного региона, антитела на который нейтрализуют связывание вируса с клеткой.
3. Специфические антитела класса в на оболочечные, капсидный и неструктурные антигены вируса гепатита С при острой инфекции появляются и исчезают, в случае элиминации вируса, в определенной последовательности. Обнаружены два варианта динамики титров специфических иммуноглобулинов в к капсидному белку и неструктурным белкам вируса в зависимости от исхода острого гепатита С.
4. Антитела класса в к нуклеокапсидному антигену выявляются при хроническом гепатите С в более высоких титрах, чем в острую фазу инфекции. Титры антител к неструктурным белкам при при хроническом гепатите С имеют широкий диапазон значений. Для всех белков вируса гепатита С кроме оболочечных характерна высокая иммуногенность. Установлена позитивная корреляция между величинами титров иммуноглобулинов в к капсидному и неструктурным белкам, наличием вирусной РНК в крови и повышенным уровнем аланин-аминотрансферазы.
5. Специфический гуморальный иммунитет после острого гепатита С, завершившегося элиминацией вируса, характеризуется отсутствием специфических иммуноглобулинов М и более узкой направленностью антител класса в, титры которых имеют низкие значения.
6. При проведении терапии интерфероном-альфа у людей с хроническим гепатитом С обнаружено снижение титров специфических антител класса Мибв случае позитивного результата лечения.
7. Специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом С имеет отличия от гуморального иммунитета взрослых больных. У детей, рожденных матерями с маркерами ВГС-инфекции, обнаружено два варианта динамики титров иммуноглобулинов в к капсидному белку в первый год жизни.
8. При ВГС-инфекции специфический гуморальный иммунитет (наличие антител на индивидуальные антигены вируса, их титр и динамика уровня) имеет определенную информационную значимость.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на XXVII и XXVIII научной конференции Центрального научно-исследовательского института гастроэнтерологии (РФ, Москва, 1999, 2000); на II Всероссийской научно-практической конференции "Интернет и современное общество" (РФ, С.Петербург, 1999); на V и IX конференции "Гепатология сегодня" (РФ, Москва, 2000, 2004); на 10-ом Международном симпозиуме по вирусным гепатитам и болезням печени (США, Атланта, 2000); на III научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консенсус)" (РФ, Москва, 2000); на конференции по Межведомственной научно-технической программе «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего» (РФ, Геленджик, 2000); на 2-ом международном пептидном симпозиуме (США, Сан Диего, 2001); на IV и на V Российской научно-практической конференции "Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики" (РФ, Москва, 2001, 2003); на 5-ом Конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (РФ, Москва, 2002); на VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (РФ, С.-Петербург, 2002); на II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы. Биотехнология и медицина» (РФ, Москва, 2003); на IV конгрессе детских инфекционистов России (РФ, Москва, 2005).
Диссертация апробирована на заседании межлабораторного Ученого совета ГУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН (протокол № 2 от 13 декабря 2005 г.) ив ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (протокол № 7 от 31 марта 2006 г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 48 научных работ (в том числе 19 статей, из них 13 в центральных отечественных и зарубежных журналах, 23 тезиса докладов в журналах, материалах и сборниках тезисов и 6 тезисов) и одно пособие для врачей.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 260 страницах, содержит 58 таблиц (из них три таблицы в приложении) и 28 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (три главы), собственных исследований (пять глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Список литературы включает 442 источника (25 отечественных и 417 зарубежных).
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Николаева, Людмила Ивановна
выводы
1. Специфические иммуноглобулины М (вторичные) определяются чаще при хроническом гепатите С (80%), чем при острой ВГС-инфекции (53%). Не обнаружено различий в частоте обнаружения и титрах специфических антител класса М у людей с разными исходами острого гепатита С в первые два месяца острой фазы. Установлена позитивная корреляция между титрами анти-ВГС ^М и наличием вирусной РНК в крови.
2. Обнаружены антитела класса в к восьми линейным В-эпитопам оболочечных белков Е1 и Е2 при остром и хроническим гепатите С. Исход острой фазы ВГС-инфекции не зависит от выявления антител к анализируемым В-эпитопам оболочечных белков, хотя на три из них образуются вируснейтрализующие антитела. При хроническом гепатите С достоверно чаще, чем при остром гепатите, определяются иммуноглобулины в к СООН-концевому эпитопу первого гипервариабельного региона, антитела на который препятствуют связыванию вируса с клеткой.
3. Специфические иммуноглобулины в на антигены ВГС при острой инфекции появляются в определенной последовательности: анти-оболочечные, анти-капсидные и/или анти-КБЗ, анти-Ы84аЬ, анти-К85а. Если острая инфекция завершается элиминацией вируса, то специфические иммуноглобулины в исчезают обычно в следующем порядке: анти-оболочечные, анти-Ы85а, анти-К84аЬ, анти-КБЗ, анти-капсидные.
4. Установлено два варианта динамики титров специфических антител класса О в острой фазе ВГС-инфекции. Первый вариант характерен для острого гепатита С, завершающегося развитием хронического гепатита С, когда титры иммуноглобулинов в постоянно увеличиваются, достигая наивысших значений к 6-ому месяцу. Второй вариант наблюдается при остром гепатите С, завершающемся элиминацией вируса, когда с 4-ого месяца начинается снижение уровня специфических иммуноглобулинов в к капсидному и неструктурным антигенам.
5. При хроническом гепатите С антитела к капсидному антигену выявляются в более высоких титрах (1/800-1/128000), чем при остром гепатите С (1/5-1/800), что можно использовать при разграничении острой и хронической инфекции. Титры антител к неструктурным белкам при хроническом гепатите С имеют широкий диапазон значений (1/5-1/16000). Белки вируса гепатита С обладают хорошей иммуногенностью. Обнаружена позитивная корреляция между титрами антител класса в к капсидному и неструктурным антигенам и наличием РНК ВГС в крови.
6. Специфический гуморальный иммунитет у людей, перенесших острый гепатит С с выздоровлением более 3-х лет назад, ограничен: не определяются анти-ВГС ^М, антитела класса в к восьми линейным В-эпитопам белков Е1 и Е2, к неструктурным антигенам, в 40% сывороток не обнаруживаются антитела к капсидному антигену. Если анти-капсидные иммуноглобулины в выявляются, то в низких титрах (1/5-1/80).
7. Обнаружены изменения в специфическом гуморальном иммунитете при проведении интерферонотерапии. При позитивном результатк лечения к 6-ому месяцу терапии у 75% больных перестали определяться специфические антитела класса М и снизились титры иммуноглобулинов в к пептидам из оболочечных белков, к капсидному и неструктурным антигенам. Установлен дополнительный иммуноглобулиновый критерий, позволяющий контролировать эффективность лечения.
8. Специфический гуморальный иммунитет у детей с хроническим гепатитом С выражен менее интенсивно, чем у взрослых больных. Частота определения специфических антител класса М и максимальные титры иммуноглобулинов в к капсидному и неструктурным белкам у детей достоверно ниже, чем у взрослых больных.
9. Обнаружено два варианта динамики титров антител класса в к капсидному антигену у детей, матери которых имели маркеры гепатита С. В случае вертикальной передачи вируса в крови новорожденных детей в период с 3-его по 5-ый месяц жизни наблюдалось увеличение титров иммуноглобулинов в к капсидному антигену. В это же время у неинфицированных детей происходило резкое снижение уровня этих антител, которые перестали определяться в период с 7-ого по 16-ый месяц.
10. Установлены показатели ВГС-специфического гуморального иммунитета, которые можно использовать при определении исхода острого гепатита С к 4-ому месяцу, при анализе эффективности противовирусной терапии, при дифференциальной диагностике острого и хронического гепатита С и при раннем выявлении инфицированных.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Ежемесячный контроль выявления и титров специфических антител класса МиБк капсидному и неструктурным антигенам у больных острым гепатитом С в период со 2-ого по 4-ый месяц позволяет предположить исход острой фазы инфекции. Обнаружение анти-ВГС 1§М после 2-ого месяца и увеличение титров антител класса в к капсидному и неструктурным антигенам после 4-ого месяца свидетельствует о хронизации ВГС-инфекции.
2. При дифференциальной диагностике острого и хронического гепатита С можно использовать значение титра антител класса в к капсидному антигену. В случае острой инфекции титры этих антител ниже 1/1000. Исключение из этой закономерности составляет около 4%. В этих случаях надо учитывать титр иммуноглобулинов в к любому неструктурному антигену, имеющему наибольший титр, он должен быть ниже 1/1000.
3. Эффективность этиотропной терапии можно контролировать по титрам анти-ВГС 1§М и титрам антител класса в к капсидному и неструктурным антигенам. Показателем эффективности терапии в первые три месяца лечения является снижение уровня специфических антител класса М и снижение титров иммуноглобулинов О к капсидному и неструктурным антигенам, хотя бы к одному антигену.
4. У детей, рожденных матерями с маркерами ВГС-инфекции, в период с 3-его по 5-ый месяц жизни в случае инфицирования ребенка наблюдается увеличение титра антител класса в к капсидному белку. Желательно сравнивать 3-4 образца (2-ой мес, 3-ий мес, 5-ый мес и 6-ой мес).
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Николаева, Людмила Ивановна, Москва
1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. // Ленинград: Гос. изд. мед. литературы, 1962.-С. 13-15.
2. Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь вирусные гепатиты. //Москва: «Амипресс», изд. 2,1999. - С. 80-106.
3. Бузина А.Б. Диагностическое и прогностическое значение спектра антител к антигенам HCV при остром и хроническом гепатите С: Автореферат диссертации кандидата мед. наук: 14.00.10 / Нижегородская гос. мед. академия. Казань, 2004. - 11-21 с.
4. Ветров Т. А. Клиническое значение определения антител к поверхностным белкам вируса гепатита С: Автореферат диссертации кандидата мед. наук: 14.00.10 / СПб. Мед. университет. СПб., 2003. -13 с.
5. Гублер Е.В., Генкин A.A. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. // Ленинград: Гос. изд. "Медицина", 1973. С. 44-52.
6. Дерябин П.Г., Вязов С.О., Исаева Е.И., Самохвалов Е.И., Львов Д.К. Персистенция вируса гепатита С в культурах клеток головного мозга новорожденных мышей. // Вопросы вирусол. 1997. - Т. 42. - С. 254258.
7. Дудина K.P. Клинико-лабораторные аспекты в прогнозировании исходов острого гепатита С: Автореферат диссертации кандидата мед. наук: 14.00.10 / Московский гос. мед.-стом. университет. Москва., 2003. -17-18 с.
8. Ершова О. Н., Шахгильдян И.В., Кузин С.Н., Кириллова И.Л., Коленова Т.В., Розова A.B., Самохвалов Е.И. Характеристика активностиперинатальной передачи вируса гепатита С. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. -№ 1. - С. 39-41.
9. Игнатова Е. М., Апросина З.Г., Серов В. В. Внепеченочные проявления хронического гепатита С. // Тер. арх. 1998. - Т. 70. - С. 9-16.
10. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь-сентябрь 2004 г. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. - № 1.-С. 64-65.
11. И. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации за январь-февраль 2005 г. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. - № 4.-С. 65.22.
12. Методы исследований в иммунологии. // Под ред. И. Лефковитс, Б. Парниса-М.: Гос. изд. "Мир", 1981. С. 459-460.
13. Михайлов М.И. Лабораторная диагностика гепатита С. (Серологические маркеры и методы их выделения). // Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. -2001. № 2. - С. 8-18.
14. Селиванов Е.А., Данилова Т.Н., Дегтярева И.Н., Григорьян М.Ш., Воробей Л.Г. Основные показатели деятельности службы крови России в 2002 г. // Трансфузиология. 2003. - Т. 4(4). - С. 6-28.
15. Семененко Т.А. Клеточный иммунный ответ при гепатите С. // Вирусные гепатиты: перспективы и достижения. 2000. - №1(8). - С. 310.
16. Семилетов Ю. А., Фирсова Т. В., Шибнев В. А., Вязов С.О. Синтез и антигенная активность пептидов из состава core- и №3-белков вируса гепатита С. // Биоорган, химия. 1993. - Т. 19. - С. 126-129.
17. Сологуб Т.В., Волчек И.В., Нестеров H.H. Комбинированная терапия Интроном А и Ребетолом современный стандарт в лечении гепатита С. //TerraMedica. -2000.-№3.-С. 2-6.
18. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. // С.Н. Соринсон. СПб., Теза, 2-ое издание, 1998.-С. 224.
19. Учайкин В.Ф. Решенные и нерешенные проблемы инфекционной патологии у детей. // Детские инфекции. 2003. - №4. - С. 3-7.
20. Учайкин В.Ф., Чередниченко Т.В., Баранова Е.Б., Гущин А.Е. Гепатит С у детей первого года жизни. // Эпидемиология и инфекционные болезни. -1997.-№2.-С. 29-33.
21. Шевченко И.Т., Богатов О.П., Хрипта Ф.П. Элементы вариационной статистики для медиков. // Киев: Гос. изд. "Здоровье", 1970. С. 56-58.
22. Шляхтенко Л.И. Системный подход к изучению эпидемического процесса гепатитов В и С. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. -2003.-№4.-С. 15-19.
23. Юнкеров В. И., Григорьев С. Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. // С.-Петербург. Изд. "Военно-Медицинская Академия". 2002. - С. 34-57.
24. Abe K., Inchauspe G., Shikata T., Prince A.M. Three different patterns of hepatitis C virus infection in chimpanzees. // Hepatology. 1992. - Vol. 15. -P. 690-695.
25. Ali N., Siddiqui A. The La antigen binds 5' NCR of HCV RNA and in the context of the initiator AUG and stimulates IRES-mediated translation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. - Vol. 94. - P. 2249-2254.
26. Alter M. J., Kruszon-Moran D., Nainan 0. V., McQuillan G.M., Gao F., Moyer L.A., Kaslow R.A., Margolis M.D. The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1988 through 1994. // N. Engl. J. Med. 1999. -Vol. 341.-P. 556-652.
27. Argentini C., Dettori S., Loiacono L., Guadagnino V., Stroffolini T., Rapicetta M. Molecular characterization of HCV lb intra-familiar infection through three generations. //Virus Genes. 1999. - Vol. 18(2). - P. 169-174.204
28. Armstrong G.L., Alter M.J., McQuillan G.M., Margolis H.S. The past incidence of hepatitis C virus infection: implications for the future burden of chronic liver disease in the United States. // Hepatology. 2000. - Vol. 31. -P. 777-782.
29. Askari M., Alane J.P., Moreno-Bondi M., Vo-Dinh T. Application of an antibody biochip for p53 detection and cancer diagnosis. // Biotechnol. Prog. -2001.-Vol. 17(3).-P. 543-552.
30. Baird C.L., Myszka D.G. Current and emerging commercial optical biosensors. // J. Mol. Recognit. 2001. - Vol. 14. - P. 261-268.
31. Barba G., Harper F., Harada T., Brechot C. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localizition and assotiation with cellular lipid storage droplets. // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1997. - Vol. 94. - P. 1200-1205.
32. Baril M., Barkier-Gingras L. Traslation of the F protein of hepatitis C virus is initated at a non-AUG codon in a +1 reading frame relative to the polyprotein. // Nucleic Acids Res. 2005. - Vol. 33(5). - P. 1474-1486.
33. Bassett S.E., Brasky K.M., Lanford R.E. Analysis of hepatitis C virus-inoculated chimpanzees reveals unexpected clinical profiles. // J. Virol. -1998. Vol. 72. - P. 2589-2599.
34. Basu A, Beyene A, Meyer K, Ray R. The hypervariable region 1 of the E2 glycoprotein of hepatitis C virus binds to glycosaminoglycans, but this binding does not lead to infection in a pseudotype system. // J. Virol. 2004. -Vol. 78.-P. 4478-4486.
35. Behrens S., Tomei L., Francesco R. Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus. // EMBO J. 1996. - Vol. 15.-P. 12-22.
36. Blight K.J., Rice C.M. Secondary structure determination of the conserved 98-dase sequence at the 3'-terminus of hepatitis C virus. // J. Virol. 1997. -Vol. 71.-P. 7345-7352.
37. Bode J.G., Ludwig S., Ehrhardt C., Albrecht U., Erhardt A., Schaper F., Heinrich P.C., Haussinger D. IFN-a antagonistic activity of HCV core protein involves induction of suppressor of cytokine signaling-3. // FASEB J. 2003. -Vol. 17.-P. 488-490.
38. Boni S., Lavergne J.-P., Boulant S., Cahour A. Hepatitis C virus core protein acts as a trans-modulating factor on internal translation initiation of the viral RNA. // J. Biol. Chem. 2005.-Vol. 280(18).-P. 17737-17748.
39. Boulant S., Wanbelle C., Ebel C., Penin F., Lavergne J.-P. Hepatitis C virus core protein is a dimeric alpha-helical protein exhibiting membrane protein features. // J. Virol. 2005. - Vol. 79(17). - P. 11353-11365.
40. Bowen D.G., Walker C.M. Adaptive immune responses in acute and chronic hepatitis C virus infection. // Nature. 2005. - Vol. 436. - P. 946-952.
41. Bowen D.G., Walker C.M. Mutational escape from CD8+ cell immunity: HCV evolution, from chimpanzees to man. // J. Exp. Med. 2005. - Vol. 201. -P. 1709-1714.
42. Bradley D., McCaustland K., Krawczynski K., Spelbring J., Humphrey C., Cook E. H. Hepatitis C virus: buoyant density of the factor VHI-derived isolate in sucrose. // J. Med. Virol. -1991. Vol. 34. - P. 206-208.
43. Brazzoli M., Helenius A., Foung K.H., Houghton M., Abrignani S., Merola M. Folding and dimerization of hepatitis C virus El and E2 glycoproteins in stably transfected CHO cells. // Virology. 2005. - Vol. 332. - P. 438-453.
44. Bressanelli S., Tomei L., Roussel A., Incitti I., Vitale R.L., Mathieu M., De Francesco R., Rey F.A. Crystal structure of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. -Vol. 96.-P. 13034-13039.
45. Brillanti S., Masci C., Miglioli M., Barbara L. Serum IgM antibodies to hepatitis C virus in acute and chronic hepatitis C. // Arch. Virol. 1993. -Vol. 8.-P. 213-218.
46. Brinton M.A., Dispoto J.H. Sequence and secondary structure analysis of the 5'-terminal region of flavivirus genome RNA. // Virology. 1988. - Vol. 162.-P. 290-299.
47. Bukh J., Miller R.H., Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes. // Semin. Liver Dis. 1995. - Vol. 15. - P. 41-63.
48. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. Sequence analysis of the core gene of 14 hepatitis C virus genotypes. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. - Vol. 91. -P. 8239-8243.
49. Butcher S.J., Grimes J.M., Makeyev E.V., Bamford D.H., Stuat D.I. A mechanism for initiating RNA-dependent RNA polymerization. // Nature. -2001.-Vol. 410.-P. 235-240.
50. Cai Q., Zhang X.X., Tian L.F., Yuan M., Jin G.D., Lu Z.M. Variant analysis and immunogenicity prediction of envelope gene of HCV strains from China. // J. Med. Virol. 2002. - Vol. 67. - P. 490-500.
51. Casiraghi M.A., De Paschale M., Romano L., Biffi R., Assi A., Binelli G., Zanetti A.R. Long-term outcome (35 years) of hepatitis C after acquisition of infection through mini transfusions of bloof given at birth. // Hepatology. -2004.-Vol. 39.-P90-96.
52. Chan-Fook C., Jiang W.R., Clarke B.E., Zitzmann N., Maidens C., McKeating J.A., Jones I.M. hepatitis c virus glycoprotein E2 binding to
53. CD81: the role of E1E2 cleavage and protein glycosylation in bioactivity. 11 Virology. 2000. - Vol. 273. - P. 60-66.
54. Chang K.S., Luo G. The polypyrimidin tract-binding protein (PTB) is required for efficient replication of hepatitis C virus (HCV) RNA. // Virus Res.-2005.-Vol. 15.-P. 1-8.
55. Charloteaux B., Lins L., Moereels H., Brasseur R. Analysisi of the C-terminal membrane anchor domains of hepatitis c virus glycoproteins El and E2: toward a topological model. // Virology. 2002. - Vol. 76(4). - P. 19441958.
56. Chen J.C., Chang M.F., Chang S.C. Specific interaction between the hepatitis C virus NS5B RNA polymerase and the 3' end of the viral RNA. // J. Virol. -1999. Vol. 73. -P. 7044-7049.
57. Chien D.Y., Choo A., Ralston R., Spaete R., Tong M., Houghton M., Kuo G. Persistence of HCV despite antibodies to bith putative envelope glycoproteins. // Lancet. 1993. - Vol. 342. - P. 933-934.
58. Choo Q.-L., Kuo G., Weiner A.J., Overby L.R., Bradley D.W., Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. // Sci. 1989. - Vol. 244. - P. 359-362.
59. Choo Q.-L., Weiner A.J., Overby L.R., Kuo G„ Houghton M., Bradley D.W. Hepatitis С virus: the major causative agent of viral non-A, non-B viral hepatitis. // British. Medic. Bulletin. 1990. - Vol. 46. - P. 423-441.
60. Choukhi A., Ung S., Wychowski C., Dubuisson J. Involvement of endoplasmic reticulum chaperones in the folding of hepatitis C virus glycoproteins. // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 3851-3858.
61. Ciccaglione A.R., Marcantonio C., Costantino A., Equestre M., Geraci A., Rapicetta M. Hepatitis C virus El protein induces modification of membrane permeability in E. coli cells. // Virology. 1998. - Vol. 250(1). - P. 1-8.
62. Clayton R.F., Owsianka A., Aitken J., Graham S., Bhella D., Patel A.H. Analysis of antigenicity and topology of E2 glycoprotein present on recombinant C virus-like particles. // J. Virol. -2002. Vol. 76(150). - P. 7672-7682.
63. Conte D., Fraquelli M., Prati D, Colucci A., Minola E. Prevalence and clinical course of chronic hepatitis C virus infection and rate of HCV vertical transmission in a cohort of 15,250 pregnant women. // Hepatology. 2000. -Vol. 31.-P. 751-755.
64. Cooper S., Erickson A.L., Adams E.J., Kansopon J., Weiner A.J., Chien D.Y., Houghton M., Parham P., Walker C.M. Analysis of a successful immuneresponse against hepatitis C virus. // Immunity. 1999. - Vol. 10. - P. 439449.
65. Coppola R., Rizzetto M., Bradley D.W. Hepatitis C. // In: Viral hepatitis handbook. Ed.: Crivelli 0. Saluggia (Vercelli), Italy: Sorin Biomedica, 1996.-P. 79-81.
66. Costa-Mattioli M., Smitkin Y., Sonenberg N. La autoantigen is necessary for optimal function of the poliovirus and hepatitis C virus internal ribosome entry site in vivo and in vitro. // Mol. Cell Biol. 2004. - Vol. 24(15). - P. 6861-6870.
67. Dammacco F., Sansonno D., Piccoli C., Racanelli V., D'Amore F.P., Lauletta G. The lymphoid system in hepatitis C virus infection: autoimmunity, mixed cryoglobulinemia, and Overt B-cell malignancy. // Semin. Liver Dis. 2000. -Vol. 20.-P. 143-157.
68. De Vos R., Verslype C., Depla E., Feveiy J., Van Damme B. Ultrastructural visualization of hepatitis C virus components in human and primate liver biopsies. // J. Hepatol. 2002. - Vol. 37. P. 370-379.
69. Delamare C., Carbonne B., Heim N., Berkane N., Petit J.C., Uzan S., Grange J.D. Recovery of hepatitis C virus RNA in pregnant women. // J. Hepatology. -1999.-Vol. 31.-P. 416-420.
70. Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C., Blight K., Xu J., Hahn Y.S., Rice C.M., Dubuisson J. Formation of hepatitis C virus glycoprotein complexes. // J. Virol. 1997. - 71. - P. 697-704.
71. Drummer H.E., Maerz A., Poumbourios P. Cell surface expression of functional hepatitis C virus El and E2 glycoproteins. // FEBS Lett. 2003. -Vol. 546.-P. 385-390.
72. Dubuisson J., Rice C.M. Hepatitis C virus glycoprotein folding: disulfide bond formation and association with calnexin. // J. Virol. 1996. - Vol. 70. -P. 778-786.
73. Ehrentreich-Forster E., Scheller F.W., Bier F.F. Detection of progesterone in whole blood samples. // Biosens. Bioelectron. 2003. - Vol. 18. - P. 375380.
74. Esumi M., Ahmed M., Zhou Y.-H., Takahashi H., Shikata T. Murine antibodies against E2 and hypervariable region 1 cross-reactively capture hepatitis C virus. // Virology. 1998. - Vol. 251. - P. 158-164.
75. Ezelle H.J., Markovic D., Barber G.N. Generation of hepatitis C virus-like particles by use of a recombinant vesicular stomatitis virus vector. // J. Virol. -2002.-Vol. 76.-P. 12325-12334.
76. Fabrizi F., Lunghi G., Guarnori I., Raffaele L., Erba G., Pagano A., Locatelli F. IgM antibody response to hepatitis C virus in end-stage renal disease. // Nephron. Dial. Transplant. 1996. -Vol. 11. - P. 314-318.
77. Fan X.G., Liu W.E., Li C.Z., Wang Z.C., Luo L.X., Tan D.M., Hu G.L., Zhang Z. Circulating Thl and Th2 cytokines in patients with hepatitis C virus infection. // Mediators Inflamm. -1998. Vol. 7. - P. 295-297.
78. Farci P., Alter H.J., Govindarajan S., Wong D.C., Engle R., Lesniewski R.R., Mushahwar I.K., Desai S.M., Miller R.H., Ogata N. Lack of protective imunity against reinfection with hepatitis C virus. // Science. 1992. - Vol. 258.-P. 135-140.
79. Farci P., Alter H.J., Wong D., Miller R.H., Shih J.W., Jett B., Purcell R.H. A long-term study of hepatitis C virus replication in non-A, non-B hepatitis. // N. Engl. J. Med. 1991. - Vol. 325. - P. 98-104.
80. Feinstone S., Kapikian A.Z., Purcell R.H., Alter H.J., Holland P.V. Transfusion-associated hepatitis not due to viral hepatitis type A or B. // N. Engl. J. Med. 1975. - Vol. 292. - P. 767-770.
81. Fernandez J.L., Valtuille R., Butera H., Fay F., Lef L., Rendo P. Influence of hemodialysis procedure on HCV RNA detection in serum and peripheral blood mononuclear cells. // Ren. Fail. 2004. - Vol. 26(4). - P. 369-373.
82. Ferrero S., Lungaro P, Bruzzone BM, Gotta C, Bentivoglio G, Ragni N. Prospective study of mother-to-infant transmission of hepatitis C virus: a 10-year survey (1990-2000). // Acta Obstet. Gynecol. Scand. 2003. - Vol. 82. -P. 229-234.
83. Fisher E. A., Ginsberg H. N. Complexity in the secretory pathway: the assembly and secretion of apolipoprotein B-containing lipoproteins. // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 17377-17380.
84. Fletcher S.P., Jackson R.J. Pestivirus internal ribosome entry site (IRES) structure and function: elements in the 5' untranslated region important for IRES function. // J. Virol. 2002. - Vol. 76. - P. 5024-5033.
85. Flint M., Dubuisson J., Maidens C., Harrop R., Guilie G.R., Borrow P., McKeating J.A. Functional characterization of intracellular and secreted forms of a truncated hepatitis C virus E2 glycoprotein. // J. Virol. 2000. -Vol. 74.-P. 702-709.
86. Flint M., McKeating J.A. The C-terminal region of the hepatitis C virus El glycoprotein confers localization within the endoplasmic reticulum. // J. Gen. Virol.-1999. Vol. 80.-P. 1943-1947.
87. Flint M., Thomas J. M., Maidens C. M., Shotton C., Levi S., Barclay W. S., McKeating J. A. Functional analysis of cell surface-expressed hepatitis C virus E2 glycoprotein. // J. Virol. 1999. - Vol. 73 (8). - P. 6782-6790.
88. Frese M., Schwarzle V., Barth K., Krieger N., Lohmann V., Mihm S., Haller O., Bartenschlager R. Interferon-gamma inhibits replication of subgenomic and genomic hepatitis C virus RNAs. // Hepatology. 2002. - Vol. 35. - P. 694-703.
89. Friebe P., Boudet J., Simorre J.P., Bartenschlager R. Kissing-loop interaction in the 3' end of the hepatitis C virus genome essential for RNA replication. // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 380-392.
90. Fukushi S., Okada M., Stahl J., Kageyama T., Hoshino F.B., Katayama K. Ribosomal protein S5 interacts with the internal ribosomal entry site of hepatitis C virus. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 72. - P. 20824-20826.
91. Garcia J.E., Puentes A., Suarez J., Lopez R., Vera R., Rodriguez L.E., Ocampo M., Curtidor H., Guzman F., Urquiza M., Patarroyo M.E. // J. Hepatol. 2002. - Vol. 36. - P. 254-262.
92. Garry R.F., Dash S. Proteomic computational analyses suggest that hepatitis C virus El and pestivirus E2 envelope glycoproteins are trucated class II fusion protein. // Virology. 2003. - Vol. 307. - P. 255-265.
93. Garson J.A., Lubach D., Passas J., Whitby K., Grant P.R. Suramin blocks hepatitis C virus binding to human hepatoma cells in vitro. II J. Med. Virol. -1999.-Vol. 57.-P. 238-242.
94. Geriach J.T., Ulsenheimer A., Gruener N.H., Jung M.-C., Schraut W., Schirren C.-A., Heeg M., Scholz S., Witter K., Zahn R., Vogler A., Zachoval219
95. R., Pape G.R., Diepolder H.M. Minimal T-cell-stimulatory sequences and spectrum of HLA restriction of immunodominant CD4+ T-cell epitopes within hepatitis C virus NS3 and NS4 proteins. // J. Virol. 2005. - Vol. 79. -P. 12425-12433.
96. Goffard A., Callens N., Bartosch B., Wychowski C., Cosset F.L., Montpellier C., Dubuisson J. Role of N-linked glycans in the functions of hepatitis C virus envelope glycoproteins. // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 8400-8409.
97. Goffard A., Dubuisson J. Glycosylation of hepatitis c virus envelope proteins. // Biochimie. 2003. - Vol. 85. - P. 295-301.
98. Golebiowski J., Antonczak S., Di-Giorgio A., Condom R., Cabrol-Bass D. Molecular dynamics simulation of hepatitis C virus IRES IHd domain: structural behavior, electrostatic and energetic analysis. // J. Mol. Model. -2004.-Vol. 10.-P. 60-68.
99. Goutagny, N., A. Fatmi, V. De Ledinghen, F. Penin, P. Couzigou, G. Inchauspe, and C. Bain. Evidence of viral replication in circulating dendritic cells during hepatitis C virus infection. // J. Infect. Dis. 2003. - Vol. 187. -P. 1951-1958.
100. Gowans E.J. Distribution of markers of hepatitis C virus infection throughout the body. // Semin. Liver. 2000. - Vol. 20. - P. 85-102.
101. Grakoui A., Shoukry N.H., Woollard D.J., Han J.H., Hanson H.L., Ghrayeb J., Murthy K.K., Rice C.M., Walker C.M. HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T cell help. // Sci. 2003. - Vol. 302. - P. 659-662.
102. Grakoui A., Wychowski C., Lin C., Feinstone S.M., Rice C.M. Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products. // J. Virol. 1993. - Vol. 67. - P. 1385-1395.
103. Grakowi A., McCourt D.W., Wychowski C., Feinstone S.M., Rice C.M. A second hepatitis C virus-encoded prorease. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1993. Vol. 90. - P. 10583-10587.
104. Haake H.M., Schutz A., Gauglitz G. Label-free detection of boimolecular interaction by optical sensors. // Fresenius J. Anal. Chem. 2000. - Vol. 366. -P. 576-585.
105. Hadziyannis S. J. The spectrum of extrahepatic manifestations in hepatitis C virus infection. //J. Viral. Hepat. 1997. - Vol. 4. - P. 9-28.
106. Hahm B., Kim Y.K., Kim J.H., Kim T.Y., Yang S.K. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L interacts with the 5' border if the internal ribosome entry site of hepatitis C virus. // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 8782-8788.
107. He L.F., Ailing D., Popkin T, Shapiro M., Alter H.J., Purcell R.H. Determining the size of non-A, non-B hepatitis virus by filtration. // J. Infect. Dis.-1987.-Vol. 156.-P. 636-640.
108. Helenius A. How N-linked oligosaccharides affect glycoprotein folding in the endoplasmic reticulum. // Mol. Biol. Cell. 1994. - Vol. 5. - P. 253-265.
109. Hino K., Sainokami S., Shimoda K., Niwa H., lino S. Clinical course of acute hepatitis C and changes in HCV markers. // Dig. Dis. Sci. 1994. - Vol. 39(1).-P. 19-27.
110. Hoffmann R.M., Diepolder H.M., Zachoval R., et al. Mapping of immunodominant CD4+ T lymphocyte epitopes of hepatitis C virus antigens and their relevance during the course of chronic infection. // Hepatology. -1995.-Vol. 21.-P. 632-638.
111. Honda M., Brown E.A., Lemon S.M. Stability of a stem-loop involving the initiator AUG controls the efficiency of internal initiation of translation on hepatitis C virus RNA. // RNA. 1996. - Vol. 2. - P. 955-968.
112. Hoofnagie J.H. Course and outcome of hepatitis C. // Hepatology. 2002. -Vol. 36.-P. S21-S29.
113. Houhgton M., Abrignani S. Prospects for a vaccine against the hepatitis C virus. // Nature. 2005. - Vol. 436. - P. 961-966.
114. Hsieh T.Y., Matsumoto M., Chou H.C., Schneider R., Hwang S.B., Lee A.S., Lai M.M. Hepatitis C virus core protein interacts with geterogeneous nuclear ribonucleoprotein K. // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 17651 -17659.
115. Hsu C.-W., Yeh C.-T., Chen P. G.-C., Liaw Y.-F. Replication of hepatitis C virus in ascitic mononuclear cells with development of distinct viral quasispecies. // J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 180. - P. 992-1000.
116. Hsu H.H., Donets M., Greenberg H.B., Feinstone S.M. Characterizition of hepatitis C virus structural proteins with a recombinant baculovirus expression system. // Hepatology. 1992. - Vol. 17. - P. 763-771.
117. Hsu M., Zhang J., Flint M., Logvinoff C., Cheng-Mayer C., Rice C.M., McKeating J.A. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -2003.-Vol. 100.-P. 7271-7276.
118. Hu Y.-W., Rocheleau L., Larke B., Chui L., Lee B., Ma M., Liu S., Omlin T., Pelchat M., Brown E.G. Immunoglobulin mimicry by hepatitis C virus envelope protein E2. // Virology. 2005. - Vol. 332. - P. 538-549.
119. Hultgren C., Milich D.R., Weiland O., Sallberg M. The antiviral compound ribavirin modylates the T helper (Th)l/Th2 subset balance in hepatitis B and C virus-specific immune responses. // J. Gen. Virol. 1998. - Vol. 79. - P. 2381-2391.
120. Imajoh-Ohmi S., Kohara M., Nomoto A. Membrane binding properties and terminal residues of the mature hepatitis C virus capsid protein in insect cells. // J. Virol. 2004. - Vol 78. - P. 11766-11777.
121. Inchauspe G., Abe K., Zebedee S., Nasoff M., Prince A.M. Use of conserved sequences from hepatitis C virus for the detection of viral RNA in infected sera by polymerase chain reaction. // Hepatology. 1991. - Vol. 14. - P. 595600.
122. Ishii K., Rosa D., Watanabe Y. et al. High titers of antibodies inhibiting the binding of envelope to human cells correlate with natural resolution of chronic hepatitis C. // Hepatology. 1998. - Vol. 28. - P. 1117-1120.
123. Ito T., Lai M.M. An internal polypyrimine-tract-binding protein-binding site in the hepatitis C virus RNA attenuates translation, which is relieved by the 3'-untranslated sequence. // Virology. 1999. - Vol. 254. - P. 288-296.
124. Ito T., Lai M.M. Determination of the secondary structure of and cellular protein binding to the 3'-untranslated region of the hepatitis C virus RNA genome. // J. Virol. 1997. - Vol. 71. - P. 8698-8706.
125. Ji H., Fraser C.S., leary J., Doudna J.A. Coordinated assaembly of human translation initiation complexes by the hepatitis C virus internal ribosome entry site RNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004. - Vol. 101. - P. 16990-16995.
126. Jin D.Y., Wang H.L., Zhou Y„ Chun A.-C., Kibler K.V., Hou Y.D., Kung H., Jeang K.T. Hepatitis C virus core protein-induced loss of LZIP function correlates with cellular transformation. // EMBO J. 2000. - Vol. 19. - P. 729-740.
127. Kaito M., Watanabe S., Tsukiyama-Kohara K., Yamaguchi K., Kobayashi Y., Konishi M., Yokoi M., Ishida S., Suzuki S. Hepatitis C particles detected by immunoelectron microcopic study. // J. Gen. Virol. 1994. - Vol. 75. - P. 1755-1760.
128. Kaneko T., Nakamura I., Kita K., Hiroishi K., Moriyama T., Imawari M. Three new cytotoxic T cell epitopes identified within the hepatitis C virus nucleoprotein. //J. Gen. Virol.- 1996. Vol. 77. - P. 1305-1309.
129. Kang S.M., Shin M.J., Kim J.H., Oh J.W. Proteomic profiling of cellular proteins interacting with the hepatitis C virus core protein. // Proteomics. -2005. Vol. 5. - P. 2227-2237.
130. Kao J.H., Lai M.Y., Chen P.Y., Chen D.S. Immunoglobulin M antibody response to hepatitis C virus core protein in patients with chronic hepatitis C. //J. Formos. Med. Assoc. 1997. - Vol. 96. - P. 825-828.
131. Kato N. Molecular virology of hepatitis C virus. // Acta Med. Okayama. -2001.-Vol. 55.-P. 133-159.
132. Kato N., Ootsuyama Y., Sekiya H., Ohkoshi S., Nakazawa T., Hijikata M., Shimotohno K. Genetic drift in hypervariable region 1 of the viral genome in persistent hepatitis C virus infection. // J. Virol. 1994. - Vol. 68. - P. 47764784.
133. Khromykh A.A., Meka H., Guyatt K.Y., Westaway E.G. Essential role of cyclization sequences in flavivirus RNA replication. // J. Virol. 2001. - Vol. 75.-P. 6719-6728.
134. Khudyakov Yu. E., Khudyakova N.S., Jue D.L., Lambert S.B., Fang S., Fields H.A. Linear B-cell epitopes of the NS3-NS4-NS5 proteins of the hepatitis C virus as modeled with synthetic peptides. // Virology. 1995. -Vol. 206.-P. 666-672.
135. Kim I., Lukavsky P.J., Puglisi J.D. NMR study of 100 kDa HCV IRES RNA using segmental isotope labeling. // J. Am. Chem. Soc. 2002. - Vol. 124(32).-P. 9338-9339.
136. Klein K.C., Polyak S.J., Lingappa J.R. Unique features of hepatitis C virus capsid formation revealed by de novo cell-free assembly. // J. Virol. 2004. -Vol. 78.-P. 9257-9269.
137. Kluger R, Muhlberger H., Hoffmann O., Berger C.E., Engel A., Pavlova B.G. Osteoprogenitor cells and osteoblasts are targets for hepatitis C virus. // Clin. Orthop. Res. 2005. - Vol. 433. - P. 251-257.
138. Kolykhalov A.A., Feinstone S.M., Rice C.M. Identification of a highly conserved sequence element at the 3' terminus of hepatitis C virus. // J. Virol. -1996.-Vol. 70.-P. 3363-3371.
139. Kolykhalov A.A., Mihalik K., Feinstone S.M., Rice C.M. Hepatitis C virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3' nontranslated region are essential for virus replication in vivo. // J. Virol. -2000. Vol. 74. - P. 2046-2051.
140. Korf M., Jarczak D., Beger C., Manns M.P., Kruger M. Inhibition of hepatitis C virus translation and subgenomic replication by siRNAs directed against highly conserved HCV sequence and cellular HCV cofactors. // J. Hepatol. -2005.-Vol. 43.-P. 225-234.
141. Koziel M.J., Dudley D., Afdhal N., Choo Q.-L., Houghton M., Ralston R., Walker B.D. Hepatitis C virus (HCV)-specific cytotoxic T lymphocytes recognize epitopes in the core and envelope proteins of HCV // J. Virol. -1993. Vol. 67. - P. 7522-7532.
142. Koziel M.J., Dudley D., Wong J.T., Dienstag J., Houghton M., Ralston R., Walker B.D. Intrahepatic cytotoxic T lymphocytes specific for hepatitis C virus in persons with chronic hepatitis. // J. Immunol. 1992. - Vol. 149. - P. 3339-3344.
143. Lai M.E., Mazzoleni A.P., Argiolu F., De Virgilis S., Balestrieri A., Purcell R.H., Cao A., Farci P. Hepatitis C virus in multiple episodes of acute hepatitis in polytransfused thalassaemic children. // Lancet. 1994. - Vol. 343. - P. 388-390.
144. Lam N.P., Neumann A.U., Gretch D.R., Wiley T.E., Perelson A. S., Layden T.J. Dose-dependent acute clearance of hepatitis C genotype 1 virus with interferon alfa. // Hepatology. 1997. - Vol. 26. - P. 226-231.
145. Laporte J., Bain C., Maurel P., Inchauspe G., Agut H., Cahour A. Differential distribution and internal translation eddiciency of hepatitis C virus quasispeciec present in dendritic and liver cells. // Blood. 2003. - Vol. 101. -P. 52-57.
146. Large M.K., Kittlesen D.J., Hahn Y.S. Suppression of host immune response by the core protein of hepatitis C virus: possible implications for hepatitis C virus persistence. //J. Immunol. -1999. Vol. 162. -P. 931-938.
147. Lechmann M., Murata K., Satoi J., Vergalla J., Baumert T.F., Liang T.J. Hepatitis C virus-like particles induce virus-specific humoral and cellular immune responses in mice. // Hepatology. 2001. - Vol. 34. - P. 417-423.
148. Lee J.W., Kim K.-M., Jung S.-H., Lee K.J., Choi E.-C., Sung Y.-C, Kang C.Y. Identification of a domain containing B-cell epitopes in hepatitis C virus E2 glycoprotein by using mouse monoclonal antibodies. // J. Virol. 1999. -Vol. 73(1). - P. 11-18.
149. Leroux-Roels G., Esquivel A., De Leys R., et al. Lymphoproliferative responces to hepatitis C virus core, El, E2, and, NS3 in patients with chronic hepatitis C infection treated with interferon alfa. // Hepatology. 1996. - Vol. 23.-P. 8-16.
150. Levin M.K., Gurjar M., Patel S.S. Brownian motor mechanism of translocation and strand separation by hepatitis С virus helicase. // Nature Struct. Mol. Biol. 2005. - Vol. 12. - P. 429-435.
151. Li C., Candotti D., Allain J.-P. Production and characterization of monoclonal antibodies specific for a conserved epitope within hepatitis С virus hypervariable region 1. //J. Virol. -2001. Vol. 75. - P. 12412-12420.
152. Li D., Lott W.B., Martyn J., Haqshenas G., Gowans E.J. Differential effects on the hepatitis С virus (HCV) intenal ribosome entry site by vitamin В12 and the HCV core protein. // J. Virol. 2004. - Vol. 78. - P. 12075-12081.
153. Lin C., Thomson J.A., Rice C.M. A central region in the hepatitis С virus protein NS4A allows formation of an active NS3-NS4A serine proteinase complex in vivo and in vitro. //J. Virol. 1995. - Vol. 69. - P. 4373-4380.
154. Lindenbach В., Rice C.M. Unravelling hepatitis С virus replication from genome to function. // Nature. 2005. - Vol. 436. - P. 933-938.
155. Lindenbach B.D., Evans M.J., Syder A.J., Wolk В., Tellinghuisen T.L., Liu C.C., Maruyama Т., Hynes R.O., Burton D.R., McKeating J.A., Rice C.M. Complete replication of hepatitis С virus in cell culture. // Science. 2005. -Vol. 309.-P. 623-626.
156. Lohr H.F., Schlaak J.K., Kollmannsperger S., et al. Liver-infiltrating and circulating CD4+ T cells in chronic hepatitis C: immunodominant epitopes, HLA-restriction and functional significance. // Liver. 1996. - Vol. 16. - P. 174-182.
157. Lott W.B., Takyar S.S., Tuppen J., Grawford D.H., Harrison T.P., Sloots T.P., Gowans E.J. Vitamin B12 and hepatitis C virus: molecular biology and human pathology. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001. Vol. 98. - P. 4916-4921.
158. Lu W., Lo S.Y., Chen M., Wu K., Fung Y.K., Ou J.H. Activation of p53 tumor suppressor by hepatitis C virus core protein. // Virology. 1999. - Vol. 264.-P. 134-141.
159. Lukavsky P.J., Kim I., Otto G.A., Puglisi J.D. Structure of HCV IRES domain II detemined by NMR. // Nat. Struct. Biol. 2003. - Vol. 10. - P. 1033-1038.
160. Lyons A.J., Robertson H.D. Detection of tRNA-like structure through Rnase P cleavage of viral internal ribosome entry site RNAs near the AUG start triplet. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 26844-26850.
161. Lytle J.R., Wu L., Robertson H.D. Domains on the hepatitis C virus internal ribosome entry site for 40S subunit binding. // Nucleic Acids Res. 2002. -Vol. 8.-P. 1045-1055.
162. Madejon A., Manzano M.L., Arocena C., Castillo I., Carreno V. Effects of delayed freezing of liver biopsies on the detection of hepatitis C virus RNA strands. // J. Hepatol. 2000. - Vol. 32. - P. 1019-1025.
163. Majeau N., Gagne V., Boivin A., Boldue M., Majeau J.A., Ouellet D., Leclere D. The N-terminal half of the core protein of hepatitis C virus is sufficient for nucleocapsid formation. // J. Gen. Virol. 2004. - Vol. 85. - P. 971-981.
164. Markwell M.A.K., Haas S.M., Bieber L.L., Tolbert N.E. Modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. // Anal. Biochem. 1978. - Vol. 87. - P. 206-211.
165. Martinelli A.L., Brown D., Braun H.B., Michel G., Dusheiko G.M. Quantitative assessment of hepatitis C virus RNA and IgM antibodies to hepatitis C core in chronic hepatitis C. // J. Hepatol. 1996. - Vol. 24. - P. 21-26.
166. Matsumori A., Ohashi N., Nishio R., Kakio T., Hara M., Furukawa Y., Ono K., Shioi T., Hasegawa K., Sasayama S. Apical hypertrophic cardiomyopathy and hepatitis C virus infection. // Japan. Circulation J 1999. - Vol. 63. - P. 433-438.
167. Matsumoto M., Hwang S.S., Jeng K.S., Zhu J.N., Lai M.M. Homotypic interaction and multimerization of hepatitis C virus core protein. // Virology. 1996.-Vol. 218.-P. 43-51.
168. Matsuura Y., Miayamura T. The molecular biology of hepatitis C virus. // Semin. Virol. 1993. - Vol. 4. - P. 297-304.
169. Matsuura Y., Suzuki T., Suzuki M., Sato H., Aizaki H., Saito I., Miyamura T. Processing of El and E2 glycoproteins of hepatitis C virus expressed in mammalian and insect cells. // Virology. 1994. - Vol. 205. - P. 141-150.
170. Mattsson L., Sonnerborg A., Weiland O. Outcome of acute symptomatic nonA, non-B hepatitis: a 13-year follow-up study of hepatitis c virus markers. // Liver. 1993. -Vol. 13. - P. 274-278.
171. McLauchlan J., Lemberg M.K., Hope G., Martoglio B. Intramembrane proteolysis promotes trafficking of hepatitis C virus core protein to lipid droplets. // EMBO J. 2002. - Vol. 21. - P. 3980-3988.
172. Memon M.I., Memon M.A. Hepatitis C: an epidemiological review. // J. Viral. Hepat. 2002. - Vol. 9. - P. 84-100.
173. Michalak J.P., Wychowski C., Choukhi A., Meunier J.C., Ung S., Rice C.M., Dubuisson J. Characterization of truncated forms of hepatitis C virus glycoproteins. // J. Gen. Virol. 1997. - Vol. 78 - P. 2299-2306.
174. Miller R.H., Purcell R.H. Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with pestiviruses and flaviviruses as well as members of two plant virus supergroups. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. - Vol. 87. - P. 2057-2061.
175. Mink M.A., Benichou S., Madaule P., Tiollais P., Prince A.M., Inchauspe G. Characterization and mapping of a B-cell immunogenic domain in hepatitis c virus E2 glycoprotein using a yeast peptide library. // Virology. 1994. - Vol. 200.-P. 246-255.
176. Miyamoto H., Okamoto H., Sato K., Tanaka T., Mishiro S. Extraordinarily low density of hepatitis C virus estimated by sucrose density gradient centrifugation and the polymerase chain reaction. // J. Gen. Virol. 1992. -Vol. 73.-P. 715-718.
177. Miyanari Y., Hijikata M., Yamaji M., Hosaka M., Takahashi H., Shimotohno K. Hepatitis C virus non-structural proteins in the probable membranouscompartment function in viral genomwe replication. // J. Biol. Chem. 2003. -Vol. 278.-P. 50301-50308.
178. Nakano I., Fukuda Y., Katano Y., Hayakawa T. Conformational epitopes detected by cross-reactive antibodies to envelope 2 glycoprotein of the hepatitis C virus. // J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 180. - P. 1328-1333.
179. Nelson D.R., Marousis C.G., Davis G.L., Rice C.M., Wong J., Houghton M., Lau J.Y. The role of hepatitis C virus-specific cytotoxic T lymphocytes in chronic hepatitis C.//J. Immunol.- 1997,-Vol. 158.-P. 1473-1481.
180. Nelson D.R., Marousis C.G., Ohno T., Davis G.L., Lau J.Y.N. Intrahepatic hepatitis C virus-specific cytotoxic T lymphocyte activity and response to interferon alfa therapy in chronic hepatitis C. // Hepatology. 1998. - Vol. 28.-P. 225-230.
181. Netski D.M., Mosbruger T., Depla E., Maertens G., Ray S.C., Hamilton R.G., Roundtree S., Thomas D.L., McKeating J., Cox A. Humoral immune responsein acute hepatitis C virus infection. // Clin. Infect. Dis. 2005. - Vol. 41. - P. 667-75.
182. Nishioka K., Watanabe J., Furuta S., Tanaka E., Suzuki H., lino S., Tsuji T., Yano M., Kuo G., Choo Q.L. Antibody to the hepatitis C virus in acute hepatitis and chronic liver disease in Japan. // Liver. 1991. - Vol. 11. - P. 65-70.
183. Nolandt O., Kern V., Muller H., Pfaff E., Theilmann L., Welker R., Krausslich H.G. Analysis of hepatitis C virus core protein interaction domains. // J. Gen. Virol. 1997. - Vol. 78. - P. 1331-1370.
184. Nulf C.L., Corey D. Intracellular inhibition of hepatitis C virus (HCV) intenal ribosomal entry site (IRES)-dependent translation by peptide nucleic acids (PNAs) and locked nucleic acids (LNAs). // Nucleic Acids Res. 2004. -Vol. 32.-P. 3792-3798.
185. Okamoto K., Moriishi k., Miyamura T., Matsuura Y. Intramembrane proteolysis and endoplasmic reticulum retention of hepatitis C virus core protein. // J. Virol. 2004. - Vol. 78(12). - P. 6390-6380.
186. Okayama A., Stuver S.O., Tabor E., Tachibana N., Kohara M., Mueller N.E. Incident hepatitis C virus infection in a community-based population in Japan. // J. Viral. Hepat. 2002. - Vol. 9. - P. 43-51.
187. Okuda M., Hino K., Korenaga M., Yamaguchi Y., Katoh Y., Okita K. Differences in hypervariable region 1 quasispecies of hepatitis C virus in human serum, peripheral blood mononuclear cells, and liver. // Hepatology. -1999.-Vol. 29.-P. 217-222.
188. Op De Beeck A., Cocquerel L., Dubuisson J. Biogenesis of hepatitis C virus envelope glycoproteins. // J. Gen. Virol. 2001. - Vol. 82. - P. 2589-2595.
189. Op De Beeck A., Dubuisson J. Topology of hepatitis C virus. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 35755-35766.
190. Op De Beeck A., Voisset C., Bartosch B., Ciczora Y., Cocquerel L., Keck Z., Foung Y., Cosset F.-L., Dubuisson J. Characterization of functional hepatitis C virus envelope glycoproteins. // J. Virol. 2004. - Vol. 78. - P. 2994-3002.
191. Owsianka A.M., Patel A.H. Hepatitis C virus core protein interacts with a human DEAD box protein DDX3. // Virol. 1999. - Vol. 257. - P. 330-340.
192. Pape G.R., Gerlach T.J., Diepolder H.M., Gruner N., Jung M., Santantonio T. Role of the specific T-cell response for clearance and control of hepatitis C virus. // J. Viral. Hepatol. 1999. - Vol. 6. (suppl.l). - P. 36-40.
193. Patel J., Patel A.H., McLauchlan J. The transmembrane domain of the hepatitis C virus E2 glycoprotein is required for correct folding of the El glycoprotein and native complex dormation. // Virology. 2001. - Vol. 279. P. 58-68.
194. Paternoster D. M., Santarossa C., Grella P., Palu G., Baldo V., Boccagni P., Floreani A. Viral load in HCV RNA-positive pregnant women. // Am. J. Gastroenterol. 2001. - Vol. 96. - P. 2751-2754.
195. Pavio N., Lai M.M. The hepatitis C virus persistence: how to evade the immune system? // J. Biosci. 2003. - Vol. 28. - P. 287-304.
196. Pawlotsky J.M. Diagnostic tests for hepatitis C. // J. Hepatology. 1999. -Vol. 31(Suppl. 1).-P. 71-79.
197. Penin F., Dubuisson J., Rey F.A., Moradpour, Pawlotsky J.M. Structural biology of hepatitis C virus. // Hepatology. 2004. - Vol. 39. - P. 5-19.
198. Pereboeva L., Pereboev A., Wang L., Morris G. Hepatitis C epitopes from phage-displayed cDNA libraries and improved diagnosid with a chimeric antigen. // J. Med. Virol. 2000. - Vol. 60. - P. 144-151.
199. Pereboeva L.A., Pereboev A.V., Morris G.E. Identification of antigenic sites on three hepatitis C virus proteins using phage-displayed peptide libraries. // J. Med. Virol. 1998. - Vol. 56. - P. 105-111.
200. Perniola R., De Rinaldis C., Leo G. Third-generation assays for hepatitis C antibodies: a four-year study of pattern changes in patients with chronic and past infection. // Panminerva Med. 1999. - Vol. 41. - P. 291-294.
201. Petit M.A., Jolivet-Reynaud C., Peronnet E., Michal Y., Trepo C. Mapping of a conformational epitope shared between El and E2 on the serum-derived human hepatitis C virus envelope. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 44385-44392.
202. Petit M.A., Lievre M., Peyrol S., De Sequeira S., Berthillon P., Ruigrok Trepo C. Enveloped particles in the serum of chronic hepatitis C patients. // Virology.-2005.-Vol. 336.-P. 144-153.
203. Pileri P., Uematsu Y., Campagnoli S., Galli G., Falugi F., Petracca R., Weiner A.J., Houghton M., Rosa D., Grandi G., Abrignani S. Binding of hepatitis C virus to CD81. // Science. 1998. - Vol. 282. - P. 938-941.
204. Piron M., Beguiristain N., Nadal A., Martinez-Salas E., Gomez J. Characterizing the function and structural organization of the 5' tRNA-like motif within the hepatitis C virus quasispecies. // Nucleic Acids Res. 2005. -Vol. 33.-P. 1487-1502.
205. Prince A. M., Huima-Byron T., Parker T. S., Levine D. M. Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins. // J. Viral. Hepat. 1996. - Vol. 3. - P. 11-17.
206. Prince A.M. Nature of non-A, non-B hepatitis viruses. // Lancet. 1982. -Vol. l.-P. 1181-1182.
207. Prince A.M., Brotman B., Huima T., Pascual D., Jaffery M., Inchauspe G. Immunity in hepatitis C infection. // J. Infect. Dis. 1992. - Vol. 165. - P. 438-444.
208. Prince A.M., Horowitz B., Brotman B., Huima T., Richardson L., van den Ende M.C. Inactivation of hepatitis B and Hutchinson strain non-A, non-B hepatitis viruses by exposure to Tween 80 and ether. // Vox. Sang. 1984. -Vol. 46.-P. 36-43.
209. Pringle C. R. Virus taxonomy 1999. The universal system of virus taxonomy, updated to include the new proposals ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses during 1998. // Arch. Virol. - 1999. -Vol. 144.-P. 421-429.
210. Pudi R., Ramamurthy S.S., Das S. A peptide derived from RNA recognition motif 2 of human La protein binds to hepatitis C virus internal ribosome entry site, and inhibits internal initiation of translation. // J. Virol. 2005. - Vol. 79. -P. 9842-9853.
211. Puig M., Major K., Mihalik K., Feinstone S.M. Immunization of chimpanzees with an envelope protein-based vaccine enhances specific humoral and cellular immune responses that delay hepatitis C virus infection. // Vaccine. -2004.-Vol. 22.-P. 991-1000.
212. Quinkert D., Bartenschlager R., Lohmann V. Quantitative analysis of the hepatitis C virus replication complex. // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 13594-13605.
213. Quiroga J.A., Campillo M.L., Catillo I., Bartolome J., Porres J.C., Carreno V. IgM antibody to hepatitis C virus in acute and chronic hepatitis C. // Hepatology. 1991. - Vol. 14. -P. 38-43.
214. Rademacher T.G., Parekh R.B., Dwek R.A. Glycobiology. // Ann. Rev. Biochem. 1988. - Vol. 57. - P. 786-830.
215. Ray P.S., Das S. Inhibition of hepatitis C virus IRES-mediated translation by small RNAs analogous to stem-loop structures of the 5'-untranslated region. // Nucleic Acids Res. 2004. - Vol. 32. - P. 1678-1687.
216. Ray R., Khanna A., Lagging L.M., Meyer K., Choo Q.-L., Ralston R., Houghton M., Berhereret P.R. Peptide immunogen mimicry of putative El glycoprotein-specific epitopes in hepatitis C virus. // J. Virol. 1994. - Vol. 68.-P. 4420-4426.
217. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C., Kunz C., Harrison S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A0 resolution. // Nature. -1995.-Vol. 375.-P. 291-298.
218. Robbins P.W., Myers G., Howard C., Brettin T., Bukh J., Gaschen B., Gojobori T., Maertens G., Mizokami M., Nainan O., Netesov S., Nishioka K.,244
219. Rodda S J., Tribbick G. Antibody-defined epitope mapping using the multipin method of peptide synthesis. // Methods. 1996. - Vol. 9. - P. 473-481.
220. Roingeard P., Hourioux C., Blanchard E., Brand D., Ait-Goughoulte M. Hepatitis C virus ultrastructure and morphogenesis. // Biol. Cell. 2004. -Vol. 96.-P. 103-108.
221. Rosenberg S. Recent advances in the molecular biology of hepatitis C virus. // J. Mol. Biol. 2001. - Vol. 313. - P. 451-464.
222. Ross R.S., Viazov S., Varenholz C., Roggendorf M. Inquiries on intraspousal transmission of hepatitis C virus: benefits and limitations of genome sequencing and phylogenetic analysis. // Foren. Sci. Internat. 1999. - Vol. 100. - P. 69-79.
223. Ryan M.D., Monaghan S., Flint M. Virus-encoded proteinases of the Fliviviridae. II J. Gen. Virol. 1998. - Vol. 79. - P. 947-959.
224. Santantonio T., Sinisi E., Guastadisegni A., Casalino C., Mazzola M., Gentile
225. A., Leandro G., Pastore G. Natural course of acute hepatitis C: a long-term prospective study. // Digestive Liver Dis. 2003. - Vol. 35. - P. 104-113.
226. Sato S., Tanji Y., Hijikata M., Kimura K., Shimotohno K. The N-terminal region of hepatitis C virus nonstructural protein (NS3) is essential for stable complex formation with NS4A. // J. Virol. 1995. - Vol. 69. - P. 4255-4260.
227. Schlaak J.F., Pitz T., Lohr H.F., Meyer zum Buschenfelde K.H., Gerken G. Interleukin 12 enhances deficient HCV-antigen-induced Tl-type immune response of peripheral blood mononuclear cells. // J. Med. Virol. 1998. -Vol. 178.-P. 17-25.
228. Schulze zur Wiesch J., Lauer G. M., Day C. L., Kim A. Y., Ouchi K., Duncan J. E., Wurcel A. G., Timm J., Jones A. M., Mothe B., Allen T. M., McGovern
229. Selby M., Glazer E., Masiarz F., Houghton M. Complex processing and protein:protein interactions in the E2:NS2 region of HCV. // Virology. -1994.-Vol. 204.-P. 114-122.
230. Shaw M.L., McLauchlan J., Mills P.R., Patel A.H., McCrudenl E.A.B. Characterisation of the differences between hepatitits С virus genotype 3 and 1 glycoproteins. // J. Med. Virol. 2003. - Vol. 70. - P. 361-372.
231. Shimizu Y.K., Feinstone S.M., Kohara K., Purcell R.H., Yoshikura H. Hepatitis С virus: detection of intracellular virus particles by electron microcopy. // Hepatology. 1996. - Vol. 23. - P. 205-209.
232. Shimoike Т., Mimori S., Tani H., Matsuura Y., Miyamura T. Interaction of hepatitis С virus core protein with viral sense RNA and suppression of its translation. // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 9718-9725.
233. Shoukry N.H., Grakoui A., Houghton M., Chien D.Y., Ghrayeb J., Reimann K.A., Walker C.M. Memory CD8+ T cells are required for protection from247persistent hepatitis C virus infection. I I J. Exp. Med. 2003. - Vol. 197. - P. 1645-1655.
234. Shoukry N.H., Sidney J., Sette A., Walker C.M. Conserved hierarchy of herper T cell responses in a chimpanzee during primary and secondary hepatitis C virus infections. // J. Immunol. 2004. - Vol. 172. - P. - 483-492.
235. Simmonds P. Viral heterogeneity of the hepatitis C virus. // J. Hepatol. -1999. Vol. 3 l(suppl. 1). - P. 54-60.
236. Smith D.B., Simmonds P. Review: molecular epidemiology of hepatitis C virus. // J. Gastroenterol. Hepatol. 1997. - Vol. 12. - P. 522-527.
237. Spahn C.M., Kieft J.S., Grassucci R.A., Penczek P.A., Zhou K., Doudna J.A., Frank J. Hepatitis C virus IRES RNA-induced changes in the conformation of the40S ribosomal subunit. // Sci. -2001.- Vol. 291. -P. 1959-1962.
238. Steininger C., Kundi M., Jatzko G., Kiss H., Lischka A., Holzmann H. Increased risk of mother-to-infant transmission of hepatitis C virus by intrapartum infantile exposure to maternal blood. // J. Infec. Dis. 2003. -Vol. 187.-P. 345-351.
239. Stransky J., Krtek V., Honzakova E., Vandasova J., Mand'akova Z., Kyncl J., Nemecek V. Clinical significance of IgM anti-HCV determination in chronic hepatitis С. (На чешском яз.) //1. Interni klinika. (Praga). 1996. -Vol. 135(7).-P. 215-219.
240. Sumiyoshi H., Tignor G.H., Shope R.E. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. // J. Infect. Dis.- 1995.-Vol. 171.-P. 1144-1151.
241. Tai C.-L., Chi W.-K., Chen D.-S., Hwang L.-H. The helicase activity associated with hepatitis С virus nonstructural protein 3 (NS). // J. Virol. -1996.-Vol. 70.-P. 8477-8484.
242. Takahashi K., Kishimoto S., Yoshizawa H., et al.! p26 protein and 33-nm particles assotiated with nucleocapsid of hepatitis С virus recovered from the circulation of infected host. // Virology. 1992. - Vol. 191. - P. 431-434.
243. Takamizawa A., Mori C., Fuke I., Manabe S., Murakami S., Fujita J., Onishi E., Andoh Т., Yoshida I., Okayama H. Structure and organization of thehepatitis C virus genome isolated from human carriers. I I J. Virol. 1991. -Vol. 65.-P. 1105-1113.
244. Takyar S.S., Gowans E.J., Lott W.B. Vitamin B12 stalls the 80S ribosomal complex on the hepatitis C virus internal ribosome entry site. // J. Mol. Biol. -2002.-Vol. 319.-P. 1-8.
245. Tan D., Im S.W., Peng W.W., Ng M.H. Follow-up study of acute hepatitis C. //Arch. Virol. 1994. - Vol. 138. - P. 71-84.
246. Tanaka T., Kato N., Cho M.J., Shimotohno K. A novel sequence found at the 3' terminus of hepatitis C virus genome. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. - Vol. 215. - P. 744-749.
247. Tanaka T., Kato N., Cho M.J., Sugiyama K., Shimotohno K. Structure of the 3' terminus of hepatitis C virus genome. // J. Virol. 1996. - Vol. 70. - P. 3307-3312.
248. Taniguchi S., Okamoto H., Sakamoto M., Kojima M., Tsuda F., Tanaka T., Munekata E., Muchmore E.E., Peterson D.A., Mishiro S. A structurally flexible and antigenically variable N-termial domain of the hepatitis C virus250
249. E2/NS1 protein: implication for an escape from antibody. // Virology. 1993. -Vol. 195.-P. 297-301.
250. Taylor D.R., Shi S.T., Lai M.M. Hepatitis C virus and interferon resistance. // Microbes. Infect. 2000. - Vol. 2. - P. 1743-1756.
251. Taylor D.R., Shi S.T., Romano P.R., Barber G.N., Lai M.M. Inhibition of the interferon-inducible protein kinase PKR by HCV E2 protein. // Science. -1999.-Vol. 285.-P. 107-110.
252. Tellinghuisen T.L., Marcotrigiano J., Gorbalenya A.E., Rice C.M. The NS5A protein of hepatitis C virus is a zinc metalloprotein. // Curr. Opin. Microbiol. -2002.-Vol. 5.-P. 419-427.
253. Tellinghuisen T.L., Rice C.M. Interaction between hepatitis C virus proteins and host cell factors. // Curr. Opin. Microbiol. 2002. - Vol. 5. - P. 419-427.
254. Thimme R., Oldach D., Chang K.-M., Steiger C., Ray S.C., Chisari F.V. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C virus. //J. Exp. Med.-2001.-Vol. 194.-P. 1395-1406.
255. Thomssen R., Bonk S., Thiele A. Density heterogeneities of hepatitis C virus in human sera due to the binding of beta-lipoproteins and immunoglobulins. // Med. Microbiol. Immunol. 1993. - Vol. 182. - P. 329-334.
256. Thurner C., Witwer C., Hofacker I.L., Stadler P.F. Conserved RNA secondary structures in Flaviviridae genomes. // J. Gen. Virol. 2004. - Vol. 85. - P. 1113-1124.
257. Tran A., Yang G., Dreyfus G., Rouquie P., Durant J., Rampal P., Benzaken S. Significance of serum immunoglobulin M to hepatitis C virus core in patients with chronic hepatitis C. // Am. J. Gastroenterol. 1997. - Vol. 10. - P. 18351838.
258. Tremolada F., Casarin C., Alberti A., Drago C., Tagger A., Ribero M.L., Realdi G. Long-term follow-up of non-A, non-B (type C) posttransfusion hepatitis. // J. Hepatol. 1992. - Vol. 16. - P. 273-281.
259. Tsai S.L., Liaw Y.F., Chen M.H., Huang C.Y., Kuo G.C. Detection of type 2-like T-helper cells in hepatitis C virus infection: implications for hepatitis C virus chronicity. // Hepatology. 1997. - Vol. 25. - P. 449^158.
260. Tsubouchi E., Akbar S.M., Horiike N., Onji M. Infection and dysfunction of circulating blood dendriting cells anf their subsets in chronic hepatitis C virus infection. // J. Gasrtoenterol. 2004. - Vol. 39. - P. 754-762.
261. Tsukiyama-Kohara K., Iizuka N., Kohara M., Nomoto A. Internal ribosomal entry site within hepatitis C virus RNA. // J. Virol. 1992. - Vol. 66. - P. 1476-1483.
262. Urbani S., Amadei B., Fisicaro P., Pilli M., Missale G., Bertoletti A., Ferrari C. Heterologous T cell immunity in severe hepatitis C virus infection. // J. Exp. Med. 2005. - Vol. 201. - P. 675-680.
263. Uyttendaele S., Claeys H., Mertens W., Verhaert H., Vermylen C. Evaluation of third-generation screening and confirmatory assays for HCV antibodies. // Vox Sang. 1994. - Vol. 66. - P. 122-129.
264. Valiante N.M., D'Andrea A., Crotta S., Lechner F., Klenerman P., Nuti S., Wack A., Abrignani S. Life, activation and death of intrahepatic lymphocytes in chronic hepatitis C. // Immunol. Rev. 2000. - Vol. 174. - P. 174-177.
265. Vassilaki N., Mavromara P. Two alternative translation mechanisms are responsible for the expression of the HCV ARFP/F/ core+1 coding open reading frame. // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 40503-40513.
266. Villano S.A., Vlahov D., Nelson K.E., Cohn S., Thomas D.I. Persistence of viremia and the importance of long-term follow-up after acute hepatitis C infection. // Hepatology. 1999. - Vol. 29. - 908-914.
267. Vyas J., Elia A., Clemens M.J. Inhibition of the protein kinase PKR by the internal ribosome entry site of hepatitis C virus genomic RNA. // RNA. -2003.-Vol. 9.-P. 858-870.
268. Walewski J.L., Keller T.R., Stump D.D., Branch A.D. Evidence for a new hepatitis C virus antigen encoded in an overlapping reading frame. // RNA. -2001.-Vol. 7.-P. 710-721.
269. Wang C., Le S.Y., Ali N., Siddiqui A. An RNA pseudoknot is an essential structural element of the internal ribosome entry site located within the hepatitis C virus 5' noncoding region. // RNA. 1995. - Vol. 1. - P. 526-237.
270. Wang Q., Contag C.H., lives H., Johnston B.H., Kaspar R.L. Small hairpin RNAs efficiently inhibit hepatitis C IRES-mediated gene expression in human tissue culture cells and a mouse model. // Mol. Ther. 2005. - Vol. 12. - P. 562-568.
271. Wang Y.F., Brotman B., Andrus L., Prince A.M. Immune response to epitopes of hepatitis C virus (HCV) structural proteins in HCV-infected human and chimpanzees. // J. Infect. Dis. 1996. - Vol. 173. - P. 808-821.
272. Westaway E.G. Flavivirus replication strategy. // Adv. Virus. 1987. - Vol. 33.-P. 45-90.
273. Wienhues U., Ihlenfeld H.-G., Scidel C., Schmitt U., Kraas W., Jung G. Characterization of a linear epitopes in the nonstructural region 4 of hepatitis C virus with reactivity to seroconversion antibodies. // Virology. 1998. -Vol. 245.-P. 281-288.
274. Xu Z., Choi J., Yen T.S., Lu W., Strohecker A., Govindarajan S., Chien D., Selby M.J., Ou J. Synthesis of a novel hepatitis C virus protein by ribosomal fraimshift. // EMBO J. 2001. - Vol. 20. - P. 3840-3848.
275. Yagnik A.T., Lahm A., Meola A., Roccasecca R.M., Ercole B.B., Nicosia A., Tramontana A. A model for the hepatitis C virus envelope glycoprotein E2. // Proteins. 2000. - Vol. 40. - P. 355-366.
276. Yamaguchi N., Tokushige K., Yamauchi K., Hayashi N. Humoral immune response in Japanese acute hepatitis patients with hepatitis C virus infection. // Can. J. Gastroenterol.-2000. Vol. 14.-P. 593-598.
277. Yi M., Lemon S.M. Structure-functionanalysis of the 3'stem-loop of hepatitis C virus genomic RNA and its role in viral RNA replication. // RNA. 2003. -Vol. 9.-P. 331-345.
278. Yoshida T., Hanada T., Tokuhisa T., Kosai K., Sato M., Kohara M., Yoshimura A. Activation of STAT3 by hepatitis C virus core protein leads to cellular transformation. // J. Exp. Med. 2002. - Vol. 196. - P. 741-653.
279. Yu Y., Ji H., Doudna J.A., Leary J.A. Mass spectrometric analysis of the human 40S ribosomal subunit: native and HCV IRES-bound complexes. // Protein Sci. 2005. - Vol. 14(6). - P. 1438-1446.
280. Yuki N., Hayashi N., Hagiwara H., Takehara T, Katayama K, Kasahara A, Fusamoto H, Kamada T. Quantitative analysis of antibodies to hepatitis C virus during interferon-a therapy. // Hepatology. 1993. - Vol. 17. - P. 960965.
281. Zaaijer H.L., Cuypers H.T.M., Reesink H.W., Winkel I.N., Gerken G., Lelie P.N. Reliability of polymerase chain reaction for detection of hepatitis C virus. // Lancet. 1992. - Vol. 341. - P. 722-724.
282. Zaaijer H.L., Mimms L.T., Cuypers H.T., Reesink H.W., van der Poel C.L., Taskar S., Lelie P.N. Variability of IgM response in hepatitis C infection. // J. Med. Virol. 1993. - Vol. 40 - P. 184- 187.
283. Zeuzem S. Viral kinetics in patients with chronic hepatitis C treated with standard or peginterferon alpha2a. // Gastroenterol. 2001. - Vol. 120. - P. 1438-1470.
284. Zhao W., Liao G.Y., Jiang Y.J., Jiang S.D. Expression and self-assembly of HCV structural proteins into virus-like particles and their immunogenicity. // Clin. Med. J.-2004.-Vol. 117.-P. 1217-1222.
285. Zhong J., Gastaminza P., Cheng G., Kapadia S., Kato T., Burton D.R., Wieland S.F., Uprichard S.L., Wakita T., Chisari F.V. Robust hepatitis C virus infection in vitro. II Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005. - Vol. 102. -P. 9294-9299.
286. Zibert A., Kraas W., Meisel H., Jung H., Roggendorf M. Epitope mapping of antibodies against hypervariable region 1 in acute self-limiting and chronic infections due to hepatitis C virus. // J. Virol. 1997. - Vol. 71. - P. 41234127.
287. Zibert A., Kraas W., Ross S., Meisel H., Lechner S., Jung H., Roggendorf M. Immunodominant B-cell domains of hepatitis C virus envelope proteins El and E2 identified early and late time points of infection. // J. Hepatol. 1999. -Vol. 30.-P. 177-184.
288. Zibert A., Schreier E., Roggendorf M. Antibodies in human sera specific to hypervariable region 1 of hepatitis C virus can block viral attachment. // Virology. 1995. - Vol. 208. - P. 653-661.
-
Николаева, Людмила Ивановна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2006
-
ВАК 03.00.06
- Характеристика напряженности и стойкости поствакцинального иммунитета и оценка эффективности массовой против вакцинации против гепатита В в разных группах населения
- Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е, и создание на их основе диагностических тест-систем
- Разработка тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов для индикации HBsAg
- Особенности вируса гепатита C в острой и хронической стадиях инфекции и дифференциация стадий
- Этиологическая структура острых вирусных гепатитов и распространенность НВ-вирусной инфекции у городского населения Приамурья
