Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ организации эпитопов белков вирусов ... В, С, Д, Е и вируса иммунодефицита человека ...ание с помощью синтетичес...
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Анализ организации эпитопов белков вирусов ... В, С, Д, Е и вируса иммунодефицита человека ...ание с помощью синтетичес..."
п 5' ОГ-
тГД РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
2 3 0\" ^
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ имени Д. И. ИВАНОВСКОГО
На правах рукописи
СЕМИЛЕТОВ Юрий Аркадьевич
АНАЛИЗ ОРГАНИЗАЦИИ ЭПИТОПОВ БЕЛКОВ ВИРУСО? '' В, С, Д, Е
И ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛ" "ШЕ
С ПОМОЩЬЮ СИНТЕТИЧЕН.
Специальность ОЗ.ОО.ОЗ - Молек> „..игия
ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва 1995
ОФИЦИАЛЬНЬЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор биологических наук, профессор доктор химических наук, профессор доктор медицинских наук, профессор
В. в. Месянжинов
г. с. Катруха
л. в. Урываев
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М. В. Ломоносова.
С Диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.
Защита диссертации состоится "Ло" 1995 г.
в 14 часов на заседании Специализированного Совета Д 001.20.01 при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16.
Автореферат разослан 1995 г.
Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор медицинских наук
Н. П. Косякова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Успехи, достигнутые в области пептидного синтеза, позволившие автоматизировать процессы получения и очистки, разработать способы одновременного множественного синтеза, сделали доступным широкое использование пептидов в лабораторных и клинических исследованиях.
Идентификация антителосвязывающих сайтов и синтез олигопепти-дов, способных имитировать соответствующие им антигенные участки вирусных белков, - путь к созданию новых диагностических и вакцинных препаратов. Анализ структурной организации белковых антигенов способствует пониманию природы взаимодействий антиген-антитело на молекулярном уровне. С помощью синтетических пептидов стало возможным решение целого комплекса проблем, связанных с исследованием антигенной структуры белков, включающих:
- картирование линейных (последовательных) В-эпитопов и хел-перных Т-эпитопов на поверхности белка;
- получение моноклональных антител к определенным участкам белковой последовательности;
- определение роли отдельных аминокислотных остатков (а.о.) в процессе взаимодействия антигенов со специфическими антителами и формировании антигенной детерминанты;
- получение аналогов эпитопов, обладающих равной или большей специфичностью и устойчивостью комплексов антиген-антитело.
Другое важное применение синтетических пептидов связано с их способностью вызывать выработку антител, служащих инструментом для выделения и характеризации рекомбинантных белков.
Исследования последних лет продемонстрировали широкое распространение и огромную медицинскую значимость инфекций, вызываемых вирусами гепатитов А (ВГА), В (ВГВ), С (ВГС), Б (ВГД), Е (ВГЕ) и опасность быстрораспространяющейся инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) на территории Российской Федерации. Эти факты говорят о необходимости проведения исследований по различным аспектам проблемы вирусных гепатитов и СПИДа в нашей стране. Одним из наиболее актуальных направлений исследований представляется изучение антигенной композиции вирусов гепатита и ВИЧ-1 и особенностей иммунитета, вызываемого этими агентами. Данные направления важны для создания современных диагностических, лечебных и профилактических препаратов.
Цель и задачи исследования.
Целью исследования является поиск пептидных антигенов - фрагментов белков вирусов гепатита и ВИЧ-i - для анализа структурной организации вирусных В-эпитопов и создания диагностических тест-систем для определения антител к вирусам гепатита и ВИЧ-1.
В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
- Осуществить выбор на основе расчетных методов анализа и данных литературы потенциальных антителосвязыващих участков иммунодо-минантных белков вирусов гепатита В, С, D, Е, А и ВИЧ-1. Синтезировать пептиды, сответствующие выбранным участкам, их укороченные и перекрывающиеся фрагменты.
- Выявить пептиды, которые в свободном состоянии или в виде конъюгатов с белками-носителями способны индуцировать образование антител у лабораторных животных - мышей и кроликов, для выявления и характеризации соответствующих нативных или рекомбинантных белков.
- Провести сравнительное исследование антигенной активности синтезированных пептидов в твердофазном ИФА путем изучения антигенного профиля сывороток крови больных с вирусными гепатитами и ВИЧ-1 инфекцией.
- Идентифицировать антителосвязывающие сайты в составе анти-генноактивных участков и определить роль отдельных остатков в процессе взаимодействия пептидов со специфическими антителами.
- Использовать наиболее перспективные в антигенном отношении пептиды для усовершенствования и модификации способов иммунофер-ментной диагностики вирусных гепатитов и ВИЧ-1 инфекции.
Научная новизна работы.
Изучена антигенная структура районов, ограниченных аминокислотными остатками (а.о.) 73-89 соге-белка ВГВ и а. о. 24-41 полипептида preSl, кодируемого геном pre-S ВГВ; а.о. 20-34 и 39-75 белка core, а. о. 1689-1732 и 1921-1940 белка NS4 ВГС; а. о. 65-80 белка Р27 ВГД; а. о. 92-123 белка 0RF3 ВГЕ. Продемонстрированы возможности выявления соответствующих антивирусных антител с помощью пептидов -фрагментов исследованных областей.
В работе впервые были синтезированы и охарактеризованы В-эпи-топы в составе белка core ВГВ и полипептидов preSl и preS2 кодируемых геном pre-S ВГВ, а также в составе белка нуклеокапсида и неструктурных белков NS3 и NS5 ВГС, которые содержат консенсусный мотив -Asp-Pro-x-y-Arg- в аминокислотной последовательности, обладают
сходной вторичной структурой и одинаковой длиной. 6-7 а. о.
Впервые идентифицирована антигенная детерминанта в С-концевой части белка NS4 на участке, частично перекрывающемся с областью ре-комбинантного антигена cl00-3, и показана высокая диагностическая ценность данного района.
Выявлен иммунодоминантный участок белка Р27 ВГД меаду 65-м и 80-м а. о. Результаты исследования указывают на наличие в этом районе HDAg нелинейной антигенной детерминанты или набора высокоиммуно-генных эпитопов.
Получена серия ранее неописанных перекрывающихся пептидов из С-концевой части белка, кодируемого открытой рамкой считывания 3 (ORF 3) ВГЕ, и идентифицированы фрагменты белка, обладающие высокой антигенной активностью.
В крови ВИЧ-инфицированных лиц юга России обнаружены антитела, способные узнавать синтезирование пептиды, соответствующие вариантам области петли V3 поверхностного гликопротеида gpl20 штамма ВИЧ-1, циркулирующего в этом регионе.
Практическая ценность работы.
Выявлены пептиды, способные индуцировать антитела, необходимые для определения уровня экспрессии рекомбинантных и гибридных белков - продуктов генов C,P,pre-S ВГВ и генов VIF, Р ВИЧ-1.
Получены пептидные антигены - фрагменты белков ВГС для создания иммуноферментной диагностической тест-системы для определения в крови антител к ВГС.
Синтетические пептида, соответствующие участкам 65-80 а.о. белка Р27 ВГД, 99-119 а.о. белка 0RF3 ВГЕ и 10-23 а.о. из области петли V3 gpl20 ВИЧ-1, рекомендованы для использования с целью выявления соответственно анти-ВГД антител, анти-ВГЕ антител и анти-УЗ gpl20 ВИЧ-1 антител в клинической практике.
Основные полозения, выносимые на защиту.
1. Стратегия химического синтеза и исследования антигенных свойств 106 олигопептидов с длиной пептидной цепи от 6 до 37 а. о. из состава белков вирусов гепатита В, С, Д. Е, А и ВИЧ-1.
2. Принципы отбора антигенов и создания композиций для диагностических тест-систем на основе иммунологически активных олигопептидов из состава иммунодоминантных белков вирусов гепатита В. С, Д, Е и ВИЧ-1.
3. Большинство проанализированных антителосвязыващих участков
имеют сложную организацию, так как обладают дискретным характером антигенной структуры и (или) содержат в своем составе несколько перекрывающихся эпитопов.
4. Консенсусный мотив -Asp-Pro-x-y-Arg-, где" х" и" у" - остатки белковых аминокислот, в последовательности белка указывает на наличие в этом районе потенциального антителосвязывающего сайта.
5. Моноклональные антитела (МКА) 18/7 к preSl-области ВГВ специфически взаимодействуют в ИФА с фрагментом 31-36 этого белка.
6. Анти-НВе-антитела узнают на участке а. о. 73-89 HBcAg более протяженные аминокислотные последовательности (73-84, 74-89) по сравнении с анти-НВс-антителами, которым для взаимодействия достаточно наличия фрагмента 78-83.
7. Участки в составе белка core (а. о. 73-84), полипептидов preSl (а. о. 24-41) и preS2 (а. о. 133-143), белка pot (а. о. 25-36 и 816-832) ВГВ; в составе белка Р27 (а.о, 65-80 и 169-179) ВГД; в составе белка р34, pol (а. о. 941-950) и белка Vif (а. о. 155-168) ВИЧ-1 являются иммуногенными. Антитела, вырабатываемые к пептидам, гомологичным данным районам, специфически реагируют с соответствующими рекомбинантными или нативными белками.
Апробация работы.
Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были обсуждены и доложены на VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов, Таллин, 1987; Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов, Рига, 1990; Международном симпозиуме "Вирусные гепатиты", Ростов 1990; I Болгаро-Советском симпозиуме по вирусным инфекциям, Варна, 1990; II Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 1991; I Съезде иммунологов России. Новосибирск, 1992; Научно-практической конференции. посвященной 70-летию Института им.Пастера, Санкт-Петербург, 1993; Международном симпозиуме по вирусным гепатитам и болезням печени. Токио. 1993; IX Международном конгрессе по вирусологии, Глазго. 1993; Международном симпозиуме "Пептиды в иммунологии", Ин-терлакен, Швейцария, 1995; XIV Американском пептидном симпозиуме, Колумбус, 1995.
Публикации.
По результатам работы опубликованы 19 статей и тезисы 20 докладов.
Работа выполнена в плане научных исследований НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (директор - академик РАМН Д.К.Львов) в лаборатории вирусных нуклеиновых кислот и белков (руководитель -д.б.н., профессор В.Д. Смирнов) и лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и пептидного синтеза (руководитель - д.х.н.. профессор В. А. Шибнев). Основные результаты получены в соавторстве с сотрудниками НИИ вирусологии: Карповой В. А., Фирсовой Т.В., Дементьевой Е. В., Худяковым Ю. Е., Калининой Т. И., Вязовым С. 0., Яшиной Т. Л., Павлюченковой Р. П., Гараевым М. М., Кузиным С. Н.; МИТХТ им. М.В.Ломоносова: Евстигнеевой Р.П., Прокуроновой Е.И., Желтухи-ной Г.А. Своим коллегам и соавторам проведенных исследований автор приносит искреннюю благодарность.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Как уже указывалось во введении, объектами исследования являлись белки нуклеокапсида (core и pot) ВГВ, полипептиды preSi и preS2. кодируемые геном pre-S ВГВ; белок core и неструктурные белки NS3. NS4, NS5 ВГС; белок Р27 ВГД; белок 0RF3 ВГЕ; капсидные белки VP1 и VP3 ВГА; поверхностный гликопротеид gpl20, регуляторный белок Vif и белок р34, pol ВИЧ-1. Несмотря на разнообразие объектов, в исследовании каждого из них можно выделить три основные этапа:
1) теоретический анализ расположения иммунодоминантных участков;
2) синтез выбранных фрагментов; 3) изучение антигенных и иммуно-генных свойств синтезированных пептидов. Проведение работы базировалось на применении определенного круга методологических подходов, рассмотренных ниже.
ОСНОВНЬЕ МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В РАБОТЕ. Синтез пептидов.
Использованные в работе пептиды синтезированы классическим, либо твердофазным методом, или методом пептидного сканирования с применением пин-технологии.
Твердофазный синтез (ТФС) проводили на основе двух наиболее распространенных схем образования пептидной связи (Вое- и Fmoc-схемы). Синтез пептидов по Вос-схеме, предусматривающий использование кис-лотолабильной трет.-бутилоксикарбонильной (Вое) группы для временного блокирования й-аминогрупп, проводился вручную на хлорметилиро-ванном тефлоне с радиационно привитым полистиролом. Защитные груп-
- б -
пы были выбраны в расчете на конечное деблокирование под действием 1М трифторметансульфокислоты (TFMSA) - тиоанизола в трифторуксусной кислоте (TFA). В реакциях конденсации использовали 4-кратные избытки 1-оксибензотриазоловых эфиров или 2-кратные симметричных ангидридов Вос-аминокислот в диметилформамиде. Boc-Asn и Boc-Gln вводили в реакцию в виде п-нитрофениловых эфиров. Полноту прохождения реакции контролировали с помощью нингидринового теста. В случае неполного прохождения реакции проводили повторную конденсацию или ацети-лирование непрореагировавших аминогрупп. Синтез пептидов по Fmoc-схеме предусматривает использование для временного маскирования й-аминогрупп флюоренилметилоксикарбонильной (Fmoc) группы, стабильной в кислой среде, но отщепляемой основаниями. Пептиды синтезировали в форме свободной кислоты на РАС-полимере либо в виде амидов на PAL-полимере фирмы MilliGen/Biosearch (США). Реакция конденсации осуществлялась методом симметричных ангидридов или 1-оксибензотриазоловых эфиров. Для отщепления пептидов от полимера использовали TFA с добавками тиоанизола, этандитиола и анизола. Очистку пептидов проводили гельфильтрацией на сефадексах G-10 - G-25 и полупрепаративной ВЭЖХ в градиенте водного ацетонитрила. Пептиды охарактеризованы данными количественного аминокислотного анализа, аналитической обращеннофазовой ВЭЖХ, ТСХ и анализа N-концевых аминокислот. Классический синтез в растворе проводили с применением стратегии максимальной защиты функциональных групп, используя Вос-схемы синтеза, сочетающие ступенчатое наращивание пептидной цепи и блочную конденсацию пептидных фрагментов. Для анализа степени гомогенности промежуточных продуктов использовали ТСХ и ВЭЖХ. Метод пептидного сканирования (Pepscan) [H.M.Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 81, 3998, 1984; H.M. Gey sen et al., Immunol. Meth.. 102, 259, 1987], позволяющий "сканировать" белковые последовательности в поисках последовательных эпитопов, использовали для получения перекрывающихся гексапептидов со сдвигом на один а.о. Методическую основу способа составляет проведение ТФС по Fmoc-схеме на индивидуальных полипропиленовых стержнях (пинах), содержащих на поверхности радиационно привитые функционально активные аминоациль-ные группы в концентрации 150-300 нмоль на пин. Синтез проводили с помощью коммерческого набора фирмы "Cambridge Research Biochemical s" (Англия). В конце синтеза после удаления всех защитных групп пептиды оставались закрепленными на пинах и многократно использова-
лись в ИФА.
Конъвгирование пептидов с белками-носителями.
Синтезированные пептиды конъюгировали с гемоцианином (KLH), бычьим сывороточным альбумином (BSA) и столбнячным анатоксином тремя различными способами. Во-первых, с применением N-оксисукцинимидного эфира 3-малеинимидобензойной кислоты (MBS) по реакции между SH-группой и белком, для чего в состав пептида дополнительно вводили остаток S-ацетамидометил (Аст) - цистеина, при этом степень конъюгации, определенная количественным аминокислотным анализом, составляла 10-15 молекул пептида на молекулу BSA или на каждую тысячу аминокислот KLH и столбнячного анатоксина. Во-вторых, использовали глутаровый альдегид. В третьем случае применяли активированный 1-оксисукцинимидный эфир сукцинилированного BSA. Компьютерный анализ вирусных белков.
В работе широко использовали компъютерный анализ вирусных белков по программам гидропатичности СТ.Р.Hopp, K.R.Woods, Proc. Natl. Acad. Sel. USA, 1981, 78, 3824; J.Kyte, R.F.Doollttle, J. Mol. Blol., 1982, 157, 1053, подвижности фрагментов [P.A.Karplus, G.E.Schulz, Naturwiss., 1985, 72, 212], предсказания В-антигенности [G.W. Welling et al., FEBS Lett., 1985, 188, 215] и вероятного расчета вторичной структуры [0. В. Ptisyn, A. V.Flnkelsteln, Biopolymers, 1983, 22, 15; P.Y.Chou, G.D.Fasraan, Biochemistry, 1974, 13, 222; G.D.Rose, Mature, 1978, 272, 586]. При исследовании потенциально антигенного участка расчет проводился как для целого белка, так и для отдельных его фрагментов. Иммунизация лабораторных животных.
Иммунизацию кроликов-самцов конъюгированными пептидами проводили трижды с интервалом 2 недели подкожно из расчета 100-200 мкг пептида. Первую иммунизацию проводили в полном адъюванте Фрейнда, для второй и третьей использовали неполный адъювант. Пептид без адъ-юванта (бустер) вводили внутривенно в том же количестве на 10-й день после последней иммунизации. Кровь брали на 11-12 день после бустера. Белых нелинейных мышей самцов иммунизировали внутрибрюшин-но из расчета 10-20 мкг пептида на мышь по аналогичной схеме без бустера. Титры антипептидных антител колебались от 5 103 до 2 104.
Идентификация антителосвязываящих сайтов в составе белков. Непрямой неконкурентный твердофазный ИФА был использован для оценки антигенной активности синтезированных пептидов по эффективности их
взаимодействия с сыворотками крови пациентов с диагнозом гепатит А. В.С.Д.Е и ВИЧ-1 инфицированных. Реактивность пептидов в ИФА рассматривалась в сравнении с реактивностью соответствующих рекомби-нантных и синтетических антигенов из коммерческих тест-систем. Панели сывороток от пациентов с активной и хронической формами вирусных гепатитов и ВИЧ-1 инфицированных нозокомиальных очагов юга России подбирались в зависимости от цели каждого эксперимента. В качестве отрицательного контроля во все панели входили сыворотки здоровых доноров и больных другими заболеваниями. В ходе работы подбирались оптимальные условия сорбции и инкубации пептидов. Результаты ИФА оценивали количественно по величине S/N в "+" по отношению поглощения образца (S) к среднему арифметическому сигналов (N) в лунках с отрицательными сыворотками, где 2.1 < 1+ < 3.5; 3.5 < 2+ < 5.0; 5.0 < 3+ < 10.0; 4+ > 10.0. Негативными по тестируемым антигенам считали сыворотки, для которых значение S/N было меньше 2.1. Методом РИА определялось взаимодействие конъюгатов пептидов с антителами к ВГА, для чего использовались поликлональные антитела из сывороток рековалесцентов, меченые 1-125. В качестве положительного контроля использовали ВГА, выделенный от больных. На твердой фазе адсорбировали антитела, которые "захватывали" антиген из раствора, связанный антиген затем выявляли с помощью радиоактивных антител.
1. АНТИГЕННЫЕ И ИММУН0ГЕННЫЕ СВОЙСТВА ОЛИГОПЕПТИДОВ -
ФРАГМЕНТОВ БЕЛКОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА В
Вирус гепатита В - прототипный представитель гепатотропных
ДНК-содержащих вирусов животных (обзор [D. Ganem, H.Е. Varmus., An-
nu. Rev. Blochem, 1987, 56, 651]). Известны три основных иммуноло-
гических маркера ВГВ-инфекции: наружняя гликопротеидная оболочка
вирусной частицы содержит детерминанты поверхностного антигена
HBsAg; внутренний нуклеокапсид ВГВ (core), содержащий двухцепочеч-
ную ДНК и ДНК-полимеразу, проявляет свойства HBcAg; в результате
процессинга молекула HBcAg теряет 33-35 С-концевых а. о. и изменяет-
ся таким образом, что начинает проявлять свойства присущие секре-
торной форме корового компанента - е-антигену (HBeAg).
1.1 Локализация иммунодоминантного сайта в составе
соге-антигена ВГВ.
На основании теоретического анализа вторичной структуры и гид-
ропатического профиля HBcAg был выявлен участок 73-84, обладающий
характерными признаками потенциальной антигенной детерминанты. Этот участок с повышенной гидрофильностью неструктурирован, расположен меаду двумя структурированными участками, содержит с большой степенью вероятности бета-изгибы, несет в своем составе остатки положительно и отрицательно заряженных аминокислот. Ранее [J. Salíeld et al., J. Virol., 1989, 63, 798] было показано, что гибридный белок, содержащий фрагмент 74-89 HBcAg, взаимодействует с одним из клонов моноклональных анти-НВс-антител.
Для локализации эпитопа на участке 73-89 HBcAg был применен метод пептидного сканирования с использованием пин-технологии. Одновременно были синтезированы 12 перекрывающихся гексапептидов (I-XII), охватывающих 17-членную аминокислотную последовательность 73-89 (рис.1), и два гексапептида (XIII, XIV). в которых остаток Не был заменен на остаток Ala, также встречающийся в геномных последовательностях природного HBcAg. Пептиды (I-XIV) тестировались на антигенность в ИФА с кроличьей антисывороткой, полученной на генно-инженерный белок core [Yu.Е. Khudyakov et al., Blomed. Sel., 1991, 2, 257], содержащий в положении 80 остаток lie.
73
89 А405
73-78 .(I)
74-79 (II)
75-80 (III)
76-81 (IV)
77-82 (V)
78-83 (VI)
79-84 (VII)
80-85 (VIII)
81-86 (IX)
82-87 (X)
83-88 (XI)
84-89 (XII)
77-82 (XIII)
78-83 (XIV)
GVNLEDPISRDLVVSYV G V N L Е D V N L Е D Р N L Е D Р I L Е D Р I S
0.02 0.04 0.07 0.16 0.60 1.12 0.13 0.12 0.23 0.05 0.02 0.03 0.33 0.52
Е D Р I S R D Р I S R D Р I S R D L
I S R D L V S R D L V V R D L V V S D L V V S Y L V V S Y V
Б D Р A S R D Р A S R D
Рис.1. Результаты ИФА взаимодействия пептидов (I-XIV) с кроличьими анти-НВс-антителами.
Здесь и далее аминокислотные остатки приведены в однобуквенном обозначении: А-аланин, С-цистеин, D-аспарагиновая кислота, Е-глута-миновая кислота, F-фенилаланин, G-глицин, Н-гистидин, 1-изолейцин, К-лизин, L-лейцин, М-метионин, N-аспарагин, Р-пролин, Q-глутамин, R-аргинин, S-серин, Т-треонин, V-валин, W-триптофан, Y-тирозин.
Из полученных результатов (рис.1) видно, что участок, узнаваемый кроличьими анти-НВс-антителами, включает а.о. с 77-го по 83-й. Максимальное взаимодействие наблюдалось для пептида (VI) DPISRD. Гексапептид (XIV) DPASRD реагировал слабее.
Для подтверждения полученных результатов и изучения зависимости антигенной активности от длины пептидной цепи осуществлен синтез серии пептидов, содержащих в своем составе активный фрагмент 78-83. Полученные пептиды (73-84)-Cys(Acra) (XV), (74-89)-Cys(Acm) (XVI), (78-83)-Cys(Aero) (XVII), (78-83)*-Cys(Acm) (XVIII), (77-83)-NHs (XIX), (77-83)*-NH2 (XX), (78-83)-NH2 (XXI), (78-83)*-NH2 (XXII) содержали в положении 80 остаток Ala или lie (отмечены звездочкой). Часть пептидов синтезировали в виде амидов для применения в ИФА в свободном состоянии (рис. 2).
75 80 85 89
GVNLEDPASRDLVVSYV
73
84
Cys(Acm)
(XV)
74
89
Cys(Acm) (XVI)
77
78 83
------------Cys(Acm)
- - I---Cys (Acm)
------NH2
- - I---NH2
83
(XVII) (XVIII) (XIX) (XX)
- I -
NHo NHo
(XXI) (XXII)
Рис. 2. Пептидные фрагменты участка 73-89 HBcAg, полученные твердофазным методом синтеза. Замена а. о. в положении 80 (А-1) приведена по отношению к пептиду (XV).
- il -
Пептиды (XV-XXII) и их конъюгаты с BSA взаимодействовали с сыворотками крови больных, содержащих анти-НВс-антитела, тогда как с анти-НВе-антителами достоверную положительную реакцию демонстрировали лишь пептиды 73-84, 74-89 и их конъюгаты [Ю.А.Семилетов и др.. Биоорган, химия, 1994, 20, 1175]. Таким образом, анти-е-антитела узнают на этом участке HBcAg более протяженную аминокислотную последовательность по сравнению с анти-соге-антителами, которым для взаимодействия достаточно наличия фрагмента 78-83. Сыворотки больных с анти-core- и (или) анти-е-антителами были отобраны с помощью коммерческих тест-систем фирмы Abbott (США).
Взаимозамена остатков Ile и Ala существенно не отражалась на антигенных свойствах пептидов (XVII-XXII) и можно предположить, что боковые радикалы этих а. о. не вовлекаются в прямое связывание с анти-соге-антителами и В-эпитоп на участке 78-83 HBcAg дискретен.
1.2. Локализация иммунодоминантного эпитопа в preSl-области белка оболочки ВГВ.
Оболочка ВГВ помимо главного белкового компонента, кодируемого геном S, содержит область preS, образуемую двумя минорными полипептидами preSl и preS2 - продуктами гена pre-S. Область preS является высокоиммуногенным антигеном, антитела к ней служат одними из наиболее ранних маркеров инфекции [A. R. Neurath et al., Nature, 1985, 315, 6014].
На основании теоретического анализа мы предположили наличие антигенной активности на участке 24-41 preSl-области ВГВ (субтип ayw),обладающем гидрофильным характером и содержащем несколько зон в районе остатков Pro с характерными признаками бета-поворотов.
Нами было проведено пептидное сканирование участка 25-41 с использованием перекрывающихся гексапептидов 25-30, 26-31, .... 36-41 (XXIII-XXXIV) и моноклональных антител 18/7 к preSl-области, полученных в лаборатории доктора В.Герлиха [К.-H.Heerman et al., J. Virol.. 1984, 52, 396].
Из приведенных результатов (рис. 3) следует, что наибольшее взаимодействие наблюдалось для пептида 31-36, DPAFRA (XXIX).
Совместно с сотрудниками лаборатории чл. -корр. РАН Р. П. Евстигнеевой (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) осуществлен ТФС пептида 24-41 (XXXV) и его укороченных фрагментов 30-36 (XXXVI), (30-36)-Cys(Acra) (XXXVII), (31-36)-Cys(Acm) (XXXVIII) и (24-30)-Cys(Acm) (XXXIX)
(рис.4). Пептиды (XXXV-XXXVIII) и их конъюгаты с BSA взаимодействовали с МКА 18/7 и сыворотками крови больных острым гепатитом В (3-14 день желтушного периода) в реакциях твердофазного ИФА. В 30 случаях из 42 получен позитивный результат. В тех же реакциях ИФА для пептида (XXXIX) не было отмечено позитивных результатов. Сопоставление антигенной активности пептидов (XXIII-XXXIX) позволяет заключить, что один из иммунодоминантных В-эпитопов preSl-области локализуется на участке 31-36 (DPAFRA).
25 41 А405
FPDHQLDPAFRANTANP
25-30 (XXIII) FPDHQL 0.005
26-31 (XXIV) Р D H Q L D 0.031
27-32 (XXV) D H Q L D P 0.008
28-33 (XXVI) H Q L D P A 0.022
29-34 (XXVII) Q L D P A F 0.041
30-35 (XXVIII) LDPAFR 0.065
31-36 (XXIX) DPAFRA 0.166
32-37 (XXX) P A F R A N 0.103
33-38 (XXXI) AFRANT 0.041
34-39 (XXXII) FRANTA 0.010
35-40 (XXXIII) R AMT AN 0.000
36-41 (XXXIV) A N T A N P 0.023
Рис.3. Результаты ИФА гексапептидов (XXIII-XXXIV), перекрывающих участок 25-41 preSl-области ВГВ, с МКА 18/7.
24 41
FFPDHQLDPAFRANTANP (XXXV) 30 36
------- ОН (XXXVI)
------- Cys(Acm) (XXXVII)
31 36
------ Cys(Acm) (XXXVIII)
24 30
------- Cys(Acm) (XXXIX)
Рис. 4. Пептид 24-41 (XXXV) из состава preSl-области ВГВ и его фрагменты (XXXVI-XXXIX), полученные твердофазным методом.
Гексапептиды DPISRD (DPASRD) из core-белка и DPAFRA из preSl-области ВГВ имеют общий консенсусный мотив DP—R-. Наличие на N- и С-конце этой последовательности а. о. с противоположно заряженными ионогенными боковыми функциями Asp (-) и Arg (+) может способствовать стабилизации бета-изгиба в районе остатка Pro и образованию петли, экспонируемой на поверхности белковой глобулы.
1.3. Анализ продуктов экспрессии гена Р ВГВ в клетках Е.coli.
Репликация генома гепаднавирусов включает этап обратной транскрипции с образованием прегеномной РНК. Ее осуществляет вирусная полимераза - мульти-функциональный белок, состоящий из двух функциональных доменов. Полимераза ВГВ кодируется открытой рамкой считывания Р вирусного генома.
Во ВНИИ вирусологии к. б. н. Е. В. Газиной были сконструированы плазмиды, позволяющие осуществлять экспрессию в E.coli полимеразы ВГВ и ее функциональных доменов - концевого белка и каталитического - в виде гибридных белков, содержащих на N-конце 12 чужеродных аминокислот. Нами был проведен ТФС пептидов H-LPRLADEGLNRR-Cys(Acm)-OH (XL) и H-PDRVHFASPLHVAWRPP-Cys(Асга)-ОН (XLI), соответствующих аминокислотным последовательностям полимеразы ВГВ, субтип ayw: 25-36 (XL) и 816-832 (XLI). Методом иммуноблота с использованием кроличьих сывороток, полученных к пептидам (XL, XLI), показано, что созданные плазмиды детерминируют синтез соответствующих белков в бактериальных клетках.
Таблица 1. Взаимодействие в иммуноблоте рекомбинантных белков, включающих полимеразу ВГВ или ее фрагменты с антителами к пептидам (XL) и (XLI).
1 Плазмида Кодируеммая об- Реакция антител к пептидам 1
1 ласть белка pol 25-36 а.о. 816-832 а.о. 1
1 ВГВ (XL) (XLI) 1
1 pNPl 9-336 а. о. + I
1 рЕТР7 200-832 а.о. - + |
1 РЕТСР1 9-832 а.о. + + |
"+" - положительная реакция в иммуноблоте; "-" - отсутствие реакции в иммуноблоте.
1.4. Антигенная активность рекомбинантных частиц на основе НВсАк и участков белка оболочки ВГВ или полимеразы ВИЧ-1.
В связи с исследованиями по созданию рекомбинантных белков заданной иммуноспецифичности, путем включения чужеродных антигенных детерминант в состав НВс-антигена и образованием химерного белка, проводимыми в лаборатории химии вирусных НК и белков ВНИИ вирусологии, изучали взаимодействие антител к синтетическим пептидам с ре-комбинантными частицами HBcAg и гибридов HBcAg с детерминантами preS-области ВГВ и белка р34, pot ВИЧ-1 (табл. 2).
Мышиные антитела к пептиду 73-84 (XV) HBcAg не взаимодействовали с гибридным белком, кодируемым плазмидой pMCS2-2 и содержащим антигенную детерминанту 133-143 ргеБ2-области в районе 70-85 а.о. соге-антигена, то есть в районе к которому были направлены анти-(73 -84) антитела. При индукции антител иммуногенность фрагмента 31-36 проявляется, когда этот участок находится в составе протяженной пептидной цепи в ее средней части. Об этом свидетельствует положительная реакция антител к пептиду 24-41 (XXXV) и МКА 18/7 с гибридным белком, кодируемым плазмидой pPS31-42.
Таблица 2. Взаимодействие в иммуноблоте антипептидных антител с HBcAg и гибридами HBcAg с фрагментами preS-области ВГВ или полимеразы ВИЧ-1.
1Плазмида| Структура кодируемого белка IAT к пептидам 1 Реакция 1 II III
IPCRL2411I сго(1-7)-НВсАк(3-174) 1 73-84 HBcAg 1 + |
|pPS31-42l его(1-7)-preS(31-36)-HBcAg(3-183)1 31-36 preSl 1 | | ----"---- I 24-41 preSl 1 1 1 -—"---- 1 preSl (МКА) 1 1 | ----и---- I 73-84 HBcAg 1 + 1 + | + |
1pMCS2-2 1 MAA-HB-[preS(133-143)3-cAg(4-176)1133-143*preS2l | | ----«---- | 73_84 HBcAg 1 + |
IdCCP 1cro(1-7)-pol(941-950)-HBcAg(1-183)I941-950**pol 1 + |
IpCRP 1 его(1-7)-pol(941-950)-HBcAg(1-176)1941-950 pol 1 + |
* H-DPRVRGLYFPA-Cys(Acm)-ОН (XLII), ргеБ2-область ВГВ; ** H-VYYRDSRNPL-Cys(Acm)-ОН (XLIII), белок р34. pol ВИЧ-1.
Следует отметить, что пептид 133-143 (XLII) из состава preSZ-области ВГВ содержит в N-концевой части последовательность DPRVR, которая соответствует консенсусной D-P-x-y-R, где "х" и "у" - остатки белковых аминокислот.
Таким образом, с использованием методов пептидного синтеза, уточнена и детализирована антигенная структура участков белка core и preSl области поверхностного белка ВГВ. Показано, что поликло-нальные кроличьи или мышиные антисыворотки к пептидам - фрагментам белка core (а. о. 73-84), полипептидов preSl (а. о. 24-41) и preS2 (а. о. 133-143), белка pol (а. о. 25-36 и 816-832) - специфически взаимодействуют с соответствующими рекомбинантными белками. Полученные сведения о высокой антигенности района 31-36 preSl явились основанием для введения его в состав конструируемых гибридных белков. Синтетические пептиды из состава соге-белка. содержащие фрагмент 78-83, могут быть использованы для выявления анти-НВс- и ан-ти-НВе-антител в клинической практике.
2. ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУНОДОМИНАНТНОГО РАЙОНА В СОСТАВЕ АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА ДЕЛЬТА.
ВГД - дефектный инфекционный агент, являющийся причиной тяжелых, часто летальных, форм острого и хронического гепатитов и цирроза печени [M.Rizetto, Hepatology, 1983, No3. 729]. Вирион ВГД содержит одноцепочечную РНК и высокоосновной фосфорилированный белок - HDAg. упакованные в оболочку HBsAg [F.Bonino et al., J. Virol., 1986, 58. 945]. HDAg присутствует в крови и печени инфицированных и представлен двумя полипептидами: Р27, содержащим 214 а. о., и его укороченной формой Р24, имеющей 195 а.о. К моменту начала этой работы были опубликованы противоречивые сообщения относительно имму-нодоминантных участков HDAg [К.F. Bergman et al., J. Immunol.,1989, 143, 3714; J.G. Wang et al.. J. Virol., 1990, M. H081.
На основании теоретического анализа выявлен ряд областей HDAg, предположительно содержащих В-эпитопы. Методом ТФС с использованием Вос-стратегии получены пептиды, соответствующие следующим участкам HDAg:
H-Cys(Acm)-SESRKNRGGREE-OH, 4-15 (XLIV);
H-GGREEILEQWVAG-Cys(Асш)-OH, 11-23 (XLV);
H-KIKKLEEDNP-Cys(Acm)-OH, 40-49 (XLVI);
H-KDKDGEGAPPA-Cys(Acm)-OH, 61-71 (XLVII);
H-GEGAPPAKRARTDQME-Cys(Acm)-ОН, 65- -80 (XLVIII);
H-DAGPRKRPLGGF-Cys(Acm)-ОН, 82- -94 (XLIX);
H-Cys(Acm)-NPLEGGSRGAPGGGF-OH. 153- -167 (L);
H-PSMQGVPESRF-Cys(Acm)-OH, 169- -179 (LI);
H-PS-Nva-QGVPESRF-Cys(Acm)-OH, 169- -179 (Lia);
H-TGEGLDDIRGSQGFP-Cys(Acm)-OH, 182- -195 (LII);
H-PADPPFSPQS-Cys(Acm)-OH, 201- -211 (LIII).
Пептид 169-179 синтезировали в двух вариантах - соответствующем природному участку HDAg (LI) и с заменой остатка Met на норва-лин (Lia) с целью сопоставления антигенных характеристик соединений, содержащих минимальные структурные различия.
Пептиды (XLIV-LIII) - в свободном виде и в форме конъюгатов с BSA - были исследованы в прямом и непрямом вариантах ИФА как с индивидуальными препаратами сывороток крови пациентов, содержащими высокие титры анти-ВГД-антител, так и с различными пулами, состоящими из 8-10 анти-ВГД-позитивных сывороток крови пациентов с хроническим гепатитом дельта (табл. 3).
Таблица 3. Взаимодействие пептидов дельта-антигена, конъюгиро-ванных с BSA, с пулами сывороток крови больных хроническим гепатитом Д в твердофазном ИФА.
1 Антигены 1 Анти- -дельта-антитела 1
1 1 пул 1 пул 2 1 пул 3 1
1 1 1 (61-71)-BSA 1 1+ отр 1 1 отр 1
1 (65-80)-BSA I 4+ 3+ 1 3+ 1
1(169-179)-BSA 1 2+ отр 1 1+ 1
1(169-179)»-BSAI 1+ отр 1 1+ 1
1(201-211)-BSA 1 1+ отр 1 н/а 1
1 НБАя 1 4+ 3+ 1 4+ 1
* Пептид (Lia).
Пептиды (XLIV-XLVI, XLIX, L, LII) выраженной антигенной активности не проявили.
Пептид 65-80 (XLVIII) и его конъюгат с BSA демонстрировали достоверную положительную реакцию с подавляющим большинством индивидуальных образцов сывороток крови больных (23 из 24). С отдельны-
ми образцами индивидуальных сывороток реагировали пептиды 61-71, 169-179 (LI и Lia) и 201-211. При этом пептиды (LI, Lía) взаимодействовали более эффективно (S/N>5). С нативным HDAg, выделенным из пораженных клеток печени, реагировали кроличьи антисыворотки, полученные к пептиду 65-80 и обоим вариантам пептида 169-179. Приведенные данные позволяют утверждать, что один из иммунодоминантных участков дельта-антигена располагается между 65-м и 80-м а. о.
С целью изучения влияния длины пептидной цепи и аминокислотных замен на антигенную активность пептидов были синтезированы, во-первых, - укороченные фрагменты пептида 65-80: (69-80)-Cys(Acm) (LIV), (71-80)-Cys(Acffl) (LV). (69-78)-Cys(Acra) (LVD и (71-78)-Cys(Acm) (LVII), соответствующие геномной последовательности, установленной [К.S. Wang et al., Nature, 1986, 323, 508], а позднее [J.A.Saldana, et al., J. Gen. Virol., 1990, 71, 1603]. Во-вторых, два пептида, соответствующие геномной последовательности, установленной [S.M. Makino et ai.. Nature, 1987, 329, 343] и имеющих аминокислотные последовательности 71-80* AKKLRMDQME (LVIII) и 73-80*-Cys(Acm) (LIX), отличающиеся от пептидов (XLVIII, LIV-LVII) а.о. в положениях 73 (K-R), 74 (L-A) и 76 (М-Т) (Рис.5).
Активность
65 80 в ИФА, %
GEGAPPAKRARTDQM E-Cys(Acm) 69 80
------------Cys (Acia)
71 80
---------- Cys(Acm)
69 78
---------- Cys(Acm)
71 78
-------- Cys(Acm)
71 80
--KL-M----OH
73 80 KL-M----Cys(Acm)
(XLVIII) 100
(LIV) 100
(LV) 80
(LVI) 0
(LVII) 0
(LVIII) 80
(LIX) 40
Рис. 5. Аминокислотные последовательности и активность в ИФА пептидов (ХЬУШ) и (ЫУ-ЫХ), включающих вариабельный участок 73-76 HDAg.
Укороченные с N-конца фрагменты пептида 65-80 реагировали с сыворотками пациентов с активной и хронической формами ВГД инфекции (65-80>69-80>71-80»73-80). Оба варианта пептида 71-80 (LV и LVIII) взаимодействовали с 80% одних и тех же анти-Н0+ сывороток, хотя пептид (LV) проявлял достоверно более высокую активность. Взаимозаменяемые остатки Lys и Arg функционально близки, остаток Met отличается от остатка Thr заменой атома серы на атом кислорода, однако боковые цепи остатков Ala и Leu сильно различаются по своим пространственным параметрам. Полученные результаты свидетельствуют о дискретном характере антигенной структуры HDAg на участке 65-80.
Следует отметить возможность практического использования факта идентификации иммунодоминантного сайта в молекуле дельта-антигена, так как клинико-эпидемиологические исследования по выявлению дельта-инфекции в нашей стране проводятся в ограниченном объеме. На наш взгляд, на основе синтетического пептида 65-80 может быть сконструирован специальный конфирмационный тест, служащий для подтверждения позитивных результатов исследования сывороток крови человека, полученных с помощью стандартных коммерческих иммуноферментных диагностических наборов.
3. АНАЛИЗ ОРГАНИЗАЦИИ ЭПИТ0П0В БЕЛКОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С.
Вирус гепатита С (ВГС) впервые идентифицирован как самостоятельная нозологическая единица в 1989 году [Q.-L. Choo et al., Science, 1989, 244. 359; G. Kuo et al., Science, 1989, Ш, 362]. В настоящее время ВГС признан как главный этиологический агент хронического гепатита ни-А, ни-В [М. Houghton, Hepatology, 1991, 14, 381]. Специфическая диагностика гепатита С является актуальной проблемой здравоохранения во всем мире, в особенности, чрезвычайно важной для ограничения распространения ВГС-инфекции посредством контаминированных ВГС продуктов крови.
Согласно современным научным взглядам ВГС классифицирован как отдельный род внутри семейства Flaviviridae. Анализ последовательности генома и кодируемого им протеина-предшественника позволяют заключить, что этот вирус имеет сходную генетическую и структурную организацию с пестивирусами растений и флавивирусами животных [R.H. Miller. R.H. Purcell., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990, 87, 2057].
ni 342 914 1490 2522 3356 5183 6377
9347 9401
5'ntl С I El IE2/NS1I NS2 I NS3 I NS4 I
NS5 |3'nt
aa 1 192 384 I structural I proteins
728 1006 1615 2013
nonstructural proteins 1569********1930
3011
clOO-3
1***120 C22-3
1689***1740
5-1-1 1001**********1616
сЗЗс
Рис. 6. Геномная карта ВГС [A. Takamizava et al.. J. Virol., 1991, 65, 1105] с указанием стартовых позиций для генов, белков, нетранслируемых (nt) областей и рекомби-нантных антигенов, используемых в диагностике.
3.1. Анализ аминокислотных последовательностей белков ВГС.
В соответствии с данными компьютерного расчета и анализа литературы осуществлен синтез 26 пептидных фрагментов из состава белков core, NS3, NS4 и NS5 ВГС (рис. 7). Антигенная композиция белков оболочки - продуктов генов El и E2XNS1, полностью охарактеризована [W. М. Ching et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89, 3190, 1992; A. J. Weiner et ai.. Ibid., 3468]. Антигены из их состава широкого применения в диагностике HCV-инфекции не получили (рис.6).
При анализе белков core, NS3, NS5 в их составе были обнаружены гидрофильные последовательности, содержащие консенсусный мотив -D-P-x-y-R-. Для синтеза и иммунологических исследований были выбраны фрагменты этих белков включающие выявленный консенсус.
В процессе работы по клонированию участков генома ВГС стало очевидным, что клон 5-1-1 кодирует иммунодоминантный В-эпитоп белка NS4, который узнают антитела, циркулирующие в крови пациентов с ВГС-инфекцией. Вследствие этого, клон 5-1-1 был выбран для разработки диагностического теста.
Из С-концевой части белка NS4, граничащей с областью антигена сЮО-З, был выбран фрагмент, соответствующий а.о. 1921-1940, С-кон-цевая часть которого (а.о. 1931-1940) выходит за рамки области сЮО-З. N-концевая часть участка 1921-1940 гидрофобна, в то время
как С-концевые остатки высоко гидрофильны. Вторичная структура неупорядоченного участка 1921-1940, расположенного между протяженными а- и р-структурами, предполагает возможность образования трех р-поворотов в районе остатков Gly1921, Pro1931, Pro1936.
Белок
Пептиды
Район
core
H-QDVKFPGGGQIVGGV-Cys(Асш)-ОН (LX) H-DVKFPGGGQIVGGV-Cys(Асш)-ОН (LXI) H-VKFPGGGQIVGGV-Cys(Acm)-ОН (LXII) H-RRGPRLGVRATRKTSERSEPRGRRQPIPKARRPEGRT-Я-GVRATRKTSERSEPRGRRQPIPKARRPEGRT-H-KTSERSEPRGRRQPIPKARRPEGRT-H-EPRGRRQPIPKARRPEGRT-H-QPIPKARRPEGRT-
H-TDPRRRS-ОЯ (LXVIII)
Я-HDPRHRS-Cvs(Асш)-ОН (LXIX)_
■OH(LXIII) ■ОН (LXIV) ОН (LXV) ОН (LXVI) ОН(LXVII)
20-34 |
21-34 I
22-34 i 39-75 | 45-75 I 51-75 I 58-75 I 63-75 I
110-116 I 110-116 I
NS3
ff-SKAHGIDPNIRTGV-Cys(Асш)-0Я (LXX) ff-GIDPNIRTGV-Cys(Асш)-0Я (LXXI) Я-GIEPNIRTGV-Cys(Асш)-Шг (ШИ) H-IEPNIRT-Шг (LXXIII) H-IDPNIRT-ОЯ (LXXIV) Я-IDPNIRT-M, (LXXV)_
1269-12821 1273-12821
1273-12821
1274-12801 1274-12801 1274-12801
NS4
область 5-1-1 Я-SGKPAIIPDREVLYREFDE-Cys(Асш)-ОН (LXXVI) Я-AIIPDREVLYREFDE-Cys(Асш)-ОН (LXXVII) Я-VLYREFDEMEEC-OH (LXXVIII) (LXXIX) Я-(Acm)CSQHLPYIEQGHMLAEQFKQKA-ОЯ (LXXX) Я-(Acm)CSSHLPYIEQGMQLAEQFKQKA-OH С-концевая часть Я-AFASRGNHVSPTHYVPESDA-Cys(Acm)-ОН (LXXXI) Я-GNHVSPTHYVPESDA-Cys(Аст)-ОН (LXXXII) Я-SPTHYVPESDA-Cys(Аст)-0Я (LXXXIII) Я-AFASRGNHVSP-Cvs(Асш)-ОН (LXXXIV)_
1689-17071 1693-16071 1700-17111 1711-17321 1711-17321 I
1921-19401 1926-19401 1930-19401 1921-19311
NS5
H-LDPQARV-ОЯ (LXXXV)
2665-2671I
Рис. 7. Синтезированные пептиды из состава core, NS3, NS4, NS5 белков ВГС.
Выделенным шрифтом указаны вариабельные а.о.
Следует учитывать сложности, связанные с предсказанием пространственной структуры белка нуклеокапсида, поскольку часть а.о. (прежде всего положительно заряженных) в нативном белке вовлечена во взаимодействие с геномной РНК, что существенно ограничивает достоверность компьютерных расчетов. Выбор пептидов 20-34 и 39-75 из состава белка core был основан, прежде всего, на анализе литературных данных [М.Sallberg et al., 1992; Н.Takahashi et al., 1992].
Антигенные свойства синтезированных пептидов оценивались по эффективности их взаимодействия в непрямом неконкурентном твердофазном ИФА с сыворотками крови пациентов с диагнозом острый и хронический гепатит С. Антителосвязывающая способность пептидов в ИФА рассматривалась в сравнении с активностью соответствующих рекомби-нантных и синтетических антигенов ВГС из коммерческих тест-систем "0RTH0-1" (Германия), "RIBA-II" (Chiron Corporation, USA) и "IN-NO-LIA HCV Ab III" (Бельгия). Панели сывороток от пациентов с гепатитом С подбирались в зависимости от цели каждого эксперимента. В качестве отрицательного контроля во все панели входили сыворотки здоровых доноров и больных гепатитами А и В. В ходе работы были подобраны оптимальные условия сорбции пептидов и инкубации с антителами на каждой стадии ИФА.
3.2. Анализ антигенных областей внутри белка core.
Антигенная активность синтетических пептидов 20-34 (LX), 2134 (LXI) и 22-34 (LXII) изучалась методом непрямого твердофазного ИФА по степени их взаимодействия с анти-с100-3+ -сыворотками ("0RTH0-1") больных хроническим гепатитом С. В качестве положительного контроля антигенов использовался рекомбинантный полноразмерный нуклеокапсидный белок (HCcAg), предоставленный ст. научн. сотр. НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского, к.б.н. Калининой Т. И.
Результаты ИФА (табл. 4) показали, что пептид 20-34 реагировал со всеми исследоваными сыворотками, а его "укороченные" варианты 21-34 и 22-34 - с частью из них. Эти данные предполагают, что пептид 20-34 включает в себя иммунодоминантный сайт, структура которого, видимо, нарушается при удалении двух аминокислотных остатков с N-конца цепи.
Антигенная активность пептида 20-34 исследовалась также в сравнении с активностью рекомбинантного антигена с22-3 из тест-системы "RIBA-II" на панели анти-ВГС+ -сывороток ("RIBA-II") больных с
острым (ОГС) и хроническим (ХГС) гепатитом С. В этом случае пептид 20-34 взаимодействовал в ИФА с 19 из 23 анти-ВГС-позитивных сывороток, что составило 83%. Полученные нами результаты согласуются с данными, представленными в работах [M.S.Nasoff et al., Proc. Natl. Acad. Sel. USA, 1991, 88, 5462; J.Chiba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991 88. 4641; M. Sail berg et al., Immunol. Lett., 1992, 33, 27], в которых продемонстрирована реактивность большинства анти-ВГС-позитивных сывороток с первыми 38 а. о. белка core.
Таблица 4. Взаимодействие синтетических пептидов с сыворотками крови больных хроническим гепатитом С.
I I_СЫВОРОТКИ*
1 1 АНТИГЕНЫ 1 1 (количество! 1 анти-ВГС 1 1 сывороток 1 количество 1 прореагировавших 1 с пептидами сывороток 1
1 1 абс. 1 в % 1
120-34 corel 18 1 18 1 100 1
121-34 core 1 18 1 14 1 78 1
122-34 core 1 18 1 13 1 72 1
1 HCcAg 1 18 1 18 1 100 1
* 5 образцов сывороток здоровых доноров и 9 образцов сывороток больных гепатитом А с исследованными пептидами и HCcAg не взаимодействовали.
С целью идентификации сайтов узнавания внутри области 39-75 был осуществлен синтез серии пептидных фрагментов, отвечающих а. о. 39-75, 45-75, 51-75, 58-75 и 63-75. Антигенная активность полученных пептидов была исследована в ИФА по их взаимодействию с ан-ти-НСУ-позитивными сыворотками ("ИВА-П", "1Ш0Ч1А АЬ Ш").
Из данных, представленных в таблице 5, следует, что наибольшей, причем, равной в процентном отношении (73.3%), активностью обладают пептида 39-75 и 45-75. Это может говорить о том. что участок 39-44 не содержит индивидуального сайта связывания с анти-соге-антитела-ми. Поскольку пептид 63-75 не прореагировал ни с одной из ан-ти-НСсА§-позитивных сывороток, то можно сделать вывод, что область а. о. 63-75 не участвует в формировании антигенной структуры со-ге-белка в качестве линейного эпитопа. Таким образом, наиболее пер-
спективным в антигенном отношении, на наш взгляд, представляется район 45-58 нуклеокапсидного белка ВГС.
Таблица 5. Выявление анти-ВГС-антител в сыворотках крови больных гепатитом С с помощью пептидов из области 39-75 белка core ВГС.
СЫВОРОТКИ
i 1 АНТИГЕНЫ 1 ! ¡количество! i анти-ВГС i ¡сывороток 1 количество 1 прореагировавших 1 с пептидами chbodotok 1
1 i абс. I в % 1
139-75 core i 15 1 И 1 73.3 i
¡45-75 core 1 15 1 И 1 73.3 1
151-75 core i 15 1 9 1 60.0 i
158-75 core 1 15 1 2 1 13.3 1
163-75 corel 15 1 0 1 0.0 I
Антигенная активность пептидов TDPRRRS-OH (LXVIII) и NDPRHRS-Cys(Acm)-0H (LXIX) изучалась в ИФА с анти-ВГС-позитивными сыворотками ("RIBA-II", "INNO-LIA Ab III") (табл. 6). Аминокислотная последовательность DPRRRS соответствует изолятам ВГС, относящимся к первому типу (субтипы 1а и 1Ь), последовательность DPRHRS относится к изолятам ВГС второго типа (субтипы 2а и 2Ь).
Таблица 6. Взаимодействие пептидов (ЬШШ и (ЬХ1Х) с сыворотками крови больных гепатитом С.
1 Сыворотки 1
1 общее i количество i количество 1 количество 1
1 количество 1 анти-соге- 1 позитивных 1 позитивных 1
1 сывороток 1 позитивных 1 с (LXVIII) 1 с (LXIX) 1
1 17 1 14/17 (82%) 1 8/17 (47%) 1 8/17 (47%)1
Примечание: 6 сывороток из 17 взаимодействовали только с пептидом (ЬХШ1), либо с пептидом (ЬХ1Х).
Результаты, представленные в таблице 6, позволяют сделать вывод о том, что участок 110-116 НСсАв соответствует одному из анти-
генных эпитопов белка core. Это заключение согласуется с данными, полученными M.Sallberg et al. (1992), которые показали, что участок 101-118 является одним из иммунодоминантных районов HCcAg.
Интересным представляется вопрос о том, чем обусловлено различие во взаимодействии пептида (LXVIII), тип 1, и пептида (LXIX), тип 2. с теми или иными анти-соге-позитивными сыворотками панели (табл. 6). Можно предположить, что замена остатка Arg на His в положении 114 является типоспецифичной и для серотипирования ВГС-ин-фекции можно использовать пептиды, содержащие а. о. 110-116 со-ге-белка ВГС и относящиеся к различным типам.
3.3. Идентификация антителосвязывающих сайтов в составе неструктурных белков NS3 и NS5.
При анализе литературы мы не обнаружили конкретных данных о локализации линейных В-эпитопов в составе белков NS3 и NS5 ВГС. Поэтому выбор пептидных фрагментов для синтеза и иммунологических исследований был обусловлен исключительно уникальностью их аминокислотных последовательностей, содержащих консенсусный мотив -Asp-Pro-x-y-Arg-.
На панелях анти-ВГС-позитивных сывороток ("INNO-LIA Ab III", "ORTHO-l", "RIBA-II"), содержащих, соответственно 17, 18 и 20 сывороток, исследовалась антигенная активность шести пептидных фрагментов (LXX-LXXV) белка NS3 - SKÄHGIDPNIRTGV-Cys(Acm)-ОН, GIDPNIRTGV-Cys(Acm)-0H, GIEPNIRTGV-Cys(Acm)-NH2, IEPNIRT-NH2, IDPNIRT-OH, IDP-NIRT-NH2. пептида LDPQARV-OH (LXXXV) из состава белка NS5 и двух пептидов TDPRRRS-OH (LXVIII) и NDPRHRS-Cys(Acra)-OH (LXIX), отвечающих а.о. 110-116 белка core ВГС (субтипы 1а и 2а, соответственно). Результаты ИФА представлены в таблице 7.
Из данных, представленных в таблице 7, следует, что все пептиды антигенно активны, причем, было отмечено, что замена остатка Asp на Glu в положении 1275 в пептидах (LXXII, LXXIII) белка NS3, соответствующая японскому изоляту HCV-J, приводит к снижению иммуноре-активности в пептидах одинаковой длины. В ходе эксперимента было показано, что использование амидов пептидов позволяет добиваться более высокого сигнала в ИФА. По-видимому, амиды пептидов лучше имитируют соответствующие участки белковой последовательности, а отсутствие отрицательного заряда на С-конце молекулы усиливает их сорбционную способность, что особенно важно при использовании ко-
• »
ротких пептидов в качестве антигенов в твердофазном ИФА. Так. пептид ЮРШЙТ-ГШ? реагировал с 13/20 сывороток, а его "кислый" аналог ЮРШТ-ОН - с 7/20. Пептиды 1269-1282 и 1273-1282 оказались менее иммунореактивны в отношении анти-ВГС-антител, чем их короткие аналоги (а.о. 1274-1280). Можно предположить, что длина пептидов в 7 а. о., включающих структуру -О-Р-х-у-И- (-Е-Р-х-у-ГЫ, является предпочтительной для данного рода антигенных детерминант.
В отношении пептида 2665-2671 из состава белка N55, взаимодействующего с 9 из 20 сывороток панели "МВА-Н", можно сделать предположительный вывод о том, что он является одним из В-эпитопов в белке N85, который требует дальнейшей характеристики.
Таблица 7. Выявление анти-ВГС-антител в сыворотках больных гепатитом С с помощью пептидов, содержащих кон-сенсусную последовательность -Лср-Рго-х-у-А^-.
1 БЕЛОК I ПЕПТИДЫ СЫВОРОТКИ !
\C0RE 1 ТОРКИГК-ОН 8/17 47.0% I
1 1 МОРНШЭ-Суб (Аси) -ОН 8/17 47.0% 1
1 ИБЗ I КАНИ0РШ1Ш;У-Суз (Аст) -ОН 6/18 33.3% 1
1 1 СЮРНШТСУ-СуБЦстЬОН 4/18 22.2% 1
1 1 СШНЫТСУ-Суэ (Аст) -Ш1г 2/18 11.1% 1
1 1 1ЕРШ11Т-ННг 5/20 25.0% 1
1 1 ЮРИШТ-ОН 7/20 35.0% !
1 1 ШРНШТ-Шо 13/20 65.055 1
1 N85 I ЬОРОАМ-ОН 9/20 45.055 1
3.4. Идентификация антигенных детерминант в белке N34.
С целью детального изучения антигенной композиции области 5-1-1 ВГС, ограниченной а.о. 1689-1740 (рис. 6), были синтезированы пептидные фрагменты 1689-1707 (ЬШ1), 1693-1707 (ЬШШ, 17001711 (ЬХШП) из ^концевой и 1711-1732 (ЬХХ1Х) (субтип 1а), 1711-1732 (ЬХХХ) (субтип 1Ь) из С-концевой частей области 5-1-1. Аминокислотные последовательности пептидов (ЬХШ-ЬХХГО соответствовали изоляту-прототипу НСУ-1 (субтип 1а), пептид (ЬХХХ) был синтезирован по секвенсу изолята НС\М (субтип 1Ь) (рис. 7).
Антигенная активность синтетических пептидов оценивалась в ИФА по степени их взаимодействия с анти-ВГС+ -сыворотками ("0йТН0-Г,
"ИВА-П") больных ОГС и ХГС. Все пептиды проявили значимую антигенную активность. В таблице 8 представлены результаты ИФА для наиболее активных пептидов.
Таблица 8. Взаимодействие синтетических пептидов из области 5-1-1 ВГС с сыворотками крови больных гепатитом С.
1 АНАЛИЗ 1 1________| АНТИГЕНЫ СЫВОРОТКИ 1 _ 1 1
1 —------1 1 1 1689-1707 14/29 1 48.3% 1
1 ИФА 1 1700-1711 16/29 1 55.2% 1
1 1 1711-1732 (1а) 21/29 1 72.4% 1
1 1 1_________ 1 1711-1732 (lb) 24/29 1 82.8% 1 1_______1
1--------- 1 1ИММУН0БЛ0Т1 5-1-1 (RIBA-II) ___ 29/29 1-------1 1100.0% 1
Полученные результаты позволяют заключить, что индивидуальные сайты узнавания специфическими анти-ВГС-антителами локализуются по всей длине области 5-1-1, а наибольшей антителосвязывающей способностью обладает пептид, отвечающий аминокислотной последовательности 1711-1732 ВГС с субтипом lb.
Наши результаты согласуются с данными [A. Cerino, M.U. Mondel-11, J. Immunol., 1991, 147, 2692; M. Sallberg et al.. J. Clin. Mic-rob.. 1992, 30. 1989 ; Yu.E. Khudyakov et al.. Virology. 1995, 206, 666].
На панели анти-ВГС+ -сывороток ("RIBA-H") исследовалась в ИФА антигенная активность пептида 1921-1940 (LXXXI) и его N- и С-конце-вых фрагментов 1921-1940 (ШХИ), 1926-1940 (LXXXIII) и 1930-1940
(txxxiv).
Результаты исследования (табл. 9) показали, что активность синтетических пептидов достаточно высока и сравнима с активностью рекомбинантного антигена clOO-З. Выло отмечено, что антителосвязы-вающая способность С-концевых фрагментов участка 1921-1940 выше, чем N-концевого фрагмента 1921-1931, хотя в одном случае имеется исключение - с сывороткой 12 взаимодействует полноразмерный (1921-1940) и N-концевой (1921-1931) пептиды, в то время как фрагменты 1926-1940 и 1930-1940 демонстрируют негативную реакцию. Полученные данные позволяют предполагать наличие на участке 1921-1940
*
« «
белка N84 ВГС по крайней мере двух индивидуальных сайтов связывания с анти-ВГС-антителами. Положительная реакция с пептидами сывороток 2 и 5, не взаимодействующих в иммуноблотинге с антигеном сЮО-З, свидетельствует о диагностической значимости С-концевой части белка N84, не входящей в область сЮО-З, оканчивающейся 1930-м а.о., и предполагают участие фрагмента 1931-1940 в формировании антигенной структуры белка N84.
Таблица 9. Взаимодействие пептидов (ЬХХХ1 - ЬХХХШ с сыворотками крови больных гепатитом С по данным ИФА.
1 Антигены 1 Сыворотки больных 0ГС1 Сыворотки больных ХГС 1
1 112 3 4 5 1 6 7 8 9 10 И 12 |
11921-1931(отр 3+ отр 2+ отр 1 отр отр отр отр отр 3+ 2+ 1
11926-19401 4+ 3+ отр 4+ отр 1 отр 4+ отр 4+ отр 4+ отр 1
11930-19401 4+ 2+ отр 3+ отр 1 отр 4+ отр 4+ отр 4+ отр ]
11921-19401 4+ 4+ отр 4+ 4+ I отр 4+ отр 4+ отр 4+ 3+ 1
1 сЮО-З* 1 4+ отр 1+ 4+ отр I отр 4+ отр 4+ отр 4+ 1+ 1
Таблица 9 (продолжение).
I Антигены \_Сыворотки больных ХГС_[
]_I 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 1
11921-19311 отр отр отр 3+ отр отр 3+ отр отр 2+ отр| 11926-19401 1+ отр 4+ 4+ отр отр 4+ отр отр 4+ 4+ I 11930-19401 отр отр отр 4+ отр отр 4+ отр отр 3+ 2+ I 11921-19401 отр отр 4+ 4+ отр 4+ 4+ отр отр 3+ 4+ I I сЮО-З* 11+ отр н/а н/а н/а н/а н/а н/а н/а н/а н/а|
* Данные иммуноблотинга сывороток с рекомбинантным антигеном сЮО-З из тест-системы "ШВА-II".
3.5. Конструирование диагностикума ВГС-инфекции на основе использования синтетических пептидных антигенов.
Идея создания нового диагностикума ВГС-инфекции на основе ре-комбинантного полноразмерного нуклеокапсидного белка {\\Cckg) и синтетических пептидов заключалась в получении антигенной смеси, сохраняющей свойства как НСсА§, так и пептидов специфически, но с более высокой эффективностью, взаимодействовать с антителами к ВГС,
чем отдельно взятье антигены. Учитывая результаты исследований, описанные выше, в качестве потенциальных компонентов новой антигенной смеси использовали пептиды из состава белка Ш (как из области 5-1-1, так и из С-концевой части, граничащей с областью сЮО-З).
Были подобраны оптимальные условия (концентрации компонентов, температурный режим, рН) инкубации антигенной смеси на твердой фазе (полистирольные планшеты).
Скрининг проводился на панели, намеренно составленной из сывороток. негативных или слабо положительных в иммуноблоте с отдельными антигенами из тест-системы "ИВА-П" с целью продемонстрировать преимущества использования новой антигенной смеси перед монокомпонентными антигенами и оценить вклад каждого компонента (табл. 10 ).
Таблица 10. Выявление антител к белку N34 ВГС с помощью пептидов (ЬХХХ) и (ЬХХХ1) и рекомбинантных антигенов 5-1-1 и сЮО-З.
1 Сыворотки! Иммуноблотинг 1 ИФА
! NN !Шифр| Рекомбинантные 1 Пептид Пептид Пептидная 1
1 ¡антигены ("ИХВА-П") 11711-1732 1921-1940 смесь 1
I 1 5-1-1 1 сЮО-З 1 (ЬХХХ) ахххп
1 1 1 1ВВ! отр 1 4+ 1 отр 4+ 4+ !
1 2 1 ЗВВ! отр 1 +/- 1 отр 1+ 1+ 1
1 3 110ВВ1 отр 1 отр 1 1+ 3+ 2+ 1
1 4 11ЗВВ1 4+ 1 4+ 1 2+ 3+ 3+ 1
1 5 115ВВ1 4+ 1 4+ 1 4+ 4+ 4+ 1
1 6 117ВВ1 4+ 1 +/- 1 1+ 4+ 4+ 1
I 7 122ВВ1 4+ 1 4+ 1 1+ 4+ 4+ 1
1 8 125ВВ1 2+ 1 2+ 1 2+ 3+ 4+ 1
1 9 131ВВ1 4+ 1 4+ 1 4+ 4+ 3+ 1
110 1 1531 3+ 1 +/- 1 1+ 4+ 3+ |
111 1 1611 3+ 1 3+ 1 1+ 4+ 4+ 1
112 1 1641 3+ 1 1+ \ 4+ 4+ 4+ 1
113 1 2111 1 + 1 1+ 1 1+ 3+ 3+ 1
Было показано, что смесь пептидов 1711-1732 (1Ь) (ЬХХХ) и 1921-1940 (ЬХХХП может быть использована в ИФА с большей эффективностью, чем антигены 5-1-1 и сЮО-З в иммуноблоте для выявления
анти-ВГС-антител в сыворотках данной панели, а исследование свойств трехкомпонентной антигенной смеси позволило сделать вывод о том, что при добавлении к рекомбинантному HCcAg синтетических пептидов значительно повышается эффективность системы скрининга, поскольку становится возможным выявлять сыворотки, негативные, либо слабо положительные по одному НСсАя (табл. И).
Таблица 11. Выявление антител к белкам ВГС с помощью пептидов (ЬШ), (1ХХХ1) и рекомбинантного \\Cckg.
1Сыворотки! Иммуноблотинг "МВА- И" ИФА 1
1 NN Шифр! Рекомбинантные антигены НСс^ 1 Антигенная!
1 1 1 5-1-1 1С100-3 1 сЗЗс С22-3 I смесь* 1
1 1 1 1ВВ1 отр 1 4+ 1 4+ отр отр 1 4+ 1
1 2 1 ЗВВ1 отр 1 +/- 1 2+ отр отр ! 1+ 1
1 3 110ВВ1 отр 1 отр 1 +/- +/- 1+ 1 3+ !
1 4 113ВВ1 4+ ! 4+ 1 4+ 4+ 2+ 1 3+ !
1 5 115ВВ1 4+ 1 4+ 1 4+ 4+ 4+ 1 4+ !
1 6 117ВВ1 отр 1 +/- ! 4+ 4+ 4+ 1 4+ 1
I 7 122ВВ1 4+ 1 4+ 1 4+ отр +/- 1 4+ 1
1 8 125ВВ1 2+ 1 2+ 1 2+ +/- отр 1 3+ 1
1 9 131ВВ1 4+ ! 4+ I 4+ 2+ 2+ 1 4+ !
110 1 1531 3+ 1 +/- ! 3+ 3+ 1 + ! 3+ 1
111 1 1611 3+ 1 3+ I 4+ 4+ 2+ 1 4+ 1
112 1 1641 3+ 1 1+ 1 4+ отр 1 + 1 4+ 1
ИЗ 1 2111 1+ 1 1+ ! 2+ отр +/- 1 4+ I
* Оптимальная рабочая смесь пептидов и HCcAg.
Таким образом, для практического использования в скрининге анти-ВГС-антител была предложена антигенная смесь, содержащая реком-бинантный НСсАё и синтетические олигопептиды, отвечающие а.о. 1711-1732 и 1921-1940 белка N84 ВГС. По проделанной работе подана авторская заявка в Патентное ведомство Российской Федерации с приоритетом от 20.10.1994г.
4. АНТИГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ ПЕПТИДОВ ИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ОИРЗ БЕЛКА ВИРУСА ГЕПАТИТА Е.
Вирус гепатита Е (ВГЕ) - недавно открытый инфекционный агент
энтерапьно передающегося гепатита ни А, ни В [G.R.Reyes et al., Science, 1990, Ш. 1335; D.W.Bradley, Prog. Med. Virol., 1990, 37, 101]. Гепатит E является серьезной проблемой во многих развивающихся странах, включая среднеазиатские регионы бывшего СССР. В результате клонирования и последующего секвенирования генома ВГЕ были идентифицированы три открытах рамки считывания (ORF) [D.W.Bradley, 1990], в том числе 0RF3, кодирующая белок, содержащий 123 аминокис-локислотных остатка, функции которого пока не установлены. Недавно [Y.Е. Khudyakov et al., Virology, 1993, 194, 89] один из иммукодо-минантных участков 0RF3 белка был выявлен между 91 и 123 аминокислотными остатками. Цель настоящего исследования состояла в более точной локализации эпитопов в С-концевой части 0RF3 белка ВГЕ с помощью синтетических пептидов.
Нами осуществлен ТФС и исследованы антигенные свойства пептидов 92-103 (LXXXVI), 99-116 (LXXXVII), 99-119 (LXXXVIII), 102-116 (LXXXIX), 102-119 (ХС), 111-123 (XCI) из состава белка, кодируемого 0RF3 генома ВГЕ (рис.8).
92 95 100 105 110 115 120
NPPDHSAPLGVTRPSAPPLPHVVDLPQLGPRR
____ (LXXXVI)
_____ (LXXXVII)
(LXXXVIII) _____________
__ (LXXXIX)
_ (ХС)
(XCI)____
Рис.8. Первичная структура, выбранного для исследования участка 92-123 а. о. белка 0RF3 ВГЕ, и последовательности синтезированных пептидов.
Предсказанная по методу Птицина и Финкельштейна вторичная структура неупорядоченного участка 92-123 предполагает наличие четырех ß-изгибов в местах расположения остатков Pro93, 99' 105• 117. которые могли бы способствовать формированию антигенных сайтов.
Свободные пептиды сорбировались на 96-луночные планшеты в концентрации 5 мкг на лунку. Сыворотки, содержащие антитела к вариантам ВГЕ, вызывавшим вспышки заболевания на территории Туркмении. Узбекистана и Киргизии в 1985-1987 г., исследовались в разведении
1:50. Отрицательным контролем служили сыворотки больных гепатитом А, гепатитом В и здоровых доноров. Полученные результаты в сравнении с положительным контролем, которым служили антигены из диагностической тест-системы, предоставленной "Centers for Disease Control" (США ), приведены в табл. 12.
Из данных, представленных в табл. 12, видно, что пептид 99-119 прореагировал со всеми сыворотками крови пациентов с диагнозом острый гепатит Е кроме одной, которая не взаимодействовала ни с одним из исследуемых пептидов, возможно по причине отсутствия у данного пациента антител к С-концевой части 0RF3 белка, что согласуется с результатом, полученным [Y. Е. Khudyakov et al., 1993]. Несмотря на одинаковый процент положительных реакций, антигенная активность пептидов 99-116 и 102-116 несколько отличалась. Эти пептиды показали противоположные по значению результаты в реакциях с двумя ан-ти-ВГЕ-положительными сыворотками. Дальнейшее уменьшение длины пептидов приводило к снижению процента связывания с анти-ВГЕ-антитела-ми, причем "периферийные" пептиды 92-103 и 111-123 обладали наименьшей антигенной активностью.
Таблица 12. Взаимодействие пептидов (LXXXV1-XCI) с сыворотками крови больных острым гепатитом Е.
! 1 1 АНТИГЕНЫ 1 1 СЫВОРОТКИ* !
количество 1 анти-ВГС ! сывороток 1 количество 1 прореагировавших 1 с пептидами сывороток 1
абс. 1 в % 1
1 92-103 21 1 4 I 19.0 1
1 99-116 21 1 19 i 90.0 1
1 99-119 21 1 20 1 95.0 1
1 102-116 21 1 17 1 81.0 1
1 102-119 21 1 19 1 90.0 1
1 111-123 21 1 5 1 24.0 1
1 Пол. контр. 21 1 21 1 100.0 1
Полученные результаты свидетельствуют, что С-концевая часть белка ОМ'З содержит набор перекрывающихся зпитопов и имеет сложную антигенную структуру. Пептид 99-119 может быть использован при конструировании тест-систем для выявления антител к ВГЕ.
5. АНТИГЕННЬЕ И ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ОЛИГОПЕПТИДОВ -ФРАГМЕНТОВ БЕЛКОВ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ТИПА 1.
Одним из наиболее опасных и быстрораспространящихся в последнее время вирусных заболеваний является инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекция), получившая в фазе клинических проявлений название СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита). Развитие этого заболевания, связанного с преимущественным поражением иммунной системы организма и сопровождающегося присоединением оппортунистических инфекций и неопластических заболеваний, неизбежно приводит к летальному исходу. Со времени появления этого заболевания число заболевших, по данным на 1994 год, составляло более 3 миллионов человек, а число инфицированных ВИЧ превышало 15 миллионов человек. Этиологический агент СПИД - вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), относящийся к семейству ретровирусов (подсемейство Lentlvirlnae), был открыт в 1983 году [L. Montagnier et al., Science, 1983, 220, 868]. Специфической мишенью для этого вируса служат Т-лимфоциты, в которых происходит размножение вируса [A.G.Dalgleish et al., Mature. 1984, 312, 763; D.E.Klatzman et al., Nature, 1984, 312, 767]. Кроме того, показано, что моноциты и макрофаги также могут быть инфицированы ВИЧ [S. Gartner et al., Science, 1986, 233, 215].
5.1. Получение поликлональных антител к белку Vif ВИЧ-1 с помощью синтетического пептида.
Появление или исчезновение антител к неструктурным белкам в сыворотках ВИЧ-инфицированных лиц может иметь значение для прогнозирования развития заболевания. Эта проблема в настоящее время интенсивно исследуется. Детекция антител к Vif-белку, одному из регу-ляторных белков ВИЧ-1, является одним из направлений подобных исследований. Этот белок интересен тем, что он, по данным, полученным in vitro, усиливает инфекционность вируса в некоторых линиях лимфо-идных клеток, а также лимфоцитах периферической крови [R.A. Subbra-manian, Е.A. Cohen, J. Virol., 1994, 68, 6831].
Для изучения уровня экспрессии в бактериях £.coli гибридных плазмид,содержащих ген vif, проведен компьютерный анализ С-концевой части VIî-белка и выявлен потенциально иммуногенный участок между 155-м и 168-м а.о. Осуществлены синтез соответствующего пентадека-пептида H-TPKKIKPPLPSVTK-Cys(Acm)-OH (XCII) и его конъюгация с бел-
нами носителями: BSA и столбнячным анатоксином. Результаты тестирования ИФА антипептидных сывороток не выявили разницы в уровне специфических антител в зависимости от белка носителя. Титр антител к пептиду составлял 1:12800.
Антипептидная сыворотка специфически взаимодействовала с ре-комбинантным Vif-белком, что было показано методами иммуноблота и ИФА. Титр антител антипептидной сыворотки к Vif-белку, определенный методом ИФА, составил 1:12800, что совпадает с титром антител данной сыворотки к пептиду.
5.2. Выявление антител к основной нейтрализующей детерминанте вируса иммунодефицита человека.
Наличие в составе генома вируса ВИЧ вариабельных областей было обнаружено сразу после первых попыток секзенирозания различных изо-лятов вируса [В.Н. Hahn, et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 1985, 82, 4813]. Особый интерес вызывает гипервариабельный участок V3, поверхностного гликопротеида gpl20, содержащий в своем составе основную нейтрализующую детерминанту вируса. Область V3 занимает положение 296-330 а. о. gpl20 и представляет собой последовательность размером 33-37 а.о. з зависимости от варианта вируса [С.К. Leonard, et al., J. Biol. ehem.. 1990, 265, 10373].
Ранее было установлено, что в популяциях ВИЧ-инфицированных лиц нозокомиальных очагов юга России (так называемая "элистинская вспышка") получил распространение вариант ВИЧ-1 с консенсусной последовательностью а.о. в области петли V3 gpi20: CTRPNNNTRKSISL-GPGQAFYTTGE11GDIRQAHC. При этом вариабельные позиции а.о. были отмечены в положениях 13,14,18,20,22,25 и 32. Особый интерес представляли замены в позициях 13, 14, 20 и 22, которые прилегали непосредственно к консервативному участку GPG и составляли основную массу замен в анализируемой популяции [R. Chcinsong-Popov et al., J. Inf. Dis., 1993, 168, 292].
Для анализа антител к V3 были синтезированы тетрадекапептиды, соответствующие 10-23 а.о. разных вариантов V3, обнаруживаемых в исследуемой популяции. Выбор этого участка был обусловлен двумя обстоятельствами: 1) в его состав входит основная нейтрализующая детерминанта в районе последовательности Gly-Pro-Gly [J. Goudsrait et al., AIDS, 1988, No2,157]; 2) в нем сосредоточено около 70% всех
замен в изучаемой популяции. Проведенный анализ встречающихся замен [М.М. Garaev, et al.. IXth Int. Conf. AIDS. Abstr. Berlin. 1993 1, 165] позволил установить, что основная масса вариантов (более 50% от общего числа) представлена 7 вариантами структуры, которые продемонстрированы на рис.9 для пептидов (XCIII-XCIX).
10 15 20 23
1. Lys-Ser-I1e-Ser-Leu-Gly-Pro-Gly-Gln-Ala-Phe-Tyr-Thr-Thr (XCII1)
2 .------------Phe---------------------------(XCIV)
3 .------------phe---------------Ile---------(xcv)
------------Phe Ala------------------------(XCVI)
5.------------Ile---------------------------(XCVII)
6----------Arg Ile---------------------------(XCVIII)
7. ------Asn Phe---------------He---------(XCIX)
Рис.9. Первичная структура пептидов (XCIII-XCIX) из состава петли V3 гликопротеида gpl20 ВИЧ-1. Приведены замены по отношению к пептиду (XCIII).
Необходимо отметить, что приведенные варианты участка 10-23 а. о. области УЗ имеют широкое распространение среди пациентов изучаемой популяции, так как обнаруживаются у 91% ВИЧ-инфицированных лиц. Консенсусный вариант обнаружен у 54,5% пациентов, последующие пять вариантов у 13-18% пациентов, однако структура, полностью соответствующая пептиду (ХС1Х), имелась только у одного пациента из 22 исследованных (4,6%).
На основе синтетических пептидов (ХСШ-ХС1Х) разработан лабораторный вариант непрямого ИФА сывороток на наличие антител к последовательности УЗ. Для проведения анализа реактивности сывороток в нашей тест-системе были подобраны условия реакции с использованием в качестве антигена пептида (ХСШ). Концентрации пептида для сорбции подбирали в пределах 50-0,0075 мкг/мл при разведении ВИЧ-позитивных сывороток 1:100 (рис.10). Концентрация олигопептидов 5 мкг/мл была выбрана как оптимальная для проведения ИФА.
[ХС1Ш, мкг/мл
Рис.10. Зависимость величины оптического поглощения в реакции ИФА от концентрации сорбированного пептида (XCIII).
Специфичность тест-системы определяли, используя панель сывороток, полученных от ВИЧ-негативных доноров (23 образца). Из анализа полученных данных в качестве величины порогового уровня, или cut off (линия дискриминации значений оптического поглощения, позволяющая надежно различать сигналы, соответствующие отрицательным и положительным образцам сыворотки), было выбрано значение среднего арифметического для отрицательных сывороток плюс три стандартных отклонения. Как правило, в наших экспериментах значение cut off для пептидов (XCIII-XCIX) не превышало 0,15-0,35 единиц ОП.
В разработанном нами варианте лабораторной тест-системы был проанализирован спектр антител к 7 синтезированным УЗ-антигенам у пациентов из Калмыкии и Северо-Кавказского региона (табл. 13).
Из данных, представленных в таблице 13, следует, что существует определенная зависимость между реактивностью синтезированных пептидов, частотой встречаемости соответствующих последовательностей в исследуемой популяции и характером аминокислотных замен. Однако прямого соответствия между этими параметрами не обнаружено, возможно, из-за высокой кросс-реактивности антител у ВИЧ-инфицированных пациентов по отношению к синтезированным пептидам. Наибольшее влияние на реактивность V3 пептидов оказывают замены Leu14 (lie) на Phe и Gly15 на Ala.
Таблица 13. Реактивность ВИЧ-1 позитивных сывороток из нозоко-миальных очагов юга России с УЗ пептидами.
1 Пептиды Результаты ИФА1
1 (ХСШ) 22/22 (100%) 1
1 (XCIV) 18/22 (81,8%) 1
1 (XCV) 16/22 (72,7%) 1
1 (XCVI) 9/22 (40,9%) 1
1 (XCVII) 21/22 (95,4%) 1
1 (XCVIII) 22/22 (100%) 1
1 (XCIX) 10/22 (45.5%) !
ОБСУЖДЕНИЕ
Ниже приведены данные о способах получения, схемах синтеза и выходах синтетических пептидов (1-ХС1Х), а также пептидов (С-СТ) из состава белков УР1 и УРЗ вируса гепатита А (ВГА).
Таблица 14. Характеристики синтезированных пептидов.
1 Вирус Белок! Пептиды 1 Район, ! С-конц. Метод Схема Выход,1
1 а. о. 1 группа получения синтеза %* 1
1 1 2 I 3 1 4 1 5 6 7 8 i
1 1 ВГВ core 1 I - XIV 1 73-89 1 | р ** Pepscan Ртос I
1 XV 1 73-84 ICys(Асш) ТФС Вое 31.0 1
1 XVI 1 74-89 1 —//— -//- -//- 18.0 1
1 XVII 1 78-83 1 --//-- -II- 25.0 1
1 XVIII 1 -//- 1 --//— -//- 27.0 1
1 XIX 1 -II- 1 -NH2 Ртос 64.0 I
1 XX 1 -//- 1 --//-- -II- -II- 68.0 1
1 XXI 1 77-83 1 --//-- -II- 65.0 I
1 XXII 1 -//- 1 --//-- -//- 71.0 I
1 preSl1 XXIII- 1 1 1
1 -XXXIV 1 25-41 1 P Pepscan -//- — 1
1 XXXV 1 24-41 ! -ОН ТФС Вое 19.0 I
Таблица 13 (продолжение).
1 1 1 2 1 3 1 4 5 6 1 7 8 1
1 XXXVI 1 30-36 -ОН ТФС 1 Вое 28.0 1
1 XXXVII 1 -//- СуБ(Аст) -II- 1 -//- 15.0 1
1 XXXVIII 1 31-36 1 -//- 33.0 I
1 XXXIX 1 24-30 1 -//- 18.0 I
1 |рге321 ХШ 1 133-143 —//-- -II- 1 -//- 22.0 I
1 1 ро1 1 ХЬ ! 25-36 -II- 1 -II- 20.0 1
1 хы ! 816-832 -II- ! Риос 56.0 1
1 вгд 1 Р27 I ХШ ! 4-15 -ОН ТФС 1 Вое 22.5 1
1 ш 1 11-23 Суз (Асга) -II- 1 -II- 7.4 1
1 ХШ 1 40-49 1 -//- 21.0 !
1 ХШ1 ! 61-71 -II- 1 -//- 38.0 1
1 хшн 1 65-80 1 -//- 18.5 1
1 ХЫХ 1 82-94 1 -//- 19.5 1
1 1 ! 153-167 -ОН 1 -//- 18.0 I
1 и 1 169-179 Суз(Асш) -II- 1 -//- 25.0 1
1 Ыа 1 169-179 --//— -II- 1 -//- 35.0 1
1 Ш 1 182-195 —//— 1 -//- 21.0 1
1 ЫН 1 201-211 —//-- 1 -II- 40.0 1
1 ЫУ 1 69-80 1 -//- 19.5 1
1 IV ! 71-80 ! -//- 25.0 1
1 141 1 69-78 ! -//- 18.0 1
1 Ж1 1 71-78 —//— 1 -//- 22.0 I
1 шп 1 71-80 -ОН -II- 1 -//- 21.0 1
1 ых 1 73-80 Суб(Асш) -II- 1 -//- 20.5 !
I вгс !соге 1 ьх ! 20-34 СуэСАст) ТФС 1 Вое 21.0 !
1 ЬХ1 1 21-34 --//— -II- 1 -//- 30.0 1
! ьхи 1 22-34 1 -//- 27.0 1
1 шп 1 39-75 -//- -II- 1 -//- 17.0 1
1 ът 1 45-75 —//— -II- 1 -//- 19.5 !
1 т 1 51-75 ! -//- 22.0 1
1 1Ж 1 58-75 -II- 1 -//- 28.0 1
1 ЬХУП 1 65-75 1 -//- 25.5 1
1 ьтп 1 110-116 -ОН 1 Ртос 77.0 1
1 ЬХ1Х 1 110-116 Суб(Аси) -II- 1 Вое 38.0 1
1 1 N53 1 ш 11269-1282 Суз(Аст) ТФС 1 Вое 20.0 1
1 ЬХХ1 11273-1282 -II- 1 -//- 23.0 1
Таблица 13 (окончание).
1112 1 3 4 5 1 6 7 8 1
1 1 1 LXXII 1273-1282 Cys(Acm)1 ТФС Вое 32.0 !
1 1 I LXXIII 1274-1280 -NH2 1 -//- Fmoc 58.0 1
1 1 1 LXXIV 1274-1280 -OH 1 -II- Вое 26.0 I
1 1 LXXV 1274-1280 -NH? 1 -II- Fmoc 42.0 1
1 1 NS4 1 LXXVI 1689-1707 Cys(Acm)1 ТФС Вое 16.0 1
1 1 1 LXXVII 1693-1707 —//-- 1 -//- -//- 15.0
1 1 1 LXXVIII 1700-1711 -OH 1 -II- 18.0 i
1 1 i LXXIX 1711-1732 --//— 1 36.0 1
1 1 1 LXXX 1711-1732 —II— \ -II- 32.0 1
I 1 1 LXXXI 1921-1940 Cys(Acm)1 22.0 1
1 1 I LXXXII 1926-1940 —II— 1 30.0 1
1 1 1 LXXXIII 1930-1940 —II—1 26.0 1
1 1 1 LXXXIV 1921-1931 —II— 1 -II- -II- 18.0 1
1 1 NS5 1 LXXXV 2665-2671 -OH 1 ТФС Fmoc 36.0 1
1 ВГЕ I0RF3 1 LXXXVI 92-103 Cys(Acm)1 ТФС Вое 25.0 1
1 1 1 LXXXVII 99-116 —//— 1 -II- -//- 27.0 I
1 1 1 LXXXVIII 99-119 --//-- | 21.0 1
1 1 1 LXXXIX 102-116 _.//._ j -II- 28.0 1
1 1 1 XC 102-119 -II- 32.0 1
! 1 1 XCI 111-123 —II— i -//- -//- 18.0 1
1ВИЧ-11 vol 1 XLIII 941-950 Cys(Acm)1 ТФС Вое 26.0 1
1 1 Vif 1 XCII 155-168 Cys(Acm)1 ТФС Вое 30.0 i
1 Igpl20l XCIII- 32.0-1
1 1 петля! -XCIX 10-23 Cys(Acm)I ТФС Вое 42.0 1
1 IV3 1
I ВГА 1 VP1 1 С 14-24 -OH 1 ТФС Вое 27.5 1
1 I I CI 66-74 __//- | -II- -II- 22.0 1
I 1 1 CII 99-109 -OMe 1 Класси- -II- 48.0 1
1 1 1 CIII 115-125 -OH 1 ческий 55.0 1
1 1 1 CIV 234-244 —//— 1 ТФС 16.0 I
1 ! VP3 1 CV 30-40 -OH i ТФС -II- 25.0 1
* Выход пептидов при проведении ТФС определен в расчете на стартовую аминокислоту после очистки ВЭЖХ. Выход пептидов (CII) и (CIII) определен на стадии финального отщепления защитных групп после очистки ВЭЖХ. ** Р - нерастворимый полимерный носитель.
Синтез выбранных пептидных фрагментов проводился в основном твердофазным методом (R.B. Merrlfield, J.Amer.Chem. Soc., 1963, 85, 2149), который обладает рядом преимуществ перед "классическими" методами синтеза пептидов в растворе, в частности, быстротой, простотой выделения промежуточных продуктов, отсутствием проблемы растворимости, технологичностью. ТФС проводился на основе двух наиболее распространенных схем образования пептидной связи - Вое- и Fffloc-схемы. Выход пептидов по Fmoc-схеме в расчете на первую аминокислоту составил 40-70%, тогда как при использовании Вос-схемы синтеза выход пептидов колебался в основном от 18 до 40%, Более низкие выходы в последнем случае можно объяснить неполным восстановлением нитрогруппы, используемой для защиты гуанидогруппы остатков Arg, под действием TFMSA, разрушением имидазольного кольца остатков Тгр и окислением сульфметильной группы Met во время кислотных обработок пептидилполимера. Проведение ТФС по Ршос-схеме является предпочтительным, несмотря на высокую стоимость FMOC-аминокислот.
В качестве полимерного носителя при ТФС по Вос-схеме использовался хлорметилированный тефлон с радиационно привитым полистиролом, ранее применявшийся для ТФС олигонуклеотидов [V.К. Pctapov et al., Nucí. AsIds Res., 1979, 6, 2043]. Этот полимер обладает рядом преимуществ, в частности, его низкая набухаемость в органических растворителях в несколько раз уменьшает их расход на стадиях промывки полимера и время промывки, что делает синтез более экономичным и эффективным. Сокращение времени промывки носителя способствовало разработке варианта одновременного синтеза нескольких пептидов, что было продемонстрировано на примере ТФС тетрадекапептидов (XCIII-XCIX) из состава петли V3 гликопротеида gpl20 ВИЧ-1.
Часть пептидов (табл.14) синтезировали в виде амидов для применения в ИФА в свободном состоянии. Амиды пептидов лучше имитируют соответствующие участки белковой последовательности, а отсутствие отрицательного заряда на С-конце молекулы усиливает их сорбционную способность, что важно при использовании в твердофазном ИФА в качестве антигенов коротких пептидов. Дополнительный N- или С-конце-вой остаток Cys(Acm) вводили в пептиды для их конъюгации с белком носителем через сульфгидрильную группу Суs. Конъюгация пептидов проводилась с целью их дальнейшего использования в качестве иммуно-генов, а также для повышения их сорбционной способности в ИФА.
Пептиды (C-CV) были синтезированы в связи с исследованиями.
которые проводились в Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского в середине 80-х годов, когда исследование антигенной структуры белков ВГА только начиналось. Они имели последовательности, соответствующие участкам 14-24 (С). 66-74 (CI). 99-109 (СИ). 115-125 (CHI), 234-244 (CIV) белка VP1 и участку 30-40 (CV) белка VP3 ВГА, а именно: H-TEQNVPDPQVG-OH (С), H-ETFPELKPG-OH (CI), H-TFNSNNKEYTF-OMe (СИ), H-STSNPPHGLPS-OH (CHI), H-ANYNHSDEVLS-OH (CIV), H-LDQEDWKSDPS-OH (CV).
Вирус гепатита А относится к роду энтеровирусов, семейству пи-корнавирусов. Вирион состоит из 60 копий капсидных белков VP1, VP2, VP3 и VP4 с молекулярными массами 33000, 27000, 21000 и 8000 соответственно. Предполагается, что VP1 и VP3 находятся частично на поверхности, a VP2 и VP4 располагаются внутри вириона.
Выбор фрагментов (C-CV) был проведен на основе теоретического анализа и данных литературы [J.V. Hugnes et al., J. Virol., 1984, 52, 465; E.A. Emini et al., J. Virol., 1985, 55, 836], указывающих, что белок VP1 является наиболее экспонированным из структурных белков ВГА и содержит вируснейтрализующие участки. Свободные пептиды и их конъюгаты с BSA были проверены в прямом и непрямом вариантах ИФА и методом РИА на способность взаимодействовать с антителами к ВГА из сывороток рековалесцентов. При этом ни один из пептидов не проявил антигенную активность, иными словами, пептиды (C-CV) оказались неспособными связываться с анти-ВГА-антителами. Однако до последнего времени не было получено убедительных данных о локализации последовательных антигенных детерминант в составе капсидных белков ВГА [G. Siegl, S.M. Lemon, Virus Res., 1990, 17, 75; Л.Д. Чикин и др., Биоорган, химия, 1991, 17, 964]. Было показано, что пептиды VP1-(126-139) и VP2-(80-99) способны связываться с фракцией IgG из пула сывороток рековалесцентов и моноклональными антителами к ВГА [Л.Н. Кулик и др., Биоорган, химия. 1994. 20, 709], но, по-видимому, они являются лишь частями большой конформационной детерминанты.
Для выбора потенциальных линейных В-эпитопов в составе вирусных белков основными критериями являются гидрофильность, гибкость, экспонирование участков пептидной цепи на поверхности белка. Этим критериям удовлетворяют неупорядоченные участки, обладающие повышенной гидрофильностью, содержащие в своем составе остатки пролина. Предпочтительным является расположение таких участков между протяженными структурированными районами, что делает возможным образова-
ние петли на поверхности белковой глобулы. Изложенным требованиям соответствуют фрагменты, содержащие в своем составе консенсусный мотив -Asp-Pro-x-y-Arg-. В них бета-изгиб, предсказываемый в районе остатка Pro, может стабилизироваться за счет противоположно заряженных боковых ионогрупп Asp (-) и Arg (+). На основании полученных результатов можно предположить, что консенсусный мотив -DPxyR- в последовательности вирусных белков указывает на наличие в этом районе антигенно-активного участка.
В результате глобального компьютерного анализа 4991 аминокислотной последовательности по программе PC/GENE было выявлено, что консенсус -Asp-Pro-x-y-Arg- встречается 327 раз в составе 292 последовательностей как структурных, так и регуляторных белков вирусов самых различных семейств, что соответствует среднестатистической вероятности.
Следует учитывать сложности, связанные с предсказанием пространственной структуры нуклеокапсидных белков, поскольку часть а.о. в нативном белке, прежде всего, положительно заряженных, вовлечена во взаимодействие с геномной РНК (ВГД, ВГС) или ДНК (ВГВ), что существенно ограничивает достоверность компьютерных расчетов.
В ходе работы были синтезированы пептидные фрагменты вариабельных областей вирусов гепатита В, С, Д и ВИЧ-1, соответствующие природным изолятам этих вирусов. Полученные экспериментальные данные подтверждают положение, что большинство секвенционных (линейных) антителосвязывающих сайтов являются дискретными (лишенными непрерывности), так как отдельные аминокислотные остатки, входящие в их состав, не вовлекаются в прямое связывание или контакт с соответствующими антителами и могут быть заменены на другие а. о. без значительной потери антигенной активности.
Взаимозамена остатков Не и Ala существенно не отражается на антигенных свойствах пептидов (XVII-XXII) из состава соге-белка ВГВ.
Оба варианта пептида 71-80 (LV и LVIII), отличающихся а.о. в положениях 73 (K-R), 74 (L-A) и 76 (М-Т), взаимодействовали с одними и теми же анти-Н0+ сыворотками, что свидетельствует о весьма дискретном характере серологической структуры HDAg на этом участке.
Аминокислотные замены на участке 1711-1732 белка NS4 ВГС в положениях 1713 (Q-S) и 1723 (M-Q) также существенно не влияли на антигенную активность пептидов (LXXIX, LXXX) (рис. 7, табл. 8). Хотя
наибольшей антителосвязыващей способностью обладает пептид (LXXX), соответствующий субтипу lb ВГС, наиболее распространенному субтипу ВГС на территории РФ. В этом случае нельзя исключать роль высокой кросс-реактивности антител сывороток крови больных гепатитом С по отношению к пептидам (LXXIX, LXXX), относящимся к одному типу ВГС.
Из всех аминокислотных замен, которые встречаются в пептидах (XCIV-XCIX) по отношению к пептиду (XCIII), критическими, снижающими процент выявляемости ВИЧ-позитивных сывороток более чем в два раза, являются лишь замены в положении 15 (G-A). пептид (XCVI), и в положениях 13 (S-N) и 14 (L-F), пептид (XCIX), (рис. 9, табл. 13).
Еще одно направление исследований, имеющее практическое значение и требующее дальнейшего развития, связано с получением аналогов эпитопов, содержащих аминокислотные замены, с одной стороны, облегчающие проведение пептидного синтеза, делающие его более экономичным, с другой, не влияющие на специфичность и устойчивость комплексов антиген-антитело. В наших опытах показано, что замена остатка Met на близкий по строению остаток Nva в положении 171 белка Р27 ВГЕ (пептиды LI и Lia) существенно не сказывается на иммунологических свойствах фрагмента 169-179.
В отличие от приведенных примеров замена остатка Arg на His в положении 114 белка core ВГС обуславливает различие во взаимодействии пептида (LXVIII), тип 1, и пептида (LXIX), тип 2, с ан-ти-НСс-позитивными сыворотками (рис. 7, табл. 6). Можно предположить, что эта замена является типоспецифичной и для серотипирования ВГС-инфекции можно использовать пептиды, содержащие а. о. 110-116 соге-белка ВГС и относящиеся к различным типам вируса.
Резюмируя все изложенное, можно заключить, что синтетические пептиды являются полезными и надежными инструментами: а) в серологической диагностике вирусных гепатитов В, С, Д. Е и ВИЧ-инфекции; б) в картировании линейных (последовательных) В-эпитопов; в) в получении моноклональных антител к определенным участкам белковой последовательности; г) в определении роли отдельных аминокислотных остатков в процессе взаимодействия антигенов со специфическими антителами и формировании антигенной детерминанты; д) в получении аналогов вирусных эпитопов, обладающих равной специфичностью и устойчивостью комплексов антиген-антитело. Антисыворотки к пептидам служат инструментами для выделения и характеристики рекомбинантных белков.
ВЫВОДЫ
1. Методами классического синтеза в растворе и на твердой фазе и методом пептидного сканирования с использованием пин-технологии синтезировано 106 олигопептидов с длиной цепи от 6 до 37 аминокислотных остатков - фрагментов белков нуклеокапсида (core и pol) ВГВ, полипептидов preSl и preS2, кодируемых геном pre-S ВГВ; белка core и неструктурных белков NS3, NS4 и NS5 ВГС; белка Р27 ВГД; белка 0RF3 ВГЕ; белков оболочки VP1 и VP3 ВГА; поверхностного гликопроте-ида gpi20, белков Vif и р34, pot ВИЧ-1, выбранных на основе данных литературы и теоретических методов анализа потенциальных антигенных и иммуногенных участков белков.
2. Показаны иммуногенные свойства фрагментов белка core (а.о. 73-84), белка pot (а. о. 25-36 и 816-832), полипептидов preSl (а.о. 24-41) и preS2 (а. о. 133-143), кодируемых геном preS ВГВ; белка Р27 ВГД (а.о. 65-80 и 169-179); белка р34, pot (а.о. 941-950) и белка Vif (а.о. 155-168) ВИЧ-1. Установлено, что поликлональные кроличьи или мышиные антисыворотки к пептидам, гомологичным данным участкам, специфически взаимодействуют с соответствующими рекомбинантными или нативными белками.
3. Уточнена и детализирована антигенная структура районов, ограниченных а. о. 24-41 preSl-области и а.о. 73-89 соге-белка ВГВ; а.о. 20-34 и 39-75 белка core, а.о. 1689-1732 и 1921-1940 белка NS4 ВГС; а.о. 65-80 белка Р27 ВГД; а.о. 92-123 белка 0RF3 ВГЕ; а.о. 10-23 области V3 gpl20 ВИЧ-1. Обнаружено, что 8 из 9 проанализированных участков имеют сложную организацию, так как обладают дискретным характером антигенной структуры и (или) содержат в своем составе несколько перекрывающихся эпитопов.
4. Локализованы неописанные ранее В-эпитопы в белке core и полипептидах preSl и preS2 ВГВ, белках core. NS3 и NS5 ВГС, которые содержат консенсусньгй мотив -Asp-Pro-x-y-Arg- в аминокислотной последовательности и обладают схожей вторичной структурой.
5. Показано, что анти-НВе-антитела узнают на участке 73-89 белка core ВГВ более протяженную аминокислотную последовательность по сравнению с анти-НВс-антителами, которым для взаимодействия в ИФА достаточно наличия фрагмента 78-83 (DPISRD, DPASRD) соге-белка.
6. Разработана оптимальная композиция тест-системы для диагностики ВГС инфекции на основе использования в качестве антигена для иммуноферментного скрининга анти-ВГС-антител смеси рекомбинант-ного HCcAg и синтетических олигопептидов, соответствующих а.о. 1711-1732 (субтип lb) и 1921-1940 белка NS4 ВГС.
7. Установлено, что олигопептиды, соответствующие участкам 20-34 а.о. белка core ВГС, 65-80 а. о. нуклеокапсидного белка ВГД и 99-119 а.о. белка 0RF3 ВГЕ обладают высокой антигенной активностью и могут быть использованы-для выявления соответственно анти-ВГС антител. анти-ВГД антител и анти-ВГЕ антител в клинической практике.
8. Предложен экспериментальный вариант тест-системы для определения антител к основной нейтрализующей детерминанте ВИЧ-1 на основе набора тетрадекапептидов, гомологичных 10-23 а. о. области V3 gpl20 вариантов ВИЧ-1, получивших распространение в внутрибольнич-ных очагах ВИЧ-инфекции юга России. Выявлена зависимость между реактивностью синтезированных пептидов, частотой встречаемости соответствующих последовательностей в исследуемой популяции и характером аминокислотных замен.
10. Разработаны принципы отбора антигенов и создания композиций для диагностических тест-систем на основе иммунологически активных олигопептидов из состава иммунодоминантных белков вирусов гепатита В, С, Д, Е и ВИЧ-1, включая отработку оптимальных условий синтеза и оценку практического выхода пептидов.
Список основных публикаций по теме диссертационной работы.
1. Семилетов Ю.А., Петрова М. Г., Смирнов В. Д. Синтез пептидных фрагментов белка УР1 вируса гепатита А. - Хим. прир. соед., 1987. N0 1. с. 152-153.
2. Семилетов Ю.А.. Петрова М.Г. Синтез пептидных фрагментов белков ЧР1 и УРЗ вируса гепатита А.- Тезисы докладов VII Всесоюзного симпозиума по химии белков и пептидов. Таллин, 1987, с. 237-238.
3. Евстигнеева Р.П.. Желтухина Г.А., Прокуронова Е.И., Смирнов В. Д., Семилетов Ю. А., Худяков Ю. Е. Предсказание локализации антигенных детерминант, синтез и иммунологические свойства пептидного фрагмента ргеБ-оболочки вируса гепатита В. - Всесоюзная научная конференция "Оценка фармакологической активности химических соединений: принципы и подходы". - Тезисы докладов, Москва, 1989, ч. 1, с. 109.
4. Семилетов Ю. А.. Карпова В. А., Калинина Т. И., Худяков Ю. Е., Синтез и иммунологические свойства пептидов из состава белка оболочки, нуклеокапсида и полимеразы вируса гепатита В. - Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума по химии пептидов, Рига, 1990, с. 43.
5. Евстигнеева Р. П., Желтухина Г. А., Прокуронова Е. И., Смирнов В. Д., Семилетов Ю. А.. Калинина Т. И., Худяков Ю. Е.. Хромов И. С., Фа-воров М.0., Яшина Т. Л. Синтез и иммунологические свойства пептидного фрагмента ргеЭ-области белка оболочки вируса гепатита В. - Биоорган. химия, 1990, т. 16. N0 1. с. 34-40.
6. Семилетов Ю.А., Карпова В.А., Прокуронова Е.И., Смирнов В.Д., Павлюченкова Р.П., Калинина Т.И., Худяков Ю.Е., Желтухина Г.А., Евстигнеева Р. П. Синтез и иммунологические свойства пептидов из белков вириона вируса гепатита В. - Итоги науки и техники. Сер. Вирусология, ВИНИТИ, Т. 22, Вирусные гепатиты.- Материалы международного симпозиума, Ростов, 1990, с. 68-69.
7. Смирнов В.Д., Семилетов Ю.А., Карпова В.А., Павлюченкова Р.П., Оспельникова Т.П., Вязов С.0., Прокуронова Е.И., Желтухина Г. А., Евстигнеева Р. П. Антигенные свойства пептидных фрагментов НОАв.- Итоги науки и техники. Сер. Вирусология, ВИНИТИ, т. 22, Вирусные гепатиты. - Материалы международного симпозиума, Ростов, 1990, с. 101-102.
8. Евстигнеева Р. П., Прокуронова Е. И., Желтухина Г. А., Смирнов В.Д., Семилетов Ю.А.. Худяков Ю.Е., Калинина Т.И., Герлих В.Г. Синтез и иммунологические свойства пептидного фрагмента 30 - 36
preSl-области белка оболчки вируса гепатита В.- Докл. Акад. наук СССР, 1990, т. 313, No 5, с. 1135-1138.
9. Семилетов Ю.А., Карпова В.А., Смирнов В.Д., Худяков Ю.Е., Калинина Т.И., ФаворовМ.0., Яшина Т.Л., Евстигнеева Р.П., Прокуро-нова Е. И., Желтухина Г.А. Иммунохимические свойства синтетических пептидов из состава белка оболочки, нуклеокапсида и полимеразы вируса гепатита В.- I Бьлгаро-Сьветски симпозиум по вирусни инфекции.- Тезисы докладов, Варна, Бьлгария, 1990, с. 84-85.
10. Khudyakov Y.E., Kalinina T.I., Makeeva I.V., Samoshin V. V. .Semiletov Y.A. Kadoshnikov Y.P. Hybrid Particals of HBcAg Antigen: New Approach for the Development of Efficient Recombinant HBV Vaccine - VIII th International Congress of Virology. - Abstracts, Berlin, 1990, P38-012, p. 349.
11. Евстигнеева P.П., Смирнов В.Д., Семилетов Ю. A., Карпова В. А., Худяков Ю. Е., Вязов С. 0., Павлюченкова Р. П., Прокуронова Е. И., Желтухина Г,А. Антигенные свойства пептидных фрагментов белка нуклеокапсида вируса гепатита дельта. - Докл. Акад. наук СССР, 1991, т. 316, No 1, с. 239-242.
12. Семилетов Ю. А., Карпова В. А., Смирнов В. Д., Вязов С. 0. Возможности использования синтетических пептидов для диагностики вирусного гепатита дельта - Второй Всесоюзный Симпозиум "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии". - Тезисы докладов (Самарканд, 1991 г.). Москва - 1991, с. 172.
13. Прокуронова Е.И., Хлебникова И.Н., Желтухина Г.А., Евстигнеева Р. П., Семилетов Ю. А., Карпова В. А., Калинина Т. И., Худяков J0.E., Павлюченкова Р.П., Смирнов В.Д. Синтез пептидов preSl- области белка оболочки вируса гепатита В и локализация антигенной детерминанты - Биоорган, химия, 1991, т. 17, No 11, с. 1500-1509.
14. Семилетов Ю.А., Карпова В.А., Худяков Ю.А., Павлюченкова Р.П., Вязов С.0., Смирнов В.Д., Прокуронова Е.И., Желтухина Г.А., Евстигнеева Р.П. Синтез и антигенная активность пептидов белка нуклеокапсида вируса гепатита дельта. - Биоорганич. химия, 1992, т. 18, No 2, С. 252-262.
15. Семилетов Ю.А., Карпова В.А., Буковский A.A. Применение метода эпитопного картирования для локализации антигенных детерминант в вирусных белках и пептидах.- Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии ( Сборник научных трудов). Под ред. С.М.Клименко, Р.М.Бикбулатова.- Москва, 1992, с. 25-31.
16. Семилетов Ю.А., Карпова В.А., Смирнов В.Д., Павлюченкова Р.П., Вязов С.0. Иммунологическое картирование вирусных белков с помощью синтетических пептидов ( на модели дельта-антигена). - Методы исследования в молекулярной,общей и медицинской вирусологии (Сборник научных трудов). Под ред. С. М. Клименко, Р. М. Бикбулатова. -Москва, 1992, с. 40-48.
17. ГазинаЕ. В., Маркова Н. В., Семилетов Ю. А.. Павлюченкова Р.П.. Смирнов В.Д. Рекомбинантные белки, содержащие аминокислотную последовательность полимеразы вируса гепатита В.- I Съезд иммунологов России.- Тезисы докладов, Новосибирск, 1992, с. 96.
18. Семилетов Ю.А., Яшина Т.Л., ФаворовМ.0., Павлюченкова Р.П.,Смирнов В.Д. Анализ сывороток больных вирусным гепатитом С с помощью синтетического пептида.- I съезд иммунологов России.- Тезисы докладов, Новосибирск, 1992, с. 426.
19. Смирнове. Д., Исагулянц М. Г., Суханова Л. Л., Калинина Т. И., Семилетов Ю. А., Фирсова Т.В., Павлюченкова Р. П. Гибридные белки направленной иммуноспецифичности; антигенные детерминанты ВИЧ-1 в составе &-GAL и HBcAg.- I Съезд иммунологов России.- Тезисы докладов, Новосибирск, 1992, с. 446.
20. Семилетов Ю. А., Фирсова Т. В., Шибнев В. А., Вязов С. 0. Синтез и антигенная активность пептидов из состава core- и NS3- белков вируса гепатита С. - Биоорган, химия, 1993, т. 19, No 1, с. 126-129.
21. Семилетов Ю.А., Фирсова Т. В., Кузин С. Н., Шибнев В. А., Вязов С.О. Антигенная активность синтетических пептидов - фрагментов белков вируса гепатита С. - Докл. Акад. Наук, 1993, т. 333, No 3, с. 391-393.
22. Семилетов Ю. А.. Карпова В. А., Смирнов В. Д., Вязов С. О. Локализация ишунодоминантного сайта в составе антигена вируса гепатита дельта с помощью синтетических пептидов.- Биоорган, химия, 1993, т. 19. No 3, С. 277-285.
23. Семилетов Ю. А., Круглов И. В., Карпова В. А., Яшина Т. Л., Фаворов М.О. Сравнительное исследование диагностической ценности пептидов, соответствующих различным геномным последовательностям вируса гепатита дельта.- Молекул, генетика, ыикробиол. и вирусол., 1993, No. 4, с. 34-37.
24. Serailetov Yu., Viazov S.. Firsova T., Lvov D. Identification of an Immunodominant epitope in NS3 protein of HCV. - International Sumposium on Viral Hepatities and Liver Desease.- Abstract
Volume, Tokyo, 1993, 355, p. 185.
25. Viazov S., Semiletov Yu., Karpova V., Klimenko S. Identification of an Immunodominant site in the hepatitis delta virus antigen.- International Sumposium on Viral Hepatities and Liver Desease.- Abstract Volume, Tokyo, 1993, 664. P. 252.
26. Семилетов Ю.A., Фирсова Т.В. Эпитопное картирование области 5-1-1 белка NS4 вируса гепатита С.- Тезисы докладов научно-практической конференции "Актуальные проблемы инфекционной паталогии".-Санкт-Петербург, май 1993, ч. 2, с. 111.
27. Карасева Н. Г., Семилетов Ю.А., Гибадулин Р.А., Карамов Э.В., Шибнев В. А. Изучение взаимодействия рекомбинантного VIF-белка ВИЧ-1 и синтетических пептидов с гипериммунными сыворотками животных и с ВИЧ-позитивными человеческими сыворотками. - Тезисы докладов научно-практической конференции "Актуальные проблемы инфекционной паталогии". - Санкт-Петербург, май 1993, ч. 2, с. 151.
28. Semiletov Yu., Karpova V., Shibnev V., Lvov D. Comparative Investigations of Diagnostic Value of Peptides Corresponding to Different Genom Sequences of Hepatitis D Virus.- IXth International Congress of Virology.- Abstract Volume, Glasgow, Scotland, 1993, Pll-10, p. 151.
29. Фирсова Т.В., Семилетов Ю.A., Кузин С.Н. Возможности использования синтетических пептидов в диагностике вирусного гепатита С.- Тезисы докладов научно-практической конференции "Состояние и перспективы.разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций,управляемых специфическими средствами профилактики". - Пермь, 1993, с. 128-129.
30. Семилетов Ю. А., Фирсова Т. В., Кузин С. Н., Худяков Ю. Е., Шибнев В.А. Синтез и антигенная активность пептидов из С-концевой части неструктурного NS4-6ema вируса гепатита С.- Биоорган, химия. 1993, т. 19, No. И. с. 1128-1131.
31. Karaseva N.G., Semiletov Yu.А., Gibadulin R.A., Shibnev V.A.. Karamov E.V. The main outlines to the HIV-i VIF-antigene definition. using antiserum to synthetic peptides.- Abstracts of 2nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses".-St-Peterburg, November 29 - December 3. 1993, p. 14.
32. ГазинаЕ. В., Семилетов Ю. А., Маркова Н. В., Павлюченкова Р.П. Экспрессия в Esherichia coli полимеразы вируса гепатита В и ее функциональных доменов.- Молекул, генетика, микробиол. и вирусол., 1994, No 2, с. 21-24.
33. Семилетов Ю.А., Ржанинова А.А., Гараев М.М. Синтез и сравнительный анализ антигенной активности пептидов, соответствующих различным геномным последовательностям гипервариабельной области V3 поверхностного гликопротеида gpl20 вируса иммунодефицита человека типа 1,- Биоорган, химия, 1994, т. 20, No 10, с. 1070-1079.
34. Семилетов Ю. А., Карпова В. А., Калинина Т. И., Худяков Ю. Е. Локализация иммунодоминантного сайта в составе норового антигена вируса гепатита В с помощью синтетических пептидов.- Биоорган, химия, 1994, т. 20. No 11, с. 1175-1185.
35. Калинина Т. И., Макеева И. В., Худяков Ю.Е., Самошин В. В., Смирнова Е. А., Семилетов Ю.А., Павлюченкова Р.П., Кадошников Ю.П., Смирнов В.Д. Введение гетерологических зпктог.ов в N концевую часть соге-белка вируса гепатита В.- Молекуляр. биология, 1995, т. 29, No 1. с. 199-210.
36. Калинина Т. И., Макеева И. В., Худяков Ю.Е., Самошин В. В., Смирнова Е.А., Семилетов Ю.А., Павлюченкова Р.П., Кадошников Ю. П., Смирнов В. Д. Гетерологичные эпитопы в центральной части соге-белка вируса гепатита В. - Молекуляр. биология, 1S95, т. 29, No 1, с. 211224.
37. Семилетов Ю. А., Дементьева Е. В., Яшина Т. Л., ФаворовМ. 0., Шибнев В.А. Синтез и антигенная активность пептидов из последовательности белка 0RF3 вируса гепатита Е.- Биоорган, химия, 1995, т. 21, No 2, с. 156-157.
38. Firsova Т.V., Makova N.Z., Semiletov Y.A. The possibilities of using of the synthetic peptides In the diagnostic of HCV infection. - Peptides in Ifflmunology.- Abstracts, Interlaken, Switzerland, 2-5 April 1995, 32.
39. Firsova Т. V., Semiletov Yu. A.. Karpova V. A., Shibnev V. A., Viazov S.0. Identification of a new type of antibody recognation sites by the synthetic peptides containing common sequence motif D-P-x-y-R. - 14th American Peptide Symposium.- Abstracts, Columbus, Ohio, 18-23 June 1995, P748, p. 2-189.
-
Семилетов, Юрий Аркадьевич
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1995
-
ВАК 03.00.03
- Поиск и выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи антиидиотипических антител
- Изучение антигенной структуры альфавирусов при помощи моноклональных антител
- Генноинженерные мутанты белка оболочки РНК-содержащего бактериофага fr
- Изучение сферических частиц, образующихся при термической перестройке вируса табачной мозаики, и области их применения
- Моноклональные антитела в изучении структурных белков патогенных для человека вирусов
