Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ структурной организации и моделирование антигенных детерминант белков вирусов гепатита D и E на основе синтетических пептидов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ структурной организации и моделирование антигенных детерминант белков вирусов гепатита D и E на основе синтетических пептидов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ^ИРУСОЛОГИИ имени Д.И. ИВАНОВСКОГО

< ^' на правах рукописи

\

ДЕМЕНТЬЕВА Екатерина Викторовна

АНАЛИЗ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И МОДЕЛИРОВАНИЕ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ БЕЛКОВ ВИРУСОВ ГЕПАТИТА DHE НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997 г.

Работа выполнена в лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и пептидного синтеза НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор химических наук, профессор В.А. Шибнев

доктор биологических наук,

ведущий научн. сотр. Ю.А. Семилетов

ОФИЦИАЛЬНЬЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биол. наук, профессор В.В. Месянжинов кандидат хим. наук Л.Ю. Скляров

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 02-К(Х 1997 г. в а часов на заседании Специализировашюго Совета Д. 001.20.01 при НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан

1997 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук

Н.П. Косякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболеваемость вирусными гепатитами во всем мире стойко сохраняется на высоком уровне. В настоящее время установлено по крайней мере шесть агентов, вызывающих это заболевание. Каждый из гепатитов отличается особенностями течения болезни, тяжестью и характером поражения, способностью к хронизации и возможностью летального исхода.

Вирусы гепатита Ю (НОУ) и Е (НЕУ) относятся к наименее изученным, но наиболее опасным возбудителям вирусных гепатитов.

Для развития гепатита Б необходимо присутствие вируса гепатита в. Инфекционность НБУ реализуется в организме в присутствии вируса гепатита В в виде супер- или коинфекции с последним. Клинические проявления дельта-инфекции (ДИ) могут колебаться от фульминантных гепатитов до форм с неявно выраженной симптоматикой. ДИ отличается неблагоприятным прогнозом. Сегодня достоверно установлено, что во многих странах мира ДИ играет важнейшую роль в формировании тяжелых, часто летальных случаев острого и хронического гепатита В, а'также являются причиной значительной доли случаев фульминантного гепатита и цирроза печени. Носительство маркеров ДИ с неявно выраженной симптоматикой представляет опасность заражения донорской крови и ее препаратов.

Гепатит Е (первоначально называемый энтерально передающимся гепатитом ни А ни В) - нозологическая форма вирусных гепатитов, которой обусловлены крупные эпидемические вспышки, охватившие в период с 1986 по 1989 г. до 5% населения среднеазиатских республик. Эпидемиологический анализ выявил взрывной характер вспышек, выраженную осенне-зимнюю сезонность, максимальную поражаемость наиболее активной возрастной группы (15-30 лет) и высокую летальность среди беременных женщин (до 20%). Этим объясняеся необходимость своевременной диагностики с целью блокирования путей дальнейшего распространения вируса-возбудителя.

Таким образом, разработка различных методов диагностики, позволяющих быстро, эффективно распознавать на ранних стадиях различные нозологические формы вирусных гепатитов - остается важной задачей.

В последние годы синтетические пептиды нашли широкое применение в молекулярной биологии, вирусологии и иммунологии. С их помощью стало возможным решение целого комплекса проблем, связанных с исследованием антигенной структуры вирусных белков. Идентификация иммунодоминантных сайтов и синтез пептидов, способных имитировать соответствующие им антигенные участки белков, - путь к созданию новых диагностических и вакцинных препаратов. Анализ структурной организации белковых антигенов способствует пониманию природы взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне.

Цели и задачи исследования. Настоящее исследование посвящено поиску В-эпитопов белков HEV и HDV, изучению их структурной организации и развитию подходов к иммуноферментной диагностике и серотипированию HEV и HDV.

В соответствии с целями исследования были сформулированы следующие задачи:

- провести анализ гидрофильное™ и предполагаемой вторичной структуры исследуемых белковых последовательностей;

- на основе результатов теоретического прогнозирования и данных литературы осуществить выбор потенциальных антигенноак-тивных участков белков HEV и HDV;

- синтезировать выбранные участки белков, их перекрывающиеся и укороченные фрагменты;

- провести сравнительное исследование антигенной активности синтетических пептидов в непрямом твердофазном ИФА с серологическим материалом, полученным от пациентов с HEV- или HDV-инфек-цией;

- на основе полученных результатов выявить наиболее перспективные в антигенном отношении пептидные фрагменты и осуществить химический синтез генотипических вариантов этих фрагментов;

- используя отработанные методы ИФА, определить типы белковых последовательностей HEV и HDV, преобладающих на территории бывшего Советского Союза;

Научная новизна. Осуществлен твердофазный синтез 25 олиго-пептидов с длиной цепи от 9 до 21 аминокислотного остатка (а.о.), представляющих фрагменты белков, кодируемых ORF1, 0RF2 и 0RF3 генома HEV и белка нуклеокапсида HDV. Из них 24 пептида ра-

нее не были описаны.

Изучена антигенная структура районов, ограниченных а.о. 414-433 белка 01^2 и а. о. 92-123 белка (ЖЗ НЕУ. Идентифицированы участки, обладающие высокой антигенной активностью.

Исследованы среднеазиатские группы анти-НЕУ-позитивных сывороток с помощью олигопептидов (а. о. 99-119), соответствующих последовательностям белка (ШЗ бирманского и мексиканского изо-лятов НЕУ и установлены значительные отличия в антигенной активности этих пептидов.

Впервые проведен сравнительный иммуноферментный анализ сывороток крови больных ГД из двух районов РФ на основе пептидов, относящихся к трем различным генотипическим вариантам НОУ и установлены белковые последовательности, наиболее характерные для НОУ, распространенного на территории нашей страны.

Практическая значимость работы. Получены пептидные антигены - фрагменты белков НЕУ и НБУ, рекомендованные для создания пептидных иммуноферментных диагностических тест-систем для определения в крови антител к НЕУ и НВУ.

Установлен изолят НЕУ, антигенная структура которого на участке а.о. 99-119 белка (ШГЗ, наиболее близка среднеазиатским вариантам этого вируса.

с помощью групп анти-НОУ-позитивных сывороток и набора синтетических пептидов из состава иммунодоминантного участка а. о. 65-80 участка, выявлены два наиболее вероятных типа НБУ, циркулирующих на территории России.

Пептидный фрагмент а. о. 99-119 из состава белка, кодируемого (ЖРЗ генома бирманского изолята НЕУ, послужил позитивным контролем на начальных этапах создания отечественной диагностической тест-системы на анти-НЕУ на основе рекомбинантного антигена.

Использованные в данной работе подходы к исследованию структурно-функциональной организации иммунодоминантных эпитопов белков НЕУ и НБУ могут быть применены для изучения вероятной антигенной структуры других вирусных белков.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Стратегия химического синтеза и иммунологического исследования антигенных свойств 25 олигопептидов с длиной пептидной цепи от 9 до 21 а.о. из состава белков вирусов гепатита Б и Е;

2. Принципы отбора антигенов для иммуноферментной диагностики и серотипирования на основе антигенноактивных олигопептидов

из состава белков 0RF2 и 0RF3 HEV и белка нуклеокапсида HDV;

3. Антигенная структура иммунодоминантного участка а. о. 99-119 ORF3 белка среднеазиатских вариантов HEV ближе к структуре изолята HEV из Бирмы, чем из Мексики;

4. Антигенная структура фрагмента а.о. 65-80 белка нуклеокапсида HDV, имеющего распространение на территории России, соответствует последовательности генотипов I и II HDV.

Публикации. По результатам проделанной работы опубликованы 3 статьи и тезисы 4 докладов.

Апробация работы. Результаты работы представлены на международном Фальк симпозиуме No 92 "Новые направления в гепатоло-гии" в г. Санкт-Петербурге (1996 г.), на VII съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в г. Москве (1997 г.), на V Международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы" в г. Санкт-Петербурге (1997 г.) и на II Российской научно-практической конференции с международным участием "Гепатиты Б, С, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики" в г. Москве (1997г.). Результаты работы доложены и обсуждены на совместной Конференции Отдела молекулярной вирусологии и Совета по предварительной экспертизе диссертаций НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 30 октября 1997 г.

Объем и структура работы. Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Объем диссертационной работы составляет 165 стр. машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 8 таблицами. 19 рисунками и 13 схемами. Список литературы включает 236 наименований на русском и английском языках.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выбор пептидных фрагментов.

Выбор для синтеза пептидных фрагментов с предполагаемой антигенной активностью базировался на анализе гидропатических профилей и вторичной структуры исследуемых областей вирусных белков, а также частично на литературных данных.

Анализ гидрофильноети аминокислотной последовательности (Kyte and Doolittle. 1982) и расчет вторичной структуры (Chou

Белок Пептиды* Район

0RF1 DAPGLLREVGISDA 1185-1198

LAGGEIGHÜRPSVIPRGNPDA 1205-1225

GEIGHQSPSVIPRGNPDA 1208-1225

0RF2 CAFQSTVAELQRLK 638-651

TSVENAÜQDKGIAIPHDIDL 414-433

TSVENAÜQDKGIAIPH 414-429

NAÜQDKGIAIPHDIDL 418-433

NAQQDKGIAIPH 418-429

DKGIAIPHD 422-430

0RF3 БИРМА:

NPPDHSAPLGVT 92-103

TRPSAPPLPHVVDLPQLGPRR 103-123

PSAPPLPHVVDLPQLGPRR 105-123

PHVVDLPQLGPRR 111-123

PLGVTRPSAPPLPHWDLPQL 99-119

PLGVTRPSAPPLPHWDL 99-116

VTRPSAPPLPHVVDLPQL 102-119

VTRPSAPPLPHVVDL 102-116

ORF3 МЕКСИКА:

PLGEIRPSAPPLPPVADLPQP 99-119

EIRPSAPPLPPVADLPQP 102-119

Рис. 1. Синтезированные пептиды из состава вирусных белков,кодируемых 0RF1, ORF2 И 0RF3 генома HEV.

Генотип Пептиды Район

I GEGAPPAKRARTDRME AKRARTDRME 65-80 71-80

II GEGAPPAKRPRTDQME AKRPRTDQME 65-80 71-80

III EDGAPPAKRPRQETME AKRPRQETME 65-80 71-80

Рис. 2. Синтезированные пептиды из состава дельта-антигена HDV.

* Здесь, на других рисунках и в таблицах аминокислотные остатки приведены в однобуквенном обозначении. Выделенным шрифтом указаны вариабельные а. о.

and Fasman. 1978; Rose, 1978) изучаемых областей белков, кодируемых тремя ORF генома HEV (рис. 1), а также дельта-антигена HDV (рис. 2) проводили с использованием программы PROSIS (Hitachi Software Engineering Co., Ltd). В ряде случаев расчета вторичной структуры приеменялся метод Ptitsyn-Finkelstein (1983). Чтобы оценить возможные изменения вторичной структуры, вызванные выделением пептидного фрагмента из белковой последовательности, в ряде случаев предполагаемую вторичную структуру рассчитывали и для фрагмента, находящегося в составе белка, и для изолированного пептида. В качестве кандидатов в В-эпитопы рассматривались участки, обладающие повышенной гидрофильностью, вторичная структура которых предполагает образование ß-изгибов.

1.1. Выбор фрагментов белковых последовательностей бирманского изолята HEV.

Первичная структура белков вируса соответствовала опубликованным нуклеотидным последовательностям генома бирманского и мексиканского изолятов HEV [Tarn 4.W., 1991; Huang С.С., 1992] (рис. 1).

Из состава 0RF1 белка (бирманский изолят) были выбраны два неупорядоченных участка, содержащих ß-изгибы в предполагаемой вторичной структуре: умеренногидрофильный фрагмент а.о.1185-1198 и высокогидрофильный - 1205-1225. Эти фрагменты располагаются в описанной ранее обширной иммунодоминантной зоне а.о. 1185-1618 [Kaur et at., 1992]. Чтобы установить значимость ß-изгиба на N-концевом участке фрагмента 1205-1225, был дополнительно синтезирован укороченный пептидный фрагмент а. о. 1208-1225.

Гидрофильный участок 0RF2 белка (бирманский изолят) а. о. 638-651 был выбран с целью локализации эпитопа между 613 и 660 аминокислотными остатками. Информация об антигенности этого участка была противоречивой: одни авторы сообщали о наличии эпи-топов [Yarbough P.O., 1991; Ktmdyakov Y.E., 1993], другие [Coursaget P., 1993; Kaur M., 1992] не находили их.

Второй пептид 0RF2 белка (414-433 а.о.) соответствовал участку с высокогидрофильной К-концевой частью. Между 422 и 426 а. о. прогнозировался гидрофобный фрагмент. Составляющие данный участок а.о., за исключением Не425, носят преимущественно гидрофильный характер. Возникновение при компьютерном расчете гидрофобного потенциала скорее всего объясняется тем, что располо-

женные в непосредственной близости гидрофильные остатки Asp422 и Lys423 компенсируют противоположный заряд друг друга. Вторичная структура данного пептидного фрагмента предполагает наличие двух возможных р-изгибов, формирование одного из которых связано с присутствием Pro428. Высокая антигенная активность пептида 414-433 известна [Khudyakov Y.E., 1994]. Нами же он был выбран для изучения его структурной организации с целью выбора оптимального по размеру иммунодоминантного участка. Кроме полноразмерного пептида а.о. 414-433 были синтезированы перекрывающие его пептиды: 414-429, 418-433, 418-429, 422-430. Наше особое внимание привлек неупорядоченный участок между 422 и 430 а.о., где предсказывается наличие двух р-изгибов, способствующих формированию антигенноактивной "петли" на поверхности белковой глобулы, которая, возможно, стабилизируется за счет электростатического взаимодействия между положительно заряженной £-аминог-руппой остатка Lys423 и отрицательно заряженной "¡(-карбоксильной группой остатка Asp130. Расчет вторичной последовательности фрагментов, ограниченных His429, продемонстрировал нарушение такой структуры вследствие исчезновения С-концевого (3-изгиба

Из иммунодоминантной С-концевой области 0RF3 белка (бирманский изолят) был выбран умеренно гидрофильный участок а.о. 92-123. По данным расчета вторичной структуры фрагмент 90-123 с большой степенью вероятности содержит два (3-изгиба, в образовании которых принимают участие остатки Pro в положениях 93, 94 и 105. С целью минимизации эпитопа и изучения антигенной организации участка 92-123 были выбраны следующие пептидные фрагменты, перекрывающие участок 92-123 белка 0RF3 HEV: 92-103, 103-123, 105-123, 111-123, 99-119, 99-116, 102-119 и 102-116 (рис. 1).

Для того чтобы определить, к какому изоляту относится белковая последовательность среднеазиатских вариантов HEV, нами были выбраны для последующего исследования антигенной активности пептидные фрагменты, соответствующие второму известному изоляту HEV - мексиканскому [Huang1 С.С., 19921 (рис. 1). Данные расчета гидрофильности и вторичной структуры фрагмента 92-123 а.о. белка 0RF3 мексиканского изолята HEV обнаружили много общего с данными, полученными для аналогичного участка последовательности бирманского изолята HEV. Это позволило сделать предположение об

одинаковой локализации эпитопов на данном участке. Нами были выбраны пептидные фрагменты а. о. 99-119 и 102-119.

1.2. Выбор фрагментов белковых последовательностей белка нук-леокапсида HPV.

Выбор пептидных фрагментов 65-80 белка нуклеокапсида HDV, соответствующих трем различным генотипам HDV, и укороченных с Ы-конца фрагментов 71-80, был осуществлен на основе ранее проведенных исследований, в результате которых была установлена антигенная активность участка 65-80 и его фрагментов [Bergmann К.F., 1989; Семилетов Ю. А., 1992}.

На рис. 2 представлены аминокислотные последовательности пептидов а.о. 65-80, соответствующие трем различным генотипам HDV [Chao Y. С., 1990; Imazeki F., 1991; Casey J.L.. 1993], и выделены шесть а.о., вариабельных для всех известных последовательностей HDAg. Для этого участка характерна высокая степень гидрофильности.

При расчете и анализе вторичной структуры HDAg и отдельных его фрагментов необходимо учитывать, что HDAg является нуклео-капсидным белком, вовлечен во взаимодействие с геномной РНК, что может существенно ограничивать применимость используемых расчетов для определения его реальной конформации в составе нуклеокапсида. Вторичная структура участка 65-80 предполагала наличие нескольких ß-изгибов, количество и протяженность которых колеблются в зависимости от генотипа.

2. Твердофазный синтез пептидов.

В соответствии с данными компьютерного расчета и на основании анализа литературы осуществлен синтез 25 пептидных фрагментов из состава белков, кодируемых 0RF1, 0RF2 и 0RF3 генома HEV, и нуклеокапсидного белка HDV.

Синтез выбранных пептидных фрагментов проводился твердофазным методом (ТФС) на основе одной из наиболее распространенных схем образования пептидной связи - Вос-схемы, предусматривающей использование mpem-бутилоксикарбонильной (Вое) группы для временного блокирорования a-аминогрупп растущей пептидной цепи. Пептиды синтезировали в неавтоматизированном режиме. В качестве полимерного носителя использовался хлорметилированный тефлон с

радиационно привитым полистиролом (10%).

Присоединение стартовой аминокислоты к хлорметилированному полимеру проводили в среде DMF в присутствии эквимолярных количеств Et3N с добавкой йодистого натрия в качестве катализатора. Содержание стартовой аминокислоты определяли по привесу аминоа-цилполимера и по данным количественного аминокислотного анализа. В соответствии с поставленными задачами нагрузка стартовой Вос-АА варьировалась от 0.25 до 0.5 ммоль/г полимера.

Удаление Вос-защиты проводилось 50% раствором трифторуксус-ной кислоты (TFA) в дихлорметане (DCM) с последующей нейтрализацией аминокомпонента 10% раствором EDIPA (этилдиизопропиламина) в DCM. Для предотвращения протекания побочных окислительных процессов, в особенности в случае присутствия остатков Met, содержащих легкоокисляемую тиоэфирную группу, отщепление проводили в атмосфере инертного газа с добавкой 10% анизола. Во избежание побочных реакций при проведении ТФС боковые реакционноспособные группы трифункциональных Вос-аминокислот блокировали следующим образом: e-аминогруппу Lys - бензилоксикарбонильной (Z); гидрок-сильные группы Ser, Thr и Туг - бензильной (Bzl); гуанидиновую группу Arg - нитрогруппой (Ж>2): имидазольную группу His - бен-зилоксиметильной (Вот); сульфгидрильную группу Cys - ацетамидо-метильной (Acm). Boc-Glu-OH и Boc-Asp-OH вводили в реакцию конденсации в виде 7ф)-0-бензиловых эфиров.

Проведение реакции конденсации осуществлялось методом симметричных ангидридов, активированных эфиров и DCC/HOBt-методом при использовании 2-5-кратных избытков карбоксильного компонента по отношению к исходной концентрации аминогрупп на полимере.

Полноту реакции образования пептидной связи контролировали с помощью нингидринового теста [Kaiser Е., 1970]. В случае неполного прохождения реакции проводили повторную конденсацию с половинным количеством реагентов или ацетилировали непрореагиро-вавшие аминогруппы.

Синтезированные пептиды отщепляли от носителя действием трифторметансульфокислоты в 7FA в присутствии тиоанизола. Одновременно происходило деблокирование боковых групп аминокислот, за исключением Acm-защиты цистеина, в отдельных случаях не наблюдалось полное восстановление И02-защиты остатка Arg.

3. Очистка и идентификация пептидов.

Для обессоливания и отделения низкомолекулярных продуктов пептидной природы использовали метод гель-хроматографии на сефа-дексах G-10 или G-15. Образцы пептидов, предназначенные для анализа и иммунологических исследований дополнительно очищали полупрепаративной ВЭЖХ в градиенте концентрации водного ацетонит-рила. Индивидуальность синтетических пептидов была доказана данными аминокислотного анализа и аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход пептидов в расчете на стартовую аминокислоту колебался от 10 до 35%.

4. Исследование антигенных свойств синтезированных пептидов.

Антигенные свойства синтезированных пептидных фрагментов белков HEV и HDV и их способность к специфическому скринингу антител к вирусам гепатитов Е и D (анти-HEV- и анти-НБУ-антител) оценивались по их взаимодействию с сыворотками крови пациентов с диагнозом "гепатит Е" и "гепатит D" соответственно, поставленным на основе их взаимодействия с рекомбинантными и/или пептидными антигенами из коммерческих тест-систем.

Для исследования антигенных свойств синтезированных пептидных фрагментов белков HEV были подобраны четыре группы сывороток от пациентов с гепатитом Е из среднеазиатского региона бывшего Советского Союза, охарактеризованные на присутствие соответствующих специфических антител и одна группа сывороток крови, собранная в эндемичном для HEV регионе, но не охарактеризованная на присутствие анти-НЕУ-специфических антител. В качестве позитивного контроля использовался рекомбинантный антиген из диагностической тест-системы, разработанной в "Centers for Disease Control" (Атланта, США), а в качестве отрицательного контроля антител - сыворотки крови здоровых доноров и пациентов с гепатитом А и гепатитом В, негативные по анти-HEV.

Для исследования антигенных свойств синтезированных пептидных фрагментов из состава HDAg были подобраны две группы сывороток, собранные в Московском регионе и на территории среднего Поволжья, и охарактеризованные на присутствие HBsAg (фирма "Им-Био", НПО "Диагностические системы". Нижний Новгород), а также специфических анти-дельта антител по взаимодействию с рекомби-

нантным HDAg (НПО "Диагностические системы". Нижний Новгород). Отрицательным контролем в этом случае служили сыворотки крови пациентов с гепатитом А и гепатитом В, негативные по анти-дель-та.

Результаты ИФА оценивали количественно по величине P/N в "+" (Р - величина поглощения образца; N - среднее арифметическое значений поглощения при реакции пептидов с группой негативных сывороток без учета максимального и минимального значений), где 2.1 < 1+ < 3.5; 3.5 < 2+ < 5.0; 5.0 < 3+ С 10.0; 4+ > 10.0. Негативными по тестируемым антигенам считали сыворотки, для которых значение P/N было меньше 2.1.

4.1. Анализ антигенных областей 0RF1. 0RF2 и 0RF3 белков HEV.

Антигенная активность синтетических пептидов 1185-1198, 1205-1225, 1208-1225 0RF1 белка HEV И 638-651, 414-433, 414-429, 418-433, 418-429 и 422-430 0RF2 белка HEV изучалась методом непрямого твердофазного ИФА по степени их взаимодействия с ан-ти-НЕУ-позитивными сыворотками больных с диагнозом "ГЕ" из Средней Азии. Результаты представленны в таблице 1.

Таблица 1.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ СОСТАВА 0RF1 И 0RF2 БЕЛКОВ С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ С ДИАГНОЗОМ "ГЕ" В ИФА (П=25)

Абс. кол-

Белок Район Пептиды во (+) В % (+) В

ИФА ИФА

0RF1 1185-1198 DAPGLLREVGISDA 0 0

1205-1225 LAGGEIGHQRPSVIPRGNPDA 1 4

1208-1225 GEIGHQRPSVIPRGNPDA 1 4

ORF 2 638-651 CAFQSTVAELQRLK 8 32

414-433 TSVENAQQDKGIAIPHDIDL 16 64

414-429 TSVENAQQDKGIAIPH 10 40

418-433 NAQQDKGIAIPHDIDL 14 56

418-429 NAQQDKGIAIPH 9 36

422-430 DKGIAIPHD 11 44

Пептиды из состава 0RF1 белка взаимодействовали только с одной из 25 исследованных сыворток. 0RF1 генома HEV кодирует неструктурные белки. Как правило, такие белки располагаются внутри вирусной частицы и поэтому не всегда содержат сильные ан-тигенноактивные участки. В работе Kaur et al (1992), напротив, отмечалась повышенная иммунореактивность этих областей. Но следует отметить, что эти данные были получены на серологическом материале из Судана. Не исключено, что здесь мы имеем дело со спецификой организации иммунодоминантных участков вирусных белков суданского варианта HEV, что интересно само по себе, но не имеет диагностической актуальности для нашей страны.

Больший интерес представляют данные, полученные в результате взаимодействия пептидов из состава 0RF2 белка с сыворотками крови больных гепатитом Е. С целью выявления особенностей строения иммунодоминантного участка а.о. 414-433 он был перекрыт укороченными пептидами. Наибольшую активность в ИФА обнаружил полноразмерный пептид 414-433, прореагировавший с 16 сыворотками из 25 (64%) (Табл. 1). Укорачивание исходного пептида на четыре С-концевых аминокислотных остатка приводило к снижению активности до 40%, аналогичное изменение длины пептида со стороны N-koh-ца снижало активность только до 56%. Это позволило сделать заключение о необходимости N- и С-концевых участков фрагмента а.о. 414-433 при формировании взаимодействия антиген-антитело.

Наименьший пептидный фрагмент 422-430 был достаточно активен в ИФА. Этот фрагмент содержал значимый для связывания с активным центром анти-НЕУ-антител а.о. Asp в положении 430. Активность пептида 422-430 составила 44%. Более длинные, но не содержащие этого а. о. пептиды 418-429 и 414-429, реагировали с меньшим процентом сывороток крови пациентов с диагнозом ТЕ".

Вторичная структура участка 422-430 в составе большего фрагмента предполагала наличие двух наиболее вероятных ß-изгибов в положениях 423 и 429, между которыми прогнозировалась неупорядоченная область (рис. 3). Возможно, именно такая структура обеспечивает экспонирование антигенной "петли", образующейся при сближении перифгрийных остатков Lys423 и Asp430. Становится понятной роль этих а.о., которые не только непосредственно участ-

414

433

414

429

TSVENAQQDKGIAIPHDIDL cchhhhhhttccccctcccc

433 422 430

TSVENAQQDKGIAIPH cchhhhhhttcccccc

418

NAQQDKGIAIPHDIDL ccttttccccctcccc

DKGIAIPHD ctccccctc

418 4;

NAQQDKGIAIPH ccttttcccccc

429

Рис. 3. Первичная и предполагаемая вторичная структуры пептидов, выбранных из состава фрагмента 410-440 а.о. белка 0RF2 HEV (бирманский изолят).

вуют во взаимодействии антиген-антитело, но и стабилизируют ан-тигенноактивную конформацию всего фрагмента.

Пептидный фрагмент а.о. 638-651 был активен в отношении 32% анти-НЕУ-позитивных сывороток (Табл. 1). Таким образом, результаты исследования пептида 638-651 подтвердили данные о присутствии антигенноактивных фрагментов на участке а.о. 613-660.

Преследуя цель локализовать эпитоп на иммунодоминантном участке 92-123 0RF3 белка HEV, мы перекрыли эту область набором из восьми пептидов, соответствующих а. о. 92-103, 99-116, 99-119,

102-116, 102-119, 103-123, 105-123 и 111-123 (рис. 1). Пептид 99-119 прореагировал со всеми анти-НЕУ-позитивными сыворотками крови, кроме одной, которая не взаимодействовала ни с одним из исследуемых пептидов этого набора, вероятно, по причине отсутствия у данного пациента антител к С-концевой части 0RF3 белка (Табл. 2). Укорачивание пептида 99-119 на три а. о. как с N-koh-ца, так и с С-конца приводило к снижению сигнала в ИФА и утрате активности в отношении одной (для пептида 102-119) или двух (для пептида 99-116) сывороток. Это позволяет предположить, что участки 99-102 и 116-119 являются фрагментами протяженного имму-нодоминантного участка. Интересно отметить важность остатка Val в положении 102. Пептид 102-119 активнее более длинного пептида

103-123, в составе которого отсутствует этот а.о. (Табл. 2). Данные ИФА (табл. 2) свидетельствуют о том, что N- и С-концевые участки фрагмента 92-123 а.о. не содержат самостоятельных эпито-пов: активность пептидных фрагментов а.о. 92-103 и 111-123 в ИФА была невысока.

Таблица 2.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ СОСТАВА ОЕБЗ БЕЛКА С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ С ДИАГНОЗОМ ТЕ" В ИФА (11=24)

Абс. кол-

Белок Район Пептиды во (+) в %(+) В

ИФА ИФА

окгз 92-103 ЫРРВНБАРЬСУТ 9 37.5

103-123 ТЕРЗАРРЬРНУУБЬРйЮРЕК 20 83.3

105-123 РЗАРРЬРНУУВЬРОЬСРЕК 16 66.7

111-123 рнууБЬРйюит 10 41.7

99-119 РЬйУТНРЗАРРЬРНУУБЬРО! 23 95.8

99-116 РЬЕУТЕРБАРРЬРНУУБЬ 21 87.5

102-119 УТЕРЗАРРЬРНУУБЬРОЬ 22 91.6

102-116 УТЕРБАРРЬРНУУБЬ 18 75

Итогом всего вышесказанного стало то. что пептидный фрагмент 99-119 а.о. был выделен в качестве перспективного компонента для диагностики НЕУ-инфекции.

К этому времени мы уже располагали данными об исследованиях

рекомбинантного по-Таблица 3. липептида, содержа-ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДА 99-119 ИЗ СОСТАВА щего фрагменты про-ОМЯ БЕЖА НЕУ (БИРМА) И РЕКОМБИНАНТНОГО дуктов 01^2 и 01^3 ПОЛИПЕПТИДА Е-56 С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ, генома НЕУ. Эти ра-СОБРАННЫМИ В ЭНДЕМИЧНОМ ДЛЯ НЕУ РЕГИОНЕ боты велись в НИИ

вирусных препаратов. Было интересно сравнить реакционную способность обоих антигенов, используя одинаковый набор сывороток (табл. 3).

Нами наблюдалась практически

СЫВОРОТКИ (П=62) АНТИГЕНЫ

99-119 Е-56

АбС. (+) 28 29

% (+) 45.2 46.8

полная корреляция (96.6%) антигенных активностей синтетического пептида и рекомбинантного антигена Е-56 в ИФА (табл. 3)*.

Серологический материал не был охарактеризован на присутствие маркеров HEV. Поэтому пептид 99-119, активный в отношении сывороток, охарактеризованных при помощи коммерческой тест-системы "Centers for Disease Control"(США), послужил позитивным контролем на начальных этапах создания отечественной диагностической тест-системы на основе рекомбинантного антигена.

4.2. Сравнительное исследование антигенной активности пептидов из состава 0RF3 белка, соответствующих двум географическим изо-лятам HEV.

Первичная структура С-концевой части 0RF3 белка достаточно консервативна в пределах бирманской группы и существенно отличается от первичной структуры мексиканского изолята. Это находит отражение и в различиях антигенных свойств.

Нами изучалось влияние аминокислотных замен на участке 99-119 на специфическую антигенную активность соответствующих пептидов в ИФА с плазмами крови анти-НЕУ-позитивных сывороток больных ГЕ (Табл. 4).

Таблица 4.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ СОСТАВА 0RF3 БЕЛКОВ HEV, СООТВЕТСТВУЮЩИХ БИРМАНСКОМУ И МЕКСИКАНСКОМУ ИЗОЛЯТАМ, С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ГЕ (п=39)

Белок Район Пептиды Абс.кол-во (+) в ИФА %( + ) В ИФА

0RF3 Бирманский изолят

99-119 PLGVTRPSAPPLPHVVDLPQL 37 94.9

102-119 VTRPSAPPLPHVVDLPQL 36 92.3

0RF3 99-119 102-119 Мексиканский изолят PLGEIRPSAPPLPPVADLPQP EIRPSAPPLPPVADLPQP 19 7 48.7 17.9

'Исследование проводилось совместно с научн. сотр. лаборатории клонирования вирусных геномов НШ вирусных препаратов Г.И. Алаторцевой.

Локализованный нами на участке а.о. 99-119 высокоактивный линейный В-эпитоп и его фрагмент 102-119 были использованы для типирования среднеазиатских анти-НЕУ-специфических сывороток. Дополнительно к уже синтезированным пептидам 99-119 и 102-119, соответствующим бирманскому изоляту HEV, были получены мексиканские варианты этих пептидов 99-119 и 102-119 (рис. 1). Была протестирована группа плазм крови эпидемиологически связанных пациентов из Узбекистана, Туркмении и Таджикистана.

Установлено, что антигенная структура среднеазиатского варианта HEV ближе к структуре бирманского изолята: 94.9% и 92.3% исследованных сывороток реагировало с пептидами 99-119 и 102-119 бирманского типа, в то время как активность пептида мексиканского типа составила только 48.7 и 17.9% соответственно (Табл. 4). Следует отметить, что интенсивность сигналов в ИФА для пептидов бирманского типа существенно превышала интенсивность сигналов для пептидов мексиканского типа.

Полученные нами данные позволяют сделать вывод о том, что вариабельные а. о. 102 (Val), 103(Thr), 112 (His), 114 (Val) и 119 (Leu) участвуют в связывании с активным центром антител, и их замены на Glu, Ile, Pro, Ala и Pro, соответственно, вызывают типоспецифический иммунный ответ.

Таким образом, на примере иммунодоминантного участка а. о. 99-119 последовательности белка 0RF3 нами установлена принадлежность среднеазиатских вариантов HEV к бирманской группе.

4.3. Сравнительное исследование антигенной активности пептидов из состава белка нуклеокапсида HPV, соответствующих трем генотипам HPV.

Нами изучалось влияние аминокислотных замен на участке 65-80 из состава дельта-антигена на специфическую антигенную активность данного пептидного фрагмента в реакции ИФА с сыворотками крови крови больных гепатитом D с явно выраженными клиническими симптомами (Табл. 5) и больных гепатитом D с неявно выраженной симптоматикой (Габл. 6)

Результаты ИФА показали, что пептиды, соответствующие а.о. 65-80, реагировали с большим количеством исследованных серологических образцов, чем "укороченные" варианты 71-80 (табл. 5). Эта зависимость, очевидно, обусловлена удалением а. о. из антиген-

но-активного участка. В одной из опубликованных ранее работ было установлено, что пептидный фрагмент 61-71 не обладает существенной антигенной активностью [Семилетов Ю.А., 1992]. Сопоставление этого факта с полученными наш данными о снижении антигенной активности пептида 65-80 при удалении шести И-концевых а.о., позволяет нам утверждать, что хотя фрагмент а.о. 65-71 и не является самостоятельным эпитопом, но содержит аминокислотные остатки, важные для формирования эпитопа на участке 65-80.

Таблица 5.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ СОСТАВА ДЕЛЬТ А-АНТИГЕНА, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ТРЕМ ГЕНОТИПАМ Ш, С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ГД В ИФА (п=16)

Абс.кол-

Генотип Район Пептиды во (+) в %(+) В

ИФА ИФА

I 65-80 СЕЙАРРАКШТОКМЕ 12 75

71-80 АКШТОИМЕ 4 25

II 65-80 СЕСАРРАЖРШЮМЕ 14 87.5

71-80 АККРИТООМЕ 7 43.7

III 65-80 ЕОБАРРАКЕРИОЕТМЕ 8 50

71-80 АКЕРШЗЕТМЕ 7 43.7

Данные, полученные на группе образцов, позволяют характеризовать распространенный на территориях Московского региона и Поволжья вариант НБУ как родственный генотипам I и II: количество положительных реакций и интенсивность сигнала в ИФА для пептидов генотипов I и II преобладали над теми же величинами в случае пептидов генотипа III (Табл. 5).

Результаты ИФА, полученные при исследовании группы сывороток больных ГД с невно выраженной клинической симптоматикой (Табл. 6), не позволяют определенно судить о предпочтительности какого-либо из пептидных фрагментов.

Все пептиды реагировали с антителами 16 сывороток из 17, за исключением пептида 71-80 генотипа II, который был активен в от-

ношении 15 серологических образцов (Табл. 6).

Таблица 6.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ СОСТАВА ДЕЛЬТА-АНТИГЕНА, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ТРЕМ ГЕНОТИПАМ Ш, С СЫВОРОТКАМИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ГД С НЕЯВНО ВЫРАЖЕННОЙ СИМПТОМАТИКОЙ В ИФА

Абс.кол-

Генотип Район Пептиды во (+) в %( + ) в

ИФА ИФА

I 65-80 GEGAPPAKRARTDRME 16 94.1

71-80 AKRARTDRME 16 94.1

II 65-80 GEGAPPAKRPRTDQME 16 94.1

71-80 AKRPRTDQME 15 88.2

III 65-80 EDGAPPAKRPRQETME 16 94.1

71-80 AKRPRQETME 16 94.1

По-видимому, серологический материал от больных ГД с невно выраженной клинической симптоматикой получен на более поздней стадии развития иммунного ответа, и поэтому набор анти-дельта антител в нем более полон.

Таким образом, использование пептидов с вариабельными а. о. в положениях 65 (Gly/Gly/Glu), 66 (Glu/Glu/Asp), 74 (Ala/Pro/Pro), 76 (Thr/Thr/Gln), 77 (Asp/Asp/Glu) и 78 (Arg/Gln/Thr) пептидных последовательностей, соответствующих генотипам I, II и III HDV, лишь в отдельных случаях позволяет относить сыворотки к тому или иному типу.

В результате проделанной работы исследованы антигенные свойства пептидов в твердофазном ИФА с анти-дельта позитивными сыворотками. Выявлены отличия в антигенной активности пептидов 65-80 и укороченных фрагментов 71-80, соответствующих трем различным генотипам HDV. Высокая реакционная способность пептидов, продемонстрированная в ИФА дает возможность рассматривать эти пептиды как перспективные компоненты диагностической тест-системы на анти-дельта.

ВЫВОДЫ

1. Твердофазным методом синтезированы 19 пептидов из состава 0RF1. 0RF2, 0RF3 белков HEV, и 6 пептидов из состава белка нуклеокапсида HDV, относящихся к генотипам I, II и III; из них 24 пептидных фрагмента синтезированы впервые;

2. Исследованы антигенные свойства пептидов в твердофазном ИФА на панелях анти-HEV- и анти-ЮУ-позитивных сывороток и выявлены пептиды, позволяющие специфически определять антитела к HEV и HDV;

3. Изучена антигенная структура районов, ограниченных аминокислотными остатками (а.о.) 414-433 0RF2 белка и 92-123 0RF3 белка HEV и показано, что наибольшей антигенной активностью обладает пептид 99-119 из состава 0RF3 белка и пептид 414-433 из состава 0RF2 белка;

4. Продемонстрировано, что антигенная структура участка а.о. 99-119 0RF3 белка среднеазиатских вариантов HEV ближе к структуре изолята HEV из Бирмы, чем к структуре изолята HEV из Мексики;

5. Показано, что антигенная структура фрагмента а.о. 65-80 белка нуклеокапсида HDV, имеющего распространение на территории России, соответствует структуре генотипов I и II HDV;

6. Полученные пептидные антигены - фрагменты 0RF2 (а.о. 414-433) и 0RF3 (а.о. 99-119) белков HEV и нуклеокапсидного белка HDV (а.о. 65-80) являются основой для конструирования пептидных иммуноферментных диагностических тест-систем для определения в крови антител к HEV и HDV.

По материалам диссертации опубликованы работы:

1. Семилетов Ю.А., Дементьева Е.В., Яшина Т.Д., Фаворов М.О., В.А.Шибнев. Синтез и антигенная активность пептидов из последовательности 0RF3 белка вируса гепатита Е. //Биоорган, химия. -1995. - Т. 21, N 2. - С. 156-157.

2. Дементьева Е.В., Семилетов Ю.А., Яшина Т. Л., Павлюченкова Р.П., Вязов С.0., Шибнев В.А. Использование синтетических антигенов для серотипирования вирусных гепатитов D и Е. //Тезисы докладов международного Фальк-симпозиума No 92 "Новые направления в гепатологии", Санкт-Петербург, июнь 1996 г. - С. 327.

3. Дементьева E.B., Семилетов Ю.А., Яшина Т.Д., ШибневВ. А. Анализ организации иммунодоминантных эпитопов белков 0RF2 и 0RF3 вируса гепатита Е с помощью синтетических пептидов. // Вопросы вирусологии. - 1997. - No 3. - С. 102-105.

4. Алаторцева Г. И., Гринев A.A.. Гольцов В.А., Зверев В.В., Ка-пасева Е.В., Титаев A.B., Суханова Л.Л., Дементьева Е.В. Создание тест-системы для диагностики гепатита Е на основе рекомби-нантных белков. // Тезисы докладов VII съезда всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, январь 1997 Г. - С. 204-205.

5. Dementyeva E.V., Kruglov I.V., Plmenov V.K., Novikov V.V. Development of the new approaches to diagnostic and serotyplng of delta-infection by usage of synthetic peptides. //Fifth International conference "AIDS, cancer and related problems", St. Petersburg, May 25-30 1997. - P. 245-246.

6. Дементьева E.B., Круглов И. В., Пименов В.К., Семилетов Ю. А. Сравнительное исследование антигенной активности пептидов нукле-окапсидного белка вируса гепатита дельта, соответствующих трем генотипам. // Тезисы докладов II Российской научно-практической конференции с международным участием'Тепатиты В, С, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, октябрь 1997 г., С. 62-63.

7. Дементьева Е.В., Круглов И.В., Пименов В.К., Семилетов Ю.А. Сравнительное исследование антигенной активности пептидов из состава дельта-антигена, соответствующих трем генотипам вируса гепатита дельта. //Вопросы вирусологии. - в печати.

вписано в печать J*M. Формат 60x84. 1/16. Объем п.л. Тираж/00 экз. Заказ 11.

МГАПИ