Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение вариантов рекомбинатных вирусов осповакцины, экспрессирующих антигены вируса гепатита В
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Получение вариантов рекомбинатных вирусов осповакцины, экспрессирующих антигены вируса гепатита В"
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИЯ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСЮС! ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ■ НПО "ВЕКТОР"
На правах рукописи
Дмитриев Игорь Павлович
ПОЛУЧЕНИЕ ВАРИАНТОВ РЕКСМБИНАНТНЫХ ЕИРУСОВ ОСПОВАКЗЩНЫ, ЭКОРЕШ1РУК1ИХ АНТИГЕНЫ ВИРУСА ГЕПАТИТА В
03.00-03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссергацйи на соискание ученой степени кандидата бшлогических наук
Кольцово - 1994
Работа выполнена во Всесоюзном науч-ко-исследовательском институте молекулярной биологии Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный руководители: кандидат биологических наук Беляев A.C. кандидат медицинских наук Игнатьев Г.Ы. "
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Гайдуль К.В.
кандидат биологических наук Ильичев A.A.
Ведущая организация: Институт вирусологии им. Д-И.Ивановского РАМН, Москва.
Защита состоится 'У/ff* в
'¿^ё-часов на заседании Специализированного совета К 098.08.01. при Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной биологии НПО "Вектор" по адресу: 633159, п. Колъцово, Новосибирская область, Новосибирский р-он.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института молекулярной биологии НПО "Вектор"
Автореферат разослан 1994г.
Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических
ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
; Актуальность проблемы. Вирусный гепатит'Б (ТВ) является од/
ней ив наиболее социально значимых инфекпий, характеризующейся высоким ггоопентом неблагопшятных исходов: хоонические заболева-
I
ния печени, цирроз и гепатокарнинома. в результате острых и хронических форм инфекшш. Более 300 шн. человек в мире находятся в состоянии хронического вирусоносителъства и яеляются резервуаром инфекции. Поэтому разработка методов борьбы с этой инфекцией -одна из важнейших проблем здравоохранения. Поскольку эффективных этиологических средств лечения ГВ не существует, вакцинопрофилак-тика является наиболее эффективным способом контроля и предупреждения этого заболевания.
Разработка вакцины против ГВ долгое время встречала большие трудности в связи с узким кругом хозяев (человек и шимпанзе') и безуспешностью культивирования вируса'in vitro. Использование методов генной инженерии позволило установить организацию генома вируса гепатита Б i'BTB) CPasek.' 19791 и обеспечить возможность для разработки рекомбинантных субъепиничных и живых вакцин против ГВ. - ■
Изучение иммунитета при ГВ показало, что протективными факторами иммунитета против БГВ являются гуморальный и клеточный иммунный ответ (Tioilais. 1685) на НВsAg и preS2 антиген оболочки.. HBeAcj и HBcAtf нуклеокалсила, что свидетельствовало о необходимости включения их в вакиину против ВГВ.
Одними из первых были получены рекомбинантные штаммы вируса осповакпины fBOB) (Paoietti, 1S84; Smith, 1983) , зкспрессируюгие НЕзАг и вызывающие пои иммунизации лабораторных животных появление ачтп-лБз-антител. Встсойка гена среднего белка оболочки БГВ в
БОБ ('Cheng-, 19871 приводила к снижению уровня экспрессии HBsAg in vitro, в тоже время не опубликованы данные о иммуногенности полученного рекомбинантного BOB для приматов.
леди и задачи исследования. Настоящая работа посвяшена получению рекомбинантных БОВ, экспрессируюдшх гены ВГВ: исследованию продукции белков, колируемых этими генами при инфицировании культуры клеток, а такие изучению гуморального и клеточного иммунного ответов против антигенов ЕГВ при иммунизации лабораторных живот- . ных.
Основной целью работы является создание штаммов рекомбинант-ных БОБ, вызывающих при иммунизации животных индукцию иммунного ответа против БГБ и перспективных для разработки живой рекомби-кантной вакцины против ГВ.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены рекомбинайтные ВОВ эффективно экспрессируюшие HBsAg с рге£2-летермшантой, HBcAg и белок проявлявший антигенную активность YBeks ВГВ. Эффективная продукция HBsAg с рге52-детершшан-той была достигнута за счет изменения неблагоприятного д)ш рибосом млекопитающих природного сайта инициации трансляции рге52-об-ласти на синтетический. Продукция ЯБсАег достигалась с гена С. тогда как экспрессия с AUG-колона ргеС-последовательности была неэффективной, удаление из гена С фрагмента t'117-ть З'-кониевых н.п.), колирушего полиаргининовый тракт белка нуклеокапсида, приводило к синтезу белкового продукта. • который, не проявлял НБс-ан-тигенности но реагировал с антителами узнавшими зпитопы НВеАе.
Впервые покаггло. что иммунизация приматов рекомбинантныы
штаммом БОВ V?,532-5 вызывает не только гуморальный но и клеточный иммунный ответ на ИВбА? с рге52-летерминантой. Иммунизация рекомбинантным штаммом v7.SC приводит к янлукшга гуморального и клеточного иммунного ответа на НБсАг у линейных мышей, а также гуморального ответа у обезьян.
Полученные рекомбинантные БОВ у7,532-3 и у7.5С. экспрессиру-¡ошие соответственно НЕгАг с рге52-детерминантсй и НВсАв являются перспективными кандидатами для создания живой рекомбинантной вакцины против Г8.
Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на конференции "Проблемы биотехнологии иммунобиологических и гемот-рансфузионных препаратов" (Новосибирск. 1988); Всесоюзной конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1988); Всесоюзном совещании (семинаре) "Молекулярная биология. ЛНК-содержащих вирусов, имеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины ("Киев, 1590); Всесоюзной школе-семинаре "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990); V конференции Российской АН "Новые направления биотехнологии" (Пушино, 1992).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ. Получено 2 патента Российской Федерации и одно авторское свидетельство. ■
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора - "Экспрессия чужеродных генов з составе генома БОВ", материалов и методов исследования, описания результатов и обсуждения, выводов и списка нотисуемой литерату-
ры, включающего 17S наименований, габота изложена на 120 страницах машинописного текста, включает 13 рисунков и 10 таблиц.
Использованные сокращения. БДУ - 5-бровдезоксиуридин, БОЕ -сляяксобразуюшие единили.' БГВ - вирус гепатита В. ВОВ - вирус ос-псвакцины, ГБ - гепатит В. ДНК - лезоксирибонуклеиновая кислота, FHK - рибонуклеиновая кислота. ИФА - иммуно-ферментный анализ. Кон.А- конканавалин А, ОЭМч - вакцина против острого энцефаломиелита человека, FETJI - реакция бласттраноформапии лимфоцитов. РИА
- ралио-иммунометрический анализ, ТК - тимилинкиназа, ак. - аминокислота, п.н. - пар нуклеотилов, м.в. - молекулярный вес. HBcAg1
- антиген нуклеокалсила вируса гепатита Б, НБеАв1 - секретируемьга антиген Еируса гепатита В, HBsAe - основной антиген оболочки вируса-гепатита В.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.
Введение. Конструирование живых рекомбинантных вакцин на основе БОБ является перспективным направлением в создании.новых средств профилактики инфекционных заболеваний. Настоящая работа посвяшена получению рекомбинантных БОБ, экспрессируюшх антигены БГБ. Выбор ВОВ в качестве вектора обусловлен его способностью инфицировать широкий круг клеточных культур, животных и человека; большой векторной емкостью и возможностью получения живых поливалентных вагашн, а кроме того многолетним опытом вакцинации против оспы.
Конструирование плазмидных векторов для интеграции генов ВГБ в геном БОБ. Получение плазмид интеграции проводили на основе
вектора рУАИа (Фодор, . 1587), содержащего ранне-поздний промотор '7.5К и последовательности гена ТК ВОВ, обеспечивающие интеграцию чужеродной ДНК в геноме ВОВ.
7 В качестве источника гена 3 с ргеь2-сбластью использовали олазмипу рЦ31 (Лунин. 1983), содержащую фрагмент ДНК, кодирующий средний белок оболочки БГВ субтипа ау». При конструировании плаз-милного вектора р7,552-3 для интеграции гена Б2-Б в геном БОВ нами была проведена замена природного сайта инициации трансляции рге32-области ((ЗССАШЗБ) на синтетический ГАТСАТОЗА) с целью увеличения продукции НВзАе. Поскольку известно, что рибосомы млекопитающих эффективно используют для инициации трансляции РНК только последовательность А/аЯАЧВА/Б (Когак, 1984: 1985). Источником гена белка нуклеокалсиаа служила плазмила рОС74 (Борисова. 1384), содержащая фрагмент ДНК БГВ Гауи), кодирующий ген С с ргеС-областью. Зля получения рекомбинантных БОБ, экспрессирукших ген нуклеокапсида БГВ были сконструированы две плазмила интеграции: р7.5ргеС, содержащая полный ген нушгеокапсила и р7,5С. содержащая 2'-конец ргеС-области (18 п.н.) и-ген С. Целью получения двух за' риантов рекомбинантных ВОВ.было сравнение уровня продукции Нас А? с сайта инициации трансляции ргеС-области ГАССАОбС) и непосредственно с гена С, имеющего более благоприятный (6 в +1 положении) для рибосом млекопитающих сайг- ОбСАЦНй. Для получения рексмби-нантного БОВ, кодирующего белок, проявляющий'свойства НЕеАе была сконструирована плазмила интеграции р7,5Е, содержащая ген О за исключением 117 З'-кснцеБьи нуклеотилов. кодирующих 39 а.к. псли-аргининового тракта белка нуклеокапсила.
Получение рекомбинантных БОБ. Встройку генов БГБ з геном £03 пссеогили методом котпансфекиии iМакало. 1962) плазмилясй и зи-
" 5 /
русной ЗНК в культуре клеток CV-1, инфицированных БОВ. Для зстройки использовали клонированный вариант БОВ штамма ЛИВП Склон N1). который был предоставлен доктором Петровым B.C. Отбор рекомбинантных БОВ fTK-j осуществляли клонированием материала транс-фекши на клетках культуры Rat-2i"IK~1 с использованием БЛУ в качестве селектирующего агента.. Подтверждение интеграции генов ВГВ в геном ВОБ проводили метолом рестрикционного анализа ДНК. Было показало, что встройка генов ВГВ произошла, в HindIIIK-фрагмент 5НК ВОБ, о чем свидетельствовало■исчезновение этого фрагмента в. HindIII-гидролизатах ЛНК рекомбинантных ВОВ и появление новых грагментоЕ соответствующих по длине Hind IIIK-фрагменту со встроенной в него ЕНК ЕГВ. На рис.! представлена электрофореграмма Hinein гилролизатов ИНК рекомбинантных БОВ. Как видно из элект-роеорегрзммы длинна соответствующих Hindi II - фрагментов ДНК, содержащих встройку составляет для V7.5S2-S около 6700 п.н., для т7.5ргеС около 6650 п.н., для V7.5C - 5870 п.н. ' и 5750 п.н. для v7,5E, что совпадает с расчетными данными. Наличие генов ЕГВ в образующихся Hindi П-фрагментах ДНК рекомбинантных ВОВ было подтверждено блот-гибрилизанией с аг~~? меченными фрагментами генов 5ГБ. На рис.2 приведена каста генома ВГВ и схема расположения последовательностей ИНК ВГВ в ТК-гене полученных рекомбинантных ВОВ.
Синтез белков вируса гепатита В в культуре клеток, иншиштоо-вачных рекомбинантиыми штаммами ВОВ. Для Есех полученных рекомбинантных ВОВ была проведена опенка продукции антигенов ЕГВ при ин-фишгооЕании культуры клеток CV-1. Для этого монослой клеток CV-i ¿з б-луночных платах ¡'диаметр лунки 36 мм) инфицировали рекомби-нантным БОБ с множественностью 10 БОЕ на клетку. В качестве отрицательного контроля испсльзовали клетки, инфицированные ВОВ ЛИВП.
Рис.1. Рестрикщонный анализ ДНК рекоыбинантных БОЕ. v7,5S2-S, v7,5E, v7,5C и v7,5preC.
А 1. Hindi I I-гидрализат ДНК ВОВ (ЛШП-клон N11.
2. HindiII-гидролизат ДНК фага
3. HindiII-гидролизат ДНК V7.5S2-S.
В 1. HindIII-гидролизат ДНК V7.5E.
Z. HindiII-гидролизат ДНК '//.SC.
3. HindiI I-гидролизат ДНК v7,cpreC.
4. HindiП-гидролигат Д}!К EG3 (ЛИЕП-кясн Ml).
-В-. _ . /
эге-С .
х-орс^5 „с-ор.с
■ Геном вируса епатита В
рге-С
С
У7,552-5 у7.5ргеС у7,5С v7.SE
Рис.2. Карта генома вируса гепатита В и расположение генов НТВ в гене ТК полученных рекомбинантных ВОВ.
Продукцию HBsAg рекомбинантным штаммом v7.5S2-S тестировали з сравнении с рекомбинантным BOB v7,5S, предоставленным Гашнико-П. Б. и экспрессирукшим только KBsAcr. Определение количества
HBsAe в образцах культуральной соеды и лизатов клеток проводили
/ ... . . .
^Аетодом РИА по калибровке сделанной по разведениям препарата плазменного HBsAg с известной концентрацией. Оказалось, что суммарный уровень экспрессии для v7,5S2-S составляет 130-340 нг а для V7.5S - 165-350 нг HBsA? за 24ч в пересчете на миллион инфицированных клеток. Полученные результаты свидетельствуют, что продукция HBsAg- с измененного сайта инициации трансляции рге52-области. сохраняется на том же уровне как с гена S (v7,5S), тогда как. при экспрессии с природного сайта инициации трансляции ргеБ2-области. (Cheng, 1987) происходило снижение уровня синтеза HBsAe на 30%.
Определение рге52-антиген& проводили метолом твердофазного FJ1A. В качестве подложки использовали антитела, полученные при иммунизации кроликов синтетическим пептидом ('DFRVRGLYFPAGG-SSSGTY-C), предоставленным доктором Самуковым В.В и содержащим антигенный сайт рге32-области f14-32 а.к.) среднего белка оболочки БГВ (Itoh, 1986). Связавшийся антиген выявляли i25l- меченными антителами к HBsAg. При этом, тестировались только рге52-антиге-ны. связанные с HBsAg. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, инфицированные BOB ЛИВП и рекомбинантным ВОВ '/7,53. При этом наблюдалось значительное превышение связывания меченых анти-HBs-антител в образцах клеток, инфицированных штаммом V7.5S2-S по сравнению с контролем. Таким образом, было показано, что рекомбинантный штамм V7.532-S синтезирует з культуре .меток белек, который проявляет одновоеменно ант!1гэнные свойства 4BsA? и рге52-знтигена среднего белка оболочки БГЗ.
/
ларактеризания белка оболочки НРБ,- синтезируемого штаммом V7.5S2-S в культуре клеток проводилась метолом электрофореза в 12,52 полиакрилаыилном геле в денатурюуюших условиях i'D.1%. йа-лолеиилсульфата) с последующей окраской кумаоси-голубым. На электросореграмме, представленной на рис. ЗА приведена картина электрофоретического разделения препаратов рекомбинантного 32-S-белка и плазменного HBsAg в качестве контроля. Зля электрофореза использовали препарат очищенного методом афинной хроматографии рекомбинантного S2-S-белка. Как вилно из злектрофореграммы, в препарате плазменного HBsAff присутствует два белка с ы.в. в диапазоне 20-26 кла, что соответствует негликозилированной форме основного белка оболочки БГБ - полипептиду Р25 (Ganem, 1987). При разделении рекомбинантного S2-S-белка было выявлено три полосы соответствующие белкам с м.в. около SO, .60 и SO кПа. При этом, белок с м.в. 30 кла примерно соответствует гликозшшрованной форме среднего белка оболочки - гликопротеину GP33' (Ganem, 1987). Полосы соответствующие белкам с м.в. около SO и 60 кДа, тго видимому, яеляются' продуктами не полной денатурации рекомбинантного S2-S-белка и соответствуют тримерной и димерной форме гликопроте-ина 5PS3.
Наличие рге52-детеомшанты е рекомбинантном S2-S-белке выявляли методом имшноблотинга. 1шя этого проводили электрофорез как описано выше, белки с геля переносили на нитроиеллюлозную мембрану п инкубировали с аффинированными антителами кролика к пептиду preS£il4-32"). Связавшиеся антитела проявляли коныогатом белка А Staphylococcus aureus с персксилазой хрена. Из рис. ЗБ видно, что все три полосы, выявляемые в препарате рекомбинантного 32-5-белка взаимодействуют с антителами к ргеь2-пептшу. Однако, наиболее сильно проявляется полоса с м.в. около 30 кПа, соответствующая
1 2 3
А ЕВ
Ркс.З. Изучение рекомбинантного иг-Б-белка при электрофорезе в 12,5Х полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (0,12 На-додецилсулъфат).
A. Окраска кумасси-голубым:
1. Маркер м.в. (кДа;
2. Рекомбинантнкй ргеБЕ-3-5елок.
3. Плазменный НВзА£.
Б. Иммуноблотинг с антителами к пептиду рге52(14-32) после переноса на нитроцеллюлозу.
B. Окраска на гликопротеины комплексом конканавадин А-пероксидаза после переноса на нитроцеллюлозу.
мономерной форме среднего белка оболочки НТВ, что, возможно связано с более полной денатурацией препарата.
Гликозилирование рекомбинантного 32-Б-белка было показано в
эксперименте по пеоеност белков с геля на нитоцеллюдозную полосу
I" ' '
и инкубации с комплексом конканавалин А-пероксидаза /рис. ЗВ).
При этом так же-было установлено, что все три формы 32-3-бедка
проявляют окраску на гликопротеины.
Полученные результаты свидетельствуют, что при инфицировании культуры клеток рекомбинантным штаммом ч7, 552-Б происходит синтез гликопротеина с ы.в. около 30 кла. который содержит рге52-детерминанту и соответствует среднему белку оболочки БГВ.
Изучение белка оболочки БГВ, продуцируемого штаммом у7,532-$ проводили методом иммуноэлектронной микроскопии. Сетки для электронной микроскопии сенсибилизировали антителами к рге52(14-32) | инкубировали в среде культивирования клеток культуры СУ-1,- инфи-1ушованных рекомбинантным ВОВ. Электронная микроскопия проводи лась в лаборатории доктора Рябчиковой Е.Й. Было однозначйо проде монстрировано', что синтезируемый белок подвергается самосборке 5 частицы НБэАг диаметром около 20 нм, которые содержат рге52-анти ген. Б тех случаях когда сетки обрабатывали отдельно препаратам) культуральной среды или антител частицы не обнаруживались.
■ Таким образом, изучение экспрессии гена-среднего белка оболочки БГВ рекомбинантным штаммом у7,552-5 показало, что проведенное изменение колона инициации трансляции рге52-области приводит * эффективной продукции гликопротеина, который подвергается самосборке в частины НЕбА? с рге52-детерминантой.
Экспрессию белка нуклеокапсида БГВ изучали при инфицировании культуры клеток СУ-1 рексмбинантными БОБ у7,5ргеС и v7.SC. Тестирование НЕсАг з образцах культуральной среды и лизатов клеток
проводили метолом конкурентного РИА по. ингибированго связывания анти-НБс с сорбированным HBcAg. Опрелеление количества НВсАг в исследуемых образцах проводилось по калибровке сделанной на разведениях препарата НВсАг с известной концентрацией, наработанного в E.coli и предоставленного доктором Пибиногиным Б.В. Было обнаружено, что штамм v7,5C продуцирует НБсАсг в количестве 600 - 700 нг/мл/'10°клеток, в то время как v7,5preC - всего лишь 5-10 нг/'мл. При этом продукт гена ргеС-С обнаруживался в среде культивирования и в лизатах инфицированных клеток, а продукт гена С -только в клетках. Таким образом, сравнение уровня экспрессии вариантов гена нуклеокапсила БГВ показало, что эсшективная продукция НВсАг происходит только с сайта инициации трансляции гена С.
Выявление HBeAg- при инфицировании куль туры клеток рекомби-нантным штаммом v7,5E проводили метопом ИФА с использованием диагностического набора для определения НВеАд/анти-НВе ("Abbot", ФРГ). При этом количественное опрелеление уровня экспрессии'HBeAg затруднялось отсутствием в наборе препарата HBeAtr с известной концентрацией, а также других его источников. При тестировании образцов культурадьной среды и лизатов клеток, инфицированных штаммом v7.dE оказалось, что НБе - антигенная активность выявляется только в клетках в титре 1:300.
Известно,' что ргеС-С-белок БГВ : направляется е STP клетки сигнальной последовательностью i'iS ак.I,- кслкруемой рге-С-об-ластью и подвергается N- и С-кониевому протеолитическому пропес-сингу с образованием секретируемого HBeAg i'Ou, 1986: Yean-Yeai, 1969). Таким образом, отсутствие ргеС-области в вариантах гена нуклеокапсила. экспрессируемых- рекомбинантными BOB v7,5C и v7,5E обуславливает локализацию синтезируемых белковых продуктов внутри клеток. В свою очередь, удаление из гена С 117-и 3'-концевых
нуклеотидов, кодирующих полиаргининовый тракт приводит к изменению кснформапии бедка нуклеокапсида. При этом белковый продукт, продушруемый рекомбинантным БОВ v7,5E теряет НВс-антигенность, что подтверждается отсутствием его взаимодействия с антителами ' к НБсАс, и предпочтительнее реагирует с антителами узнающими эпито-пы НБеАв- (MacKav, 1981).
Изучение специфического иммунного ответа на антигены ВГБ v лабзиатосных .тавотных при иммунизации рекомбинантными штаммами ¿05. Оснсзным преимуществом живой вакцины является моделирование -стественного инфекционного mouecca. При этом иммуногенность вакшш на основе рекомбинантных БОВ определяется как уровнем экспрессии. так характером зкспрессируемого продукта. Поэтому для изучения иммунобиологических свойств были Еыбраны рекомбинантные итаммы '/7,532-5 и V7.5C, эффективно экспрессирующие, соответственно, HBsAg, рге32-антиген и HBcAg. Иммуногенность рекомбинантных шташоЕ испытывали на мышах линии Balb/c и обезьянах пасаса mlaita и шСаса bonnet по инлукшш специфического гуморального и клеточного иммунного ответа на антигены БГВ. Иммунизация мышей проводилась в дозе 10° БСЕ/лшвотное метолом скарификации кожи у основания хвоста, а обезьян в лозе 1и7 БОЕ/животное скарификацией участка кожи между лопарками.
Индукцию гуморального иммунного ответа выявляли по появлению з сыворотке иммунизированных животных антител против HBsAcr, рге£2-антигена и НБсАг. Наличие в образцах сывороток антител против mEsAe1 определяли метолом прямого МФА. а антител против ?reS2-антигена - методами конкурентного РИА. Б качестве отрицательного яснтоода исизльсовали сызосоткк аитзктных животных и им-'.¡унизлсселн^ЫХ Етам!.:см Я'Зй
Изучение гуморального иммунного ответа на поверхностные антигены БГБ при иммунизации мышей показало, что ответ на HB^.-j и рге32-антиген имеет различную динамику. Так антитела, специфичные к preS2-антигену достигают максимальных значений к 34-м суткам, а ' к HBsAg - на 64-е сутки после иммунизации. Полученные результаты согласуются с. данными о динамике гуморального иммунного ответа при острой инфекшш ГВ (Milien, 1985: Neurath, 1985), заканчивающейся выздоровлением.
В экспериментах проведенных на приматах (табл. 1') было обнаружено, что анти-рге32-антитела достоверно выявляются у 4-х из б-и обезьян тасаса mulatta, уже через 14 дней после иммунизации штаммом V7.5S2-S. Однако, в отличие от мышей, у обезьян при однократной иммунизации не было обнаружено антител против HBsAff. Поэтому были проведены эксперименты по двукратной иммунизации обезьян тасаса bonnet совместно с индийскими учеными из Национального института иммунологии г.Лели. При этом было показано, что повторная иммунизация через 14 дней индуцирует образование анти-KBs антител у 50Х животных.
йндукштю гуморального иммунного ответа у лабораторных животных, иммунизированных рекомбинантньм штаммом v7,5C выявляли по появлению в сыворотке как суммарных специфических антител гоотие НВсАег, так и антител класса igW. Наличие в образцах сывороток суммарных антител специфичных к НБсАа определяли методом конкурентного ИФА. Все животные, начиная со второй недели после иммунизации, отвечали. образованием антител к HBcAg- в течение 11 недель наблюдения у линейных мышей и 19 недель у обезьян тасаса malst Ьз.
Индукцию анти-НВс класса IoM , которые являются ранними маркерами при инфекции ВГВ человека и животных (Murray, 1987), изу-
--------Таблица 1.
Индукция клеточного и гуморального иммунного ответа у обевъян Macaca inulatta, иммунизированных рекомбинантными штаммами ВОВ V7.5S2-S и v7,5S.
Штамм вируса N "Антитела ""Индексы стимуляции пролиферации лимфоцитов (М±б) Спонтанная прод-ция
против preS2 Титр против. ВОВ
Антиген 3П-Тшшдин имп/мин. (М4б)
HBsAg preS2 ВОВ ОШч Кон. А
v7,5 52-S 1 г 3 4 5 6 53 50 <10 <10 21 17 1:150 >1:1500 1:150 >1:1500 1:1500 1:450 2,3+0,3 2,640,3 1,040,1 ЗД±0,4 2,9+0,4 2,li0,3 1,8±0.2 2,140,3 0,8+0,1 2,1±0,2 2,040,2 2,040,2 1,б±0,2 1,540,2 1.040.1 1,6+0,2 1.440.2 1,640,2 1.0±0.1 0,9±0,1 0,9+0,1 1,0±0Д 0,9+0,1 0,9+0,1 5,540.5 5,040,5 3,940,4 4.640.4 4,6+0,4 4,340,4 3266+110 2732И06 31084108 2467+88 3328+104 25744104
'ч 1 <1 >1:1500 2,0+0,2 1,2+0,1 Г,б±0,2 1,0±0Л 5,7+0,6 2692+102
8 <1 1:150 1,8±0,2 1,040,1 1,440,1 1,040,1 5,340,5 27484104
v?,5S 9 <1 1:150 1,240,1 1,040,1 1,240,1 1,140,1 4,740,5 2486492
10 <1 >1:1500 1,3±0,1 1,1±0,1 1,6+0,2 1,0±0,1 5,1+0,5 2518+98
11 <1 1:450 1,6±0,2 1,240,1 1,640,2 1,140,1 4,840,4 28984104
12 <1 1:1500 1,8+0,2 1,240,1 1,540,2 1,0+0,1 4,840,4 31284116
V-V
* Приведены данные на 14 сутки после иммунизации. Серопозитивными по анти-рге52 считаются сыворотки дающие > 10% падения сигнала в конкурентном РИА. • ** Приведены средние значения (М) для 4-х параллельных определений на 56 сутки после иммунизации, б - среднеквадратичное отклонение. . ;
_ А ~Т -
i. I
чали при иммунизации обезьян macaca mulatta. Выявление ан-ти-HBcí 1й.!> в образцах сывороток проволили с ломошью диагностического набора для иммуноферментного опрелеления анти-НБсПсМ) ■"F.Hci:mann-La Roche & Со. Limited Companv. Diagnostica", Швей-иагпя). Опоелеление титра НБсАдг-спепифических ¡cM-антител показало. что они выявляются в течение 3-х недель после иммунизации, причем максимальные титры приходятся на 2-ю неделю. При этом у 2-х обезьян из 5-и титры составляли 1:2700, у 2-х - 1:8100, в лишь одна отвечала только на 1-ю и 2-ю недели в титре 1:900.
Индукцию клеточного иммунного ответа на антигены ВГВ у иммунизированных животных изучали в РБТЛ (Хоробрых, 1983). Определение индексов стимуляции спленоштаов в ответ на HBsAg, НВсА? и антигены ВОВ у линейных мышей проводили на 21 сутки после иммунизации. Б таблице 2 и 3 приведены индексы стимуляции спленопитов. выделенных у мышей линии Ба1Ь/с после иммунизации рекомбинантными штаммами ВОВ v7,5S2-S, v7,5C и ВОВ ГЖВП) в качестве контроля. Как видно из таблиц, HBsAg и HBcAg вызывают irt vi tro пролиферацию клона сенсибилизированных спленопитов. Это указывает на индукцию специфического клеточного иммунного ответа на указанные антигены ВГВ у мышей, иммунизированных рекомбинантными ВОВ по сравнению с контрольными животными, у которых такой пролиферации не было отмечено. О .специфичности иммунного ответа свидетельствует и тот факт, что при стимуляции лимфоцитов гетерологичным антигеном -вакциной ОЭМч, пролиферации также не было выявлено.
Таким образом, показано, что иммунизация лабораторных животных рекомбинантным' штаммом ВОВ v7,5C вызывает индукцию раннего гуморального иммунного ответа на НВсАг у линейных мышей и приматов и специфического клеточного иммунитета у линейных мышей. Известно, что НВсАг обладает протективными свойствами против ВГВ
- is -
Таблица 2.
Индукция клеточного зшунного ответа на HBsAg при иммунизации мышей линии Ва.1Ь/с рекомбинантным штаммом v7,5S2-S и ВОВ (ЛИВЩ.
| Штамм вируса i ; Индекс стимуляции (М±б) Спонтанная прш-ция 3Н-Тимидин имп/мин
Антиген
HBsAg i BOB 031ч Кон.А
V7.5S2-S 2,0+0,3 1,6+0,2 1,0±0,1 7,5±1,2 1267+68
ВСЕ ЛИВП 1,0+0,2 1,7+0,3 0,9+0,1 7,3±1,1 1359+72
интактные 1,0±0,1 0,9±0,1 1,010,1 7,6±1,2 1328+64
Таблица 3.
Индукция клеточного иммунного ответа на HBcAg при иммунизации мышей линш Balh/c рекомбинантным штаммом v7,5C и ВОВ (ЛИВП).
Штамм вируса Индекс стимуляции (Ы±б) Спонтанная прод-ция 3Н-Тиыидин имп/мин
Антиген
HBcAg ВОВ 031ч Кон. А
V7.5C 2,310,4 1,710,2 0,910,1 7,711,2 1473183
ВОВ(ЛИВП) 1,110,2 1,6±0,2 1,010,1 7,611,1 1582179
jинтактные 0,9±0,1 1,0±0,1 1,010,1 7.811,3 1617185
Приведены средние значения СМ) для 4-х параллельных оп-селелений на 21 сутки после иммунизации, б - среднеквадратичное отклонение.
лля шимпанзе (¡warson, 1985: Murray, 1S87). а клеточный иммунитет на этот антиген является фактором пожизненной резистентности против ГВ у переболевших людей íSvlvan. 1587: Pontisso, 19871. Поэтому полученные результаты свидетельствуют о перспективности штамма v7.5C лля разработки вакшлы.
Изучение инлукиии клеточного иммунного ответа на поверхностные антигены БГБ у приматов провозили при иммунизации о&езьян macaca mulatta рекомбинантными штаммами v7,5S2-S и v7,53. Б таблице 1 приведены значения индексов стимуляции лимфоцитов в ответ на HBsAgr, preS2-антиген и антигены ВОВ на 56 сутки после .иммуниза-цш. Из представленных данных видно, что пролиферация лимфоцитов в ответ на HBsAg у обезьян обеих групп достоверно вше, чем при стимуляции не специфическим антигеном ('вакпина СШч). Это свидетельствует, о формировании у иммунизированных обезьян клонов специфически сенсибилизированных лимфоцитов. Хотя все обезьяны предварительно были проверены на отсутствие маркеров ВОВ и БГВ, обезьяна N3 не отреагировала на HBs- , preS2- и ВОВ-антигена. Тем не менее, полученные результаты указывают на индукция специфического клеточного иммунного ответа и формирование иммунологической памяти на HBs-, preS2- и ВОВ-антигены у большинства обезьян, иммунизированных штаммом v7,5S2-S. При этом у обезьян контрольной группы, иммунизированных штаммом v7,5S не было выявлено пролиферации лимфоцитов на preS2-антиген, а средний индекс стимуляции лимфоцитов на HBsAg был достоверно ниже íp=95%'). Полученные результаты согласуются с литературными данными о том, что preS2-антиген может стимулировать кйеточный иммунный ответ против HBsAg (Cells. 1984).,
Известно, что клеточный иммунитет на поверхностные антигены 3ГБ играет важную роль в выздоровлении при инфекции (Milich,
: - 20 -
1585).. а антитела к рге32-детеоминанте могут обеспечить защиту от ВГВ (Neurath, 1986: Iton, 1986). Поэтому полученные результаты свидетельствуют о перспективности штамма v7,5S2-S для профилактики этого заболевания. ' .
Б результате проведенного исследования показано, что реком-бинантные штаммы BOB v7,5S2-S и v7,5C обеспечивают индукцию специфического иммунитета против антигенов БГВ при иммунизации мышей и приматов, и, следовательно, могут быть рекомендованы для разработки и внедрения в практику здравоохранения живой рекомбинантной вакцины против ВГВ.
ВЫВОДЫ
;
!
1. Получены штаммы рекомбинангных ВОВ. содержащие в составе генома ген среднего белка оболочки ВГВ - v7,5S2-S и варианты гена
1 I
нукдеокапсида: v7,5preC-C, v7,5C и v7,5E.;;
2. Впервые показано, ' что изменение, природного сайта инициации трансляции рге52-области приводит к эффективной продукции. HBsAg с рге52-детерминантой рекоыбинантным штаммом BOB V7.5S2-S. .
3. Впервые показана продукция HBcAg рекомбинантным штаммом BOB v7,5C и белка, .проявлявшего антигенные свойства НБеАе рекомбинантным штаммом BOB v7,5E.
4. Рекомбинантные штаммы БОБ V7.5S2-S и v7,5C вызывают гуморальный иммунный ответ соответственно на HBsAg, рге32-антиген и НВсАе при иммунизации линейных мышей и обезьян.
5. Впервые показана индукция клеточного иммунного ответа на H£sÄz, рге22-ангиген и HEcAg у лабораторных животных, иммунизированных секоысияантными ВСЕ.
• - 21 -
5. Рекоибинантные штаммы BCS v7,5S2-S и v7,5C язлягтся перспективными зля создания живой рекомбинантной вакцины для профилактики заболевания гепатитом Б.
Результата диссертации опубликованы в следующих работах:
1. Беляев A.C., Лмитриев Й.П., Игнатьев Г.М., МизенкоГ.А., Лутиниева H.H., Сзбиров А.Н., Самуков В.Б., Семенова Л.К.. Аммс-сов А.5., Рукавишников м.Е>., Красавина И.Н., Муратов П.Ю., микры-ксв H.H., шевлягина Л.Р., Константинов А.П., Санлахчиев Л.С. Ре-комбинаниши вирус оспэвакшшы, экспрессируюший средний рге21'2'|-3-Селок оболочки вируса гепатита Б. Индукция гуморального и клеточного иммунитета при иммунизации лабораторных животных.// Докл. АН СССР,- 1950.- Т.314.- Н.2.- C.4SB-491.
2. Беляев A.C., Хромых A.A., Дмитриев И.П. Разработка реком-бинантных вакцин против клешевого энцефалита и гепатита В.- Сборник материалов конференции "Проблемы биотехнологии иммунобиологических и гемотрансфузионных препаратов". Ленинград, 1989. с.52.
3. лшгариев А.П., Беляев A.C., Путинцева К. И., Рукавишников М.Ю., Гайфуллина Л.Р., Агеенко В. А. Рекомбинантные вирусы оспо-ва'сиины, экспрессирушие гены вирусов клеиевого энцефалита и гепатита В.- Сборник материалов Всесоазной конференции 'Тенная и клеточная, княенерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии". Тарту, 1&Ö9, т.1, c.95-i01.
4. Муратов П.Ю., Дмитриев й.П., Беляев A.C. Изучение иммунобиологических свойств рекомбинанткых штаммов осповакиины ¡v7,5S2-S н v7,5C), зкспрессиру них антигены вируса гепатита В. - . Тезисы докладов Всесоюзного семинара "гйу^кулярная биология и медицина". Ленинград. 15&0. с.57.
5. Беляев A.C., Дмитриев И.П., Муратов П.Ю., Фролов И.В.,
Сершшским О.И., Урманоз й.л., Агапов Е.В.. Колыхапов A.A., Нете-сов С.Б., Сандаччиев JI.C. Вирус оспоеакшшы, как вектор для'создания вакцин. Некоторые итоги и перспективы.- Тезисы докладов V конференции РАН "НоЕые направления биотехнологии". Путано. 1692. с.51.
5. Дмитриев Я.П., Беляев A.C. РекоиЗмнантная плазыидная ЖЧ р7;5С, кодирующая антиген вируса гепатита Б, и способ ее конструирования.// Патент Fi> N1551555 от 17.01.1903г., приоритет N46353 •ОТ 27.07.89.
7. Муратов П.Ю., Дмитриев й.П., Беляев A.C. Шт&чм рекомби-нантного вируса осповакиипы v7,5C, экспрессируюший коровий антиген вируса гепатита Б.// Заявка на патент Р5 N4928632/14.- приоритет от 17.04.S1 г., положительное ресенке от 30.08.91 г.
S. Беляев A.C., Путкнцева Н.И., Дмитриев й.П., АммоЬов А.Л., Черный Н.Б., и др. Рекшбинанткая влазмидная ДНК p7,5S2-S, содержащая preS2-S ген вируса гепатита В, способ ее получения и штамм рексибинантного вируса осповакцины, зкспрессирутсншй preS2-S ген вируса гепатита В.// Патент N1575575 от 10.01.93г.
- Дмитриев, Игорь Павлович
- кандидата биологических наук
- Кольцово, 1994
- ВАК 03.00.03
- Конструирование и анализ свойств рекомбинантных вирусов осповакцины, экспрессирующих гетерологичные гены
- Структурно-функциональные и биотехнологические аспекты изучения геномов ДНК-содержащих вирусов человека и животных
- Использование методов молекулярной биологии и генной инженерии для конструирования вакцинных и диагностических препаратов
- Биологические свойства рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего ген env вируса лейкоза крупного рогатого скота
- Культуральные, антигенные и иммуногенные свойства рекомбинантных вирусов осповакцины, содержащих ген ENV вируса лейкоза крупного рогатого скота