Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Циркуляция вируса гепатита E кроликов на территориях с разной степенью эндемичности по гепатиту E

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Циркуляция вируса гепатита E кроликов на территориях с разной степенью эндемичности по гепатиту E"

На правах рукописи

иМ^^ииШ]

Мохаммед Ахмед Мохаммед Еладли

Циркуляция вируса гепатита Е кроликов на территориях с разной степенью эндемичности по гепатиту Е

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2015

005570523

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» и в Федерельном государственном автономном образовательном учреждении высшего образования «Российский университет дружбы народов»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАН Михайлов Михаил Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, академик РАН, директор ФГБНУ «Институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова»

доктор медицинских наук, ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, заведующий научно-консультативным клинико-диагностическим центром

Ведущая организация ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

Защита диссертации состоится 19 июня 2015 г. в 10 часов 00 минут на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 на базе ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» по адресу 142782, Москва, поселение Московский, поселок Института полиомиелита, 27 км. Киевского шоссе.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» и на сайте http://poliomyelit.ru.

Автореферат разослан « С » 1идЛ_2015 г.

Ученый секретарь диссертацонного совета,

кандидат биологических наук /'Т^Ч Романова Лидия Юрьевна

Зверев

Виталий Васильевич

Чуланов

Владимир Петрович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность и степень разработанности темы

Вирус гепатита Е (ВГЕ) является этиологическим агентом острого гепатита. В развитых странах, находящихся в умеренном климатическом поясе, последние годы наблюдается спорадическая заболеваемость гепатитом Е (ТЕ), связанная не только с посещением гиперэндемичных территорий, но и с автохтонными случаями инфекции, вызванной 3 и 4 генотипами ВГЕ. В настоящее время установлено, что ГЕ, ассоциированный с 3 и 4 генотипами вируса, является зоонозной инфекцией, что подтверждается существованием случаев заражения людей при употреблении в пищу недостаточно обработанного термически мяса инфицированных животных, преимущественно свиней. Исчерпывающим доказательством того, что именно мясо животных служит источником вируса, является идентичность нуклеотидных последовательностей ВГЕ, выделенных от заболевших и из мясных продуктов.

Открытия последних лет показали разнообразие циркулирующих вариантов вируса ГЕ. Были определены последовательности изолятов ВГЕ, выделенных от различных видов животных, таких как олени, мангусты, кролики и крысы. На основании результатов анализа геномных последовательностей вирусов, выделенных от животных, сделано предположение о существовании новых видов. Помимо собственно ВГЕ, представленного четырьмя (или пятью) генотипами, описана еще целая группа сходных вирусов животных, которая, по-видимому, будет только увеличиваться по мере проведения исследований. Однако с точки зрения патологии человека интерес представляют только четыре генотипа ВГЕ -генотипы 1 и 2, способные инфицировать только человека, и генотипы 3 и 4, способные инфицировать как человека, так и животных (преимущественно свиней и оленей).

В настоящее время отсутствует четкое понимание механизма реализации пищевого пути передачи ВГЕ от инфицированного животного к человеку. Наибольшее число случаев заражения связаны с употреблением в пищу печени животных. Очевидно, наибольший интерес представляет изучение свойств вируса и механизмов его передачи среди животных, с которыми возможен непосредственный контакт человека (например, разведение в условиях ферм, употребление в пищу).

В 2009 году С. Zhao с соавторами описали выделенный в Китае от домашнего кролика вариант ВГЕ, и предположили его принадлежность к новому генотипу вируса. При изучении распространенности ВГЕ среди кроликов, содержащихся на фермах различных регионов мира (США, Китай, Франция), а также в популяциях диких кроликов, было показано, что эти животные могут являться резервуаром вируса и, вероятно, вызывать инфекцию у человека. Анализ нуклеотидной последовательности полного генома вируса показал сходство с генотипами 1—4 ВГЕ на 72,2-78,2%, при этом наиболее близким он оказался к третьему генотипу ВГЕ. Показано, что ВГЕ кроликов эффективно реплицируется в человеческих клеточных линиях. Таким образом, возможность передачи ВГЕ кроликов человеку поднимает важную проблему общественного здравоохранения по безопасности пищевых продуктов и зоонозных рисков. Данные по распространенности и генетическом разнообразии ВГЕ кроликов в Российской Федерации и на сопредельных территориях отсутствуют, равно как и сведения о выявлении ВГЕ кроликов у людей, заболевших ГЕ.

Вышеизложенное определяет актуальность диссертационной темы. Цель работы

Целью исследования является определение распространенности и генетического разнообразия вируса гепатита Е кроликов на территориях с разной степенью эндемичности по гепатиту Е.

Задачи исследования

1. Отработать методики детекции анти-ВГЕ и РНК ВГЕ кроликов в биологичнских образцах.

2. Определить распространенность ВГЕ среди поголовья кроликов на территориях с разной степенью эндемичности в отношении гепатита Е (Россия, Белоруссия, Египет).

3. Установить возраст животных, в котором преимущественно происходит инфицирование ВГЕ.

4. Провести анализ генетического разнообразия вариантов ВГЕ, выделенных от кроликов.

Научные положения, выносимые на защиту

1. Вирус гепатита Е кроликов широко распространен на негиперэндемичных по гепатиту Е территориях, к которым относятся Российская Федерация и Республика Беларусь.

2. Циркуляция среди кроликов вируса гепатита Е в Египте, гиперэндемичном по гепатиту Е регионе, не установлена.

3. Все выделяемые от кроликов изоляты ВГЕ относятся к одному геноварианту, близкому к генотипу 3 ВГЕ, но отличному от него; среди людей и свиней ВГЕ кроликов не встречается.

4. Отсуствие случаев выявления вируса гепатита Е кроликов у людей и у свиней на территории РФ свидетельствует об ограниченном значении данного варианта ВГЕ для патологии человека.

Научная новизна работы

Впервые установлено, что вирус гепатита Е кроликов циркулирует на территории Российской Федерации и Республики Беларусь, но, по-видимому, не встречается в гиперэндемичном по гепатиту Е регионе -Египте.

Впервые показано, что вирус гепатита Е кроликов широко распространен среди кроликов в возрасте до 6 месяцев на территории Российской Федерации и Республики Беларусь; на это указывают высокая частота выявления анти-ВГЕ (до 82,2%) и РНК ВГЕ (от 2,2% до 30%).

Доказано, что изоляты ВГЕ кроликов не связаны генетически с изолятами ВГЕ человека и свиней, выделенными на тех же территориях, что не позволяет рассматривать кроликов в качестве резервуара патогенных для человека штаммов ВГЕ.

Теоретическая и практическая значимость и внедрение результатов

На основании выполненных исследований установлена широкая распространенность вируса гепатита Е кроликов на территории России и Беларуси. Доказано, что кроличьи штаммы ВГЕ, по-видимому, редко переходят межвидовой барьер, их циркуляция в человеческой популяции, а также среди свиней не установлена. Описаны первые отечественные штаммы вируса гепатита Е кроликов. В базе данных ОепВапк депонированы 16 последовательностей вируса гепатита Е кроликов (номера КР144111 - КР144126). Полученные данные о распространенности ВГЕ-инфекции у кроликов и выделенные изоляты вируса служат основой для создания экспериментальной модели гепатита Е.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на УШ Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2014» (г. Москва, март 2014 года), на конференции молодых ученых Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (апрель 2013 г., Москва).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в Перечень рецензируемых изданий, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 122 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 14 отечественных и 182 зарубежных источников. Диссертационная работа иллюстрирована 11 таблицами и 10 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Основным материалом исследования являлись образцы сыворотки

крови и фекалий кроликов, а также образцы фекалий свиней. Анти-ВГЕ

класса определяли методом ИФА в образцах сыворотки крови,

полученных от выращенных на фермах кроликов в возрасте до 6-ти

месяцев. Всего было обследовано 95 образцов сыворотки крови: из

Москвы —27 образцов, Московской области — 28 и Белоруссии — 40.

Анти-ВГЕ класса определяли в образцах сыворотки крови кроликов с

помощью коммерческого диагностикума ДС-ИФА-АНТИ-НЕУ-О

(производство НПО «Диагностические системы», Россия). Поскольку

данный набор предназначен для выявления анти-ВГЕ человека с

видоспецифичным конъюгатом, в постановке вместо конъюгата из набора

использовали анти-кроличий конъюгат (Антитела козьи, аффинно-

очищенные, специфичные к иммуноглобулинам 1§А, 1§М кролика,

меченные перкоксидазой хрена; произвоодство "ИМТЕК", Россия) в

разведении 1:10000 в фосфатно-солевом буфере.

-7-

РНК ВГЕ определяли в образцах фекалий кроликов возрасте от 2 до 12 месяцев. Всего было собрано и протестировано на наличие РНК ВГЕ 482 образца фекалий кроликов (Таблица 1).

Таблица 1. Исследованные образцы фекалий кроликов на фермах в трех странах____

Страна Регион Количество ферм Количество исследованных образцов фекалий

Российская г. Москва 1 29

Федерация Московская область, г. Электрогорск 2 85

Белгородская область 2 40

Свердловская область 1 52

Республика Беларусь Республика Беларусь 2 103

Египет Луксор 1 48

Файюм 1 45

Каир 1 28

Банха 1 52

Всего 12 482

Сбор материала выполнялся в период с май 2012г. по декабрь 2014 г. Все образцы собирались индивидуально от кроликов на фермах на территории РФ, Египта и Республики Беларусь. На территории РФ были обследованы 6 ферм, расположенных в 4 регионах — г. Москва, Московская область (г. Электрогорск), Белгородская область (районы Старый Оскол и Корочанский), Свердловская область; на территории Египта были обследованы 4 фермы (города Луксор, Файюм, Каир, Банха), в Беларуси были обследованы 2 фермы.

РНК ВГЕ определяли в образцах фекалий свиней, собранных индивидуально на свинофермах Белгородской области - региона РФ, где регистрируется самая высокая в РФ заболеваемость ГЕ. Были

протестированы 811 образцов, собранных на 8 фермах в 7 районах области (Таблица 2).

Таблица 2. Исследованные образцы фекалий на свинофермах в 7 регионах РФ

Районы Белгородской области Количество ферм Количество исследованных образцов

Старый Оскол 1 105

Ивнянский район 2 200

Ракитянский район 1 105

Фрунзенский район 1 101

Губкинский район 1 100

Красногвардейский район 1 100

Алексеевский район 1 100

Всего 8 811

Для выделения нуклеиновых кислот из образцов фекалий готовили 10% осветленный фекальный экстракт. Нуклеиновые кислоты выделяли из осветленных фекальных экстрактов с помощью набора для выделения нуклеиновых кислот (производство НПО «Литех») по протоколу производителя.

Амплификация фрагментов генома ВГЕ в ПЦР

Выявление РНК ВГЕ проводили в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦ) с вырожденными праймерами к участку открытой рамки считывания 2 (ОРС 2) ВГЕ (Таблица 3).

Таблица 3. Олигонуклеотиды, применявшиеся для амплификации РНК ВГЕ

Последовательности Положение Направление Позиция в геноме ВГЕ*

5' - аау tat gem cag tac egg gtt g -3' Внешний Прямой 5687 -5708

5' - ccc tta tcc tgc tga gca ttc te -3' Внешний Обратный 6395-6414

5' - gty atg yty tgc ata cat ggc t -3' Внутренний Прямой 5972-5993

5' - age cga cga aat yaa ttc tgt с -3' Внутренний Обратный 6298 -6319

* — нумерация нуклеотидных позиций приведена по штамму ВГЕ Burma (номер в базе данных GenBank М73218)

Первый раунд ПЦР проводили совмещено с ОТ, условия реакции были следующими: 42 °С - 1 час, затем 5 мин. - 94 °С (денатурация и инактивация обратной транскриптазы), затем 35 циклов: 94 °С - 30 сек, 45 °С - 30 сек., 72 °С - 45 сек., финальная элонгация - 72 °С - 7 мин.

Условия для второго раунда ПЦР - 35 циклов: 94 °С - 30 сек, 45 °С - 30 сек., 72 °С - 45 сек., финальная элонгация - 72 °С - 7 мин. Полученные продукты ПЦР, соответствующие ВГЕ, определяли в 1,5% агарозном геле в TBE. Величина продукта амплификации для ВГЕ составляла 350 пар оснований.

Для выделенных от кроликов изолятов ВГЕ определяли нуклеотидную последовательность амплифицированного участка ОРС2 вирусного генома величиной 300 нуклеотидов. Для определения нуклеотидной последовательности анализируемых фрагментов вирусных геномов проводили секвенирование ампликонов. Секвенирование осуществляли с использованием набора GenomeLabTMMethods Development Kit Dye Terminator Cycle Sequencing ("Beckman Coulter", США), согласно протоколу производителя. Полученные нуклеотидные последовательности фрагментов вирусных геномов выравнивали друг с другом и с соответствующими им участками полных и частичных геномных последовательностей анализируемых вирусов, доступными в GenBank на момент проведения исследования, с помощью программы MEGA версии 5.05. Статистические методы

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием пакета прикладных программ GraphPad Prism 4 и электронных таблиц Excel 2010. Для статистической оценки достоверности полученных данных использовали точный тест Фишера (Fisher's exact test). Различия оценивались как достоверные при вероятности 95% (р <0,05).

Результаты и их обсуждение Выявление анти-ВГЕ среди кроликов

Результаты выявления анти-ВГЕ в образцах сыворотки крови кроликов в возрасте до 6-ти месяцев приведены в Таблице 4. Большинство образцов сыворотки крови, полученных от кроликов в Москве и Московской области, были позитивными по анти-ВГЕ класса (22/27 и 23/28, соответственно). Достоверно реже анти-ВГЕ выявляли у кроликов из Республики Беларусь (5/40, р<0,05). Анти-ВГЕ являются

анамнестическими, то есть указывают на имевшую место ранее встречу с ВГЕ, поэтому полученные результаты указывают на более интенсивную циркуляцию ВГЕ среди кроликов на фермах в Московской области и г. Москве по сравнению с Республикой Беларусь. Таким образом, к возрасту 6 месяцев большинство кроликов на двух из трех обследованых ферм уже встречались с ВГЕ.

Таблица 4. Частота обнаружения анти-ВГЕ класса IgG среди кроликов

Регион N образцов Частота выявления анти-ВГЕ (%)

г. Москва 27 81,5%

Московская обл. (г.Электрогорск) 28 82,2 %

Республика Беларусь 40 12,5%

По данным литературы, частота выявления анти-ВГЕ может значительно варьировать от фермы к ферме. Так, в США частота выявления анти-ВГЕ у кроликов от одного поставщика составляла 40%, у другого - 50% (5/10). Причем первый поставщик являлся производителем SPF кроликов (Birke L. et al., 2014). На двух других фермах в штате Вирджиния (США) распространенность анти-ВГЕ у кроликов составила 36%, в Китае (провинция Ганьсу) 55% - 57% (Caitlin М.С. et al., 2011). С

одной стороны, различия между данными, полученными в разных

- И -

исследованиях, могут быть связаны с различиями в чувствительности и специфичности применяемых ИФА-тестов. Однако в нашем исследовании все постановки на анти-ВГЕ выполнялись с одной тест-системой, высокая специфичность и чувствительность которой при тестировании человеческих образцов была доказана в испытаниях (Drobeniuc J. el al., 2010). Поэтому различия в частоте выявления анти-ВГЕ у кроликов в разных регионах не связаны с методологией. По-видимому, различия по частоте выявления анти-ВГЕ связаны с различиями в возрасте животных, при котором чаще происходит инфицирование. А это, в свою очередь, зависит от условий содержания животных. Вероятно, на ферме в Республике Беларусь, откуда были получены сыворотки для нашего исследования, инфицирование кроликов происходит в более поздние сроки.

Определение РНК ВГЕ в образцах фекалий от кроликов

При исследовании 482 образцов фекальных экстрактов кроликов РНК ВГЕ была выявлена в 26 образцах. На фермах в РФ и Республике Беларусь, где ВГЕ-инфекция у кроликов была выявлена, частота обнаружения РНК ВГЕ варьировала от 2,2% до 30%. Различия между показателями были статистически значимыми (р<0,05) (Таблица 5). Это сопоставимо с данными по частоте выявления РНК ВГЕ у кроликов на фермах США, Китая и Франции (от 7% до 16,5%) (Geng Y. et al., 2011; Caitlin M.C. et al., 2011; Izopet J. et al., 2012).

РНК ВГЕ в образцах фекалий кроликов из остальных регионов (Белгородская и Свердловская области РФ, Египет) выявлена не была. Поскольку в этих регионах были обследованы животные разных возрастов (от 2 до 12 месяцев), отрицательный результат поиска РНК ВГЕ отражает скорее истинное отсутствие циркуляции вируса на этих фермах, а не ошибки в сборе образцов.

Страна Регион/ферма Возраст животных N образцов Частота выявления РНК ВГЕ (%)

Российская Федерация г.Москва 4-6 мес. 29 13,8%

Московская область, г. Электрогорск, ферма 1 2-10 мес. 40 10,0%

Московская область, г. Электрогорск, ферма 2 0-10 мес. 45 2,2%

Белгородская область (Старый Оскол) 2-12 мес. 20 0%

Белгородская область (Корочанской район) 8 мес. 20 0%

Свердловская область 0-12 мес. 52 0%

Республика Беларусь Ферма 1 4-6 мес. 73 11,0%

Ферма 2 2-6 мес. 30 30,0%

Египет Луксор 4-12 мес. 48 0%

Файюм 2-12 мес. 45 0%

Каир 3-8 мес. 28 0%

Банха 0-6 мес. 52 0%

Для того чтобы установить, в каком возрасте у кроликов преимущественно регистрируется ВГЕ-инфекция, было проанализировано распределение позитивных случаев в зависимости от возраста животных. Животные разных возрастов были обследованы на трех фермах, где был выявлен ВГЕ кроликов - двух в Московской области и одной в Республике Беларусь. Распределение случаев выявления РНК ВГЕ среди кроликов разных возрастов приведено в Таблице 6.

Большинство обследованных животных имело возраст 4-6 месяцев,

и среди них частота ВГЕ-инфекции варьировала от 0% до 25%. Между

обследованными фермами существовали различия не только по частоте

выявления ВГЕ-инфекции, но и по возрасту животных, в котором чаще

выявляется ВГЕ. Так, на ферме 1 в Московской области РНК ВГЕ не была

-13-

выявлена у животных моложе 6 месяцев, хотя встречалась у более старших животных (6-10 месяцев). В то же время на второй ферме в этом регионе и на ферме 1 в Республике Беларусь ВГЕ-инфекция выявлялась преимущественно у животных в возрасте до 4 месяцев. Выявленные различия, по-видимому, отражают разные подходы к содержанию животных. Таким образом, большинство случаев ВГЕ-инфекции у кроликов происходит в возрасте до 6 месяцев. На это же указывает и высокая частота выявления анти-ВГЕ у животных этого возраста.

Таблица 6. Частота выявления РНК ВГЕ у кроликов в зависимости от возраста.___

Ферма Возраст животных Частота выявления РНК ВГЕ (%)

Ферма 1, Московская обл. 2-6 месяцев 0/12 (0%)

6-10 месяцев 4/28 (14,3%)

Ферма 2, Московская обл. 0-4 месяца 1/35 (2,9%)

4-10 месяцев 0/10 (0%)

Ферма 1, Республика Беларусь 0-4 месяца 4/10 (40,0%)

4-6 месяцев 5/20 (25,0%)

Определение РНК ВГЕ в образцах фекалий свиней

Одновременно с поиском РНК ВГЕ кроликов нами была определена распространенность ВГЕ среди поголовья свиней в Белогородской области - регионе РФ, где регистрируется самая высокая в РФ заболеваемость ГЕ. Целью этого раздела работы являлось определение вклада двух видов животных - кроликов и свиней в поддержание циркуляции ВГЕ в регионе и поиск связи между случаями заболевания людей и вирусами животных. Для достижения этой цели необходимо было получить нуклеотидные последовательности ВГЕ не только кроликов, но и свиней, и сравнить их с последовательностями ВГЕ, выделенными от заболевших людей. Для создания рабочей базы данных свиных изолятов ВГЕ нами было протестировано 811 образцов фекальных экстрактов от свиней разных

возрастов, содержащихся на фермах 8 районов Белгородской области. РНК ВГЕ была выявлена в 241 образце.

У животных в возрасте 3-4 месяца частота выявления РНК ВГЕ варьировала от 39% (Старый Оскол) до 98% (Фрунзенский район). У животных моложе 2 месяцев и старше 1,5 лет (свиноматок) не было выявлено ни одного случая ВГЕ-инфекции. Среди животных, достигших возраста забоя (170-210 дней) был выявлен только один случай ВГЕ-инфекции (Таблица 7).

Таким образом, в большинство случаев ВГЕ-инфекция у свиней в Белгородской области протекает в возрасте 2-4 месяца, до достижения возраста забоя. В принципе, это совпадает с возрастом, в котором чаще выявляется ВГЕ-инфекция и у свиней на территории РФ (2-4 месяца) (Солонин С.А. и др., 2009).

Таблица 7. Частота выявления РНК ВГЕ методом ОТ-ПЦР в образцах фекалий свиней на территории Белгородской области

Регион Количество обследованных образцов Возраст, ДНИ Наличие РНК ВГЕ

N %

Старый Оскол 105 120 40 39,0

Ивнянский район 100 1,5-2,5 года Не обнаружено

Корочанский район 100 35-50 Не обнаружено

Ракитянский район 105 105-177 1 0,9

Фрунзенский район 101 90 99 98,0

Губкинский район 100 170-210 1 1,0

Красногвардейский район 100 90 45 45,0

Алексеевский район 100 104 55 55,0

Всего 811 241 30,5

Анализ нуклеотидных последовательностей ВГЕ

Для филогенетического анализа выявленных фрагментов генома ВГЕ в базе данных GenBank нами были отобраны референсные последовательности изолятов вируса ГЕ кроликов, полученных в Китае и Франции, а также большое число последовательностей ВГЕ от человека и свиней различных генотипов и субтипов, циркулирующих в разных регионах мира. В анализ филогенетических взаимоотношений также включены выделенные ранее на территории РФ изоляты ВГЕ от людей, заболевших ГЕ (вспышка и спорадические случаи) и изоляты ВГЕ от свиней.

Результаты филогенетического анализапоказали, что выделенные нами изоляты вируса ВГЕ кроликов образовывали единый кластер со всеми известными на сегодняшний момент последовательностями ВГЕ кроликов, формируя филогруппу ВГЕ кроликов, близкую генотипу 3 ВГЕ (Рисунок 1).

Последовательности ВГЕ кроликов из Республики Беларусь (обозначены на рисунке 1 как Rabbit Belor) формируют на филогенетиченском дереве единую, довольно однородную группу, со степенью сходства внутри группы 98-100%. Изоляты из Московского региона формируют две независимые группы — в одну вошли два изолята из г. Москвы (78 Rabbit Mose 2013 и 79 Rabbit Mose 2013 на рисунке 1), во вторую — все остальные изоляты из Москвы и Московской области. Степень сходства между последовательностями двух групп изолятов из Московского региона - 84%, степень сходства внутри групп - 99-100%.

15 F3 Bat »WW* 2013 23 F3 Bat »wtoa2013

21 F3 Brt swine 2013 17 F3 Bel SWIM 2013 34 F3 8*1 swirw 2013 30 F3 Bat (WVM 2013 »»03 Bai F3 swirw 2012 5333 F4 swma Bat 2012 37 F3 Bai «win* 2013 36 F3 BalSWin« 2013 2a F3 B*i swina 2013 «a F3 Be4 swina 2013 AF503512 3e AY362357 M 3e AB094231 3e

repeats SCI Vlad human 2008 hep trie SC2 Vktd feaiur 2008 AB073911 3e

3 swine 2012 HE.v Bel 3 human 2012 HEV BfH 1 human 2012

heperus FSC1 VlatJ human 2009 — hepErus OB2 Vlad human 2009 hepErus OB1 Vlad human 2009 — hfcperus 063 Viod huiian 2009 594Vlad human 2013 1202Vljd fxman 2012 eal 553V1ad human 2013

4069кЛаЬ.1 swme 2009 Ü4J— HEV Bei hieran 5 2014 («Г^— HEV Bei 4 human 2013

1-5638 Bei Fl swine 2012

43Q|— AY0327S7 3t AY032758 3T AF332620 ЗГ AF336236 31 AY323506 3f юа 4i72enat.i swme2008 4352etiat 3 swine 2008 i

2010

AF456784 H 3g

__T5109kaiin 1 swine 2009

100— 5l30katin 2 s*me 2009

-AB 10590Э S.3a

-HEV Bei 2 hunan 2012

-AP003430 H 3b

AF296167 H 3d 10Cf AY1154Ö8 S 3) до!— 4586sar2 swfie 2009

-4677sar 3 Swine 2009

AF336290 S 3C AF336293 3C

JQ013792 RaöUt France JQ013791 Rabbtt France 11 Rabbft Betör 2014 17 Rabbit Balor 2014 10 Rabbit Baior 2014 С Rabtort Bator 2014 3 Rabbit B« lor 2014 » Rabbit Веют 2014 »Rabbit Betör2013 7 Rabbit Bator 2013 «R^>brt Ba»of 2013 5 Rabbit Bator 2013 " 4 Rabbit Ba Юг 2013 4 Rabtut Betör 2014 23 Rabbit Bator 2013 J 29 Rabbit Bator 2013 641 Rabbit Bator 2013 » Rabbit Bator 2014

_г 7» Rabbit Mose 2013

10CT 79 Rabbit Mom 2013

JQ 013/93 Htv human France AB74J229 RaOtwt CJwvVMongoita KF 564258 HEV raDL*t Cftna JQ 065074 HEV raunt China AB 740220 HEV rabbit Ch*\aiMongc*a • JX 566469 USA HEV rabWt FJ906895 RaüOrt CTima AO 740222 HEV rat»rt China/Mongolia ' M Rabbit Mose 2013 3» Rabbit Mom 2014 13 Rabbit Mose 2013 40 Raoblt Mose 2014 15 Rabbit Mose 2014 30 Rabbit Mose 2014 FJ906896 Rabtxt Choa HEV JS634 China raUxt JQ 065090 HEV rabtrt Chna JX 501284 HEV rabbit China AS 740221 HEV ratofl ChnaMongoiia AB 74126Ö HEV rabbet China'Mongoiia GU937805 Rabbit China JX 121233 HEV rabbit China 99 JX 109634 HEV rabbit China АБ097811 Japan HEV type IV DQ450072 China HfcV type IV ]

. AY5&4199 China HEV type (V MM&06 HEV2 Mexico

X 96292 ma hev037 type I D10330 Burma HEVNE8L type I M/3218 В<жтпа H E vrus type I AF051830 Nepal HEV TK15/92 type » - x№441 Inda HEV type I

MÖ0S81 Pakistan HEV type I

D11093 Crura HEV type I L25S47 Cheia HEV type I GI962&440 HEV t 98 W&4177 China HEV type I -Avian hepatitis E wirus compiele genome

Рисунок 1. Филогенетические взаимоотношения изолятов ВГЕ, выделенных от кроликов, а также людей и свиней, по участку ОРС 2 ВГЕ (300 нт., 5996-6295 нумерация по прототипному изоляту Burme — М73128). Жирным шрифтом обозначены изоляты ВГЕ, выделенные в данной работе. Изоляты, выделенные от кроликов, обозначены Rabbit, от свиней -Swine, от людей - Human. Для обозначения региона выделения вируса использованы следующие обозначения: Республика

Беларусь - Belor, Белгородская область — Bel, Московская обл. -Mose, Архангельская область — arch, Владимирская область — vlad, Калининградская область — kaiin, Саратовская область — sar, Свердловская область — ekat, Хабаровский край — khab. Для каждого изолята указа год Прототипные

выделения, изоляты приведены номеров

ВГЕ

в

GenBank указанием их базе данных.

Филогенетическое дерево

построено по алгоритму Neighbour-joining без коррекции (uncorrected distance) при помощи программы MEGA 5.05. Числа в узлах дерева — процент bootstrap-псевдорепликатов, поддерживаемых данную группу (приведены только достоверные значения >70%). Длина ветвей отражает степень отличия нуклеотидной

последовательности вирусов в соответствии с приведенной

Степень сходства между московскими и белорусскими изолятами составляет 86-87%, при этом более многочисленная группа московских изолятов имеет больше сходства с китайскими последовательностями, чем с белорусскими (89% и 86-87%, соответственно). Два отдельно стоящих московских изолята, наоборот, ближе к белорусским изолятам.

Необходимо отметить, что все последовательности ВГЕ кроликов, и выявленные в нашей работе, и опубликованные ранее, формируют отдельную группу, и отличаются от последовательностей генотипа 3 ВГЕ, выделенных от людей и свиней на территории РФ и других стран, на 1821%.

В отличие от ВГЕ кроликов, последовательности ВГЕ, выделенные от свиней на территории Белгородской области (на рисунке 1 обозначены Bel swine), сходны с последовательностями ВГЕ, выделенными от заболевших людей в этом же регионе, и образуют с ними единые филогруппы. Степень сходства между последовательностями ВГЕ, выделенными на территории Белгородской области от людей и от свиней, составляет 94-97%.

Таким образом, до настоящего времени на территории РФ не выявлены случаи ГЕ, ассоциированные с ВГЕ кроликов. В мире в настоящее время известен только один изолят, выделенный во Франции от заболевшего человека и относящийся, по результатам анализа геномной последовательности, к ВГЕ кроликов (Izopet J. et al., 2012). Поэтому данные для заключения о значении ВГЕ кроликов для инфекционной патологии человека пока ограничены. Не исключается возможность передачи ВГЕ от кроликов человеку, аналогично хорошо документированной и доказанной передаче вируса от свиньи человеку, тем более что описаны успешные случаи экспериментального заражения приматов, а также свиней кроличьим ВГЕ (Liu P. et al., 2013), и кроликов штаммами ВГЕ генотипов 3 и 4 (Мао J. et al., 2014). Однако полученные

нами данные не поддерживают предположение о какой-либо значимой роли кроликов как резервуара ВГЕ для человека, в отличие от свиней. Аналогичным образом, нами не выявлены случаи заражения свиней кроличьими вариантами ВГЕ.

Выводы

1. Вирус гепатита Е кроликов выделен на территории Российской Федерации и Республики Беларусь; циркуляция этого вируса у кроликов в гиперэндемичном по гепатиту Е регионе (Египет) не установлена.

2. Вирус гепатита Е кроликов широко распространен среди кроликов на территории Российской Федерации и Республики Беларусь; на это указывают высокая частота выявлениа анти-ВГЕ (от 12,5 до 82,2%) и РНК ВГЕ (от 2,2% до 30%).

3. Циркулирующие в Российской Федерации и Республике Беларусь варианты ВГЕ кроликов принадлежат к геноварианту, близкому к 3 генотипу ВГЕ и объединяющему все известные последовательности ВГЕ кроликов.

4. Выявленные изоляты ВГЕ кроликов не связаны генетически с изолятами ВГЕ человека и свиней, выделенными на территории России, что не позволяет рассматривать кроликов в качестве резервуара патогенных для человека штаммов ВГЕ.

Практические рекомендации

1. Кролики, являясь естественным хозяином вируса, похожего на патогенный для человека генотип 3 ВГЕ, являются удобной экспериментальной моделью для воспроизведения ВГЕ-инфекции.

2. При эксперментальном моделировании ВГЕ-инфекции на кроликах целесообразно проводить предварительный скрининг животных на анти-ВГЕ и РНК ВГЕ для выявления инфицированных или перенесших инфекцию животных.

Список научных трудов, опубликованных по теме диссертации

Статьи в научных журналах, входящих в Перечень рецензируемых изданий, рекомендованных ВАК.

1. Потемкин И.А., Малинникова Е.Ю., Дьяррассуба А., Мохаммед

А.М.Е., Щибрик Е.В., Поляков А.Д. Обнаружение антител к вирусу гепатита Е среди жителей Белгородской области. // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 2. URL: http://www.science-education.ni/l 16-12499 (дата обращения: 08.04.2015)

2. Кюрегян К.К, Малинникова Е.Ю., Дьяррассуба А., Мохаммед А.М.Е., Землянский O.A., Поляков А.Д. Заболеваемость острым гепатитом Е в Российской Федерации // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - № 2. URL: http://www.science-education.ru/116-12532 (дата обращения: 08.04.2015)

3. Мохаммед А.М.Е., Потемкин И.А., Карлсен A.A., Исаева О.В., Кюрегян К.К., Козлов В.Г., Жаворонок C.B., Михайлов М.И. Циркуляция вируса гепатита Е кроликов на территориях с разной степенью эндемичности по гепатиту Е // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 2; URL: http://www.science-education.ru/122-18395 (дата обращения: 08.04.2015)

Публикации в прочих изданиях

1. Исаева О. В., Мохаммед А.М.Е., Козлов В.Г., Малинникова Е. Ю., Кюрегян К. К., Михайлов М. И. Обнаружение вируса гепатита Е среди кроликов на территории РФ (Москва) // В мире вирусных гепатитов. - 2013. - №2. - С. 27-31.

2. Мохаммед А.М.Е., Лопатухина М.А., Михайлов М.И. Вирус гепатита Е у животных/ / В мире вирусных гепатитов. - 2014. - № 2. -С. 6-14.

3. Арабей А. А., Мохаммед А. М. Е., Жаворонок С. В., Кюрегян К. К., Будько Л. В., Давыдов В. В., Михайлов М. И. Обнаружение вируса гепатита Е среди кроликов в Республике Беларусь // Военная медицина. -2015. -№ 2 (35) . - С. 51-53.

Список сокращений:

Анти-ВГЕ — антитела к вирусу гепатита Е Анти-ВГЕ - антитела к вирусу гепатита Е класса Анти-ВГЕ 1|>М - антитела к вирусу гепатита Е класса ВГЕ - вирус гепатита Е ГЕ - гепатит Е

ИФА - иммуноферментный анализ ОРС - открытая рамка считывания

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РФ - Российская Федерация

РБ - Республик Беларусь

Подписано в печать 16.04.2015г. Формат 60x84/16. Гарнитура «Times New Roman» Бумага офсетная. Заказ № 103. Объем -1,4 усл. печ. л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ЗАО «Издательство ИКАР» Москва, ул. Академика Волгина, д. 6 Тел.: 936-83-28. Тел./факс: 330-89-77 www.ikar-publisher.ru

Благодарности

Считаю своим приятным долгом выразить огромную благодарность научному руководителю Михайлову Михаилу Иванновичу, член-корреспондент РАН, доктору медицинских наук, профессор, директору ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова» и заведующему кафедрой микробиологии и вирусологии медицинского факультета Российского Университета Дружбы Народов за постоянное внимание, полученные знания, неоценимую помощь и поддержку в процессе проведении исследования и написания диссертации.

Выражаю огромную благодарность заведующему лабораторией гепатитов, доктору биологических наук Кюрегяну Карену Кареновичу и заведующей отделением секвинирования кандидату биологических наук Исаевой Ольге Владиславовне за то, что научили меня всему, что я знаю, за под держку и наставления.

Глубокую признательность выражаю доктору медицинских наук, профессор кафедры инфекционных болезней БГМУ, проректору Белорусского государственного медицинского университета Жаворонку Сергею Владимировичу, а также заведующему лабораторией Предприятия по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова Козлову Виталию Григорьевичу за помощь в сборе материала. Хочу поблагодарить всех коллег, которые принимали участие в исследованиях, особую признательность выражаю заведующему лаборатории патогенеза гепатита с экспериментальной клиникой игрунковых обезьян, кандидату медицинских наук Гордейчуку Илье Владимировичу и младшему научному сотруднику ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова» Потемкину Илье Александровичу.