Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов для индикации HBsAg

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов для индикации HBsAg"

На правах рукописи

и>,Л„. Г.^З I I

СОКУРОВА Алла Михайловна

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ЖЕЛТОЧНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ИММУНИЗИРОВАННЫХ ПЕРЕПЕЛОВ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ НВвА«

03.00.06 - вирусология, 14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 20С

ии34 76804

003476804

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова»

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор Сбойчаков Виктор Борисович кандидат ветеринарных наук Борисенко Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Кузнецов Олег Константинович доктор биологических наук старший научный сотрудник Суборова Татьяна Николаевна

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора

диссертационного с_______ ... ... . . , _____________ I Академии

медицинских наук «Научно-исследовательский институт гриппа СевероЗападного отделения РАМН» по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. профессора Попова, д. 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт гриппа Северо-Западного отделения РАМН»

Защита состоится

заседании

Учёный секретарь диссертационного со! кандидат медицинских наук

Суховецкая В.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В связи с увеличением численности населения планеты все более масштабным становится распространение различных инфекционных заболеваний, особенно вирусной природы. Своевременная индикация возбудителей или маркеров инфекций у людей и животных способна предотвратить возникновение эпидемий и эпизоотии.

Глобальную проблему для населения Земли представляют вирусные гепатиты, в частности вирусный гепатит В (ВГВ). По оценкам Всемирной организации здравоохранения, более 600 тыс. человек ежегодно умирает от острой или хронической формы гепатита В (Шляхтенко Л.И., 2004; Ивашкин В.Т., 2006; MastE.E. et al., 1993). Учитывая продолжающийся рост заболеваемости ВГВ в связи с распространением наркомании, а также внутрибольничным инфицированием медицинских работников и доноров крови, проблема профилактики, диагностики и лечения ВГВ в России является одной из наиболее важных (Шахгильдян И.В. и др., 2004; Шаповалова И.В. и др., 2007; Colin J.F. et al., 1999).

В Российской Федерации основной метод этиологической лабораторной диагностики ВГВ - серологический. В настоящее время «золотым стандартом» в диагностике ВГВ, помимо клинико-биохимических признаков, является выявление поверхностного антигена ВГВ - HBsAg.

За последние 5-10 лет значительно возросла чувствительность и специфичность существующих тест-систем. В качестве диагностического средства используются моноклональные антитела, полученные с помощью гибридомной технологии, и сывороточные поликлональные антитела, полученные от животных-доноров. Производство диагностических антител к HBsAg является длительным и дорогостоящим. Стоимость 1 г монокло-нальных антител к HBsAg (производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) составляет около 1500 рублей. Использование птиц, в частности перепелов, в качестве продуцентов диагностических иммуноглобулинов экономически более эффективно, чем использование антител, полученных методом гибридомной технологии, и от различных видов животных, так как финансовые затраты на единицу массы получаемых специфических иммуноглобулинов значительно ниже (табл. 1).

Таблица 1. Эффективность использования различных видов жиу

Вид животного Стоимость, руб. Количество иммуноглобулинов (за 1 мес.), г Эффективность (стоимость 1 г), руб.

животного (1 ед.) содержания (за 1 мес.)

Лошадь 60000 12000 100,00 5120

Корова 50000 9500 56,00 4340

Кролик 1500 1000 1,75 700

Курица 500 200 1,25 200

Перепел 50 25 0,30 90

Эти особенности побудили нас рассмотреть возможность использования диагностических препаратов на основе желточных иммуноглобулинов (Ig Y, от англ. yolk) от различных видов птиц (гусей, уток, кур, перепелов и др.). Иммуноглобулины птиц не обладают неспецифическим взаимодействием с компонентами сыворотки крови человека, т.к. птицы эволюционно представляют собой отдельную ветвь развития. Кроме того, взятие крови у лабораторных животных представляет сложную, болезненную процедуру, а получение яиц от иммунизированных птиц, которые содержат специфические иммуноглобулины, является физиологичным и неинвазивным.

Помимо вышеперечисленных преимуществ и особенностей, используя птиц в качестве продуцентов биологического сырья для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов, становится возможным круглогодичное получение недорогих диагностических иммуноглобулинов, а также осуществление быстрой замены продуцента с минимальным сроком восстановления его продуктивности.

Целью исследования является разработка тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов (Coturnix со-tiirnix japónica) для индикации HBsAg.

Задачи исследования:

1. Разработать биологическую модель - продуцента диагностических иммуноглобулинов.

2. Определить влияние препаратов для иммунизации и факторов окружающей среды на биологическую модель.

3. Сформировать опытный образец тест-системы для индикации HBsAg на основе желточных иммуноглобулинов и разработать схему его получения.

4. Провести лабораторные испытания разработанной тест-системы на основе желточных антител для индикации HBsAg и оценить её чувствительность и специфичность.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые для нужд медицины для получения диагностических иммуноглобулинов были использованы перепела вида Coturnix coturnix japónica. Впервые разработана методика иммунизации самок перепелов HBsAg с последующим получением в качестве конечного продукта специфических антител. Впервые создана тест-система на основе желточных иммуноглобулинов для индикации HBsAg с высокой чувствительностью и специфичностью и разработана схема получения лабораторного образца диагностической тест-системы на основе Ig Y для индикации HBsAg.

Научно-практическая значимость работы. На основании проведённых исследований разработана тест-система для этиологической лабораторной диагностики ВГВ. Разработана биологическая модель и экспериментально обоснована её биологическая и диагностическая целесообразность. Разработана схема получения лабораторного образца диагностической

тест-системы на основе Ig Y для индикации HBsAg.

Разработаны методические рекомендации «Создание биологической модели для получения диагностических иммуноглобулинов» (2009), предназначенные для вирусологов, микробиологов и других специалистов, работающих в области создания иммунодиагностических средств медицинского и ветеринарного назначения.

Разработанные рекомендации и фактический материал используются в качестве теоретического обоснования и практического воплощения при проведении научно-исследовательских работ в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук», а также при обучении слушателей и курсантов Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Применение перепелов вида Coturnix coturnixjapónica для получения специфических диагностических иммуноглобулинов к HBsAg, исходя из их иммунофизиологических показателей и возможности поддержания статуса SPF (specific pathogen free - свободный от специфических патогенов), является обоснованным.

2. Тест-система на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов является высоко эффективной для диагностики ВГВ.

3. Разработанная схема производства диагностической тест-системы для индикации HBsAg на основе Ig Y иммунизированных перепелов применима для практического использования.

Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены и обсуждены на двух Всероссийских конференциях: «Современные проблемы 'здоровья населения и военнослужащих» (СПб., 2007 г.), «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (СПб., 2008 г.), IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (СПб., 2008 г.), на научной конференции Северо-западного научно-методического центра Российской академии сельскохозяйственных наук «Нанотехнологии в зоотехнии и ветеринарной медицине: реализация и перспективы» (СПб., 2008 г.), V съезде общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова (М., 2008 г.), XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству «Современное производство: исследования и инновации» (М., 2009 г.), заседании отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (СПб., 2009 г.) и XIV Европейском конгрессе по биотехнологии (Барселона, Испания, 2009 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК. Получены 3 удостоверения на рационализаторские предложения (№ 11522/11, № 11523/11, № 11524/11 от 13 ноября 2008 г.) и справка о регистрации в Федеральном институте промышленной собственности заявления о выдаче патента Российской Федерации на изобретение: «Способ получения диагностических иммуноглобулинов для выявления HBsAg» (вх, № 009557, per. №2009107142 от 27.02.2009 г.).

Личный вклад автора. Автором лично сформулированы цель и задачи исследования, составлен план экспериментов, осуществлён сбор и анализ научной информации по теме исследования. Самостоятельно спланированы и проведены исследования, систематизация, обработка и анализ полученных результатов.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования и результаты), обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений.

Список литературы включает 207 источников, из них 92 отечественных и 115 иностранных.

Текст диссертации содержит 22 таблицы, 29 рисунков, 2 приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В соответствии с целью и задачами настоящего исследования был сформирован алгоритм выполнения работы, изложенный в структурно-логической схеме (рис. 1).

Исследования состояли из трёх основных этапов.

На первом этапе провели сбор, систематизацию и анализ научных данных, опубликованных в литературных источниках.

На втором этапе исследования были получены диагностические иммуноглобулины и сформирована тест-ситема на основе желточных иммуноглобулинов для индикации HBsAg. Для этого подобрали биологическую модель, установили соответствие перепелов статусу SPF, подобрали дозу антигена и адъювант для иммунизации птиц. Далее изучили влияние факторов окружающей среды и иммунизирующего антигена на биологическую модель. Выделили иммуноглобулины из желтков яиц, установили их титр и сформировали лабораторный образец тест-системы для диагностики HBsAg, оценили её чувствительность и специфичность. Разработали схему получения тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов для диагностики HBsAg.

На третьем этапе сформулировали выводы и практические рекомендации.

Рисунок 1. Структурно-логическая схема исследования

Материалы исследования

Для приготовления препарата для иммунизации перепелов использовали рекомбинантную вакцину против вируса гепатита В фирмы «Эндже-рикс В» (Бельгия), содержащую основной поверхностный антиген вируса гепатита В (HBs Ag) в концентрации 20 мкг/мл, сорбированный на гидроокиси алюминия, и адъювант «Montanide ISA 70 VG» фирмы «Сеппик» (Франция) для неспецифического усиления иммунного ответа.

Животные: в условиях лаборатории содержали перепелов мясного кросса породы «Фараон» в количестве 47 голов.

Кормление птицы осуществляли комбикормом ПК-5 производства ЗАО «Гатчинский ККЗ» (Ленинградская область).

Для содержания перепелов применяли клетки из оцинкованной металлической сетки с ячейками 70x10 мм размером 250x350x200 мм.

Методы исследования

Условия содержания экспериментальных животных в виварии позволяли обеспечить нормальный биологический фон и полностью соответствовали требованиям санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) (СанПиН № 1045-73).

Для проверки птиц на наличие инфицированное™ возбудителями заболеваний вирусной и микробной этиологии согласно перечню инфекций птиц, подлежащих контролю на статус SPF, применяли следующие методы.

Для выявления инфицированности перепелов возбудителем гидроперикардита использовали реакцию иммунной диффузии; возбудителями лейкоза и саркомы птиц, болезни Гамборо, инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, реовирусного теносиновита и инфекционной анемии применяли метод иммуноферментного анализа; контаминацию возбудителями Ньюкаслской болезни и гриппа птиц определяли с помощью реакции торможения гемагглютинации. Инфицированность сальмонеллами определяли в кровяно-капельной реакции агглютинации, мико-плазмами и возбудителями инфекционного синовита- сывороточно-капельной реакцией агглютинации. Контаминацию кокцидиями определяли методом микроскопиии фекальных масс.

Бактериологическое исследование кормов проводили согласно .Правилам бактериологического исследования кормов (утв. Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 10 июня 1975 г.).

От перепелов экспериментального поголовья пробы крови получали пункцией подкрыльцовой вены.

Для иммунизации птицы готовили два варианта препаратов. Для приготовления первого препарата брали 150 мл рекомбинантной вакцины для профилактики гепатита В, которую концентрировали в 10 раз при помощи центрифугирования на центрифуге «MLWk-80» производства «VEB Zentrifugenbau Engelsdorf» (Германия) при 3000 об./мин. в течение 20 мин. при комнатной температуре воздуха. Полученный осадок в виде гидроокиси

алюминия с сорбированным на нём HBsAg ресуспендировали в 15 мл супер-натанта, полученного при центрифугировании. В результате был получен препарат HBsAg в концентрации 200 мкг/мл, сорбированный на гидроокиси алюминия. Для приготовления второго препарата для иммунизации использовали 150 мл рекомбинантной вакцины для профилактики гепатита В, которую концентрировали в 30 раз вышеуказанным способом. В результате был получен препарат HBsAg в концентрации 600 мкг/мл, сорбированный на гидроокиси алюминия. Полученный препарат смешивали с адъювантом «Моп-tanide ISA 70 VG» фирмы «Сеппик» (Франция) из расчёта три объёмных части полученного препарата и семь объёмных, частей вышеуказанного адъю-ванта. Смешивание проводили на гомогенизаторе «UltraTuraks 20» в течение 2 мин. при скорости вращения активатора 14000 об./мин. и температуре 20°С. При этом получили однородную эмульсию белого цвета типа «вода-масло», содержащую HBsAg в концентрации 200 мкг/мл, сорбированный на гидроокиси алюминия и введённый в обратную эмульсию «вода-масло». Эмульгированные антигены (липосомы), такие как «Montanide ISA 70 VG», оказывают адъювантное действие за счёт «корпускулирования» антигена (создания дискретных, частиц, содержащих антиген). Они обладают хорошей биосовместимостью и биодеградируемостью.

Иммунизирующий антиген вводили однократно в верхнюю треть дорсальной поверхности шеи параллельно продольной оси шейного отдела позвоночника, не травмируя мышцы и фасции птицы-донора, равномерно распределяя препарат по дорсальной поверхности подкожной клетчатки шеи непосредственно в области тимуса по 200 мкг HBsAg на инъекцию для каждого животного.

Выделение иммуноглобулинов из желтков яиц перепелов. Отделение овоальбуминов белка от желточного шара проводили механическим способом, затем производили коагуляцию белка 70° этанолом или депротеиниза-цию насыщенным раствором гидрокарбоната натрия (NaHCOj). Далее эмульсию желтка яиц перепелов обрабатывали хлороформом и центрифугировали. Отбирали верхнюю водную фазу и проводили ее насыщение аммонием сернокислым до 50 % по массе, оставляли на экспозицию 30 мин. при 4°С, затем центрифугировали. Осадок использовали для дальнейших исследований.

При определении титра иммуноглобулинов к HBsAg в исследуемых пробах сывороток крови и желтках яиц перепелов за основу взяли методику, изложенную в «Наставлении по применению набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом» (ТУ 9388-014-00495527-99), (утверждённы Заместителем руководителя Департамента ветеринарии 06 июня 2001 г.).

Полученные результаты заносились в электронные таблицы для статистической обработки материала. Анализ информации осуществлялся на персональном компьютере «Celeron (R) CPU 2.40 GHz» с использованием инструмента «Анализ данных» пакета прикладных программ «Microsoft Excel 7.0» и пакета прикладных программ «Statistica 6.0 for Windows».

РЕЗУЛЬТАТЫ

Особенности содержания перепелов

С целью исключения возможности заноса бактериальных возбудителей заболевания птиц с комбикормами и поддержания статуса SPF проводили стерилизацию комбикормов у-облучением в дозе 15 кГр и 40 кГр и определяли стерилизующие дозы для комбикормов, используемых в промышленном птицеводстве и экспериментальных исследованиях.

По результатам микробиологических исследований нестерильный комбикорм не содержал патогенной микрофлоры и соответствовал по микробиологическим показателям требованиям ГОСТа, предъявляемого к комбикорму ПК-5. Общая бактериальная обсеменённость составляла менее 0,5 млн. КОЕ в 1 г корма. Бактерии рода Salmonella при исследовании корма методом последовательного обогащения не выявлены, энтеропатогенные типы кишечной палочки и токсинообразующие анаэробы не обнаружены.

Доза у-облучения 15 кГр является недостаточной для получения стерильного комбикорма, микробиологическая обсеменённость после облучения составляла 0,000505 млн/г, при дозе у-облучения 40 кГр - микробиологическая обсеменённость отсутствует.

Таким образом, у-облученне в дозе 40кГр обеспечивает надежную стерилизацию промышленно выпускаемого комбикорма и может бьпъ применено для сте-ршшзации корма для SPF-ггшц - продуцентов диагностических иммуноглобулинов.

Птицепоголовье находилось в условиях лаборатории 6 мес. Условия содержания обеспечивали перепелам нормальную жизнедеятельность. Сбор яиц производили с момента начала яйцекладки (с возраста птиц 70 сут.). В процессе проведения опыта клинически больных и павших птиц не зарегистрировано. Нарушений в физиологическом процессе яйцекладки не обнаружено.

Схема иммунизации перепелов

В ходе исследования было создано две опытные и одна контрольная группы перепелов, которые приведены в таблице 2.

Таблица 2. Распределение перепелов по группам исследования

Группа Количество птиц Препарат для иммунизации

Опытная груша № 1 13 $/2<? НВз А§, сорбированный на гидроокиси алюминия и заключенный в обратную эмульсию «вода-масло»

Опытная группа Ка 2 13 $/1 з НВз Ag, сорбированный на гидроокиси алюминия

Контрольная 17 ?/1 в Натрия хлорид раствор для инфузий 0,9 %

Опытные группы №№ 1 и 2 были предназначены для определения наиболее эффективной формы иммунизации птиц. Контрольная группа бы-

ла предназначена для определения влияния на птиц условий содержания. Определение соответствия перепелов статусу животных, свободных от специфических патогенов

Предварительно экспериментальное птицепоголовье было проверено

на отсутствие ряда вирусных и бактериальных инфекций птиц, что соответствовало уровню контроля на статус SPF в соответствии с требованиями GMP (good manufacturing practice - надлежащая производственная практика).

Было установлено, что перепела мясного кросса породы «Фараон» в количестве 47 голов, полученные из ОАО «Перепелочка» (Ленинградская область), соответствуют статусу SPF и могут быть использованы для дальнейших исследований.

Серологические исследования перепелов на соответствие статусу SPF проводили каждые 30 сут. По результатам исследований положительно реагирующих сывороток с диагностикумами к возбудителям заболеваний, регламентируемых статусом SPF, не выявлено в течение всего опыта.

Влияние факторов окружающей среды и условий эксперимента на физиологические показатели перепелов

Температура воздуха в помещении соответствовала оптимальным показателям для содержания перепелов. Среднее значение температуры воздуха окружающей среды составляло 24,8±0,6°С.

Колебания температуры воздуха окружающей среды значительно не влияют на время снесения первого яйца.

Долгота светового дня в период проведения эксперимента постепенно увеличивалась от 9 час. 48 мин. до 17 час. 18 мин. и далее поддерживалась на этом уровне.

Между долей несушек перепелов опытных и контрольной групп и долготой дня установлена сильная, прямая, значимая корреляционная связь (в опытных и контрольной группах гху>0,7, р<0,001).

В дальнейшем была изучена зависимость массы перепелиного яйца от возраста птицы. В таблице 3 приведены показатели, характеризующие динамику изменения массы яйца у перепелов опытных и контрольной групп в период с 70 по 105 сут.

Таблица 3. Значения показателей, характеризующих динамику изменения массы яиц у перепелов опытных и контрольной групп_

Показатели Опытная группа № 1 Опытная группа № 2 Контрольная группа

Возраст птицы (сут.) 76-99 100-105 70-99 100-105 82-99 100-105

Количество яиц, п (шт.) 79 20 100 34 49 26

Среднее арифметическое значение массы яйца, х (г) 10,28 10,49 10,77 10,61 10,64 10,96

Стандартное отклонение переменной в выборке, 5 (г) 0,76 0,48 1,18 0,50 1,00 0,54

Продолжение таблицы 3

Показатели Опытная группа № 1 Опытная группа № 2 Контрольная группа

Минимальное значение массы яйца в выборке, *,„,„ (г) 8,32 9,70 8,22 9,95 8,62 ¡0,01

Максимальное значение массы яйца в выборке, (г) 11,74 11,70 13,80 11,99 12,71 12,03

Размах вариаций (г) 3,42 2,00 5,58 2,04 4,09 2,02

Коэффициент вариации, V, (%) 7,39 4,58 10,96 4,71 9,40 4,93

По результатам взвешивания яиц перепелов установлено, что стабилизация массы яйца в опытной группе №1 происходила на 24 сут., в опытной группе №2 - на 30 сут., в контрольной группе - на 18 сут. от времени снесения первого яйца, стандартное отклонение, коэффициент и размах вариации значений массы яйца после достижения перепелами возраста 100 сут. во всех группах птиц снижался примерно в 2 раза. Уменьшение этих статистических показателей свидетельствовало о стабилизации массы перепелиного яйца.

Также для определения влияния на перепелов препарата, используемого для иммунизации, были изучены параметры перепелиного яйца: масса, продольный и поперечный диаметры и индекс формы (БрЬ).

Параметры перепелиных яиц в опытных и контрольной группах представлены в таблице 4.

Таблица 4. Параметры перепелиных яиц (х ' тх)

Группа Количество яиц, шт. Параметры яйца

диаметр яйца, мм индекс формы (ЭрЬ) масса яйца (т, г)

продольный поперечный

Опытная группа № 1 99 31,16±0,22 24,69±0,11 0,79±0,01 Ю,32±0,14

Опытная группа № 2 134 31,96±0,25 24,82±0,12 0,78±0,00 10,73±0,18

Контрольная 75 32,35±0,25 24,77±0,17 0,77±0,01 Ю,75±0,20

Было установлено, что иммунизация птиц рекомбинантным ИВбА^ как сорбированным на гидроокиси алюминия, так и сорбированным на гидроокиси алюминия и заключённым в обратную эмульсию «вода-масло», не оказывало влияния на физиологические функции перепелов и не приводило к снижению яйценоскости птиц, наблюдались лишь изменения качественных показателей перепелиных яиц.

Различие значений массы перепелиных яиц между контрольной группой и опытной группой № 1 статистически значимо (р<0,001). Разли-

чий значений массы между контрольной группой и опытной группой № 2 не наблюдалось (р>0,05). Отмечалось достоверное различие массы перепелиных яиц между опытными группами № 1 и № 2 (р<0,01).

Различие значений индекса формы перепелиных яиц между опытными № 1 и № 2 и контрольной группами достоверное и более выражено между опытными группами (р<0,001). Наибольшие значения индекса формы наблюдались в опытной группе № 1, наименьшие - в контрольной группе.

Различия значений продольного диаметра перепелиных яиц между опытной №2 и контрольной группами не существенны (р>0,05), в то же время между опытной № 1 и контрольной, а также между опытной № 1 и опытной № 2 группами они имели статистически значимые отличия (р<0,01). При этом наибольшие значения продольного диаметра наблюдались в контрольной группе, наименьшие - в опытной группе № 1.

Таким образом, иммунизация птиц рекомбинантным HBsAg, заключённым в обратную эмульсию «вода-масло», влекла за собой статистически значимое снижение показателей качества перепелиных яиц. Иммунизация птиц HBsAg, сорбированным на гидроокиси алюминия, не приводила к значительному снижению качественных показателей перепелиных яиц.

Динамика изменений титров специфических иммуноглобулинов к НВбАз в сыворотке крови и желтках яиц перепелов при использовании различных препаратов для иммунизации Для изучения динамики изменений титров специфических иммуноглобулинов к НВбА§ в сыворотке крови и желтках яиц перепелов при использовании различных препаратов для иммунизации разработали скри-нинговую тест-систему. Для этого использовали рекомбинантный HBsAg, полученный из ЗАО «ЭКОлаб» (Россия). Объём рекомбинантного HBsAg-1 мл, концентрация - 1,37 мг/мл.

Предварительно HBsAg разводили до концентрации 30 мкг/мл в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буферном растворе (рН 9,5-9,6), сорбировали на поверхности лунок полистироловых планшетов и инкубировали в течение 16-18 часов при температуре +4°С, затем промывали лунки планшета от несорбированного антигена 0,01 М фосфатно-буферным раствором (ФБР) (рН 7,2-7,4) с 0,5 % твин-80 и 1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА). Стартовое разведение исследуемых проб сывороток крови и желточной массы составляло 1:400. Остальные процедуры постановки имму-ноферментного анализа (ИФА) проводили с использованием компонентов «Набора для определения антител к вирусу инфекциоиного бронхита кур иммуноферментным методом» (ТУ 9388-014-00495527-99) и согласно наставлению по его применению.

Отбор проб крови для исследований на наличие антител к HBsAg производили один раз в Юсут. от трёх птиц каждой группы, начиная с возраста перепелов 34 сут., т.е. на 10 сутки после иммунизации. Выделение проб желточной массы также производили один раз в 10 сут. от каждой из

трёх групп, начиная с момента снесения первого яйца.

По результатам определения показателей, характеризующих динамику изменений оптической плотности проб антител к НВзА§, полученных из сыворотки крови перепелов опытных и контрольной групп, было определено, что стабилизация уровней специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови у перепелов опытной группы № 1 происходила к возрасту птицы 114сут., опытной группы №2- 84 сут, так как размах и коэффициент вариации снижался (размах вариации в опытной группе № 1 в 11 раз, коэффициент - в 28 раз, а в опытной группе № 2 - в 11 и 40 раз соответственно). В контрольной группе на протяжении всего периода наблюдений уровни иммуноглобулинов сыворотки крови не изменялись и по абсолютному значению были низкими, что соответствовало фоновым показателям.

Кроме того, для изучения связи между периодом времени, прошедшим с момента иммунизации перепелов, и уровнем содержания специфичных к HBsAg ^вв сыворотках крови, полученных от иммунизированных перепелов, применяли непараметрические методы проверки статистических гипотез.

Для оценки зависимости между двумя переменными, вычисляли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (г$).

Установлено, что с момента иммунизации перепелов (в возрасте 24 сут.) как HBsAg, сорбированным на гидроокиси алюминия и введенного в обратную эмульсию «вода-масло» (до возраста птиц 114 сут.), так и НВзА§, сорбированным на гидроокиси алюминия (до возраста птиц 84 сут.), между возрастом птиц и уровнем содержания специфических к HBsAg сыворотках крови, полученных от иммунизированных пере-

пелов, имелась сильная прямая (^>0,7), статистически значимая (р<0,001) корреляционная связь. У перепелов, иммунизированных НВ5А§, сорбированным на гидроокиси алюминия и введенного в обратную эмульсию «вода-масло» (с возраста птиц 114 сут.), и у перепелов, иммунизированных НВзА§, сорбированным на гидроокиси алюминия (с возраста птиц 84 сут.), между возрастом птиц и уровнем содержания специфических к НВзАц в в сыворотках крови, была выявлена статистически незначимая корреляционная связь (р>0,05), при этом коэффициент Спирмена составлял ^<0,3, что свидетельствовало о стабилизации уровней в сыворотке крови перепелов опытных групп. В контрольной группе перепелов на протяжении всего периода эксперимента уровень содержания ^йв сыворотке крови находился на уровне фоновых значений (г5<0,3; р>0,01).

По результатам определения показателей, характеризующих динамику изменений оптической плотности проб антител к HBsAg, полученных из желточной массы в опытных и контрольной группах перепелов, установлено, что стабилизация уровней специфических иммуноглобулинов в желтках яиц перепелов опытной группы № 1 происходила к возрасту птицы 114 сут., опытной группы №2- 94 сут, так как размах и коэффициент вариации снижался (размах вариации в опытной группе № 1 в 20 раз, ко-

эффициент- в 33 раза, а в опытной группе № 2 - в 5 и 11 раз соответственно), что подтверждали непараметрические методы проверки статистических гипотез с использованием рангового коэффициента корреляции Спирменагэ р<0,001). Между возрастом птиц (опытной группы № 1 со 114 сут., опытной группы №2 - 94 сут.) и уровнем содержания специфичных к НВзА§ 1§ У в желтках яиц отмечалась статистически незначимая корреляционная связь (р>0,05), при этом коэффициент Спирмена составлял г5<0,3, что свидетельствовало о стабилизации уровней ^У в желтках яиц перепелов опытных групп (рис. 2-3). _______

Рисунок 2. Динамика темпов прироста (снижения) значений оптической плотности проб антител к НВзА«, полученных из сыворотки крови и желточной массы яиц перепелов опытной группы № 1

Рисунок 3. Динамика темпов прироста (снижения) значений оптической плотности проб антител к HBsAg, полученных из сыворотки крови и желточной массы яиц перепелов опытной группы № 2

вень

В контрольной группе на протяжении всего периода наблюдений ^ иммуноглобулинов в желтках яиц не изменялся (г5<0,3; р>0,01) (рис.

100,0 90,0

ао.о

70,0 60.0 60,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0 •10,0 -20,0 -30,0

— ---------- ■сыворотхакрови |

--------------- 1 '-»-жененная масса]

Возраст птицы, сут.

Рисунок 4. Динамика темпов прироста (снижения) значений оптической плотности проб антител к HBsAg, полученных из сыворотки крови и желточной массы яиц перепелов контрольной группы

Динамика изменений уровней ^ У в желтках яиц иммунизированных перепелов соответствовала динамике уровней ^ в в сыворотках крови (г5>0,7; р<0,001), при этом концентрации 1§У в желтках яиц достигали уровня специфических ^ в в сыворотках крови на 10 сут. позже.

Титры специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови и желтках яиц были выше в группе перепелов, иммунизированных НВбА§, сорбированным на гидроокиси алюминия и введенным в обратную эмульсию «вода-масло», и составляли 1:8391±239,67 в сыворотке крови и 1:8137^60,24 в желтках яиц (р<0,001). В группе перепелов, иммунизированных НВзА§, сорбированным на гидроокиси алюминия, титры составляли 1:5406,72±59,00 и 1:5148,73±60,80 соответственно.

Таким образом, более эффективной является иммунизация перепелов HBsAg, сорбированным на гидроокиси алюминия и введённым в обратную эмульсию «вода-масло», так как титры иммуноглобулинов были выше, чем при иммунизации HBsAg, сорбированным на гидроокиси алюминия.

Выделение н определение степени чистоты желточных иммуноглобулинов

Коагуляцию белковой оболочки проводили 70° этанолом, затем желток обрабатывали хлороформом с последующим осаждением сульфатом аммония до насыщения 50 % по массе, что обеспечивало получение чистого препарата иммуноглобулинов.

Для определения степени чистоты получаемых препаратов проводили электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата на-

трия. При этом белки находились в растворе, содержащем мощный, отрицательно заряженный детергент - додецилсульфат натрия. Связываясь с гидрофобными участками белковой молекулы, этот детергент вызывает развертывание белковых молекул в длинные вытянутые цепи. По результатам электрофореза обнаружено два вида белков с молекулярной массой около 65 кДа и 30 кДа, что соответствует массе «тяжёлых» и «лёгких» цепей ^ У.

Оценка эффективности разработанной тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов для индикации HBsAg Для сорбции диагностических иммуноглобулинов на полистироле использовали 0,1 М карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (рН 9,59,6). Время сорбции составляло 16-18 часов при +4-+6°С. Постоянная сорбирующая концентрация специфических желточных иммуноглобулинов -100мкг/мл. Сорбционный объём на лунку иммунологического планшета составлял 100 мк'л. Сорбционную блокировку активных центров полистирола не применяли. Остальные компоненты для постановки реакции ИФА использовали из стандартного набора «Вектогеп-НВз-антиген-стрип» (комплект 3) производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия).

Оценка прецизионности в условиях повторяемости проводилась с помощью тестирования одного и того же образца положительного контроля из стандартного набора «Вектогеп-НВБ-антиген-стрип» (комплект 3) производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) в одной постановке тест-системы на основе ^ У 40 раз. Этапы постановки и систему регистрации использовали в соответствии с инструкцией по применению указанной тест-системы. Результаты измерений приведены в таблице 5.

Таблица 5. Результаты измерений оптической плотности стандартного образца положительного контроля в тест-системе для индикации НВаА« на основе желточных иммуноглобулинов___

Статистические показатели Положительный контроль

Количество измерений, п (ед.) 40

Среднее арифметическое значение, х (o.e.) 3,109

Стандартное отклонение переменной в выборке, S (o.e.) 0,050

Минимальное значение переменной в выборке, xmm (o.e.) 2,998

Максимальное значение переменной в выборке, хаш (o.e.) 3,176

Коэффициент вариации, Vx (%) 1,61

Уровень надежности, t ■ т- (o.e.) 0,016

Из данных таблицы 5 следует, что прецизионность в условиях повторяемости независимых результатов измерений, полученных при использовании тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов, при исследовании положительного контроля из стандартного набора «Вектогеп-НВз-антиген-стрип» (комплект 3) производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) высокая. Коэффициент вариации составил 1,61 %.

Пробы сывороток крови от пациентов исследовали й параллельных опытах со стандартной, диагностической тест системой производства ЗАО

«Вектор-Бест» (Россия) и предложенной нами тест-системой на основе желточных иммуноглобулинов.

Различия значений оптической плотности между стандартной диагностической тест системой производства ЗАО «Векгор-Бест» (Россия) и тест-системой на основе желточных иммуноглобулинов не существенны (г^О.7, р>0,05). Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о высокой воспроизводимости результатов в разработанной нами тест-системе на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов для индикации HBsAg.

Также исследовали пробы сывороток крови от пациентов в параллельных опытах со стандартной диагностической тест системой «ЭKOлaб-HBsAg» (комплект № 2) производства ЗАО «ЭКОлаб» (Россия) и предложенной нами тест-системой на основе желточных иммуноглобулинов.

Различия значений оптической плотности между стандартной диагностической тест системой производства ЗАО «ЭКОлаб» (Россия) и тест-системой на основе желточных иммуноглобулинов не существенны (гху>0,7, р>0,05). Полученные результаты сопоставимы и свидетельствуют о высокой воспроизводимости результатов в разработанной нами тест-системе на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов для индикации HBsAg.

С целью изучения диагностической ценности тест-системы на основе желточных антител определяли ее чувствительность, специфичность, прогнозируемое положительное и отрицательное значения и диагностическую эффективность.

В соответствии с этим были сформированы опытная и контрольная группы исследуемых сывороток. В опытную группу вошли сыворотки крови 35 больных, в которых с помощью коммерческой тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) по результатам лабораторных исследований был выявлен HBsAg. В эту группу вошли сыворотки крови 12 больных вирусным гепатитом, 16 больных хирургического и 7 больных терапевтического профилей. Контрольную группу составили сыворотки крови 32 больных (16 хирургического и 16 терапевтического профилей) в которых с помощью коммерческой тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) HBsAg выявлен не был.

Для определения вышеперечисленных показателей использовали четырехпольные таблицы взаимной сопряженности (табл. 6).

Таблица 6. Диагностическая четырехпольная таблица

Исследуемые сыворотки Серопозитивные вИФА Серонегативные вИФА Всего

Сыворотки, содержащие HBsAg 32 3 35

Сыворотки, не содержащие HBsAg 4 28 32

Всего 36 31 67

Исходя из данных таблицы 6, определяли чувствительность, специфичность, показатели прогнозируемых значений и эффективность.

Значения показателей диагностической ценности тест-системы на основе желточных антител представлены в таблице 7.

Таблица 7. Показатели диагностической ценности тест-системы

для индикации НВэАо на основе желточных антител

Параметры Значения показателей, %

Чувствительность 91,4

Специфичность 87,5

Прогнозируемое положительное значение 88,9

Прогнозируемое отрицательное значение 90,3

Эффективность 89,6

Таким образом, тест-система обладает высокой чувствительностью, специфичностью, достоверностью и эффективностью.

В таблице 8 представлена схема получения диагностической тест-

системы.

_Таблица 8. Схема получения диагностической тест-системы

№ п/п Основные этапы Вспомогательные

этапы операции

1 Изучение нормативно-технической документации по производству диагностических тест-систем Составление и комплектация материалов, необходимых для создания тест-системы

2 Отбор перепелов для иммунизации Контроль перепелов на соответствие статусу ЭРР Исследование проб сывороток крови перепелов на соответствие статусу ЭРР

3 Иммунизация перепелов Приготовление антигена для иммунизации перепелов. Изготовление тест-системы для индикации антител к HBsAg в сыворотке крови и желтках яиц иммунизированных перепелов. Определение титра специфических антител к HBsAg в сыворотке крови и желтках яиц перепелов. Сорбирование реком-бинантного HBsAg на гидроокиси алюминия и введение его в обратную эмульсию «вода-масло».

4 Выделение и очистка специфических к HBsAg желточных иммуноглобулинов. Получение желточной массы и определение титра специфических антител к НВеАц. Удаление белка перепелиных яиц. Приготовление раствора желточной массы и обработка её хлороформом.

5 Приготовление иммуно-сорбента и определение его' диагностической ценности. Комплектация необходимыми реактивами для определения диагностической эффективности им-муносорбента. Определение чувствительности и специфичности иммуносор-бента.

ВЫВОДЫ

1.По своим иммунофизиологическим показателям и возможности поддержания статуса SPF применение в качестве биологической модели перепелов вида' Coturnix coturnix japónica для получения диагностических желточных иммуноглобулинов является обоснованным.

2. Иммунизация перепелов HBsAg, сорбированным на гидроокиси алюминия и введённым в обратную эмульсию «вода-масло», приводит к статистически значимому (р<0,001) снижению морфометрических показателей перепелиных яиц. В то лее время не отмечено влияния препаратов, используемых для иммунизации, на динамику яйцекладки перепелов. Основным лимитирующим фактором внешней среды, влияющим на динамику яйцекладки перепелов, а соответственно и количество получаемых диагностических иммуноглобулинов, является долгота дня.

3. Использование для иммунизации перепелов HBsAg, сорбированного на гидроокиси алюминия и введённого в обратную эмульсию «вода-масло», позволяет получать более высокие титры специфических антител по сравнению с иммунизацией перепелов HBsAg, сорбированным на гидроокиси алюминия.

4. Повышение уровня антител к HBsAg в сыворотке крови иммунизированных перепелов является критерием повышения уровня специфических антител в желтках яиц (р<0,001).

5. Применение специфических желточных антител в опытном образце диагностической тест-системы для индикации HBsAg позволяет получать результаты, сопоставимые с результатами тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) и ЗАО «ЭКОлаб» (Россия).

6. Разработанная схема получения и выделения специфических диагностических иммуноглобулинов из желтков яиц иммунизированных перепелов для индикации HBsAg является эффективной и позволяет получать их в необходимых объёмах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В качестве продуцента диагностических иммуноглобулинов для индикации HBsÁg могут быть использованы перепела вида Coturnix coturnix japónica.

2. Для проведения эффективной иммунизации перепелов целесообразно применять препарат в виде HBsAg, сорбированного на гидроокиси алюминия и заключённого в обратную эмульсию «вода-масло».

3. Для создания биологической модели и получения диагностических иммуноглобулинов следует руководствоваться практическими рекомендациями «Создание биологической модели для получения диагностических иммуноглобулинов», утверждёнными в !марте 2009 г. академиком-секретарём отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым, которые предназначены для вирусологов, микробиоло-

гов и других специалистов, работающих в области создания иммуиодиаг-ностических средств медицинского и ветеринарного назначения,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Борисенко C.B. Влияние лекарственной формы и адъювантов на морфометрические показатели перепелиных яиц, получаемых от птиц-продуцентов биологического сырья / C.B. Борисенко, В.Б. Сбойчаков,

A.M. Сокурова // Современное птицеводство: исследовании и инновации. -XVI конференция Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству. - Материалы конференции. - Сергиев Посад: РОВНАП, 2009. - С. 342-344.

2. Борисенко C.B. Использование желточных иммуноглобулинов при конструировании тест-систем для диагностики вирусных заболеваний / C.B. Борисенко, В.Б. Сбойчаков, A.M. Сокурова // Современное птицеводство: исследовании и инновации. - XVI конференция Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству. - Материалы конференции. - Сергиев Посад: РОВНАП, 2009. - С. 340-341.

3. Борисенко C.B. Перспективы использования желточных антител для получения иммунобиологических препаратов / C.B. Борисенко,

B.Б. Сбойчаков, A.M. Сокурова // Архив ветеринарных наук. - Т. 9 (56). -Ч. 2. - Ветеринария в птицеводстве. - 2008. - № 2. - С. 39-40.

4. Сбойчаков В.Б. Coturnix coturnix japónica как продуцент биологического сырья для производства иммунобиологических препаратов / В.Б. Сбойчаков, C.B. Борисенко, A.M. Сокурова // Здоровье населения и среда обитания. - 2008. - № 10 (187). - С. 45-48.

5. Сбойчаков В.Б. Биотехнологические аспекты новых методик диагностики и терапии заболеваний инфекционной природы/ В.Б. Сбойчаков, A.M. Сокурова // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. - Четвертая международная конференция, посвященная 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера. - Материалы конференции. - СПб.: НИИЭМ имени Пастера, 2008. - С. 160.

6. Сбойчаков В.Б. Желточные антитела как модель для создания иммунологических тест-систем и вакцин нового поколения / В.Б. Сбойчаков, A.M. Сокурова // Современные проблемы здоровья населения и военнослужащих. - Всеросс. науч.-практ. конф. - Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2007. - № 4 (20). - Приложение. - С. 83.

7. Сбойчаков В.Б. Перспективы использования Ig Y у птиц в диагностике и терапии инфекционных заболеваний/ В.Б. Сбойчаков, A.M. Сокурова // Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний, - Всеросс. науч. конф., посвящ. 210-годовщине основания Воен.-мед. акад. - Труды конференции. - Вестник

Российской Военно-медицинской академии. - 2008. - № 2 (22). - Приложение. - Часть I. - С. 226.

8. Сбойчаков В.Б. Способ депротеинизации оболочки желточного шара для выделения желточных иммуноглобулинов/ В.Б. Сбойчаков, C.B. Борисенко, A.M. Сокурова// Усовершенствование способов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. - Сборник изобретений и рационализаторских предложений. - Выпуск 40. - СПб.: ВМедА, 2009. - С. 128-129.

9. Сбойчаков В.Б. Способ подготовки поверхности оболочки желточного шара яиц птиц и повышения ее прочности для выделения желточных иммуноглобулинов / В.Б. Сбойчаков, C.B. Борисенко,

A.M. Сокурова // Усовершенствование способов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. - Сборник изобретений и рационализаторских предложений. - Выпуск 40. - СПб.: ВМедА, 2009. - С. 127-128.

10. Сбойчаков В.Б. Стерильные корма как фактор стабильности иммунобиологического статуса продуцентов биологического сырья /

B.Б. Сбойчаков, C.B. Борисенко, A.M. Сокурова// Материалы Пятого съезда общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова 24 декабря 2008 г.- М.: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, 2008. - С. 146-147.

11. Сбойчаков В.Б. Устройство для механического разделения массы белка и желточного шара яиц птиц для последующего выделения желточных иммуноглобулинов/ В.Б. Сбойчаков, C.B.Борисенко, A.M. Сокурова // Усовершенствование способов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. - Сборник изобретений и рационализаторских предложений. - Выпуск 40. - СПб.: ВМедА, 2009. - С. 128.

12. Сокурова А.М. Желточные иммуноглобулины - сырьё для изготовления диагностических иммунологических препаратов/ A.M. Сокурова,

C.B. Борисенко // Международный вестник ветеринарии. - 2009. - № 1. - С. 10-14.

Подписано в печать 31.08.09

Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Формат 60x84/16 Заказ № 614

Типография BMA им. С.М. Кирова 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сокурова, Алла Михайловна

Перечень сокращений и условных обозначений

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Краткие сведения о вирусном гепатите В

1.1.1 Вирус гепатита В, его морфология, биологические и антигенные свойства

1.1.2 Открытие первого маркера вируса гепатита В

1.1.3 Строение поверхностного антигена вируса гепатита В '.

1.1.4 Цикл репродукции вируса гепатита В

1.2 Диагностика вирусного гепатита В

1.2.1 Серологические маркеры инфекции

1.2.2 Методы иммунологической диагностики поверхностного антигена вируса гепатита В

1.3 Обоснование выбора птиц в качестве донора биологического сырья

1.4 Диагностическая и практическая ценность иммуноглобулинов желтков яиц в различных областях биологической науки

1.4.1 Гуморальный иммунитет птиц

1.4.2 Область применения желточных иммуноглобулинов

2 Материалы и методы

2.1 Материалы

2.2 Методы исследования

2.2.1 Определение соответствия перепелов статусу животных, свободных от специфических патогенов вирусной и микробной этиологии

2.2.2 Способ подготовки к стерилизации и стерилизация комбикорма

2.2.3 Способ забора крови у перепелов

2.2.4 Особенности приготовления препаратов для иммунизации

2.2.5 Способ иммунизации перепелов

2.2.6 Процесс выделения иммуноглобулинов из желточной массы яиц и их очистка

2.2.7 Определение титра специфических иммуноглобулинов к поверхностному антигену вируса гепатита В

2.2.8 Статистические методы исследования

3 Подготовка биологической модели (перепелов) для проведения экспериментальных исследований

3.1 Особенности содержания перепелов в условиях эксперимента

3.2 Схема иммунизации перепелов

3.3 Результаты определения соответствия перепелов статусу животных, свободных от специфических патогенов

3.4 Влияние факторов окружающей среды и условий эксперимента на физиологические показатели перепелов

3.5 Влияние схемы иммунизации на морфометрические показатели перепелиных яиц

3.6 Динамика изменений титров специфических иммуноглобулинов к НВз

§ в Сыворотке крови и желтках яиц перепелов при использовании различных препаратов для иммунизации

4 Формирование опытного образца тест-системы для индикации HBsAg на основе желточных иммуноглобулинов и оценка его эффективности

4.1 Определение чистоты желточных иммуноглобулинов

4.2 Оценка эффективности разработанной тест-системы для индикации НВз

§ на основе желточных иммуноглобулинов

4.3 Схема получения лабораторного образца диагностической тест-системы для индикации HBsAg на основе желточных иммуноглобулинов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов для индикации HBsAg"

Актуальность темы- исследования. В связи с увеличением численности населения планеты, все более масштабнымстановится распространение различных- инфекционных заболеваний, особенно вирусной природы. (£воевременная4 индикация возбудителей или маркеров-инфекций у людей и животных способна предотвратить возникновение эпидемий- и эпизоотий.

Глобальную проблему для- населения Земли представляют вирусные гепатиты, в частности-вирусный-гепатит В* (BFB); которым* инфицировано» около в млрд. человек, при этом около 350*млн. человек имеют хроническую форму заболевания. По оценкам Всемирной организации здравоохранения, более 600-тыс. человек-ежегодно-умирает от острой или хронической формы-гепатита Вг[32; 37, 88, 89, 91, 134, 159]:

В'Российской Федерации непрерывность эпидемического процесса гепатита-В в. основном обеспечивается'недиагностируемыми. формами инфекции: Из , материалов Государственного'статистического наблюдения 19942003 гг., только среди населения групп высокого риска заражения выявлено 1158258- HBsAg-позитивных лиц, в этот же период зарегистрировано 475824 больных острыми-манифестными, формами, инфекции, т.е. в 2,4 раза меньше; Только используя доступный и информативный метод определения HBsAg в сыворотке крови, медицина будет располагать возможностью оценить интенсивность основного скрыто развивающегося эпидемического процесса гепатита В [4-9, 29, 45, 90]. Особенно важен данный аспект в отношении внутрибольничного инфицирования' вирусом гепатита В медицинских работников и доноров крови [13, 19-21,^24, 49, 59, 74, 159].

Установлено, что в последние годы на фоне снижения заболеваемости острой формой гепатита В увеличилось количество больных с хроническими формами заболевания [4-8, 88-91, 111, 150].

В* Российской Федерации основным* методом1 этиологической лабораторной диагностики. ВГВ является- серо л огиче с ки й метод. В настоящее время-«золотым стандартом» в диагностике ВГВ; помимо- клинико-биохимических признаков, является выявление поверхностного антигена ВГВ - HBsAg.

За последние 5-10 лет значительно возросла чувствительность и специфичность существующих* тест-систем. В'качестве диагностического-средства используются моноклональные антитела, полученные с помощью! гиб-ридомной технологии, и сывороточные поликлональные антитела, полученные от животных-доноров.

Разработчики диагностических тест-систем учли многие рекомендации клиницистов в процессе их применения^, обеспечили устранение выявленных недостатков для повышения уровня качества проведения диагностических исследований. Вместе с тем следует отметить, что развитие.этиологической лабораторной диагностики шло в экстенсивном» направлении, не затрагивая особенностей; получения биологического сырья:

Производство диагностических антител к HBsAg является* длительным и дорогостоящим. Эти особенности'побудили нас рассмотреть возможность использования других, более рентабельных, биологических моделей ч для получения диагностических иммуноглобулинов. Особого внимания, заслуживает возможность получения- диагностических препаратов на основе желточных иммуноглобулинов (IgY, от англ. yolk) от различных видов птиц (гусей, уток, кур, перепелов и др.). Иммуноглобулины, птиц не обладают неспецифическим взаимодействием с компонентами сыворотки крови человека, т.к. птицы эволюционно представляют собой отдельную ветвь развития. Кроме того, взятие крови у лабораторных животных представляет сложную, болезненную процедуру, а получение яиц от иммунизированных птиц, которые содержат специфические иммуноглобулины, является физиологичным и неинвазивным.

Помимо вышеперечисленных преимуществ и особенностей, используя птиц в качестве продуцентов биологического сырья, для изготовления диагностических и лечебно-профилактических препаратов, становится возможным круглогодичное получение недорогих диагностических иммуноглобулинов, а также осуществление быстрой замены продуцента с минимальным сроком восстановления его продуктивности.

Кроме того, в настоящее время в медицине ощущается большой? недостаток в специфических сорбентах, в частности иммуноглобулинового происхождения. В медицинской практике довольно часто приходится проводить аферез, т.е. удаление из периферической крови различных антител и антигенов^ В этом* направлении весьма перспективным специфическим сырьём с неограниченным материальным ресурсом могут выступить желточные антитела [76].

Цель исследования: разработка тест-системы на основе желточных иммуноглобулинов'иммунизированных перепелов {Coturnix coturnix japónica) для индикации HBsAg.

Исходя из цели исследования, были поставлены следующие задачи.

1. Разработать биологическую модель — продуцента диагностических иммуноглобулинов.

2. Определить влияние препаратов для иммунизации и факторов окружающей среды на биологическую модель.

3. Сформировать опытный образец тест-системы для индикации HBsAg на основе желточных иммуноглобулинов и разработать схему его получения.

4. Провести лабораторные испытания разработанной тест-системы на основе желточных антител для индикации HBsAg и оценить её чувствительность и специфичность.

Научная новизна работы состоит в том, что впервые для нужд медицины для получения диагностических иммуноглобулинов были использованы, перепела вида Coturnix coturnix japónica. Впервые разработана методика иммунизации самок перепелов HBsAg с последующим получением в качестве конечного продукта специфических антител. Впервые создана тест-система-на основе желточных иммуноглобулинов для индикации HBsAg с высокой чувствительностью и специфичностью и-разработана схема получения лабораторного образца диагностической тест-системы на основе Ig Y для индикации HBsAg.

Практическая значимость. На основании проведённых исследований разработана тест-система для» этиологической? лабораторной диагностики ВГВ. Разработана биологическая модель и экспериментально обоснована её биологическая и диагностическая целесообразность. Разработана схема получения лабораторного образца диагностической тест-системы на основе Ig Y для индикации HBsAg.

Разработаны* методические рекомендации «Создание биологической модели для получения диагностических иммуноглобулинов» (2009); предназначенные для вирусологов, микробиологов и других специалистов, работающих в области создания иммунодиагностических средств медицинского-и ветеринарного назначения;,

Разработанные рекомендации и фактический материал используются в качестве теоретического обоснования и практического воплощения при проведении научно-исследовательских работ в.Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства Российской академии сельскохозяйственных наук» (ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии), а также при обучении слушателей и курсантов Федерального государственного образовательного« учреждения высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» (ФГОУ ВПО «ВМА им. С.М. Кирова»).

Положения, выносимые на защиту:

1. Применение перепелов вида Coturnix coturnix japónica для получения специфических диагностических иммуноглобулинов к HBsAg, исходя из их иммунофизиологических показателей и возможности поддержания статуса

SPF (specific pathogen free — свободный- от специфических патогенов), является обоснованным.

2. Тест-система на основе желточных иммуноглобулинов иммунизированных перепелов является высоко эффективной для диагностики ВГВ.

3. Разработанная схема производства диагностической тест-системы,для индикации HBsAg на основе" Ig Y иммунизированных перепелов применима для практического использования:

Апробация работы и реализация- полученных результатов. Основные результаты исследования« были, доложены и обсуждены на двух Всероссийских конференциях: «Современные проблемы здоровья населения и военнослужащих» (СПб:, 2007 г.), «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (СПб., 2008'г.), IV международной конференции «Идеи Пастера в^ борьбе с инфекциями» (СПб., 2008 г.), на научной конференции Северо-западного научно-методического1 центра Российской академии сельскохозяйственных наук «Нанотехнологии в зоотехнии и ветеринарной медицине: реализация и перспективы» (СПб:, 2008 г.), V съезде общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова (М., 2008 г.), XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству «Современное производство:. исследования и инновации» (М., 2009 г.), заседании отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (СПб., 2009 г.) и XIV Европейском конгрессе по биотехнологии (Барселона, Испания, 2009 г.).

В настоящее время в Федеральном институте промышленной собственности рассматривается заявление о выдаче патента Российской Федерации на изобретение: «Способ получения диагностических иммуноглобулинов для выявления HBsAg» (вх. № 009557, per. № 2009107142 от 27.02.2009 г.).

Реализовано'три рационализаторских предложения, направленные на существенное упрощение процедуры выделения и очистки Ig Y, принятые к использованию в ФГОУ ВПО «BMA им. С.М. Кирова»:

- способ подготовки поверхности оболочки желточного шара яиц птиц и повышения её прочности» (№ 11522/11 от 13 ноября 2008 г.);

- способ депротеинизации оболочки желточного шара для выделения желточных иммуноглобулинов (№ 11523/11 от 13 ноября 2008 г.);

- устройство для механического разделения массы белка и желточного шара яиц птиц (№ 11524/11 от 13 ноября 2008 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК.

Личный- вклад автора. Автором лично сформулированы цель и задачи исследования, составлен план» экспериментов, осуществлён сбор и анализ научной информации по. теме исследования. Самостоятельно-спланированы и проведены исследования, систематизация; обработка и анализ полученных результатов.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах компьютерного набора, состоит из введения, четырёх глав, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Список литературы включает 207 источников, из них: 92'отечественных и 115 иностранных. Текст диссертации содержит 22 таблицы, 29 рисунков, 2 приложения.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Сокурова, Алла Михайловна

100 Выводы

1. По своим иммунофизиологическим показателям и возможности поддержания статуса SPF применение в качестве биологической модели перепелов вида Coturnix coturnix japónica для получения диагностических желточных иммуноглобулинов является обоснованным.

2. Иммунизация перепелов- HBsAg, сорбированным на гидроокиси алюминия- и введённым в обратную эмульсию «вода-масло», приводит к статистически значимому (р<0,001) снижению морфометрических показателей перепелиных яиц. В то же время не отмечено влияния препаратов, используемых для иммунизации, на динамику яйцекладки перепелов. Основным лимитирующим фактором внешней среды, влияющим на динамику яйцекладки перепелов, а соответственно и количество получаемых диагностических иммуноглобулинов, является долгота дня.

3. Использование для иммунизации перепелов'HBsAg, сорбированного на гидроокиси алюминия и введённого в обратную эмульсию «вода-масло», позволяет получать более высокие титры, специфических антител^ по сравнению с иммунизацией перепелов HBsAg, сорбированным на гидроокиси алюминия.

4. Повышение уровня антител к HBsAg в сыворотке крови иммунизированных перепелов является критерием повышения уровня специфических антител в желтках яиц (р<0,001).

5. Применение специфических желточных антител в опытном образце диагностической тест-системы для индикации HBsAg позволяет получать результаты, сопоставимые с результатами тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) и ЗАО «ЭКОлаб» (Россия).

6. Разработанная схема получения и выделения специфических диагностических иммуноглобулинов из желтков яиц иммунизированных перепелов для индикации HBsAg является эффективной и позволяет получать их в необходимых объёмах.

Практические рекомендации

1. В качестве продуцента диагностических иммуноглобулинов для индикации HBsAg могут быть использованы перепела вида Coturnix coturnix japónica.

2. Для проведения эффективной иммунизации перепелов целесообразно применять препарат в виде HBsAg, сорбированного на гидроокиси алюминия и заключённого в обратную эмульсию «вода-масло».

3. Для создания биологической модели и получения диагностических иммуноглобулинов следует руководствоваться практическими рекомендациями «Создание биологической модели для получения диагностических иммуноглобулинов», утверждёнными в марте 2009 г. академиком-секретарём отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым, которые предназначены для вирусологов, микробиологов и других специалистов, работающих в области создания иммунодиагностических средств медицинского и ветеринарного назначения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сокурова, Алла Михайловна, Санкт-Петербург

1. Болотских JI.A. Питание безмикробных животных/ JI.A. Болотских // Теоретические и практические проблемы гнотобиологии; Под ред. В.П. Шишкова, Ю.Ф. Исакова. М.: Агропромиздат, 1986. - С. 79-81.

2. Ветеринарная энциклопедия. М.: Сов. энциклопедия, 1976. — 1032 с.

3. Ветеринарно-санитарные требования к перепелиным СПФ-фермам, продающим биопредприятиям инкубационное яйцо / Р.Н. Коровин, В.П. Зеленский, C.B. Борисенко и др. Л.: ВНИВИП, 1989. - 18 с.

4. Вирусные гепатиты в Российской Федерации (аналитический обзор, 2 выпуск) / Под ред. А.Б. Жебруна. СПб.: НИИЭМ имени Пастера,1999.-264 с.

5. Вирусные гепатиты в Российской Федерации (аналитический обзор, 3 выпуск) / Под ред. А.Б. Жебруна. — СПб.: НИИЭМ имени Пастера,2000.-256 с.

6. Вирусные гепатиты в Российской Федерации (аналитический обзор, 4 выпуск) / Под ред. А.Б. Жебруна. — СПб.: НИИЭМ имени Пастера, 2003.-200 с.

7. Вирусные гепатиты в Российской Федерации (аналитический обзор, 5 выпуск) / Под ред. А.Б. Жебруна. СПб.: НИИЭМ имени Пастера,2005.-160 с.

8. Вирусные гепатиты в Российской Федерации (аналитический обзор, 6 выпуск) / Под ред. А.Б. Жебруна. — СПб.: НИИЭМ имени Пастера,2006.- 110 с.

9. Вирусные гепатиты / А.Г. Рахманова, В.К. Пригожина, В.А. Неверов и др. СПб.: ССЗ, 1995. - 40 с.

10. Воронин Е.С. Способы получения СПФ-эмбрионов птиц для производства живых вирусных вакцин / Е.С. Воронин // Теоретические и практические проблемы гнотобиологии; Под ред. В.П. Шишкова,

11. Ю.Ф. Исакова. -М.: Агропромиздат, 1986. С. 37-42.

12. ГОСТ Р 50258-92. Комбикорма полнорационные для лабораторных животных. Технические условия, Введ. 1994-01-01.- М.: Изд-во стандартов, 1992. - 8 с.

13. ГОСТР 52249-2004. Правила производства и контроля качества лекарственных средств. -Введ. 2005-01-01. -М.: Изд-во стандартов, 2004. -100 с.

14. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения. Введ. 2002-11-01. - М.: Изд-во стандартов, 2002. — 32 с.

15. Динамика распространения/HBs-антигена: в контингентах с. различным риском инфицирования? в; г. Москве: в; 2001-2003 гг. / П.Г. Богуш,

16. A.A. Потапова; Е.Б. Редченко и др. // Вирусный гепатит В — диагностика, лечение и профилактика (к 40-летию открытия HBs Ag). Российская научно-практическая конференция с международным участием. - Тезисы докладов. -М-РАМН, 2004; - С: ЮЭД.

17. Дифференциальная лабораторная; иммунодиагностика вирусных гепатитов. Методические рекомендации / A.A. Новик, В;Н. Цыган,

18. B.Ю. Никитин и др. -М.: ГВМУ Минобороны России, 2002. 80 с.

19. Жданов В.М; Вирусные гепатиты / В.М. Жданов, В.А. Ананьев, В.М. Стаханова. М.: Медицина, 1986. - 256 с.

20. Иммунологические методы: Пер. с нем. А.П. Тарасова / Под ред Г. Фримеля: М.: Медицина, 1987. - 472 с.

21. Иммунология. Методы исследований: Пер. с англ. А.Н. Маца/ М. Трукко, С. де Петрис, Б. Такач и др.; Под общ. ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1983. - 349 с.

22. Кишкун A.A. Руководство по лабораторным методам диагностики / A.A. Кишкун. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. -800 с.

23. Колабская JI.C. Иммуноглобулины птицы / JI.C. Колабская // Птицеводство. 1987. - № 9. - С. 35-36.

24. Куликов JI. Как образуется яйцо / Л. Куликов // Птицеводство. — 1998. -№3.- С. 43-45.

25. Лабораторные методы исследования в ветеринарии. М.: Гос. изд-во сельскохоз. лит-ры, 1953. - 587 с.i

26. Лопаткина Т.Н. Клиника гепатитаг С / Т.Н. Лопаткина // Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. 1997. — № 1. — С. 12-16;

27. Маркеры гепатитов В и С у больных острым лейкозом/107 :

28. Медуницын Н.В. Вакцинология / Н.В. Медуницын. М.: Триада-X, 1999.-272 с.

29. Научные основы производства диагностических препаратов> (Сыворотки для идентификации энтеробактерий) / В.В. Смирнов, В.Я-. Чаплинский, З.М. Андреева, Л.Б. Богоявленская. Киев: Наукова думка, 1980.-196 с.

30. НетесовС.В. Вирусные гепатиты / C.B. Нетесов// Биология.-1997.-№2.-С. 35-43.

31. О применении в практике здравоохранения иммуноферментных тест-систем для выявления вируса гепатита В (HBsAg) и антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) в сыворотке крови человека: Пр. Минздрава РФ от 21.10.2002 г. № 322. М.: Минздрав РФ, 2002. - 8 с.

32. ОвиноваЕ.В. Значение диагностики гепатитов различными лабораторными методами / Е.В. Овинова, Е.И. Глухова, И.А. Мисевич // Вирусные гепатиты- эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика.

33. УПТоссийскаяшаучно-практическая конференция с международным участием. Материалы конференции. - М.: РАМН, 2007. - С. 52-54.

34. Пелконен К. Применение концепции SPF в конструировании помещений для лабораторных животных / К. Пелконен // Современные методы в выращивании^ и содержании лабораторных животных. — Мат. симпозиума И мая 1988 г.-Mi: 1988.-С. 22-27.

35. ПигареваМ.Д. Разведение перепелов / М.Д. Пигарева. М.: Рос-сельхозиздат, 1978. - 79 с.

36. Правила бактериологического исследования кормов: утв. Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 10 июня 1975 г. -М.: Министерство сельского хозяйства, 1975. 10 с.

37. Практическое пособие по иммуноферментному анализу / Н.В. Иванская, Е.Н. Кислых, Е.В. Максименок и др.; Под ред. А.Л. Гураля, Н.Я. Спивака. Киев: НАНУ, 2003. - 68 с.

38. Пшеничнов В.А-. Стандартизация методов вирусологических исследований/ В.А. Пшеничнов, Б.Ф.Семенов, Е.Г. Зезеров. М.: Медицина, 1974. - 168 с.

39. Рахманова А.Г. Хронические вирусные гепатиты / А.Г. Рахманова, A.A. Яковлев, E.H. Виноградова. СПб., 1997. - 29 с.

40. Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных: Национальный; научно-исследовательскит совет. Комиссия по наукам о: жизни. Институт ресурсовлабораторных животных: RussiamVersion: -Washington; National Academy Press, 1996; 138 с.

41. Санитарные правила1 по устройству, оборудованию:-и содержанию экспериментально-биологических клиник: (вивариев) № 1045-73 (Утверждены Главным санитарным врачом СССР 06 апреля 1973 г.). М.: Минздрав СССР, 1973.- 13 с.

42. Современная характеристика внутрибольничных парентеральных вирусных гепатитов и пути совершенствования их профилактики/

43. Создание биологической модели для получения-диагностических иммуноглобулинов (методические рекомендации) / В.Б. Сбойчаков, C.B. Борисенко, А'.М. Сокурова и др. — М.: Россельхозакадемия, 2009. 16 с.

44. Соринсон С.Н: Вирусные гепатиты в клинической практике / С.Н. Соринсон. СПб.: ТЕЗА, 1996. - 304 с.

45. Специфические иммуноглобулины из желтков яиц японских перепелов, иммунизированных вирусами гриппа и HIV-1 / A.A. Ковган, Е.И. Исаева, З.И. Ровнова, A.A. Шилов // ДАН. Вирусология. - 1989. -Т. 307.-№1.-С. 229-233.