Исследование антигенных детерминант вирусов гепатитов A, C, дельта и их значения для клиники и диагностики

Круглов, Игорь Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование антигенных детерминант вирусов гепатитов A, C, дельта и их значения для клиники и диагностики
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Исследование антигенных детерминант вирусов гепатитов A, C, дельта и их значения для клиники и диагностики"

На правах рукописи

Круглов Игорь Вячеславович

ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУСОВ ГЕПАТИТОВ А, С, ДЕЛЬТА И ИХ ЗНАЧЕНИЯ ДЛЯ КЛИНИКИ И ДИАГНОСТИКИ.

03.00.06 - вирусология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Москва, 2004.

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Научные консультанты: Доктор медицинских наук Николай Васильевич Дорошенко. Доктор биологических наук Юрий Аркадьевич Семилетов.

Официальные оппоненты: Профессор, доктор медицинских наук Вера Михайловна Стаханова. Профессор, доктор медицинских наук Нина Васильевна Шалунова. Профессор, доктор медицинских наук Татьяна Васильевна Голосова.

Ведущее учреждение - ГУ НИИ вирусных препаратов им. О.Г.Анджапаридзе.

Зашита диссертации состоится 2004 в........на заседании

специализированного совета Д 001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16.

Автореферат разослан «....»............2004.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Учёный секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

Н.П.Косякова.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Гепатиты С и дельта являются актуальными проблемами для здравоохранения Российской Федерации в связи с высокими показателями иввалидизации и смертности в результате этих заболеваний и их последствий. В настоящее время в России умирает не менее 10.000 человек в год в результате заболеваний парентеральными гепатитами и их отдаленных последствий, и есть все основания ожидать роста этого показателя в дальнейшем (С.М.Клименко, 1997). Проблема гепатита А (ГА) актуальна в связи с высокими показателями заболеваемости. Согласно официально регистрируемым данным за период с 1995 по 2001 годы заболеваемость ГА в Российской Федерации находилась в пределах от 78,5 до 123,5 заболевших на 100.000 населения.

Одним из путей создания эффективных диагностических и профилактических препаратов против вирусных инфекций является использование синтетических пептидов, моделирующих антигенные детерминанты белков вируса. Знание особенностей строения, предопределяющих активность и специфичность этих участков, позволяет более точно ориентироваться при поиске В-эпитопов в аминокислотной последовательности белка, а также формирует подходы к пониманию функционирования вирусов в живом организме.

Трудности анализа антигенных детерминант вируса гепатита А (ВГА) обусловлены их конформационной структурой. В связи с этим перспективным представляется использование более сложных нелинейных синтетических пептидов, в том числе и являющихся гетерогенными антигенами.

В настоящее время в клинической практике с целью диагностики ГС используются иммуноферментные тест-системы Ш и IV поколений, позволяющие выявлять антитела класса ^ О к ВГС. На стадии внедрения в практику здравоохранения России находятся тест-системы, позволяющие выявлять алЙ-НСУ класса ^ М. Однако эти тест-системы не позволяют оценить уровень иммунного ответа по отношению к отдельным белкам ВГС и к отдельным эпитопам этих белков. Выявление нуклеиновой кислоты вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) весьма информативно при проведении эпидемиологических исследований, однако будучи отдельно взятым, этот метод недостаточно информативен при оценке течения

заболевания у конкретного больного. в настоящее время принципиально

обследования больных гепатитом В (ГВ) например, которое носит гораздо более комплексный характер. Серологическое обследование больного ГВ -это по сути своей мониторинг различных маркеров, каждый из которых несёт свою информационную нагрузку (HBsAg, anti-HBcor Ig М, anti-HBcor Ig G, anti-HBs, HBeAg/anti-HBe). Предлагаемый нами комплексный подход к серологическому обследованию актуален для больных ГС не менее, чем для больных ГВ, прежде всего потому, что заболевание ГС значительно чаще переходит в хроническую форму, следовательно патологический процесс носит более сложный, более комплексный характер.

Применение пептидных моделей позволяет определять роль отдельных аминокислотных остатков в составе белков, соответствующих различным генотипам вируса гепатита С (ВГС), а также интерфероно-чувствительным и интерфероно-резистентным разновидностям одного и того же генотипа. Ряд авторов указывает на то, что выявление антител к отдельным антигенным детерминантам (белки и отдельные эпитопы) ВГС коррелирует с определенной фазой течения заболевания и позволяет оценить активность патологического процесса (А.Ю.Афанасьев с соавт., 1997; Е.А.Засильева, 1995; С.Н.Соринсон, 1997; Z.-X.7.hang et al., 1995). Однако такие исследования, как правило, либо ограничивались сопоставлением частоты выявления Ig G к core- и NS4-6ejreaM, либо их титров у различных групп больных, либо проводилось аналогичное сравнительное исследование частоты выявления Ig G и их уровня к отдельным фрагментам из последовательности структурных белков ВГС. В ходе проведения нашего исследования была сопоставлена частота выявления антител (как класса Ig G, так и класса Ig M) и их уровня к отдельным фрагментам вирусных белков у различных групп больных. Было также проведено исследование спектра антител в динамике у больных ГС с различными исходами заболевания. Были использованы наиболее значимые с точки зрения поставленной задачи антигенные детерминанты вирусных белков, выявленные в процессе исследования.

Вирус гепатита дельта - дефектный инфекционный агент, являющийся причиной тяжелых, часто летальных форм острого и хронического гепатитов и цирроза печени. Инфекционность HDV связана с HBV-инфекцией и реализуется в виде супер или коинфекции с последним. Вирион HDV содержит одноцепочечную циркулярную РНК 1,75 кб, упакованную высокоосновным, фосфорилированным по остаткам серина нуклеокапсидным

белком - антигеном вируса гепатита дельта (НОА£). Оболочка HDV состоит из поверхностного антигена вируса гепатита В (НВ8А£). HDV присутствует в крови и ткани печени инфицированных.

Специфическая диагностика вирусного гепатита дельта является актуальной проблемой здравоохранения. Первоначально в соответствующих, диагностикумах использовался вирусный антиген, выделяемый из ткани печени умерших от FD. Более эффективным и безопасным является использование генноинженерных препаратов или синтетических пептидов, моделирующих иммунодоминантные эпитопы НОА£. Использование рекомбинантного HDAg имеет свои недостатки. Рекомбинантные белки состоят из целевого протеина и дополнительных полипептидов, из-за которых иммуноферментная реакция иногда.дает ложноположительпые результаты. Синтетические пептиды легче и дешевле очистить, чем генноинженерные препараты. Поэтому тест-системы на основе синтетических пептидов более специфичны и заслуживают разработки и внедрения.

HDV распространен во всем мире. Известны нуклеотидные последовательности РНК HDV и аминокислотные последовательности HDAg, полученные из различных географических регионов. В соответствии с принятой классификацией, большинство таких последовательностей принадлежит к первому типу HDV. Второй тип, наряду с первым, встречается в Азии. HDV третьего типа циркулирует в Южной Америке. Данные о генотипах HDV, циркулирующих на территории РФ очень ограничены и противоречивы.

По одним данным расшифрованная нуклеотидная последовательность генома российского изолята HDV наиболее близка к последовательностям молдавских и болгарского изолятов, относящихся к генотипу Ш. По другим -нуклеотидные последовательности геномов HDV, кодирующих С-кояцевую часть HDAg и циркулирующих в Северо-Западном регионе России, относятся к ]Л генотипу HDV.

В диссертации представлены результаты серотшшрования HDV, циркулирующего на территории России, с помощью синтетических пептидов, моделирующих аминокислотные последовательности иммунодоминантного и вариабельного участков HDAg, соответствующих трем известным типам HDV.

ЦЕЛЯМИ диссертационной работы являются: - исследование антигенной структуры белков вирусов гепатитов А, С и дельта с помощью пептидных моделей фрагментов аминокислотной последовательности соответствующих вирусных белков;

- разработка тест-системы четвертого поколения для выявления апЙ-НСУ;

- разработка тест-системы для контроля спектра антител в динамике, что позволит выявлять антитела к различным эпигонам белков ВГС, и исследование особенностей сероконверсни антител к антигенным детерминантам структурных и неструктурных белков вируса гепатита С у больных с различными исходами острого гепатита С;

- разработка модификации метода иммуноферментного анализа для выявления типоспецифических anti-HCNS4 антител у больных гепатитом С;

- разработка новых иммуноферментных тест-систем для диагностики гепатита D на основе синтетических пептидов;

- оценка целесообразности использования гетерогенных тетрамерных мультипептидных антигенов при разработке новых тест-систем для выявления серологических маркёров ВГА.

Для достижения указанных целей были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. На основании компьютерного анализа гидрофильности и рассчета вторичной структуры аминокислотных последовательностей вирусных белков выбрать участки с потенциальной антигенной активностью.

2. Установить оптимальные условия проведения иммуноферментного анализа (ИФА) при использовании в качестве антигенов синтетических пептидов различной длины и вариабельности, моделирующих эпигоны из состава белков вирусов гепатитов А, С и дельта и провести анализ антителосвязывающей способности синтезированных пептидов.

3. На основе полученных результатов выявить наиболее перспективные с точки зрения поставленных целей пептидные фрагменты, моделирующие соответствующие участки аминокислотной последовательности вирусных белков.

4. Изучить спектр антител к разным группам антигенных детерминант структурных и неструктурных белков вируса гепатита С у больных с различными клиническими особенностями гепатита С в остром периоде, периоде реконвалесценцни и при различных исходах заболевания.

Методами, позволяющими реализовать поставленные задачи, являются: моделирование консервативных иммунодоминантных, а также вариабельных тшюспецифических эпитопов вирусных белков с помощью синтетических пептидов;

- иммуноферментное исследование антигенной активности пептидов с помощью сывороток больных различными вирусными гепатитами;

- метод множественного пептидного исследования (Multiple Peptide Assay (Z.-X. Zhang etal. 1995));

- исследование методом иммуноферментного анализа (ИФА) корреляции между наличием того или иного спектра антител к различным вирусным белкам, представленным разными антигенными детерминантами и клипико-биохимическим вариантом течения HCV-инфекщш;

- общие клинические методики, тестирование серологического материала на маркёры гепатитов А, В, С и дельта;

- биохимический анализ крови обследуемых больных;

- статистическая обработка полученных данных, в том числе оценка достоверности различий и вычисление коэффициента корреляции будут проводиться на основании критерия Сгьюдента.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

1. Сопоставлена частота выявления anti-HCV антител (как класса Ig G, так и класса Ig M) и их уровня к отдельным фрагментам вирусных белков у различных групп больных ГС.

2. Впервые проведено исследование спектра anti-HCV антител и их уровня в динамике заболевания у больных ГС с различными исходами. Для этого были выявлены и использованы наиболее значимые с точки зрения поставленной задачи антигенные детерминанты вирусных белков.

3. Новые иммуноферментные тест-системы для диагностики гепатита D разработаны на основе синтетических пептидов.

4. В процессе проведения исследования серологического материала, полученного от больных ГА, впервые были использованы гетерогенные тетрамерные мультипептидные антигены.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Наиболее эффективным антигеном с точки зрения скрининга anti-HAV-IgM позитивных сывороток среди использованных в данном исследовании

синтетических пептидных антигенов является MAP4(VP1+VP3).

Использование MAP4(VP1+VP3) для этой цели более эффективно, чем использование комбинации его составляющих - линейных пептидов VP1 и VP3, взятых по отдельности, или же его комбинации с его составляющими. При разработке новых тест-систем для ВГЛ использование гетерогенных тетрамерных мультипептидных антигенов, в том числе содержащих VP1 (1125) и VP3 (110-121), целесообразно.

2. Разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления anti-delta классов Ig G и Ig M в сыворотках крови. Тест-системы разработаны на основе синтетических пептидов, и позволяют выявлять маркёры дельта-инфекции у 100% обследованных больных ГД.

3. Наиболее перспективным среди синтезированных NSS-пептидов с точки зрения диагностики является наиболее полноразмерный пептид с последовательностью 2295-2317 а.о. Последовательность 2295-2317 а.о. белка NS5A HCV содержит как минимум два эпитопа, имеющих различную природу. Установлены оптимальные условия для проведения реакции с этим пептидом, позволяющие максимально полно использовать потенциал обоих эпигонов. Полученные результаты позволили включить пептид 2295-2317 в состав новой антигенной композиции, куда дополнительно также был включён синтетический пептид, дублирующий иммунодоминантный участок HCcAg, но более короткий, чем рекомбинантный HCcAg, также используемый. Подобное дублирование, характерное для тест-систем IV поколения, позволило увеличить чувствительность разработанной тест-системы.

4. Установлена корреляция между наличием того или иного спектра антител к различным вирусным белкам, представленным различными же антигенными детерминантами и клинико-биохимическим вариантом течения хронической HCV-инфекции. Б случае, если сыворотка пациента с хронической HCV-инфекцией не содержит Ig О к какой-либо из антигенных детерминант неструктурных белков вируса, использованных в настоящем исследовании, либо к обоим антигенным детерминантам core белка HCV, то с высокой степенью вероятности можно полагать, что данный пациент находится в состоянии клинико-биохимической ремиссии. Особенно выраженный характер данная закономерность имеет для пациентов, в сыворотке которых не содержится Ig G к обоим антигенным детерминантам NS4. Также установлено,

что наличие и в высоком титре характерно для больных

хроническим гепатитом С.

5. При исследовании сероконверсии антител к различным антигенам вируса гепатита С у больных ГС с различными исходами были установлены различия в динамике гуморального иммунного ответа в зависимости от дальнейшего, развития патологического процесса, в том числе и в острой фазе заболевания. Полученные данные представляют интерес с точки зрения их прогностического значения.

6. На основе тшюспецифических пептидов, моделирующих различные участки вариабельного региона N84 белка вируса гепатита С, была разработана тест-система для выявления тшюспецифических антител, появление которых в сыворотке крови больного характерно для ВГС соответствующего типа. В результате проведённого исследования по выявлению тшюспецифических апИ-НС№4 антител у больных гепатитом С с помощью разработанной тест-системы было установлено различие в циркуляции ВГС различных типов в Москве и Белоруссии (Витебск).

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ определяется полученной новой информацией об антигенной структуре исследованных детерминант вирусных белков, а также исследованием взаимного влияния синтетических пептидных антигенов, которое приводит к изменению их иммунохимических свойств на уровне взаимодействия антиген - антитело. В результате проведённого исследования установлены закономерности развития гуморального иммунного ответа у больных гепатитом С в зависимости от дальнейшего развития заболевания.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.

1. Сконструированы компоненты диагностикумов на основе синтетических пептидных антигенов вирусов гепатитов С и дельта, и их комбинаций с генноинженерными препаратами.

2. Выявлены различия в клиническом течении и исходах острого гепатита С у больных с различным спектром антител к иммунодоминантным участкам структурных и неструктурных белков вируса гепатита С.

3. Разработан новый подход к серологической диагностике ГС, основанный на динамическом контроле за спектром антител к вирусу гепатита С.

4. Разработаны методические рекомендации, содержащие дополнительные критерии оценки активности патологического процесса и сроков заболевания у пациентов с HCV-инфекцией.

5. Дана оценка принципиальной возможности использования мультипептидных гетерогенных структур для диагностики ГА-

АПРОБАЦИЯ.

Результаты исследований по теме диссертации были доложены на Фальк симпозиуме № 92 "Новые направления в гепатологии", Санкт-Петербург, Россия, 21-22 июня 1996; на 24 симпозиуме Европейского Пептидного Общества, Эдинбург, Великобритания, 1996; на Пятой международной конференции «СПИД, рак и связанные проблемы», Санкт-Петербург, Россия, 25-30 мая, 1997; на П Российской научно-практической конференции "Гепатиты В, С, D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, Россия, октябрь 1997; на научной конференции "Вирусные инфекции на пороге 21 века: эпидемиология и профилактика», С.-Петербург, Россия, 21-23 апреля 1999; на Ш Российской научно-практической конференции "Гепатиты B.C.D и G - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, Россия, июнь 1999; на научной конференции "Актуальные проблемы медицинской вирусологии», Москва, Россия, ноябрь 1999; на 2-й Объединенной Всероссийской и Всеармейской научной конференции "Санкт-Петербург -Гастро-2000", С.-Петербург, Россия, 20-22 сентября 2000; на научно-практической конференции "Гепатит С (Российский консенсус)", Москва, Россия, 26-27 сентября 2000; на IV Российской научно-практической конференции "Гепатиты В,С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, Россия, июнь 2001. В завершённом виде диссертационная работа была доложена на конференции отдела вирусных гепатитов и клинической вирусологии Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН в 2003 году.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

По материалам диссертационной работы опубликовано 10 научных статей в рецензируемых журналах и 21 сообщение в сборниках тезисов научных симпозиумов и конференций.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использовавшихся материалов и методов, 6 глав собственных исследований.

обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертация изложена на 200 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 рисунками и 36 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.Материалы и методы.

Пептиды были синтезированы в лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и пептидного синтеза Института вирусологии- им. Д.И.Ивановского РАМН под руководством профессора» д.х.н. В.А.Шибнева. Синтез пептидов для серологического исследования иммунодоминантиого участка нуклеокапсидпого белка вируса гепатита дельта проводился твердофазным методом с использованием трет-бутилоксикарбонил/бензил стратегии в соответствии с методикой, предложенной Ю.Л.Семилетовым с соавт. (1992). Всего на данном этапе работы было синтезировано 5 пептидов. Среди них полноразмерный пептид 65-80 (Gly-Glu-Gly-Ala-Pro-Pro-Ala-Lys-Arg-Ala-Arg-Hir-Asp-Gln-Met-Glu) и его укороченные фрагменты 69-80 и 71-80 соответствовали геномной последовательности, установленной ICS.Wang et al. (1986). 2 других пептида были синтезированы в соответствии с геномной последовательностью, установленной S.Makino et aL (1987), и имели аминокислотные последовательности 71-80* (Ala-Lys-Lys-Leu-Arg-Met-Asp-Gln-Met-Glu) и 73-80*. Обе данные аминокислотные последовательности соответствуют I типу HDAg.

Серологический материал для исследования иммунодоминантногоучастка нуклеокапсидного белка вируса гепатита дельта был представлен образцами сывороток 5 больных острым ГД, в том числе 2 больных из города Уральска (Северо-Западный Казахстан - №№ 1583 и 1706), 2 больных из города Ставрополя (Северный Кавказ - №№ 38 и 87) и 1 больного из города Ош (Киргизия - № 66). Наличие анти-дельта антител в данных образцах было установлено ранее методом ИФА на основе антигена, полученного из гомогената печени больного ГД.

Исследованиеиммунодоминантногоучасткануклеокапсидногобелка вируса гепатита дельта проводилось методом ИФА. В 96-луночных планшетах ("Linbro", Великобритания) сорбировались пептиды в концентрации от 10 до 100 мкг/мл и конъюгаты пептидов с BSA в концентрации 10 мкг/мл в

физиологическом растворе в течение ночи (overnight) при комнатной температуре. Затем планшеты были 4-хкратно промыты фосфатно-солевым раствором с тайном (ФСР-Т). Подобная отмывка имела место после каждого этапа проведения реакции. Первым таким этапом была предварительная 2-хчасовая инкубация с 5 % раствором BSA в ФСР-Т (5 % BSA-ФСРТ). Затем в лунки планшетов было внесено по 100 мкл сывороток в разведении 1:100 ФСР-Т с последующей инкубацией при 37°С в течение 1 часа. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело выявлялись коныогатом антивидовых антител против Ig G человека с пероксидазой хрена, с которым также проводилась инкубация при 37°С в течение 1 часа. Активность фермента, зафиксированного на твёрдой фазе в результате проведённой таким образом иммунологической реакции, проявлялась при внесении в лунки планшета 0,04 % раствора ортофенилендиамина в цитратном буфере. Реакция, катализируемая пероксидазой хрена, останавливалась добавлением в лунки планшета 50 мкл 10 % раствора H2SO4. После этого оптическая плотность (OD) раствора в лунках планшета измерялась на спектрофотометре "Labsystems Multiskan Plus" при . длине волны 490 нм. В качестве негативного контроля были использованы результаты реакции тех же антигенов с сыворотками крови неинфицированных людей.

Исследование антигенных свойств пептидов, соответствующих фрагментам последовательности белка нуклеокапсида HDV различных генотипов. Аминокислотные последовательности выбранных пептидных фрагментов из области 65-80 HDAg соответствовали опубликованным нуклеотидным последовательностям генома HDV I (Y.C.Chao et al., 1990), П (FJmazeki et al., 1991) и Ш (J.L.Casey et al., 1993) типов (рис. 1).

Пептиды синтезировали твердофазным методом в неавтоматизированном режиме в соответствии с методикой (Д.Стюарт, ДЛнг, 1971).

Исследование антигенныхсвойств дельта-пептидов методом непрямого твердофазного ИФА. Д ля исследования антигенных свойств синтезированных пептидных фрагментов из состава HDAg в Москве и Н.Новгороде были собраны две группы сывороток (группы А и Б), охарактеризованные на присутствие HBsAg (тест-система фирмы "ИмБио", НПО "Диагностические системы", Нижний Новгород), а также специфических анти-дельта антител (тест-система на основе рекомбинантного HDAg, НПО "Диагностические

генотип! ОБСАРРАККАКТПЯМЕ

^ЮМ^сс^^сс НОАв с с с с (I 1 I с с I 1 сс пептид

генотип П

.........р. . <г . .

гггс^^г^^гвв HDAg ссссМ111М1Мсс пептид

генотип Ш ЕР

Р. ЕТ .

Ьссс! I I I I И I ЬЬЬЬ ИОД с с с с I 1 1 1 I г! I ЬЬ Ь Ь пептид

Рис. 1. Первичная и предполагаемая вторичная (Р.У.СИои, О.Б.Ра8шап, 1978) структуры фрагментов 65-80 а.о. дельта-антигена, соответствующего I, П И Ш генотипам НОУ. Жирным шрифтом выделен аминокислотный мотив, постоянный для всех известных вариантов последовательностей HDAg. Вторичная структура изображена с помощью следующих обозначений: 1 - Р-изгиб; с - неупорядоченный клубок; Ь - а-спираль; 8 • р-складчатая структура.

системы", Нижний Новгород). Сыворотки для проведения данного исследования были предоставлены сотр. Нижегородского Государственного Университета им. Н.И Лобачевского В.К.Пяменовым.

Группа А - 19 сывороток. Из них 17 были получены от больных ГД с неявно выраженной клинической симптоматикой. Они содержали антитела, взаимодействовавшие с рекомбинантным HDAg, по данным ИФА, проведённого с тест-системой НПО "Диагностические системы" (Нижний Новгород). По одной сыворотке от доноров с диагнозом "гепатит А" и "гепатит В" использовалось в качестве отрицательного контроля.

Группа Б - 18 сывороток. Из них 16 были получены от больных ГД с явно выраженной клинической симптоматикой и содержали антитела, взаимодействовавшие с рекомбинантным (НПО "Диагностические

системы", Нижний Новгород). По одной сыворотке от доноров с диагнозом "гепатит А" и "гепатит В" использовалось в качестве отрицательного контроля.

ИФА. В лунки планшетов ("Dynatech hnmulon", США) сорбировались синтезированные пептиды (аминокислотная последовательность 65-80 и 7180), соответствующие последовательности HDAg I, П и Ш типов (рис. 1). При этом различные пептиды сорбировались в различные лунки планшета по 1 мкг в 120 мкл физиологического раствора. Сорбция проводилась в течение ночи при 20° С. После четырехкратпой отмывки 0.01М фосфатно-солевым буфером (рН 7.4) с 0.05% Tween-20 (ФСР-Т) перед внесением сывороток была проведена преинкубация с 5% раствором BSA в ФСР-Т в течение 2 ч при 20° С.

Затем планшеты четырежды промывали ФСР-Т и в лунки вносили исследуемые и контрольные серологические образцы в разведении 1:100 в ФСР-Т. Инкубация 1 ч при 37° С. После четырехкратной отмывки ФСР-Т в лунки планшета вносили раствор антивидового конъюгата Boehiinger Mannheim (Германия) (Anti-human y-chain IgG, меченые пероксидазой хрена) в ФСР-Т. Инкубация 1 ч при 37° С. Затем лунки планшета промывали пятикратно ФСР-Т, после чего вносился раствор ортофенилендиамина в цитратном буфере. Реакцию останавливали 10% серной кислотой. Оптическая плотность измерялась на автоматическом спектрофотометре "Multiskan plus" (США) при длине волны 492 нм. Антигенная активность пептидов анализировалась таким образом с сыворотками групп А и Б. Панель негативных сывороток состояла из 53 образцов, полученных от больных гепатитами А и В, негативных по анти-HDV. Данная панель была собрана в отделе клинической вирусологии и вирусных гепатитов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН на базе 1-ой клинической инфекционной больницы г. Москвы.

Разработка новых иммуноферментных тест-систем для диагностики гепатита D на основе синтетических пептидов. Пептиды были получены твердофазным методом по Fmoc-схеме, предусматривающей использование флюоренилметилоксикарбонильной (Fmoc) группы для временного блокирования а-аминогрупп. Таким образом были получены пептиды (рис. 2), моделирующие фрагменты иммунодоминантной области а.о. 53-94 HDAg - 5368, 65-80, 53-80, 71-93, граничащего с ней участка а.о. 89-108, а также вариабельной С-концевой зоны а.о. 201-213. Пептиды 53-68, 65-80 и 201-213 были получены в трех вариантах, соответствующих 3 известным генотипам HDV. Пептиды а.о. 53-80, 71-93 и 89-108 соответствуют HDAg Italy I (K.S.Wang et al., 1986), последовательность которого сходна на этих участках с последовательностями молдавского, шведского и болгарского HDAg I типа.

Сыворотки для исследования антигенных свойств синтезированных пептидных фрагментов HDAg были собраны в Москве (две группы), и охарактеризованы на присутствие HBsAg, а также специфических анти-дельта антител (диагностикумы фирм НПК "Препарат", «Вектор» и НПО "Диагностические системы", Нижний Новгород"). Группа сывороток В состояла, из образцов сывороток крови (п=43), полученных от пациентов с диагнозом "гепатит дельта". В группу сывороток Г были включены сыворотки от здоровых лиц без маркеров ГВ, ГС, ГД (п~49).

53-68-1NIKGILGKKDKDGEGA Moldavia 1 (Y.Y-Zhang el al.,1996) 53-68-2 NHGHR.KGKDGEGA Taiwan 3 (C-MXee et al., 1996) 53-68-3 NWGLLRRK.KDEDGA Peru 1 (JX.Casey et al., 1993) 65-80-1 GEGAPPAKRARTDRME Moldavia 1 (Y.Y-Zhang et al., 1996) 65-80-2 GEGAPPAKRPRTDQME Japan 1 (FJmazeki et al., 1991) 65-80-3 EDGAPPAKRPRQETME Peru 1 (J.L.Casey et al., 1993] 201-213-1 PADPP.FSPQSCRP Moldavia 1 (Y.YZbang et aL, 1996) 201-213-2 PPQQR.LPLLECTP Taiwan 3 (C.M.Lee et al., 1996) 201-213-3 PPPPGQQWVPGCTQ Peru 1 (JlXasey et al., 1993) 53-80 NDCGILGKKDKDGEGAPPAKRARTDQME (K-S.Wang et al., 1986) 71-93 AKRARTDQMEVDSGPRKRPLRGG (K.S.Wang et al., 1986) 89-108 PLRGGFTDKERQDHRRRKAL (K-S.Wang et al., 1986)

Рис. 2. Аминокислотные последовательности синтезированных пептидных фрагментов HDAg. Точками отмечены делении а.о. по отношению к последовательности HDAg Italy 1 (KS.Wang et al., 1986). В пептидах 201-213 CysJ" присутствуют в виде их S-ацетамидометильных (Асm) производных.

Антигенная активность пептидов была исследована методом непрямого твердофазного ИФА. Использовались плашки ВНИИМЕДПОЛИМЕР модернизированные. Сорбция по 1 мкг/100 мкл в лунку overnight в физиологическом растворе. Сыворотки 1:100 ФСР-Т. Anti-human Ig G/HRP конъюгат 1:12000 ФСР-Т, anti-human Ig M/HRP конъюгат 1:24000 ФСР-Т. Инкубация при 37° С по 1 часу.

Серологическое исследованиеэпитопов белка М85вирусагепатита С.

Пептиды синтезировали на твердой фазе в форме свободной кислоты на РАС-полимере фирмы MilliGen/Biosearch (США) с использованием 9-флуоренилметилоксикарбонил / трет-бутил / трет-бутилоксикарбонил (Ртос/Ви/Вос)-стратегии согласно (Ю.А.Семилетов с соавт., 1994). После отщепления от полимера действием трифторуксусной кислоты в присутствии тиоанизола, этандитиола и анизола пептиды очищали гель-хроматографией на сефадексе G-10 или G-15 и полупрепаративной обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Серологический материал. Исследование проводилось с двумя группами сывороток крови. Группа Д была сформирована из сывороток, охарактеризованных методом иммупоблотинга (LiaTek HCV Ш, Organon Teknika), позволяющем выявлять антитела к отдельным белкам вируса гепатита С(ВГС). В состав данной группы вошли сыворотки с наличием anti-HCV-45 образцов, в том числе с наличием антител к NSS-белку ВГС по данным иммуноблотинга LiaTek HCV Ш, Organon Teknika - 15 образцов. В группу Д был также включен 21 anti-HCV-негативный образец, охарактеризованный методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческой тест-системы Тепастрип" и 20 anti-HCV-негативных образцов, находящихся в так называемой "серой зоне" по данным ИФА и дополнительно охарактеризованных методом иммуноблотинга.

Группа Е была сформирована из сывороток крови находившихся под нашим наблюдением пациентов с хронической HCV-инфекцией (51 человек). Срок наблюдения составлял от 2 до 5 лет (ср. 3.5). По клинико-биохимическим показателям, основным из которых являлась активность АЛТ (аланинаминотрансфераза), эти пациенты были разделены на 2 подгруппы. Подгруппу Е1 (п-27) составили лица с картиной клинико-биохимической ремиссии длительностью не менее 1 года (1-5 лет), что подтверждалось нормальными значениями АЛТ. Подгруппу Е2 (п=24) составили пациенты с клинико-биохимической картиной хронического вирусного гепатита С (стойкая или флюктуирующая активность АЛТ). Подгруппы Е1 и Е2 были сопоставимы по полу, возрасту и длительности наблюдения.

Иммуноферментный анализ. В 96 луночные планшеты (Dynatech Immulon, USA) были сорбированы пептиды в физиологическом растворе в течение 18 часов при комнатной температуре. Затем планшеты четырехкратно отмывали фосфатно-солевым раствором с твином (ФСР-Т). В лунки с фиксированным

антигеном вносили по 100 мкл сывороток в разведении 1:100 (ФСР-Т), инкубировали 1 час при 37° С и отмывали как указано выше. Образовавшиеся иммунные комплексы выявляли с помощью меченых пероксидазой хрена антивидовых антител против IgG человека. Для проявления ферментативной активности применяли раствор ортофенилендиамина в цитратном буфере в концентрации 0,4 мг/мл. Реакция останавливалась добавлением 10% H2SO4. Степень поглощения (оптическая плотность - OD) регистрировали на автоматическом спектрофотометре при длине волны 492 нм.

Спектр антител к различным антигенам HCV при различных вариантах течения хронической HCV-инфекции. Пациенты. Спектр anti-HCV Ig G был исследован у 44 пациентов с хронической HCV-инфекцией. По клинико-биохимическим показателям, основным из которых являлась активность АЛТ, пациенты были разделены на 2 группы. Группу К (и=25) составили пациенты с картиной клинико-биохимической ремиссии (стойко нормальные показатели АлАТ) от 1 года до 5 лет. Группу составили

пациенты с клинико-биохимической картиной хронического гепатита С (стойкая или флюктуирующая активность АЛТ). Группы К (ПНАТ) и Л (ХГС) были сопоставимы по полу, возрасту и среднему сроку наблюдения (3,1 и 3,6 года, соответственно).

Детекция HCVPHK. В сыворотках крови больных обеих групп определяли РНК ВГС методом ПЦР и в положительных образцах определяли генотип. Всего было исследовано 44 серологических образца от 44 пациентов. Выявление РНК ВГС и её генотипирование проводились в лаборатории экологии вирусов парентеральных гепатитов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН под руководством д.б.н. Н.А.Селиванова.

Генотипы определяли методом ПЦР с использованием

типоспецифических праймеров на область гена core HCV, позволяющих идентифицировать эти генотипы вируса. Синтез к-ДНК проводили по стандартной методике, используя AMV RT (Promega).

Синтетические пептиды ирекомбинантные белки. В качестве антигенов использовали пептиды, синтезированные на твердой фазе согласно 9-флуоренилметилоксикарбонил / трет-бутил / трет-бутилоксикарбонил (Ртос/Ви/Вос)-стратегии, как это описано (ЮА-Семилетов с соавт., 1994), и рекомбинантные белки используемые в коммерческой тест-

системе Тепаскан" для выявления анти-ВГС антител в сыворотке крови,

которые были любезно предоставлены сотрудниками Института вирусных препаратов им. О.ГАнджапаридзе Л Л.Сухановой и ААТринёвым.

Серологическое тестирование. Исследования проводились методом ИФА, как это описано выше для серологического исследования эпитопов белка NS5 вируса гепатита С. ИФА с рекомбинантными белками проводился по стандартной методике для тест-системы Тепаскан". Предварительно ИФА был проведен с контрольной панелью сывороток, состоявшей из 33 анти-ВГС позитивных и 60 анти-ВГС негативных образцов.

Исследование сероконверсии антител к различным антигенам ВГС у больныхГСвпроцессеразвитиязаболевания.

Было обследовано 136 пациентов с желтушной формой острого ГС (ОГС). Больные ГС обследовались в разные сроки с момента начала заболевания - от 110 дня желтухи до 6-ти и более месяцев; в том числе 26 человек наблюдались 6 и более месяцев. Кроме того, было обследовано 43 пациента с HCV-инфекцией, наблюдавшихся в различные сроки с 1991 по 1998 годы (20 человек с ХГС и 23 человека с постоянно нормальным уровнем АлАТ при наличии anti-HCV). Исследования проводились методом ИФА, подобно тому, как это описано выше для серологического исследованияэпитопов белкаМ85вирусагепатита С. В качестве антигенов использовались синтетические пептиды соге-16, NS4-20 и NS5-23, моделирующие иммунодоминантные участки core, NS4 и NSS белков ВГС.

Выявление типоспецифическаяИ-НСЫ84 антителубольныхгепатитом С методом иммуноферментного анализа. Был синтезирован набор из 10

типоспецифических пептидов, моделирующих различные участки вариабельного региона белка ВГС, ограниченного аминокислотными

остатками 1683 - 1732. Этот набор был использован для разработки мультипептидной иммуноферментной тест-системы, позволяющей выявлять типоспецифические антитела к ВГС 1 типа (генотипы 1а и 1b), 2 типа (генотипы 2а и 2b) и 3 типа (генотип За). Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов соответствовали субтипам lb (NJKato et aL, 1990), 2a (H.Okamoto et al, 1991), 2b (H.Okamoto et al.„ 1992) и За Каждый из субтипов был представлен двумя

пептидами, условно обозначенными ИNS4^Г, и "NS4C" (рис.3). Пептиды

1689 N 1707 1711 С 1732

la SGKPAIIPPREVLYREFPEMEECSOHLPYIEOGMMLAEOFKOKA

1683 N 1705 1711 С 1732

lb VGRnLSGRPAVIPPREVLYOEFDEMEECASHLPYIEOGMOLAEOFKOKA

1683 N 170S 1711 С 1732

2a 1GRLHVNORAVVAPDKEVLYEAFDEMEECASRAALIEEGORIAEMLKSKL

1683 N 1705 1711 С 1732

2b IGRLIIL!4PRWVTPI>KEn,YEAFDEMEECASKAALIEKGORMAKMLKSKl,

1683 N 1705 1711 С 1732

За VGHIELGGKPALVPPREVLYOOYDEMEECSOAAPYIEOAOVIAHOFKEKV

Рис. 3. Аминокислотные последовательности синтезированных пептидов (подчёркнуты), моделирующих N- и С-участки вариабельного региона NS4 белка ВГС, ограниченного аминокислотными остатками 1683 - 1732.

синтезировали на твёрдой фазе (тефлон с радиацнонно привитым полистиролом) с использованием Boc/Bzl-стратепш, активированных эфиров и симметричных ангидридов Вос-аминокислот, как это более подробно описано (ЮА.Семилетов с соавт., 1993, 1994). После отщепления от полимера действием трифторметансульфокислоты в трифторуксусной кислоте в присутствии тиоанизола пептиды очищались гель-хроматографией на сефадексах G-10, G-15 и полупрепаративной обращбнно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Разработанная тест-система была апробирована с набором из 42 сывороток от 26 больных хроническим гепатитом С (ХГС) (Москва), которые были отобраны. методом случайной выборки и предварительно генотшшрованы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, специфичных для различных генотипов ВГС. Данный набор сывороток был любезно предоставлен - доцентами, кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ, кандидатами медицинских наук О.О.ЗБОЙКО И ЕАКлимовой. Набор был представлен, 24 образцами (57%) с РНК ВГС генотипа За, 10 образцами (24%) - с генотипом вируса 1b, 3 образцами (7%) -с генотипом 1а, и 2 образцами (5%) от пациентов с коинфекцией 2а/с. 3 образца были получены от больных ГС, у которых не удалось определить генотип ВГС методом ПЦР.

Пептиды сорбировались overnight в концентрации 1 мкг / 100 мкл физиологического раствора в лунку. В лунки с фиксированным антигеном вносили по 100 мкл сывороток в разведении 1:30 ФСР-Т. В остальном ИФА проводился подобно тому, как это описано выше для серологического исследования эпитопов белка NS5 вируса гепатита С.

Исследование ВГА-инфекции с помощью синтетических пептидов.

Пептиды, моделирующие антигенные детерминанты ВГА, были синтезированы старшим научным сотрудником лаб. антигенных детерминант и пептидного синтеза Т.В.Фирсовой в Department of Peptide & Protein Chemistry, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Centro de Investigation у Desarrollo (CID-CSIC), Барселона, Испания. Был синтезирован диэпитопный тетрамер МАР — MAP4(VP3+VP1) (рис. 4) с двумя ответвлениями каждой из двух аминокислотных последовательностей капсидных белков

Тетрамер был

синтезирован вручную на п-бензилоксибензил-полимере (полимер Wang, содержащий 0,8 мМ/г активных групп) согласно 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) стратегии. Полученный пептид очищался диализом и полупрепаративной обращённо-фазовой ВЭЖХ.

Серологический материал. Были исследованы 2 группы сывороток больных острыми вирусными гепатитами, собранные в Москве, в 1995 и 1996 гг. Первая группа (М) состояла из 33 сывороток крови больных ГА, 26 сывороток больных ГВ и 22 сывороток больных ГС. Все 33 анти-ВГА позитивные сыворотки содержали которые были выявлены как при использовании

соответствующей коммерческой тест-системы (Hofmann La Roche, Switzerland), так и при использовании лабораторной тест-системы, также выявляющей методом ИФА. Серологические маркёры ГВ и ГС

выявлялись, соответственно, с помощью коммерческих диагностикумов фирмы «Диагностические системы» (Нижний Новгород, Россия) и тест-системы «Гепаскан» фирмы «Биосервис» (Москва, Россия). Вторая группа сывороток (71 образец, группа Н) была исследована на наличие с помощью

коммерческой тест-системы фирмы «Диа-Плюс» (Москва, Россия). Anti-HAV Ig М были выявлены в 17 сыворотках группы Н.

Иммуноферментный анализ. Антигены. В качестве антигенов использовались следующие пептиды и их смеси:

I - линейный пептид VP1(11-25);

П-линейный пептид VP3(110-121); Ш- MAP4(VP1+VP3);

IV - комбинация пептидов 1+П;

V - комбинация пептидов 1+П+Ш;

а также HAV Ag - культуральный антиген ВГА, который был любезно предоставлен старшим научным сотрудником лаб. физиологии вирусов Института вирусологии им. ДЛИвановского РАМН, к.м.н. А.Б.Быченко.

Неконкурентный ИФА Пептиды и их смеси сорбировались в течение ночи при комнатной температуре в планшетах для иммунологических реакций Dynatech Immulon в концентрации 0,1 мкг/100 мкл в лунку в карбопатном буфере рН 9,4. После сорбции планшеты отмывались четырёхкратно ФСР-Т. Сыворотки вносились по 100 мкл в лунку, в разведении 1:100 в буфере, содержащем 0,05 М трис (рН 7,4), 0,89 % NaCl, 0,1 % твин-20 и 5 % BSA (TTBS), с последующей инкубацией в течение 1 часа при 37°С. После стандартной процедуры отмывки, связавшиеся с антигенами на

твёрдой фазе, выявлялись с помощью антивидовых козы,

меченых пероксидазой хрена ("Sigma"), в разведении 1:2000 TTBS в течение 1 часа при 37°С. Планшеты отмывались и в лунки вносилось по 100 мкл раствора OPD (0,4мг/мл) в нитратном буфере (рН 4,5). Реакция останавливалась добавлением 50 мкл 10 % H2SO4. OD измерялась при длине волны 492 нм. Уровень cut off рассчитывался как среднее значение OD для негативных контролей с высоким и с низким счётом (high negative and low negative), умноженное на коэффициент 2,2. Данный коэффициент для соответствующих контролей был рассчитан при проведении иммуноферментной реакции со всеми сыворотками группы М.

Сэндвич-ИФА. В лунки планшетов (Dynatech Immulon) было внесено по 100 мкл антивидовых anti-human-ц Ig G свиньи, разведённых 1:1000 PBS, рН 7,4.

сорбировались в течение ночи при комнатной температуре. После сорбции планшеты отмывались согласно стандартной процедуре (см. неконкурентный ИФА). Затем в лунки планшетов было внесено по 100 мкл сывороток в разведении 1:100 TTBS, которые инкубировались в течение ночи при комнатной температуре. После стандартной отмывки, в лунки планшета было добавлено по 100 мкл HAV Ag (культуральный супернатант, разведённый 1:10 RPMI с 10 % эмбриональной коровьей сыворотки), с последующей

инкубацией в течение ночи при комнатной температуре. После отмывки, образовавшиеся иммунные комплексы выявлялись с помощью меченых пероксидазой хрена, которые вносились по 100 мкл в лунку в разведении 1:1000 TTBS, и инкубировались в течение 1,5 часов при 37°С. Далее иммуноферментная реакция проводилась так, как это описано для неконкурентного ИФА. Cut off был рассчитан также, как это описано для неконкурентного ИФА.

Конкурентный ИФА с целью подтверждения специфичности полученных результатов проводился подобно тому, как проводился неконкурентный ИФА, за исключением этапа инкубации с сыворотками. Сыворотка (высокопозитивный контроль) в разведении 1:100 и 1:200 вносилась в лунки планшета порциями по 100 мкл, которые содержали 0,15, 030, 0,60, 1,25,2,5, 5,0 и 10,0 мкг/мл ингибирующего пептида. Степень нейтрализации (%) была рассчитана при сравнении уровней OD в результате проведения реакции в присутствии и в отсутствии ингибитора.

При проведении конкурентного ИФА с целью исследования антигенной активности пептидных смесей в лунки планшетов

сорбировалась смесь пептидов, содержащая пептиды каждый в

концентрации 1 мкг/мл (комбинация V), в карбонатном буфере (рН9,4), в

NH2-TVSTEQNVPDPQVGI-OH VP1-15 (а.о. 11-25)

NH2-FWRGDLVFDFQV-OH VP3-12 (а.о. 110-121)

Рисунок 4. Химическая структура и линейных пептидов

VP1-15h VP3-12.

течение ночи при комнатной температуре. Далее ИФА проводился подобно тому, как проводился неконкурентный ИФА, за исключением этапа инкубации с сыворотками. Сыворотки разводились 1:100 и вносились в лунки планшета порциями по 100 мкл, содержащими в концентрации 0,3 мкг/мл ингибитор — либо пептид Ш (MAP4(VP1+VP3)), либо комбинацию IV (I+П), либо-комбинацию V. Степень нейтрализации (%) была рассчитана при сравнении уровней OD в результате проведения реакции в присутствии и в отсутствии ингибитора.

Статистический анализ. Для сравнения использовали критерий Стыодента; различия признавали достоверными при р < 0,05.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУСА ГЕПАТИТА А.

В результате проведения ИФА с группой сывороток М было установлено, что наиболее эффективными антигенами, с точки зрения скрининга anti-HAV-IgM позитивных сывороток, среди синтезированных пептидов являются MAP4(VP1+VP3) и комбинация линейных пептидов VP1 и VP3. При этом надо учитывать, что МАР4, в отличие от комбинации линейных пептидов (IV), не давал ложнопозитивных результатов.

Дополнительно проводился сравнительный анализ антигенной активности и двух пептидных комбинаций при тестировании IgM-позитивных и anti-HAV-IgM-негативных сывороток (группа Н). Вопреки ожидаемым результатам, комбинация всех трёх пептидов (V) продемонстрировала меньшую антигенную активность по сравнению с и комбинацией линейных пептидов и в обоих

постановках.

Специфичность реакции антиген-антитело была подтверждена методом конкурентного ИФА.

На основании полученных результатов можно утверждать, что не только связь линейных аминокислотных последовательностей в одну молекулу (MAP), но также и их простая комбинация приводит к появлению новых иммунохимических свойств на уровне взаимодействия антиген - антитело. Это также подтверждают результаты конкурентного ИФА. Например, взаимодействие комбинации всех трёх пептидов (V) с в

наибольшей степени ингибировалось аналогичной комбинацией (V), в то время

как MAP и комбинация линейных пептидов, взятые по отдельности, продемонстрировали меньший ингибирующий эффект.

Таким образом, комбинация антигенов, адсорбированных на полистироловой поверхности, может рассматриваться как отдельный антиген со своими собственными антигенными свойствами, которые нетождественны сумме свойств его составляющих. Этот факт взаимного влияния пептидов вероятно можно объяснить некоторым изменением конформации линейных структур, которое приводит к экспозиции новых групп, взаимодействующих с антителами.

Наиболее эффективным антигеном с точки зрения скрининга anti-HAV-

позитивных сывороток среди использованных в данном исследовании синтетических пептидных антигенов является MAP4(VP1+VP3). Для взаимодействия по крайней мере части anti-HAV Ig М с антигенами ВГА необходима определенная конформация линейных структур этих антигенов. Использование для этой цели более эффективно, чем

использование комбинации его составляющих - линейных пептидов взятых по отдельности, или его комбинации с его составляющими.

Результаты настоящего исследования позволяют утверждать, что при разработке новых тест-систем для ВГА на основе синтетических пептидов, использование гетерогенных тетрамерных мультипептидных антигенов, в том числе содержащих целесообразно.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУСА ГЕПАТИТА D.

Методом ИФА было исследовано влияние изменения длины пептидной цепи и замен отдельных аминокислот на взаимодействие пептидов, соответствующих участку 65-80 а.о. дельта антигена, с антителами сывороток больных гепатитом дельта из различных регионов СНГ. В результате проведённого исследования установлена диагностическая ценность полноразмерного пептида 65-80 а.о. При этом полученные результаты позволяют сделать предположение о наличии не одного, а нескольких иммунодоминантных эгоггопов, в том числе и нелинейной антигенной детерминанты между 65 и 80 а.о. Это предположение основано на взаимодействие пептидов

1987), отличающихся 3 аминокислотными остатками, с одними и теми же анти-

дельта позитивными сыворотками. Это указывает на то, что антигенная детерминанта на этом участке является нелинейной, т.е. детерминантой, в последовательности которой не все аминокислотные остатки важны для специфического взаимодействия с антителами, и возможна замена отдельных аминокислотных остатков другими, близкими по свойствам и строению, с полным или частичным сохранением антигенных свойств.

Эти результаты, полученные в ходе предварительного исследования с использованием ограниченного количества позитивных сывороток

были подтверждены результатами дальнейшего исследования антигенных свойств пептидов, соответствующих фрагментам последовательности белка нуклеокапсида различных генотипов ЫБУ с большим количеством серологического материала.

С одной стороны, результаты ИФА показали, что полноразмерные пептиды, соответствующие а.о. 65-80, реагировали с большим количеством исследованных серологических образцов группы больных ГО с явно выраженными клиническими симптомами (группа Б), чем "укороченные" варианты 71-80. Эта зависимость, очевидно, обусловлена удалением а.о. из антигенно-активного участка. С другой стороны, в одной из опубликованных ранее работ было установлено, что пептидный фрагмент 61-71 не обладает существенной антигенной активностью (ЮАСемилетов с соавт., 1992). Сопоставление этого факта с полученными нами данными о снижении антигенной активности пептида 65-80 при удалении шести К-концевых а.о., позволяет нам утверждать, что хотя фрагмент 65-71 и не является самостоятельным эпитопом, но содержит аминокислотные остатки, имеющие существенное значение при формировании эпитона на участке 65-80 а.о. Анализ данных, полученных при исследовании антигенных свойств пептидов, соответствующих фрагментам последовательности белка нуклеокапсида различных генотипов ЫБУ, в общем и целом позволяет охарактеризовать наиболее широко распространенный на территории Центральной России среди больных гепатитом дельта вариант ЫБУ как относящийся к I типу. Пептиды 6580, соответствующие последовательности типов, прореагировали соответственно с 75, 87.5 и 50% сывороток больных ГО с явно выраженными клиническими симптомами, то есть аминокислотные замены в последовательности фрагмента 65-80, характерные для различных генотипов ЫБУ, не являются решающими для полного исключения

взаимодействия пептида определённого типа с антителами к HDAg других типов, хотя и влияют на уровень этого взаимодействия. Применять пептидные фрагменты 65-80 а.о. для титрования серологического материала в случае отдельно взятого конкретного больного, таким образом, было бы нецелесообразно, но данные, полученные на группе образцов, позволяют охарактеризовать распространенный на территории Центральной России вариант HDV как близкий I генотипу: интенсивность сигнала в ИФА для пептидов, соответствующих I генотипу вируса, в большинстве случаев преобладала над теми же величинами в случае пептидов, соответствующих HDV других генотипов. Также были получены данные, указывающие на возможность циркуляции на территории России новых, гибридных штаммов HDV, с мозаичной структурой отдельные участки которого

соответствуют или близки последовательностям различных типов. В сыворотке одного из нижегородских больных нами были выявлены антитела, взаимодействующие с пептидами 65-80 и 71-80 типа, но не с

пептидами, соответствующими аналогичным аминокислотным последовательностям НОА§двух других типов. В.К.Пименов и соавт. (2001), на основании полученных ими данных при проведении аналогичного исследования в Нижнем Новгороде, утверждают, что антигенная структура С-концевого фрагмента HDAg (201-213 а.о) в 10 % случаев была близка структуре HDAg Ш типа. В связи с этим представляет интерес обратиться к нашим данным, полученным при исследовании сыворотки больного 3 из группы московских больных ГД (группа В), иммуноферментная реакция с которой на дала слабопозитивный результат с пептидом 201-213

типа, и только с ним. Однако иммуноферментная реакция с этой же сывороткой на имела более выраженный характер с пептидом 53-

80, соответствовавшим I типу, что позволяет полагать результат, полученный с пептидом 201-213 Ш типа либо соответствующим нижегородским данным, либо не вполне специфическим. К сожалению, нижегородские исследователи не проводили исследования серологического материала на что не

позволяет в полной мере сопоставить наши данные, полученные при исследовании серологического материала московских больных ГД, и их данные. Однако, при исследовании того нижегородского материала, которым располагали мы, в сыворотке одного из нижегородских больных нами были выявлены взаимодействующие с пептидами 65-80 и 71-80

III типа, но не с пептидами, соответствующими аналогичным аминокислотным последовательностям HDAg двух других типов. При этом реакция антиген-антитело была достаточно выраженной и превышала уровень cut оАТболее чем в 3,5 раза. Это позволяет полагать, что мы действительно имеем дело с проявлениями циркуляции на территории России гибридных штаммов HDV с-мозаичной структурой отдельные участки которого соответствуют или

близки последовательностям различных типов. Для возникновения таких штаммов необходима определённая вероятность заражения различными типами

вгд.

Полученные косвенные данные о возможности циркуляции вируса с мозаичной структурой HDAg совпадают с данными J.-C. Wu et al. (1998), обнаружившими на Тайване ВГД с последовательностью HDAg, сходной с HDAg II типа по обоим концевым фрагментам и с HDAg I типа в центральной части аминокислотной последовательности (субтип ПВ).

В итоге проведённых нами исследований, на основе синтетических пептидов, входящих в состав иммунодоминантной области дельта-антигена, были разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления anti-delta классов в сыворотках крови.

Тест-система для выявления антител класса к вирусу гепатита

дельта была разработана на основе пептида а.о. 53-80.

Тест-система для выявления антител класса к вирусу гепатита

дельта была разработана на основе пептида а.о. 65-80 I типа. Полученные данные позволяют использовать тест на основе пептида 65-801 типа в качестве основного теста на а тест-систему на основе комбинации 4

пептидов а.о. 53-80, 53-68 и 65-80 I типа, а также 65-80 П типа - в качестве подтверждающего, и направлять на него сыворотки, OD по результатам реакции с которыми в основном тесте составит от 70 % до 100 % уровня cut off (т.н. «серая зона»). Всего такой комбинированный подход позволил выявить anti-delta Ig М у 88 % больных гепатитом дельта, в том числе у 21 % больных, в сыворотках которых с помощью соответствующих тест-систем

фирм «Вектор» и «НПК Препарат» выявить не удалось. В тоже время, все anti-позитивные сыворотки, выявленные с помощью данных тест-систем, были также выявлены и при применении разработанной нами комплексной диагностики.

Всего разработанные иммуноферментяые тест-ситемы позволили выявить маркёры дельта-инфекции у 100% обслсдованых больных ГД.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕННЫХ ДЕТЕРМИНАНТ ВИРУСА ГЕПАТИТА С.

При разработке иммуноферментных тест-систем третьего и четвертого поколений для диагностики ГС наряду с антигенами вирусных белков NS3, NS4 и белка нуклеокапсида ВГС используются антигены, аминокислотная последовательность которых соответствует иммунодоминантным участкам №5-белков.

Белок NS5a содержит большое число линейных В-клеточных эпитопов. Из 68 исследованных Yu.E.Khudyakov et al. (1987) синтетических пептидов, перекрывающих его аминокислотную последовательность, 30 оказались антигенноактивными, а наиболее высокую активность проявил пептид с последовательностью 2295-2313 а.с который прореагировал с 50% анти-ВГС-позитивных сывороток. Пептиды с близкой последовательностью (2303-2317) были описаны Zhu-Xu Zhang et al. (1995).

Нам представлялось интересным исследовать антигенную активность фрагмента, соответствующего 2295-2317 а.о. (I), перекрывающего эти последовательности, и сравнить его антигенную активность с активностью укороченных пептидов 2295-2313 (П) и 2303-2317 (Ш) с целью изучения антигенной структуры данного участка, и возможности использования пептидов из его состава в конструировании диагностических тест-систем.

Первоначальный эксперимент был проведён с наиболее полноразмерным пептидом (I), 2295-2317 а.о. Затем, с целью подбора оптимальных условий проведения реакции были отобраны две сыворотки высокопозитивная и слабопозитивная (№№ 405 и 410, соответственно) и две негативные, в том числе с наиболее высоким значением OD среди негативных сывороток по результатам предварительного эксперимента. В процессе подбора оптимальных условий была установлена интересная закономерность. В зависимости от изменения условий проведения реакции высокопозитивная сыворотка и сыворотка слабопозитивная "меняются местами". Эта тенденция носит более выраженный характер для пептида 2295-2317 а.о., чем для пептида 2295-2313 а.о. Как для сыворотки № 405, так и для сыворотки № 410 более высокий сигнал относительно фона был получен с пептидом 2295-2317 а.о.

При сопоставлении полученных данных с результатами взаимодействия сывороток с пептидом 2303-2317 а.о. было установлено, что в отличие от двух первых пептидов (I и П), сыворотка № 405 почти не содержит в, взаимодействующих с данным пептидом. В тоже время сыворотка № 410 дала наибольшее превышение сигнала над фоном именно при взаимодействии, с пептидом 2303-2317 а.о.

На основании полученных данных были сделаны следующие предварительные выводы: 1. Последовательность 2295-2317 а.о. белка N85 ЫСУ содержит как минимум два эпитопа, имеющих различную природу; 2. Следствием этого является то, что оптимальные условия проведения иммуноферментной реакции являются различными для различных сывороток; 3. Среди трёх исследуемых пептидов для диагностических целей наиболее целесообразно использование пептида I в концентрации 0,1 мкг/100мкл.

Группа сывороток, охарактеризованных методом иммуноблотинга (УаТек НСУ Ш, Ог^апоп Текшка) (группа сывороток Д), была проанализирована в подобранных оптимальных условиях. В результате удалось не только повысить по сравнению с предварительным экспериментом % выявляемых ап11-К55 позитивных сывороток, но и довыявить апИ-К85 позитивную сыворотку из числа позитивных образцов, не

содержащих апй-№>5 по данным и м м у н о б лЬЙГак фк р м ы О^апоп Текпка. При проведении исследования антигенной активности пептида I с сыворотками пациентов с хронической НСУ-инфекцией (группа Е), апЙ-К55 были выявлены у 56% пациентов в состоянии ремиссии и у 92% больных хроническим гепатитом.

Предварительный вывод о том, что последовательность 2295-2317 а.о. белка содержит как минимум два эпитопа, имеющих различную

природу, был подтверждён при проведении иммуноферментного анализа группы сывороток Д с каждым из трёх пептидов в различных условиях, являющихся оптимальными для различных сывороток. При- анализе полученных данных выявлена тенденция, в соответствие с которой сыворотки, реагирующие преимущественно с меньшей концентрацией сорбируемого пептида, реагировали преимущественно с пептидом 2295-2313 а.о., в то время как сыворотки, преимущественно реагирующие с большей концентрацией пептида, в большей степени реагировали с пептидом 2303-2317 а.о.

Отклонения от выявленной тенденции на уровне отдельных сывороток можно объяснить как соотношением в данных сыворотках антител к обоим эпигонам, так и наличием в обоих фрагментарных пептидах общего участка 2303-2313 а.о.

Итак, было установлено, что наиболее перспективным среди синтезированных -пептидов с точки зрения диагностики является наиболее полноразмерный пептид с последовательностью 2295-2317 а.о. На основании полученных данных было установлено, что последовательность 2295-2317 а.о. белка NS5A HCV содержит как минимум два эпитопа, имеющих различную природу. Были установлены оптимальные условия для проведения реакции с этим пептидом, позволяющие максимально полно использовать потенциал обоих эпитопов.

Полученные результаты позволили рассматривать пептид 2295-2317 как перспективный компонент разрабатываемой тест-системы для серологической диагностики гепатита С, и включить его в состав новой антигенной композиции. Разработанная тест-система IV поколения имеет общие компоненты с разработанной ранее в Институте вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН тест-системой П поколения (ЮАСемилетов с соавт., 199S) - а именно рекомбинантный. полипептид, включающий первые 150 аминокислот который был получен в лаборатории химии вирусных

нуклеиновых кислот и белков под руководством профессора, д.х.н. В Д.Смирнова, (НБЛетракова с соавт., 1997), и один из двух синтетических пептидов, соответствующий иммунодоминантному участку аминокислотной последовательности белка ВГС, хотя концентрация данных антигенов при сорбции была изменена относительно первоначальных условий (Ю.Л.Семилетов с соавт., 1998). Отличие новой тест-системы от ранее разработанной тест-системы П поколения состоит также в том, что использование второго синтетического пептида, соответствующего более вариабельному участку белка, на основании анализа результатов как настоящего исследования, так и исследования, проведённого ранее (ЮА.Семилетов с соавт., 1998), было признано нецелесообразным. В тоже время, как уже было сказано выше, в состав новой антигенной композиции был включён синтетический пептид а также синтетический пептид,

дублирующий иммунодоминантный участок но более короткий, чем

рекомбинантный также используемый. Подобное дублирование,

характерное для тест-систем поколения, позволило увеличить чувствительность разработанной тест-системы.

Целью следующего этапа нашего исследования было изучение корреляции между наличием того или иного спектра антител к различным вирусным белкам, представленным различными же антигенными-детерминантами и клинико-биохимическим вариантом течения хронической HCV-инфекции. Исследования проводились методом иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве антигенов были выбраны синтетические пептиды соте-16, NS4-20 и NS5-23, моделирующие иммунодоминантные участки core, NS4 и NS5 белков и рекомбинантные белки соге-114 и NS4-86. Эти рекомбинантные белки, используемые в тест-системе Тепаскан" для выявления анти- антител в сыворотке крови, были любезно предоставлены для этого исследования сотрудниками Института вирусных препаратов им. О.ПАнджапаридзе ЛЛ.Сухановой и ААХринёвым.

В результате проведённого исследования установлено, что в случае, если сыворотка пациента с хронической -инфекцией не содержит к какой-либо из антигенных детерминант неструктурных белков вируса, использованных в настоящем исследовании, либо к обоим антигенным детерминантам core белка то с высокой степенью вероятности можно

полагать, что данный пациент находится в состоянии клиникс-биохимической ремиссии. Особенно выраженный характер данная закономерность имеет для пациентов, в сыворотке которых не содержится к обоим антигенным

детерминантам Также установлено, что наличие и в

высоком титре характерно для больных хроническим гепатитом С.

После того, как были установлены различия в спектре антител к отдельным антигенам при различных вариантах течения хронической

HCV-инфекции, было решено выяснить, каким образом складывается подобная картина. С целью получить ответ на этот вопрос, было проведено исследование сероконверсии антител к различным антигенам ВГС у больных ГС с различными исходами.

Были выявлены следующие особенности сероконверсии. Для больных ГС с последующей ремиссией (рис. 5) характерно быстрое нарастание титра anti-core Ig G в течение первых 72 дней заболевания с достижением максимального уровня в период с 72 по 120 день заболевания и последующим спадом вплоть до полного исчезновения антител к 10 — 13 месяцу заболевания. Сероконверсия

anti-NS4 Ig G имеет свои особенности. У больных ОГС уровень anti-NS4 Ig G нарастает весьма быстрыми темпами вые зависимости от последующей судьбы больного. У пациентов с последующей ремиссией уровень anti-NS4 Ig G достигает максимальных значений к 72 - 120 дню заболевания. Затем уровень anti-NS4 Ig G довольно быстро снижается с 8 по 10 месяц заболевания, или в более ранние сроки, с последующим постепенным снижением до минимальных значений. У больных ОГС с последующей ремиссией уровень минимален, либо anti-NS5 Ig G отсутствуют. Впоследствии, в процессе ремиссии, исчезают у тех пациентов, у которых они были в

остром периоде, и могут появиться у тех пациентов, у которых их не было в остром периоде. Уровень anti-NS5 Ig G, появляющихся в процессе ремиссии, также минимален. У некоторых больных ГС с последующей ремиссией Ig G, в отличие от anti-NS4 Ig G, могут так и не появиться ни в остром периоде, ни в процессе ремиссии.

Для больных ГС с последующей хронизацией (рис. 6) характерно менее быстрое нарастание титра anti-core Ig G в течение первых 6-7 месяцев заболевания. Затем начинается стремительный рост титра антител с достижением максимального уровня к 8 - 12 месяцу. При этом максимальный уровень у больных оказывается, как правило, значительно

выше, чем максимальные значения у больных ОГС с последующей ремиссией. Но уже слишком поздно. Запоздалый иммунный ответ не спасает, и высокие показатели гуморального иммунного ответа в этом случае служат всего лишь индикатором активности патологического процесса. После 12 месяца заболевания у большинства больных ХГС уровень anti-core Ig G снижается, но полностью антитела не исчезают. Впоследствии уровень anti-core Ig G у больных ХГС, как правило, коррелирует с активностью патологического процесса.

У больных с последующей хронизацией средневзвешенный срок достижения своего максимума - 6 - 7 месяцев, однако у некоторых

таких больных уровень антител может быть максимален уже в первые 12 дней заболевания. Впоследствии уровень anti-NS4 Ig G у больных ХГС, как правило, коррелирует с активностью патологического процесса. Для больных ГС с последующей хронизацией характерно постепенное нарастание уровня Ig G, который достигает своего максимума к 8 - 14 месяцу заболевания. Однако, у отдельных больных ОГС с последующей хронизацией уровень

NS5 Ig G может быть относительно высоким уже в первые 12 дней заболевания. Таким образом, можно утверждать, что высокий и относительно высокий уровень в любом случае является неблагоприятным признаком.

Впрочем, как и почти во всём, что касается гепатита С, признак этот не является абсолютным. Среди больных ГС с последующей хронизацией также есть и. такие больные, у которых не удалось выявить ни в остром

периоде, ни в более поздние сроки - в отличие от

Как у больных ГС с последующей ремиссией (рис. 7), так и у больных ГС с последующей хронизацией, anti-core Ig М могут быть, а могут и не быть. Тем пе менее, сероконверсия этого маркёра имеет некоторые различия в этих двух группах больных. У больных ГС с последующей ремиссией были

выявлены только в течение первого месяца заболевания. У некоторых больных ГС с последующей ремиссией М выявлялись до 7 месяца

заболевания включительно. Впрочем, относительно высоким уровень Ig М у таких больных был только в течение первого месяца заболевания. Что касается то их не удалось выявить ни у одного из больных ГС с

последующей ремиссией. Только одна сыворотка дала повышенное значение OD при учете результатов иммуноферментной реакции, однако это значение OD находилось в пределах «серой зоны».

У больных ГС с последующей хронизацией (рис. 8) anti-core Ig М могут сохраняться в течение неопределённо длительного периода, исчезать и появляться вновь при обострении ХГС. Таким образом, наличие в

сыворотке крови больного после первого месяца заболевания можно считать неблагоприятным признаком, хотя, также как и в случае с этот

признак нельзя считать абсолютным, так как не у всех больных ГС имеет место сероконверсия Тоже самое можно сказать про У

части больных ОГС с последующей хронизацией anti-NS5 Ig М были выявлены. В процессе хропизации заболевания anti-NS5 Ig М у таких больных могут исчезать и появляться вновь. Таким образом, согласно нашим данным, наличие у больного ГС является однозначно неблагоприятным признаком. Что касается отсутствия то сделать однозначный вывод нельзя,

так как хотя согласно вашим данным отсутствуют у больных ГС

с последующей ремиссией, они также отсутствуют у части больных с последующей хронизацией заболевания.

О —I—I—I—I—I—I—1—I—I—1—I—I—I—I—I—I—I—г" 1 4 7 Ю 13 16 13 гг 25 28 3! 34 37 40 43 46 4Э 52 55

Рис. 5. Сероконверсия анти-ВГС ДО у больных ОГС с последующей ремиссией.

по осям ординат — величины оптической плотности; по осям абсцисс — дни болезни х 12. / — анти-соге ДО; 2 — акги^ЗД ДО; 3— анти-^5 ДО.

/ 4 7 го 13 16 1Э гг 25 28 31 34 3740 43 46 43 52 55

Рис.6. Сероконверсия анти-ВГС ДО у больных ОГС с после дующей хронизацией.

по осям ординат — величины оптической плотности; по осям абсцисс — дни болезни * 12. • / — анти-соге ДО;2— анти-№4 ДО;.?-анти^55 ДО.

______36

Таблица № 1.

Прогностическое значевие особенностей сероконверсии у больных ГС.

Серологические маркёры Благоприятные признаки Неблагоприятные признаки

Anti-core Ig М Отсутствие anti-core Ig M в сыворотке крови больного после. первого месяца заболевания. Наличие anti-core Ig М в сыворотке крови больного после первого месяца заболевания.

Anti-NS4 Ig М Отсутствие anti-NS4 Ig М после 7 месяца заболевания. Низкий уровень anti-NS4 Ig М после первого месяца заболевания. Наличие anti-NS4 Ig М после 7 месяца заболевания. Относительно высокий уровень anti-NS4 Ig М после первого месяца заболевания.

Anti-NS5 Ig M Отсутствие anti-NS5 Ig М. Наличие anti-NS5 Ig М.

Anti-core Ig G Быстрое нарастание уровня anti-core Ig G в течение первых 72 дней заболевания с достижением максимального показателя в период с 72 по 120 день заболевания и последующим спадом вплоть до полного исчезновения антител к 10-13 месяцу заболевания. Постепенное нарастание уровня anti-core Ig G в течение первых 6-7 месяцев заболевания. Стремительный рост уровня anti-core Ig G после 6-7 месяца заболевания с достижением максимального показателя к 8 -12 месяцу. Наличие anti-core Ig G в дальнейшем.

Anti-NS4 Ig G Снижение уровня anti-NS4 Ig G после 8 месяца заболевания или в более ранние сроки. Высокий уровень anti-NS4 Ig G после 8 месяца заболевания.

Anti-NS5 Ig G Минимальный уровень anti-NS5 Ig G, особенно после первого месяца заболевания, или их отсутствие. Высокий и относительно высокий уровень anti-NSS Ig G.

Установленные различия в динамике гуморального иммунного ответа можно сформулировать в виде таблицы № 1. При этом необходимо иметь ввиду, что ГС не является типичной инфекцией подобно ГВ, например, а имеет ряд особенностей, характерных скорее для медленных инфекций. Поэтому гуморальный иммунный ответ на ту или иную отдельно взятую антигенную детерминанту вируса у отдельно взятого больного может быть и нетипичным для того или иного варианта развития заболевания. Поэтому для клинического

прогноза имеет значение совокупность нескольких благоприятных или неблагоприятных признаков из перечисленных в таблице.

Необходимо также иметь в виду то, что когда мы говорим об

речь не идет о суммарном гуморальном иммунном ответе ко всем антигенным детерминантам вирусных белков core, Данные литературы и наших собственных исследований свидетельствуют о том, что для оценки гуморального иммунного ответа на тот или иной вирусный белок может иметь некоторое значение, какие именно антигенные детерминанты данного белка для этого используются (ОЗ.Масалова с соавт., 2000; И.В.Круглов с соавт., 2002). При этом результаты нашего исследования позволяют утверждать, что использование с этой целью отдельных иммунодоминантных участков вирусных белков предпочтительнее использования более протяжённых фрагментов аминокислотной последовательности или же полноразмерных белков вируса. В настоящем исследовании нами были использованы наиболее значимые с точки зрения поставленной задачи антигенные детерминанты вирусных белков, выявленные в процессе исследования. Актуальность такого подхода оказалась особенно значимой для установленных нами в процессе настоящего исследования закономерностей сероконверсии В результате, вопреки довольно

широко распространённому в научной литературе мнению, согласно которому anti-NS4 Ig G в острую фазу ГС отсутствуют (АЮАфанасьев с соавт., 1995; И.В.Шахгильдян с соавт., 2003), нами были установлены иные закономерности сероконверсии согласно которым у больных ОГС уровень

нарастает весьма быстрыми темпами вне зависимости от последующей судьбы больного. При этом, хотя в течение острого периода anti-выявляются достоверно чаще, чем наиболее

частым вариантом спектра при ОГС, также как при ХГС, является

одновременное присутствие После того, как

данные результаты были получены, для нас стал актуальным вопрос о том, отличается ли чем-либо, и если да, то чем именно, серологическая картина обычного ОГС от ОГС на фоне давнего инфицирования ВГС. С целью получить ответ на этот вопрос, нами были отдельно проанализированы результаты, полученные при исследовании материала, полученного в первые 10 дней желтушного периода, от двух групп больных ОГС - употребляющих наркотики внутривенно 1 год и более до начала заболевания (а - 17), и начавших

употребление наркотиков в течение б месяцев, предшествующих началу заболевания (п = 34).

В результате проведённого исследования было установлено, что в первые 10 дней заболевания среди больных ОГС частота выявления anti-NS4 Ig G достоверно выше у пациентов, более длительно употребляющих

наркотики (76,5 %), по сравнению с пациентами, начавшими употребление наркотиков в течение б месяцев, предшествующих началу заболевания (47,1 %). Данные клинического и биохимического обследования, а также частота выявления anti-core (70,6 % и 76,5 %, соответственно) и anti-NS5 IgG ( 47,1 % и 44,1 %) не зависят от данного показателя. Выявленную закономерность можно объяснить более высокой вероятностью суперинфекции различными штаммами пациентов, длительно употребляющих наркотики, которые могли перенести первичную HCV-инфекцию в безжелтушном варианте. В принципе, полученные данные согласуются с данными ЕЛ.Васильевой (1995), предлагавшей учитывать высокий титр как признак давнего

инфицирования ВГС. Давнее инфицирование ВГС, как указывает ЕАВасильева (1995), может иметь место и как фон при суперинфекции ВГС, и как ХГС после того, как ОГС был перенесён без клинической манифестации. Можно утверждать, что в случае нашего исследования выявленные закономерности связаны именно с суперинфекцией ВГС, так как больные были нами исследованы в первые 10 дней желтушного периода, обострения же ХГС, как правило, не сопровождаются желтухой. Для того, чтобы иметь возможность полноценного сравнения полученных нами данных с данными ЕА-Васильевой (1995), было проведено сравнение двух вышеупомянутых групп больных ОГС не только по частоте выявления но также и

по уровню этих антител. В результате (рис. 9) было установлено, что у пациентов, начавших употребление наркотиков внутривенно в течение 6 месяцев, предшествующих началу заболевания, уровень в первые

10 дней желтушного периода статистически достоверно (р < 0,01) превышал уровень anti-NS5 Ig G. У пациентов, более длительно употребляющих наркотики (1 год и более), превышение уровня относительно

уровня не являлось статистически достоверным. Само по себе это

могло бы говорить о том, что в процессе развития заболевания уровень anti-будучи изначально более низким, чем уровень либо

нарастает быстрее последнего, «догоняя» его, либо уровень anti-core Ig G

/ !

Рис. 9. Anti-core, anti-NS4 и anti-NS5 Ig О у больных ОГС в первые 10 дней заболевания в зависимости от длительности внутривенного употребления наркотиков до начала заболевания.

успевает пройти свой максимум, и начать падать к тому моменту, когда уровень anti-NSS Ig G достигает своего максимума. Наши исследования показали (рис. 6), что в большинстве случаев действительности соответствует второе предположение.

Нам не удалось установить, что в первые 10 дней заболевания у пациентов, употребляющих наркотики не более полугода, превышение уровня anti-core Ig

относительно уровня носило статистически достоверный

характер, равно как и обратное соотношение у больных, более длительно употребляющих наркотики. Впрочем, ЕАВасильева (1995) также не настаивает на том, что её соответствующие данные носят статистически достоверный характер. Тем не менее, нами была выявлена тенденция к различию (Т = 1,92) по уровню при сравнении обследованных нами двух групп

пациентов между собой. Кроме того, была выявлена тенденция к различию (Т -1,97) по соотношению anti-NS4 Ig G и anti-NS5 Ig G у пациентов, более длительно употребляющих наркотики внутривенно, в то время как среди

пациентов, начавших аналогичное употребление наркотиков не более чем за полгода до развития заболевания, такой тенденции не было. Характерно, что статистически достоверного различия между уровнями

в начале заболевания у пациентов, более длительно употребляющих наркотики, не было обнаружено, несмотря на почти двукратное превышение уровня относительно в среднестатистическом случае

у таких больных, в результате того, что ошибка средней m для anti-NS4 Ig G также превышала таковую для почти в 2 раза. Это можно

объяснить тем, что само по себе длительное употребление наркотиков не является необходимым и достаточным условием для суперинфекции. Поэтому, хотя вероятность суперинфекции в данной группе больных существенно выше, нельзя утверждать, что данная группа состоит только из суперинфицированных.

Всё это совпадает с результатами наших исследований (рис. 5, б), которые показали, что уровень при развитии заболевания нарастает

наиболее быстрыми темпами, и, впоследствии, сохраняется наиболее длительно, в том числе и в случаях ремиссии и реконвалесценции. Поэтому, веб-таки можно считать маркером давнего инфицирования, но только в тех случаях, когда уже в начале заболевания выявляется их высокий уровень. Это характерно для -суперинфекции на фоне давнего

инфицирования ВГС, как в случае нашего исследования. Также, судя по результатам наших исследований (рис. 6), выявленные закономерности будут характерны и для случаев обострения ХГС после перенесённого без клинической манифестации ОГС.

Генотипирование вируса гепатита С в настоящее время проводится с использованием полимеразной цепной реакции. Высокая себестоимость и относительная сложность этого метода не позволяют достаточно широко применять его в практическом здравоохранении. Типирование более

дешёвым методом иммуноферментного анализа позволяет решить эту проблему. Кроме того, данные ИФА позволяют идентифицировать тип ВГС в том числе и в тех случаях, когда вирус отсутствует в сыворотке крови или лейкоцитарной фракции.

С помощью разработанной тест-системы для типирования anti-HCV, в 85% генотипированных сывороток крови московских больных ХГС были обнаружены типоспецифические антитела, соответствующие генотипам,

идентифицированным методом ПЦР. В 3 образцах (8%), полученных от больного с генотипом вируса За по данным ПЦР, были выявлены антитела 1 типа. Так как ПЦР проводилась только с первичной сывороткой данного больного, а типоспецифические антитела были выявлены в каждой из трёх сывороток, с высокими значениями оптической плотности по данным ИФА и-отсутствием выраженного перекрестного реагирования с пептидами других типов, расхождение данных ПЦР и ИФЛ в случае этого больного мы объясняем технической ошибкой при проведении ПЦР. Также были серотипированы все 3 образца, которые не удалось генотипировать методом ПЦР. Среди них был выявлен 1 серопозитивный образец 1 типа и 2 серопозитивных образца 3 типа. В 3 (8%) из 39 генотипированных образцов выявить типоспецифические антитела не удалось. При этом в одном из этих трёх случаев (сыворотка О6СЗ) выявить типоспецифические антитела удалось в последующей сыворотке (0611), полученной от этого же больного. Только у одного пациента типоспецифические антитела выявить не удалось ни в первичной, ни в последующей сыворотке (сыворотки 06С1, 0617). Таким образом, генотшшрование сывороток методом ПЦР было эффективным в 88 % (23/26) случаев, в то время как серотипирование методом ИФА - в 93 % (39/42). Этот показатель сопоставим с эффективностью серотипирования по данным российских и зарубежных источников (88,4% - И~А.Созина (1999), 89% - Zhu-Xu Zhang et al. (1995)). Эффективность же типирования сывороток пациентов при комплексном применении методов ПЦР и ИФА в нашем исследовании составила, таким образом, 100%.

Таким образом, ПЦР и ИФА можно считать взаимодополняющими методами, особенно с учётом того, что данные ИФА позволяют идентифицировать тип ВГС в том числе и в тех случаях, когда вирус отсутствует в сыворотке крови или лейкоцитарной фракции, не прибегая при этом к пункционной биопсии печени.

С помощью разработанной тест-системы было проведено исследование по выявлению типоспецифических антител в сыворотках крови больных ХГС из Белоруссии (Витебск). Группа больных ХГС была собрана в Витебске методом случайной выборки, также как и группа больных ХГС в Москве. Однако, витебская и московская группа больных оказались при этом неоднородными по возрастному составу. Это явилось следствием различий в эпидемическом процессе ГС в Москве и Витебске. В Москве в 1995-99 годы по данным

Н.В.СадиковоЙ (2001) заражение ГС в результате внутривенного введения наркотических препаратов происходило в 48,9 % случаев и только в 7,2 % в лечебно-профилактических учреждениях. Если же интерпретировать данные вышеупомянутого автора за вычетом случаев ГС с не установленным путём передачи (которые, в свою очередь, с высокой степенью вероятности являются заражением в результате парентерального введения наркотиков и половых контактов), то мы получим долю передачи ВГС в Москве в эти годы за счет внутривенного введения наркотиков с нарушением стерильности среди случаев с известным путём заражения 60 %. В тоже время в Белоруссии внутривенное введение наркотиков не играло значительной роли в передаче ВГС. Более значительную роль в передаче вируса в Белоруссии продолжал играть такой путь, как заражение при переливании крови и препаратов на основе донорской крови, что связано с недостаточно высокой чувствительностью используемых тест-систем. В тоже время сдерживающим фактором для данного, основного пути передачи вируса в Белоруссии, является недостаточное финансирование донорства и, как следствие, частое использование в качестве доноров родственников реципиента. В результате уровень заболеваемости ГС в городе Витебске в 1996 - 2000 гг. был значительно ниже уровня заболеваемости в Москве. Различия эпидемического процесса обусловливают, в свою очередь, различную возрастную структуру больных ГС в Москве и в Витебске, что и отразилось на возрастном составе витебской и московской групп больных ХГС, собранных методом случайной выборки.

Среди витебских больных ХГС тшюспецифические антитела 1 типа были выявлены у 81 % серотипопозитивных больных, антитела 2 типа - у 2 %, и антитела 3 типа - у 29 %. Эти данные были сопоставлены с данными, полученными в ходе описанного выше исследования московских больных ХГС, согласно которым антитела 1 типа были выявлены у 44% серотипопозитивных больных, антитела 2 типа - у 4%, антитела 3 типа - у 52 %. В результате было установлено статистически достоверное различие 0,01) частоты выявления апИ-ЫСУ 1 типа в Москве и Витебске. Что касается 3 типа, то хотя с учетом выявленных в Витебске случаев микст-инфекции разными типами вируса (9 %) различие не является достоверным (р > 0,05), однако можно говорить о тенденции к различию (1 = 1,86). Таким образом, в результате проведённого нами исследования с помощью разработанной тест-системы для серотипирования, было установлено различие

в циркуляции ВГС в Москве и Витебске в 1999 голу (период сбора серологического материала). Это различие заключается в том, что ведущая роль в инфицировании больных ХГС в Витебске в этот период принадлежала ВГС 1 типа позитивных при 29% позитивных, в

то время как в Москве ведущая роль в инфицировании больных ХГС-принадлежала ВГС как 1, так и 3 типа, с незначительным доминированием последнего позитивных при 52%

0,05). На основании полученных данных был сделан вывод о том, что в 1998 году в Москве, и, вероятно - в других крупных российских городах уже начался процесс увеличения доли генотипа За ВГС среди циркулирующих генотипов вируса за счёт проникновения ВГС За генотипа в среду внутривенных наркоманов нового, молодого поколения и быстрого распространения вируса в этой среде. В то время процесс этот, также как и процесс распространения внутривенного употребления наркотиков, по видимому ещё не успел с той же степенью интенсивности охватить менее крупные российские города и города стран СНГ. В результате нам удалось в 1999 году выявить это различие на примере Москвы и Витебска.

ВЫВОДЫ:

1. Установлено, что наиболее эффективным антигеном с точки зрения скрининга позитивных сывороток, среди использованных в данном исследовании синтетических пептидных антигенов, является

- тетрамерный гетерогенный мультипептидный антиген. При разработке новых тест-систем для диагностики ГА, использование гетерогенных тетрамерных мультипептидных антигенов, в том числе содержащих целесообразно.

2. Наиболее широко распространенный на территории Центральной России среди больных гепатитом дельта вариант ЫБУ относится к I типу. Получены данные, указывающие на возможность циркуляции на территории России новых, гибридных штаммов ЫБУ, с мозаичной структурой НОА^ отдельные участки которого соответствуют, или близки последовательностям различных типов.

3. Установлена диагностическая ценность пептида 65-80 а.о., соответствующего иммунодоминантному участку нуклеокапсидного белка вируса гепатита дельта. При этом полученные результаты позволяют

предполагать наличие не одного, а нескольких иммунодомянантных эпитопов, в том числе и нелинейной антигенной детерминанты между 65 и 80 а.о. На основе синтетических пептидов разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления в сыворотках крови,

позволяющие выявлять маркёры дельта-инфекции у 100% обследованных больных ГД.

4. Установлено, что среди синтезированных пептидов, моделирующих фрагменты аминокислотной последовательности белка наиболее перспективным с точки зрения диагностики является полноразмерный пептид с последовательностью 2295-2317 а.о. Последовательность 2295-2317 а.о. белка КБ5А НСУ содержит как минимум два эпитопа, имеющих различную природу. Установлены оптимальные условия для проведения реакции с этим пептидом, позволяющие максимально полно использовать потенциал обоих эпитопов. Полученные результаты позволили использовать пептид 2295-2317 в качестве компонента разработанной тест-системы поколения для серологической диагностики гепатита С, включив его в состав новой антигенной композиции, куда дополнительно также был включён синтетический пептид, дублирующей иммунодоминантный участок но более короткий, чем рекомбинантный также используемый. Подобное дублирование, характерное для тест-систем поколения, позволило увеличить чувствительность разработанной тест-системы.

5. Впервые установлены закономерности сероконверсии аШ1-К84 в, согласно которым у больных ОГС уровень апй-К84 в нарастает весьма быстрыми темпами, вне зависимости от последующей судьбы больного. При этом, хотя в течение острого периода выявляются достоверно чаще, чем наиболее частым вариантом спектра при ОГС, также как при ХГС, является одновременное присутствие апй-соге, апй-КМиапй"^.

6. Установлено, что среди больных ОГС частота выявления в начале желтушного периода среди пациентов, употребляющих наркотики внутривенно не менее 1 года, достоверно выше по сравнению с пациентами, начавшими употребление наркотиков в течение 6 месяцев, предшествующих началу заболевания. Выявлена тенденция к различию (Т 1,92) по уровню апй-Ы54 ^ О при сравнении обследованных нами двух групп пациентов между собой. Впоследствии уровень сохраняется

наиболее длительно, в том числе и в случаях ремиссии и реконвалесценции. Поэтому anti-NS4 Ig G можно считать маркёром давнего инфицирования, в том числе - суперинфекции ВГС, в тех случаях, когда уже в первые 10 дней заболевания выявляется их высокий уровень. Данные клинического и биохимического обследования, а также частота выявления

в первые 10 дней заболевания не зависят от степени риска давнего инфицирования.

7. Впервые установлено, что у пациентов, не имеющих в анамнезе факторов риска давнего инфицирования ВГС (более 6 месяцев, предшествующих началу заболевания), уровень anti-core Ig G в первые 10 дней желтушного периода статистически достоверно (р < 0,01) превышает уровень anti-NS5 Ig G. На основании этого можно утверждать, что соотношение не менее 3,5 в первые 10 дней желтушного периода является статистически достоверным признаком отсутствия давнего инфицирования ВГС.

8. Установлена тенденция к различию (Т = 1,97) по соотношению anti-NS4 Ig G и anti-NS5 Ig G у пациентов, более длительно употребляющих наркотики внутривенно, в то время как среди пациентов, начавших аналогичное употребление наркотиков не более чем за полгода до развития заболевания, такой тенденции не установлено.

9. Установлены различия в динамике гуморального иммунного ответа в зависимости от дальнейшего развития патологического процесса, в том числе и в острой фазе заболевания. Полученные данные представляют интерес с точки зрения их прогностического значения.

10. Установлены статистически достоверные различия спектра антител у больных ХГС и пациентов с ПНАТ. Высокий уровень anti-NS4 Ig G характерен более для ХГС, чем для ПНАТ (р < 0,05). Сочетание высокого уровня с высоким уровнем ещё в большей степени характерно для ХГС по сравнению с ПНАТ (р < 0,01). Неполный спектр anti-HCV более характерен для ПНАТ. Отсутствие в спектре anti-HCV anti-NS4 Ig G, либо anti-core Ig G статистически достоверно (p < 0,01) для ПНАТ. Более же всего для ПНАТ характерно (100 % выявленных случаев) отсутствие anti-core Ig G, сочетанное с отсутствием к какому-либо из неструктурных белков вируса. В той же степени (100 % выявленных случаев) для ПНАТ характерно отсутствие anti-NS4 Ig G к обоим антигенным детерминантам NS4, использованным в данном исследовании.

11. Разработана тест-система для выявления типоспецифических антител у больных гепатитом С. Генотигагрование сывороток методом ПЦР было эффективным в 88 % случаев, в то время как серотшшрование методом ИФА -в 93 %. Этот показатель сопоставим с эффективностью серопширования по данным российских и зарубежных источников. Эффективность типирования сывороток пациентов при комплексном применении методов ПЦР и ИФА в нашем исследовании составила 100 %. Таким образом, ПЦР и ИФА можно считать взаимодополняющими методами, особенно с учетом того, что данные ИФА позволяют идентифицировать тип ВГС в том числе и в тех случаях, когда вирус отсутствует в сыворотке крови или лейкоцитарной фракции, не прибегая при этом к пункционной биопсии печени.

12. В результате проведённого исследования по выявлению типоспецифических апИ-ЫСК84 антител у больных гепатитом С с помощью разработанной тест-системы на основе типоспецифических пептидов, было установлено статистически достоверное различие в циркуляции ВГС различных типов в Москве и Белоруссии (Витебск).

Считаю приятным долгом выразить свою благодарность моим научным консультантам - доктору медицинских наук Н.В.Дорошенко и доктору

биологических наук глубокоуважаемым оппонентам и

рецензентам, дирекции Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, учёному секретарю Института, доктору медицинских наук Н.ПКосяковой, заведующему отделом клинической вирусологии и вирусных гепатитов, профессору, доктору медицинских наук, заслуженному врачу Российской Федерации СГ.Чешику, заведующему лабораторией антигенных детерминант вирусных белков и пептидного синтеза, профессору, доктору химических наук В«АШибневу, заведующему лабораторией химии вирусных нуклеиновых кислот и белков, профессору, доктору химических наук В.Д.Смирнову, доктору биологических наук НА. Селиванову, главному врачу 1-ой клинической инфекционной больницы города Москвы, профессору, доктору медицинских наук, заслуженному врачу Российской Федерации Н.А.Малышеву, доценту кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ, кандидату медицинских наук О.ОЗнойко, доктору медицинских наук С.Н.Кузину, кандидату медицинских наук Е.В.Воропаеву, всем сотрудникам лаборатории антигенных детерминант и лаборатории нуклеиновых кислот и

белков, сотрудникам клинического отдела Института вирусологии и 1-ой клинической инфекционной больницы города Москвы, а также кафедры инфекционных болезней МГМСУ и Института вирусных препаратов им. О.Г.Анджапаридзе, Витебского филиала НИКИ радиационной медицины и эндокринологии, имевшим отношение к выполнению данной работы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. КХА-Семилетов, И.В.Круглов, ВАКарпова и др. "Сравнительное исследование диагностической ценности пептидов, соответствующих различным геномным последовательностям ВГД." "Мол. генетика, микробиология и вирусология." № 4,1993.

2. Т.В.Фирсова, И.В.Круглов, О.О.Знойко и др. "Синтез гетерогенного мультивалентного антигена вируса гепатита А и перспективы нового метода диагностики." Тезисы Фальк симпозиума № 92 "Новые направления в гепатологии". Санкт-Петербург, Россия, Июнь 21-22, 1996.

3. TJFiisova, JAJPerez, LVTCruglov et al "Synthesis of a diepitope multiple antigen peptide containing sequences from VP1 and VP3 proteins of hepatitis A virus and its use in hepatitis A diagnosis." Theses of 24th symposium of the European Peptide Society, Edinburgh, Great Britain, 1996.

4. T.Firsova, J.Perez, FJligh, LKroglov, I.Haro."Synthesis ofa diepitope multiple antigen peptide containing sequences from VP1 and VP3 proteins ofhepatitis A virus and its use in hepatitis A diagnosis." "Peptides",1996, N133. R.Ramage and R-Epton (Eds.) EPS, P. 383-384.

5. Dementyeva E.V., Kruglov LV., Pimenov V.K., Novikov V.V. "Development of the new approaches to diagnostic and serotyping of delta-infection by usage of synthetic peptides." Fifth International conference "AIDS, cancer and related problems." St Petersburg, May 25-30,1997.

6. Ogienko O.L., Znoyko O.O., Kruglov I.V. et al. "Dynamic study of antibodies to immunodominant region of NS4 HCV protein." Fifth International conference "AIDS, cancer and related problems." St Petersburg, May 25-30,1997.

7. Е.В .Дементьева, И.В.Круглов, В.КПименов, КХА.Семилетов. "Сравнительное исследование антигенной активности пептидов нуклеокапсидного белка вируса гепатита дельта, соответствующих трём генотипам." Тезисы П Российской научно-практической конференции "Гепатиты B,C,D И G - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, октябрь 1997.

8. О.О.Знойко, ОЛ.Огиенко, И.В.Круглов и др. "Клинико-биохимическая картина острой и хронической HCV-инфекции и её связь с наличием антител к различным антигенным детерминантам вируса гепатита С". Тезисы П

Российской научно-практической конференции "Гепатиты В, С, D и G -проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, октябрь 1997.

9. Ю.А.Семилетов, Т.В.Фирсова, И.В.Круглов и др. "Использование синтетических пептидов как дополнительных антигенов для выявления антител к вирусу гепатита С"."Вопросы вирусологии", № 3,1998.

10. Е.В.Дементьева, И.В.Круглов, В.К. Пименов, ЮА.Семилетов. "Антигенная активность пептидов дельта-антигена, соответствующих трём генотипам вируса гепатита дельта." "Вопросы вирусологии", № 5,1998.

11. Н.Д.Ющук, О.О.Знойко, О.Л.Огиенко, Д.М.Брагинский, И.В.Круглов и др. "Спектр антител к антигенным детерминантам HCV у больных гепатитом С." "Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии." Т. 8, №5,1998,35-39.

12. И.В.Круглов, О.О.Знойко, М.П.Финогепова и др. "Серологическое исследование эпитопов белка NS5 вируса гепатита С и их значение для клиники и диагностики." Международная конференция "Вирусные инфекции на пороге 21 века: эпидемиология и профилактика." С.-Петербург,21-23 апреля, 1999.

13. И.В.Круглов, О.ОЗнойко, ОЛОгиенко и др. "Клинические варианты течения хронической HCV-инфекции и их связь с генотипом HCV и наличием антител к различным антигенам HCV." Международная конференция "Вирусные инфекции на пороге 21 века: эпидемиология и профилактика." С.Петербург, 21-23 апреля, 1999.

14. ОЛОгиенко, И.В.Круглов, О.ОЗнойко и др. "Частота встречаемости антител к антигенам белков core, NS4, NS5 HCV в сыворотках крови больных ОГС в первые десять дней желтушного периода." Тезисы докладов Ш Российской научно-практической конференции "Гепатиты B,CJ) и G -проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, июнь 1999.

15. ТЗ.Фирсова, И.В.Круглов, О.О.Знойко и др. "Синтез диэшггопного мультиплетного пептидного антигена, содержащего последовательности из VP1 и VP2 белков вируса гепатита А, и его применение в диагностике гепатита А." Тезисы докладов научной конференции "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", Москва, ноябрь 1999.

16. И.В.Круглов, О.Л.Огиенко, О.О.Знойко и др. "Исследование спектра антител класса G у больных различными клиническими формами гепатита С." "Российский гастроэнтерологический журнал",! 999, № 4.

17. ИЗ.Круглов, О.О.Знойко, М.П.Финогенова и др. "Серологическое исследованае эпитопов белка NS5 вируса гепатита С и их значение для клиники и диагностики." "Вопросы вирусологии" № 1,2000.

18. И.В.Круглов, О.О.Знойко, ЕАКлимова и др. "Серотипирование вируса гепатита С." Тастробюллетень", 2000, № 1-2. Приложение № 1. Материалы 2-й Объединённой Всероссийской и Всеармейской научной конференции "Санкт-Петербург - Гастро-2000." 20-22 сентября 2000.

19. ЮА.Семилетов, И.В.Круглов, О.О.Знойко и др. "Мультипептидная иммуноферментная тест-система для серотипирования вируса гепатита С." "Гепатит С (Российский консенсус)". Тезисы докладов научно-практической конференции, 26-27 сентября 2000, Москва.

20. КХА.Семилетов, И.В.Круглов, О.О.Знойко и др. "Варианты течения хронической HCV-инфекции и их связь с наличием антител к различным антигенам HCV." "Гепатит С (Российский консенсус)". Тезисы докладов научно-практической конференции, 26-27 сентября 2000, Москва.

21. НДЮшук, О.Л.Огиенко, И.В.Круглов и др. "Определение антител класса Ig G к антигенам белков core, NS4, NS5 ВГС в дифференциальной диагностике острой и хронической HCV инфекции." "Гепатит С (Российский консенсус)". Тезисы докладов научно-практической конференции, 26-27 сентября 2000, Москва.

22. НДЮшук, О.Л.Огиешсо, Л.В.Круглов и др. "Определение антител класса Ig G к антигенам белков core, NS4, NS5 ВГС у больных желтушной формой ОГС с различным стажем внутривенного употребления наркотических вешеств." "Гепатит С (Российский консенсус)". Тезисы докладов научно-практической конференции, 26-27 сентября 2000, Москва.

23. И.В.Круглов, О.ОЗнойко, КХА.Семилетов и др. "Серотшшрование вируса гепатита С с помошью мультипептидной иммуноферментной тест-системы." "Иммунопатология, аллергология, инфектология", № 3,2000.

24. ЮА.Семилетов, В.К.Пименов, И.В.Круглов и др. "Серотшшрование вируса гепатита дельта на основе синтетических пептидов." Тезисы докладов ГУ Российской научно-практической конференции с международным участием "Гепатиты В,С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики", Москва, июнь 2001,313-314.

25. ЮА.Семилетов, В.К.Пимепов, И.В.Круглов и др. «Определение типоспецифических антител к BFD на основе синтетических пептидов.» «Вопросы вирусологии № 5,2001,21-25.

26. И.В.Круглов, О.О.Знойко, ОЛ.Огиенко и др. "Спектр антител к различным антигенам HCV при разных вариантах течения хронической HCV-инфекции." "Вопросы вирусологии" № 2,2002,11-16.

27. К.Р.Дудина, О.О.Знойко, И.В.Круглов и др. «Проблемы ранней диагностики острых вирусных гепатитов, актуальные для стационаров хирургического профиля.» «Неотложная помощь в клинических условиях», (под ред. Э.В.Луцевича, Г.Н.Проскурникова) том 9,2002, с. 138-140.

28. Н.Д.Ющук, О.Л.Огиенко, И.В.Круглов и др. "Диагностическая значимость определения антител к различным антигенам ВГС у пациентов с острой и хронической HCV инфекцией." 'Терапевтический архив", 2002, №4, с. 18-22.

29. O.O.Znoyko, M.I.Michailov, K.R.Dudina, I.V.Kruglov et al. "Etiological Structure of Viral Hepatitis in Moscow." XVI World Congress of Epidemiology International Epidemiological Association, Montreal 2002, WP10.

30. И.В.Круглов, ОЛ.Огиенко, О.ОЗнойко и др. «Исследование сероконверсии к различным антигенам ВГС у больных ГС с различными исходами». «Вопросы вирусологии», 2003, № 2, стр. 36 - 40.

31. И.В.Круглов, О.О.Знойко, ЕАКлимова и др. «Выявление типоспецифических aHTH-HCNS4 антител у больных ГС методом ИФА». «Вопросы вирусологии», 2003, № 3, стр. 32 - 36.

Подписано к печати Вб. 03. 04, Заказ Тираж 100

Издательский центр МГАПИ

экз.

' 1-78 2 1

Информация о работе

Круглов, Игорь Вячеславович
доктора медицинских наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.06

Автореферат

Похожие работы