Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Культуральные, антигенные и иммуногенные свойства рекомбинантных вирусов осповакцины, содержащих ген ENV вируса лейкоза крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Культуральные, антигенные и иммуногенные свойства рекомбинантных вирусов осповакцины, содержащих ген ENV вируса лейкоза крупного рогатого скота"

• 5 5 2'

ВСЕРОССИЙСКИЙ ОРДЕНА -ЛЕНИНА МУЧНО^СООДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.КОВАЛЕНКО •

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

СВЕРЧКОВ Алексей Вадимович

КУЛЬТУРАЛЬШЕ, АНТИГЕННЫЕ И ИШЛЮГЕНШЕ СВОЙСТВА РЕКОМШНАНТВДХ ВИРУСОВ ОСПОВАКЦИНЫ, С0ДЕР2АЩИХ ГЕН £N7 ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.06 - вирусология

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследоватвльокои институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко.

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных наук, профессор Л.Г.Бурба.

Кандидат биологических наук А.Ф.Валихов. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, професоор Л.П.Дьяконов кандидат биологических наук В.К.Сологуб

Ведущая организация - Московская ветеринарная академия.

Защита диссертации состоится " " 1992 г.в-¿Уч.

на заседании специализированного оовета Д 020.28.01 по звщите диооертаций на соискание ученей степени доктора нау* при Воероо-онйокоы ордена Ленина нвучно-жоследовательоком институте экспериментальной ветеринария по адреоу: 109472, Москва, Кузьмин«, ВИЭВ. С диссертацией мокяо ознакомиться в. библиотеке ВИЗВ. Автореферат разоолан * Зо * 3992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат ветеринарных наук Ф.Г.Терепов

7r?:i?a:C.i i ■'?:•', Ü

5t..„,;;,,| ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

j'-'-'ü^ Актуальность теш. Лейкоз крупного рогатого скота является заболеванием опухолевого характера. Возбудитель - РНК-содержа-щий вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) из семейства Retroviridae . В искоренении ВЛКРС-тфэтяя специфическая профилактика может быть важным звеном в системе мероприятий. В странах ЕЭС с высоким уровнем инфицированности животных вирусом лейкоза в борьбе с инфекцией используют принцип "выявление-бойня", который экономически не оправдан по сравнению с методом вакцинации.

Применение специфического иммуногенного препарата (Miller J., Уan der Maaten Ii., 1978; Kono J., et.al, 1986) снизит расхода на проведение работ по борьбе с лейкозом, ускорит оздоровление стада, его воспроизводство за счет собственного молодняка. Особенно необходам такой подход для племенных хозяйств с высоким уровнем инфицированности животных ВЛКРС, когда требуется полная замена всех коров стада, и оздоровление с применением обычных методов растягивается на многие годы.

Попытки создания шактивпрованйых или субъеданичных вакцинных препаратов в предыдущие года предпринимались, однако у них были выявлены недостатка:

- низкий уровень накопления вируса в культурзльнои. срчдо и трудоемкость выделения, очистки и концентрирования его антигенов;

трудность дифференциации по с твэкцинал-о них антител от вирус~ индуцированных при естественном заражении животных ВЛКРС;

- невысокий протективный эффект нэ позволяет использовать эти препараты в качестве вакцин серийного производства (Шишков В.П. с соавт., 1979, 1983; Кукайн P.A. с соавт., I983;Miller J.,

Van der Maaten M. , 1978, 1983; Koberts D., et.al. , 1982, 1984; Onu.na M., et.al. ,1984; Xono J., et.al. , 1986).

С появлением методов генной инженерии стало возможным создание вакцин на основе рекомбинантной технологии с использованием в качестве вектора бактерий е.Coli , вируса оспы, герпеса, ба-куловируса и т.д. (Хромых A.A. с соавт., 1990; Irillien е., et. ali. , 1989; Scott-Ram N. , 1989; Weber E., et.al., I989;Vfeir J., et.al. , 1989).

Одним из наиболее приемлемых для этой цели биологических объектов является вирус ооповакцины. Он безопасен при массовых прививках и имеет значительную емкость генома дяя встраивания ■чужеродной информации. Начало работы с этим вирусом в качестве вектора было положено Panically D., et.al.B 1983 году.

Применение рекомбинантных вакцин удобно в виду их высокой экономичности, возможности быстрого изготовления больших коли- . честв препарата, простоты применения (Альтштейн А.Д., 1987). Такой подход возможен при конструировании рекомбинангного вектора на основе вируса осповакцины, имеющего в составе своего генома ген env , кодирующий оболочечннй гликопротеид (gp51-gp3P )ВДКРС. Однако остаются не изученными такие биологические свойства ре-комбинантного вируса, как репродуктивная способность штаммов рекомбинантного вакцинного вектора (РВВ) в различных клеточных культурах. Не отработаны оптимальные режима культивирования РВВ, соответствующие максимальному синтезу гликопротеядных антигенов ВЛКРС и не изучены антигенные и шмуногенные свойства РВВ.

Цель и задачи работы. Цель» наших исследований было определение оптимального решила культивирования РВВ, зкспрессирутацего ген env вируса лейкоза крупного.рогатого скота, выявление антигенных и ишуногенных свойств РВВ и эхсцрессируемого зтим векто-

ром ассоциированного о цитоплазматическими мембранами гл'икопро-тевдного антигена ВЖРС.

Выполнение поставленной цели осуществляли решением следующих задач.

1. Выявить рекомбинантный штамм вируса осповакцины, обладающий наибольшей репродуктивной активностью и синтезом гликопро-' теидов ВЛКРС в культуре клеток.

2. Провести сравнительное изучение различных клеточных систем для культивирования рекомбинантного штамма вируса осповакцины л определить культуру клеток с максимальной репродукцией РВЗ.

3. Изготовить в лабораторных условиях препараты из РВВ и продукта его синтеза в культуре клеток - ассоциированного с ци-топлазматическими мембранами гликолротеида ВЛКРС, изучить юс антигенные и иммуногеняые свойства.

Научная новизна. Сравнительными исследованиями выявлена более высокая репродуктивная активность рекомбинантного вируса WR-ВЛКРС К4 tk+, сконструированного на основе штата '.7R оспо-вакцины.

Показано, что культуры клеток cv-1 и Tero являются оптимальными клеточными линиями для культивирования рекомбинантного век-, тора, причем наиболее высокий титр вируса осповакцины и максимальное накопление gp5i антигена БЛКРС происходит в культуре

клеток cv-1 .

¡

Разработан режим культивирования рекомбинантного вектора

i

«н-ВЛКРС К4 tk+, позволяющий получить максимальный выход экс-прессируемого им антигена gp5i ВЖРС.

В лабораторных условиях изготовлены и испытаны в качества иммуногвнов два биопрепарата: собственно рекомбинантный вирус

у/к -ВЛКРС К4 и+ я ассоциированный с цитоплазматическими мембранами рекомбинантный вр51.

На кроликах, овцах и телятах проведено испытание приготовленных препаратов и дана оценка юс антигенных и иммуногенных свойств.

Комбинированное применение рекомбинантного вируса «и-ВЛКРС К4 tk+ и выделенных из кулътуральной жидкости гликопротеидных антигенов ВЛКРС вызывало у телят иммунитет, предохраняющий животных после контрольного заражения их вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Научно-практическая ценность. Разработана в лабораторных условиях технология культивирования рекомбинантных штаммов на основе вирусов осповакцины с интегрированным в их геном гена епу вируса лейкоза крупного рогатого скота, ответственного за синтез гликопротевдного антигена ВЖРС. Показана принципиальная возможность использования в комплексе двух препаратов для иммунизации крупного рогатого скота: живого рекомбинантного вируса и инактивироваиного гликопротевдного антигейа ВЛКРС.

Апробация -работа. Результата диссертации доложены на: Всесоюзной научно-цроизводствен'лои конференции "Проблема оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота", Новосибирск, 1990 г.; научной конференции молодых ученых (ВЙЭВ, 1991 г.) к заседаниях Ученого совета ВИЭВ.

Публикации» По теме диссертации опубликовано три научные работы.

Объем и структура •работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсувдения результатов и выводов. Работа изложена на' 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 5 рисунками. Список лите-

ратуры включает 171 источник отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Работу проводили в Центральном отделе лейкозов, сравнительной и экспериментальной онкологии ВйЭВ и на экспериментальной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭЗ.

В Институте биологии гена АН России профессором А.Д.Альт-штейном с сотрудниками на основе двух штаммов осповакцины Lister и wrбыли сконструированы 9 рокомбкнаятных вариантов вирусов, содержащих полный ген eavjuv его компоненты, и имеющие tk~ фенотипы. Всего было 4 генноикженерные конструкции, обозначенные KI, К4, К7 и KI0, схема получения которых приведена на рлс.1.

Штаммы Li-BJIKPC-K4 и n-BJIKPC-M tk+исследовали на репро-

о

дуктивную активность в различных типах клеток млег.опитащих. На кроликах определяли антигенную активность только тех вариантов, для которых in vitro установлена экспрессия sp51 (конструкции К4 и KI0). Для изучения на телятах иммуногенных свойств был отобран штамм '«''Е-ВЛКРС-К4 tk* , показавший на кроликах более выраженную, по сравнению с другими штаммами, антигенную активность. Для контрольного заражения вакцинированных телят использовали культуральный BJEKPC, предварительно оттитрованный на овцах.

В работе использовали постоянно перевиваемые линии меток млекопитающих: почек зеленой мартышки ( cv-1), Yero , почек эмбриона свиньи (СПЭВ), трахеи плода коровы СТр),почек теленка (ПТ-80). Перевиваемые линии клеток культивировали в 250 мл матрасах с использованием среды Игла и гвдролизата лактальбумина, взятых в равных соотношениях, с добавлением 5-10$ сыворотки крови плодов коров и антибиотиков (пенициллин 100 ЕД/мл и сгреп-

«ря

gP30

АТС

Тготлн | , Tí 2.о тли L

шг.отлл!

1У2.0ТЛЛ

_Ген env BLV » pUCl9

Полный ген tnv |К4) Д í/lv<-L) 1KI) Д <itv(L+SpSl) 1К101 Л tiivUpíl) IK7I

Клонирование

• р varis

AHind Ш.(1.8тлн)

Др BR322

промотор nOKCíMpyClíÓnO гена бели 7.5 К (0,3 тлд)

IIШ

I_

scrpoAjcjBHliidüIJ фрагмент генома вируса оспояакцниы (Шетли WR)

асе

' ) • f

ищ

env (i> u тлн

4.8глл

Í.9tjih

1 cnv (JJ 1.9 TJUI

a;

Д cdv щ) lo тлн

BLV-K4 BLV-K1 BLV-K10 BLV-K7

u^) « tjlh

Ряс. I. Схема конструирования рекомбинантных вирусов осповакцины, содержащих нуклеотидные последовательности гена ват вируса лейкоза крупного рогатого скота

томивдн 100 мкг/мл). Посадочная концентрация клеток составила 5 х 10^ в I мл. Культивировали в течение 5-7 суток при 37°С. Морфологию клеток оценивали в нативных или фиксированных метанолом и окрашенных гематоксялин-эозшом препаратах.

В оштах были использованы 33 кролика породы белый и серый великан весом 2-3 кг, 16 телят 6-8-месячного возраста черно-пестрой породы, 16 полугрубошерстных овец 6-8-месячного возраста.

В работе применяли иммунологические реакции: реакцию имму-нодиффузии в геле агара (РИД), иммуноферментный анализ ШФА), реакцию нейтрализации псевдотипов вируса везикулярного стоматита ВЛКРС (РНПТ). Для выявления ВЛКРС у вакцинированных телят-после контрольного заражения использовали метод биологической пробы на овцах.

Статистическуп обработку результатов проводили общеприняты-

с

мп методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Сравнительная оценка репродукции рекомбннантов та-ВЛКРС-К4

и Ы-ВЛКРС-К4 в культуре клеток су-1_

Клетки су-1 выращивали в 500 мл матрасах. После формирования монослоя клетки заражали рекомбинантшии штаммами га-ВЛХРС-К4 и Ы-ВЛКРС-К4 из расчета 1-2 БОЕ на клетку. В1фус адсорбировали в течение I ч при комнатной температуре. Затем в матрас вносили поддерживающую среду с 2% сыворотки эмбриона коровы и инкубировали при 37°С, контролируя визуально состояние монослоя с помощью приставки фазового контраста для инвертированного микроскопа. Кроме того заражали клетки, выращенные на покровных стеклах в пробирках. Проводили отбор покровных стекол через 4, 8, 12, 18, 20, 24, 36, 48 л 72 часа после заражения. Клетки фиксировали метиловым спиртом, окрашивали гематоксилин-эозином и заключали в бальзам. Всего было приготовлено 3 серии клеточных

культур на матрасах и проанализировано 425 препаратов на noiqpoB-ных стеклах.

Первые изменения, характерные для цитопатогенного действия вирусов оспоЕакцины, отмечали через 12 часов после заражения клеток штаммов РВВ та -В JTKPC-K4 tk+ , тогда как в клетках, инфицированных штаммом Li-BJKPC-K4, аналогичные изменения в монослое наблюдали только после 16-18-часового культивирования. Через 48 часов после заражения клеток штаммом m -ВЛКРС-К4 tk+монослой был полностью разрушен. В культуре, зараженной рекомбинан-том Ы—ВЛКРС-К4, аналогичные изменения наблюдали через 52 часа культивирования. В эти периода в хультуральной жидкости оцреде-ляли титр вируса осповакцияы. В трех сериях опытов были получены средние величины накопления в культуральной жидкости реком-бинантных вирусов, которые составили для WB-BJIKPC-K4 tk+ и Li-ВЛКРС-К4 1,05 х 306 и 5,2 х Ю5 БОЕ/мл соответственно.

Накопление рекомбинактного вируса осповакцины штамм та-ВЛКРС-К4 tic4в различных клеточных культурах

Линии клеток cv-1 , Vero , СПЭВ, Тр. ПТ-80 выращивали в .одинаковых условиях в матрасах объемом 250 мл. После формирова-. ния клеточного монослоя, на 4-5 сутки, клетки заражали путем внесения в каждый матрас по 3 мл суспензии вирусной расплодки штамма WR-BJIKPC-K4 tk+c титром 106Б0Е/мд, что составило I БОЕ на клетку. После адсорбции вируса в течение I часа при комнатной температуре в матрасы вносили по 50 ыл поддергивающей среда и инкубировали при 37°С в течение 72 часов. Затем отбирали куль-' туралькую жидкость и определяли в ней титр вируса (табл.1).Сравнительное изучение'различных культур клеток показало, что цито-патогенное действие, характерное для вируса осповакцины, было только в культурах клеток cv-i и vero , тогда как в монослое клеток СПЭВ, Тр, ПТ-80 цитопатогенный аффект не наблюдали.

Таблица I

Показатели инфекционных титров в БОЕ рекомбинантного штамма WR-BIKPC-K4 tJc+в куль тура льной жидкости клеток различных линий через 72 часа после их заражения

Название культуры клеток ! Тиар вируса в БОЕ/мл

cv-1 1,2 х I06

Vero 7,2 х I05

СПЭВ 30

Тр 30

ПТ-80 42

Как видно из таблицы активная репродукция рекомбинантов (РВВ) была только в культурах клеток cv-1 и Vero , тогда как в культурах клеток СПЭВ, Тр и ПТ-80 отмечали лишь остаточную активнооть расплодки вируса, внесенного в момент заражения клеток.

Накопление 'М-ВЖРС-К4 №+и 5р51антигена вируса лейкоза в культурах СУ-1 и Varo

В опыте использовали рекомбинантный и исходный m штатам вируса осповакцины.

На сформированный монослой клеток cv-1 и Vero , выращенных в 500 мл матрасах, вносили расплодки вируса с титром 10®Б0Е/мл нз расчета 0,5 БОЕ на клетку. Через I час в каждый матрас вносили по 50 мл поддерживающей среда и инкубировали при 37°С в i

течение 72 часов. Отбор проб культуральной жидкости проводили через 12, 18, 24, 36, 42, 48, 60, 66 и 72 часа. Результаты исследования приведены на рис.2.

log PFU/ml

Рдо.2. График титрации почасовых проб культу-ральной жидкости клеток cv-1 я Tero , зараженных рекомбинангным та-ВЖРС-К4 -tk+ и исходным штаммом № вируоа ооповакцюы

Как видно из рисунка репликация рекомбинвнтного вируса происходила интенсивнее в культуре клеток ст-1 ¡чем вУегои характеризовалась полным разруиениеы клеточного монослоя вирусом ооповакцины через 42 часа и рекомбинантным вариантом вируса через 48 ч после заражения.

Уровень экспрессии рекомбююнтного gp5i антигена ВЛКРС в культуральной жидкости определяли в ИФА (табл.2). В ИФА использовали fgs , выделенный из сыворотки крови естественно инфицированной вирусом лейкоза коровы, имевшей антитела к gp5t в титре I : 128 по данным РИД. Иммуноглобулин сорбировали на лунки из

полистерола в после внесения испытуемой пробы культуральной яид-хооти выявляли связавшийся антиген с помощью того же препарата igG , но уже меченного пероксидазой.

Таблица 2

Результаты исследования в ИФА культур клеток 07-1 и Vero, инфицированных рекомбинантом «VR -ВЛКРС-К4

Время культивиро-, Разведения культуральной жидкости ~~

жения Wac) i 1 :2 ! :4 ! :8 ! : 16 ! :2 Г «I ! :4 . V ., . . ! :8 ! :16

12 I I I I I I I I

18 0,72 0,60 0,11 0 0,83 0,64 0,12 0

24 0,81 0,67 0,04 0.1 0,21 0,38 0,03 0

36 0,95 0,63 0,18 0.3 0,93 0,63 0,18 0

42 1,88 1,08 0,87 4,12 0,94 0,52 0,53 3,78

48 1,27 0,97 0,72 3,91 1,45 1.07 1,68 2?60

60 - - - - 1,74 1,36 2,06 5,56

66 - - - 1,50 1,30 2,07 3,53

72 - - - - 1,60 1,27 1,46, 2,77

Результаты, представленные в табл.2 показывают, что накопление гликопротеидного антигена ВЛКРС в культуральной жидкости клеток cir-i происходит более интенсивно по сравнение с клетками Vero и достигает максимума через 48 часов после заражения. В культуре клеток Vero рекомбянантный sp51 выявляли через 42 часа и к 48-60 часам отмечали пик его экспрессии (рис.3).

' Сравнение динамики накопления ' ЯВ-ВЖРС-К4 tk+ в культуральной жидкости клеток Vero и рекомбинантного гликопротеида показало, что сроки появления вируса и обнаружения в ®А gp5l антигена совпадают и приходятся на 42 часа- ■

WR-BLV-K4|tM Vero

Рио.З. 3?рафик ИФА почасовых проб культуральной кидкооти клеток vero , зараженных реком-бинантным «Н-влкРС-К4 "

Обозначения: (:2, :4, :8, :16 - разведе-. кия культуральнсЧ жидкости).

Выявление внутриклеточного вируса та-ВЖРС-К4Ък+в клетках

• СУ-1_

Внутриклеточное накопление вируса изучали в клетках ст-1 , выращенных в 1500 мл Клияских матрасах, которые на 3-4 сутки за-. .

ражали вирусом из расчета 0,5 БОЕ на одну клетку. После внесения в матрасы поддерживающей ореда культивировали клетки при 37°С и через 6, 9, 12, 18 и 24 часа брали по одному матрасу, жидкость удаляли, клетки снимали со стекла 0,02$ раствором версёна и определяли их общее количество. Затем суспензии клеток центрифугиро-

вали при ЗОООв в осадок ресуспевдировали в 5 мл дистиллированной вода.. Клетки разрушали путем трехкратного замораживания и оттаивания о последуодей обработкой суспензии ультразвуком при 20 в течение 5 мин. Суспензию осветляли методом низкоскоростного центрифугирования и в надооадочной жидкости определяли инфекционную активность вируса. Результаты исследования приведены в табл. 3.

Таблица 3

Внутриклеточное накопление вируса мв -ВЛКРС-К4 в клетках в динамике их культивирования

Время после заражения !_Титр вируса_■

клеток вирусом (час) ! БрЕДи ! БОБ/5 мл ! БОЕ/ИО клеток

6 3100 15500' 0,03

9 5200 26000 0,05

12 61000 305000 0,67

18 4800000 24000000 53,33

24 420000 2100000 4,66

Интенсивное накопление внутриклеточных вирионов отмечали через 18 часов пооле их заражения. В этот период на 100 клеток при-ходилооь 53,33 БОЕ. Через 24 часа количество внутриклеточных вирионов, резко уменьшалось до 4,66 БОЕ на 100 клеток.

Сравните^ноо изучение репродукции рекомбинантного вируса в различных клеточных системах полазало более интенсивное размножение, штамма та -ВЖРС-К4 -Ыс* до сравнении со шташо1лЫ-ВЛКРС-К4.

В культуре клэток су-1 полное ЦПД та -ВЛКРС-К4 наступало раньше и сопровождалось накоплением в куль тура льной жидкости вируса в высоком тигре, который достигал максимума к 48 ч и составлял 0,5' - I БОЕ на одну клетку. Это поолужило основанием для выбора линии клеток от-1 как оптимальной клеточной сиотещ для на-

работки рекомбинантных вирусов.

Изучение антигенных свойств штаммов осповакцины. экспрессирустих поверхностный гдикоггротеид BJIKPG

Антигенную активность изучали у тех штаммов рекомбинантных вирусов, у которых in vitro была выявлена экспрессия gp5i антигена ВЛКРС.

Кроликам 5 груш на скарифицированный участок кожи наносили по 0,2 мл суспензии испытуемого рекомбинантного'вируса о титром Ю^БОЕ в I мл, смешанного с равным объемом глицерина, и втирали ее в кожу стеклянной палочкой. У кроликов на месте введения вируса развивалось характерное для поксвирусов местное воспаление кожи. На 3-4 сутки отмечали выраженную припухлость за счет воспалительного отека и клеточной инфильтрации основы кожи и подкожной клетчатки. На поверхности кожи обнаруживали серозный эксудат, затем корочки и очаговый некроз кожи. Ревакцинацию проводили через 12 недель таким же способом.

По ходу опыта кровь животных исследовали серологическим методом в РИД, ИФА, РНПТ на наличие антител к ВЛКРС. Схема опыта и результаты серологического исследования приведены в табл. 4.

Как показано в табл.4 у кроликов 2 и 5 групп рекомбинанты Li -ВЛКРС-К10 и '«R-BJKPC-KI0, которые экспресоировали только gp51'антиген без gp50 , не индуцировали образование в крови антител против gp51 ВЛКРС.

В первой группе у 4 из 5 кроликов, инокулированннх Ы-ВЛКРО-К4, антитела против gp5t ВЛКРС в РИД и РНПТ обнаруживали только после ревакцинации животных этим же вирусом. У одного кролика этой группы антитела на gp5i были выявлены через I месяц после первой вакцинации. В 4 группе у всех кроликов обнаруживали через 1-2 месяца после однократной накожной вакцинации антитела против gp5i . Рекомбинант с восстановленным tk-фенотипом (тр.З) обладал

выраженной биологической активностью, которая проявлялась более выоокими титрами антител, выявляемых в РНПТ, по сравнению о кроликами четвертой группы, привитыми ™~ВЛКРС-К4.

Таблица 4

Результаты серологического исследования в РИД кроликов, иммунизированных рекомбинантными штаммами вирусов оспы

&ГЛ6 П9РВ0Г0 введ9НИЯ ^в

! ! 0 ! I ! 2 ! 3 ! 4 1 ! 5 ? 6

I Ы-ВЛКРС-К4 0/5 1/5 1/5 4/5 4/5 4/5 5/5

2 Ы-ВЛКРС-К10 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5

3 *Н-ВЛКРС-К4 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3

4 »Н-ВЛКРС-К4 0/3 2/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3

5 та-ВЛКРС-КЮ 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3

Примечание: - в знаменателе показано количество иммунизированных кроликов;

- в числителе - количество кроликов о антителами к вр51 антигену ВЛКРС.

У яивотных всех пяти груш, привитых различными рекомбинан-тами, были выявлены антитела, нейтралнзуодие вирус ооповакцинн. Высокие титры антител отмечали у кроликов, привитых рекомбшган-тами на основе вируса штамма чш , по сравнению о кроликами, привиты?.® рэкоибинаяталет, оконс труировалными на основе вируса штаг.ма Ыо/Ьаг.

! ■ В опытах на кроликах была установлена антигенная активность только тех рекомбинантов, которые с о дерзали полный ген ешгВЛКРС Ч 5р51-врЗО). Рекомбинантн, содержащие только экспреооирушдае последовательности, иодирующие ер51 ВЛКРС, нэ индуцировали у кроликов оинтэз анти-8р51 антител. Антигенность РВВ усиливалась при

использовании в качестве вектора осповакцины штамм та о восстановленным tk+ фенотипом.

Гипериммунизация кроликов глккопротвидом ВЛКРС, ассоции-

рованнкм о цитоплазматдчаокими клеточными мембранами

Выделение рекомбинантного гликопротеида ВЛКРС проводили по методу Barrett et.ax.(Г989), описанному для рекомбинантного gplöO HIV-1 .

Клетки через 20-24 часа после заражения РВВ собирали, разрушали и выделяли клеточные мембраны, из которых экстрагировали гликопротеида. Полученный препарат перед иммунизацией смешивали с равным объемом 0,6% суспензии гидроокиси алюминия и вводили каждому кролику внутримышечно в области правого бедра по 0,33 мл препарата, содержащего 2,7 мг/мл белка. Цикл гипериммунизации состоял из 8 инъекций с двухнедельным интервалом. Перед каждым введением препарата и после цикла гипериммуниз8ции у кроликов брали кровь и исследовали на наличке антител к гликопротеиду ВЛКРС в РИД, ИМ, РНПТ. В опыте было 14 кроликов, распределенных , в 4 опытные группы по 3 животных, и в контрольной группе - 2 кролика.

Животным первой группы вводили препарат, полученный после заражения клеток GV-1 рекомбинантным вирусом штамм га-ВЖРС-К4 tk; животным второй группы - препарат, приготовленный из клеток су-1, инфицированных исходным вирусом осповакцины штамм га . Кроликам третьей и четвертой групп вводили экстракты цитоплазматических мембран, приготовленные из клеток ФЛК-ВЛКРС и инфицированных вирусом осповакцины клеток cv-1 . Дозу каждого из 4 препаратов определяли по содержанию белка. Гипериммунные сыворотки кроликов исследовали на содержание анти-ВЛКРС антител и определяли также титр нейтрализующих антител против вируса осповакцины по подавле-

них фокусов цитопатогеиного действия в культуре клеток су-1 . Приготовление ассоциированного с цитоплазматическими мембранами рекомбинантного гликопротеида ВЛКРС, гипериммунизацию кроликов проводили совместно со старшим научным сотрудником Центрального отдела лейкозов, к.б.н. Л.А.Макаровой. Патологоанатомические и гистологические исследования животных проводили совместно о научным сотрудником Центрального отдела лейкозов А.В.Васиным.

Результаты опытов показали, что гипериммунизация кроликов белковыми препаратами, приготовленными путем экстракции гликопро-теидов, ассоциированных с клеточными мембранами, не вызвала у животных образования антител к гликопротеидиому антигену ВЛКРС.

Иммуногенные свойства рекомбинантного вектора "ТО-ВЛКРС-К4 tk+

Опыт поставлен на 16 телятах 6-8-месячного возраста, приобретенных в благополучном по лейкозу и другим инфекционным болезням хозяйстве. За 2 месяца до начала опыта у них была исключена естественная ВЛКРС-ннфекция трехкратным серологическим исследованием в РИД и Шк. Изучали иммуногенные свойства рекомбинантного вакцинного штамма wa -ВЛКРС-К4 tk+ , который в опытах на кроликах показал более выраженную антигенную активность gp5i антигена ВЛКРС по сравнению о другими рекомбинантами.

Каждому теленку на скарифицированный участок кожи в области нижней трети.шеи наносили по 0,5 мл вирусной суспензии в 50$ раствора глицерина с титром 2 х I08 БОЕ/мл. Животных групп А и Б вакдшщроволи вирусом штага ш -ВЛКРС-К4 tk+, живот!ШХ групп В и Г - исходным вирусом вакцпш штамм та .

Третьи иммунизацию проводила через 15 недель после начала опыта па телятах групп Б и Г, которым внутримышечно ввели по 5 мл инактивированного 5Р51-антигона, полученного путем концентрирования кулътуральпоЗ шдхостз ФЛК-ВЖРС. Тлтр gp5i -антигена до

сорбции его гидроокисью алюминия составил в РИД 1:8.

Обнаружение или исключение ВЛКРС у телят проводили методом биопробы на овцах. Напряженность иммунитета проверяли путем контрольного заражения ВЛКРС вакцинированных телят. Через 3 месяца после заражения у них брали по I мл крови, стабилизировали три-лоном В и вводили от каждого теленка подкожно одной овце. У овец в течение 4 месяцев регулярно брали кровь через каждый месяц и серологическим методом в РИД исследовали на анти-ВЛКРС антитела. Результат биопробы считали положительным, если за период наблюдения у овец обнаруживали антитела к ВЛКРС.

У всех телят после первой иммунизации развивалась местная (кожная) и общая (температура тела) реакции, характерные для ооповакцины.

Местная реакция у телят проявлялась воспалительным отеком скарифицированного участка кожи, формированием характерных оспин, корочек и появлением трещин в коже. При пальпации отмечали болезненность воспалительного участка кожи. Воспалительная реакция достигала максимума на 4 день, затем постепенно состояние кожи нормализовалось. Одновременно отмечали региональный лимфаденит предлопаточного лимфоузла, который увеличивался в 2 раза. Через неделю размеры лимфоузлов уменьшились, и на 10-12 день их состояние Нормализовалось.

Общая реакция организма на прививку вируса осповакцины характеризовалась повышением температуры тела животного. Пик температуры тела у животных в группах, привитых РВВ и ВВ,'отмечали на 4 день после вакцинации. Максимальная средняя вечерняя температура тела у животных составила 39,5°С ± 0,2 и 39,8°С ± 0,1 соответственно.

Двухкратная прививка РВВ телят групп А и Б не индуцировала у них выработку анти-ёр51 антител ВЛКРС. Сыворотки, полученные

от этих животных в течение 15 недель после начала опыта, были отрицательными в РИД, ИФА и РНПТ. Однократная внутримышечная инъекция инактивированного вр51 антигена ВЛКРС вызывала образование специфических антител только у телят группы Б, тогда как телята группа Г остались серологически отрицательными. Следовательно, инактивированный ер51 антиген ВЖРС у этих животных оказал действие бустера и вызвал образование анти-вр51 антител по типу вторичного иммунного ответа только у телят группы Б.

Через две недели после контрольного заражения животных ВЖРС анти-йр51 антитела появились у 3 из 4 животных в группе А, тогда как телята групп В и Г в этот период оставались серонегатив-пнш, у них антитела были обнаружены только спустя 5 недель (группа Г) и 10. недель (группа В) после заражения. Появление анти-ВЛКРС антител у вакцинированных животных свидетельствует о развитии инфекционного процесса после введения разрешающей дозы ВЛКРС. Однако, сокращение срока появление антител до двух недель у животных, привитых рекомбинантным вирусом, вместо 10 недель, когда антитела появились впервые у животных, привитых исходным вирусом штамм та , позволяет считать, что образование специфических антител у вакцинированных животных группы А протекало по типу вторичного иммунного ответа. При этом роль бустера у них играл юболочечный глинопротеид, который накапливался в организме животных,-зараженных ВЛКРС. ВЛКРС бил реизолирован методом биопробы па овцах у 3 из 4 телят группы А. У телят Ш 3696 и 3618 в группа Б через 10 дней посла введения разрешающей дозы ВЛКРС, титр антител к вр51 снизился до уровня, не выявляемого в РИД, и пробы крови, взятые в этот период, были неинфекционнм для овец. У телят ЛЙ 3691 и 3637 антитола пэрскотировали в течение 13 недель после контрольного заражения. Однако ВЛКРС был реизолирован из крови только у теленка # 3637. .

Телята группы В, привитые исходным вирусом осповакцины, штамм «я , заразились ВЛКРС, в биопробе у всех овец обнаружили сероконверсию через 8 недель после заражения. У овец группы В, по сравнению с овцами групп А, Б, Г был отмечен самый короткий . инкубационный период с момента заражения до появления анти-ВЖРС антител. Известно, что между продолжительностью инкубационного периода и инфекционной дозой существует обратная зависимость, следовательно удлинение инкубационного периода'связано с уменьшением количества инфекционного вируса в единице объема вводимой овцам крови телят.

Таким образом, у телят не удалось индуцировать образование анти- ер51 антител, выявляемых в РИД, ЙФА, РШТ даже после ревакцинации, проведенной через 3 месяца. Последующее однократное внутримышечное введение инактивированного гликопротеидного антигена ВЛКРС, приготовленного из культуральной жидкости ФЛК-ВЛКРС и сорбированного на гидроокиси алкминия, способствовало усилению синтеза анти- &р51 антител, содержание которых в крови привитых животных достигало уровня, выявляемого в РИД. Тохяа как у телят, привитых исходным вирусом оспы штамм ян, получивших однократную инъекцию инактивированного антигенного препарата, гуморального ответа не обнаружено.

ВЫВОДЫ

1. Изучены культуральные, антигенные и иммуногенные свойства рекомбинантных вакцинных векторов, среда которых выявлено 5 вариантов, экспрессирувдих ген оболочечного гликопротеида ВЛКРС. Экспрессия продукта гена ешг была возможна только для конструкций, содержащих икггактную лидерную зону.

2. Культивирование рекомбинантных вирусов в различных клеточных системах показало, что к рекомбинантным вирусам чувстви-

тельны культуры клеток cv-1и Vero , тогда как в культурах ПТ-80, Тр, СПЭВ вирусы не размножались. Репликация вируса штамма га-ВЛКРС-К4 tk+в клетках cv-1 происходит более интенсивно, чем в клетках Vercv это проявлялось в сокращении времени появления первых признаков цитопатогаиного действия в среднем на 4 часа; наступлением полной вирусопецифической дегенерации клеточного монослоя через 48 часов против 72 часов в культуре клеток Vero а более высокими титрам накопления вирусов и гликолротеидного антигена ВЖРС в культурзльной среде,

3. Изучение рекомбинантншс векторов, полученных на основе двух штаммов осповакцини Ltstern та показало, что наиболее интенсивная репродукция в культуре клеток cv-1 была у штамма

га -ВЛКРС-К4 tk+B сравнении со итаммом ы-ВЛКРС-К4.

4. Разработан режим культивирования рекомбинантного вируса ТО-ВЖРС-К4 tk+ , позволяющий получать максимальный выход экоп-

рессируемого им гликопротеидного антигена ВЖРС. Режим культиви-' рования контролировался ороком проявления полного цитопатогеиного действия рекомбинанта. Максимальный титр антигена обнаруживали через 48 часов после заражения клеток культуры cv-1 .

5. В опытах на кроликах изучены антигенные свойства рекомби-нантшх вакцинных вирусов. Установлено, что антигенно активными былп только рекомбипантнне вирусы, которые содержали полный ген

env gp5l-sp30 ВЛКРС. Титры антител, нейтрализующие ВВ, били бо-лэа высокими у кроликов, привитых рехомбинантныи вирусом на основе штамма Ш.

6. Внутршсожная, двукратная о интервалом 3 месяца, аппликация телятам реномбннангного вируса осповакцпш WH-BJIKPC-K4 tk+ , содержащего полный экспросоирукщий ген, кодирующий оболочзчньй глп-копротеид ВЛКРС, сопровоздалаоь местной специфической для оспо-

вакцины воспалительной реакцией кожи, регионарный лимфаденитом и повышением температуры тела животного. Посла последующего внутримышечного введения этим телятам шактивироваиного gp5i антигена ВЛКРС в оыворотке крови . выявляли анти- gp5i антитела о помощью РИД.

7, У телят, привитых только исходным штаммом *в осповакцины и затем инактивированным gp5i антигеном ВЛКРС, анти- gp5i антитела не обнаруживали.

8. После консольного заражения ВЛКРС вакцинированных телят, у трех из четырех животных отмечали протективный иммунный ответ. Методом биопробы на овцах в крови зараженных телят ВЛКРС не обнаружен. Тогда как все телята, привитые исходным штаммом осповакцины ш , после контрольного введения им ВЛКРС заразились, и методом биопробы на овцах в крови телят был обнаружен ВЖРС.

Список работ, опубликованных по теме диссертаций

1. Сверчков A.B., Макарова Л.А., Валихов А.Ф., Альтштейн А.Д. Характеристика продукта env гена БЯВ, экспрессируемого рекомби-нантным вирусом осповакцины.// Тезисы докл. Всеоош.научно-практ. конф.Проблемы оздоровления хозяйств от лейкоза круп.рог.скота. Новосибирск, 1990, 0.43-44.

2. Валихов А.Ф., Кузьмичев B.C., Иванова Л.А., Сверчков A.B., Бурба Л.Г., Шишков В.П., Альтштейн А.Д., Бендукидзе. К.А., Захарова 1.Г., Гринекко Н.Ф. .Кряжевская М.В. Изучение имцуногенных свойств рекомбинантов вируса осповакцины, экспрессирующих env ген вируса лейкоза крупного рогатого скота.// Тезисы докл.Всесоюз.на-учно-практ.конф. Проблемы оздоровления хозяйств от лейкоза круп, рог.скота. Новосибирск, 1990, с.76-77.

3. Валюсов А.Ф., Кузьмичев B.C., Иванова I.A., Сверчков A.B., Макарова Л.А., Илышенко С.Б., Бендукидзе К.А., Захарова Л.Г., Гринашсо Н.Ф., Кряхевская М.В., Альтштейн А.Д., Бурба Л.Г., Шишков В.П. Иммуногеннооть рекомбинантного вируоа ооповакцины, эко-преооирупцего оболочечннй глихопротеид вируоа лейкоза бычьего лейкоза.// Труда ВИЭВ, 1992. Т.70, с.89-97.

Подписано в печать 15.04.92. Заказ 579 Формат 60x84/16 . Тираж 120

Москва. Типография РАСХН