Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, экспрессирующих поверхностный гликопротеид вируса лейкоза крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, экспрессирующих поверхностный гликопротеид вируса лейкоза крупного рогатого скота"

ГГи 01

российская академия сельскохозяйственных наук

2 1 АПР 1997

всероссийский научно-исследовательский институтэкспериментальной ветеринарии имени Я.Р.КОВАЛЕНКО

11а правах рукописи

иванова александра владимировна

сравнительная характеристика рекомби11лнтных штаммов вируса осповакциньг, экспресснрующих

поверхностный гликопротеид вируса лейкоза крупного рогатого скота

03.00.23 - биотехнология 03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Москва - 1997

Работа выполнена в комплексной лаборатории но изучению лейкозов и злокачественных опухолей с/х животных Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. >1. р.Коваленко.

Научные руководители: доктор биологических наук

А.Ф.Валихов

член-корреспондент АЕН РФ, доктор медицинских наук, профессор

__А П А тплчптум'т---

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук, профессор Б.Г.Орлянкин (ВИЭВ)

Доктор биологических наук, профессор Б.С.Народицкий (ВНИИСБ)

Ведущая организация - Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина

ор

Защита диссертации состоится " Об " МО-Я 1997 г. в " на

заседании диссертационного совета К.020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовальском институте экспериментально» ветеринарии им. Я.Р.Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан "<3 " МО- РI А 1997 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Ф.Г.Трешков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лейкоз крупного рогатого скота относится к числу опухолевых заболеваний, индуцируемых вирусной инфекцией. Возбудителем является вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС). Это РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae, подсемейства Oncovirinae. Он входит в одну группу с возбудителем Т-клеточного лейкоза человека. ВЛ КРС, являясь экзогенным ретровирусом, имеет чрезвычайно широкое распространение среди животных, особенно в условиях индустриального животноводства с высокой концентрацией поголовья в хозяйствах. Инфицированность животных в некоторых стадах может превышать 50%. У части инфицированных животных развивается лимфоцитоз или опухолевая форма болезни, приводящая к гибели животных (Бурба Л.Г., 1977).

Мероприятия по борьбе с лейкозом направлены на предупреждение ВЛ КРС-инфекции, как этиологической основы заболевания. При низком уровне инфицированносги достаточно диагносцировать ВЛ КРС инфекцию с помощью хорошо разработанных серологических методов, а затем удалить зараженных животных из стада. Однако, в сильно пораженных хозяйствах такой подход не может быть использован по экономическим соображениям. В этом случае могла бы быть полезной вакцинация против ВЛ КРС, которая привела бы к резкому снижению процента зараженных животных, с последующим освобождением стада от них с помощью традиционных подходов (Шишков В.П.. Крикун В.А., 1979).

Современная биотехнология, основанная на методах генетической инженерии, позволяет разрабатывать вакцины нового типа. В частности, важным направлением является использование в качестве вектора вируса осповакцины (ВОВ) и других поксвирусов для создания живых рекомби-нантных вакцин (Альтштейн А.Д., Валихов А.Ф., 1992). В настоящее время создан набор рекомбинантов ВОВ (РВОВ), экспрессирующих env ген ВЛ КРС и отличающихся по: свойствам вируса-вектора; промотору, контроли-

рующему экспрессию епу гена; встроенной в вирус генно-инженерной конструкции. Сравнительное изучение этих рскомбинантов стало предметом настоящего исследования.

Цель ч задачи исследовании. Работа посвящена сравнительному изучению биологических свойств рекомбинантных штаммов ВОВ, экспресси-рующих оболочечный гликопротеид ВЛ КРС, полученных в лаборатория генетики вирусов НИИ биологии гена РАН.

В процессе выполнения настоящей работы решались следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение репродукции, экспрессии оболо-чечного антигена gp М ВЛ КРС, особенности цитопатического эффекта рекомбинантных штаммов ВОВ в культуре клеток.

2. Изучить на лабораторных животных иммунологические свойства и нейровирулентную активность рекомбинантов ВОВ.

3. Изучить накопление антигена gp 51 ВЛ КРС в куриных эмбрионах, зараженных рекомбинантными штаммами вируса осповакцины.

4. Изучить возможность применения рекомбинантных штаммов ВОВ, как источник антигена gp 51 в диагностических целях.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработка и изучение рекомбинантов ВОВ, экспрессирующих цр 51 ВЛ КРС, является новым научным направлением в области создания специфических средств профилактики лейкоза крупного рогатого ско га.

Проведено сравнительное изучение биологических и иммунологических свойств рекомбинантных штаммов ВОВ, экспрессирующих ген епу ВЛ КРС в культуре клеток, на животных и в куриных эмбрионах. Дана сравнительная оценка экспрессии йр 51 ВЛ КРС оригинальными рекомбинантами ВОВ. Впервые выявлен и изучен симпластообразующий эффект в культуре клеток. Показано существенное снижение нейровирулентной активности ) рекомбинантов по сравнению с исходными штаммами ВОВ. Установлено что рекомбинанты ВОВ могут быть использованы в качестве источника ан

тигена gp 51 для диагностических целей. Разработан и утвержден лабораторный регламент по изготовлению и контролю набора диагностикумов для выявления антител к гликопротеидному антигену ВЛ КРС методом иммуноферментного анализа (Москва, ВИЭВ 23.04.1996; Москва, НИИ биологии гена РАН 31.05.1996).

Изученные варианты рекомбинантных штаммов ВОВ в дальнейшем также могут использоваться для разработки живой вакцины против инфекции, вызванной ВЛ КРС.

Апробация работы. Результаты исследовании доложены:

на научно-практических конференциях: "Вирусные болезни сельскохозяйственных животных" (Владимир, 1995), "Ретровируспые п прионные инфекции животных" (Москва, 1995); на научно-производственной конференции (Курск, 1996); на 10-ом международном конгрессе по вирусологии (Израиль, Иерусалим, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы (84 отечественных и 202 зарубежных источника) и приложения. Работа содержит 13 таблиц и иллюстрирована 21 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа была выполнена в комплексной лаборатории по изучению лейкозов и злокачественных опухолей с/х животных ВИЭВ, в лаборатории генетики вирусов НИИ биологии гена РАН, на опытной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ о.Лисий. Отдельные исследования проведены совместно с сотрудниками НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалея и НИИ вирусных препаратов РАМН.

Объектом исследования являлись рекомбинантные штаммы ВОВ, экспрессирующие поверхностный гликопротеид ВЛ КРС, полученные в ла-

боратории генетики вирусов НИИ биологии гена РАН под руководством д.м.н., профессора А.Д.Альтштейна, Рекомбинанты отличались друг от друга по вирусу-вектору, промотору и Ис-фенотипу (табл. 1).

Все вирусы были накоплены в культуре клеток СУ - 1 и хранились при -20" С. ВОВ и его рекомбинанты титровали в культуре СУ - I методом бляшек без агара.

Таблица 1

Исходные и рекомбинантные ВОВ, использованные в работе

Исход- Обозначения Промо- Встроенный Фрагмент Экспрес-

ный рекомбинантов тор ген генома сия gp 51

-Шфус ■ (Ilind III) BJI КРС

WR-BLV-K4- tK+ Р 7,5 РР L-gp 51 - gp 30 tK HSV J F +

WR-KI-BLV Р 7,5 gp 51 - gp 30 J -

WR - К7 - BLV Р 7,5 gp51 J -

WR-K10-BLV Р 7,5 L - gp 51 - tK J +

WR 18-2-WR-BLV-65 ранне-поздний синтетический L - gp 51 -gp 30 -P 7,5 - lac Z J +

6-4-WR-BLV-601 поздний синтетический L-gp 51 -gp 30-P 7,5 - lac Z J +

Lister 20-1-L-BLV- 65 ранне-поздний синтетический L - gp 51 -gp 30 -P 7,5 - lac Z К +

Примечание: 1. Все рекомбинанты имеют не фенотип за счет встрой ки чужеродных генов в 1к-ген ВОВ. В рекомбинанте \¥11 - ВЬУ - К4 - 1к+

tK+ фенотип восстановлен за счет встройки ti< гена вируса простого герпеса HSV в Hind III F фрагмент генома ВОВ.

2. L-лидерная область; gp 51 и gp 30 области env гена ВЛ КРС (BLV),A кодирующие соответствующие белки.

3. lac Z - ген ß - галактозидазы Е. coli.

В работе использовали следующие перевиваемые культуры клеток:

- FLK - BVL - почки эмбриона овцы, хронически инфицированной В Л КРС;

- CV - 1 - почки зеленой мартышки;

- 293 - почки эмбриона человека;

- Rat 2tK-- почки эмбриона крысы.

Все клеточные линии были получены из лаборатории генетики вирусов НИИ биологии гена РАН и выращены по общепринятой методике в стационарном режиме культивирования.

В опыте по изучению иммунологических свойств рекомбииантов ВОВ использовали 15 кроликов породы белый великан в возрасте 9-11 месяцев. Кроликам опытных групп на скарифицированную поверхность кожи в предлопаточной области втирали 0,6 мл суспензии рекомбинантного вируса (титр 107 БОЕ/мл), смешанную с равным объемом глицерина. Через 2 месяца после первичной иммунизации, животных опытных групп ревакцини-ровали тем же способом, а еще через 1 месяц проводили заражение животных опытных и шггактной групп путем введения в ушную вену суспензии лейкоцитов, взятых от больной лейкозом коровы, из расчета 10 ООО клеток на животное. Периодически брали кровь для серологических исследований в РДП и ИФА.

РДП ставили согласно "Временному наставлению, по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота", утвержденному ГУВ Госагропрома СССР 30.04.87 г.

Постановку ИФЛ осуществляли в трех вариантах (прямом, непрямом и конкурентном) совместно с научным сотрудником Л.А.Ивановой (ВИЭВ).

Изучение нейровирулентной активности рекомбинантных штаммоЕ ВОВ проводили на мышах линии BALb/c весом 10-12 гр (8 мышей на группу), которых заражали внутрицеребралыю по 0,03 мл вируссодержащей жидкостью в разведениях 10°, Ю1, Ю'2, Ю-3. В опыте использовали 220 мышей. Наблюдение за клиническими признаками инфекции пели в течение 14 дней. Работа была выполнена на базе НИИ вирусологических препаратов РАМН в лаборатории генной инженерии под руководством В.Р.Ярулина, СОЬместно с к.о.н. Г.П.Антоновой. Выборочно у погибших животных брали головной мозг. Совместно с научным сотрудником А.В.Васиным (ВИЭВ) были получены гистологические препараты головного мозга мышей по общепринятой методике.

Для изучения накопления gp 51 ВЛ КРС в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), 450 РКЭ 9- и 12-дневного срока инкубации от кур племенной яичной породы Легорн (из птицеводческого хозяйства г.Птицеграда Сергиево-Посадского района Московской области) заражали путем введения 0,1 мл культурального рекомбинангного вируса с титром 107 БОЕ/мл в различных разведениях, тремя способами: на хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), в аллантоисную полость, в куриный эмбрион. Использовали стандартную методику заражения РКЭ. После 24, 48, 72 часов инкубирования от РКЭ отбирали аллантоисную жидкость. ХАО, эмбрионы (из двух последних материалов готовили суспензию) и центрифугировали 40 мин при 3000 об/мин. В надосадочную жидкость для подавления ферментов добавляли PMSP и ЫаЫз в качестве бактериостатика, маркировали и хранили при -70° С. Полученный материал исследовали в РДП и ИФА.

Цитопатогенное действие рекомбинантных штаммов ВОВ в культуре клеток СУ - 1 изучали после окрашивания монослоя клеток гематоксилином-эозином (Дьяконов Л.П., 1986).

Электронно-микроскопические исследования клеток С\'-1, зараженных рекомбинантами ВОВ, осуществляли общепринятым методом ультратонких срезов в НИИ микробиологии и эпидемиологии им. Н.Ф.Гамалея, в лаборатории ассоциированных инфекций под руководством к.б.н. Г.Г.Миллер.

Результаты исследования обрабатывали статистическими методами дисперсионного и корреляционного анализа (Лакин Г.Ф., 1980).

результаты исследования

Репродукция рекотбинаитов ВОВ и экспрессия цр 51 в культуре клеток

Репродукцию РВОВ, экспрсссирующих gp 51 ВЛ КРС, изучали в культуре клеток СУ - 1. Монослой клеток, выращенный в 24-луночных панелях, заражали РВОВ с множественностью 2 -3 БОЕ/клетка. После адсорбции вируса в течение 1 часа при комнатной температуре зараженный монослой промывали раствором Эрла и инкубировали в поддерживающей среде, в атмосфере с содержанием СО: до 5%, до наступления полного цитопато-генного действия (ЦПД). Остатки клеточного монослоя и культуральную среду собирали вместе, подвергали трехкратному замораживанию-оттаиванию и центрифугировали при 2000 об/мин, 10 мин. Надосадочную жидкость титровали с клетках СУ - 1 методом бляшек без агара. Результаты опыта представлены в таблице 2.

Таблица 2

Накопление рекомбинаптных ВОВ, экспрессирующих gp 51 ВЛ КРС

в клетках CV - 1

Вирус Титр (БОЕ/мл)

WR Ю7^

WR - BLY - 65 10^'

W-BLV-601

W - BLV - К4 - tK+

Lister ]0<VJ

L - BLV - 65 L - BLV - 601 __10M__

Все рекомбиианты размножались в клетках CV - 1, однако их титр несколько ниже, чем титр соответствующих исходных вирусов. По-видимому, продукция нерекомбинантных белков несколько снижает репродукцию ВОВ.

В аналогичном эксперименте культуральную жидкость и клетки отбирали по отдельности через 24, 48, 72 часа и исследовали иммунофермент-ным методом на содержание gp 51. Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из представленных данных, даже через 24 часа содержание gp 51 в культуральной жидкости выше, чем в клетках. В дальнейшем содержание gp 51 в клетках падает, а в культуральной жидкости возрастает. После наступления полного цитопатического эффекта (ЦПЭ) титр gp 51 снижается, по-видимому, в результате тепловой инактивации антигена и действия клеточных протеаз. Рекомбинанты WR - 65, WR - 601 и L - 65, содержащие синтетические поксвирусные промоторы, экспрессируют в 4 - 5 раз больше gp 51 по сравнению с WR - К4 - tK+.

Таблица 3

Динамика накопления антигена gp 51 в культуре клеток СУ - 1, зараженной рекомбинантами ВОВ - ВЛ КРС: зависимость от промотора и векторного

штамма

Исследуе- Ти гры gp 51 п НФА

Рскомбипант Промотор мый мате- Время после заражения, часы

ВОВ ВЛ КРС риал

24 48 72

WR - К4 - tK+ P 7,5 к ж 1:40 1:64 1:20

кл. 1:12 1:5 1:2

WR-BLV-65 ранне- кж 1:80 1:200 1:250

поздний кл. 1:80 1:13 1:16

синтетич.

WR - BLV-601 поздний кж 1:200 1:300 1:32

синтетич. кл. 1:40 1:13 1:3

L- BLV-601 ранне- кж 1:80 1:300 -

поздний кл. 1:40 1:100 -

синтетич.

Примечание: кж - культуральная жидкость кл - клетки.

Снмпластообразующий эффект, вызываемый рекомбинантами ВОВ в культуре клеток СУ -1

По скорости развития цитопатогенного действия в культуре клегок CV - 1 два исходных штамма вируса осповакцины значительно отличались друг от друга. Так полное ЦПД при тотальном заражении клеток Lister и WR наступало через 48 и 72 часа соответственно.

Цитопатогенное действие, вызываемое рекомбинантами ВОВ WR-601, WR - 65, Ь - 65, \\'К - К4 - 1к+, отличалось от ЦГ1Д исходных вирусов тем, что рекомбинанты ВОВ образовывали симпласты в культуре клеток. По-видимому, обнаруженный феномен симпласгообразования связан с экспрессией £р 51, симпластообразуюшие свойства которого хорошо известны.

Для цитологического изучения симпласгообразования, культуру клеток СУ - 1 выращивали на покровных стеклах по стандартной методике Монослой клеток заражали исходным и рекомбинантными вирусами с множественностью 2-3 БОЕ/клетка. Через 24, 36, 48 часов культивирования после заражения, клетки фиксировали раствором Буэна и окрашивали

гематоксилином-эозином._______

Таблица 4

Среднее число ядер в симластах, индуцируемых рекомбинантами ВОВ - ер 51 в клетках СУ - 1 (п = 25)

Рекомбинант ВОВ Время культивирования после заражения, часы

36 48

WR - К4 11,8 ±0,9 11,1 ±0,8

WR - 65 14,1 ± 1,3 22,6 ± 2,0

WR -601 25,5 ±2,1 56,2 ±6,6

Первые цитопатические изменения в клетках, зараженных исходными и рекомбинантными штаммами ВОВ, появлялись через 10-12 часов, и более четко их можно было наблюдать через 24 часа после заражения. Штамм Lister вызывал более быстрые и более интенсивные изменения в монослое клеток. В течение первых суток после заражения рекомбинантными штаммами в культуре отсутствовали многоядерные клетки. Позднее появились симпласты, содержащие 10-15 ядер. В дальнейшем происходило постепенное увеличение числа ядер в симпластах (табл. 4). У WR - К4 - 1к+ симплас-тообразование было менее выражено.

Симпластообразование коррелировало с уровнем экспрессии gp 51. Особенно интенсивно оно наблюдалось в клетках, зараженных рекомбинантами WR - 65, WR - 601 с высокой экспрессией gp 51.

В симпластах, на ультратонких срезах 48 часовой культуры клеток CV-1, после заражения WR - 601 отсутствовали пограничные мембраны между ядрами, а в цитоплазме находились скопления внутриклеточных ви-рионов ВОВ. Эти данные подтверждают симластную природу многоклеточных образований и демонстрируют возможность репликации вируса в симпластах.

Симпластообразующая активность рекомбинантных ВОВ была изучена также в культурах клеток почки человека (линия 293) и почки крысы (Rat 2). Более интенсивное симпласгообразование было в клетках линии 293, по сравнению с CV - 1 и оно полностью отсутствовало в клетках линии Rat 2 (табл. 5).

Важно отметить, что процесс симпластообразования вызывали только рекомбинанты, экспрессирующие полный продукт гена env (gp 51 - gp 30). Рекомбинант WR - BVL - К10, экспрессирующий только gp 51 ВЛ КРС, а также рекомбинант WR - BLV - К1 со встроенным геном env, но не экс-прессирующим его, таким эффектом не обладали. Таким образом, симплас-тообразование, наблюдаемое в зараженных рекомбинантами клетках, индуцируется только gp 51 - gp 30.

Таблица 5

Зависимость симпласгообразующей активности рекомбинантов ВОВ от

конструкции вирусного штамма и клеточной линии

Рекомбинант Относительная Симпластообразоваиие в клеточных

ВОВ экспрессия gp 51 линиях

(в усл. ед.) CV- 1 293 Rat 2

WR-K4 1,0 + +++ -

WR-65 4,7 ++ +++ -

L - 65 4,5 ++ +++ -

WR-601 5,0 ++ +++ -

Ь - 601 5,0 ++ +++ -

WR - К10 1,0 - - не исследов.

WR-K1 0 - не исследов. не исследов.

Примечание: уровень экспрессии gp 51 рекомбинантом WR - К4-принят за 1 ед.

При изучении распределения gp 51 между клетками и культуральной жидкостью установили, что он в основном содержится в культуральной жидкости. Возникает вопрос, как ёр 51 действует на клетки - из вне (из культуральной жидкости, где его больше, чем внутри клеток), или внугри-клеточно (где он определяется в свободной форме в меньшем количестве, но имеет особые условия для воздействия на клеточную мембрану). Была сделана попытка решить этот вопрос путем включения в среду иммунной сыворотки, содержащей антитела к gp 51. С этой целью клетки СУ - 1 заражали рекомбинантом \УЯ - 601 и добавляли в поддерживающую среду различные концентрации анти- ВЛ КРС сыворотки. В качестве контроля нс-нильлжиШ различные концентрации нормальной телячьей сыворотки (лишенной антител к ВЛ КРС) и бычьего альбумина. Полученные результаты представлены в таблице 6.

Как видно из таблицы 6 анти- ВЛ КРС сыворотка подавляла процесс симпластообразования при концентрации 4% (разведение 1:24). Следует однако отметить, что не только антитела, но и специфические белки, например альбумин, при достаточной концентрации так же подавлял симпластообразо-вание. Нормальная телячья сыворотка (НТС) подавляла симпластообразова-ние при концентрации 16%, а альбумин - при концентрации 4%.

Таблица 6

Влияние различных концентраций сывороток па процесс симпластообразования в культуре клеток СУ - 1, зараженной рекомбинантом ВОВ \УК. - 601.

Добавки в среду % содержания добавок в рост овой среде

1% 2% 4% 8% 16%

нормальная телячья сыворотка +++ +++ ++ + -

анти- ВЛ КРС сыворотка ++ + - - -

Бычий альбумин ++ + - - -

- +++ +++ +++ +++ +++

Примечание: Учет результатов симпластообразования проводили по трехкрестовой системе. Не зараженная РВОВ культура СУ - 1 была в норме; токсического эффекта не наблюдалось.

Иммунная сыворотка в активной концентрации содержала в 4 раза меньше белка, чем нормальная телячья сыворотка и в 10 раз меньше белка, чем 4% раствор бычьего альбумина. Поэтому эти данные показывают, что антитела, по-видимому, способны подавлять симпластообразованне, но в достаточно высокой концентрации. Этот эксперимент врядли отвечает на вопрос - происходит симпластообразованне под влиянием экзогенного или эндогенного £р 51, но по-видимому указывает, что активно действующий на мембраны gp 51, может быть доступен действию антител.

Для того, чтобы отдифференцировать действие экзогенного и эндогенного gp 51 были поставлены опыты двух типов. В первом случае клетки СУ - 1, выращенные в пластиковых чашках Петри с с1 = 3 см, заражали разными дозами РВОВ \У11 - 601 так, чтобы индуцировать от 10 до 100 бляшек. Через 48 часов монослой фиксировали раствором Бузна и окрашивали гематоксилин-эозином. Затем исследовали образование симпластов в области бляшек и между ними. Поскольку концентрация экзогенного gp 51 была одинакова для всего клеточного монослоя, а эндогенный цр 51 был только в области бляшек, было проведено исследование на симпластообразованне в области бляшек и между ними. Даже при большом числе бляшек, где концентрация экзогенного gp 51 была высокой, симпластообразованне наблюдалось в области бляшек, ближе к их центру, и не наблюдалось между ними и по краю бляшек. При низкой заражающей дозе (10-20 бляшек на чашку), где внеклеточная концентрация gp 51 была незначительной, в области бляшек наблюдали симпластообразованне (табл. 7).

Таблица 7

Симпластообразованне в области бляшек, вызываемое РВОВ "\У11 - 601 в

культуре клеток СУ - 1

Разведение вируса ю-2-8 Ю-3,5 Ю-4,5

Число бляшек в культуре СУ - 1 > 500 ~ 100 - 200 -10-20

Симпласты в области бляшек + + +

Симпласты между бляшками - - -

Эти данные свидетельствуют о том, что симпластообразование индуцируется эндогенным продуктом гена env, по-видимому в результате встраивания его в мембрану.

Другой тип эксперимента показал, что экзогенный gp 51, в той концентрации в какой он содержится в культуральной жидкости, не индуцирует симпластообразование. Чтобы показать это, культуральную жидкость, собранную через 48 часов после заражения клеток CV - 1 рекомбинантом BOB WR - 601, фильтровали через миллипоровый фильтр (диаметр пор d = 220 нм). Затем наносили полученный материал на клетки CV - 1, выращенные в чашках Петри (d = 3 см). Симпластообразование не наблюдалось в течение 48 часов.

Сравнительная нейровирулснтиость рекомбинаптов ВОВ

Нейровирулентность является важной характеристикой вирусов, которые могут быть использованы в качестве будущих живых вакцин. Исследованные нами рекомбинанты были получены на основе двух штаммов ВОВ - Lister и WR. Вакцинный штамм L, широко использовавшийся в медицинской практике, обладает относительно низкой нейровирулентностью. Лабораторный штамм WR обладает высокой нейровирулентностью. При включении чужеродного генетического материала в тимидинкиназный ген (Ш) обычно наблюдается снижение нейровирулентности вируса (Альтштейн А.Д. и др., 1985, Buller R., et al., 1985). Такого рода исследования для ре-комбинантов ВОВ, экспрессирующих gp 51 BJ1 КРС ранее не проводилось. Поэтому нами было проведено сравнительное исследование по изучению нейровирулентности 6 вариантов рекомбинантных и нерекомбинантных ВОВ на 10 - 12 гр. мышах линии BALb/c. Вирус для этих испытаний был выращен в культуре клеток CV - 1. Вируссодержащий материал штамма L и основанных на нем рекомбинантов был сконцентрирован в 100 раз с по-

мощью скоростного центрифугирования (20000 об/мин). Это было сделано в связи с тем, что штамм L обладает низкой нейровируленгностыо.

Мышей заражали внутри церебрально вируссодержащей жидкостью в 4-х разведениях. На каждое разведение РВОВ и ВОВ использовали по 8 животных. Наблюдение за клиническими признаками инфекции вели в течение 14 дней. Результаты исследования представлены в таблице 8.

Как видно из этой таблицы, нейровирулентность всех рекомбинантов была существенно снижена по сравнению с исходными вирусами. Нейровирулентность РВОВ, основанных на штамме L, практически не определялась: даже концентрированный вирус не вызывал гибели мышей. Нейровирулентность РВОВ, на основе штамма WR, также была существенно снижена, но была выше, чем у исходного штамма L.

Было проведено гистологическое исследование головного мозга отдельных мышей с параличами, зараженными РВОВ и исходными вирусами. У всех исследованных мышей обнаружен острый, негнойный полиоэнцефалит смешанного лимфоцитарно-гемморагического типа с явлениями ней-рофагии, характерными для вируса ВОВ.

Таблица 3

Сравнение нейровирулентности рекомбинантов ВОВ на мышах

Реком- Титр Разведе- Кол-во павших но iîccro Lg ВОЕ/

бинант БОЕ/мл ние дням после зараже- пало LD*> ILDjo

ВОВ НИН

5 6 7 8 9

I 2 j 4 5 6 7 8 9 10 11

L - 601 10" 10° 0 0 0 0 0 0/8 0,5 >10*.»

ю-1 0 0 0 0 0 0/8

ю-2 0 0 0 0 0 0/8

ю-3 0 0 0 0 0 0/8

Окончание таблицы 8

1 2 3 4 5 6 п 1 8 9 10 11

Ь - 65 10«." 10° 0 0 0 0 0 0/8 0,5 >1070

ю-1 0 0 0 0 0 0/8

10-2 0 0 0 0 0 0/8

10-' 0 0 0 0 0 0/8

Ь-Ис* юм 10° 4 0 2 2 - 8/8 -0,57 10"

10-1 1 0 0 0 0 1/8

10 2 0 0 0 0 0 0/8

Ю-з 0 0 0 0 0 0/8

\Vfl- 106-7 " 10° ~ ~г пг "о" ~0~ 4/8 0 10«

65 ю-1 0 0 0 0 0 0/8

10 2 0 0 0 0 0 0/8

Ю-з 0 0 0 0 0 0/8

10" 10° 4 1 1 1 0 7/8 -1,0 106."

601 ю-1 3 1 0 0 0 4/8

10-2 0 0 0 1 0 1/8

10-з 0 0 0 0 0 0/8

\УП- 1075 10" 8 - - - - 8/8 г-3,4 <102.6

ю-1 8 - - - - 8/8

10-2 8 - - - - 8/8

Ю-3 7 0 0 0 0 7/8

\УЯ - 107-2 10° 8 - - - - 8/8 >3,5 <1022

к4 - йс+ ю-' 8 - - - - 8/8

10-2 8 - - - - 8/8

10 3 8 - - - - 8/8

Примечание: В числителе - общее число павших животных за все дни наблюдения;

в знаменателе - число животных, участвующих в опыте. Расчет 1Л)5о осуществляли методом Рида-Менча.

Изучение иммунологической активности РВОВ - ер 51 на кроликах

Иммунологическую активность РВОВ проверяли иммунизируя кроликов вируссодержащим материалом на скарифицированную поверхность кожи дозой 107 БОЕ/мл. На месте введения вирусного материла развивалась воспалительная реакция, характерная для ВОВ. На 3 - 4 день наблюдения формировалась припухлость скарифицированного участка кожи, окруженного инфильтрационным валиком подкожной клетчатки. На поверхности кожи отмечали очаги некроза и корочки. Через 2 месяца после первичной вакцинации, всех животных ревакциннровали точно таким же способом. Сыворотку крови животных периодически исследовали на наличие анти - рр 51 антител в РДП и ИФА. Качественный результат выявления антител в РДП и непрямом ИФА показан в таблице 9.

Таблица 9

Результаты выявления анти - gp 51 антител у кроликов, иммунизированных РВОВ в РДП и непрямом ИФА

Рекомби- Время после вакцинации, недели

нант ВОВ 0 4 6 10" 12 15"" 19 23 29

\УЯ - 65 1 0/3 0/3 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3 2/3 2/3

2 0/3 0/3 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 2/3

- К4 - 1 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 2/2 2/2

1к+ 2 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 2/2 2/2

\УЯ- 601 1 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3

2 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3

Ь - 65 1 0/3 0/3 0/3 0/3 2/3 2/3 1/3 1/3 1/3

2 0/3 2/3 2/3 2/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3

контроль 1 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3

2 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3

Примечание: Результаты исследования сывороток крови кроликов: 1 -в РДП, 2 - в непрямом ИФА.

" - ревакцинация через 10 педель; "" - заражение через 15 недель.

В числителе - количество сероположительных животных с анти- ¿р 51 антителами.

В знаменателе - количество животных в группе.

Из таблицы 9 видно, что через 4-10 недель после первичной вакцинации, антитела обнаруживали у всех животных, привитых рекомбинанта-ми - К4 - 1к+ и - 601 и - 65. После ревакцинации антитела появились у всех животных и сохранялись до конца эксперимента. Результаты ньоличаш тнниш определения антител в непрямом ИФА даны в таблице 10.

Таблица 10

Титры анти- gp 51 антител в сыворотках крови кроликов, иммунизированных рекомбинантными штаммами ВОВ, выявленные методом непрямого ИФА

Штамм № кро Время после вакцинации, педели

РВОВ лика 0 4 6 10" 12 15"" 19 23 29

\VR-65 276 - <50 <50 <50 200 400 400 800 100

28 - <50 <50 <50 200 100 100 1600 50

0188 - <50 <50 <50 50 50 50 400 <50

\УЛ-К4-1к+ 246 - 100 200 400 400 800 800 >6400 400

17/0139 - 50 100 100 200 200 100 умер

20/198 - 100 400 400 800 800 1600 >6400 800

\VR-601 286 - 100 200 400 400 800 6400 6400 800

100 - 800 800 800 1600 3200 800 1600 800

30 - 100 800 800 1600 1600 1600 6400 160

1,-65 31 - <50 <50 <50 100 100 100 >6400 50

89 - 400 100 100 800 1600 1600 >6400 800

0183 - 800 800 800 1600 1600 1600 >6400 800

Контроль 38 74 82 - 800 800 1600 400 1600 1600 100 100 800

Примечание: " - время ревакцинации, недели;

"" - время контрольного заражения, недели.

Титр антител 19 А

■WR.K4.tKt

—*— Ксигрол ь

10

Недели

15

19

23

29

Рис. 1. Динамика развития антител у кроликов, вакцинированных РВОВ.

Сравнивая динамику накопления антител у привитых животных можно сказать, что наиболее активным в индукции антител является ре-комбинант \VR-601. Примерно одинаковой активностью обладают реком-бинантные штаммы Ь-65 и \VR-K4- и<+. Через 8 недель после заражения (срок 23 недели) у привитых животных наблюдается значительный подъем антител (рис. 1).

Имеющиеся данные позволяют оценить способность рекомбинантов индуцировать антитела к цр 51 ВЛ КРС, но не позволяют оценить их про-тективную активность на кроликах. Этот вопрос нуждается в дальнейшем изучении.

Для накопления продуктов, экспрессируемых рекомбинатами ВОВ можно использовать не только культуру клеток, но так же и 9 - 12 дневные куриные эмбрионы. Сравнивали два РВОВ - gp 51 (АУЛ -65 и \VR-K4-tK*) по уровню накопления gp 51 в разных частях развивающегося куриного эм-

Накопление ер 51 ВЛ КРС в куриных эмбрионах, зараженных РВОВ - ер 51.

бриона (РКЭ) (ХАО, тело эмбриона, аллантоисная жидкость) в зависимости от способа заражения РКЭ (на ХАО, в эмбрион, в аллантонсную полость), дозы вируса и времени инкубации после заражения. Концентрацию антигена определяли с помощью прямого ИФА. Полученные результаты представлены на рис. 2,3, 4.

время инкубации, часы Ч*м<имкубм«,часы время инкубации, часы

Рис. 2. Динамика накопления gp 51 BJI КРС в куриных эмбрионах, зараженных рекомбинантными вирусами ВОВ на ХАО, в дозе 1050 БОЕ/эмбрион.

На рис. 2 показана динамика накопления gp 51 - В Л КРС в РКЭ после заражения на ХАО. Оба штамма РВОВ образовывали на ХАО серо-белые, непрозрачные бляшки с выраженными геморрагиями. Как видно из рисунка, после заражения РКЭ на ХАО антиген обнаруживался в наибольшем титре именно в ХАО (1:64). В тоже время его удавалось обнаружить в теле эмбриона (WR-65-l:16, WR-K4-tK+-l:8) и в меньшей концентрации в аллан-тоисной жидкости (WR-65-1-.8, VVR-K4-tK+-l:4). При таком способе заражения разница между исследуемыми штаммами была незначительной.

Как видно из рис. 3, при заражении РКЭ в аллантоисную полость антиген обнаруживается в ХАО, в аллантоисной жидкости и лишь в незначительных количествах с теле эмбриона.

Ш К4-1К*

1од;А

В1

ХАО эмбрион аллант.

жидкость

1ЛШ-65

ХАО эмбрион аппант.

жидкость

Рис. 3. Накопление gp 51 ВЛ КРС в куриных эмбрионах, в зависимости от вируса и дозы заражения (заражение РКЭ в аллантоисную полость, 48 ч. инкубирования после заражения).

Примечание: Дозы заражения: 1 - 105 7 БОЕ / эмбрион,

2- 1050 БОЕ/эмбрион.

3- БОЕ /эмбрион.

Накопление вируса зависело от заражающей дозы и резко снижалось когда доза была ниже 1050 БОЕ/эмбрион. При этом способе заражения выявлялась более активная экспрессия §р 51 в эмбрионах, зараженных реком-бинантом \VR-65 по сравнению с рекомбинантом \УЯ-К44к+. Разница между ними коррелировала с их различиями, выявленными в культуре клеток (табл. 3).

Как видно из рис. 4 при заражении в куршгый эмбрион антиген в основном накапливался в ХАО и в аллантоисной жидкости, и в меньшей степени в теле эмбриона.

и/я-м-ж*

10В1А

1одаА

Рис. 4. Накопление gp 51 ВЛ КРС в куриных эмбрионах в зависимости от вируса и дозы заражения (заражение в куриный эмбрион, 48 часов инкубирования).

Примечание: Дозы заражения: 1 - Ю5-7 БОЕ/эмбрион,

2 - 1050 БОЕ/эмбрион, 3-10*» БОЕ/эмбрион.

Так же как и при заражении в аллантоисную полость уменьшение дозы заражения ниже 1050 БОЕ / эмбрион приводило к снижению накопления антигена, особенно со штаммом \\П-К4-1к+ и в меньшей степени со штаммом \VR-65.

Антигенсодержащие материалы, полученные от РКЭ, зараженных РВОВ и исследованные в ИФА были так же исследованы в РДП. В таблице 11 представлена зависимость между титром gp 51 BJI КРС, накопленном в РКЭ, в ИФА и его способностью выявляться в РДП.

Таблица 11

Выявление антигенной активности gp 51 В Л КРС, накопленного в куриных эмбрионах в ИФА и РДП.

Титр в ИФА Число образцов Из них положительных в РДП

1:4 7 0

1:8 8 0

1:16 5 4

1:32 4 4

1:64 5 5

Как видно из таблицы 11 в материалах от РКЭ с титром в ИФА 1:4, 1:8 антиген в РДП не выявлялся. При титрах в ИФА 1:32, 1:64 наблюдалась специфическая линия преципитации в РДП. При тигре 1:16 линия преципитации была менее четкой и не всегда выявлялась.

Материалы РКЭ с титром 1:32, 1:64 удавалось получать в экстрактах ХАО и в аллантоисной жидкости. Эти материалы можно рассматривать как потенциальный источник антигена для постановки РДП.

Использование рекомбинантпого gp 51, экснрессируемого РВОВ - рр 51 для выявления антител к ВЛ КРС

Известно, что основным методом диагностики ВЛ КРС - инфекции является выявление антител в РДП. Антиген для РДП готовят из культу-ральной жидкости клеток FLK, хронически продуцирующих ВЛ КРС. В последние годы в ветеринарную практику для выявления антител к ВЛ КРС

начинают внедрять ИФА. В культуральной жидкости Р'ЬК цр 51 составляет лишь небольшую часть вирусных белков, присутствующих в ней. Это создает трудности при использовании антигена, изготовленного из культуральной жидкости ИЬК для ИФА, направленного на выявление антител к gp 51. Культуральная жидкость из клеточных культур, зараженных РВОВ, содержит лишь оболочечные белки ВЛ КРС - gp 51 и gp 30. Это может дать определенные преимущества при использовании культуральной жидкости, содержащей РВОВ белок ВЛ КРС, как антигенную основу для ИФА.

Совместно с н.с. Ивановой Л.А. (ВИЭВ), показано, что рекомбинант-ный gp 51 может быть применен для выявления антител к gp 51 в конкуРеНТНОМ ИФА. Р ТГИУ опч-гчу р^т-гч.Ят........ 1,11111111 111|И,1И1.'1Ар^прд р

виде концентрата культуральной жидкости культуры клеток СУ-1, зараженной РВОВ WR-K4-tк+. Для сравнения в качестве антигена был использован антиген для РДП из коммерческого диагностического набора производства Курской биофабрики.

В таблице 12 показаны результаты исследования сывороток крови шести баранов, иммунизированных ВЛ в конкурентном ИФА с использованием антигена для РДП и рекомбинантного антигена \VR-K4-tK4.

Таблица 12

Результаты исследования сывороток крови баранов, инфицированных ВЛ в РДП и конкурентном ИФА

Инв. № барана Титры противовирусных антител

ндп Конкурентный ИФА с АГ РДП % конкуренции Конкурентный ИФА с АГ РВОВ % конкуренции

9119 1:16 1:16 100,0 1:128 100,0

8225 1:4 1:2 51,8 1:32 100,0

5419 1:16 1:8 83,0 1:128 100,0

2402 1:4 1:4 62,1 1:64 100,0

5408 1:2 отр. 48,0 1:64 100,0

9120 1:8 1:16 71,4 1:128 100,0

Как видно из таблицы 12, использование в ИФА рекомбинантного антигена дает лучшие результаты по сравнению с использованием антигена для РДП. По-видимому, это объясняется тем, что при использовании РВОВ антигена действительно выявляются антитела к gp 51, а при использовании антигена для РДП выявляются преимущественно антитела к р 24 ВЛ КРС, титр которых обычно ниже. Конкурентный ИФА с рекомбинантным антигеном в 8-16 раз более чувствителен, чем с антигеном для РДП.

При сравненительном исследовании сывороток крови КРС в РДП и в конкурентном ИФА с рекомбинантным антигеном показано полное совпадение двух методов (табл. 13).

Таблица 13

Результаты сравнительных исследований сывороток крови КРС в

конкурентном ИФА с рекомбинантным антигеном и РДП

Группы животных п Результаты серологических исследований

РДП конкурентный ИФА % конкуренции М ±т

Неинфицированные ВЛ КРС 14 -14/14 -14/14 -32,94±7,30

Естественно и экспериментально инфицированные ВЛ КРС 26 +26/26 +26/26 93,92+1,51

Следует отметить, что оптическая плотность продуктов реакции в конкурентном ИФА при исследовании большинства отрицательных по РДП сывороток была выше, чем в отрицательном контроле. Это отразилось на величине % конкуренции, который имел в таких случаях отрицательный знак.

ВЫВОДЫ

1. Изучена сравнительная продукция белка gp 51 ВЛ КРС рекомби-нантами ВОВ, экспрессирующими ген env ВЛ КРС под контролем разных поксвирусных промоторов. Показано, что под контролем синтетических промоторов (ранне-позднего и позднего) образуется в 4-5 раз больше gp 51, чем под контролем естественного ранне-позднего промотора р 7,5. Природа векторных штаммов (WR и Lister) не влияла на уровень продукции белка. ____

-2. ПОкЛШю, что рекомОинанты ВОВ, экспрессирующие env ген ВЛ

КРС, обладают способностью вызывать симпластообразование в клетках обезьяны (линия CV - 1) и человека (линия 293), но не в клетках крысы (линия Rat 2 tK-). Эффективность симпластообразования зависела от уровня продукции gp 51 и природы вируса-вектора (штамм WR более эффективен, чем штамм Lister). Симпластообразование было вызвано внутриклеточным действием gp 51 на клеточную мембрану. В симпластах происходило размножение вируса. Феномен симпластообразования можно использовать для отбора рекомбинантов ВОВ, экспрессирующих ген env ВЛ КРС.

3. Все рекомбинанты ВОВ, экспрессирующие ген env ВЛ КРС, вызывали образование антител к gp 51 у кроликов. Не было корреляции между уровнем продукции gp 51 в культуре клеток и способностью индуцировать антитела к gp 51 у кроликов.

4. Показано, что все рекомбинанты ВОВ, экспрессирующие gp 51 ВЛ КРС, обладали сниженной нейровирулентностью для мышей.

5. Установлена продукция gp 51 ВЛ КРС в куриных эмбрионах, зараженных РВОВ. Рекомбинантный белок обнаружен в экстрактах хорион-аллантоисной оболочки и в аллантоисной жидкости.

6. Антиген gp 51 ВЛ КРС, наработанный в клетках культуры CV - 1 или куриных эмбрионах, зараженных рекомбинантами ВОВ, может быть

использован для выявления антител к gp 51 у крупного рогатого скота с помощью конкурентного метода ИФА. Подготовлен и утвержден лабораторный регламент по постановке конкурентного ИФА на основе рекомби-нантного gp 51.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Иванова Л.А., Валихов А.Ф., Васин A.B., Иванова A.B. Использование рекомбинантного гликопротеидного антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота для постановки конкурентного иммуноферментного анализа. Тезисы докл. всерос. научно-практ. конф., Владимир, 1995, с.20.

2. Иванова A.B. Использование куриных эмбрионов для изучения возможности культивирования рекомбинантных штаммов вируса осповак-цины, экспрессирующих поверхностный гликопротеид вируса лейкоза крупного рогатого скота. Бюл. ВИЭВ, 1996, вып. 77, с.52.

3. Иванова A.B. Рскомбинантные штаммы вируса осповакцины, экс-прессирующие поверхностный гликопротеид вируса лейкоза крупного рогатого скота. Бюл. ВИЭВ, 1996, вып. 77. с.56.

4. Иванова A.B., Захарова Л.Г., Антонова Т.П., Валихов А.Ф., Альтштейн А.Д. Нейровирулентность рекомбинантов вируса осповакцины, экспрессирующих оболочечный гликопротеид вируса бычьего лейкоза. Тезисы докл. научно-произв. конф., Курск, 1996, с. 152.

5. Altstein A., Zakharova L., Ivanova A., Valikhov A. Vaccinia virus (VV) recombinants expressing gp 51 bovine leukemia virus (BVL): approach to control of BVL infection. Xth international congress of Virology, Jerusalem, Israel, 1996, p.lll.