Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование и иммунологическая характеристика рекомбинантных полипептидов, содержащих антигенные детерминанты белков вируса гепатита С

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гринев, Андриян Анатольевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1 Клинические особенности гепатита С.

2.2 Молекулярная характеристика генома вируса гепатита С.

2.2.1 Структурные белки ВГС.

2.2.2 Неструктурные белки ВГС.

2.2.3 Нетранслируемый участок генома ВГС.

2.3 Вариабельность вируса гепатита С и связанные с ней проблемы лабораторной диагностики.

2.3.1 Изменчивость вирусного генома.

2.3.2 Диагностика вирусного гепатита С.

2.3.2.1 Детекция антител к белкам ВГС.

2.3.2.2 Определение РНК ВГС.

2.3.2.3 Изменчивость генома ВГС и диагностика.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 МАТЕРИАЛЫ.

3.2 МЕТОДЫ.

3.2.1 Компьютерный анализ генома вируса гепатита С.

3.2.2 Методы генной инженерии.

3.2.3 Иммунологические методы.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Компьютерный анализ генома вируса гепатита С поиск потенциальных антигенных детерминант вирусных белков.

4.1.1 Белок Core вируса гепатита С.

4.1.2 Белок NS3 вируса гепатита С.

4.1.3 Белок NS4 вируса гепатита С.

4.1.4 Белок NS5a вируса гепатита С.

4.2 Сборка и клонирование фрагментов генома вируса гепатита С.

4.2.1 Сборка фрагмента гена Core из олигонуклеотидов.

4.2.2 Сборка фрагментов гена NS3 из олигонуклеотидов.

4.2.3 Сборка фрагментов гена NS4 из олигонуклеотидов.

4.2.4 Сборка фрагмента гена NS5a из олигонуклеотидов.

4.3 Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты белков вируса гепатита С.

4.3.1 Получение и очистка рекомбинантного белка, содержащего фрагмент белка Core вируса гепатита С.

4.3.2 Получение и очистка рекомбинантных белков, содержащих фрагменты белка NS3 вируса гепатита С.

4.3.3 Получение и очистка рекомбинантных белков, содержащих фрагменты белков NS вируса гепатита С (субтипы 1Ь,2а,За).

4.3.4 Получение и очистка рекомбинантного белка, содержащего фрагмент белка NS5 вируса гепатита С.

4.4 Изучение антигенной активности и специфичности полученных рекомбинантных белков.

4.4.1 Исследование антигенной активности рекомбинантных белков методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

4.4.2 Исследование антигенной специфичности рекомбинантных белков методом иммуноблоттинга.

4.5. Создание иммуноферментной тест-системы для определения антител к ВГС в сыворотках крови.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Конструирование и иммунологическая характеристика рекомбинантных полипептидов, содержащих антигенные детерминанты белков вируса гепатита С"

Вирусный гепатит С (ВГС) является одним из наиболее опасных заболеваний человека, передающихся парентеральным путем. Во всем мире этим вирусом инфицировано более 200 миллионов человек. Эпидемиологические данные показывают, что ежегодно выявляется более миллиона вновь заболевших гепатитом С, что позволяет отнести это заболевание к числу одного из наиболее распространенных во всем мире (Балаян М.С. и др. 1999 ).

В России и странах СНГ гепатит С распространен повсеместно, антитела к ВГС выявляются у 1,4% безвозмездных доноров, что примерно в два раза выше, чем в развитых странах Европы и США . Наибольшее распространение ВГС получил в странах Африки и Юго-восточной Азии, где число инфицированных составляет 47% О^оув. е? а/. 1997).

В настоящее время вирусный гепатит С стал рассматриваться во всем мире как чрезвычайно актуальная проблема здравоохранения. Главным образом это связано со все большим распространением методов лечения, включающих внутривенные инъекции, переливание крови и пересадку органов и тканей (РгасЫ Р. е^ а\. 2000).

Вирус гепатита С передается, в основном, через цельную кровь, компоненты крови, либо через другие жидкости и ткани тела человека. Основным фактором риска, достигающим 60%, является наркомания. Инфицирование ВГС наркоманов достигает в некоторых регионах 85% и нередко наблюдается в сочетании с инфицированием вирусами гепатитов В, О и ВИЧ (Каиг Н. eí а/. 1998, Магйпо V. е^ а/. 2001). Переливание крови и ее компонентов являются причиной развития посттрансфузионного гепатита С и составляют до 10% в спектре факторов риска. У 2% больных заражение происходит при гемодиализе и трансплантации органов (Weinstein J.S. etal. 1995)

Относительно низкий уровень виремии делает эпидемиологически менее значимыми непарентеральные механизмы передачи инфекции: сексуальные, бытовые и профессиональные контакты составляют в совокупности не более 15% фактора риска (Poel С.L. 1994 ).

Особенностью вируса гепатита С является способность к длительной персистенции в организме больного, что обуславливает 50-80% уровень хронизации инфекции. Молекулярным механизмом неполной элиминации вируса под воздействием иммунного ответа является чрезвычайная генетическая изменчивость вируса. После заражения, популяция вируса у каждого больного представлена множеством одновременно существующих генетически различающихся вариантов - квазивидов. Степень гетерогенности спектра квазивидов у конкретного больного имеет важное значение и определяет тяжесть течения гепатита и эффективность противовирусной терапии (Thimme R. et al.2001, Moorman J.P. etal. 2001, FornsX. etal. 1999).

Разнообразие вирусных генотипов создает трудности в диагностике и лечении вирусного гепатита С и отодвигает на неопределенную перспективу разработку вакцины. Разработка диагностических препаратов для выявления гепатита С неразрывно связана с историей изучения вируса, ставшей возможной только после существенного развития методов молекулярной биологии и генной инженерии.

В начале 80-х годов исследователи компании Chiron (USA) приступили к изучению ни А ни В посттрансфузионного гепатита. Вопрос о существовании нового вируса возник в 70-е годы. В то время предполагали, что случаи посттрансфузионного гепатита неизвестной этиологии вызваны вирусом гепатита

В, маркеры которого не выявлялись из-за недостаточной чувствительности использующихся тест-систем. В последующем детальный анализ ряда случаев позволил предположить существование отличной от гепатитов А и В формы посттрансфузионного гепатита, названного гепатитом ни А ни В, который и получил затем название гепатита С.

В 1988 году Choo и соавторам (Choo Q-L et al. 1989) удалось из плазмы экспериментально инфицированного шимпанзе клонировать фрагмент генома вируса гепатита С. Работа по расшифровке полного генома ВГС была успешно завершена в 1989 году, в этом же году появилась первая диагностическая тест-система «Ortho HCV ELISA», которая позволяла определять в крови больных анти-ВГС антитела класса IgG. В 1990 году японские исследователи завершили расшифровку полного генома первого японского изолята ВГС (Kato N. et al. 1990). Тогда же была создана оригинальная японская тест-система для определения антител к ВГС.

За прошедшие с той поры десять лет был достигнут значительный прогресс в изучении ВГС. Расшифрованы сотни полных и неполных последовательностей геномов вирусов гепатита С со всех регионов планеты. Показаны большая вариабельность и изменчивость ряда вирусных генов. Составлена современная классификация субтипов ВГС (Mellor J. etal. 1995).

На данный момент, повсеместно внедрены в практику различные типы диагностических препаратов, которые позволяют выявлять как антитела к вирусным белкам в крови больных ВГС, так и компоненты вируса (РНК, вирусные белки). Учитывая напряженную эпидемиологическую обстановку в СНГ и в России, разработка отечественных тест-систем и их компонентов постоянно остается крайне актуальной задачей.

К началу настоящей работы были известны лишь две полноразмерные структуры генома - американская, расшифрованная Choo и соавт. и японская -Kato и соавт. Было также известно о наличии антител к большинству вирусных белков в крови больных и бессимптомных вирусоносителей.

Целью настоящей работы являлось создание рекомбинантных полипептидов, содержащих антигенные детерминанты структурных и неструктурных белков вируса гепатита С, пригодных для лабораторной диагностики инфекции методами иммуноферментного анализа (ИФА).

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести компьютерный анализ известных структур геномов ВГС на предмет поиска потенциальных антигенных детерминант в различных вирусных белках.

2. Собрать из отдельных олигонукпеотидов фрагментов генома ВГС, кодирующих предполагаемые В-клеточные эпитопы.

3. Клонировать собранные фрагменты генома вируса и проверить соответствие нуклеотидной последовательности.

4. Получить бактериальные штаммы-продуценты рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты ВГС.

5. Выделить и очистить рекомбинантные антигены в препаративных количествах.

6. Иммунологическими методами подтвердить специфичность полученных рекомбинантных антигенов и изучить их диагностическую значимость, с целью создания на их основе диагностических препаратов для обнаружения антител к вирусу.

Научная новизна диссертации: предсказаны потенциальные антигенные детерминанты (В-клеточные эпитопы) для генов Core, NS3, NS4 и NS5 ВГС; собраны из олигонукпеотидов и проклонированы в E.coli фрагменты генома ВГС, кодирующие наиболее консервативные антигенные детерминанты белков Core, NS3, NS4 и NS5; получены бактериальные штаммы-продуценты, экспрессирующие рекомбинантные полипептиды, имитирующие основные антигенные детерминанты белков Соге(субтип 1b), NS3(cy6™n 1b), Ы54(субтипы 1b, 2a иЗа) и NS5 (субтип 1b) ВГС; исследована диагностическая значимость полученных рекомбинантных белков на охарактеризованных панелях сывороток и материалах из очагов вирусной инфекции с целью отбора пригодных для использования при лабораторной диагностике инфекции, вызываемой вирусом гепатита С. На их основе создан ряд диагностических препаратов для определения антител к белкам ВГС;

Практическая значимость. Полученные в результате данной работы рекомбинантные антигены были использованы в разработке различных вариантов наборов для определения антител к вирусу гепатита С человека. Данные наборы выпускаются ЗАО ВТК «Биосервис» на основании временной фармакопейной статьи ВФС 42-2682-96. 1996г.

Принципы и методы, разработанные в процессе выполнения работы для получения рекомбинантных антигенов, пригодных для создания иммуноферментных тест-систем, могут использоваться в вирусологии, эпидемиологии и микробиологии в решении актуальных задач, связанных с выявлением и мониторингом различных возбудителей опасных инфекционных заболеваний.

Публикация результатов исследования и апробация работы.

По материалам диссертации получены три патента РФ. Результаты исследований представлены и обсуждены на: международной конференции «СПИД, рак и ретровирусы человека»(г.Санкт-Петербург,1993), всероссийской конференции «Препараты для диагностики вирусных гепатитов» (г.Пермь,1993), VII съезде ВОЭМП (г.Москва, 1997), Международной конференции «Прогресс в клинической вирусологии» (Чехия, г.Прага, 1995), Научно-практической конференции «Гепатит С (Российский консенсус)» (г.Москва, 2000), Международном FEMS симпозиуме (Турция, г.Стамбул, 2000).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выбранные антигенные детерминанты белков Core, NS3, NS4 и NS5 вируса гепатита С являются значимыми для диагностики данного заболевания.

2. Синтезированные рекомбинантные антигены, содержащие антигенные детерминанты белков вируса гепатита С, способны специфически связываться с антителами к вирусным белкам, содержащимися в крови больных.

3. Разработанные на основе полученных рекомбинантных полипептидов тест - системы пригодны для диагностики гепатита С и проведения сероэпидемиологических исследований.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР «Молекулярная биология и генетика вируса гепатита С. Лабораторная диагностика вирусного гепатита С».

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Гринев, Андриян Анатольевич

выводы

1. Проведен компьютерный анализ аминокислотных последовательностей генов Core NS3, NS4 и NS5 различных изолятов вируса гепатита С. Выявлены консервативные антигенные детерминанты.

2. Синтезированы из олигонуклеотидов и клонированы фрагменты ДНК, кодирующие фрагменты белков Core, NS3, NS4 и NS5 вируса гепатита С субтипа 1Ь и NS4 субтипов 2а и За, содержащие предсказанные антигенные детерминанты.

3. Получены бактериальные штаммы-продуценты рекомбинантных полипептидов, содержащих антигенные детерминанты вышеуказанных белков вируса гепатита С. Рекомбинантные полипептиды выделены и очищены в препаративных количествах.

4. В реакциях ИФА и иммуноблотинга доказана диагностическая значимость полученных рекомбинантных антигенов. Сделан вывод о их пригодности для лабораторных исследований и создания иммуноферментных тест-систем.

5. На основе этих рекомбинантных антигенов созданы и выпускаются иммуноферментные диагностические препараты для выявления антител к вирусу гепатита С в сыворотках крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в ходе проведенных исследований были собраны из олигонуклеотидов и клонированы фрагменты генов Core , NS3, NS4 и NS5 вируса гепатита С субтипа 1Ь, также были клонированы фрагменты генов NS4 субтипов 2а и За. Данные участки генома были отобраны по результатам изучения антигенной структуры белков вируса с помощью компьютерного анализа аминокислотных последовательностей различных изолятов.

В результате экспрессии в бактериальной клеточной системе клонированных фрагментов генов ВГС были получены и очищены рекомбинантные полипептиды, содержащие вирусспецифические эпитопы.

Доказана антигенная специфичность полученных рекомбинантных полипептидов. На основе этих рекомбинантных антигенов создана и с 1994 года выпускается ЗАО «Биосервис» тест-система иммуноферментная «Гепаскрин» (по изменению №1 к ВФС 42-2682-96, регистрационный номер 96/94/6) для выявления антител к вирусу гепатита С в сыворотках крови.

Тест-система успешно прошла сравнительные Государственные испытания в 2000 году и рекомендована Минздравом РФ к применению в практике здравоохранения (приказ №292 от 30.07.2001 г.) для обследования доноров крови, органов и тканей человека; обследования больных острыми и хроническими гепатитами; первичного скрининга населения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гринев, Андриян Анатольевич, Москва

1.Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциклопедический словарь - вирусные гепатиты. Изд. 2-е. Москва: Амипресс. 1999. с. 302-304.

2. Гловер Д. (под редакцией). Новое в клонировании ДНК. Методы. Москва, издательство «Мир», 1989. с. 155-161.

3. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукДж. Молекулярное клонирование. Москва, издательство «Мир», 1984.

4. Abid К., Quadri R., Negro F. Hepatitis С virus, the E2 envelope protein, and alphainterferon resistance.

5. Science. 2000 Mar 3;287(5458),p.1555.

6. Alter H.J. Clinical, virological and epidemiological basis for the treatment of chronic non-A, non-B hepatitis. J Hepatol. 1990;11 Suppl 1:S,p.19-25.

7. Asabe S.I., Tanji Y., Satoh S., Kaneko Т., Kimura K., Shimotohno K. The N-terminal region of hepatitis С virus-encoded NS5A is important for NS4A-dependent phosphorylation.

8. J Virol. 1997 Jan;71 (1 ),p.790-796.

9. Barba G., Harper F., Harada Т., Kohara M., Goulinet S., Matsuura Y., Eder G., Schaff Z., Chapman M.J., Miyamura Т., Brechot C.

10. Hepatitis С virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets.

11. Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Feb 18;94(4),p. 1200-1205.

12. Bartenschlager R., Lohmann V. Replication of the hepatitis С virus.

13. Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2000 Apr;14(2),p.241-254.

14. Blum H.E. Hepatitis viruses: genetic variants and clinical significance. Int J Clin Lab Res. 1997;27(4),p.213-224.

15. Bobkov A.F., Samokhvalov E.I., Lvov D.K., Bobkova M.R., Povkrovsky V.V., Weber J.N.Absence of viral transmission in injecting drug users in Russia.1.ncet. 2001 Sep 22;358(9286),p.1016-1017.

16. Bruno S., Silini E., Crosignani A., Borzio F., Leandro G., Bono F., Asti M., Rossi S., Larghi A., Cerino A., Podda M., Mondelli M.U.

17. Hepatitis C virus genotypes and risk of hepatocellular carcinoma in cirrhosis: a prospective study.

18. Hepatology. 1997 Mar;25(3),p.754-758.

19. Bukh J., Miller R.H., Purcell R.H.

20. Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes. Semin Liver Dis. 1995 Feb;15(1),p.41-63.15.Bull H.B., Breese K.

21. Surface tension of amino acid solutions: a hydrophobicity scale of the amino acid residues.

22. Arch Biochem Biophys 1974 Apr 2;161(2),p.665-670.

23. Cacoub P., Renou C., Kerr G., Hue S., Rosenthal E., Cohen P., Kaplanski G., Charlotte F., Thibault V., Ghillani P., Piette J.C., Caillat-Zucman S.1.fluence of HLA-DR phenotype on the risk of hepatitis C virus-associated mixed cryoglobulinemia.

24. Arthritis Rheum. 2001 Sep;44(9),p.2118-2124.

25. Cavallari A., De Raffele E., Bellusci R., Miniero R., Vivarelli M., Galli S., Luchetti R., Fruet F., Giordano E., Mazziotti A., Conte R., Sprovieri G.

26. De novo hepatitis B and C viral infection after liver transplantation. World J Surg. 1997 Jan;21(1),p.78-85.

27. Chan-Fook C., Jiang W.R., Clarke B.E., Zitzmann N., Maidens C., McKeating J.A., Jones I.M. Hepatitis C virus glycoprotein E2 binding to CD81: the role of E1E2 cleavage and protein glycosylation in bioactivity.

28. Virology. 2000 Jul 20;273(1),p.60-66.

29. Charloteaux B., Lins L., Moereels H., Brasseur R.

30. Analysis of the C-Terminal Membrane Anchor Domains of Hepatitis C Virus Glycoproteins E1 and E2: toward a Topological Model. J Virol. 2002 Feb;76(4),p. 1944-1958.

31. Chayama K. Genotyping of hepatitis C virus by polymerase chain reaction with a mixedprimer set derived from nucleotide sequences of NS5 region. Nippon Rinsho. 1995 Sep;53 Suppl:321-325.

32. Choo Q-L,Kuo G., WeinerA.J., OverbyL.R., Bradley D.W., Houghton M.: Isolation of a cDNA clone derived from blood-borne non-A,non-B viral hepatitis genome. Sciencel 989;244,p.359-362.22.Damen M., Cuypers H.T.

33. Detection of hepatitis C virus RNA: application to diagnostics and research. CurrStud Hematol Blood Transfus. 1998;(62),p.76-101.

34. Davis G.L. Hepatitis C virus genotypes and quasispecies. Am J Med. 1999 Dec 27;107(6B),p.21-26.

35. Di Martino V., Rufat P., Boyer N., Renard P., Degos F., Martinot-Peignoux M., Matheron S., Le Moing V., Vachon F., Degott C., Valla D., Marcellin P.

36. The influence of human immunodeficiency virus coinfection on chronic hepatitis C in injection drug users: a long-term retrospective cohort study. Hepatology. 2001 Dec;34(6),p.1193-1199.

37. Dow B.C., Buchanan I., Munro H., Follett E.A., Davidson F„ Prescott L.E, Yap P.L., Simmonds P. Relevance of RIBA-3 supplementary test to HCV PCR positivity and genotypes for HCV confirmation of blood donors.

38. J Med Virol. 1996 Jun;49(2),p. 132-6.

39. Ebeling F. Epidemiology of the hepatitis C virus. Vox Sang. 1998;74 Suppl 2,p.143-146.

40. Errington W., Wardell A.D., McDonald S., Goldin R.D., McGarvey M.J. Subcellular localisation of NS3 in HCV-infected hepatocytes.

41. J Med Virol. 1999 Dec;59(4),p.456-462.

42. Fabrizi F., Martin P., Dixit V., Quan S., Brezina M., Kaufman E., Sra K., Mousa M., DiNello R., Polito A., Gitnick G.

43. Automated RIBA HCV strip immunoblot assay: a novel tool for the diagnosis of hepatitis C virus infection in hemodialysis patients. Am J Nephrol. 2001 Mar-Apr;21(2),p.104-111.

44. Farci P., Alter H.J., Wong D„ Miller R.H., Shih J.W., Jett B„ Purcell R.H. A long-term study of hepatitis C virus replication in non-A, non-B hepatitis. N Engl J Med. 1991 Jul 11;325(2),p.98-104.

45. Forns X., Purcell R.H., Bukh J.

46. Quasispecies in viral persistence and pathogenesis of hepatitis C virus. Trends Microbiol. 1999 0ct;7(10),p.402-10.31.Forns X., Bukh J.

47. The molecular biology of hepatitis C virus. Genotypes and quasispecies. Clin Liver Dis. 1999 Nov;3(4),p.693-716.

48. Gomez J., Martell M., Quer J., Cabot B., Esteban J.I. Hepatitis C viral quasispecies.

49. J Viral Hepat. 1999 Jan;6(1),p.3-16.

50. Hijikata M., Kato N., Ootsugama Y. et al. Hypervariable regions in the putative glycoproteins of hepatitis C virus. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991, 175, p.220-228.

51. Hijikata M., Mizushima H., Tanji Y., Komoda Y., Hirowatari Y., Akagi T., Kato N., Kimura K., Shimotohno K. Proteolytic processing and membrane association of putative nonstructural proteins of hepatitis C virus.

52. Proc Natl Acad Sci USA. 1993 Nov 15;90(22),p. 10773-10777.

53. Hoffmann R.M., Diepolder H.M., Zachoval R. et al. Mapping of immunodominant CD4+ T lymphocyte epitopes of hepatitis C virus antigens and their relevance during the course of chronic infection. Hepatology 1995, 21,p. 632-638.

54. Honda M., Kaneko S., Sakai A., Unoura M., Murakami S., Kobayashi K. Degree of diversity of hepatitis C virus quasispecies and progression of liver disease.

55. Hepatology. 1994 Nov;20(5),p.1144-1151.38.Hopp T.P., Woods K.R.

56. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc Natl Acad Sci U S A 1981 Jun;78(6),p.3824-3828.

57. Houghton M., Weiner A., Han J., Kuo G., Choo Q.L. Molecular biology of the hepatitis C viruses: implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology. 1991 Aug;14(2),p.381-388.40.Huang F„ Zhao G.Z, Li Y.

58. HCV genotypes in hepatitis C patients and their clinical significances. World J Gastroenterol. 1999 Dec;5(6),p.547-549.41.Janin J.

59. Surface and inside volumes in globular proteins. Nature 1979 Feb 8;277(5696),p.491-492.

60. Jolivet-Reynaud C., Dalbon P., Viola F., Yvon S., Paranhos-Baccala G., Piga N., Bridon L., Trabaud M.A., Battail N., Sibai G., Jolivet M.

61. HCV core immunodominant region analysis using mouse monoclonal antibodies and human sera: characterization of major epitopes useful for antigen detection. J Med Virol. 1998 Dec;56(4),p.300-309.

62. Kanai A., Tanabe K., Kohara M. Poly(U) binding activity of hepatitis C virus NS3 protein, a putative RNA helicase.

63. FEBS Lett. 1995 Dec 4;376(3),p.221-224.

64. Kato N., Hijikata M., Ootsuyama Y., Nakagawa M., Ohkoshi S., Sugimura T., Shimotohno K.; "Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis"; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990; 87,p.9524-9528.

65. Kato N., Ootsugama Y., Tanaka T. et al. Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatitis C virus. Virus Res. 1992, 22,p. 107-123.

66. Kato N., Sekiya H., Ootsuyama Y., Nakazawa T., Hijikata M., Ohkoshi S., Shimotohno K.

67. Humoral immune response to hypervariable region 1 of the putative envelope glycoprotein (gp70) of hepatitis C virus. J Virol. 1993 Jul;67(7),p.3923-3930.

68. Kato N. Lan K.H., Ono-Nita S.K., Shiratori Y., Omata M.

69. Hepatitis C virus nonstructural region 5A protein is a potent transcriptional activator.

70. J Virol. 1997 Nov;71(11),p.8856-8859.

71. Kato N. Genome of human hepatitis C virus (HCV): gene organization, sequence diversity, and variation.

72. Microb Comp Genomics. 2000;5(3),p. 129-151.

73. Kaur H., Marshalla R. Seroepidemiology of HIV, HBV, HCV and treponemal infections.

74. J Commun Dis. 1998 Mar;30(1),p.29-31.

75. Kessler H.H., Dragon E.A., Pierer K., Santner B.I., Liao Y., Stunzner D., Stelzl E., Marth E. Performance of the automated COBAS AMPLICOR system for the detection of hepatitis C virus RNA.

76. Clin Diagn Virol. 1997 Feb;7(3),p.139-145.

77. Koch J.O., Bartenschlager R. Modulation of hepatitis C virus NS5A hyperphosphorylation by nonstructural proteins NS3, NS4A, and NS4B. J Virol. 1999 Sep;73(9),p.7138-7146.

78. Koga K. Clinical aspects of cryptogenic hepatocellular carcinoma. Kurume Med J. 1998;45(1),p.105-11.

79. Kolaskar A.S., Tongaonkar P.C.

80. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens.

81. FEBS Lett 1990 Dec 10;276(1-2),p.172-174.

82. Kolykhalov A.A., Mihalik K., Feinstone S.M., Rice C.M.

83. Hepatitis C virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3' nontranslated region are essential for virus replication in vivo. J Virol. 2000 Feb;74(4),p.2046-2051.

84. Kurtz J.B., Boxall E., Qusir N., Shirley J., Coleman D„ Chandler C. The diagnostic significance of an assay for 'total' hepatitis C core antigen. J Virol Methods. 2001 Aug;96(2),p. 127-132.56.Kyte J., Doolittle R.F.

85. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol 1982 May 5;157(1),p.105-132.

86. Laemmli U.K. Clivage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970,227,p.680-685.

87. Large M.K., Kittlesen D.J., Hahn Y.S. Suppression of host immune response by the core protein of hepatitis C virus: possible implications for hepatitis C virus persistence. J.Immunol. 1999, 162,p. 931-938.

88. Lee J.W., Kim K.M., Jung S.H. et al. Identification of a domain containing B-cell epitopes in hepatitis C virus E2 glycoprotein by using mouse monoclonal antibodies. J.Virol. 1999, 73, p.11-18.

89. Leroux-Roels G., Esquivel A., De Leys R. et al. Lymphoproliferative responces to hepatitis C virus core E1,E2, and NS3 in patients whith chronic hepatitis C infection treated with interferon alfa. Hepatology 1996, 23, p.8-16.

90. Leon P., Lopez J.A., Elola C., Lee S.R., Calmann M., Echevarria J.M.

91. Use of overlapping synthetic peptides to characterize samples from blood donors with indeterminate results to hepatitis C virus core antigen. Vox Sang. 1998;75(1),p.32-36.

92. Le Pogam S., Dubois F., Christen R., Raby C., Cavicchini A., Goudeau A. Comparison of DNA enzyme immunoassay and line probe assays (Inno-LiPA HCV I and II) for hepatitis C virus genotyping.

93. J Clin Microbiol. 1998 May;36(5),p.1461-1463.63.Lin C., Rice C.M.

94. The hepatitis C virus NS3 serine proteinase and NS4A cofactor: establishment of a cell-free trans-processing assay.

95. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Aug 15;92(17),p.7622-7626.

96. Liu Q., Tackney C., Bhat R.A., Prince A.M., Zhang P.

97. Regulated processing of hepatitis C virus core protein is linked to subcellular localization.

98. J Virol. 1997 Jan;71(1),p.657-662.65.Lo S., Lin H.H.

99. Variations within hepatitis C virus E2 protein and response to interferon treatment.

100. Virus Res. 2001 Jun;75(2),p.107-112.

101. Lohmann V., Korner F., Herian U., Bartenschlager R.

102. Biochemical properties of hepatitis C virus NS5B RNA-dependent RNA polymerase and identification of amino acid sequence motifs essential for enzymatic activity.

103. J Virol. 1997 Nov;71(11),p.8416-8428.

104. Lu L., Nakano T., Orito E., Mizokami M., Robertson B.H. Evaluation of accumulation of hepatitis C virus mutations in a chronically infected chimpanzee: comparison of the core, E1, HVR1, and NS5b regions. J Virol. 2001 Mar;75(6),p.3004-3009.

105. Lu M., Wiese M., Funsch B., Roggendorf M.

106. Different susceptibilities of genetic variants of hepatitis C virus (HCV) to interferon (IFN). Arch Virol. 1997;142(3),p.581-588.

107. Machida A., Ohnuma H., Tsuda F., Munekata E., Tanaka T., Akahane Y., Okamoto H., Mishiro S. Two distinct subtypes of hepatitis C virus defined by antibodies directed to the putative core protein.

108. Hepatology. 1992 Oct;16(4),p.886-891.

109. Manavalan P., Ponnuswamy P.K.

110. Hydrophobic character of amino acid residues in globular proteins. Nature 1978 Oct 19;275(5681),p.673-674.

111. Matsumoto M., Hsieh T.Y., Zhu N., VanArsdale T., Hwang S.B., Jeng K.S., Gorbalenya A.E., Lo S.Y., Ou J.H., Ware C.F., Lai M.M.

112. Hepatitis C virus core protein interacts with the cytoplasmic tail of lymphotoxin-beta receptor.

113. J Virol. 1997 Feb;71 (2),p.1301-1309

114. Mellor J., Holmes E.C., Jarvis L.M., Yap P.L., Simmonds P. Investigation of the pattern of hepatitis C virus sequence diversity in different geographical regions: implications for virus classification. The International HCV Collaborative Study Group.

115. J Gen Virol. 1995 Oct;76 ( Pt 10),p.2493-507.

116. Mink A.M., Benichou S., Madaule P. et al. Characterization and mapping B-cell immunogenic domain in hepatitis C E2 glycoprotein using a yeast peptide library. Virology 1994, 200, p. 246-255.

117. Miyamura T., Matsuura Y. Structural proteins of hepatitis C virus. J.Virol. 1993, 67, p.1385-1395.

118. Moorman J.P., Joo M., Hahn Y.S.

119. Evasion of host immune surveillance by hepatitis C virus: potential roles in viral persistence.

120. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2001 ;49(3),p. 189-194.

121. Morales M.F., Lossi J.S., Alderete T.N., Noli D.

122. Prevalence and seroconversion to HCV in hemodialyzed patients, andepidemiological factors.

123. Transplant Proc. 1996 Dec;28(6),p.3402-3405.

124. Moriya K., Fujie H., Shintani Y. et al. The core protein of hepatitis C virus induces hepatocellular carcinoma in transgenic mice. Nat. Med. 1998,4, p. 1065-1067.

125. Nakao T., Enomoto N., Takada N., Takada A., Date T.

126. Typing of hepatitis C virus genomes by restriction fragment length polymorphism. J Gen Virol. 1991 Sep;72 ( Pt 9),p.2105-2112.

127. Neddermann P., Clementi A., De Francesco R.

128. Hyperphosphorylation of the hepatitis C virus NS5A protein requires an active

129. NS3 protease, NS4A, NS4B, and NS5A encoded on the same polyprotein. J Virol. 1999 Dec;73(12),p.9984-9991.

130. Park J.S., Yang J.M., Min M.K.

131. Hepatitis C virus nonstructural protein NS4B transforms NIH3T3 cells incooperation with the Ha-ras oncogene.

132. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Jan 19;267(2),p.581-587.

133. Pereboeva L.A., Pereboev A.V., Morris G.E. Identification of antigenic sites on three hepatitis C virus proteins using phage-displayed peptide librares. J.Med.Virol. 1998, 56, p.105-111.

134. Perlemuter G., Sabile A., Letteron P., Vona G., Topilco A., Chretien Y., Koike K., Pessayre D., Chapman J., Barba G., Brechot C.

135. Poel C.L. Hepatitis C virus. Epidemiology, transmission and prevention. CurrStud Hematol Blood Transfus. 1994;(61),p. 137-163.

136. Pradat P., Trepo C. HCV: epidemiology, modes of transmission and prevention of spread. Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2000 Apr;14(2),p.201-210.

137. Rabe C., PilzT., Klostermann C., Berna M., Schild H.H., Sauerbruch T., Caselmann W.H. Clinical characteristics and outcome of a cohort of 101 patients with hepatocellular carcinoma.

138. World J Gastroenterol. 2001 Apr;7(2),p.208-215.

139. Arch Virol. 1998;143(12), p.2493-503.

140. Roudot-Thoraval F. Epidemiology of infections linked to hepatitis C virus in France Bull Acad Natl Med. 1996 Jun-Jul;180(6),p.1253-1265.

141. Saito K. Morphology and molecular pathology: detection of hepatitis C virus RNA sequences in stained sections by microscopy-directed selective extraction Rinsho Byori. 1998 Jan;46(1),p.49-55.

142. Rose G.D., Geselowitz A.R., Lesser G.J., Lee R.H., Zehfus M.H. Hydrophobicity of amino acid residues in globular proteins. Science 1985 Aug 30;229(4716),p.834-838.

143. Ruster B., Zeuzem S., Roth W.K. Hepatitis C virus sequences encoding truncated core proteins detected in a hepatocellular carcinoma. Biochem. Biophis. Res. Comm. 1996, 219,p. 911-915.

144. Sacco R., Randone A., Flichman D., Oliveri F., Colombatto P., Scaraggi F.A., Bonino F., Schiraldi O., Brunetto MR.

145. The prevalence of hepatitis C virus types in patients of the same geographic area, according to the source of infection and liver disease. Clin Diagn Virol. 1997 Nov;8(3),p.189-194.

146. Saito K. Morphology and molecular pathology: detection of hepatitis C virus RNA sequences in stained sections by microscopy-directed selective extraction Rinsho Byori. 1998 Jan;46(1),p.49-55.

147. Sallberg M., Pumpen P., Zhang Z.X., Lundholm P., Gusars I., Ruden U., Wahren B., Magnius L.O. Locations of antibody binding sites within conserved regions of the hepatitis C virus core protein. J Med Virol. 1994 May;43(1),p.62-68.

148. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 1977,74, v.12,p.5463-5467.

149. Santolini E., Pacini L., Fipaldini C., Migliaccio G., Monica N. The NS2 protein of hepatitis C virus is a transmembrane polypeptide. J Virol. 1995 Dec;69(12),p.7461-71.

150. Seong Y.R., Choi S„ Lim J.S., Lee C.H., Lee C.K., Im D.S. Immunogenicity of the E1E2 proteins of hepatitis C virus expressed by recombinant adenoviruses. Vaccine. 2001 Apr 6;19(20-22),p.2955-2964.

151. Shimotohno K. Hepatitis C virus as a causative agent of hepatocellular carcinoma.Intervirology. 1995;38(3-4), p.162-169.

152. Simmonds P., Holmes E.C., Cha T.A., Chan S.W., McOmish F., Irvine B., Beall E., Yap P.L., Kolberg J., Urdea M.S.

153. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region. J Gen Virol. 1993 Nov;74 ( Pt 11),p.2391-2399.

154. Taylor D.R., Shi S.T., Romano P.R., Barber G.N., Lai M.M. Inhibition of the interferon-inducible protein kinase PKR by HCV E2 protein. Science. 1999 Jul 2;285(5424),p.107-110.

155. Thimme R., Oldach D., Chang K.M., Steiger C., Ray S.C., Chisari F.V. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C virus infection.

156. J Exp Med. 2001 Nov 19;194(10),p.1395-1406.

157. Thio C.L., Thomas D.L., Goedert J.J., Vlahov D., Nelson K.E., Hilgartner M.W., O'Brien S.J., Karacki P., Marti D., Astemborski J., Carrington M.

158. Racial differences in HLA class II associations with hepatitis C virus outcomes. J Infect Dis. 2001 Jul 1;184(1),p.16-21.

159. Vejbaesya S., Songsivilai S., Tanwandee T., Rachaibun S., Chantangpol R., Dharakul T. HLA association with hepatitis C virus infection.

160. Hum Immunol. 2000 Mar;61(3),p.348-353.

161. Viazov S., Kuzin S., Paladi N., Tchernovetsky M., Isaeva E., Mazhul L., Vasychova F., Widell A., Roggendorf M. Hepatitis C virus genotypes in different regions of the former Soviet Union (Russia, Belarus, Moldova, and Uzbekistan).

162. J Med Virol. 1997 Sep;53(1),p.36-40.

163. Wang C., Sarnow P., Siddiqui A.

164. Translation of human hepatitis C virus RNA in cultured cells is mediated by an internal ribosome-binding mechanism. J Virol. 1993 Jun;67(6),p.3338-3344.

165. Watanabe S., Kaito M., Kohara K., Kohara M. Searching for hepatitis C virus by immunoelectron microscopy and its morphology.

166. Nippon Rinsho. 1995 Aug;53(8),p.2069-2078.

167. Weinstein J.S., Poterucha J.J., Zein N., Wiesner R.H., Persing D.H., Rakela J. Epidemiology and natural history of hepatitis C infections in liver transplant recipients.

168. J Hepatol. 1995;22(1 Suppl),p.154-159.121 .Welling G.W., Weijer W.J., van der Zee R., Welling-Wester S. Prediction of sequential antigenic regions in proteins. FEBS Lett 1985 Sep 2; 188(2),p.215-218.

169. Wiener A.J., Brauer M.J., Resenblatt J. et al. Variable and hypervariable domains are found in the regions and the pestivirus envelope glycoproteins. Virology 1991,180, p. 842-848.

170. Yamada N., Tanihara K., Mizokami M., Ohba K., Takada A., Tsutsumi M., Date T. Full-length sequence of the genome of hepatitis C virus type 3a: comparativestudy with different genotypes. J Gen Virol. 1994 Nov;75 ( Pt 11),p.3279-3284.

171. Yao N. Reichert P., Taremi S.S., Prosise W.W., Weber P.C. Molecular views of viral polyprotein processing revealed by the crystal structure of the hepatitis C virus bifunctional protease-helicase. Structure Fold Des. 1999 Nov 15;7(11),p. 1353-1363.

172. Zavaglia C., Martinetti M., Silini E„ Bottelli R., Daielli C., Asti M., Airoldi A., Salvaneschi L., Mondelli M.U., Ideo G. Association between HLA class II alleles and protection from or susceptibility to chronic hepatitis C.

173. J Hepatol. 1998 Jan;28(1),p.1-7.126.Zein N.N.

174. Clinical significance of hepatitis C virus genotypes. Clin Microbiol Rev. 2000 Apr;13(2),p.223-235.

175. Zhou H.C., Xu D.Z., Wang X.P., Zhang J.X., Huang Y„ Yan Y.P., Zhu Y„ Jin B.Q. Identification of the epitopes on HCV core protein recognized by HLA-A2restricted cytotoxic T lymphocytes.

176. World J Gastroenterol. 2001 Aug;7(4),p.583-586.

177. Zibert A., Kraas W., Meisel H., Jung G., Roggendorf M. Epitope mapping of antibodies directed against hypervariable region 1 in acute self-limiting and chronic infections due to hepatitis C virus. J. Virol. 1997, 71,p. 4123-4127.