Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гепатит А и сходный с ним по клинике и эпидемиологии гепатит НИ-А, НИ-В

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Гепатит А и сходный с ним по клинике и эпидемиологии гепатит НИ-А, НИ-В"

sYjT

акаделш гешинских наук ссср /l^ls

институт пслиоледита и косных энцефалитов х

На правах рукописи УДК 6I6.36-002-022:578.89lJ-07(048.8)

андкапардцзе александр георгиевич

гепатит а и сходный с ним по клинике и эш'щежшюпн ш1атит ш-а, ни-в (специфическая диагностика, моделирование инфекции In vivo и in vitro )

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой стзпенн доктора медицинских шук

академия медицинских наук ссср институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

На правах рукописи УДК 616.36-002-022:578.89l]-07(048.8)

АНДЖАПАРИДЗЕ АЛЕКСАНДР ГЕОРГИЕВИЧ

гепатит а и сходный с ним по клинике и

этдадашши гепатит ни-а, ш-в

(специфическая диагностика, моделирование инфекции in vivo И in vitro )

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик АН Латв. ССР профессор Р.А.КУКАИН

доктор медицинских наук, академик АМН СССР профессор В.И.ВОТЯКОВ

доктор медицинских наук, член-корреспондент АМН О профессор Б.Ф.СЕМЕНОВ

Ведущая организация: Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского

АМН СССР

Защита состоится " " _198 г. в ._часов

на заседании специализированного совета Д.001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР по адресу: 142782, Московская область, Ленинский район, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР.

Автореферат разослан " " _ 198 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

О.А.МЩЩЦКИНА

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Среди вирусных инфекций человека вирусные гепатиты по своей распространенности, уровню заболеваемости и причиняемому экономическому ущербу занимает одно из ведущих мест.

В суммарной заболеваемости вирусными гепатитами наибольший удельный вес приходится на гепатит А (ГА). Истинное число случаев заболеваний ГА трудно поддается оценке, что связано с полиморфизмом клинических проявлений инфекции и преобладанием атипичных и субклинических форм, затрудняющих его диагностику. ГА остается практически неконтролируемой инфекцией, и заболеваемость им, испытывая колебания в сторону увеличения или уменьшения в разные годы, в общем имеет тенденцию к возрастанию (В.М.Жданов, 1984; В.М.Жданов с соавт., 1986). Все вышеизложенное, а также отсутствие надежных средств специфической профилактики, делает проблему ГА особенно актуальной для здравоохранения.

Прогресс, достигнутый за последние 15 лет в изучении ГА, неразрывно связан с новым этапом развития вирусологии, вобравшим в себя достижения биохимии, генетики, электронной оптики, общей и прикладной иммунологии и многих других отраслей науки.

Поворотными моментами в изучении ГА были в первую очередь открытие в 1973 г. Feinstone et el. вируса гепатита А (ВГА) с помощью иглмуноэлектронной микроскопии (ИЭМ), установление возможности моделирования указанной инфекции на шимпанзе и мар-мозетах (P.J.Provost et al., 1973; J.L.Dlenstag et al.,19750,затем разработка и использование радио- и энзимоиммунологических методов (РИМ и ЭИМ), для обнаружения ВГА и антител против него

(анти-ВГА) (F.B.Hollinger et al., 1975s W.Duermeyer, 1978).

На всех этапах исследования основной трудностью в изучении НГА оставалась проблема получения материала, содержащего ВГА в количествах, необходимых для исследования его свойств и использования в качестве антигена для серологических реакций. Очень важное значение имеют поиски и получение вируссодержащих материалов от больных ГА, так как ВГА в основном выделяется из организма больного в инкубационном периоде до наступления клинической картины (J.w.Mosley, 1983). Кроме подбора вируссодержащих материалов,немаловажное значение имеет отбор отрицательных и положительных сывороток анти-ВГА, которые также необходимы для постановки всех серологических реакций.

Описанные в литературе варианты ИЭМ, РИМ и ЭИМ для обнаружения ВГА и анти-ВГА весьма сложны, требуют специального лабораторного оснащения и достаточного времени для приготовления препаратов ( W.T.Hall et al., 1977; L.R.Mathiesen et al., 1978} M.Eoggendorf et al., 198o). Кроме того, постановка всех этих методов доступна лишь для специализированных хорошо оснащенных лабораторий, занятых изучением ГА. В связи с этим, одной из важных задач, в рамках всей проблемы борьбы с ГА, является упрощение известных и создание новых более доступных и быстрых методов специфической диагностики указанной инфекции.

Несмотря на то, что во многих специализированных лабораториях мира были освоены методы обнаружения ВГА, обследование больных ГА ограничивалось анализом лишь отдельных случаев (Н.В.Дорошенко с соавт., 1982; P.Skinhoj et al., 198-1 j B.Fleh-mig et al., 1977 ) . Мало что известно о характере экскреции ВГА у больных с фекалиями, не говоря уже о частоте вьщеления ВГА и других вирусов у больных в зависимости от диагноза, эпид-

ситуации, срока и тяжести заболевания. Также отсутствуют данные об обследовании носоглоточных смывов и слюны у больных с диагнозом ГА на наличие ВГА. Не проводились специальные исследования, направленные на выяснение возможности циркуляции ВГА в коллективах, благополучных и не благополучных по ГА. Не были известны количественные особенности формирования иммунного ответа при ГА в сравнении с другими энтеровирусними инфекциями.

Имеющиеся в литературе данные по электронномикроскопическо-му изучению ВГА ограничиваются обследованием малых чисел изоля-тов ВГА (Е.Н.Соок et а1., 1976? й.31ев1, 1982). При этом проводился неполный ультраструктурный анализ ВГА и вирусспецифиче-ских структур. При исследовании биофизических свойств ВГА мало внимания уделялось морфологическому анализу фракции градиентов и в большинстве работ для оценки флотационных свойств изолятов указанного вируса использовались РИМ и ЭИМ (г.в.НоШпбвг еъ а1., 1975; ■1.1/.К±еп^ай еЪ а1., 1976; Р.СоигэабеЪ еЪ а1., 1980), которые могут дать только антигенную характеристику, тогда как только с помощью методов электронной микроскопии возможно получение более детальной информации.

Не проводилось сравнительное изучение антигенных свойств изолятов ВГА из различных географических зон СССР и других стран. Эти исследования необходимы для выяснения, имеются ли антигенные различия между изолятами указанного вируса, выделенными в различных регионах мира.

В результате прогресса в исследованиях распространения ГА с применением методов его специфической диагностики происходило накопление фактических сведений, которые с нарастающей убедительностью свидетельствовали о существовании по крайней мере еще одного вида гепатита, сходного по клинической картине и

эпидемиологическим закономерностям с ГА, но отличающегося от него этиологически. Критериями для выделения этой инфекции из общей массы вирусных гепатитов служили отсутствие этиологической причастности вирусов гепатитов А и В и других известных агентов вирусной природы в сочетании с вероятностью фекально-оральной передачи заразного начала (М.С.Балаян, 1983; J.Rosen-Ъаит et al., 1984; C.Erepo, 19,84). Спорадические случаи тако-'го гепатита регистрировались во многих странах, однако, крупные водные вспышки имели место на азиатском континенте (M.A.Sreeni-vasaa et al., 1984-j D.C.Wong et al., 1980s M.A.Kane et al.,1984)

Многочисленные попытки идентифицировать этиологический агент, вызывающий указанное заболевание, успеха не имели. Проблема эта новая и не изученная. Единственным путем для начала изучения этой проблемы представлялось осуществление работ по поиску, выявлению и установлению нового возбудителя гепатита у человека, создание тест-системы для обнаружения данного вируса и антител против него и определения возможности моделирования указанной инфекции на обезьянах. При удачном завершении этих работ появится реальная перспектива развития нового направления в изучении гепатопатии человека инфекционного происхождения.

Известно, что в экспериментальных условиях надежно моделировать ГА удалось только на шимпанзе и дармозетах (F.Deinhaxdt, 1976, 1985$ Е.Tabor et al., 1983). В то же время поиски восприимчивых к вирусным гепатитам лабораторных животных показали, что среди многих видов обезьян достаточно часто встречаются особи, имеющие анти-ВГА. В связи с этим большой научный и практический интерес представляет выявление возможности моделирования ГА на более доступных видах обезьян, чем шимпанзе и мармозеты.

Моделирование ГА на обезьянах необходимо для изучения патогенеза, иммуногенеза указанной инфекции и для испытания эффективности различных терапевтических и профилактических препаратов.

Важное значение для решения проблемы ГА имеет культивирование ВГА в клеточных культурах. В результате интенсивных исследований за последние годы в некоторых лабораториях мира достигнуты определенные успехи в культивировании указанного вируса в клеточных культурах, что дает реальную возможность для создания диагностических препаратов и средств специфической профилактики.

Цель и задачи исследований. Основным направлением и целью настоящей работы явилось получение с помощью лабораторных методов исследований новых вирусологических и эпидемиологических знаний о гепатите А и о сходном с ним по клинике и эпидемиологии гепатите человека, но отличающегося от него этиологически. Исследование посвящено выявлению и характеристике возбудителей, совершенствованию специфической диагностики и выяснению возможности моделирования этих инфекций на обезьянах, культивирования их этиологических агентов в клеточных культурах.

В задачи работы входило:

1. Совершенствование и разработка новых более доступных и быстрых методов обнаружения ВГА и антител против него и их применение для диагностики и эпидемиологического анализа ГА.

2. Изучение частоты выделения НГА и других вирусов у больных в зависимости от диагноза, эпидситуации, срока и тяжести заболевания; определение распространения вируса гепатита А в коллективах, благополучных и не благополучных по гепатиту А.

3. Морфологическое, биофизическое и антигенное изучение изолятов вируса гепатита А, выделенных от больных гепатитом А.

4. Изучение особенностей формирования иммунного ответа при гепатите А.

5. Поиски, выявление и идентификация нового возбудителя гепатита, передающегося фекально-оральным механизмом и вызывающего сходную клиническую картину с ГА, но отличающегося от него этиологически; создание тест-системы для выявления нового этиологического агента и антител против него, определение его циркуляции в различных районах СССР и других странах.

6. Изучение возможности моделирования на обезьянах ГА и сходного с ним заболевания, отличающегося от него этиологически.

7. Разработка методов культивирования в клеточных культурах вируса гепатита А.

Научная новизна работы и положения, которые выносятся на защиту. Выявлено, что в фекальных пробах., содержащих и не содержащих ВГА, может присутствовать материал, дающий псевдоположительную реакцию в ЭИМ, который блокируется отрицательными на .анти-ВГА сыворотками человека и некоторых видов животных и угнетается в присутствии слабых неионных детергентов.

Впервые показано, что в результате инфекции ГА у человека развивается в 25-800 раз больше специфических антител, чем после инфекции другими энтеровирусами.

В работе на основе обширных экспериментальных данных научно обоснована возможность и доказана эффективность применения разработанных упрощенных методов выявления ВГА и антител против него в целях ускоренного обнаружения указанного вируса в различных материалах и для осуществления быстрой специфической диагностики ГА.

Определены закономерности частоты выделения ВГА и других вирусных агентов с фекалиями в зависимости от эпидситуации, ди-

- 9 -

агноза, возраста, срока и тяжести заболевания.

Получена полная морфологическая характеристика материалов, содержащих частицы НГА; с помощью метода ИЭМ показана антигенная идентичность изолятов этого вируса, собранных в различных географических районах мира.

Показана циркуляция ВГА в детских коллективах, в которых имели место случаи клинически выраженного заболевания ГА.

Впервые экспериментально доказано существование фекально-орального гепатита ни-А, ни-В и установлено, что его этиологическим агентом является вирус, который имеет сферическую форму размером 27 нм, коэффициент седиментации 183S и антигенно отличается от ВГА и ВГВ.

Впервые создана тест-система для выявления вируса фекаль-но-орального гепатита ни-А, ни-В и антител против него с помощью метода ИЭМ.

Впервые определен характер распространения вируса фекаль-но-орального гепатита ни-А, ни-В в различных географических районах мира и установлено его этиологическое значение при водных вспышках гепатита.

Впервые показана возможность моделирования фекально-ораль-ного гепатита ни-А, ни-В на яванских макаках.

Впервые установлена естественная ГА-подобная инфекция у яванских макак, бурых макак и африканских зеленых мартышек. Доказано, что среди указанных видов обезьян имеет место циркуляция ВГА.

Впервые проведено экспериментальное моделирование ГА на яванских макаках, бурых макаках и африканских зеленых мартышках при их заражении штаммом ВГА ЯМ-55, выделенным от яванской макаки при спонтанном ГА,

Впервые описана репродукция изолятов ВГА людей в культуре клеток, обработанных субтоксическими дозами трипсина или желчи. Впервые проведена адаптация штамма ВГА ЯМ-55 в культуре клеток линии РШк-Л.

Теоретическое значение результатов работы определяется созданием новых перспективных направлений в изучении гепато-тропных вирусных инфекций. Более конкретно эти направления касаются неизвестных ранее проблем гепатита человека, вызванного вирусом фекально-орального гепатита ни-А, ни-В, и заболевания низших обезьян Старого Света, этиологически связанного с вирусом, сходным с ВГА человека.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Разработаны и внедрены в практику лабораторных исследований упрощенные модифицированные методы выявления ВГА и антител против него для быстрой специфической диагностики ГА.

На основе использования методов выявления ВГА и антител против него получены новые объективные знания по эпидемиологии ГА, что в свою очередь может послукить основой для дальнейшей разработки более эффективных, рациональных и комплексных противоэпидемических мероприятий.

Разработана тест-система, позволяющая проводить специфическую диагностику фекально-орального гепатита ни-А, ни-В с помощью метода ИЭМ (11гЬегу1го1ову, 1985).

Создана возможность проводить моделирование фекально-орального гепатита ни А, ни В на яванских макаках (Вопросы вирусологии, 1986).

Выделен и охарактеризован штамм ВГА ЯМ-55, который успешно используется для накопления вирусной массы, пригодной для специфической диагностики ГА человека, и для моделирования этой ин-

фекции на яванских макаках, бурых макаках и африканских зеленых мартышках (Авторское свидетельство 1Ь 1328376).

Из печени обезьян, зараженных штаммом ВГА ЯМ-55, получен значительный запас антигена ВГА, который используется для специфической диагностики ГА человека (акты о внедрении 1987).

Моделирование ГА на более доступных обезьянах, чем шимпанзе и маршзеты, создает реальную возможность интенсифицировать и расширить изучение патогенеза и иммуногенеза этой инфекции.

Штамм НГА ЯМ-55, адаптированный к культуре клеток, внесен в Инструкцию по производству инактивированной вакцины против ГА в качестве прототипного штата.

Апробация работы состоялась на конференции межлабораторного Ученого совета по проблемам частной вирусологии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР 10 ноября 1987 года.

Материалы диссертации доложены на XIX и XX итоговых научных сессиях Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (Москва, 1981, 1985); Европейском конгрессе вирусологов (Мюнхен, 1979); рабочих совещаниях специалистов стран-членов СЭВ по проолеме "Вирусные гепатиты" (Рига, 1980; Ташкент, 1983); на совещаниях экспертов ВОЗ по вирусным гепатитам (Женева,1982, 1983, 1987); совещании в Региональном Бюро ВОЗ Юго-Восточной Азии (Дели, 1984); советско-французском симпозиуме по медицинской вирусологии (Москва, 1980); симпозиуме СССР-ФРГ по гепатиту А (Москва, 1984); всесоюзных конференциях по проблеме "Вирусные гепатиты" (Москва, 1984, 1987), заседании Бюро 0№иЭ АМН СССР (Москва, 1987).

Публикация результатов исследований. Материалы проведенных исследований отражены в 57 пуоликациях.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 404 стра-

-Li -

ницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (трех глав), раздела собственных исследовании (семи глав), обсуждения, выводов и списка литературы, диссертация содержит 33 таблицы и 63 рисунка. Библиографический указатель включает 445 оте чественных и зарубежных источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. В экспериментальных исследованиях использовали ВГА и вирус фекально-орального гепатита ни-А, ни-В. Источником поучения НГА служили фекальные пробы от больных людей, собранные в острой стадии заболевания, и лиц, имевших контакт с ними фекальные пробы и печеночная ткань обезьян при естественной и экспериментальной инфекции ГА, а также клеточные культуры, зараженные ВГА. Вирус фекально-орального гепатита нл-А, ни-В получали из фекальных проб больных людей и экспериментально зараженных обезьян в острой стадии заболевания.

При проведении работ по выявлению и идентификации вирусов обследованию' подлетали различные экспериментальные и клинические материалы: клеточные культуры, биопсишше и аутопсийные ткани обезьян, носоглоточные смывы, фекалии и др.

В работе использовали метод негативного контрастирования ( B.V.Johanson, 1978); стандартный ( J.D.Almeida, A.P.Waterson, Iöo9) и модифицированный ааш метод ИЭМ (А.Г.Анджапаридзе и др., I960); метод комбинированной постановки РИМ и ИЭМ в одном препарате (А.Г.Анджапаридзе и др., 1983); метод ИЭгЛ для индикации внутриклеточного вируса (М.Б.Королев и др., 1981); метод ультратонких Срезов ( H.H.Mollenhauer, 1964); непрямой метод флюоресцирующих антител (МФА); стандартный ( W.Duermeyer, 1978) и модифицированный ЭИМ (М.К.Ыамедов и др., 1983); методы обнаружения цитопатоген-ных вирусов.

Препараты изучали в электронном микроскопе ДВД-100В.

Ультрацентрифугирозание в градиенте хлорида цезия исследуемых материалов проводили в роторах SVY-55Ti и SW-65Ti ("Beckman", Австрия).

Определение РНК ВГА проводили методом молекулярной гибридизации с Р3;а к да ВГА ( S.M.Lemon et al., 1985).В качестве кДДПС использовали рекомбинантную плазщцу РБН322 (Ю.А.Овчинников и др., 1985).

Игловую пункционную биопсию печени у обезьян и приготовление гистологических препаратов проводили согласно методической рекомендации (А.С.Логинов и др., 1979).

Определение активности сывороточных амгаютрансфераз осуществляли кинетическим методом с использованием диагностических наборов UV-Test фирмы Permognost (ВД11).

для статистической обработки материалов и построения гистограмм использовали стандартные метода биометрии (Н.Бейли, 1970; Г.Ф.Лакин, 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ И 0БС7^ДО1Е

Выявление вируса гепатита А и антител против него. Первым этапом исследовании был отбор материалов, содержащих ВГА, и сывороток, содержащих и не содержащих антитела к указанному вирусу. Используя сыворотки, полозштелыше и отрицательные на анти-ЕГА, с помощью метода ИУш были исследованы фекальные пробы больных с диагнозом ГА на наличие частиц ВГА. В результате исследования методом liaiil ¿63 фекальных проб от 119 больных, в ¿9 фекалышх пробах от ¡¿0 болышх удалось выявить характерные частицы ВГА в варьирую-цих концентрациях. Первичная идентификация частиц, так же как описано другими исследователями (S.M.ieinstone et al., 1974; R.H.Pur-cell et al., 1974; S.A.Locarnini et al.,1974), основывалась на выявлении вирионов размером ¿¡7-30 нм в виде полных и пустых форм,

обильно покрытых антителами при использовании анти-ВГА содержащих сывороток. При фракционировании в равновесном градиенте плотности хлорида цезия фекальных цроб, содержащих вирусные частицы, проведенный с помощью ИЭМ анализ показал, что для большинства препаратов частицы размером 27-30 им, покрытые антителами, седименти-ровались в зоне с плавучей плотностью 1,33-1,35 г/см3. Таким образом, с помощью метода ИЭМ была проведена успешная идентификации ВГА и отбор фекальных проб, содержащих частицы указанного вируса. Используя ВГА-содеркацую фекальную пробу в качестве вируосодержа-щего материала, с помощью ИЭМ били отобраны сыворотки с высоким содержанием анти-ВГА и сыворотки, не содержащие антитела к этому вирусу. Отбор фекальных проб, содержащих частицы ВГА, и сыворогок, положительных и отрицательных на анти-ВГА, проведенный методом ИЭМ, дал возможность приступить к освоению ЭШ дом выявления антигена ВГА и антител против него.

В сравнительных опытах были проанализированы эффективность выявления частиц ВГА методом ИЭМ и его антигена ЭИЫ. В шифрованных экспериментах было найдено, что при наличии в нативных препаратах едшшчных "полных" частиц ВГА их обнаружение возможно преимущественно методом ИЭМ. ЭШ оказался более пригодным для определения антигена указанного вируса в тех препаратах, в которых присутствовали пустые частицы ВГА и их фрагменты. Полученные нами данные убедительно свидетельствуют о том, что при параллельном исследовании материалов методом ИсЫ и ЭШ повышается вероятность выявления ВГА.

Так же как и другими исследователями (R.H.Pareen et al., 1976j W.Г.Hall et al., 1977; W.Duemeyer et al., 1978 ), нами ЩН постановке ЭШ для выявления антигена ВГА в фекальных пробах, со-дернащих и не содержащих ВГА, был выявлен материал, дающий псевдоположительную реакцию. Было установлено, что этот материал можно

блокировать отрицательными на анти-ВГА сыворотками человека и некоторых видов животных. В результате проведенного исследования выявлены параметры, которые необходимо учитывать при постановке РШ и ЭШ с целью создания условий, максимально благополучных дня обнаружения антигена ВГА в фекальных экстрактах.

Проведенные эксперименты показали, что ЭИш и Иэи обладают одинаковой чувствительностью и специфичностью для определения анти-ВГА, однако для количественного определения этих антител более пригодным оказался ЭРы. При'исследовании сывороток было выявлено, что самый высокий уровень анти-ВГА наблюдался в сыворотках ранних реконвалесцентов, взятых через 1-1^ месяцев после заболевания ГА. У поздних реконвалесцентов уровень антител был значительно нияе, чем у ранних реконвалесцентов, но выше, чем у лиц, не тлевших в анамнезе заболевания печени.

В литературе отсутствовали данные о формировании иммунного ответа при ГА в сравнении с другими энтеровирусными инфекциями. Наши исследования показам, что в результате инфекции ВГА у человека образуется в ¿5-800 раз больше специфических антител, чем после инфекции другими энтеровирусами.

Усовершенствование методов обнаружения вируса гепатита А и антител против него. Проведены исследования, направленные на разработку упрощенных, доступных и быстрых методов специфической диагностики ГА.

Разработан модифицированный метод Каш для быстрого исследования материалов на наличие частиц ВГА, отличающийся от стандартного метода ИЭы простотой, доступностью, гораздо меньшей продолжительностью и в то же время обладающий необходимыми специфичностью и чувствительностью. При стандартном методе 11Эл1 приготовление препаратов, как Правило, ЫСИХет ДЛИТСЯ -¿-16 чаСОВ ( А. 2, КарИс! ап et а1„, 1976), тогда как при модифицированном Шл время для приготовления

препаратов составляет всего 30-40 мшут. Модифицированный метод ИЭМ основан на использовании А белка золотистого стафилококка, дающего псевдополодательную реакцию с иммуноглобулинами человека

И МНОГИХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ ( А.Роге^гвп еЬ в1., 1966).

На основе модифицированного метода ИЭы наш была разработана комбинированная постановка РШ и ИЭш в одном препарате, которая позволила в течение 40-60 минут одновременно проводить исследование материалов на наличие антигена и частиц НГА. Применение этого метода позволяет установить, с какими морфологическими структурами ассоциирована антигенная активность препарата.

Для упрощения и сокращения продолжительности ЗИМ, используемого дая выявления ВГА и антител против него, наш был предаожен модифицированный вариант, который разрабатывался на основе стандартного ЭШ гтеуег, 1978). Разработанный нами модифицированный ЭШ отличался от стандартного ЭЖа тремя основными особенностями. Во-первых, в качестве твердофазного носителя используются полистироловые шарики одинакового диаметра, а все этапы постановки осуществляются в стеклянных пробирках. Во-вторых, метод предполагает использование полистироловых шариков, заранее "покрытых" антителами, которые хранятся в растворе бычьего сывороточного альбумина с антибиотиками в течение полугода. В-третьих, количественный учет результатов метода осуществляется визуально, с использованием специально приготовленных эталонных цветных растворов с известными значениями экстинкций. Именно благодаря этим особенностям модифицированный ЭШ по сравнению со стандартным ЗИМ является более простым, доступным и менее продолжительным (на 18-^0 часов). Вместе с тем, этот метод обладает близкими к стандартному ЭЙД показателями объективности, специфичности и воспроизводимости.

Дда проведения экспресс-диагностики ГА оказался пригодным предложенный нами непрямой метод флюоресцирующих антител (ыФА),

позволяющий определить иммуноглобулины класса ы к ВГА (анти-ВГА класса м) с использованием криостатных срезов печеночной ткани обезьян, содержащих антиген ВГА. Чувствительность и специфичность непрямого хлФА лишь немногим уступает чувствительности и специфичности yliivi, о чем свидетельствуют результаты постановки параллельных шифрованных опытов по определен!® анти-ВГА класса ц в сыворотках: совпадение результатов отмечалось в ЭЪ,8%. Непрямой ii$A имеет ряд преимуществ. Вся процедура постановки реакции, просмотра и штерпретации результатов занимает период времени, не превышающий полутора часов.

Использование методов обнаружения вируса гепатита А в диагностических и эпидемиологических целях. В настоящем разделе работы представлены результаты практического применения и доказательства пригодности разработанных методов выявления ВГА и антител против него дая осуществления специфической диагностики и изучения различных аспектов ГА. Проведенные исследования показали, что только с шмотью специфической диагностики ГА, основанной на обнаружении анти-ВГА класса м возможно осуществить объективную диагностику ГА, особенно атипичных его форы и получить четкое представление о доле указанного заболевания в структуре заболеваемости вирусных гепатитов ( J.D.Gust et ai., 1983).

Продемонстрировано, что модифицированный Эйд является методом, позволяющие проводить специфическую диагностику ГА непосредственно в очаге, на базе вирусологической лаборатории практического профиля. Наши исследования показали также возможность успешного применения непрямого иЙА, дозволяющего выявлять анти-ВГА класса м для экспресс-диагностики ГА в очагах. С помощью указанного метода в течение нескольких часов была проведена диагностика ГА в двух обособленных очагах.

Обнаружение в фекальных пробах частиц ВГА, так же как и выяв-

ление анти-БГА класса U, указывает на острую инфекцию ГА (В.гд.Лда-нов И др., 1986; А. Z.Kapikian et al., 1976; J.W.Mosley, 198J). Диагностика ГА, основанная на выявлении ВГА, практически не используется, так как отсутствие в фекальных пробах указанных частиц не может однозначно приниматься за отсутствие у обследуемых ГА Ы.С.Балаян и др., 1978; Е.С.Кетиладзе и др., 1982). Несмотря на это, в наших исследованиях на основе выявления частиц ВГА в фекальных пробах от острых больных при вспышках гепатитоподобного заболевания модифицированным методом ИЭы и комбинированной постановки PI'k и ЮМ в одном препарате в течение нескольких часов было установлено, что вспышки этиологически были связаны с ВГА. Описанные В литературе ( J.L.Dienstag, 1981-, J.D.Gast, 1984; G.R.Xstre, E.S.Hopkins, 1985) расшифровки различных вспышек ГА, основанные на специфической диагностике ГА, в основном имели ретроспективный характер.

Разработанные нами ускоренные метода обнаружения ВГА и антител против него, позволяющие оперативно осуществлять специфическую диагностику ГА, создают практическую возможность своевременно проводить целенаправленные практические и противоэпидемические мероприятия.

Получены результаты, которые дают представление о рассеиваний ВГА и других вирусов и опасности для окружающих при работе с материалами от больных в зависимости от диагноза, эпидситуации, срока и тяжести заболевания, что весьма важно для проведения мероприятий, направленных на предотвращение внутрибольничных заболеваний как ГА, так и другими вирусными кишечными инфекциями.

При ультраструктурном анализе материалов, содержащих частицы ВГА, выявлено, что в препаратах кроме типичных частиц ВГА размером 27-30 нм, хорошо реагирующих с анти-ВГА, наблюдаются сферические структуры размером 20-22 нм и1 27 нм, слабо реагирующие с анти-ВГА.

Сравнение с помощью M&vl изолятов ВГА, собранных в различных географических зонах мира показали их антигенную идентичность независимо от места их выделения.

К началу наших исследований отсутствовали данные, указывающие на экскрецию ВГА при асимптоштической форме ГА, а такие не были известии вопросы, связанные с циркуляцией этого вируса в коллективах, благополучных и не благополучных по ГА. Проведенные нами исследования показали циркуляцию ВГА в тех детских коллективах, в которых имели место случаи клинически выраженного ГА. Циркуляция указанного вируса имела более интенсивный характер в тех коллективах детей, в которых наблюдалось наибольшее количество случаев клинически выраженного заболевания ГА. Показано, что при асимптоматиче-ской форме инфекции ГА наблюдается образование анти-ВГА класса М. Экскреция ВГА при асимптоматической форме ГА по нашим данным не является длительной и по всей вероятности, она короче по сравнению с периодом экскреции указанного вируса при типичной манифестной форме инфекции. В отличие от детских коллективов, не благополучных по ГА, в детских коллективах, где не наблюдались случаи клинически выраженного заболевания ГА, циркуляцию ВГА выявить не удалось.

Вирусный гепатит с фекально-оральным механизмом передачи. отличный от гепатита А. В последние годы все большее внимание исследователей привлекает проблема гепатитов, этиологически не связанных с ВГА и ВГВ (В.ы.Жданов, IS84; М.И.Михайлов и др., 1984; М.О. Фаворов и др., 1986).

В начале наших исследований имелись данные о распространении гепатятоподобного заболевания в некоторых районах Азии, где он проявлялся в виде водных вспышек и пораиал преимущественно взрослые контингент, в том числе лиц, высокоиммунных к ВГА. Этиологическая природа этого заболевания оставалась нераспознанной ( D.с.Wong et al., 1980).

- го -

В результате наших исследований была установлена новая нозологическая форма гепатита человека, передающаяся фекально-оралышг путем. При пероральном экспериментальном заражении добровольца, у которого развился клинически выраженный гепатит, показано, что этиологическим агентом этого гепатита является вирус, имеющий сферическую структуру размером ¿7-30 нм, который выделяется из организма с фекалиями в острой стадии заболевания. Указанный вирус выявлялся в препаратах в виде полных и пустых форм, имеет коэффициент седиментации 183s в сахарозе и антигенно отличается от ВГА, BIB и вируса постранфузионного гепатита ни-А, пи-В. зтот гепатит, передающийся фекально-оральным путем и отличающийся этиологически от известных гепатотропных инфекций, был обозначен условно как фе-кально-оральный гепатит ни-А, ни-В. Для агента, вызывающего указан ное заболевание, было предложено обозначение "вирус фекально-ораль ного гепатита ни-А, ни-В". Предполагается, что этот вирус менее стабилен, чем ВГА, так как разрушается в результате замораживания-оттаивания, а также в результате воздействия концентрации солей хлорида цезия.

Проведенные методом Иэы исследования фекальных проб доброволь ца и больных фекально-оральным гепатитом ни-А, ни-В показали, что при этой инфекции экскреция вируса с фекалиями имеет менее интенсивный характер, чем при ГА. Исследование этим же методом сыворото добровольца и больных фекально-оральным гепатитсы ни-А, ни-В, на наличие и уровень антител к вирусу гепатита ни-А, ни-В выявили, что при фекалыю-оральном гепатите ни-А, ни-В имеет место более низкое образование специфических иммуноглобулинов класса g , чем при ГА.

При исследовании препаратов иммуноглобулинов серийного производства, сывороток больныц и лиц, дважды перенесших гепатит, из различных географических зон мира, методом 1Ш на наличие антител

к вирусу фекально-орального гепатита ни-А, ни-В была объективно оценено распространение этой инфекции. Получены данные, свидетельствующие о достаточно широком распространении фекально-орального гепатита ни-А, ни-В в Средней Азии СССР и в странах iCtro-Восточной Азии и, несомненно, о его ограниченном распространении в Европейской части СССР. Выявление иммуноглобулинов класса ivi к вирусу фе-кально-орального гепатита ни-А, ни-В в сыворотках больных, собранных в Непале, Бирме, Пакистане, Судане, Сомали, Индии и Мексике при водных вспышках гепатитоподобного заболевания указывали на то, что эти вспышки этиологически связаны с выделенными нами вирусом.

Обезьяны, как модель для изучения гепатита А и фекально-ораль-ного гепатита ни-А. ни-В.

Выполненные нами исследования показали, что при экспериментальном заражении яванских макаках материалами, содержащими вирус фекально-орального гепатита ни-А, ни-В, удалось воспроизвести инфекцию, которая сопровождалась экскрецией вируса фекалыго-орально-го гепатита ни-А, ни-В с фекалиями, повышением активности печеночных ферментов в острой стадии заболевания, характерным для острого вирусного гепатита изменением печеночной ткани ( L.E.Overty, 1983; w.s.Robinson, 198?) и образованием антител к указанному вирусу. Получены данные о возможности пассирования этого вируса от обезьяны к обезьяне. Было выявлено, что у яванских макак, зараженных вирусом фекально-орального гепатита ни-А, ни-В наблюдается короткая и неинтенсгоная экскреция вируса с фекалиями. Попытки интенсифицировать экскрецию вируса у зараженных обезьян введением препаратов для создания иыыунодепрессивного состояния, особого успеха не "имели, однако у животных на фоне иммунодепрессивного состояния наблюдалось выделение частиц вируса более длительное время, чщ у обезьян без иммунодепрессии.

Несмотря на то, что в результате заражения яванских- макак не<

- -¿г -

удалось получить вирус фекально-орального гепатита ни-А, ни-В в больших количествах, тем не менее фекальные пробы зараженных кивс ных, содержащие частицы этого вируса, оказались пригодными душ ис пользования их в качестве вируссодержащего материала при исследоЕ нии сывороток на наличие антител против указанного вируса. Кроме этого, в наших исследованиях нашли практическое применение сыворс ки зараженных обезьян, содержащие антитела к вирусу фекально-орал ного гепатита ни-А, ни-В. Они применялись для исследования йекаль ных проб больных людей и экспериментально зараженных обезьян на наличие частиц указанного вируса методом Иэм.

Таким образом, в результате проведенных исследований установ лено, что вирус, выделенный от человека, больного фекально-оралъ-1шм гепатитом ни-А, ни-В, при заражении яванских ыакак в экспериментальных условиях может вызывать у животных патологический процесс, похожий на гепатит, что в свою очередь еще раз подтверждает этиологическую связь этого вируса с заболеванием человека, условн называемым фекально-оральным гепатитом ни-А, ни-В.

Было известно, что в экспериментальных условиях надежно моде лировать ГА удавалось на шимпанзе и маряозетах (5,.Ве1пЛаг^, 197* Проведенные нами опыты по воспроизведению инфекции на серонегатив ных яванских макаках, бурых макаках и африканских зеленых мартышк при их заражении изолятами ВГА людей и штаммом ВГА ндз-15 , куль тивируемым в шхеточной культуре, закончилось также безрезультатно как описано в литературе (]?.1>е1п11агс№, <1.В.Се1п11агйЪ, 1985). Единственным признаком инфицирования этих животных было выявление анти-ВГА в низких титрах. Известно, что аналогичную картину наблк дали другие исследователи, как при заражении использованных нами видов обезьян, так и при заражении патас, бабуинов, буш-бэби, сое ных обезьян, шерстистых обезьян, беличьих обезьян, паукообразных обезьян, капуцинов и макак резусов изолятами ВГА людей (н.н.Вдгс

J,L.Dienstag, 1978). Вместе с тем, результаты серологического исследования этих видов обезьян указывали, что достаточно часто среди них встречаются особи, имеющие анти-НГА ( J.W.Eicfrberg, S.S.Kalter, 1980j J.L.Dienstag et al.,1976).Зти антитела обнаруживались как у животных, недавно отловленных в местах естественного обитания, так и у животных, долго содержащихся в неволе (P.Cour-saget et al., 1981; D.S.Barke et al.,1981>To, что с одной стороны у этих обезьян присутствовали в сыворотках анти-ВГА, а с другой стороны серонегативные особи оказались не восприимчивы к экспериментальному заражению, не позволяло четко представить, как эти животные приобретают анти-ВГА. Известно, что наличие анти-ВГА у высших обезьян рассматривается как результат инфекции ВГА, которым они заражаются от человека (W.D.Hilles, 19м). Что касается наличия анти-ВГА у других видов обезьян, было высказано предположение, что это, возможно, является результатом циркуляции ВГА или вируса, антигенно сходного с ним (d.s.Burke, G.B.Heisen, 1984). Факты, подтверждающие указанное предположение, отсутствовали.

Нами в процессе отбора обезьян для экспериментального моделирования фекально-оральиого гепатита ни-А, ни-В был выявлен спонтанный ГА у яванской макаки, подвергнутой воздействию иммунодепрес-сантов. У этого животного наблюдалось повьшение активности печеночных ферментов, экскреция с (фекалиями вирусоподобных частиц размером /¿7-30 нм, характерные для острого гепатита изменения печеночной ткани. Установлено, что выделенный вирус по своим морфологическим, биофизическим и антигенным свойстыам сходен с ВГА человека. Условно этот вирус был обозначен как штамм Ш-55. Принадлежность штамма Яы1-55 к ВГА была подтверждена специфическими серологическими методами ИЭм, ЗИЛ, РШ и методом молекулярной гибридизации с клонированным кДЯС ВГА.

Кроме яванских макак нам удалось выявить естественную инфекцию

ГА у бурых макак и африканских зеленых мартышек. Доказательстве» того, что незаражешше бурые макаки и африканские зеленые мартын ки болели ГА, служили: выявление анти-ВГА класса ш; повышение at тивности печеночных ферментов; характерные дал острого гепатита изменения печеночной ткани; экскреция с фекалиями вируса, принад лежность которого к ВГА также была подтверждена специфическими серологическими методами и методом молекулярной гибридизации с клонированным kJíIK ВГА.

Анализ полученных результатов дал основание предположить, что описанные наш спонтанные заболевания обезьян явились резуль татом естественного заражения ВГА обезьяньего происхождения.

Проведенные наш эксперименты показали, что ВГА штамм Яи-55 выделенный от яванской макаки при спонтанном ГА, является патоге ным для яванских макак, бурых макак и африканских зеленых мартыш и способен вызывать у них заболевание ГА.

Представлены результаты, указывающие на возможность провода изучение патогенеза и иммуногенеза ГА на указанных видах животш Показано, что печень обезьян, зараженных штаммом ВГА Дл-55, явля ется источником антигена ВГА, пригодного для специфической диагн стики ГА человека.

В целом, полученные данные изменяют существующее ранее пред] ставление об отсутствии у низших обезьян Старого Света естествен ной инфекции ГА и формируют новые перспективные направления, позволяющие проводить всестороннее изучение этой инфекции на досту них видах обезьян.

Культивирование вируса гепатита А в клеточных культурах

В результате интенсивных исследований за последние годы достигнуты значительные успехи в культивировании ВГА в клеточных культурах ( J.M.Crance et al., 1983; L.H.Birm et al., 1984-; R.J, Daemer et al., 1981). Вьдесте с тем, до настоящего времени ыехак

репродукции указанного вируса в клеточных системах остается не ясным.

Наши первые опыты по культивированию показали, что при воздействии субтоксических доз трипсина или желчи на клетки перевиваемых линий человеческого или обезьяньего происхождения возможно воспроизведение репродукции ВГА. Интенсивная репродукция вируса имела место на первых двух пассажах, но в последующих пассагах наблюдалось постепенное ее снижение и уже на 6-8 пассаже выявлять ВГА не удавалось. Такая же динамшса репродукции ВГА в других клеточных культурах была описана в литературе и другими исследователями ( S.A.Locarnini et al., 1981; D.A.Anderson et al., 1985). Анализируя полученные нами и другими учеными результаты, можно предположить, что при таком цикле репродукции ВГА в клеточных культурах B03J.io.v.''T образуется дефектное потомство популяции указанного вируса, которое не способно инфицировать клеточные культуры, что приводит к абортивной инфекции.

Эти условия культивирования ВГА в клеточных культурах оказались непригодными для получения вирусной массы, необходимой для осуществления специфической диагностики и профилактики ГА. Более перспективным оказался способ культивирования ВГА, заключающийся в его адаптации в культурах в течение длительного срока. Таким способом были адаптированы многие штаммы ВГА в различных культурах ( G.G.FrÖsner et al., 1979; P.J.Provost, M.K.Hilleman, 1978; L.N. Blnn et al., 1986), в том числе и штамм ВГА HAS-15 , адаптация которого была проведена на культуре клеток линий FHik-4 американскими исследователями ( D.W.Bradley et al., 1984).

Нами била изучена динамика репродукции штамма ВГА HAS-15 в культуре клеток линии EE£hk-4 с помощью методов ИЭМ. Показано, что процесс накопления ВГА лмел четко выраженный одноволновый характер и максимальное количество вирусных частиц обнаруживались

на '¿¿-¿В сутки. При изучении количественного соотношения полных и пустых частиц ИГА в динамике было выявлено, что в течение пер вых Ш суток в зараженной культуре клеток продуцируются только полные частицы ВГА, тогда как в последующие сроки в основном др. дуцируются пустые частицы указанного вируса.

Проведенное сопоставление продукции штамма ВГА EAS-15 в культуре клеток линии FBhk-4 , выращиваемых во вращающихся и стационарных флаконах показало, что количество частиц ВГА как в лизате клеток, так и особенно в культуральной жидкости заметно выше во вращающихся флаконах, чем в стационарных флаконах.

Проведенные эксперименты по адаптации шташа ВГА ЯУ-55 к культуре клеток линии FHht-4 показали, что при заражении указанной клеточной линии печеночными экстрактам обезьян, содержащими этот штамм вируса, адаптационный период ВГА до получения вь сокого уровня его репродукции составил четыре пассажа, то есть i целом 105-109 дней. В литературе описаны результаты пассирована двух штаммов ВГА has-15 и kBi/OOI на той же л1шш клеток FEhic-(D.W.Bradley et al,, 1984). По данным авторов,адаптационный период для штамма ВГА His-15 , выделенного от человека, больного ГА, до получения высокого уровня репродукции вируса составлял 7 пассажей (в целом ¿о0 дней). Адаптационный период для шталма ВГА ms-i/ooi, исходно выделенного от человека, а затем пассированного через мармозет, был короче - 116 дней. По мнению авторов, именно пассирование указанного штамма на обезьянах привело к сокращению адаптационного периода этого шташа в культуре клеток. Известно также, что ВГА, выделенный при спонтанном ГА у Панамских ночных обезьян, гораздо легче адаптировался к клеточной культуре, чем изоляты ВГА, непосредственно выделенные от людей ( s.M.Lemon et al., 1983; G.G.Frosner, 1983). С этими данными хорошо согласуются подученные наш результаты, указывающие на тс

что штамм ВГА Яы-55, выделенный при спонтанном ГА у яванской макаки, обладал способностью почти в два раза быстрее адаптироваться в культуре клеток, чем ВГА штамм наз-15 , выделенный от человека .

Показано, что на шестом пассаже ВГА штамма Яя-55 в культуре клеток линии РНЫс-Ч- интенсивное накопление внутриклеточных частиц указанного влруса, а также его антигена происходило до 14 дня культивирования. По сравнению со вторым днем культивирования на 14 день количество ВГА возрастало в 175-И80 раз, тогда как в последующие сроки количество вируса возрастало всего в 3-4 раза.

Полученные нами данные позволяют утверждать, что штамм ВГА ЯМ-55, прошедший адаптацию в культуре клеток РНЬк-4 , не уступает штамму КГА НАЗ-15 по способности репродуцироваться в этой клеточной системе, что позволяет использовать этот штамм (так же успешно, как и штамм ВГА НА&-15) для получения вирусной массы в клеточной системе, обеспечивающей работы по изучению ВГА и созданию средств специфической диагностики и профилактики ГА.

ОСНОВНЫЕ выводу

I. Показано, что параллельное исследование материалов методами ншуноэлектронной микроскопии и энзимоиммунологическим повышают вероятность выявления вируса гепатита А. В сравнительных опытах по изучению эффективности выявления вируса гепатита А этими методами установлено, что при наличии в нативных препаратах единичных "полных" частиц этого вируса их обнаружение возможно преимущественно методом ишуноэлектронной микроскопии. Энзимоиммунологи-ческий метод оказался более пригодным для определения антигена указанного вируса в тех препаратах, в которых присутствовали только пустые частицы вируса гепатита А и их фрагменты. В процессе использования энзимоиммунологического метода для выявления антигена вируса гепатита А установлено, что в фекальных пробах,' содержащих

и не содержащих этот вирус, может присутствовать материал, дают псевдоположительную реакцию, который блокируется отрицательными на антитела к вирусу гепатита А сыворотками человека и некоторы видов животных и угнетается в присутствии слабых неиопных детер гентов.

2. При отборе сывороток, положительных и отрицательных на антитела к вирусу гепатита А, выявлено, что уровень антител к указанному вирусу самый высокий в сыворотках ранних реконвалес-центов, взятых через 1-12 месяцев после заболевания гепатитом А Сыворотки поздних реконвалесцентов содержат антитела к этому вирусу на более низком уровне, чем ранних реконвалесцентов, но вы чем сыворотки лиц с отсутствием в анамнезе заболевания печени. Показано, что шушунноэлектронномшсроскопический и энзишиш^унол! гический методы обладают одинаковой чувствительностью для опред! ления наличия антител к вирусу гепатита А, однако для количественного определения указанных антител более пригоден энзимоишу] логический метод. Изучено форми рование иммунного ответа при ге: тите А в сравнении с друиыи энтеровирусаши. Показано, что в результате инфекции вирусом гепатита А у человека развивается в 25-800 раз больше специфических антител, чем после инфекции дру: ми энтеровирусами.

3. Предложены и научно обоснованы упрощенные и ускоренные метода исследования для обнаружения вируса гепатита А и антител против него. Показано, что разработанные модифицированный метод иммуноэлектронной микроскопии и метод комбинированной постанови радиоиммунологического и ишуноэлектронномикроскопического мето, в одном препарате позволяют исследовать материал на наличие вир: гепатита А в течение одного часа. По чувствительности и еяецифи ности они не отличаются от стандартных методов выявления этого вируса, постановка которых требует более дательного времени (6-36 часов).

Разработан модифицированный энзимоиммунологический метод для обнаружения вируса гепатита А и антител против него, пригодный для диагностических и эпидемпологических исследований в условиях типичной неспециализированной лаборатории практического профиля. Ыодиоицированный и стандартный энзимоиммунологяческие метода имеют примерно одинаковые показатели специфичности и чувствительности, но при этом модифицированный метод менее продолжителен (на 18-20 часов) и более прост.

Впервые для экспресс-диагностики гепатита А предложен непрямой метод флюоресцирующих антител, позволяющий определить иммуноглобулины класса м к вирусу гепатита А в сыворотках с использованием криостатных срезов печеночной ткани обезьян, содержащих антиген указанного вируса. Процедура постановки реакции, просмотра и интерпретации результатов занимает период времени, не превышающий 1,5 часов.

•1. Показана пригодность разработанных методов обнаружения вируса гепатита А и антител против него для осуществления специфической диагностики и изучения эпидемиологических аспектов гепатита А. Продемонстрирована высокая эффективность практического использования этих методов в целях экспресс-диагностики гепатита А.

5. С помощью методов электронной микроскопии проведены исследования, в результате которых установлены закономерности частоты выделения вируса гепатита А и других вирусных агентов с фекалиями в зависимости от эпидситуации, диагноза, возраста, срока и тяжести заболевания. Сравнение с помощью иммуноэлектронной микроскопии изолотов вируса гепатита А, собранных в различных географических зонах мира, показало, их антигенную идентичность независимо от места их выделения. Получена полная морфологическая характеристика материалов, содержащих частицы вируса гепатита А.

6. Получены данные, указывающие на циркуляцию вируса гепати-

та А в детских коллективах, где имели место случаи клинически выраженного заболевания гепатитом А. Показано также, что при ас томатической форме этой инфекции наблюдается экскреция вируса с фекалиями и образование иммуноглобулинов класса и к указанно!,¡у вирусу. При исследовании детских коллективов, благополучных по гепатиту А, циркуляция вируса гепатита А не была■выявлена.

7. Впервые установлено существование заболевания человека гепатитом, который ло клинической картине и механизму передачи сходен с гепатитом А, но не имеет этиологической связи с вируса! гепатита А, гепатита В и посттрансфузионного гепатита ни-А, ни-] Указанное заболевание было обозначено как фекально-оральный геп< тит ни-А, ни-В.

Впервые проведена идентификация вируса фекально-орального гепатита ни-А, ни-В и установлено, что он имеет сферическую фор; и размер '¿7-о0 нм, коэффициент седиментации 18^3 в сахарозе и представлен полными и пустыми частицами. Предполагается, что эк вирус менее стабилен, чем вирус гепатита А. доказано, что указа! ный вирус является отличным от вируса гепатита А этиологическим агентом, вызывающи.! заболевание гепатитом у человека при фекалы оральной передаче заразного начала.

Впервые создана тест-система для выявления вируса фекально-орального гепатита ни-А, ни-В и антител против него с использов; наем метода шмуноэлектронной микроскопии.

Впервые получены данные о достаточно широком распространен, фекально-орального гепатита ик-А, ни-В в Средней Азии СССР и в странах Юго-Восточной Азии и о его ограниченном распространении в Европейской части СССР.

Впервые продемонстрировано этиологическое участие вируса ф кально-орального гепатита ни-А, ни-В в водных вспышках гелатито подобного заболевания в Непале, Бирме, Пакистане, Судане, Сомал

Индии и Мексике.

8. Впервые установлена возможность моделирования фекально-орального гепатита ни-А, ни-В на яванских макаках. Показано, что при заражении обезьян материалами больных, содержащими вирус фе-кально-орального гепатита ни-А, ни-В, воспроизводится инфекция, которая сопровождается повышением уровня печеночных ферментов, экскрецией частиц указанного вируса с фекалиями, характерными для острого гепатита изменениями печеночной ткани и образованием антител к вирусу фекалыю-орального гепатита ни-А, ни-В.

9. Впервые установлена естественная инфекция гепатита А у яванских макак, бурых макак и африканских зеленых мартышек. Доказано, что среди указашшх видов обезьян имеет место циркуляция вируса, который по своим морфологическим, биофизическим, антигенным свойствам, по способности гибридизироваться с кДНК вируса гепатита А идентичен вирусу гепатита А человека и вызывает у обезьян клиническую картину заболевания, сходную с гепатитом А людей.

10. Впервые осуществлено экспериментальное моделирование гепатита А на серонегативных яванских макаках, бурых макаках и африканских золеных мартышках при их заражении штаммом вируса гепатита А Ям-55, выделенным от яванской макаки при спонтанном гепатите А. Доказана возможность изучения патогенеза и иммуногенеза гепатита А на указанных видах обезьян и показано, что печень животных, зараженных шташом вируса гепатита А Ям-55, является источником антигена вируса гепатита А, пригодным для проведения специфической диагностики гепатита А. Вместе с тем выявлено, что изоляты вируса гепатита А человеческого происхождения не способны воспроизвести инфекцию гепатита А на этих видах животных.

11. Впервые описана репродукция изолятов вируса гепатита А люден в клетках перевиваемых линий человеческого и обезьяньего происхождения, обработанных субтоксическими дозами трипсина или

- iäü -

желчи. Показано, что при этом способе культивирования интенсивн накопление вируса тлело место на первых двух пассажах. При поел дующих пассажах репродукция вируса поотелешю снижалась и затем прекращалась.

12. С помощью методов иыауноэлектрошшй микроскопии изучен; динамика репродукции шташа вируса гепатита A HAS-15 в культу, клеток линии Ffihk-4 и определены опиыальные сроки накопления полных и пустых частиц, внутриклеточного и внеклеточного вируса

13. Впервые проведена адаптация шташа вируса гепатита А ЯЫ-55 в культуре клеток линии FRhk-4 и показано, что указана штамм не уступает штамму вируса гепатита A has-15 по cnocoi ности репродуцироваться в этой клеточной системе.

ClüiCOK 0ЦУШД\0ВА1ПШ РАБОТ

По теме диссертации опубликовано 57 работ, из которых след; щие o¿ работы наиболее полно отражают содержание исследования:

i. Опыт обследования больных инспекционным гепатитом с прим< нением метода обнаружения вируса / С.С.Савинская, А.Г.Андаапари, м.С.Балаян, Г.С.Кантор, ni. Б.Королев и ду. - цу^н. ыикробиол., эпидемиол. и иммунобиологии, 1973, J« 7, с. 96-100.

¿. Andjaparidze A.G., Tolskaya Е.А., Balayan M.S. Successf: attempt to propagate hepatitis A virus in a tissue culture syst - Hap at. Scient. Memoranda, 1979, N 2, p. 4-.

3. О возможности воспроизведения инфекции вируса гепатита в клеточных системах / м.С.Балаян, А.Г.Анджапаридзе, Е.А.Тольск т.С.Колесникова. - Вопр.вирусологии, 1979, ß 6, с. 675-676.

4. Анджапаридзе А.Г., Тольская Е.А., Балаян ы.С. Новая мод фикация метода шл^уноэлектронной микроскопии для выявления виру гепатита А. - В кн.: Вирусные гепатиты. Сб.трудов, м., 1980,

с. 10-13.

5. Современные вирусологические и эпидемиологические аспекты изучения вирусного гепатита Л / А.Г.Анджапаридзе, С.С.Савин-ская, Е.А.Тольская, -л.С.Балаян. - В кн.: Вирусные инфекции. Сб. трудов, Свердловск, IS80, с. 88-91.

6. Балаян ы.С., Андкапаридзе А.Г., Тольская Е.А. Способ получения вируса гепатита А. - Авторское свидетельство й 8I08II. Б.К., 1980, JS 19.

7. Вирусологические находки в материалах от больных с диагнозом инфекционный гепатит / А.Г.Анджапаридзе, С.С.Савинская, Е.А. Тольская, 1Л.К.»ламедов, ы.С.Балаян. - В кн.: Вирусные инфекции человека. Тез.докл. гл., 1981, с. Ü17.

8. Водная вспышка гепатита А на севере Якутской АССР / С.С. Савшская, А.Е.Аненков, А.Г.Андаапаридзе, ¡¿¡.С.Балаян и др. - В кн.: Вопросы региональной гигиены, санитарии и эпидемиологли. Тез.докл. Якутск, 198¿, с. 8¿-85.

9. ыамедов ы.К., Балаян гл.С., Анджапаридзе. Современные методы обнаружения вируса гепатита А и антител против этого вируса. -¿¡урн.микробиологии, эпидемлологии и иммунобиологии, I98Ü, № 10,

с. 3-10.

10. The spread of hepatitis A viras in connection with hepatitis cases in children's communities / M.S.Balayan, M.D.Aleyiiic, S.S.Savinskaya, A.G.Andjaparidze et al. - Inj Ball, of the WHO, 1982, v.60, N 2, p. 243-251.

11. Balayan M.С., Andjaparidze A.G., S.S.Savinskaya. Evidence for a causative agent of human Non-A, Hon-B hepatitis transmited via fecal-oral ronte. - Ins Hepatitis Scientific memoranda, 1982, N 4, p. 51-53.

12. Вирусный гепатит, сходный.по клинике и эпидемиологии с гепатитом А, но отличающийся от него этиологически / М.С.Балаян, В.И.Агафонов, А.Г.Андаапаридзе и др. - Журн. микробиол., эпидемиол.

и иммунобиологии. IS8ü, JS 8, с. 79-83.

13. Клиническое значение выявления специфических маркер вирусного гепатита А у детей / И.В.Шахгильдян, А.Г.Андаапарл М.С.Балаян и др. - Вопросы охраны материнства и детства, 198 т.гч, № 7, с. 13-18.

14. Морфологические находки в пробах фекалий, содержали рус гепатита А / А.Г.Анджапаридзе, м.С.Балаян, Ы.А.Горюнова, мамедов. - В кн.: Упидемнология, диагностика, клиника и лече вирусных гепатитов. Сб.трудов, Горький, 1985, с. 39-4¿.

15. Evidence for a virus in Non-A, iíon-B hepatitis tran¡ ted via fecal-oral ronte / M.S.Balayan, A.G.Andjaparidze, S.I vinskaya et el. - Intervirology, 1983, v. 20, p. 2>-31.

16. ыаыедов M.K., Балаян i.i.C., Анджапаридзе А.Г. Способ ружения вируса гепатита А и антител к нему. - Авторское свид ство Ш IQ76I¿I. Б.И., 1983, Si ¿4.

17. Enzyme-immunoassay in the diagnosis of human hepati speaific and non-spesific reactions / E.A.Tolskaya, S.S.Savi M.S.Balayan, A.G.Andjaparidze et al. - Acta virologica, 1983 N 27, p. 43-50.

18. Анджапаридзе А.Г., Горюнова И.Л., моделирование $ei орального гепатита ни-А, ни-В на обезьянах. - В кн.: Вирусы века и животных. Тез.докл., tura, 1984, с. 7.

19. мамедов wi.K., Андаапаридзе А .Г., Балаян ы.С. tu3¿-aC упрощенной модификации энзимоиымуносорбентного метода обнару вируса гепатита А и антител хс нему. - В кн.: Вирусные гепатг Сб. трудов, ¿.-и, 1983, с. I7-/¿¿¡.

¿0. Андаапаридзе А.Г., Балаян м.С., Полещук B.<¡>. üiccnei тальное изучение на обезьянах вирусного гепатита, передающег Фекально-оральным путем и отличающегося этиологически от гег та А. - В кн.: 71 Всеооюзн. конфер. по клинической биохимии,

фологик и иммунологии инфекционных болезней. Тез.докл., Рига, 1983, с. ¿49-¿50.

¿1. Анджапаридзе А.Г., Балаян ja.С., Ыасташенко Т.А. Комбинация радиоиммунологического и иммуноэлектронномикроскопического методов для обнаружения вируса гепатита А. - Вопроси вирусологии,

1983, jTí 4, с. 65-68.

22. Вирусы в фекалиях больных вирусным гепатитом и другими энтеровирусными инфекциями / А.Г.Андаапаридзе, м.С.Балаян, С.С. Савннская и др. - Вопр. вирусологии, 1984, № о • С • 559-566.

23. Antibody response in hepatitis A and some other entero-viral infections: Quantitative comparison / A. G.Andjjaparidze, E.A.Tolskaya, m.S.Kolesnikova, M.S.Balayan. - Acta virologica,

1984, v. 28, p. 53-55.

24. Использование срезов ткани печени обезьяны, содержащей антиген ВГА, для выявления специфических igM методом шмуно-флгаоресценцин / А.Г.Анджапаридзе, И.Н.Гавриловская, И.А.Замятина, i.j.С.Балаян.- в кн.: Вирусные гепатиты. Сб. трудов, м., 1984,

с. -iü-46.

25. Анджапаридзе А.Г., Балаян ivi.C. дальнейшее изучение гепатита ни-А, ни-В, передающегося текально-оральным путем. - В кн.: Вирусные гепатиты. Сб. трудов, м., 1984, с. 76-82.

26. Культивирование и свойства вируса гепатита А. / м.С.Балаян, Ю.Ю.Кусов, Г.П.Флеер,... А.Г.Анджапаридзе. - В кн.: Вирусные гепатиты. Сб. трудов. í.l., 1984, с. 29-36.

27. Новая нозологическая форма вирусного гепатита, передающаяся (Текально-оральным путем / м.С.Балаян, А.Г.Анджапаридзе,

С.С.Савннская и др. - В кн.: Вирусные гепатиты. Сб. трудов, Ташкент, 1985, с. 14-24.

28. Спонтанный гепатит у яванской макаки, подвергнутой воздействию иммунодепрессантов / А.Г.Андаапаридзе, В.Ф.Полещук, Н.А.

Замятина и др. - Вопр. вирусологии, 1У85, J5 4, с. -±68-473.

29. Воспроизведение на обезьянах гепатита ни-А, ни-В, j дающегося фекально-оральным путем / А.К.Анджапаридзе, ui.C.B; А.П.Савшов и др. - Вопр. вирусологии, 1986, $ I, с. 73-81.

30. Накопление инфекционного вируса и вирусного антиги размножении вируса гепатита А в культуре клеток почки эмбрш макаки резус ( FBlik-A-) / Ю.Ю.Кусов, Г.П.Флеер, Т.И.Заводовг А.Г.Анджапаридзе, ... - Вопр. вирусологии, 1У87, й 3, с. 30',

31. Адаптация штамма вируса гепатита А (Ям-55), исходш генного для обезьян, к клеточной культуре / А.Г.Анджапаридзе Т.Ы.Орлова, 1.1 .С.Балаян, Ю.Ю.Кусов. - мол. генетика, шкробш вирусол., 1987, Д 5, с. 40—i-i.

32. Анджапаридзе А.Г., Поленек В.Ф., Балаян i.l.G. Штамм са гепатита А, используемый для приготовления специфических ностических препаратов. - Авторское свидетельство i." 1328376, 1987, й 29.

Соискатель