Вирусный гепатит С: новые подходы к изучению патогенеза и разработка средств диагностики и профилактики

Масалова, Ольга Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Вирусный гепатит С: новые подходы к изучению патогенеза и разработка средств диагностики и профилактики
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Вирусный гепатит С: новые подходы к изучению патогенеза и разработка средств диагностики и профилактики"

На правах рукописи

МАСАЛОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ВИРУСНЫЙ ГЕПАТИТ С: НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ПАТОГЕНЕЗА И РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ

03.02.02 - вирусология

4847181

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 9 МАЙ 2011

Москва-2011

4847181

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Кущ Алла Александровна

Официальные оппоненты:

академик РАМН

доктор биологических наук Зверев Виталий Васильевич

профессор

доктор медицинских наук Михайлов Михаил Иванович

профессор

доктор медицинских наук Наровлянский Александр Наумович

профессор

Ведущая организация:

НИИ переливания крови им. A.A. Богданова ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития Российской Федерации

Защита состоится «06» июня 2011 г. в 12 00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.131.01 при ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития Российской Федерации

Автореферат разослан « мая 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Гепатит С по оценкам экспертов ВОЗ и Европейского Союза относится к наиболее важным социально значимым инфекционным заболеваниям человека и является одной из главных причин хронических заболеваний печени. Около 3% человеческой популяции на Земле инфицировано вирусом гепатита С (ВГС) [Albeldawi et al., 2010]. Современные проявления эпидемического процесса при гепатите С характеризуются снижением частоты острых форм этой инфекции, но ростом числа лиц с наличием антител к ВГС в крови, а также увеличением числа микст-инфекций (в том числе сочетание ВГС- и ВИЧ-инфекции); отмечается также изменение возрастного состава больных, структуры путей передачи ВГС, увеличение показателей смертности от хронических гепатитов и цирроза печени [Михайлов М.И. и др., 2007, Шахгильдян И.В. и др., 2008]. Гепатит С характеризуется высокой частотой формирования хронической инфекции (до 70% - 80% острых форм переходят в хронический гепатит) и широким спектром клинических проявлений. Тяжесть заболевания варьирует от бессимптомного носительства до тяжелых форм с повреждением печени, прогрессирующим в цирроз и гепатоцеллюлярную карциному. Кроме того, с хроническим гепатитом С (ХГС) связывают многочисленные внепеченочные проявления, что позволяет рассматривать гепатит С как системное заболевание [Bowen, Walker, 2005, Heller, Rehermann, 2005]. Эффективность комбинированного лечения больных ХГС с помощью пегилированного альфа-интерферона с рибавирином не превышает 50%, к тому же данная терапия сопряжена с серьезными побочными эффектами [Ghany et al., 2009].

Несмотря на успехи в изучении молекулярно-биологических свойств вируса, до сих пор не существует единой концепции патогенеза ВГС-инфекции и ясного понимания механизма повреждающего действия ВГС на клетки печени. По-прежнему, не совсем ясно, какие факторы вируса и хозяина определяют исходы острого гепатита С (ОГС) - реконвалесценцию или формирование хронической инфекции, а также обусловливают прогрессирующее в цирроз течение ХГС [Sumida et al., 2010, Wadhawan et al., 2010]. Возможности изучения структуры ВГС и патогенеза заболевания ограничены сложностями культивирования вируса in vitro и узким кругом восприимчивых к вирусу животных. Большинство исследователей полагает, что ВГС не обладает прямым цитопатогенным действием, и главным фактором хронизации и прогрессирования заболевания является нарушение Т-клеточного ответа, а именно дисбаланс в соотношении Thl и Th2 лимфоцитов и секретируемых ими цитокинов [Albeldawi et al., 2010, Sharma, 2010].

выяснена функциональная роль белков ВГС в формировании хронического гепатита, а также не выявлены маркеры инфекции, ассоциированные с активностью и стадией ХГС. Выяснение структуры и свойств вирусных белков необходимо как для решения теоретических проблем (локализация антигенных и иммуногенных детерминант, определение протективных эпитопов), так и для решения задач практической медицины - создания профилактических средств, терапевтических препаратов и диагностических тест-систем.

Вакцина против гепатита С до настоящего времени не создана. Одна из основных причин - недостаточная изученность защитных механизмов врожденного и адаптивного иммунитета в ходе взаимодействия ВГС и иммунной системы хозяина. Сложность разработки вакцины заключается в высокой гетерогенности ВГС и способности вируса ускользать от иммунного ответа хозяина (escape effect). Имеющиеся данные позволяют заключить, что решающим фактором при элиминации ВГС является ранний, сильный, мультиспецифичный и функционально активный иммунный ответ клеточного звена иммунитета [Albeldawi et al., 2010, Sharma, 2010]. Основным подходом к созданию вакцин против гепатита С в настоящее время является использование индивидуальных рекомбинантных белков, отдельных пептидов или участков генома ВГС в составе ДНК-конструкций [Abdulhaqq et al., 2008, Houghton, Abrignani, 2005, Encke et al., 2007]. Анализ результатов опубликованных работ показал, что ни одна из кандидатных вакцин пока не способна обеспечить полноценный профилактический и терапевтический эффекты против ВГС. Можно констатировать, что, несмотря на определенные успехи, разработка вакцин против гепатита С требует дальнейших усилий и новых решений.

Актуальной проблемой здравоохранения является усовершенствование диагностики гепатита С. Для ограничения распространения ВГС-инфекции особое значение имеет надежное обнаружение ВГС в крови и продуктах крови. Индикация анти-ВГС антител, в основном, решает задачу этиологического диагноза, но не характеризует течение инфекции и не решает задачу прогноза исхода заболевания. По этим причинам важным является развитие методов прямого определения вирусспецифических маркеров - РНК и белков, как в сыворотке крови, так и непосредственно в клетках организма. Обнаружение указанных маркеров ВГС может решить проблему серонегативного «окна», а также дать ответ на вопрос о репликации ВГС и вирусной нагрузке.

Вышеизложенное свидетельствует об актуальности работ, направленных на комплексный анализ роли вирусных факторов (РНК и белков ВГС) и иммунного ответа хозяина (спектра антител к ВГС, иммунокомпетентных клеток, цитокинов и других иммунорегуляторных молекул) в патогенезе гепатита С. Эти знания необходимы для разработки эффективных средств диагностики, профилактики и создания специфических препаратов для лечения гепатита С, что позволит контролировать это широко распространенное заболевание.

Перечисленные нерешенные проблемы в изучении гепатита С определили актуальность настоящей работы, цель и задачи, которые в ней были поставлены.

Цель и задачи исследования

Цель работы - разработать критерии оценки активности гепатита путем комплексного определения РНК и белков ВГС в печени и периферической крови, маркеров функциональной активности иммунной системы у больных острым и хроническим гепатитом С для прогнозирования исходов заболевания и на основании полученных данных разработать вакцинную композицию, обеспечивающую эффективный иммунный ответ против ВГС.

Для достижения цели был поставлен ряд как фундаментальных, так и прикладных задач:

1. Получить панель моноклональных антител к белкам ВГС для изучения антигенной структуры белков и разработки иммунохимических методов выявления белков ВГС;

2. Оценить степень накопления белков ВГС в инфицированных клетках печени и в мононуклеарных клетках периферической крови больных гепатитом С;

3. Исследовать количественное содержание белка нуклеокапсида (core) ВГС в сыворотках крови больных гепатитом С и ВГС-инфицированных лиц;

4. Оценить частоту встречаемости геномных и репликативных форм РНК ВГС в печени и периферической крови больных гепатитом С;

5. Выявить особенности спектра и активности антител к белкам ВГС у пациентов с острым и хроническим гепатитом С;

6. Определить популяционный состав лимфоцитов периферической крови и исследовать содержание растворимых форм дифференцировочных антигенов в сыворотке крови больных с разными формами и стадиями гепатита С;

7. Исследовать концентрацию про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови, а также продукцию цитокинов in vitro клетками периферической крови пациентов с гепатитом С;

8. С помощью комплексного корреляционного анализа сопоставить результаты выявления вирусных маркеров и параметров иммунного ответа с клинико-морфологическими и биохимическими данными больных гепатитом С. Оценить роль вирусных и хозяйских факторов в повреждении печени, в течение и прогнозе гепатита С;

9. Провести иммунизацию мышей рекомбинантными белками ВГС и ДНК-конструкциями, сравнить эффективность иммунного ответа;

10.Дать сравнительную оценку иммуномодулирующего действия адьювантов, усиливающих гуморальный и клеточный иммунные ответы;

11.Выбрать оптимальные антигенные сочетания и адъюванты, создать вакцинную композицию, обеспечивающую эффективный иммунный ответ против ВГС.

Научная новизна

С использованием полученных моноклональных антител (МКА) к белкам ВГС установлена структурная организация 10 антигенных детерминант, не описанных ранее. Впервые установлено, что антигенные детерминанты белков ВГС выявляются в инфицированных клетках печени и мононуклеарных клетках

периферической крови (МКПК) больных гепатитом С с различной частотой. Наиболее часто выявляются пять эпитопов на белках NS4A, NS4B и NS5A, что может быть связано с пространственной доступностью этих детерминант.

С помощью иммунохимических методов, разработанных на основе МКА, получены новые данные о патогенетической роли белков ВГС. Впервые установлено, что у больных ХГС накопление соге-белка в печени и в МКПК прямо коррелирует с выявлением репликативной формы РНК ВГС. Таким образом, соге-белок может служить маркером активной репликации вируса. Частота обнаружения репликативной формы РНК ВГС, а также экспрессия белка NS4A в печени и в МКПК больных ХГС сокращается при тяжелых некрозо-воспалительных процессах в печени, что может свидетельствовать о снижении репликативной активности ВГС при прогрсссировании заболевания. Впервые показано, что гистологическая активность ХГС и повышение уровня ферментов печени прямо связана с наличием как геномной РНК ВГС, так и белков ВГС в ткани печени, РНК и соге-белка ВГС в сыворотках крови и белков ВГС в МКПК. При ХГС впервые установлена прямая зависимость между экспрессией белка NS5A в печени, выработкой антител к этому белку, увеличением гистологической активности и развитием фиброза, что позволяет рассматривать NS5A как один из маркеров степени повреждения ткани печени.

Анализ белков ВГС в печени больных гепатитом С впервые позволил получить прямые доказательства более высокой транскрипционной активности ВГС при ОГС по сравнению с ХГС. При ОГС выявлена прямая зависимость между накоплением белков core, NS3 и NS5A в гепатоцитах и некрозо-воспалительными изменениями ткани печени. Интенсивная экспрессия белков NS4A и NS3 в печени в период около 1 месяца после манифестации ОГС является предпосылкой спонтанной реконвалесценции.

Впервые установлено, что накопление белков ВГС в МКПК ассоциируется с иммунными расстройствами - сокращением доли мононуклеарных клеток и лимфоцитов в популяции лейкоцитов. При ОГС уменьшение количества СШ6+-лимфоцитов связано с более активной экспрессией белков NS3 и NS5A ВГС в печени (г= -0,7, р<0,05), а С04+-лимфоцитов - с повышенным содержанием sFas (г= -0,52; р<0,05) и sHLA-DR (г= -0,56; р<0,05) в сыворотке крови.

Впервые установлена преимущественная циркуляция ВГС у пациентов с ОГС в виде безоболочечных нуклеокапсидов, а у больных с циррозом печени -в виде иммунных комплексов. Средняя концентрация соге-белка в сыворотках крови больных ХГС достоверно выше, чем у пациентов с ОГС (р<0,05).

Впервые показано, что достоверный (р<0,05) прогноз реконвалесценции может быть сделан на основе комплекса следующих иммунологических и вирусологических признаков: в течение 1 месяца от начала клинических симптомов ОГС - отсутствие антител к NS5A, низкая концентрация (<20 УЕ/мл) растворимой формы дифференцировочного антигена sCD38 и низкая концентрация (<40 пг/мл) соге-белка в сыворотке крови; в течение 3-4 месяцев - сочетание отсутствия РНК ВГС в сыворотке крови и нормализация уровня аланинаминотрансферазы (AJIT).

При помощи технологии фагового дисплея получены фаговые клоны с пептидными вставками, имитирующими 11 антигенных детерминант белков core, NS3, NS4B и NS5A ВГС. Впервые показано, что антигенные детерминанты белков ВГС, экспонированные на поверхности фаговых частиц, являются более эффективными стимуляторами клеточного иммунного ответа по сравнению с олигопептидами со сходной аминокислотной последовательностью.

Впервые установлено, что ковалентные конъюгаты рекомбинантных белков ВГС с петидогликаном растительного происхождения иммуномодулятором иммуномаксом наиболее эффективно стимулируют гуморальный и клеточный иммунные ответы при введении низких доз антигена (около 1 мкг/мышь). Иммуномакс оказался также эффективным адъювантом при иммунизации мышей ДНК-плазмидой, кодирующей белки ВГС. Впервые показано, что вакцинная композиция, включающая специфические компоненты ВГС (ДНК-плазмиду и рекомбинантные белки) и иммуномакс в качестве адъюванта стимулирует интенсивный клеточный и гуморальный иммунный ответ к широкому спектру эпитопов ВГС.

Практическая значимость

Полученные МКА могут быть использованы в разных областях вирусологии и биотехнологии: для контроля качества и стандартизации рекомбинантных белков при производстве диагностических тест-систем, предназначенных для выявления антител к белкам ВГС в сыворотках крови; как аффинные сорбенты при очистке рекомбинантных белков; для разработки более чувствительных вариантов ИФА-диагностикумов ("capture''-ИФА и варианты, основанные на конкуренции); для анализа экспрессии белков ВГС в эукариотических клетках при создании новых векторных систем и ДНК-вакцин. Информация о детальном строении детерминант ВГС, полученная с помощью МКА, может применяться для усовершенствования диагностики гепатита С, для изучения влияния аминокислотных замен в белках на их антигенные свойства, а также для изучения иммунного ответа у пациентов, инфицированных разными генотипами ВГС.

Разработан чувствительный иммуноферментный метод выявления соге-белка в сыворотках как бессимптомных ВГС-инфицированных доноров, так и больных ОГС и ХГС. Получен патент на изобретение № 2329303 от 20.07.2008 г. Показано, что для обнаружения ВГС в крови пациентов с ОГС достаточно выявлять свободно циркулирующие вирионы, тогда как при ХГС следует включать анализ ВГС в составе иммунных комплексов. Преимущества количественного определения белка могут быть полезны для определения вирусной нагрузки, в том числе при оценке эффективности терапии. Низкая концентрация (<40 пг/мл) соге-белка в сыворотке в ранние сроки (около 1 месяца) после манифестации ОГС является предиктором реконвалесценции. Полученные результаты являются основой для разработки ИФА тест-системы для диагностики гепатита С, в том числе и его ранних стадий. Внедрение метода в практику позволит увеличить надежность диагностики гепатита С и вирусную безопасность гемотрансфузий.

Разработан метод выявления белков ВГС в инфицированных клетках (печень, клетки крови, трансфицированные ДНК-плазмидами клетки) in situ. Выбраны иммунные реагенты (смесь МКА к неструктурным белкам NS4 и NS5A), позволяющие выявлять натуральные белки ВГС с наибольшей чувствительностью. Показано, что обнаружение белков ВГС в зараженных клетках увеличивает эффективность диагностики. Метод полезен также для исследования фундаментальных вопросов, связанных с механизмами взаимодействия хозяин-вирус на клеточном уровне. Иммунные реагенты на основе МКА к ВГС, меченных ФИТЦ, пригодны для определения внутриклеточной экспрессии белков ВГС и анализа клеток методами проточной цитофлюориметрии и прямой иммунофлюоресценции. Конъюгаты МКА с пероксидазой хрена являются компонентами для разработки сэндвич-ИФА на антигены ВГС. На основе МКА к белкам core и NS4 разработаны варианты сэндвич-ИФА для выявления белков ВГС в лизатах клеток и тканей. С помощью данного метода обнаружены белки ВГС в лизатах биоптатов печени пациентов с гепатитом неуточненной этиологии. Методы могут быть полезны при исследовании замороженных клеток крови, биопсийных и аутопсийных материалов, а также для анализа экспрессии белков ВГС в трансфицированных клетках.

Выявлены закономерности, которые являются предикторами реконвалесценции: отсутствие антител к белку NS5A; низкая концентрация sCD38 и соге-белка в ранние сроки после манифестации заболевания (около 1 месяца), сочетание отсутствия РНК ВГС в сыворотке крови и нормального уровня трансиаминаз в период 3-4 мес. от начала заболевания. Включение этих параметров в обследование пациентов позволит повысить точность прогноза исхода ОГС и своевременно начать противовирусную терапию.

Выбраны адъюванты для вакцинной композиции против гепатита С: иммуномакс в виде ковалентного конъюгата с рекомбинантными белками ВГС, иммуномакс или ген GM-CSF - для ДНК-плазмиды. Эти вещества наиболее эффективно стимулируют гуморальный и клеточный иммунные ответы к широкому спектру эпитопов ВГС. Определен дизайн экспериментальной кандидатной вакцины против гепатита С. Принцип, положенный в основу создания описанного мультиэпитопного вакцинного препарата, открывает перспективы для разработки на его основе вакцин нового поколения с использованием биотехнологических конструкций (белков и ДНК), содержащих аминокислотные и нуклеотидные последовательности структурных и неструктурных белков ВГС, в сочетании с иммуномаксом.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Получена панель из 26 МКА к 5 белкам ВГС, с помощью которых проведено антигенное картирование белков core, NS3, NS4A, NS4B и NS5A.

2. На основе МКА разработано три группы иммунохимических методов для выявления белков ВГС в материалах (сыворотка/плазма крови, клетки периферической крови и печени) от больных гепатитом С и ВГС-инфицированных лиц.

3. Антигенные детерминанты белков ВГС выявляются в инфицированных клетках с различной частотой, что может быть связано с пространственной доступностью этих детерминант.

4. Частота обнаружения белков ВГС в печени больных ОГС статистически значимо выше, чем больных ХГС, что свидетельствуют о более высокой активности репликации ВГС при ОГС по сравнению с ХГС.

5. Выявление соге-белка в сыворотке крови прямо коррелирует с гистологической и биохимической активностью, а также стадией ХГС.

6. Белки ВГС экспрессируются в мононуклеарах периферической крови большинства больных ХГС и чаще обнаруживаются в моноцитах.

7. Наличие и высокая активность антител к неструктурному белку NS5A ассоциированы с более тяжелым поражением печени при ХГС, а также с неблагоприятным прогнозом исхода ОГС.

8. У больных гепатитом С выявлены изменения функциональной активности иммунной системы: повышение концентрации растворимых форм дифференцировочных антигенов, усиление экспрессии рецептора Fas-зависимого апоптоза на клетках крови, уменьшение доли Т-хелперов и NK-клеток, снижение иммунорегуляторного индекса, дисбаланс продукции цитокинов с преобладанием ТЬ2-цитокинов.

9. Мультикомпонентный препарат, созданный на основе биотехнологических продуктов - рекомбинантных белков ВГС,-ДНК-конструкций, содержащих гены ВГС, в составе эукариотических векторов и иммуномодулятора иммуномакса, индуцирует наиболее эффективный клеточный и гуморальный ответ, направленный к широкому спектру эпитопов ВГС. -Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на IX и X Международных симпозиумах по вирусным гепатитам и болезням печени (Италия, Рим, 1996, США, Атланта, 2000), на X Международном конгрессе по вирусологии (Израиль, Иерусалим, 1996), на IV и XI Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (РФ, Москва, 1997, 2004), на II, III, IV, V, VI и VIII Российских научно-практических конференциях «Гепатиты В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики» и «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (РФ, Москва, 1997, 1999, 2001, 2003, 2005, 2009), на Научно-практической конференции «Гепатит С (Российский консенсус)» (РФ, Москва, 2000), на XXV и XXVI научных сессиях ЦНИИ гастроэнтерологии (РФ, Москва, 1998, 1999), на 3-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (РФ, Москва, 2000), на I и II конгрессах Европейского общества вирусологов (Великобритания, Глазго, 2000, Испания, Мадрид, 2004), на 6-ой, 9-ой и 14-ой Российских конференциях «Гепатология сегодня» (РФ, Москва, 2001, 2004, 2009), на Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (РФ, Москва, 2002), на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (РФ, Москва, 2002), на 8-ой Российской гастроэнтерологической неделе (РФ, Москва, 2002), на VI Российском съезде врачей-инфекционистов (РФ, С.-Петербург, 2003), на Международном Междисциплинарном Симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Украина, Судак, 2006), на

итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий за 2007, 2008 и 2009 г.г. в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (РФ, Москва, 2007, 2008, 2009), на конференции по ДНК-вакцинам (США, Лас-Вегас, 2008), на 2-ом Европейском конгрессе по иммунологии (Германия, Берлин, 2009).

В окончательном виде диссертация апробирована на заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России 10 февраля 2011 г. (протокол № 118 от 10.02.2011).

Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 76 научных публикациях: в 24 статьях (из них опубликованных в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК, - 21 статья и 1 патент) и в 52 тезисах научных конференций.

Работа выполнялась в соответствии с планом НИР ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России в рамках тем: «Особенности эпидемиологии и патогенеза гепатита С, совершенствование методов диагностики, лечения и профилактики ВГС-инфекции» (госрегистрация № 0120.0 603540) и «Фундаментальные аспекты создания вакцин нового поколения для профилактики гепатита В, С и ВИЧ, разработка новых методических подходов для ранней диагностики других вирусных инфекций» (госрегистрация № 0120.0 603546).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 336 страницах, содержит 57 таблиц и 49 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения и выводов. Список литературы включает 435 источников, в том числе 48 - на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Плазмы доноров. Сыворотки и плазмы крови (п=225) получены из НИИ переливания крови ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России от добровольных доноров, среди которых были анти-ВГС позитивные (п=85) и анти-ВГС негативные образцы (п=140). Пациенты. В работе использована венозная кровь и биопсии печени 432 пациентов с ОГС (п=79), ХГС (п=313), хроническими заболеваниями печени невирусной этиологии (п=25) и гепатитом неуточненной этиологии (п=15). Материалы от больных и клиническая характеристика предоставлены д.м.н. Блохиной Н.П. и к.м.н. Шкурко Т.В. (Консультативное гепатологическое специализированное отделение при Инфекционной клинической больнице №1 г. Москвы - ИКБ №1), д.м.н. Знойко О.О. и д.м.н. Климовой Е.А. (ИКБ №1, Московский государственный медико-стоматологический университет), к.м.н. ГГкачевым В.Д. I (ЦНИИ гастроэнтерологии Департамента Здравоохранения г. Москвы). Диагноз ОГС и ХГС ставился на основании общепринятых эпидемиологических и клинико-лабораторных данных, а также исключения других этиологических факторов. Исход ОГС учитывали в среднем через

13,6±1,7 месяцев после манифестации ОГС в 1-3 временных точках. Критериями предполагаемой реконвалесценции считали нормализацию уровня ферментов печени и отсутствие РНК в сыворотке крови. Хронизацию заболевания констатировали при выявлении РНК и/или повышении активности трансаминаз.

Морфологический анализ ткани печени. Образцы ткани получали методом чрескожной пункционной биопсии печени (ПБП) иглой типа Menghini. Оценка структурных изменений печеночной ткани проводилась полуколичественным методом с использованием индекса Knodell et al. [1981] и шкалы METAVIR [Bedossa et al„ 1996]. Степень активности гепатита оценивали по индексу гистологической активности (ИГА) и уровню АЛТ, стадию заболевания - по индексу фиброза (ИФ). Морфологический анализ срезов печени выполнен Келли Е.И. (ИКБ №1) иI Ткачевым В.Д. I (ЦНИИ гастроэнтерологии). Лабораторные животные. Для иммунизации животных и наработки асцитных жидкостей использовали самок мышеи линии BALB/c (гаплотип H-2d), DBA/2J (H-2d), С57В1/6 (Н-2Ь) и гибридов 1 поколения (Fl) BALB/c-DBA в возрасте 6-8 недель.

Рекомбинантные белки. Очищенные рекомбинантные белки, имитирующие иммунодоминантные регионы белков ВГС core, NS3, NS4 и NS5A (табл. 1), экспрессированные в прокариотической системе в комплексе с белками слияния р -галактозидазой и глутатион-Б-трансферазой (GST), любезно предоставлены д.м.н. Бурковым А.Н. и д.б.н. Улановой Т.И. (НПО Диагностические системы, г. Нижний Новгород).

Пептиды получены из Института биоорганической химии им. акад.. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Из состава белка core использовано 16 пептидов, NS3 - 7, NS4 - 29, NS5A - 8 пептидов.

ДНК-конструкции для эукариотической экспрессии белков ВГС предоставлены для совместных исследований к.б.н. Мохоновым В.В.,

Грабовецким В.В. и д.б.н. Забережным А.Д. (ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России). В качестве эукариотического вектора для создания рекомбинантных плазмид использовали коммерческую плазмиду pcDNA3.1(+) (Invitrogen, США), обеспечивающую транскрипцию целевого гена под контролем CMV-промотора. Трансфекцию перевиваемых клеточных линий почек зеленой мартышки (Vero) и гепатокарциномы человека (Huh7) плазмидами проводили с использованием поликатионного липосомального реагента метафектина (Metafectene Pro, Biontex, Германия), Унифектина 56 (Унифект Групп, РФ) или липофектамина-2000 (Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями фирм.

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела (МКА) к белкам ВГС, получали стандартным методом [Köhler, Milshtein, 1975] путем слияния спленоцитов мышей, иммунизированных рекомбинантными белками ВГС, с клетками миеломы Sp2/0. МКА заданной специфичности отбирали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Иммунноглобулины (Ig) очищали из асцитных жидкостей мышей с помощью аффинной хроматографии.

Конъюгацию МКА с пероксидазой хрена (ПХ) и ФИТЦ выполняли с помощью стандартных методов.

Картирование эпитопов белков ВГС с помощью технологии фагового дисплея. Использовали две фаговые библиотеки случайных эпитопов, сконструированные в лаборатории J.M. Gershoni (Tel Aviv University, Israel) на базе вектора Fthl [Enshell-Seijffers et.al., 2001] и предоставленные к.б.н. Денисовой Г.Ф. Нуклеотидные последовательности, кодирующие двенадцатичленные пептиды, фланкированные цистеиновыми остатками в одной библиотеке (pVIII/CXnC) и семичленные пептиды (pVIII/X7) - в другой, были встроены в ген поверхностного белка фага fd - pVIII. Получение фаговых клонов, реагирующих с МКА, включающее этапы аффинной селекции, трансдукцию клеток E.coli фагами, иммуноскрининг, выделение одноцепочечной фаговой ДНК и секвенирование, проводили по описанной ранее схеме [Enshell-Seijffers et.al., 2001]. По нуклеотидной последовательности расшифровывали аминокислотную последовательность пептидной фаговой вставки. Для поиска мотивов, гомологичных фаговому пептиду, использовали сравнительный анализ пептидных вставок и аминокислотных последовательностей белков ВГС при помощи метода, разработанного Денисовым Д.А. [Enshell-Seijffers et.al., 2003], и алгоритма ClustalW [Jolivet-Reynaud et al„ 2004].

Подготовка сывороток для детекции соге-белка. Сыворотки/плазмы в объёме 1-4,5 мл «осветляли» центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 мин, затем добавляли полиэтиленгликоль 4000 до конечной концентрации 4% и перемешивали. Осадок формировался в течение ночи или не менее 3 часов при 4°С, затем смесь центрифугировали при 12000 об/мин 30 минут при 4°С. Осадок ресуспендировали в PBS до объёма, составляющего 1/15 часть исходного объема сыворотки, и анализировали в сэндвич-ИФА.

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК)

проводили в градиенте плотности фиколл-пак (Pharmacia, Швеция). Цитологические препараты готовили на стеклах путем центрифугирования на цитоцентрифуге. Спленоциты из суспензии селезенки мышей получали аналогичным способом.

Иммуноблот и иммунодот выполняли стандартными методами. Непрямой вариант твердофазного ИФА проводили стандартным способом в микропанелях (NUNC, Дания), концентрации антигенов при сорбции составляли: рекомбинантные белки ВГС - 0,5-2 мкг/мл, пептиды - 5-10 мкг/мл, лизат клеток E.coli - 10 мкг/мл, GST и ß-галактозидаза - 1 мкг/мл, фаговые частицы - Ю8-Ю10/мл. Сыворотки или МКА вносили в серийных разведениях. Вторичные антитела - антивидовые конъюгаты, меченные ПХ (Сорбент, Россия, Jackson Immunoresearch Laboratories, США), субстрат тетраметилбензидин гидрохлорид (ТМБ, US Biomedical, США). Сэндвич-варианты ИФА, разработанные с использованием МКА, применяли для выявления антигенов ВГС: рекомбинантных белков, соге-белка ВГС в сыворотках крови, белков ВГС в лизатах клеток и ткани печени. Индивидуальные МКА или смесь МКА сорбировали в лунки 96-луночных

панелей NUNC Maxisorp (Дания) в концентрации 5 мкг/мл в растворе PBS, отмывали и блокировали неспецифические участки связывания 5% обезжиренным сухим молоком на PBS в течение часа при 37°С. Затем добавляли материалы, содержащие ВГС, и инкубировали 2 ч при 37°С при постоянном встряхивании. После отмывки добавляли конъюгаты - МКА, меченные ПХ, на 1 ч при 37°С, затем - ТМБ. Пробы считали положительными, если оптическая плотность (ОП) превышала критическую. Последнюю вычисляли, как среднюю ОП отрицательных контролен плюс две величины стандартного отклонения (SD).

Конкурентный ИФА использовали для сравнения антигенной специфичности МКА. В лунки микропанелей, сенсибилизированных рекомбииантными белками, вносили очищенные МКА-конкуренты в серийных разведениях, добавляли коныогированные с ПХ МКА в разведениях, позволяющих получить ОП в пределах 1,0-1,5 при взаимодействии с рекомбииантными белками в отсутствии конкурирующих МКА, инкубировали 1 ч при 37°С, затем добавляли ТМБ. Результаты представляли как степень ингибирования (в %) связывания конъюгатов МКА с соответствующим белком в присутствии немеченных МКА. Аналогичная методика использовалась при изучении конкуренции за связывание с рекомбинантными белками между антителами в сыворотках ВГС-инфицированных лиц и конъюгированными МКА.

Иммуногистохимическое окрашивание in situ выполняли непрямым иммунопероксидазньш методом (ИПО). После блокирования эндогенной пероксидазы и неспецифических участков связывания на препараты (криостатные срезы печени, цитологические препараты МКПК, трансфицированные клетки) наносили очищенные МКА (50-100 мкг/мл);тюсле инкубации с которыми - антимышиный ПХ конъюгат (Jackson Immunoreserch Laboratories, США, DAKO, Дания). Реакцию проявляли раствором субстрата 3,3'-диаминобензидина (ДАБ, Sigma, США). Контрастирование ядер проводилось гематоксилином Карачи. Результаты ИПО оценивали с помощью светового микроскопа Opton (Германия). Количество окрашенных клеток представляли в процентах или в баллах.

Окрашивание клеток авидин-биотиновым комплексом проводили с использованием набора LSAB 2 Kit (DAKO, Дания) в соответствии с рекомендациями фирмы, концентрация МКА составляла 10 мкг/мл. Внутриклеточное окрашивание белков ВГС методом проточной цитофлюорометрии. Цельную кровь для удаления эритроцитов, фиксации и пермеабилизации лейкоцитов обрабатывали реактивами Fix&Perm GAS-003 (Caltag, США), клетки промывали и инкубировали с МКА к белкам ВГС, меченными ФИТЦ, в конечной концентрации 20 мкг/мл. Анализ проводили на проточном цитофлюориметре FACS CALIBUR (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения Cell Quest. Идентификацию клеток крови проводили по параметрам светорассеяния. Наличие белков ВГС внутри клеток оценивали по интенсивности флюоресценции. Работа проводилась совместно с к.б.н. Пичугиным A.B. и д.м.н., проф. Атауллахановым Р.И. (ФГБУ «ГНЦ РФ «Институт иммунологии» ФМБА России).

Детекция РНК ВГС. Определение геномной РНК ВГС (плюс-цепей) в сыворотках, лизатах МКПК и печени пациентов проводили методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров к 5'-нетранслируемому региону ВГС [Okamoto et al.,1990]. Репликативную (минус-цепь) РНК ВГС выявляли с использованием праймеров в соответствии с Lanford et al. [1995]. Генотипирование ВГС проводили по методу Ohno et al. [1997]. Генодиагностика проводилась совместно с к.б.н. Самохваловым Е.И. и к.б.н. Альховским C.B. (ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России). Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) проводили стандартным методом в 96-луночных панелях. Для стимуляции клеток in vitro использовали пептиды в конечной концентрации 5 мкг/мл, рекомбинантные белки - 0,5-1 мкг/мл, фаги - 5 мкг/мл, митоген конканавалин А (КонА) - 5 мкг/мл. Образование бластов учитывали либо по включению в ДНК [3Н]-тимидина (ß-счетчик Beckman, США), либо визуально по изменению морфологии клеток. Результаты РБТЛ выражали как индекс стимуляции пролиферации (ИСП). Определение содержания популяций лимфоцитов. Иммунологический статус пациентов характеризовали с помощью МКА (Сорбент, Москва), направленных к поверхностным рецепторам лимфоцитов различных субпопуляций, меченных ФИТЦ (CD4+, CD8+, CD 16+, CD20+, CD95+), с помощью метода прямой флюоресценции в соответствии с рекомендациями фирмы. Содержание лимфоцитов мышей, экспрессирующих маркеры Т-клеток (CD4+ и CD8+) и B-клеток (CD19+), относительно всех СБ45+-позитивных клеток (лейкоциты), оценивали с помощью ФИТЦ- и фикоэритрин - меченных антител методом трехцветной проточной цитометрии (BD Biosciences, США). Анализ проводили на проточном цитофлюориметре FACS CALIBUR (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения Cell Quest совместно с к.б.н. Пичугиным A.B. и д.м.н., проф. Атауллахановым Р.И. (ФГБУ «ГНЦ РФ «Институт иммунологии» ФМБА России).

ELISpot. Определение количества клеток, секретирующих IFN-y, проводили с помощью тест-системы «ELISpot mouse IFN-y» (R&D systems, США) в соответствии с инструкцией фирмы.

Определение содержания цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, TNF-a

в сыворотках пациентов и в культуральных супернатантах проводили методом ИФА с помощью тест-систем фирм Вектор-Бест (Новосибирск) и Протеиновый контур (С.-Петербург). Измерение концентрации цитокинов в супернатантах, полученных при культивировании стимулированных спленоцитов мышей, проводили методом ИФА с использованием тест-систем для определения IFN-y, IL-2 - Mabtech (Швеция) и TNF-a - BioLegend (США). Уровень растворимых форм дифференцировочных антигенов (sFas, sCD38, sHLA-DR и sHLA-I) определяли в сэндвич-ИФА с использованием МКА серии ИКО и поликлональных антител против мембранных антигенов человека. Данные тест-системы разработаны и любезно предоставлены д.б.н., проф. В.В. Новиковым (Нижегородский Государственный Университет им. Н.И. Лобачевского). Использовали также тест-систему для определения sFas «Human CD95 ELISA kit» (Abeam, США).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ «Биостатистика» (версия 4.03) и «Statistica 6». Использовались следующие параметрические и непараметрические критерии: t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна-Уитни, коэффициенты линейной регрессии Пирсона и ранговой корреляции Спирмена, критерий Пирсону ( -квадрат) и точный тест Фишера. Сравнение двух зависимых (связанных) выборок проводили с помощью критерия Уилкоксона или метода знаков. Сравнение нескольких независимых выборок выполняли с помощью рангового двухфакторного анализа Фридмана (Friedman ANOVA). Уровень статистической значимости определяли при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ЭПИТОПНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ МКА

В результате серии опытов по слиянию спленоцитов мышей, иммунизированных рекомбинантными белками, с клетками миеломы отобрано 26 гибридом, стабильно секретирующих МКА к белкам ВГС core, NS3, NS4 и NS5A (табл. 1). Большинство МКА относились к субклассу Gl, 2 МКА - к субклассу G2b и 1 МКА - к классу М. В ИФА МКА с различной активностью взаимодействовали с соответствующими рекомбинантными белками - титры от 10"4 до 9x10"7.

Эпитопное картирование антигенных детерминант, реагирующих с полученными МКА, проводилось с использованием пяти методов: пептидного картирования (использовано более 60 пептидов), взаимодействия с антигенами разного состава в 8 коммерческих тест-системах на основе иммуноблота и ИФА, реактогенности с денатурированными белками, конкурентного анализа, а также с помощью пептидной фаговой библиотеки.

Восемь МКА получены к белку core. Конкурентный анализ показал, что 6 МКА распознают индивидуальные неперекрывающиеся эпитопы, МКА 1F9 и 6D1 - частично перекрывающиеся эпитопы в центральной части молекулы. С пептидами реагировали только 2 анти-core МКА - 1F9 и 6D1. Установлена специфичность связывания МКА 1F9 с пептидом 76-90 а.о., полученные методом фагового дисплея результаты позволили более точно определить этот эпитоп - 81-85 а.о. (табл. 1). Эта последовательность полностью консервативна для генотипов 1, 2 и 3. Нами впервые описаны МКА (1F9 и 6D1), взаимодействующие с центральной частью соге-белка, которая содержит антигенный участок, активно реагирующий с сыворотками больных гепатитом С [Jolivet-Reynaud et al., 1998].

Антигенную специфичность четырех из шести анти-core МКА, не реагировавших с пептидами (МКА 1А12, 27, D4, 4G5), исследована методом фагового дисплея. Прямой гомологии между мотивами пептидных вставок полученных фагов, опознаваемых МКА, и соге-белком, не обнаружено. Логично предположить, что эти а.о. удалены друг от друга в полипептидной цепи, но сближены в пространстве и входят в состав конформационных эпитопов. В связи с тем, что полная третичная структура соге-белка ВГС в

настоящее время не установлена, можно предположить локализацию только отдельных мотивов этих эпитопов (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика моноклональных антител к белкам ВГС

Реком бинант IIUN белок МКА Изо тип Ig Титр в ИФА Результаты картирования эпитопов (локализация, последовательность а.о.) Эпи топ **

гСоге 1-90 а.о. 1F9 * Gl вхЮ"6 (81)YPWPL(85) Л

6D1 Gl 10s (71)PEGRTWAQPGYPWPLYGNEG<90) Л

1А12 * Gl 10" (36)LLP(38) и VRGAPPD К

гСоге 1-150 а.о. 27 * Gl 5x10"6 74-99 (часть эпитопа) - (74)RWWL(V,I)SGD к

37 Gl 10"5 1-80 к

D4 * Gl 10"6 (56)SQPR(59), (71)PxGR(74) и (84)PLYxN(88) к

G7 G2b lff4 80-150 к

4G5 * Gl 10-' QSPSRLxD и KQxKExxxE к

rNS3 13561459 а.о. 2G12 Gl 10° 1356 -1459 к

2Н4 * Gl 10-' 1363-1449: (1363)NI(V)EE(D)(1366) и KE(D)RE(D) к

5В2 Gl 10"5 1356 -1459 к

5G2 Gl 10"' 1356 -1459 к

6Е9 Gl 106 1356 -1459 к

4Н8 Gl 10- 1356-1459 к

4G7 M 10-' 1356-1459 к

rNS4 16771756 а.о. 3F11 Gl 5xl0"7 (1700)AVLYQEFD(1707) л

3F12 Gl 9xl0'7 (1700)AVLYQEFD(1707) л

1D11 * G2b 5xl0"6 (1713)SHLPY(1717) л

1D3 Gl ю-4 (1711)EASHLPYIEQGMQLAEQFKQKA(1732) л

6В11 * Gl 106 (1748)PVVESKW(1754) к

С1 Gl 10-b 1689-1738 к

1-NS5A 21932300 а.о. 2С9 * Gl 10* (2264)DEREVSV(2270) к

3F4 * Gl 10"6 (2223)DADLIEANL(2231) л

1С5 * Gl 10'6 (2223)DADLIEAN(2230) и DT(S)L к

6D12 Gl 5xl0'6 2193-2212 к

5А9 Gl lO'6 2193-2212 к

Примечания: * эпитопы, картированные с помощью фагового дисплея; ** природа эпитопа - линейный (Л) или конформационно-зависимый (К)

По характеру конкуренции в ИФА и по способности взаимодействовать с N83 из различных коммерческих наборов 7 МКА к N83 можно условно разделить на 5 групп: 2Ы2-2Ш, 5В2-5С2, 6Е9, 4Н8, 467 (табл. 1). Активность взаимодействия пяти клонов с денатурированными препаратами г^З резко падала или полностью отсутствовала, что свидетельствует о чувствительности большинства МКА к целостности конформационной структуры белка. Реакция двух клонов (2012 и 2Н4) с гЫБЗ оказалась более устойчивой к денатурации, сохраняя до 70% активности. Однако эпитоп белка N83, опознаваемый МКА 2Н4, также оказался конформационно-зависимым. Его мотив

(1363)NI(V)EE(D)(1366) является линейной частью эпитопа 2Н4. Основываясь на данных по трехмерной модели хеликазного домена белка NS3 (Protein Data Bank, код 1A1V), можно предположить что а.о., участвующие в образовании второго мотива, располагаются в составе полипротеина В ГС в следующих позициях: К1378 или 1386, Е1372, R1389, D1447 или 1449. Мотив NIEE и а.о. мотива KERE сближены друг с другом в составе третичной структуры хеликазного домена NS3 (рис. 1 А).

1 2

N335 - 1361

Е337 1363

Е338 1364

К352 1378

Е346 1372

Е357 1383

К360 1386

R363 1389

D421 1447

D423 1449

n335 л

i e337-33s d<123 d421 -

R D e V

Рисунок 1. Конформационная структура антигенных детерминант 2Н4, 6В11 и 2С9 белков NS3, NS4B и NS5A

A. Локализация а.о., образующих эпитоп 2Н4, на модели третичной структуры хеликазного домена белка NS3. Слева - модель третичной структуры хеликазного домена NS3; справа - область локализации эпитопа 2Н4 на молекуле хеликазного домена; посередине - 1) положение а.о. в составе хеликазного домена; 2) положение а.о. в составе полипротеина. Нумерация а.о. приведена согласно Protein Data Bank 1A1V.

Б. Предположительная вторичная структура участка белка NS4B в области локализации антигенной детерминанты 6В11.

B. Предположительная вторичная структура участка белка NS5A в области локализации антигенной детерминанты 2С9.

Активность взаимодействия шести МКА с rNS4, с синтетическими пептидами и с рекомбинантными белками из коммерческих наборов в ИФА и в иммуноблоте различалась, при этом МКА 3F11 и 3F12 были активны во всех изученных тест-системах. Эпитопное картирование 6 МКА к NS4 с помощью пептидов, а также конкурентный ИФА показали, что они опознают 5 антигенных детерминант. МКА 3F11 и 3F12 направлены к одному общему линейному эпитопу на С-конце белка NS4A (1707-1707 а.о.), МКА 1D11 и 1D3 -к двум различным линейным эпитопам на N-конце белка NS4B (1711-1732 а.о.). Линейный характер эпитопа для МКА 1D11 подтвердился и при картировании с помощью фагов, но локализацию детерминанты удалось сузить до участка 1713-1717 а.о. (табл. 1). МКА 6В11 и С1 не взаимодействовали с короткими пептидами и были чувствительны к денатурации антигена. В фаговом дисплее показано, что конформация эпитопа, опознаваемого МКА 6В11, определяется вторичной структурой белка NS4B. С помощью метода Гарньер-Робсон предсказания вторичной структуры белка показано, что этот участок белка NS4B образует а-спираль и а.о. PV и KW сближены друг с другом в составе ее витков (рис. 1 Б), что указывает на зависимость формирования эпитопа от вторичной структуры белка. Установлено, что эпитопы МКА 1D11 и 1D3 на участке 1711-1732 а.о. NS4B специфичны для генотипа 1 ВГС, эпитоп 1748-1754 а.о. (МКА 6В11) более консервативен, тогда как эпитоп 1707-1707 а.о. (МКА 3F11 и 3F12) оказался полностью консервативным для всех изученных генотипов (1,2 и 3).

По результатам реципрокного конкурентного анализа и взаимодействия с рекомбинантными белками МКА к NS5A можно условно разделить на 3 группы: 2С9, 3F4-1C5 и 6D12-5A9. МКА 2С9 чувствительны к конформации белка. Однако при картировании методом фагового дисплея обнаружено, что мотив детерминанты непрерывный (табл. 1). Согласно методу Гарньер-Робсон показано, что участок белка NS5A 2260-2276, на котором локализуется данный эпитоп, образует вторичную структуру типах -спирали (рис. 1 В). Эпитоп 3F4 2223-2231 а.о. имеет линейный характер. Эта последовательность полностью консервативна в белках NS5A разных генотипов. В отличие от 3F4, МКА 1С5 чувствительны к денатурации антигена, хотя и опознают сходный мотив на белке NS5A. Детерминанта 1С5 состоит из линейного мотива (2223)DADLIEAN(2230) и из мотива DT(S)L, локализация которого неизвестна в связи с отсутствием модели третичной структуры белка NS5A. Таким образом, детерминанты, опознаваемые данными МКА, имеют различное строение, частично перекрываясь.

Проведение конкурентного анализа MICA с антителами в сыворотках больных гепатитом С за связывание с рекомбинантными белками ВГС показало, что все МКА конкурировали с ними, но с разной эффективностью. Набор эпитопов, с которыми взаимодействовали эти антитела, значительно отличался у разных пациентов. Этот результат имеет практическое значение, так как указывает на один из путей совершенствования лабораторной диагностики гепатита С за счет включения в состав тест-систем максимального

спектра антигенных детерминант ВГС, способных индуцировать иммунный ответ.

Таким образом, полученная панель из 26 МКА, направленных к 22 линейным и конформационным эпитопам пяти белков ВГС, является наиболее представительной из известных в настоящее время. С помощью МКА картированы новые иммунодоминантные эпитопы в составе вирусных белков. Полученные МКА могут быть использованы в разных областях вирусологии и биотехнологии, а также для изучения фундаментальных проблем иммунопатогенеза гепатита С.

2. ВЫЯВЛЕНИЕ ВГС В МАТЕРИАЛАХ ОТ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С

Многие проблемы диагностики гепатита С, особенно ранних стадий, остаются нерешенными. В настоящее время диагностика основывается на выявлении антител к вирусным белкам. Однако установлено, что вирус-специфические антитела не выявляются на ранних стадиях инфицирования вирусом (фаза «окна» продолжительностью до нескольких месяцев) и у части хронических больных при иммунодефицитных состояниях. Кроме того, наличие антител к ВГС не позволяет судить о стадии и активности гепатита [Chen, Morgan, 2006, Pawlotsky et al., 2003]. Для надежной диагностики гепатита С и мониторинга подтвержденного гепатита С требуется определение прямых маркеров ВГС - РНК ВГС и вирусспецифических белков. Ко времени начала наших исследований коммерческие тест-системы для выявления белков ВГС отсутствовали, метод ПЦР в реальном времени также еще не применялся. Для решения фундаментальных и практических задач, поставленных в работе, были разработаны две группы методов на основе МКА: сэндвич-варианты ИФА для детекции вирусных антигенов в биологических жидкостях и в лизатах клеток и иммунохимическое окрашивание инфицированных клеток in situ.

2.1. Анализ выявления соге-белка в сыворотках крови больных гепатитом С

Одной из приоритетных задач стала разработка метода выявления белка нуклеокапсида (core) в сыворотках крови. Прямая детекция белков ВГС в сыворотке затруднена в связи со следующими факторами: низкая концентрация вирусных частиц в крови (обычно <1нг/мл), блокирование ВГС антителами в составе иммунных комплексов (ИК) и высокая генетическая вариабельность ВГС [Gastaminza et al., 2010, Seme et al., 2005, Simmonds, 2004].

С использованием плазм крови доноров, содержащих антитела к белкам ВГС, разработан оригинальный подход, включающий: 1- концентрирование вируссодержащего материала; 2 - его обработку детергентом в присутствии высокой ионной силы; 3 - ИФА с использованием МКА к белку нуклеокапсида. Концентрирование вируссодержащего материала проводили путем обработки плазм полиэтиленгликолем (ПЭГ-4000).

Обработка осадков заключалась в солюбилизации липидной оболочки вируса детергентом и дезинтеграции ИК с помощью хаотропных агентов. Использование 2,5М КВг в сочетании с 0,5% твин-80 было выбрано как наиболее эффективное из более чем 20 экспериментально апробированных

нами способов разрушения ИК.

Решающую роль в определении соге-белка играют аффинность и специфичность МКА. В результате сравнительных экспериментов установлено, что высокий уровень детекции натурального антигена достигался при включении в состав сэндвича МКА 27 как в качестве улавливающих, так и в качестве детектирующих антител. Вероятно, этот участок наиболее экспонирован и/или антигенно активен в пространственной мультимерной структуре молекул соге-белка, образующих капсид вирусных частиц. В состав моноклонального сэндвича были введены, кроме МКА 27, МКА 1F9 и 4G5, что позволило повысить чувствительность выявления соге-белка на 17%. Такой состав сэндвича эффективно выявлял ВГС, по крайней мере, трех генотипов -1, 2 и 3. Чувствительность метода составила 20 пг/мл.

Частота выявления соге-белка и РНК у ВГС-позитивных доноров и больных гепатитом С представлена на рис. 2 А, Соге-белок обнаруживался во всех группах со сходной частотой - 66-74%. У ВГС-позитивных доноров и пациентов с ХГС выявление обоих маркеров практически полностью совпадает. При ОГС белок обнаруживали чаще по сравнению с РНК, но различия не были статистически значимыми. В целом, между обнаружением белка и РНК BFC установлена достоверная корреляция во всех группах сывороток (р<0,05). Максимальная концентрация core в сыворотках составляла 2,2 нг/мл при средних значениях >200 пг/мл. Средняя концентрация соге-белка у пациентов с ХГС была выше, чем в других группах (рис. 2 Б), статистически значимые различия получены между больными ОГС и ХГС (р<0,05).

А Б

score ПРНК

о;

х 60 Ф

с; m

5 40

.й

СО

5 20 I-

о со

3- п

У/.

У/,

доноры п=85

ХГС п=177

ОГС п=56

500 400 300 200 100 0

р<0,05

доноры ХГС ОГС п=85 п=177 п=56

Рисунок 2. Сравнительная частота выявления соге-белка и РНК ВГС в сыворотках и плазмах крови ВГС-позитивных лиц (А) и концентрации соге-белка (М ± щ) (Б)

У двух больных с симптомами острого гепатита при первичном скрининге антитела к ВГС, маркеры других вирусных гепатитов, а также иные этиологические причины обнаружены не были, в связи с чем был установлен

диагноз острого гепатита неясной этиологии. В то же время, наше исследование выявило прямые маркеры ВГС - соге-белок и РНК ВГС (табл. 2).

Таблица 2. Выявление маркеров ВГС у пациентов с острым гепатитом неясной этиологии в динамике

Паци ент День от начала желтухи Концентра цня core, иг/мл РНК (генотип) антитела к ВГС* АЛТ (Мкмоль/ мин.л)

Core NS3 NS4 NS5

1 3 н/и н/и отрицательный скрининг 1453

10 139 + (1Ь) отрицательный скрининг 412

23 <20 . 0.8** | 1,2 1 0,3 | 0 135

2 4 н/и н/и отрицательный скрининг 1989

18 152 + (2а) отрицательный скрининг 1200

23 512 + 0,5 3,1 0 0 652

29 74 - 0,7 3,3 0 0 394

51 69 + 1,5 3,0 0 0 155

Примечания: * определение антител к ВГС проводили с помощью скринирующих и подтверждающих тест-систем "Диагностические системы" (г. Нижний Новгород); **ОП сывороток с антигенами ВГС в ИФА; "-" - не обнаружено; н/и- не исследовали

У 32% больных ОГС соге-белок обнаруживался при отсутствии РНК в сыворотке. В 17% случаев встречалась обратная ситуация - отрицательный результат ИФА при положительном сигнале в ПЦР. Несовпадение результатов определения РНК и соге-белка описано и другими исследователями [Bouvier-Alias et al., 2002, Schuttler et al., 2004]. Наличие РНК при отсутствии соге-белка может свидетельствовать о низкой концентрации вируса в крови. Положительные показатели ИФА по сравнению с отрицательными - в ПЦР, по-видимому, можно объяснить наличием в некоторых образцах большого количества дефектных вирусных частиц, не содержащих РНК [Schuttler et al., 2004]. На то, что в крови циркулируют лишенные РНК соге-содержащие структуры, указывают данные о широком разбросе между концентрациями белка и РНК: на 1 пг соге-белка может приходиться от 50 до 20000 ME РНК ВГС при среднем соотношении 8000 ME РНК/пг core [Seme et al., 2005]. РНК-негативных, но соге-позитивных сывороток обнаружено больше при ОГС, чем при ХГС (32% против 13%). Возможно, для ОГС более характерна продукция дефектных вирусных частиц в связи с высокой репликативной активностью ВГС. Второй причиной расхождений может служить разрушение РНК в процессе выделения или хранения проб, тогда как для соге-белка показана большая стабильность in vitro [Tanaka et al., 2003].

Разработанный метод представляет интерес не только для диагностики гепатита С, особенно ранних стадий, но также для изучения патогенеза гепатита С, так как дает возможность дифференцировать разные популяции частиц ВГС, циркулирующих в плазме крови. При сравнении результатов выявления соге-белка в сыворотке с клиническими, морфологическими, биохимическими и вирусологическими данными у больных гепатитом С

впервые показано, что наличие соге-белка в сыворотках прямо коррелирует с активностью и стадией ХГС, при этом содержание ИК увеличивается при прогрессировании заболевания и у больных с циррозом печени ИК являются преобладающей формой циркуляции ВГС. Впервые установлена преимущественная циркуляция ВГС у пациентов с ОГС в виде безоболочечных нуклеокапсидов, что может быть связано с высокой скоростью репликации вируса. При оценке исхода ОГС установлено, что концентрация белка нуклеокапсида в сыворотке крови выше у больных с последующей хронизацией гепатита, чем у предполагаемых реконвалесцентов (92±40 против 26±13 пг/мл, р<0,05).

2.2. Изучение экспрессии вирусных белков в клетках печени у

пациентов с гепатитом С

Целью работы на данном этапе было изучение экспрессии вирусных белков в ткани печени пациентов с ОГС (п=20) и ХГС (п=69), а также анализ связи выявления белков с исходом ОГС и активностью патологического процесса при ХГС. Для этого проведен сравнительный анализ пяти методов иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания криостатных срезов печени пациентов с гепатитом С. Выбраны два наиболее чувствительных -иммунопероксидазное окрашивание (ИПО) и окрашивание с помощью авидин-биотинового комплекса.

Серийные срезы печени окрашивали с использованием МКА к белкам core, NS3, NS4A, NS4B и NS5A. Отдельные эпитопы белков ВГС выявлены у пациентов с различной частотой - от 10% до 95% (табл. 3). Разная частота детекции одних и тех же белков ВГС различными МКА, вероятно, свидетельствует о влиянии экспонированности индивидуальных эпитопов на выявляемость белков. Криостатные срезы печени больных различались по спектру выявляемых вирусных белков и интенсивности окрашивания клеток. Наибольшее количество антиген-позитивных (АГ+) клеток обнаруживали при окраске препаратов гепатоцитов МКА 3F12 к белку NS4A, МКА 1D11 и 6В11 к белку NS4B, а также МКА 2С9 к белку NS5A. Оценку ИГХ-реакции с белками ВГС в печени проводили, суммируя результаты окраски серийных срезов отдельными МКА к данному белку.

Установлено, что антигены ВГС локализуются в цитоплазме гепатоцитов (рис. 3). У большинства больных ОГС прослеживалось более интенсивное окрашивание клеток около лимфоидных инфильтратов (рис. 3 А); при ХГС ВГС-содержащие гепатоциты располагаются диффузно, без топографической связи с очагами воспаления и некроза ткани печени (рис. 3 В). Инфицированные гепатоциты выглядели либо морфологически нормальными, либо имели те же морфологические изменения, что и неинфицированные.

Статистический анализ показал, что различия в выявлении белков ВГС в печени пациентов с ОГС и ХГС высоко достоверны (р=0,009) (табл. 3). Количество клеток печени, содержащих белки ВГС, при ОГС было больше, чем при ХГС: 51 ±7% против 33±3% (р=0,006). Эти различия складывались за счет достоверно большего числа больных ОГС, у которых хотя бы один из белков

ВГС обнаруживался более чем в половине клеток печени (12 из 20, 60%), тогда как при ХГС таких больных было всего 16%. Анализ экспрессии отдельных белков ВГС в печени у больных с ОГС ранее не проводился. В настоящем исследовании индивидуальные вирусные белки в печени обнаруживались при ОГС с частотой 89-95%, при ХГС - 28-65%. Сравнение этих показателей позволило установить, что различия характеризовались высокой достоверностью для белков core (р<0,00001), NS4A (р=0,0001) и NS3 (р=0,0007); достоверные различия показаны также для белков NS5A и NS4B (табл. 3). Полученные данные свидетельствуют о более высокой транскрипционной и трансляционной активности ВГС при ОГС по сравнению с ХГС.

Таблица 3. Частота выявления белков ВГС с помощью МКА в срезах биопсий печени и в мононуклеарах периферической крови пациентов с гепатитом С

Белок ВГС МКА БЕЛКИ ВГС В ПЕЧЕНИ БЕЛКИ ВГС В МКПК ХГС (п=83)

ОГС (11=20) ХГС (п=69) Достоверность различий между ОГС и ХГС

core 1F9 9/19 (47%) * 10/36 (28%) * р>0,05 9/44 (20%) *

6D1 6/19 (32%) н/и н/и н/и

1А12 9/16 (56%) н/и н/и 6/54 (11%)

27 7/19 (37%) 3/26 (12%) р>0,05 12/60 (20%)

37 14/19 (74%) н/и н/и н/и

D4 9/19 (47%) 1/17 (6%) р=0,01 11/48(23%)

ВСЕГО** 18/19 (95%) 17/61 (28%) р<0,00001 36/82 (44%)

NS3 2G12 12/18 (67%) 2/17 (12%) р=0,001 8/33 (24%)

2Н4 14/18 (78%) н/и н/и н/и

6Е9 6/9 (67%) 8/37 (22%) р>0,05 2/7 (28,5%)

5G2 12/19 (63%) 8/41 (20%) р=0,002 4/14 (28,5%)

5В2 14/19 (74%) 1/4 (25%) р>0,05 8/38 (21%)

4Н8 10/19 (53%) 3/30 (10%) р=0,003 4/24 (17%)

ВСЕГО** 17/19 (90%) 18/42 (43%) р=0,003 29/83 (35%)

NS4A 3F12 18/19 (95%) 17/40 (43%) р=0,0007 32/80 (40%)

NS4B 1D11 17/19 (89%) 31/56 (55%) р=0,01 3/10 (30%)

6В11 14/19 (74%) 46/69 (67%) р>0,05 6/8 (75%)

ВСЕГО ** 17/19 (89%) 46/69 (67%) р=0,008 34/78 (43%)

NS5A 2С9 15/19 (79%) 29/50 (58%) р<0,05 18/46 (39%)

3F4 9/19 (47%) н/и н/и 15/51 (29%)

1С5 14/17(81%) н/и н/и 20/40 (50%)

6D12 8/15 (53%) н/и н/и 5/37 (13,5%)

5А9 8/15 (53%) н/и н/и п/и

ВСЕГО** 17/19 (89%) 29/50 (58%) р<0,05 51/83 (61%)

ВСЕГО ** 20/20 (100%) 51/69 (74%) р=0,009 71/83 (86%)

Примечания: * доля антиген-позитивных пациентов; ** белок ВГС выявлен хотя бы одним МКА; выделены ячейки с р<0,05; н/и - не исследовали

•А л. ■ л „ ЛзйЧ

1>. в -V ***

с»

"о »

»«1

»4 •

л V л С Ч -й Ч-

9 г» *

« "Г-*' * '■ Мг Д * * • * 9

« - < * .V Л

Рисунок 3. Иммуногистохимическое окрашивание криостатных срезов печени пациентов с гепатитом С

А, Б - пациент с острым гепатитом С; В, Г - пациент с хроническим гепатитом С со слабовыраженной гистологической активностью, жировой дистрофией печени. А и В - окрашивание МКА 2С9 к белку Ы85А. А - Наиболее интенсивное окрашивание гепатоцитов (коричневый цвет) наблюдается около лимфоидных инфильтратов (обозначены красными стрелками). В - Белки ВГС диффузно распределены в цитоплазме гепатоцитов. Б и Г - окрашивание неспецифическими МКА (отрицательный контроль). Специфическое окрашивание отсутствует. Докраска ядер гематоксилином (синий цвет). Ув. 400

белка Ы84В ВГС в

Рисунок 4. Иммунопероксидазное окрашивание мононуклеарных клетках периферической крови

А - больной ХГС; Б - ВГС-негативный донор крови. Окрашивание МКА 6В11 к белку Ы84В ВГС. Докраска ядер гематоксилином. Ув.1000

Таблица 4. Зависимость выявления белков ВГС в печени и РНК ВГС в сыворотке у больных ОГС с различной гистологической активностью гепатита

Параметры Белки ВГС в печени РНК ВГС в сыв-ке

Core NS3 NS4A NS4B NS5A

Дни от начала желтухи до ПБП -0,48* 0,3 <0,3 -0,34 <0,3 -0,57

Гистологическая активность по METAVIR А 0,35 0,5 <0,3 <0,3 <0,3 <0,3

PMN 0,44 0,52 0,34 <0,3 0,41 <0,3

LN <0,3 0,4 <0,3 <0,3 <0,3 <0,3

Примечания: *коэффициенты ранговой корреляции (г); выделены ячейки со статистически значимыми (р<0,05) корреляциями. А - гистологическая активность; PMN - ступенчатый некроз; LN - интралобулярный некроз

Для выявления связи между детекцией вирусных антигенов в печени и клиническими, биохимическими, морфологическими параметрами гепатита С проведен корреляционный анализ. При ОГС впервые выявлена прямая зависимость между накоплением белков в печени и выраженностью некрозо-воспалительных повреждений ткани печени. В наибольшей степени с гистологической активностью (А) ассоциировано накопление белка NS3 (табл. 4). При этом установлено, что экспрессия белков ВГС ассоциирована только со степенью ступенчатого (PMN), но не интралобулярного (LN) некроза. Наибольший вклад в прогрессирование ступенчатого некроза вносили белки NS3, NS5A и core (табл. 4). Эти результаты могут свидетельствовать о прямом цитопатическом действии ВГС. Подобный механизм действия ВГС показан в исследованиях in vitro и на модели трансгенных мышей: повышенное накопление вирусных белков влияет на метаболизм клеток и может оказывать прямое цитотоксическое действие, приводящие к их гибели [Pavio, Lai, 2003, Realdon et al., 2004]. С другой стороны, явная топографическая ассоциация АГ+ клеток с лимфоидными инфильтратами указывает также на участие иммуноопосредованного механизма повреждения гепатоцитов при ОГС.

У пациентов с ХГС степень ступенчатого некроза прямо коррелировала с накоплением белка NS5A (г=0,5, р=0,001). Экспрессия белков core и NS4A сокращалась по мере увеличения активности гепатита, и при тяжелом гепатите (А=3) эти белки не обнаруживались (р<0,05). У больных с умеренным интралобулярным некрозом (LN=2) белки NS4A и NS4B выявлялись достоверно реже и в меньшем количестве клеток печени по сравнению с пациентами, у которых значение LN составляло 0-1 балл, a core белок не был выявлен ни у одного из 15 пациентов с LN=2. При анализе белков ВГС в печени пациентов с различной стадией ХГС установлено, что белок NS5A достоверно обильнее накапливался у больных с продвинутым фиброзом и циррозом печени (1=0,6, р=0,0001).

При анализе связи между выявлением белков и биохимическими показателями у пациентов с ОГС статистически достоверных ассоциаций не обнаружено, но наблюдалась тенденция обратной зависимости между

экспрессией белков ВГС и уровнем AJIT. При ХГС накопление исследованных белков ВГС коррелировало с более высокой активностью AJIT, статистически значимая зависимость получена для белков core (г=0,36, р=0,01) и NS4B (г=0,56, р=0,003).

Обнаружено, что соге-белок чаще выявляется в печени пациентов, которым проводили ПБП в более ранние сроки от начала заболевания (табл. 4). Уменьшение накопления этого белка может отражать снижение репликативной активности ВГС с течением времени и служить маркером ранней стадии ОГС. Та же закономерность установлена для РНК ВГС в сыворотке (табл. 4). При ХГС оценка продолжительности инфицирования показала, что в целом белки ВГС достоверно чаще обнаруживаются в печени больных с большей длительностью заболевания (р<0,05), при анализе индивидуальных белков ВГС статистически достоверные связи обнаружены между степенью накопления белка NS5A ВГС и продолжительностью заболевания (г=0,4, р=0,01).

В сыворотке крови исследованной группы больных ХГС РНК ВГС найдена в 33 из 54 анализированных образцов (61%). Белки ВГС в печени определяли приблизительно с одинаковой частотой у пациентов с виремией и без виремии (р>0,05). У 18 больных исследовали РНК ВГС в ткани печени, у 17 из них (94%) обнаружена геномная (плюс-цепи) РНК. Репликативная форма РНК выявлена у 8 из 17 пациентов, содержащих геномную РНК в печени (47%), и у 13 (76%) из этих пациентов обнаружены белки ВГС в печени. В наибольшей степени совпали результаты детекции репликативной формы РНК и белка core - в 83% образцов (р<0,05). При количественном учете результатов ИПО оказалось, что относительное количество клеток, содержащих белок нуклеокапсида, положительно коррелировало с обнаружением минус-цепей РНК ВГС в печени пациентов (г=0,56, р<0,05).

Для оценки факторов, которые могут влиять на исход ОГС, пациенты были условно разделены на две группы, отличающиеся по исходу болезни: одна группа - с биохимической и вирусологической ремиссией (предполагаемая реконвалесценция), вторая группа - со сформировавшимся ХГС (хронизация). Сравнение параметров показало, что первая группа характеризовалась достоверно более высоким уровнем экспрессии белков NS4A (р=0,045) и NS3 (р<0,0001) в печени. Можно предположить, что для успешной элиминации ВГС необходим высокий уровень экспрессии белков NS4A и NS3 на ранних стадиях инфицирования, что способствует их более эффективной презентации иммунокомпетентным клеткам, активации Т-лимфоцитов по Th-1 типу и продукции IFN-y и других провоспалительных цитокинов. РНК ВГС в первые два месяца от начала заболевания определялась в группах с равной частотой, тогда как сохранение виремии в период 3-4 месяцев достоверно чаще отмечалось у пациентов второй группы. В этот период одновременное отсутствие РНК ВГС в сыворотке и нормализация AJIT отмечалось только у пациентов с дальнейшей предполагаемой ремиссией (р=0,01). В первой группе активность AJIT в разгар болезни была почти в 2 раза ниже, но различия не достигали достоверных значений.

2.3. Выявление маркеров ВГС в мононуклеарных клетках периферической крови

Внепеченочная репликация ВГС долгое время ставилась под сомнение [Ваге et al., 2005, Zignego et al., 2007]. Роль мононуклеаров периферической крови в репликации вируса до сих пор до конца не ясна. Основным доказательством репликации является обнаружение минус-цепи РНК ВГС. Ключевым подходом в доказательстве вирусной репликации в клетках периферической крови может стать выявление вирусных белков, в особенности неструктурных, которые формируют репликативный комплекс.

При помощи иммуноцитохимического метода изучена экспрессия белков ВГС в МКПК больных ХГС. Наиболее часто выявлялся белок NS5A - у 61% больных, остальные белки выявлялись со сходной частотой - у 35-44% пациентов (табл.3). Хотя бы один вирусный белок выявлен у 71 из 83 пациентов с ХГС (86%), что согласуется с результатами Gong et al. [2003]. Все использованные нами МКА выявляли белки ВГС, частота выявления и интенсивность окраски варьировали. В целом, наиболее активно взаимодействовали с белками МКА 1С5, 1D11, 3F12, 2С9. Следует отметить, что именно эти МКА были самыми эффективными при выявлении вирусных антигенов в ткани печени. Это свидетельствует о том, что эпитопы, выявляемые данными МКА на белках NS4A, NS4B и NS5A, являются иммунодоминантными и должны учитываться при разработке вакцин. Эту задачу облегчают результаты по картированию последовательностей, опознаваемых указанными МКА, полученные в настоящей работе.

Доля АГ+ клеток значительно варьировала от больного - к больному и различалась при выявлении отдельных белков ВГС. Средние количества АГ+ клеток составили: core - 2,3±1,7%, NS3 - 6,3±3,5%, NS4A - 15,6±3,2%, NS4B -19,6±2,4%, NS5A - 13,1±2,3%. Вирусные антигены обнаружены исключительно в цитоплазме клеток (рис. 4). Чаще всего они были локализованы в более крупных клетках, по морфологии сходных с моноцитами. В случае большого количества окрашенных клеток АГ-положительными были также и более мелкие мононуклеарные клетки, по-видимому, лимфоциты.

Полученные результаты были подтверждены при помощи метода проточной цитофлюорометрии. Показано, что в основном белки ВГС локализовались во фракции моноцитов, их доля в некоторых случаях достигала 32% (табл. 5). АГ+ лимфоциты составляли не более 5% и выявлены у меньшего числа пациентов.

Статистический анализ показал достоверную обратную корреляцию между накоплением белков ВГС и количеством как лимфоцитов (г= -0,64, р=0,001), так и общей популяции МКПК (г= -0,66, р=0,002). Можно предположить, что экспрессия и накопление вирусных белков индуцирует гибель клеток крови. Не исключено, что одним из механизмов действия ВГС является повреждение ДНК лимфоцитов, обнаруженное у больных гепатитом С [Bolukbas et al., 2006].

В МКПК 37 больных ХГС исследовали наличие геномной и репликативной цепей РНК ВГС. Плюс-цепи РНК ВГС найдены в 35 образцах (95%), минус-цепь выявлялась значительно реже - у 19 больных ХГС (51%). В группе пациентов, у которых в мононуклеарах периферической крови была выявлена

репликативная цепь РНК ВГС, все исследованные белки ВГС выявлялись чаще, в большем количестве клеток и с большей интенсивностью, чем у больных, у которых минус-цепь не была обнаружена. Для белков core и NS5A эти различия были достоверными (р<0,05).

Таблица 5. Выявление белков ВГС в различных популяциях мононуклеарных клеток крови у больных ХГС методом проточной цитофлюорометрии

Субпопуляции МКПК Частота выявления белков ВГС Количество АГ+ клеток (%), М±т (минимум-максимум)

моноциты 11/21 (52,4%) 13,7±2,6 (6,1-32,2)

лимфоциты 4/21 (19%) 3,1± 0,7 (1,6-4,9)

А=1 А=2 А=3 F=1 F=3-4 гистологическая активность индекс фиброза

100

60 -

20-п--

Норм.АЛТ Повыш. АЛТ

Рисунок 5. Выявление белков ВГС в МКПК в зависимости от гистологической активности гепатита и степени фиброза (А) и уровня АЛТ (Б)

Мы сравнили выявление вирусных антигенов в МКПК у больных с различными клиническими, биохимическими, морфологическими параметрами ВГС. Показано, что белки ВГС достоверно чаще обнаруживались в МКПК пациентов с тяжелыми некрозо-воспалительными повреждениями печени (А=3), высоким индексом фиброза (ИФЗ) (рис. 5 А), а также у больных с повышенным уровнем АЛТ (рис. 5 Б). Количество АГ+ МКПК и интенсивность окрашивания клеток также были достоверно выше у этих пациентов, чем у больных с менее выраженными морфологическими изменениями в печени. Это позволяет заключить, что накопление белков ВГС в МКПК может влиять не только на нарушение иммунологических функций мононуклеаров, но также приводить к персистенции вируса и вызывать повреждение печени при ХГС.

2.4. Обнаружение белков ВГС в лизатах инфицированных клеток

Представляло интерес изучить возможность определения антигенов ВГС в инфицированных клетках с помощью ИФА. Лизаты клеток печени готовили с помощью сочетаний ионных и неионных детергентов, которые

солюбилизировали цитоплазматические мембраны, но не инактивировали вирусные белки. Методы разрабатывали с использованием замороженных образцов биопсий печени от 24 больных ХГС. Апробировано около 30 сочетаний МКА в качестве сорбентов на твердую фазу и в качестве конъюгатов с ПХ. Наиболее чувствительное определение соге-белка достигалось при конструировании сэндвича с использованием МКА 04-1Б9* и 1Р9-601*. Белок N84 при оптимальном подборе сочетаний МКА (6В11-Ш11* и ЗР12-Ш11*) определялся с чувствительностью около 80 пг/мг ткани печени. Концентрация белков ВГС в лизатах биоптатов печени составляла 0,1-3 нг/мг ткани. Белки N83 и N85 выявить данным методом не удалось, вероятно, из-за разрушения конформационно-зависимых эпитопов МКА детергентами, используемыми при лизировании клеточных мембран.

50 п

I 30

Ш 20 га н о

I-

га ю У

ИМКА1А12

ЕШКА1Р9

I МКА27

К МКА 04

■. Лй

£ 5

60 -

30 -

20 -

га ь о н

га ю

конъюгаты МКА

6В11-Ю11* 6В11-ЗЯ12* Ю11-6В1Г Ю11-ЗГ12* ЗР12-Ю11* композиция сэндвича

Рисунок 6. Эффективность выявления соге-белка (А) и белка N84 (Б) ВГС в лизатах ткани печени методом сэндвич-ИФА

Использование разработанных методов позволило верифицировать гепатит С у 3 из 15 пациентов с гепатитом неясной этиологии, у которых не были обнаружены серологические маркеры инфекции. Результаты выявления белков коррелировали с наличием РНК в печени этих пациентов. Исследовано содержание белков В ГС в замороженных МКПК больных ОГС и ХГС (п=39). Уровни детекции белков core и NS4 составили 40% и 48%, соответственно, суммарно белки ВГС обнаружены у 75% больных. Таким образом, ИФА лизатов клеток представляет интерес как с теоретической точки зрения - для изучения роли белков ВГС в патогенезе гепатита С, так и с практической - для экспресс-диагностики гепатита С.

Таблица 6. Схема корреляционных зависимостей между выявлением белков и РНК ВГС и активностью и стадией ХГС

Белки и РНК ВГС Гистологические Биохимиче

показатели екая

Лока Маркеры ВГС Средняя Индекс Индекс активность

лизац частота гистологич. фиброза ГАЛТ)

ия выявления активности

Белки сумма 51/69 (74%) 44 <-> t

Core 17/61 (28%) 4- 44 t

NS3 18/42 (43%) <-> 44 44

NS4A 17/40 (43%) 4- 44 44

т NS4B 46/69 (67%) 4- 44 t

Е NS5A 29/50 (58%) t t 44

Плюс-цепи РНК 71/87 (82%) <-> О t

Минус-цепи РНК 22/69 (32%) 1 о 44

Белки сумма 71/83 (86%) 44 44 t

Core 36/82 (44%) t t t

NS3 29/83 (35%) 44 44 44

X а NS4A 32/80 (40%) 1 1 44

X NS4B 34/78 (43%) <-» 1 44

S NS5A 51/83 (61%) о 44 <4

Плюс-цепи РНК 35/37 (95%) 44 44 44

Минус-цепи РНК 19/37 (51%) 44 44 О

а Соге-белок 126/177 (71%) t t t

¥ а Вирионы 105/177 (59%) 44 <4 44

ИК 21/79 (27%) 44 t

и Плюс-цепи РНК 189/267 (71%) 44 44 44

Одновременно белки в 22/54 (41%) t 44 t

печени и РНК в сыворотке

Примечания: Т- выявлена позитивная корреляция между частотой выявления маркера или активностью экспрессии белков ВГС и показателями тяжести ХГС (р<0,05); -выявлена негативная корреляция (р<0,05); 44-корреляция не выявлена (р>0,05)

В таблице 6 схематично представлены выявленные в данной части исследования закономерности, характеризующие связи между обнаружением РНК и экспрессией белков ВГС в печени и периферической крови у больных

ХГС в зависимости от активности и стадии заболевания. Следует отметить, что указанные закономерности установлены впервые.

Показано, что повышение уровня ферментов печени прямо связано с общей вирусной нагрузкой: наличием как геномной РНК ВГС, так и белков ВГС в ткани печени, РНК и соге-белка в сыворотках крови и белков ВГС в МКПК (табл. 6). С повышением гистологической активности ассоциированы активная экспрессия белка NS5A в печени и обнаружение белка core в периферической крови. В то же время, при тяжелых некрозо-воспалительных процессах в печени (ИГА 9-12, А=3) частота обнаружения минус-цепей РНК ВГС, а также экспрессия белка NS4A в печени и в МКПК больных ХГС сокращается, что может свидетельствовать о снижении репликативной активности ВГС при прогрессировании заболевания. Прямые корреляционные связи установлены между развитием тяжелого фиброза и цирроза ткани печени (ИФ>3) и накоплением белка NS5A в печени, а также белка core в МКПК и сыворотке крови, при этом у пациентов с циррозом преобладающей формой циркуляции ВГС являются иммунные комплексы.

Сравнивая частоту обнаружения маркеров ВГС, можно сделать вывод, что отсутствие ВГС в сыворотке или плазме крови, которые наиболее часто используются для диагностических целей, не означает отсутствие РНК и белков ВГС в клетках. Полученные данные указывают на большую диагностическую ценность анализа клеток крови или цельной крови, в том числе, методом ПЦР.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ВГС-ИНФЕКЦИЮ И АНАЛИЗ ИММУННОГО СТАТУСА БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С

Третья часть работы посвящена изучению роли белков ВГС в индукции антивирусного иммунного ответа. Анализировали спектр и активность антител к белкам ВГС и ряд маркеров иммунного статуса и активации иммунной системы. Нас интересовала также связь этих параметров с активностью и стадией заболевания и влияние вирусных белков и РНК ВГС на Т- и В-клеточный ответ при ВГС-инфекции.

3.1. Активность антител к белкам ВГС в сыворотке и плазме крови

Спектр антител к рекомбинантным белкам ВГС определяли в ИФА. Данные о выявлении антител к белкам ВГС у больных ХГС с различной активностью и стадией заболевания представлены в табл. 7. Антитела к белку core и NS3 обнаруживались у большинства больных ХГС, однако их выявление не коррелировало с гистологической и биохимической активностью и стадией заболевания. Антитела к белку NS5A достоверно чаще обнаруживались у больных с более высокими показателями ИФ и AJIT; при оценке ИГА по шкале METAVIR положительная корреляция установлена между титрами airra-NS5A антител и гистологической активностью (г=0,35, р=0,01). Пациенты, у которых найдены белки ВГС в печени, также значительно чаще имели airm-NS5A антитела. Положительная корреляция (i=0,42, р=0,03) найдена между экспрессией белка NS5A в клетках печени и наличием антител к этому белку. У больных с определяемыми белками ВГС в печени и одновременно РНК ВГС

в сыворотке достоверно чаще по сравнению с пациентами без этих вирусных маркеров выявлялись антитела к белкам N84 и ^5А.

При исследовании пациентов с ОГС у 5 из 22 больных (23%) наиболее вероятно произошла реконвалесценция, у 17 сформировался ХГС. Сравнение больных ОГС с различным исходом заболевания показало, что активность антител к белку №5А была достоверно больше в группе больных с хронизацией гепатита (табл. 8).

Таблица 7. Частота встречаемости антител к белкам ВГС у пациентов с ХГС в зависимости от активности и стадии заболевания и наличия вирусных маркеров

Морфологические, биохимические и вирусологические характеристики Частота встречаемости нтител к белкам ВГС, %

core NS3 NS4 NS5A

Показатели активности и стадии ХГС ИГА (баллы) * (п=52) 1-8 96 74 65 56

9-12 96 83 78 72

ИФ (баллы) * (п=52) 1-2 96 77 70 60

>3 100 80 60 100

АЛТ (мкмоль/мин. л) (ч=52) <40 95 77 62 31

>40 98 77 72 72

Маркеры ВГС Белки в печени (п=52) Есть 96 78 75 72

Нет 96 76 59 37

РНК в сыворотке (п=37) Есть 98 84 72 66

Нет 95 67 67 52

РНК в сыворотке и белки в печени (п=20) Есть 100 86 71 67

нет 96 67 33 17

Пациенты с ХГС (п=52), средние значения 96 77 70 60

Примечания: * по модифицированной системе Кло<1е11; выделены статистически значимые (р<0,05) различия между группами больных с различными характеристиками параметров

Таблица 8. Характеристика активности антител в сыворотках пациентов с ОГС в зависимости от исхода заболевания

Антитела к белкам ВГС в сыворотке крови Группы больных Достоверность различий

Реконвалесценция (п=5) Хронизация (п=17)

core 3,4±0,5* 3,3±0,8 р=0,93

NS3 3,4±0,9 2,4±0,5 р=0,38

NS4 0,4±0,2 1,6±0,5 р=0,24

NS5 <0,1 0,9±0,4 р=0,048

Примечания: *ОП в ИФА сывороток крови в разведении 1:10, М±т; выделены ячейки со статистически значимыми различиями между группами (р<0,05)

Таким образом, анализ спектра и активности антител к разным белкам ВГС выявил различия в гуморальном ответе на белки N84 и №5А у больных ХГС с разной активностью и стадией гепатита и на белок ЫБ5А у пациентов ОГС с различными исходами заболевания. Впервые выявленная нами корреляция

между накоплением белка NS5A в клетках печени, выработкой антител к этому белку и прогрессированием заболевания позволяет предположить, что белок NS5A может рассматриваться как один из маркеров тяжести патологического процесса при ХГС.

3.2. Показатели иммунного статуса при гепатите С

Анализ фенотипа лимфоцитов периферической крови у исследованных пациентов с ХГС (п=52) выявил достоверно значимое по сравнению с ВГС-негативными донорами крови снижение количества CD4+ (Th) при относительно нормальном уровне CD8+ (CTL) и, как следствие, уменьшение иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+ (табл. 9). Это свидетельствует о слабом пролиферативном ответе CD4+ Т-клеток на антигены ВГС у пациентов с ХГС. К подобному заключению пришли и другие исследователи [Редькин Ю.В., Дронь Е.В., 2007, Amador-Cañizares et al., 2008].

Таблица 9. Выявление поверхностных маркеров Т- и В-лимфоцитов периферической крови у больных с ОГС и ХГС

Группы пациентов в зависимости от выявления ВГС Количество лимфоцитов (%), содержащих антигены (М±ш):

СЮ+ CD4+ CD8+ CD4+/ CD8+ CD16+ CD20+

Контроль (п=20) 67,1±1,5 44,5±0,3 25,3±0,5 1,73±0,03 14,6±0,2 13,5±0,5

Пациенты с ОГС (п=22) 64,7±1,8 37,0±1,3 * 27,4±0,9 * 1,34±0,02 * 13,0±0,7 12,6±0,6

Пациенты с ХГС (п=52) 65,0±1,0 39,0± 0,8 25,6±0,7 1,55±0,03 12,6±0,5 12,6±0,5

Белки в печени (ХГС, п=52) Есть 64,9±1,4 38,9±1,0 25,7±0,6 1,51 ±0,03 12,1±0,6 12,4±0,5

Нет 65,2±1,1 40,1±0,8 25,1±0,7 1,63±0,06 13,3±1,1 13,0±1,0

РНК в сыв-ке (ХГС, п=37) Есть 67,0±2,0 41,1±0,9 26,1±0,7 1,58±0,04 12,2±0,8 12,7±0,7

Нет 66,0±1,1 40,3±1,1 26,0±0,6 1,57±0,07 13,1±1,0 12,1±0,9

РНК в сыв-ке и белки ВГС в печени (ХГС, п=20) Есть 66,4±1,9 41,1±1,3 26,6±1,0 1,57±0,06 11,8±0,9 13,1±0,9

Нет 64,5±0,5 40,3±1,4 24,8±1,6 1,64±0,18 13,0±2,1 13,5±2,2

Примечания: выделены статистически значимые (р<0,05) отличия от контроля; ""статистически значимые (р<0,05) различия между группами пациентов с ОГС и ХГС

Данные настоящей работы впервые показали, что более выраженное снижение иммунорегуляторного индекса происходит у пациентов с активной экспрессией белков ВГС в печени (р<0,05). Среднее количество натуральных киллеров (№С, С016+) также было меньше у пациентов с ХГС по сравнению с контрольной группой (р<0,05), при этом концентрация "ЫК была в большей степени снижена у пациентов с определяемыми белками ВГС в печени и/или РНК в сыворотке (р<0,05). У пациентов, не содержащих этих вирусных маркеров, данные показатели не отличались от нормы. Выявленные закономерности могут отражать более слабую противовирусную резистентность и неэффективный клеточный иммунный ответ у пациентов с активной репликацией ВГС.

У больных ОГС обнаружены значительно более глубокие изменения в иммунном статусе (табл.9). По сравнению с ВГС-негативными донорами были

статистически значимо снижены показатели CD4 , CD 16 и индекса CD4 /CD8 , сопровождающиеся увеличением доли С08+"лимфоцитов. Обнаружены различия и с больными ХГС - по показателям CD4+, CD8+ и CD4+/CD8+. Впервые установлено, что сокращение количества С016+-лимфоцитов ассоциировано с более активной экспрессией белков NS3 и NS5A ВГС в печени (г=0,6-0,7, р<0,01).

□ белки и/или РНК выявлены

■ белки и/или РНК не выявлены

core NS3 NS4A NS4B NS5A

РНК

Рисунок 7. Экспрессия маркера Fas-зависимого апоптоза CD95+ на МКПК больных ХГС в зависимости от выявления белков ВГС в печени и РНК ВГС в сыворотке крови

По оси абсцисс: Белки ВГС в печени и РНК в сыворотке крови; по оси ординат: относительное количество рецептора CD95+ в МКПК (%), М±т; * статистически достоверные различия с контрольной группой (р<0,05)

У 53-54% исследованных пациентов обнаружены лимфоциты, несущие рецептор Fas-зависимого апоптоза CD95+. Относительное содержание этой субпопуляции варьировало от 0 до 10%, в среднем составив 1,7±0,3% у больных ХГС и 2,8±0,5% - ОГС, что достоверно отличалось от нормы: ни у одного человека в контрольной группе С095+-лимфоциты не выявлены (р=0,02 и р=0,0006, соответственно). Одной из причин повышения относительного количества рецепторов CD95+ на МКПК может быть персистенция ВГС в клетках лимфоидной системы. В работе японских исследователей показано, что МКПК, несущие рецептор CD95+, содержали РНК ВГС, в то время как в популяции С095+-негативных лимфоцитов РНК ВГС отсутствовала [Taya et al., 2000]. При ХГС относительное содержание С095+-лимфоцитов у больных с виремией оказалось в 2 раза больше, чем у больных без виремии (р<0,05) (рис. 7). Впервые выявлена негативная корреляция между количеством CD95 -лимфоцитов и степенью накопления в клетках печени белков ВГС: core и NS4A - при ХГС (р<0,05) (рис. 7), NS3, NS4A и NS5A - при ОГС (р<0,05). Роль белков ВГС в апоптозе исследована, главным образом, в модельных системах

(трансфицированные клетки и трансгенные животные), в которых показаны как апоптотические, так и антиапоптотические потенции белков [Hahn et al., 2000, Machida et al., 2001, Siavoshian et al., 2005]. Результаты наших исследований свидетельствуют об ингибирующем влиянии экспрессии вирусных белков в печени на процесс Fas-опосредованного апоптоза в клетках крови. Однозначная интерпретация полученных результатов в настоящее время представляется затруднительной, однако, учитывая противоположное влияние вирусного генома и белков ВГС на экспрессию рецептора CD95+, нельзя исключить, что в Fas-опосредованный апоптоз могут быть вовлечены разные механизмы.

3.3. Содержание растворимых форм дифференцировочных антигенов в сыворотках крови больных гепатитом С

Следующим этапом работы было определение содержания растворимых (s) форм мембранных белков клеток иммунной системы больных гепатитом С и их роли в патогенезе гепатита С. Исследования были сфокусированы на s-формах четырех антигенов - sCD95 (Fas), sCD38, sHLA-I и sHLA-DR. У пациентов с ОГС средний уровень всех исследованных антигенов достоверно превышал средние значения, обнаруженные в сыворотках доноров (табл. 10). У больных ХГС достоверные отличия от группы сравнения получены для sCD38. При использовании тест-системы фирмы Abeam (США) при исследовании других пациентов с гепатитом С (п=36) было установлено статистически значимое повышение концентраций sCD95 как при остром, так и хроническом гепатите С по сравнению с группой контроля (р=0,01), при этом наиболее высокий средний уровень sCD95 (219 пг/мл по сравнению с 34 пг/мл в контроле, р=0,0006) выявлен у больных с циррозом печени.

Анализировали возможную связь между содержанием растворимых форм дифференцировочных антигенов и клинико-морфологическими и вирусологическими данными пациентов.

Впервые показано, что существует статистически значимая корреляция (г=0,3-0,4, р<0,05) между степенью накопления белков ВГС в печени и концентрацией sFas в сыворотках: белков core, NS3, NS4B, NS5A при ХГС и NS4A, NS5A - при ОГС. Полученные данные показывают, что гепатоциты, экспрессирующие белки ВГС, вносят существенный вклад в образование растворимой формы sFas. Молекулы sCD95 являются конкурентами Fas рецептора на инфицированных клетках, и их высокое содержание в организме может препятствовать апоптозу и способствовать персистенции вируса. Таким образом, белки ВГС, стимулируя повышение концентрации sFas, могут ингибировать элиминацию вирус-инфицированных клеток вследствие связывания Fas-лиганда на активированных цитотоксических лимфоцитах циркулирующими молекулами sFas. Наряду с описанными ранее механизмами ингибирования апоптоза вирусными белками [Kountouras et al., 2003, Sacco et al., 2003], этот путь также может участвовать в патогенезе гепатита С. В других исследованиях была показана увеличенная экспрессия Fas-антигена на мембранах ВГС-инфицированных гепатоцитов [Kountouras et al., 2003] и установлена корреляция между уровнем экспрессии Fas на гепатоцитах и концентрацией sFas [El Bassiouny et al., 2008].

Таблица 10. Уровень растворимых форм мембранных антигенов в сыворотках больных гепатитом С

Исследуемая группа Уровень растворимого антигена (УЕ/мл), М±т

sFas SCD38 sHLA-I sHLA-DR

Доноры (п) 203±35 (68) 72±8 (100) 517±80 (24) 192±38 (66)

ОГС (п) 350±53(71) 178±26 (68) 97б±124 (59) 355±64 (68)

ХГС (п) 250±27 (157) 204±23 (155) 411±66(67) 285±33 (155)

Примечания: выделены статистически достоверные различия с контрольной группой (р<0,05)

Большой интерес представляло выяснить, существует ли связь между концентрацией sFas в сыворотке и выявлением маркеров ВГС в МКПК. Взаимосвязи между сывороточным содержанием sFas, наличием плюс- и минус-цепей РНК ВГС в МКПК не наблюдалось. В то же время, обнаружено достоверное снижение уровня sFas в сыворотках пациентов с ХГС, у которых выявлено большое количество (>25%) ВГС-позитивных МКПК, по сравнению с больными, не содержащими вирусные белки в МКПК (р=0,02). Это может быть связано с установленным нами сокращением популяции ВГС-инфицированных МКПК и, как следствие, снижением экспрессии мембранного Fas и образования растворимой формы Fas-антигена. Следует отметить, что вклад мононуклеаров крови в продукцию sFas существенен только при острой форме гепатита С: корреляция между sFas и числом С095+-лимфоцитов при ОГС была статистически значимой (г=0,4; р<0,05), тогда как при ХГС связи между этими параметрами не установлено (г<0,3). При изучении других растворимых форм показано, что уровень sHLA-DR также был ниже у пациентов с высокой долей АГ+ МКПК (р=0,05), достоверные значения получены для белка NS3 (р=0,018).

Уровень sFas в сыворотках больных ОГС с генотипами вируса 1а и Ib был достоверно выше, чем в сыворотках пациентов с другими генотипами (462±120 УЕ/мл и 148±29 УЕ/мл, соответственно, р<0,05). Концентрация других исследованных растворимых форм также была выше у пациентов с генотипом 1 ВГС, однако различия не были достоверными (р>0,05).

При сравнении двух групп пациентов с различными исходами ОГС установлено, что больные, у которых сформировался ХГС, характеризовались более высокой концентрацией s-форм в первый месяц от начала заболевания в отличие от возможных реконвалесцентов (рис. 8). Для sCD38 полученные отличия оказались статистически достоверными. Это означает, что концентрация sCD38 в сыворотке крови пациентов с ОГС может иметь прогностическое значение при оценке исхода заболевания.

Негативная роль растворимых форм дифференцировочных антигенов состоит также в снижении популяции иммунокомпетентных клеток: у больных ОГС обнаружена обратная корреляция между количеством CD4+ -лимфоцитов периферической крови и концентрациями sFas (г= -0,52; р<0,05) и sHLA-DR (г= -0,56; р<0,05), что может свидетельствовать об усилении гибели CD4+-лимфоцитов путём апоптоза [Rebmann et al., 2003]. Интересно, что у больных ХГС такой зависимости выявлено не было, что является дополнительным

доказательством в пользу различного проявления иммунных реакций при острой и хронической формах гепатита С.

Рисунок 8. Концентрация растворимых форм дифференцировочных антигенов у пациентов с различным исходом ОГС (М±т)

3.4. Цитокиновый профиль больных гепатитом С

Цитокины контролируют процессы пролиферации, дифференцировки и функциональной активности всех иммунокомпетентных клеток. Задача данного этапа состояла в изучении цитокинового статуса больных гепатитом С, а также в выборе цитокинов, наиболее значимо отражающих иммунные изменения при ВГС-инфекции.

У больных гепатитом С по сравнению с ВГС-негативными донорами выявлен дисбаланс цитокинов, продуцируемых Thl и Th2 Т-клетками. Он заключается в гиперпродукции IL-6, IL-10 и TNF-ав сыворотках крови (р<0,001) (рис. 9). Кроме этого, при ХГС по сравнению с донорами наблюдается повышение концентрации IL-4 (р=0,02), а при ОГС повышена продукция IL-8 (р<0,002) и понижена - IL-2 (р=0,035). Эти показатели характеризуют иммунный ответ при гепатите С как идущий преимущественно по гуморальному, ТЬ2-типу. Сходные данные по содержанию некоторых из изученных нами цитокинов в сыворотках больных ХГС получены и другими исследователями [Мезенцева М.В. и др., 2007, Баранов А. В., Малеев В. В., 2008, Макашова В. В. и др., 2009, de Almeida et al„ 2011, Zarife et al„ 2010]. Содержание IFN-y у пациентов не отличалось от группы сравнения.

Уровень исследованных цитокинов в крови не коррелировал ни с ИГА, ни с ИФ, ни с АЛТ.

При анализе продукции цитокинов клетками крови больных ХГС in vitro установлено, что рекомбинантные белки ВГС (core, NS3, NS4 и NS5A) проявили себя значительно более слабыми стимуляторами IL-2, IFN-y и TNF-a, чем конканавалин А (р<0,01). Это убедительно свидетельствует о неспособности белков ВГС быть эффективными индукторами антивирусных

функционально активных ТЫ цитокинов. Сравнение антигенов ВГС между собой показало, что рекомбинантный белок N83 оказался наиболее эффективным стимулятором большинства исследованных цитокинов: 1Ь-4, 1Ь-б, 1Ь-8, И-10,и ТОТ-а (р<0,05).

Рисунок 9. Концентрация цитокинов в сыворотках крови пациентов с гепатитом С по сравнению с ВГС-негативными донорами крови

Представлены концентрации цитокинов (медианы, пг/мл); прямоугольники -интерквартильные интервалы (25-75%); отрезки - минимальные и максимальные значения; * статистически достоверные различия с контрольной группой (р<0,05)

Таким образом, наиболее значимые отличия в цитокиновом статусе больных гепатитом С обнаружены при анализе уровня цитокинов IL-6, IL-10 и TNF-a, а также IL-2 и IL-8 при ОГС в сыворотках крови, что указывает на диагностическую ценность этих тестов.

4. РАЗРАБОТКА КАНДИДАТНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА С

Целью данного раздела работы было исследование иммунного ответа животных на иммунизацию конструкциями из состава ВГС для выбора вакцинной композиции, индуцирующей интенсивный и мультиспецифический клеточный и гуморальный иммунный ответ против гепатита С. В большинстве исследований, посвященных созданию вакцин против гепатита С, предлагается использовать индивидуальные рекомбинантные белки, пептиды различной протяженности или отдельные участки генома ВГС в составе ДНК-конструкций [Abdulhaqq et al., 2008, Chen et al., 2006, Drane et al., 2008, Houghton, Abrignani, 2005, Encke et al., 2007].

Для разработки дизайна кандидатной вакцины на основании полученных данных мы выбрали иммунодоминантные области неструктурных белков N83, N84 и №5А ВГС, экспрессия которых и иммунный ответ на которые связан с прогрессированием ХГС и исходом ОГС.

Проведенная серия экспериментов по оценке иммунного ответа мышей на введение рекомбинантных белков ВГС показала, что они слабо иммуногенны. На это указывают и данные других исследователей [СНи й а1., 2008]. Для усиления иммуногенности белков проведено сравнительное исследование иммуностимулирующего действия 6 адъювантов различной природы при введении разных доз белков. Оценивали параметры гуморального ответа, включая спектр антител к отдельным детерминантам, представленных пептидами, и изотип антител. Клеточный ответ исследовали по пролиферации лимфоцитов в РБТЛ и секреции цитокинов активированными лимфоцитами. Наши исследования подтвердили высокую адъювантную активность адъюванта Фрейнда (ПАФ) и гидроокиси алюминия (А1) как мощных стимуляторов гуморального ответа (рис. 10). Однако, как известно, ПАФ не разрешен для клинического использования, тогда как А1 входит в состав многих вакцин. В настоящей работе впервые показано, что при иммунизации рекомбинантными белками ВГС А1 - не лучший выбор. Во-первых, он не индуцирует образование антител к широкому спектру эпитопов белка, во-вторых, не стимулирует Т-клеточный ответ. Сходные данные получены при использовании ПАФ в качестве адъюванта. Более перспективными по репертуару антител и большему соотношению антител изотипов 1§02а/1£01 показали себя новые, ранее не исследованные вещества: глюкозаминил-мурамилдипептид (ГМДП) синтетический аналог участка клеточной стенки бактерий, и 2 производных фуллерена С6о: с ГМДП и с натриевой солью аминокапроновой кислоты (С6о -ГМДП и Сбо -АКК). Однако эти препараты, также как ПАФ и А1, не были эффективны при использовании малых доз антигена (<2 мкг/мышь) и стимулировали иммунный ответ только после 4-5 иммунизаций. Это снижает их пригодность в составе вакцинных препаратов. Лучшей иммуностимулирующей потенцией обладали ковалентные конъюгаты белков с иммуномаксом. Показано, что ковалентные конъюгаты рекомбинантных белков ВГС с иммуномаксом эффективно стимулируют гуморальный и клеточный иммунные ответы при введении белка в низких дозах - около 1 мкг/мышь. Фармакологический препарат Иммуномакс® - кислый пептидогликан растительного происхождения, обладающий свойствами иммуномодулятора, оказывает активирующее действие на КК-клетки, дендритные клетки, моноциты и макрофаги [Атауллаханов Р.И. и др., 2005].

При исследовании иммуногенности двух ДНК-конструкций, кодирующих неструктурные белки N83 и №5А ВГС, показано, что они индуцируют достаточно высокий клеточный ответ, но низкий гуморальный ответ. Установлено, что испытанные в качестве адъювантов иммуномакс и ген цитокина СМ-СББ эффективно стимулируют клеточный иммунный ответ.

Проведена серия экспериментов по сравнению иммунного ответа мышей при введении ДНК-плазмиды, кодирующей белок ^5А ВГС, рекомбинантного

белка NS5A - продукта этого гена, а также различных их сочетаний. Двум группам мышей вводили либо ДНК, либо конъюгат белка NS5A с иммуномаксом; двум другим - ДНК и белки в различной последовательности (табл. 11). Для оценки специфичности клеточного иммунного ответа использованы 15 антигенов из состава NS5A: 8 синтетических пептидов, 4 рекомбинантных белка различных генотипов и 3 фаговых клона, экспонирующие различные пептиды NS5A, которые отобраны из фаговых библиотек методом аффинной селекции с помощью МКА 3F4, 2С9 и 1С5.

доза rNS4, мкг/мы шь

—♦— конъюгат -и— иммуномакс -тЬ—ПАФ ..... : А1(ОН)3

-ж-гмдп С60-АКК —1— С60-ГМДП -К

Рисунок 10. Продукция антител к белку гИ84 при иммунизации мышей рекомбинантным белком в зависимости от дозы белка и адъюванта

Показано, что двукратная иммунизация не приводит к стимуляции эффективного иммунного ответа ни в одном из вариантов. Анализ иммунного ответа после трех иммунизаций показал, что одновременное введение мышам ДНК-плазмиды и конъюгата рекомбинантного белка Ы85А с иммуномаксом стимулирует наиболее эффективный иммунный ответ к белку ЫБ5А ВГС (табл. 11). Клеточный ответ заключается в интенсивных реакциях на широкий спектр эпитопов белка Ш5А ВГС в форме пролиферации лимфоцитов, накопления клеток, синтезирующих 1Р]\'-у, и секреции активированными Т -клетками провоспалительных цитокинов 1ГЫ-у и 1Ь-2. Важным критерием эффективности иммунного ответа может служить количество мультифункциональных эпитопов, которые стимулируют более двух клеточных

реакций. Наибольшее число таких эпитопов выявлено у мышей, иммунизированных 3 раза смесью белка и плазмиды. Расширение спектра эпитопов, вероятно, связано с активацией разных субпопуляций Т-лимфоцитов. С помощью метода проточной цитометрии установлено увеличение относительного количества Т-клеток - СБ4+ и СС8+, свидетельствующее об их активной пролиферации и сдвиге иммунного ответа в сторону клеточного звена. О направленности иммунного ответа по ТЫ-типу свидетельствует также преобладание антител к N85А изотипа \gG2a по сравнению с 1. Кроме клеточного ответа, данные иммуногены индуцируют стабильную продукцию антител к N85 А.

Комплексный анализ данных позволил установить 7 Т-клеточных детерминант на белке ^5А, на которые чаще всего был получен мультифункциональный ответ независимо от схемы иммунизации. Наиболее часто (во всех пяти экспериментальных группах) его стимулировали регионы Ш5А 2223-2233 а.о. и 2264-2277 а.о., в 2-3 группах - регионы 2151-2160 а.о., 2252-2260 а.о., 2295-2313 а.о. и только в одной группе - регион 2140-2149 а.о.

Таким образом, установлен ряд ключевых позиций в дизайне кандидатной вакцины - состав, адъювант и последовательность введения, что позволит продолжить работу гго созданию вакцины против гепатита С.

Таблица 11. Сравнение иммунного ответа мышей, иммунизированных рекомбинантным белком Ш5А и/или ДНК-конструкцией, кодирующей N85 А

Вид тестя Экспериментальные группы мышей

ЕДНК + белок (3 раза) ДНК (3 раза) 1. ДНК 2. белок 3. белок белок (3 раза) 1. белок 2. ДНК 3.ДНК

Пролиферация Т-клеток, ИСП 14±6 * 4±6 7±5 4±2 10±4

Секреция IFN-y (количество спотов/106 клеток), ELISpot 38±16 0 8±4 0 4±3

Секреция IFN-y (пг/мл), ИФА 3±1 27±И 0 6±2 0

Секреция IL-2 (пг/мл), ИФА 8±2 10±4 25±4 5±2 3±1

Секреция TNF-a (пг/мл), ИФА 2±0 2±1 4±1 4±2 2±1

Мультиэпитопность ** 11/15 3/15 5/15 1/15 3/15

Содержание CD4+ (%) 25±3 22±4 25±3 19±1 19±1

Содержание CD8+ (%) 6.6±1.0 5.9±1.0 6.9±1.3 5.3±0.6 5.1±0.5

Титр aiiTH-NS5A антител 2263±2 И2±3 50±1 25000±10 112±3

Соотношение антител IgG2a/IgGI 4,1 4,3 7,8 0,2 2,6

Примечания: * М±т; ** количество NSSA-антигенов из 15 тестированных, стимулирующих продукцию двух и более цитокинов одновременно (в ИФА или ELISpot); выделены статистически достоверные (р<0,05) различия с контрольной группой (парное сравнение по критерию Уилкоксона). Рекомбинантный белок rNS5A вводили в дозе 1,4 мкг на мышь внутрибрюшинно в виде конъюгата с иммуномаксом, flHKNS5A- 100 мкг/мышь внутримышечно в смеси с иммуномаксом

выводы

1. Впервые на белках core, NS3, NS4A, NS4B и NS5A вируса гепатита С (ВГС) определена локализация 22 антигенных детерминант, взаимодействующих с моноклональными антителами (МКА). Установлено, что большинство эпитопов (16) являются конформационно-зависимыми, 6 эпитопов выявляют линейные участки вирусных белков.

2. Впервые установлены особенности экспрессии белков ВГС в печени при различных формах гепатита С. При ХГС показана прямая зависимость между накоплением белка NS5A в печени, выработкой антител к этому белку, увеличением гистологической активности и развитием фиброза (р<0,05), что позволяет рассматривать NS5A как один из маркеров повреждения печени. При ОГС выявлена прямая зависимость между накоплением белков core, NS3 и NS5A в гепатоцитах и некрозо-воспалительными изменениями ткани печени (р<0,05).

3. Сравнительный анализ структурных и неструктурных белков ВГС в печени показал, что при ОГС белки встречались с частотой 89-95%, при ХГС - 2865%. Среднее количество ВГС-содержащих клеток печени при ОГС превышает таковое при ХГС: 51±7% против 33±3% (р=0,006). Полученные данные прямо свидетельствуют о более высокой активности репликации ВГС при ОГС по сравнению с ХГС.

4. В мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) больных ХГС геномная РНК ВГС выявляется достоверно чаще, чем в сыворотке крови (94,6% против 76%, р=0,029). Белки ВГС найдены у 86% больных ХГС преимущественно в моноцитах (до 32% популяции), в меньшей степени -в лимфоцитах (до 5% популяции). Накопление белков ВГС в МКПК ассоциируется с уменьшением количества мононуклеаров (г= -0,66, р=0,001), повышением активности AJIT (р<0,05) и присутствием репликативной формы РНК ВГС в МКПК (р<0,05).

5. Частота выявления белка core ВГС в ткани печени и МКПК значительно ниже, чем в сыворотке крови (28 и 44%, соответственно, против 71%, р<0,05). Наличие соге-белка в периферической крови прямо коррелирует с гистологической и биохимической активностью, а также со стадией ХГС (р<0,05). Результаты определения соге-белка в сыворотках статистически значимо связаны с обнаружением геномной РНК ВГС; в клетках крови и печени - репликативной формы РНК ВГС (р<0,05).

6. У больных гепатитом С на МКПК статистически значимо по сравнению с ВГС-негативными донорами крови повышена экспрессия рецептора Fas-зависимого апоптоза CD95+ (р<0,05). Выявлена негативная корреляция между количеством С095+-лимфоцитов и степенью накопления в клетках печени белков ВГС: core и NS4A - при ХГС (р<0,05), NS3, NS4A и NS5A -при ОГС (р<0,05). При ХГС относительное содержание С095+-лимфоцитов у больных с виремией в 2 раза больше, чем у больных без виремии (р<0,05).

7. У больных гепатитом С по сравнению с ВГС-негативными донорами крови установлено статистически значимое (р<0,05) повышение концентраций

растворимых форм дифференцировочных антигенов в сыворотке крови: sFas, sCD38, sHLA-I и sHLA-DR - при ОГС, sFas и sCD38 - при ХГС. Выявлена прямая корреляция между концентрациями sFas, sHLA-I и накоплением белков ВГС в клетках печени больных гепатитом С (г=0,3-0,4, р<0,05). Уровень sFas достоверно выше у больных ОГС с генотипами 1а и lb ВГС по сравнению с генотипами 2а и За (462±120 и 148±29 УЕ/мл, соответственно, р<0,05).

8. У больных ХГС наблюдается нарушение иммунного статуса, которое проявляется в статистически значимом (р<0,05) снижении относительного количества субпопуляций лимфоцитов с маркерами CD4+ (Th) и CD16+ (NK), а также иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+ по сравнению с ВГС-негативными донорами. У больных ОГС, кроме этого, статистически значимо увеличена субпопуляция CD8+ (CTL). При ОГС сокращение количества С016+-лимфоцитов ассоциировано с более активной экспрессией белков NS3 и NS5A ВГС в печени (г= -0,7, р<0,05), a CD4+-лимфоцитов - с повышенным содержанием sFas (г= -0,52; р<0,05) и sHLA-DR (г= -0,56; р<0,05) в сыворотке крови.

9. У больных гепатитом С по сравнению с ВГС-негативными донорами крови выявлен дисбаланс цитокинов, продуцируемых Thl и Th2 Т-клетками. Он заключается в гиперпродукции IL-6, IL-10 и TNF-ав сыворотках крови (р<0,001). Кроме этого, при ХГС наблюдается повышение концентрации IL-4 (р=0,02), а при ОГС - повышение IL-8 (р<0,002) и понижение - IL-2 (р=0,035). Рекомбинантные белки ВГС значительно слабее стимулируют секрецию клетками крови in vitro цитокинов IL-2, IFN-y и TNF-a, чем конканавалин А (р<0,01).

10. При исследовании гуморального ответа установлено, что частота встречаемости и активность антител к белку NS5A статистически значимо выше у пациентов с большей гистологической и биохимической активностью и стадией ХГС, а также у больных ОГС с последующей хронизацией заболевания (р<0,05). Эти данные позволяют рассматривать наличие антител к NS5A как неблагоприятный признак при гепатите С.

11. Анализ полученных вирусологических и иммунологических данных выявил новые прогностические критерии для оценки исхода ОГС. Показано, что предвестниками реконвалесценции в течение первого месяца от начала заболевания служат: высокий уровень экспрессии белков NS4A и NS3 в печени; низкая концентрация (<20 УЕ/мл) sCD38 в сыворотке; отсутствие антител к NS5A; низкая концентрация (<40 пг/мл) соге-белка в сыворотке.

12. На основе полученных МКА разработан комплекс иммунохимических методов, которые позволили: а) выявлять белки ВГС в инфицированных клетках печени и крови in situ', б) обнаруживать белки ВГС в лизатах клеток и тканей; в) определять белок нуклеокапсида в сыворотках крови и дифференцировать безоболочечные нуклеокапсиды, вирионы ВГС и иммунные комплексы.

13. Разработан дизайн экспериментальной кандидатной мультиэпитопной вакцины против гепатита С. Вакцинная композиция включает: специфические компоненты ВГС (ДНК-плазмиду и рекомбинантные белки) и новый оригинальный отечественный адъювант иммуномакс. Установлено, что трехкратное введение комплексной вакцины лабораторным животным стимулирует интенсивный клеточный и гуморальный иммунный ответ к широкому спектру эпитопов ВГС.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Масалова О.В., Атанадзе С.Н., Калинина Т.И. и др. Иммунохимические свойства и специфичность моноклональных антител в отношении N- и С-концевых участков рекомбинантного белка нуклеокапсида вируса гепатита С (HCcAg).//Bonpocbi вирусологии. - 1996. - Т.41. - №4. - С.150-153.

2. Масалова О.В., Логинов A.C., Атанадзе С.Н. и др. Иммунохимическое выявление белков вируса гепатита С в печени с помощью моноклональных антител.//Российский гастроэнтерологический журнал. - 1997. - №3. - С. 15-23

3. Masalova O.V., Atanadze S.N., Samokhvalov E.I. et al. Detection of Hepatitis С virus core protein circulating within different virus particle population.//Journal of Medical Virology. -1998. - V.55. - №1. - P.l-6.

4. Масалова O.B., Шепелев A.B., Атанадзе С.Н. и др. Иммуностимулирующее действие водорастворимых производных фуллерена - перспективных адьювантов для вакцин нового поколения.//Доклады Академии Наук. - 1999. -Т.369. - №3. - С.411-413.

5. Масалова О.В., Самохвалов Е.И., Петракова Н.В. и др. Выявление маркеров вируса гепатита С - белка нуклеокапсида вируса гепатита С, РНК и вирусспецифических антител в плазмах доноров.//Вопросы вирусологии. -2000. - Т.45. - №2. - С.12-18.

6. Лакина Е.И., Самохвалов Е.И., Левченко О.Г., Масалова О.В. и др. Выявление положительных (геномных) и отрицательных (репликативных) цепей РНК вируса гепатита С в сыворотке крови, лимфоцитах и ткани печени больных хроническим гепатитом С с помощью полимеразной цепной реакции.//Вопросы вирусологии. - 2000. - Т.45. - №4. - С.37-42.

7. Лакина Е.И., Масалова О.В., Абдулмеджидова A.A., Кущ A.A. Вирусная нагрузка и тяжесть заболевания гепатитом С - есть ли связь?//Вирусные гепатиты - достижения и перспективы. - 2001. - №3. - С.11-16.

8. Значение выявления РНК вируса гепатита С в различных субстратах у больных хроническим гепатитом С./Ющук Н.Д., Климова Е.А., Знойко О.О., Пылева О.Г., Келли Е.И., Чешик Д.С., Брагинский Д.М., Лакина Е.И., Масалова О.В., Кущ А.АУ/Клиническая медицина. - 2001. - Т.79. - №12. - С.24-28.

9. Абдулмеджидова А.Г., Масалова О.В., Атанадзе С.Н. и др. Характеристика панели моноклональных антител к рекомбинантному белку NS3 вируса гепатита С.//Вопросы вирусологии. - 2002. - Т.47. - №1. - С.21-25.

10. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Атанадзе С.Н. и др. Характеристика панели моноклональных антител и эпитопное картирование белков вируса гепатита С.//Доклады Академии Наук. - 2002. - Т.383. - №4. - С.545-550.

11. O.V. Masalova, E.I. Lakina, A.G. Abdulmedzhidova et al. Characterization of monoclonal antibodies and epitope mapping of the NS4 protein of hepatitis С virus.//Immunology Letters. - 2002. - V.83. - №3. - P.187-196.

12. Масалова О.В., Кущ A.A. Моноклональные антитела к белкам вируса гепатита С - инструмент для картирования антигенных детерминант, диагностики гепатита С и изучения вирусного патогенеза.//Российский биотерапевтическни журнал. - 2003. - Т.2. - №3. - С.7-24.

13. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Шкурко Т.В. и др. Анализ белков вируса гепатита С в клетках печени больных хроническим гепатитом С.//Вопросы вирусологии. - 2003. - Т.48. - №1. - С.9-14.

14. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Моргунов К.В. и др. Изменение параметров гуморального и клеточного иммунного ответа у пациентов с хроническим гепатитом С различной тяжести.//Вопросы вирусологии. - 2003. -Т.48. - №3. - С.15-19.

15. Вишневская Т.В., Масалова О.В., Шкурко Т.В. и др. Растворимые формы дифференцировочных антигенов в сыворотке крови больных гепатитом С.//Медицинская иммунология. - 2005. - Т.7. - №1. - С.33-40.

16. О.В. Масалова, Е.А. Речкина, Т.В. Шкурко и др. Белки вируса гепатита С в клетках печени при остром гепатите С: связь с повреждением печени и исходом заболевания.//Вопросы вирусологии. - 2005. - Т.50. - №4. - С.18-23.

17. Е. А. Речкина, Г. Ф. Денисова, О. В. Масалова и др. Картирование антигенных детерминант белков вируса гепатита С при помощи технологии фагового дисплея.//Молекулярная биология. - 2006. - Т.40. - №2. - С.357-368.

18. О.В. Масалова, Т.В. Вишневская, Т.В. Шкурко и др. Сравнительный анализ соге-белка вируса гепатита С в образцах плазмы и сывороток крови ВГС-инфицированных доноров крови и больных гепатитом С.//Вопросы вирусологии. - 2007. - Т. 52. - №4. - С.11-17.

19. Вишневская Т.В., Масалова О.В., Альховский С.В. и др. Выявление маркеров репликации вируса гепатита С в мононуклеарных клетках периферической крови больных хроническим гепатитом С.//Медицннская иммунология. - 2008. - Т. 10.-№4-5.-С. 397-404.

20. О.В. Масалова, Е.И. Леснова, A.B. Пичугин и др. Исследование иммуногенности ковалентных конъюгатов неструктурных белков вируса гепатита С с иммуномаксом.//Иммунология. - 2008. - Т. 29. - №6. - С.338-345.

21. Масалова О.В., Вишневская Т.В., Кущ A.A. Моноклональное антитело, иммунореактивное с белком нуклеокапсида (кор) вируса гепатита С - 4G5, способ диагностики ВГС-инфекции и комбинация моноклональных антител для его осуществления./Патент на изобретение № 2329303 от 20.07.2008 г.// Бюллетень «Изобретения. Полезные модели». - 2008. - №20. - С.1-8.

22. Masalova O.V., Lesnova E.I., Pichugin A.V. et al. Peptidoglycane Immunomax increases humoral and cell immune responses of mice to recombinant proteins of hepatitis С virus.//MEDIMOND International Proceedings, ed. R.E. Schmidt. -2009. - P.469-472.

23. О.В. Масалова, Е.И. Леснова, B.B. Грабовецкий и др. ДНК-иммунизация плазмидой, содержащей ген белка NS5A вируса гепатита С, индуцирует эффективный клеточный иммунный отвег.//Молекулярная биология. - 2010. -Т. 44. - № 2. - С.275-283.

24. O.V. Masalova, E.I. Lesnova, A.V. Pichugin et al. The successful immune response against hepatitis С nonstructural protein 5A (NS5A) requires heterologous DNA/protein immunization.//Vaccine. - 2010. - V.28. - №8. - P.I987-1996.

Благодарности

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую признательность за содействие в проведении исследований, внимание к работе, ценные рекомендации и теплое отношение моему научному консультанту - доктору биологических наук, профессору Алле Александровне Кущ.

Автор благодарен дирекции НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского за предоставленную возможность выполнения работы.

Благодарю за активную помощь в исследованиях, результатом которых явилась данная работа, как ныне работающих, так и бывших сотрудников лаборатории клеточной инженерии НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского: к.м.н. Атанадзе С.Н., к.б.н. Вишневскую Т.В., Леснову Е.И., к.м.н. Абдулмеджидову А.Г., к.б.н. Речкину Е.А., к.б.н. Лакину Е.И.

Искренне признательна за плодотворное сотрудничество и участие в выполнении отдельных фрагментов работы сотрудникам нашего института (к.б.н. Самохвалову Е.И., к.б.н. Альховскому C.B., д.б.н., проф. Забережному А.Д., к.х.н. Исагулянц М.Г., к.б.н. Петраковой Н.В.), а также сотрудникам следующих учреждений:

ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России - д.м.н., проф. Атауллаханову Р.И. и к.б.н. Пичугину A.B.;

ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России -д.м.н., проф. Голосовой Т.В., д.б.н., проф. Филатову Ф.П., к.б.н. Гаранжа Т.А., к.б.н. Туполевой Т.А., к.м.н. Сомовой A.B.;

Московский онкологический институт им. П.А. Герцена - чл.-корр. РАМН, д.м.н., проф. Франку Г.А., д.б.н. Завалишиной Л.Э.;

Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН - к.б.н. Иванову A.B.;

Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского -д.б.н., проф. Новикову В.В.

Отдельная благодарность клиницистам: к.м.н. Шкурко Т.В. (Консультативное гепатологическое специализированное отделение при ИКБ №1 г. Москвы, рук. - д.м.н., проф. Блохина Н.П.), Келли Е.И. (ИКБ №1 г. Москвы, гл. врач - д.м.н., проф. Малышев H.A.), д.м.н., проф. Знойко О.О., д.м.н., проф. Климовой Е.А., к.м.н. Пылевой О.Г. (МГМСУ, ИКБ №1 г. Москвы) - за предоставленную возможность для исследований и оценку клинического состояния обследованных больных.

Искренне благодарна глубокоуважаемым оппонентам (академик РАМН, д.б.н., проф. Зверев В.В., д.м.н., проф. Михайлов М.И., д.б.н., проф. Наровлянский А.Н.) и рецензентам (д.м.н., проф. Знойко О.О., д.б.н., проф. Наровлянский А.Н., д.б.н., проф. Маныкин A.A.) за внимательное рассмотрение диссертационной работы и конструктивные замечания.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - аланинаминотрансфераза

АГ - антиген, АГ+ - антиген-позитивный

а.о. - аминокислотный остаток

АТ - антитело

ВГС - вирус гепатита С

ГМДП - глюкозаминил-

мурамилдипептид

ДАБ - 3,3'-диаминобензидин

ИГА - индекс гистологической

активности

ИГХ - иммуногистохимия ИК - иммунные комплексы ИПО - иммунопероксидазное окрашивание

ИСП - индекс стимуляции пролиферации

ИФ, Р - индекс фиброза

ИФА - иммуноферментный анализ

КонА - конканвалин А

МКА - моноклональные антитела

МКПК - мононуклеарные клетки

периферической крови

ОГС - острый гепатит С

ОП - оптическая плотность

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция-

полимеразная цепная реакция

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ПБП - пункционная биопсия печени

ПХ - пероксидаза хрена

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РБТЛ - реакция бласттрансформации

лимфоцитов

ТМБ - тетраметилбензидин гидрохлорид УЕ - условная единица ФИТЦ - изотиоционат флуоресцеина ХГС - хронический гепатит С

А - аланин И - аргинин N - аспарагин О - аспарагиновая кислота С - цистеин

Е - глутаминовая кислота

0 - глутамин в - глицин Н - гистидин

1 - изолейцин

AI - гидроокись алюминия

CD - маркеры дифференцировки

лимфоцитов

CD3+ - Т-лимфоциты

CD4+, Th - Т-хелперы

CD8+, CTL - цитотоксические Т-

лимфоциты

CD16+, NK - натуральные киллеры CD19+- В-клетки

С6о-АКК - производное фуллерена С6оС натриевой солью аминокапроновой кислоты С60-ГМДП - производное фуллерена С6о с ГМДП

ELISpot - (enzyme-linked immunosorbent spot) полуколичественный метод определения цитокин-секретирующих клеток

GM-CSF - гранулоцитарно-макрофа-гальный колониестимулирующий фактор GST - глутатион-8-трансфераза HLA -лейкоцитарный антиген человека IFN - интерферон Ig - иммуноглобулин IL - интерлейкин

LN - интралобулярный (внутридольковый) некроз

М±ш - среднее ± стандартная ошибка

NS - неструктурный белок

PBS - 0,1 М фосфатно-солевой буфер

PMN - ступенчатый (перипортальный)

некроз

s - растворимые формы антигенов Thl - Т-хелперы 1 типа Th2 - Т-хелперы 2 типа TNF - фактор некроза опухоли

L - лейцин К - лизин М - метионин F - фенилаланин Р - пролин S - серин Т - треонин W - триптофан

Y - тирозин

V - валин

Заказ № 08-П/04/2011 Подписано в печать 27.04.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maiUinfo%cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Масалова, Ольга Владимировна, Москва

Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д. И. Ивановского

05201151141

Масалова Ольга Владимировна

ВИРУСНЫИ ГЕПАТИТ С: НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ПАТОГЕНЕЗА И РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ И

ПРОФИЛАКТИКИ

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

03.02.02 - Вирусология

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Кущ А.А.

Москва, 2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ВИРУС ГЕПАТИТА С: ПАТОГЕНЕЗ, ДИАГНОСТИКА И

ПРОФИЛАКТИКА........................................................................................................................18

1.1. Эпидемиология и клиническое течение гепатита С.............................18

1.2. Молекулярная организация вируса гепатита С................................................25

1.2.1. Структура вириона..................................................................................................................................25

1.2.2. Организация вирусного генома................................................................................................26

1.2.3. Структура и функции вирусных белков..............................................................................28

1.2.4. Жизненный цикл ВГС....................................................................................................................46

1.2.5. Антигенная структура белков ВГС и методы картирования В-клеточных эпитопов................................................................................................................................................48

1.3. Иммунопатогенез вирусного гепатита С..............................................................54

1.3.1. Врожденный иммунный ответ..................................................................................................54

1.3.2. Адаптивный иммунный ответ..................................................................................................55

1.3.3. Иммунный статус больных гепатитом С............................................................................64

1.3.4. Лечение гепатита С........................................................................................................................75

1.3.5. Вирусные и хозяйские факторы, связанные с исходом ОГС и эффективностью IFN-терапин..................................................................................................77

1.4. Разработка вакцин против гепатита С........................................................................78

1.5. Молекулярные основы диагностики гепатита С..........................................84

1.5.1. Определение маркеров ВГС в сыворотке крови............................................................84

1.5.2. Выявление ВГС в инфицированных клетках больных гепатитом С..................91

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................................97

2.1. Характеристика клинического материала..........................................................97

2.2. Лабораторные животные и клеточные линии..................................................101

2.3. Основные материалы (рекомбинантные белки, синтетические пептиды, ДНК-конструкции, адъюванты)............................................................101

2.4. Получение гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА) к рекомбинантным белкам вируса гепатита С.. 106

2.5. Биохимические и иммунохимические методы исследования............107

2.5.1. Определение концентрации белка..........................................................................................107

2.5.2 Изотипирование MICA..................................................................................................................107

2.5.3. Очистка МКА из асцитных жидкостей................................................................................107

2.5.4. Приготовление конъюгатов........................................................................................................107

2.5.5. Подготовка биологического материала................................................................................108

2.5.6. Иммуноферментный анализ (ИФА)......................................................................................110

2.5.7. Реакция иммунофлюоресценции.........................................................................113

2.5.8. Иммуногистохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание in situ... 113

2.5.9. Выявление белков ВГС в МКПК методом проточной цитофлюориметрии.. 115

2.5.10. Иммуноблоттинг и иммунодот................................................................................................115

2.5.11. Истощение МКА и сывороток..................................................................................................116

2.6. Картирование антигенных детерминант белков ВГС с помощью технологии фагового дисплея........................................................................................116

2.7. Иммунологические методы исследования........................................................117

2.7.1. Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ)......................................................117

2.7.2. Определение содержания популяций лимфоцитов......................................................118

2.7.3 ELISpot....................................................................................................................................................118

2.7.4. Определение содержания цитокинов....................................................................................119

2.7.5. Определение содержания растворимых форм дифференцировочных антигенов................................................................................................................................................1X9

2.8. Детекция РНК вируса гепатита С и генотипирование ВГС................120

2.9. Статистическая обработка результатов..................................................................121

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ГШИТОП ПАЯ

СПЕЦИФИЧНОСТЬ МКА.....................................................................................122

3.1. Получение МКА к рекомбинанатным белкам core, NS3, NS4 и NS5 ВГС............................................................................................................................................122

3.2. Иммунохимические свойства МКА..........................................................................123

3.3. Эпитопная специфичность МКА................................................................................123

3.4. Взаимодействие MICA с денатурированными антигенами..................128

3.5. Реципрокный конкурентный анализ МКА........................................................130

3.6. Конкуренция МКА с антителами в сыворотках больных гепатитом С....................................................................................................................................133

3.7. Картирование антигенных детерминант с помощью технологии фагового дисплея........................................................................................................................134

ГЛАВА 4. ВЫЯВЛЕНИЕ ВГС В МАТЕРИАЛАХ ОТ БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С.. 140

4.1. Детекция РНК ВГС в материалах от больных гепатитом С................140

4.2. Экспрессия вирусных белков в клетках печени у пациентов с острым и хроническим гепатитом С........................................................................142

4.3. Детекция белков ВГС в мононуклеарных клетках периферической крови..........................................................................................................156

4.3.1. Выявление белков ВГС в клетках крови in situ..............................................................156

4.3.2. Анализ белков ВГС в клетках крови методом проточной цитометрии............159

4.4. Обнаружение белков ВГС в лизатах инфицированных клеток.... 162

4.5. Количественное определение содержания белка core ВГС в сыворотке и плазме крови................................................................................................164

4.5.1. Разработка метода выявления соге-белка ВГС..............................................................164

4.5.2. Анализ содержания соге-белка в сыворотках больных гепатитом С

171

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ВГС-ИНФЕКЦИЮ И АНАЛИЗ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА БОЛЬНЫХ ГЕПАТИТОМ С.............................................................. 178

5.1. Активность антител к белкам ВГС в сыворотке и плазме крови.. 178

5.2. Анализ относительного содержания различных популяций

клеток крови................................................................ 180

5.3. Изменение содержания растворимых форм дифференцировочных антигенов в сыворотках крови больных гепатитом С................................................................. 183

5.4. Цитокиновый профиль больных гепатитом С........................ 189

ГЛАВА 6. ИНДУКЦИЯ И АНАЛИЗ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ИММУНИЗАЦИЮ МЫШЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫМИ БЕЛКАМИ

ВГС, ОТДЕЛЬНЫМИ ДЕТЕРМИНАНТАМИ И ДНК- ^

КОНСТРУКЦИЯМИ.........................................................

6.1. Иммунный ответ на введение рекомбинантных белков........................193

6.2. Иммунный ответ при иммунизации мышей ВГС-специфическими фагами и синтетическими пептидами........................203

6.3. Анализ иммунного ответа на ДНК-иммунизацию......................................207

6.4. Сочетанная иммунизация животных рекомбинантными белками и ДНК-конструкциями....................................................................................215

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ....................................................................234

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................................................................295

ВЫВОДЫ........................................................................................................................................................................297

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................300

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - аланинаминотрансфераза

АГ - антиген, АГ+ - антиген-позитивный

АД - антигенная детерминанта

а.о. - аминокислотный остаток

АПК - антигенпрезентирующая клетка

АСТ - аспартатаминотрансфераза

АТ - антитело

БСА — бычий сывороточный альбумин

ВГС - вирус гепатита С

ВПЧ - вирусоподобная частица

ГГТП - у-глутамилтранспептидаза

ГМДП - глюкозаминил-мурамилдипептид

ГС - гепатит С

ДАБ - 3,3'-диаминобензидин

ИГА - индекс гистологической активности

ИГХ - иммуногистохимические методы

И К - иммунные комплексы

ИКК - иммуннокомпетентные клетки

ИПО - иммунопероксидазное окрашивание

ИСП — индекс стимуляции пролиферации

ИФ, Е - индекс фиброза

ИФА - иммуноферментный анализ

КонА - конканвалин А

ЛПК - лимфоциты периферической крови

МЕ - международные единицы

МКА — моноклональные антитела

МКПК - мононуклеарные клетки

периферической крови

мРНК - матричная РНК

НАФ - неполный адъювант Фрейнда

НТР - нетранслируемый регион

ОГС — острый гепатит С

ОП - оптическая плотность

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция-

полимеразная цепная реакция

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

ПБП - пункционная биопсия печени

ПХ - пероксидаза хрена

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РБТЛ - реакция бласттрансформации

лимфоцитов

ТМ - трансмембранный домен

ТМБ - тетраметилбензидин гидрохлорид

УЕ - условная единица

ФИТЦ - изотиоционат флюоресцеина

ХГС - хронический гепатит С

ЭКС - эмбриональная сыворотка крупного

рогатого скота

ЭР - эндоплазматический ретикулум

AI - гидроокись алюминия

Р-МЕ - р-меркаптоэтанол

Сбо-АКК - производное фуллерена С6о с

натриевой солью аминокапроновой кислоты

Сбо-ГМДП - производное фуллерена Сбо с

ГМДП

CD - маркеры дифференцировки

лимфоцитов

CD3+ — Т-лимфоциты

CD4+, Th - Т-хелперы

CD8+, CTL - цитотоксические Т-лимфоциты CD16+, NK - натуральные (естественные) киллерные клетки CD19+ — В-клетки

CTLA - (cytotoxic Т lymphocyte antigen) -

цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген

DC - дендритные клетки

ELISpot - (enzyme-linked immunosorbent

spot) полуколичественный метод

определения цитокин-секретирующих клеток

GFP—зеленый флюоресцентный белок

GM-CSF — гранулоцитарно-макрофагальный

колониестимулирующий фактор

GST - глутатион-Б-трансфераза

HLA - (Human Leukocyte Antigens) -

лейкоцитарный антиген человека

HVR - гипервариабельный регион

IFN - интерферон

Ig — иммуноглобулин

IL - интерлейкин

1RES - (Internal Ribosome Entry Site) -участок внутренней посадки рибосомы ISDR - (interferon sensitivity determining region) — сайт устойчивости к интерферону LDLR - рецептор липопротеинов низкой плотности

LN — интралобулярный (внутридольковый) некроз

М±т — среднее ± стандартная ошибка

МНС - (Major Histocompatibility Complex) -

главный комплекс гистосовместимости

NS - неструктурный белок

NTPase — нуклеотид трифосфатаза

OAS -2-5' олигоаденилсинтетаза

ORF - (open reading frame) - открытая рамка

считывания

РАР — пероксидаза-антипероксидаза

PBS - фосфатно-солевой буфер, PBST - PBS

с добавлением 0,1% твин-20

РКЯ - с^РНК-зависимая протеинкиназа Р]УЕЧ - ступенчатый (пери портальный) некроз

К(Шр - (КМА-с1ерепс1еп1 ИЫА-ро1утеп5е) -РНК-зависимая РНК-полимераза ИТ - комнатная температура в - растворимые формы антигенов вБ - стандартное отклонение

SDS - додецилсульфат натрия

TCR - Т-клеточный рецептор

ТЫ - Т-хелперы 1 типа

Th2 - Т-хелперы 2 типа

TLR - (Toll-like receptor) - То11-подобный

рецептор

TNF - фактор некроза опухоли Treg - Т-регуляторные клетки

А - аланин R - аргинин N - аспарагин D - аспарагиновая кислота С - цистеин

Е - глутаминовая кислота Q - глутамин G - глицин Н - гистидин I - изолейцин

L — лейцин К - лизин М - метионин F — фенилаланин Р - пролин S - серин Т - треонин W - триптофан

Y - тирозин

V - валин

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Гепатит С по оценкам экспертов ВОЗ и Европейского Союза относится к трем наиболее важным социально значимым инфекционным заболеваниям человека и является одной из главных причин хронических заболеваний печени. Около 3% человеческой популяции на Земле (примерно 170 млн. человек) инфицировано вирусом гепатита С (ВГС), и ежегодно около 3-4 млн. человек вновь инфицируется [Albeldawi et al., 2010]. Современные проявления эпидемического процесса при гепатите С характеризуются снижением частоты острых форм этой инфекции, но ростом числа лиц с наличием антител к ВГС в крови, а также увеличением числа микст-инфекций (в том числе сочетание ВГС- и ВИЧ-инфекции); отмечается также изменение возрастного состава больных, структуры путей передачи ВГС, увеличение показателей смертности от хронических гепатитов и цирроза печени [Михайлов М.И., Шахгильдян И.В., 2007, Шахгильдян И.В. и др., 2008]. Гепатит С характеризуется высокой частотой формирования хронической инфекции (до 70% - 80% острых форм переходят в хронический гепатит) и широким спектром клинических проявлений. Тяжесть заболевания варьирует от бессимптомного носительства до тяжелых форм с повреждением печени, прогрессирующим в цирроз и гепатоцеллюлярную карциному. Кроме того, с хроническим гепатитом С (ХГС) связывают многочисленные внепеченочные проявления, что позволяет рассматривать гепатит С как системное заболевание [Bowen, Walker, 2005, Heller, Rehermann, 2005]. Эффективность комбинированного лечения больных ХГС с помощью пегилированного интерферона-альфа (IFN-a) с рибавирином не превышает 50%, к тому же данная терапия сопряжена с серьезными побочными эффектами [Ghany et al., 2009].

За 20 лет интенсивных исследований со времени открытия ВГС определены структура вирусного РНК-генома и функции значительной части кодируемых им белков. Несмотря на успехи в изучении молекулярно-биологических свойств вируса, до сих пор не существует единой концепции патогенеза ВГС-

инфекции и ясного понимания механизма повреждающего действия ВГС на клетки печени. По-прежнему, не совсем ясно, какие факторы вируса и хозяина определяют исходы острого гепатита С (ОГС) - реконвалесценцию или формирование хронической инфекции, а также обусловливают прогрессирующее в цирроз течение ХГС [Sumida et al., 2010, Wadhawan et al., 2010]. Возможности изучения структуры ВГС и патогенеза заболевания ограничены сложностями культивирования вируса in vitro и узким кругом восприимчивых к вирусу животных. Большинство исследователей полагает, что ВГС не обладает прямым цитопатогенным действием, и главным фактором хронизации и прогрессирования заболевания является нарушение Т-клеточного ответа, а именно дисбаланс в соотношении ТЫ и Th2 лимфоцитов и секретируемых ими цитокинов [Albeldawi et al., 2010, Sharma, 2010].

Белки вируса изучены недостаточно в связи с их малой доступностью, так как ВГС циркулирует и накапливается в организме больных в низких концентрациях. Сведения о воздействии белков ВГС на клетки и организм противоречивы: вирусные белки могут супрессировать или усиливать иммунный ответ, ингибировать или индуцировать апоптоз [Irshad, Dhar, 2006, Pindel, Sadler, 2010, Siavoshian et al., 2005, Tang, Grisé, 2009]. До сих пор не выяснена функциональная роль белков ВГС в формировании хронического гепатита, а также не выявлены маркеры инфекции, ассоциированные с активностью и стадией ХГС. Выяснение структуры и свойств вирусных белков необходимо как для решения теоретических проблем (локализация антигенных и иммуногенных детерминант, определение протективных эпитопов), так и для решения задач практической медицины - создания профилактических средств, терапевтических препаратов и диагностических тест-систем.

Актуальной проблемой здравоохранения является усовершенствование диагностики гепатита С. Для ограничения распространения ВГС-инфекции особое значение имеет обнаружение ВГС в крови и продуктах крови. Серодиагностика, основанная на определении специфических антител к вирусным белкам, сегодня является одним из основных методов диагностики

ВГС-инфекции. Однако, одного этого теста недостаточно, поскольку антитела не выявляются на ранних стадиях инфицирования вирусом (фаза серонегативного «окна» продолжительностью до нескольких месяцев), а также при иммунодефицитных состояниях [Daniel et al., 2008]. Высокий уровень антигенной вариабельности ВГС может обусловливать ложноотрицательные результаты. Возможно также получение ложноположительных результатов за счет перекрестно-реагирующих детерминант [Pawlotsky, 2003]. Часто отмечаются несовпадения в результатах тестирования контрольных панелей сывороток с помощью различных тест-систем [Chen, Morgan et al., 2006, Chou et al., 2004]. В основе перечисленных недостатков - использование в тест-системах рекомбинантных белков и пептидов, недостаточно точно моделирующих антигенную структуру возбудителя, а также неполное знание особенностей взаимодействия ВГС с иммунной системой хозяина.

Индикация анти-ВГС антител, в основном, решает задачу этиологического диагноза, но не характеризует течение инфекции и не решает задачу прогноза исхода заболевания. По этим причинам важным является развитие методов прямого определения вируссп�

Информация о работе

Масалова, Ольга Владимировна
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.02

Диссертация

Вирусный гепатит С: новые подходы к изучению патогенеза и разработка средств диагностики и профилактики - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы