Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и испытание метода иммуноферментного анализа для диагностики лейкоза крупного рогатого скота
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Разработка и испытание метода иммуноферментного анализа для диагностики лейкоза крупного рогатого скота"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК
ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ИМ.Я.Р.КОВАЛЕНКО
На правах рукописи
РГ& од
ИВАНОВА ЛЮДМИЛА АЛЕКСАНДРОВИЧ ^ ^^ эдэд
РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ МЕТОДА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО
СКОТА
03.00.23 - биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА 2000
Работа выполнена в комплексной лаборатории по изучению лейкозов и злокачественных опухолей сельскохозяйственных животных Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко.
Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор М.И.Гулюкин
Официальные оппоненты:
доктор ветеринарных наук, профессор Б.Г.Орлянкин (НАРВАК)
кандидат ветеринарных наук, Г. А.Надгочей (ВИЭВ)
Ведущая организация: Московская Государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина (МГАВМиБ)
Защита состоится "48"ои>/7Л 2000 г. в Мчасов на заседании диссертационного совета К 020.28.01 при Всероссийском научноисследо-вательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко
Автореферат разослан "/^^<52000 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат ветеринарных наук Ф. Г.Терешков
пги./и^^о
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Лейкоз крупного рогатого скота - наи-элее широко распространенное опухолевое заболевание сельскохозяйст-гнных животных, вызываемое ретровирусом, получившим название вируса гйкоза крупного рогатого скота(ВЛКРС).
Начало заболевания протекает бессимптомно и единственным и наи-олее постоянным признаком заражения служит перманентная продукция тгател к антигенам вируса , а также наличие инфицированных лимфоцитов, геном которых встроен провирус. Кроме крупного рогатого скота, в экс-ериментальных условиях возможно развитие инфекции, вызванной ЛКРС, у овец, коз, кроликов и других видов животных.
В Российской Федерации лейкоз распространен повсеместно. В 5 из 75 субъектов РФ уровень инфицирования крупного рогатого скота виру-зм лейкоза (ВЛКРС) составляет 10 -50% и имеет тенденцию к повышению, связи с крайне неблагополучной эпизоотической ситуацией по лейкозу и от-утствием средств специфической профилактики, особое значение приобрета-г совершенствование методов прижизненной диагностики, как основы мер орьбы с данным заболеванием.
За последние 20 лет, в связи с разработкой и внедрением в ракгику серологического метода - реакции иммунодиффузии в геле агара ЭИД) для выявления инфицированных ВЛКРС животных, стало воз можным ассовое проведение диагностических исследований. Этот метод по простоте, адежности и низкой стоимости превосходит другие тесты, применяемые для иагностики инфекции, вызываемой ВЛКРС и, вместе с тем, обладает высо-ой специфичностью и воспроизводимостью.
Однако, вследствие недостаточной чувствительности РИД оздо-овление неблагополучных по ВЛКРС-инфекции хозяйств, основанное на гом методе, продолжается, как правило, в течение нескольких лет и требует роведения многократных поголовных взятий крови , что уве личивает риск гражения крупного рогатого скота ВЛКРС и снижает эффективность про-иволейкозных мероприятий. Таким образом, проблема совершенствован^ етодов выявления антител к ВЛКРС является актуальной.
Цель и задачи исследования. Основной целью исследований вилась разработка метода иммуноферментного анализа для выявления анти-гл к вирусу лейкоза крупного рогатого скота.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить сле-ующие задачи:
- отработать оптимальные условия изготовления антигена вируса лейко-1 для использования в иммуноферментном анализе;
- отработать условия выявления антител в сыворотке крови и секрет вымени крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа I испытать его на различных категориях животных;
- изучить возможность применения иммуноферментного анализа дл: оценки антигенной и иммуногенной активности штаммов рекомби нантноп вируса осповакцинй, экспрессирующих поверхностный гликоп ротеи, ВЛКРС;
Научная новизна. Разработан способ изготовления антиген; ВЛКРС для иммуноферментного анализа с использованием бессыворбточно) поддерживающей питательной среды для вируспродуцирующей культур! РЫС.
С помощью ИФА изучены:
- особенности гуморального иммунного ответа на индуцируемуь ВЛКРС инфекцию у экспериментально инфицированных животных;
- динамика снижения титров антител в молоке в первой половине лакта
ции;
- соотношение титров антител в сыворотке крови и молозиве матере] и сыворотке крови их потомства;
- динамика распада пассивно приобретенных колостральных антител : ВЛКРС; '
- антигенные и иммуногенные свойства рекомбинантных штаммов ос повакцины.
Практическая значимость работы. Результаты проведенных ис следований использованы при разработке:
- "Методических рекомендаций по определению антител к вирусу лей коза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа", рас смотренных и одобренных на! заседании секции отделения ветеринари: ВАСХНИЛ, М„ 1983 г.
- НТД на опытную партию набора для серологической диагностики лей коза крупного рогатого скота (Технические условия, Временная инструкци по изготовлению и контролю), утвержденных Главным управлением ветеринг рии МСХ СССР, 1985 г.
- Стандарта СЭВ "Диагностика лейкоза крупного рбгатого скота" 1987 г
- Лабораторного регламента изготовления и контроля диагностическог набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота ме тодом иммуноферментного анализа, утвержденного директором ВИЗЕ 1988г.
- Авторского свидетельства №1582395 "Способ получения антигена вк руса лейкоза крупного рогатого скота", зарегистрированного' в Госреестр изобретений СССР 1 апреля 1990г., приоритет от 26 января 1989 г.
- Правил по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота, утвержденных приказом министра сельского хозяйства и продовольствия РФ , регистрационный № 1799 ,1999 г.
- Методических рекомендаций по диагностике лейкоза крупного рогатого скота 2000 г. '
Положения, выносимые на защиту:
- метод иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота;
- результаты испытания метода ИФА.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены на координационных совещаниях по проблеме 0.69.05 1"Лейкозы", Москва, 1982 и 1984 гг.; конференции Эстонской ССР "Ветеринарные проблемы индустриального животноводства", Тарту, 1983 г.; Всесоюзной конференции "Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных", Самарканд, 1984 г.; годичной отчетной сессии ВАСХНИЛ, Москва, 1984 г.; Всесоюзном семинаре "Иммуноферментный метод в ветеринарии и животноводстве", Москва, 1984 г.; экспозиция
ВДНХ,"Биотехнология",1991г., научно-практической конференции "Ретрови-русные и прионные инфекции животных", Москва, 1995 г.; экспозиции ВВЦ "Ветеринарная наука - производству", 1999 г.; научно-практической конференции "Актуальные вопросы диагностики, профилактики и борьбы с лейкозами сельскохозяйственных животных и птиц", Екатеринбург, 2000 г. ;;
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 рисунками и 19 таблицами. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований , обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 338 источников, из которых 273 иностранных и приложение, содержащее документы, подтверждающие практическую ценность отдельных этапов работы.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследования
Культура клеток и питательные среды. В работе использовали перевиваемую линию клеток FLK, хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, полученную M.J.van der Maaten и J.M.Miller (1976). Культивирование линии клеток проводили в стационарных матрасах различного объема в условиях комплексной лаборатории по изучению лейкозов и злокачественных опухолей с.-х. животых ВИЭВ совместно с сотрудни-
ками лаборатории ВЙЭВ А.Ф.Валиховым, Е.А.Михалевой и в роллерных флаконах в условиях Курской биофабрики совместно с сотрудниками цеха по изготовлению диагностикума для выявления антител к вирусу лейкоза методом иммунодиффузии в гелеагара . В качестве ростовой среды использовали среду Игла с добавлением 10% сыворотки крови эмбриона коровы, лошади или северногооленя. Бессывороточная поддерживающая среда для культуры клеток FLK представляла собой среду Игла MEM. Во всех случаях в питательную среду добавляли смесь антибиотиков: 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл канамицина.
Концентрирование вируса лейкоза. Вируссодержащую культуральную жидкость культуры FLK подвергали концентрированию на ультрафильтрационных установках плоско-параллельного типа "Пелликон" или "Минитан"( фирма Миллипор, США) , используя кассеты с пределом задержания 10000 дальтон согласно инструкции изготовителя, а также на ультраполых волокнах УПВ 6/3(СССР) с пределом задержания более 15000 дальтон, согласно технологии, разработанной ВИЭВ и Курской биофабрикой. Как самостоятельный метод концентрирования или дополнительно к ультрафильтрации применяли осаждение белков из культуральной жидкости полиэтиленгликолем ПЭГ 6000 в конечной концентрации 10% в присутствии 0,65 М хлористого натрия. После добавления ПЭГ и NaCl для образования преципитата смесь оставляли при 4°С на 18 часов, затем центри фугировали 30 мин при 10000 об/мин в роторах JA-10 или. JA-14 центрифуги J2-21 (Вескшап). Осадок растворяли в буфере TEN(10mM трис-HCl, ЮшМ ЭДТА, 150 Mm NaCl, рН 7,2) и осветляли центрифугированием в том же режиме.
Очистку антигена BJI КРС проводили методом скоростного центрифугирования в градиентах сахарозы на центрифугах Суперспид-65, MSE( роторы 8x50 мл, угловой, 3x5 мл, бакет), К 32 М (ротор 3x30мл), TL-100 (ротор TLS 4x2 мл), Beckman L5-75, ротор 41(6 х 12мл). Осветленные концентраты культуральной жидкости подвергали ультрацентрифугированию в ступенчатом градиенте сахарозы (20 - 50% в/в на буфере TEN) при 100000 g в течение .120 мин. Опалесцирующую зону, расположенную над 50% сахарозой, диализовали против буфера TEN и подвергали центрифугированию в непрерывном градиенте плотности сахарозы 20 - 60% в том же режиме. Линейный градиент фракционировали и определяли антигенную активность и специфичность фракций методами РИД и ИФА. Фракции, активность и специфичность которых удовлетворяла требованиям ИФА, объединяли, разделяли на аликвоты и хранили при минус 20 или минус 70 °С.
Илшуноферментный анализ. В работе использовали непрямой вариант ИФА, предусматривающий сенсибилизацию панелей для микротирова-ния (МТП) очищенным антигеном ВЛКРС, инкубацию в подготовленных таким образом МТП испытуемых и контрольных проб, инкубацию с меченными пероксидазой видоспецифическими антителами, отмывание несвязавшихся
реагентов после каждого этапа и добавление субстрата ферментативной реакции. После измерения оптической плотности продуктов ферментативной реакции рассчитывали показатель P/N по формуле:
DS-DKK
P/N= ----------------------(1)
D(OKC)- D КК
где DS - оптическая плотность испытуемой пробы, . ...
DKK - оптическая плотность контроля конъюгата, D(OKC) - оптическая плотность отрицательного контроля.
Материалом исследования служили сыворотка крови, молоко и молозиво.
Испытания непрямого ИФА проводили при исследовании: - сывороток крови 72 коров из благополучного по лейкозу хозяйства; '
- сывороток крови 12 телят в возрасте 6-8 месяцев, экспериментально инфицированных BJIKPC, в динамике развития иммунного ответа;
- сывороток крови 13 кроликов породы белый великан живым весом 2,5-3,0 кг, иммунизированных рекомбинантными штаммами вируса ос-повакцины, полученными сотрудниками Института биологии гена РАН под руководством доктора медицинских наук, профессора А. Д.Альттптейна;
- сывороток крови, молока и молозива коров и телят, содержавшихся на опытно-экспериментальной базе ВИЭВ, о.Лисий;
- 51 пробы сыворотки крови эмбрионов, получетшх с Московского мясокомбината и использованных для культивирования вйруспродуци-рующей культуры FLK;
- 2262 сывороток крови крупного рогатого скота различных возрастных групп из хозяйств с разным уровнем инфицирования ВЛКРС;
- сывороток крови 30 овец, вакцинированных рекомбинантным штамм WR-BLV-K4tk+ на базе Ставропольской НИВС. Опыт поставлен совместно с ведущим научным сотрудником А.Ф.Валиховым и аспирантом С.С.Абакиным.
Постановку биопробы проводилина овцах 6-8 месячного возраста местных пород.
Изготовление конъюгатов антител с пероксидазой проводили по методу, предложенному Wilson and Nakane (1978).
Гематологические исследования и реакцию иммунодиффузии в геле агара проводили в соответствии с методическими указаниями "Диагностика лейкоза крупного рогатого скота", М.,ВО"Агропромиздат",1989.
Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами (Г.Ф.Лакин, 1990).
Результаты исследований
Источником антигена ВЛКРС для непрямого ИФА служила куль-туральная жидкость культуры РЬК, хронически инфицированной ВЛКРС, полученная с использованием ростовых или бессывороточных питательных сред.
Культуральную жидкость, полученную с использованием сыворотки эмбрионов коровы, концентрировали до 0,01 от первоначального объема.
Кратность концентрирования культуралъной жидкости, полученной с использованием бессывороточных питательных сред, методами ультрафильтрации составляла в среднем 66,5±27,8, а после дополнительного концентрирования осаждением белков ПЭГ6000 кратность концентрирования, по отношению к исходной культуральной жидкости, составляла в среднем 3800±1518.
На основании результатов титрования в ИФА рассчитывали выход антигена в диагностических дозах из 1 л культуральной жидкости с учетом двукратного запаса активности.
По выходу антигена наиболее эффективным оказался способ, предусматривающий культивирование вируспродуцирующей культуры на ростовой среде с добавлением 10% сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота. Титры активности антигена, представляющего собой фракции из зоны 1,14-1,18 г/смЗ в непрямом ИФА составляли 1:500 -1:2000. Выход антигена в среднем составил 1927±323 диагностических доз из 1л культуральной жидкости.
Культуральную жидкость, полученную с использованием бессывороточной поддерживающей среды, сначала подвергали концентрированию ультрафильтрацией, а затем - осветлению центрифугированием в указанном выше режиме, дополнительному концентрированию осаждением ПЭГ 6000 и ультрацентрифугированию в непрерывном градиенте. Удовлетворяющими требованиям ИФА были не только фракции с плотностью 1,14-1,18 г/смЗ, но и фракции с более низкой плотностью сахарозы, включая зону наслоенного на градиент материала. Активность суммарного препарата антигена, полученного из бессывороточной среды, варьировала в пределах 1:16-1:128 в непрямом ИФА. Выход антигена из 1 л культуральной жидкости составил в среднем 695± 346 диагностических доз или в 2,8 раза ниже, чем при использовании ростовой среды.
Испытания непрямого иммуноферментного анализа проводили в различных опытах на естественно и экспериментально инфицированных животных и при применении вакцинного препарата.
Специфичность метода ИФА для выявления антител к ВЛКРС была подтверждена при проведении исследований с гипериммунными, специфическими к рота- и коронавирусам, вирусам инфекционного ринотрахеи-та, парагриппа и диареи (болезни слизистых) сыворотками крови, любезно
б
предоставленным« ведущим научным сотрудником отдела вирусологии ВИЭВ М.М.Гоголевым. Предварительно все антисыворотки были исследованы в РИД с антигеном gp51 BJ1KPC с отрицательным результатом. При проведении ИФА во всех случаях не было установлено перекрестных реакций между антисыворотками к указанным возбудителям и тест-системами на антитела к ВЛКРС. Антисыворотку к вирусу диареи использовали в РИД для выявления перекрестных реакций между этой сывороткой и антигеном ВЛКРС. Результат также был отрицательным.
Для 72 проб сыворотки крови от коров из благополучного по лейкозу.хо-зяйства среднее значение оптической плотности в диагностическом разведении 1:40 составило 0,107± 0,03, с разбросом 0,057-0,182, а рассчетное максимально допустимое значение для отрицательной сыворотки (М+Зо) в разведении 1:40 было равно 0,197, или 1,8 D(OKC), что совпало с пограничном значением P/N, рассчитанным для 2219 отрицательных по результатам РИД и ИФА сывороток крови.
Таким образом, для разработанного варианта ИФА, значение P/N, превышающее 1,8, достоверно означает положительный результат.
Методы подготовки проб молока и молозива к проведению анализа и методику самого анализа отрабатывали на пробах сыворотки крови , молока и молозива 16 инфицированных ВЛ КРС и 2 контрольных, свободных от вируса коров, содержавшихся на опытно-экспериментальной базе ВИЭВ. Оптимальные результаты получены при обезжиривании проб с помощью центрифугирования при 3000 - 5000 об/мин в течение 30 мин при 4°С и проведении ИФА при начальном разведении молозива 1:200, молока-1:2-1:3.
Уровень антител в секрете вымени в первые 3,5 месяца пос ле. отела непрерывно снижался. В молозиве, полученном сразу после отела, титры антител к ВЛКРС были в 28,1 раза выше, чем в сыворотке крови, полученной одновременно с молозивом, и в 5,4 раза выше, чем в сыворотке крови, полученной через 3,5 мес после отела. Через месяц титры антител в ,сыворотке крови были в 17,6, а через 3,5 мес - в 28 раз выше, чем титры антител в молоке. Сразу после отела титры антител в сыворотке крови коров были в среднем в 6 раз ниже, чем в сыворотке крови через 3,5 мес после отела. Несмотря на значительное снижение уровня антител, в ИФА через 3,5 мес после отела положительно реагировали пробы молока всех исследованных коров, тогда как в РИД-только половина.
Диагностика ВЛ РТС-инфекции у телят на основании результатов серологических методов вызывает затруднения вследствие персистенции коло-стральных антител. Возможность постановки диагноза внутриутробного, .инфицирования ВЛКРС у новорожденных телят изучали при исследовании сывороток крови 18 новорожденных телят до приема ими молозива и двух плодов в возрасте 5-6 мес, из которых внутриутробно, по результатам биопробы, были инфицированы 7. Разведение сывороток крови новорожденных телят
1:10 было оптимальным для исследования в ИФА ; в более низких разведениях отмечали ложноположительные реакции. Методом ИФА было выявлено положительно реагирующих 5( 71,4%), а методом РИД - 1 (14,3%) от числа инфицированных.Таким образом, эффективность выявления инфицированных ВЛКРС внутриутробно телят методом непрямого ИФА была выше, чем методом РИД, однако не достигла 100%.
В результате титрования методом ИФА 51 пробы сывороток крови плодов коровы, приобретенных на Московском мясокомбинате для культивирования культуры БЪК, не выявлено ни одной положительно реагирующей . Все сыворотки крови предварительно были протестированы в РИД с глико-протеидным антигеном на наличие в них антител к ВЛ КРС с получением отрицательного результата. При добавлении в среду культивирования, ни одна из этих сывороток не вызывала заметного подавления вируспродукции.
Коэффициент корреляции между титрами антител в первой порции молозива и сыворотке крови телят в возрасте 2-3 сут. был равен 0,725 (достоверен при при Р>0,05). Таким образом, уровень антител в сыворотке крови телят после приема молозива, в значительной степени определяется содержанием антител в молозиве матери.
С целью изучения динамики распада колостральных антител был проведен анализ изменения уровня антител у 4 инфицированных и 9 свободных от ВЛКРС телят, родившихся от инфицированных ВЛКРС матерей, в первые месяцы жизни. Диагноз был установлен на основании результатов биопробы на овцах.. Математической обработке подвергали группы данных неинфицированных телят, для которых было получено не менее трех последовательных положительных результатов при исследовании методом непрямого ИФА после приема молозива в течение 3-5 мес с момента рождения, а после сероконверсии отрицательную реакцию отмечали в течение 3-4 мес.
Изменение уровня колостральных антител подчинялось уравнению показательной функции
1ЕУ =3,84 - 0,0132Х (2). где ^ - десятичный логарифм обратной величины титра сывороток;
X - возраст теленка, когда наблюдали данный титр антител (сут.).
Период полураспада антител в сыворотке крови телят, свободных от ВЛКРС, составил в среднем 22,8 сут. с колебаниями от 15,7 до 25,3 сут. Рассчитанный на основании приведенного уравнения срок, за который коло-стральные антитела полностью исчезают из организма теленка, в среднем составил 7,2 мес с колебаниями от 5,2 до 8,7 мес. Длительность существования колостральных антител прямо зависела от титра антител на высоте колост-рального иммунитета, и обратно зависела от скорости распада ( выведения) колостральных антител, характеризующейся периодом полураспада.
Для сравнения использовали группы данных инфицированных прена-тально телят, полученные в те же сроки. Периоды полураспада и полного выведения материнских антител у инфицированных телят, рассчитанные так же, как и для неифицированных телят,значительно различались. У двух телят значения периодов полураспада составили 31,4 и 32,8 сут, соответственно, и были близки к максимальным значениям этого показателя для неинфи-цированных телят. По-видимому, синтез собственных антител в период наблюдений был незначительным, возможно имело место ингибирование синтеза собственных антител высокой концентрацией материнских антител в сыворотке крови. Напротив, у двух других телят синтез собственных антител был, по-видимому, интенсивным, что выразилось в медленном снижении уровня антител у одного из них с периодом полураспада 90,3 сут и в отсутствии снижения уровня антител у другого. У телят этой группы не наблюдали се-роконверсии после ожидаемого исчезновения колостральных антител .
Развитие гуморального иммунного ответа при экспериментальной инфекции , вызванной ВЛКРС, изучали на 12 телятах в возрасте 6-8 мес, разделенных на 3 группы, по 4 теленка в каждой, которым вводили вирусо-держащий материал, полученный от инфицированой ВЛКРС и больной лейкозом коровы, в 1 мкл крови которой содержалось 60,6 тыс. лейкоцитов :
- телятам первой группы внутривенно вводили 20 мл суспензии лейкоцитов крови, содержащей 12*10Е8 клеток;
- телятам второй группы внутривенно вводили 15 мл плазмы крови той же коровы, освобожденной от клеток;
- телятам третьей группы внутривенно вводили 2 мл культуральной жидкости краткосрочной культуры лимфоцитов крови той же коровы.
Наличие инфекционного вируса во вводимом материале. , было подтверждено методом биопробы на овцах. В контроле находились 4 теленка, которым внутривенно ввели 20 мл суспензии лейкоцитов здоровой коровы.
Развитие гуморального иммунного ответа на введение вируссодержаще-го материала у животных 1-й и 2-й опытных групп было сходным.
Первые 15-20 дней после введения заражающей дозы характеризовались появлением единичных положительно реагирующих проб. Незначительный подъем уровня антител отмечали на 5-е сутки у 2-х телят из первой группы и у одного - из второй. Все животные стали положительными в ИФА на 30 сутки, в РИД - на 60-е сутки от начала эксперимента. В целом, методом ИФА положительно реагирующие пробы были выявлены раньше, чем в РИД, на 15-45 дней.
У животных третьей опытной группы через 30 дней после введения В Л КРС в ИФА положительно реагировали 3 из 4, а спустя еще 30 суток- 4 из 4 животных. В РИД через месяц от начала эксперимента все 4 теленка были отрицательными; положительная реакция была отмечена через 2 месяца у 2-х, а через 3 месяца у всех четырех телят этой группы.
^ С 20-30 по 60 сутки отмечали наивысший уровень антител за
период наблюдений. Затем следовало снижение, нередко до минимального значения 1:40. Этот этап продолжался с третьего месяца по шестой включительно, а у некоторых животных - до окончания периода наблюдений.
Наконец, у части животных спустя 6-7 месяцев от начала эксперимента наблюдали повышение титров антител, по сравнению с предыдущим периодом,
Гематологические показатели у всех животных в опыте в начале эксперимента находились в пределах физиологической нормы (лейкоцитоз составлял 8,4 ± 2,0, 7,9± 0,6 и 6,4 ±1,3 тыс в 1 мкл крови, соответственно). После введения вируссодержащего материала в первой группе началось стремительное повышение уровня лейкоцитов, достигшее на 60-й день 19,4 ± 5,4тыс.в мкл, после чего последовало некоторое снижение лейкоцитоза. Во второй группе повышение уровня лейкоцитов было более плавным и менее выраженным. К 60-му дню оно достигло 14,1+2,7 тыс в мкл и продержалось на этом уровне с незначительными колебаниями до 120 дня от начала эксперимента, затем последовало снижение до 11,1± 3,1 и 10,8 ± .0,6 тыс в мкл на 180 и 210 дни, соответственно. В третьей группе максимальное повышение количества лейкоцитов было отмечено через 1 мес после введения вируссодержащего материала с последующим снижением и стабилизацией на уровне 8,59,3тыс в мкл крови в течение 5 мес (срок наблюдения). Повышение уровня лейкоцитов происходило во всех случаях за счет лимфоцитов. Уже через три дня после введения вируссодержащего материала у некоторых животных отмечали увеличение количества лимфоцитов; в мазках крови обнаруживали молодые клетки. Лимфоциты характеризовались базофильной цитоплазмой. В основном популяция относилась к средним и большим лимфоцитам. Через 5 дней после введения лейкоконцентрата у телят этой группы отмечали увеличение процента молодых клеток (бластов) в лейкоформулах.
У 4 животных контрольной группы за весь период наблюдений не отмечали появления положительных реакций в РИД или ИФ А.
Через 7 мес от начала эксперимента всех животных убили с диагностической целью. У 3 из 4 животных первой группы при гистологическом исследовании установлен лимфолейкоз; у остальных животных в опыте экспериментальная ВЛКРС-инфекция в течение периода наблюдений не привела к развитию лейкоза, что свидетельствует о четкой взаимосвязи между инфицирующей дозой ВЛКРС й темпом развития лейкозного процесса. Исключение составляет теленок № 0053, у которого отмечен интенсивный синтез противовирусных антител в ранний период: титр антител на 20-й день эксперимента составил 1:1280; только у этого теленка из всей группы за период наблюдений не развился лейкоз. :
Исследования методом ИФА сывороток крови крупного рогатого скота различного возраста из хозяйств, оздоравливаемых от BJI КРС-
инфекции, были проведены с целью изучения чувствительности непрямого ИФА, а также возможности использования этого метода на заключительной стадии оздоровительных мероприятий.
Таблица 1
Результаты исследования сывороток крови коров из хозяйств на разных стадиях оздоровления от ВЛ КРС-инфекции
Хозяйство, группа животных Исследовано животных Выявлено положительных проб
РИД % ИФА %
«А», телки 113 14 12,4 16 14,2
«Б», двор 2, коровы 177 0 0 0 0
«Б», двор 3, коровы 176 0 0 1 0,6
«В», молодняк 340 1 0,3 1 0,3
«В», коровы 392 0 0 2 0,5
«Г», коровы 116 1 0,9 2 1,7
«Д», двор 1, коровы 250 1 0,4 4 1,6
«Д», двор 2, коровы 199 2 1,0 5 2,5
«Д», двор 3, коровы 213 6 2,8 7 3,3
«Е», коровы 91 0 0 0 , 0
«Е», коровы 93 0 0 0 0 ■
«Ж», коровы 102 0 0 3 2^9 '
Итого 2262 25 1,1 41 1;8
и
Таблица 2
Сравнение результатов РИД и ИФА с сыворотками крови животных оздоравливаемых от лейкоза хозяйств
ИФА ИФА(+) ИФА(-) Всего
РИД
РИД(+) 23 2 25
% 1% 0,1% 1,1%
РИД(-) 18 2219 2237
% 0,8% 98,1% 98,9%
Всего 41 2221 2262
% 1,8% 98,2% 100%
Для решения этих задач были проведены однократные исследования сывороток крови крупного рогатого скота из неблагополучных по лейкозу хозяйств, в том числе из 4 хозяйств на заключительной стадии оздоровления (хозяйства Б, В, Е, Ж) и 3 хозяйств, в различной степени пораженных ВЖРС (хозяйства А, Г, Д). Исследования методом ИФА проводили параллельно с плановыми исследованиями сывороток крови в РИД.
Результаты исследования 2262 сывороток крови крупного рогатого скота различных возрастных групп из хозяйств с разным уровнем инфицирования представлены в таблице 1.
Сравнительный анализ результатов серологических исследований в РИД и ИФА всех 2262 проб сыворотки крови представлен в таблице 2. Совпадение результатов, полученных двумя методами (РИД+/ИФА+, РИД-/ИФА-) наблюдали в 99,1% случаев. Несовпадение (РИД+/ИФА-.РИД-/ИФА+) - в 0,9% случаев, при этом положительными в ИФА и отрицательными в РИД были 18 или 0,8% всех исследованных сывороток крови. В двух случаях показатель P/N проб, положительных по результатам РИД, не превышал 1,7, т.е. пробы по результатам ИФА были расценены как подозрительные.
Наибольшее количество расхождений результатов РИД и ИФА (5,31%) было отмечено при исследовании молодняка из хозяйства "А" и скорее всего было обусловлено наличием колостральных антител в сыворотке крови, не выявленных в РИД. В остальных случаях расхождение результатов РИД и ИФА не превышало 1,5%.
Возможность выявления антител к гликопротеидному антигену ВЛКРС. методом непрямого ИФА изучали на животных, которым вводили вакцинные препараты на основе рекомбинантных штаммов вируса осповакци-ны (ВОВ) , экспрессирующих ген епу ВЛКРС.
Изучение рекомбинантных вирусов осповакцины (РВОВ), содержащих ген епу ВЛКРС, их антигенных и иммуногенных свойств проводили совместно с сотрудниками лаборатории генетической инженерии института Биологии гена АН СССР (в настоящее время - НИИ Биологии гена РАН) под руководством заведующего лабораторией, профессора А.Д.Альтпггейна. Характеристики рекомбинантов вируса осповакцины, содержащих ген епу ВЛКРС, представлены в таблице 3. Таблица 3
Характеристики рекомбинантов вируса осповакцины,
содержащих ген env ВЛКРС
Рекомбинант ВВ вектор Предсказанный продукт env Экспрессия gp51 -gp30 ВЛКРС в клетках CV -1
L-BLV-K4 Lister gp51-gp30 +
L-BLV-K10 Lister gp51 +
WR-BLV-K4tk+ WR gp51-gp30 +
WR-BLV-K10 WR gp51 +
WR-BLV-K4tk- WR gp51-gp30 +
Примечание:
Рекомбинанты содержат нуклеотидные последовательности гена env ВЛ КРС, встроенные в ген тимидинкиназы ВОВ под контроль поксвирусного промотора гена 7,5 кД белка (Р7,5); фенотип tk+ рекомбинанта WR-BLV-k4tk+ был восстановлен встройкой tk-гена вируса простого герпеса в фрагмент Hind Ш F генома вируса осповакцины под контролем раннего поксвирусного промотора. Остальные рекомбинанты имеют фенотип tk-.
Рекомбинанты были сконструированы на основе вакцинного штамма вируса осповакцины Lister или высокоактивного лабораторного пггамма WR. Конструкции К4 должны продуцировать полный продукт гена env, конструкции К10 - только gp51 без 3 последних аминокислот.
.. ' Антигенную.активность рекомбинантаых штаммов вируса осповакцины ,-дпя которых была установлена экспрессия gp51 in vitro, испытывали на кроликах.: С этой целью штаммы вируса осповакцины L-BLV-K4 и ! L-BLV-K10 вводили каждый пяти, а штаммы WR-BLV-K4tk+, WR-BLV-K10 и WR-BLV- K4tk- трем кроликам, втирая в участок скарифицированной кожи по 0,2 мл суспензии рекомбинантного вируса с титром 10Е8 БОЕ/мл. Ревакцинацию штаммами L-BLV-K4 и L-BLV-K1Q проводили в. тех же условиях через 3 мес после первой вакцинации. .■>.•■:
В группе вакцинированных штаммом L-BLV-K4, в РИД у одного кролика антитела были выявлены спустя 1 месяц после инокуляции РВОВ и у 4 из 5 кроликов - спустя 1 мес после ревакцинации. В ИФА 4 из 5 кроликов стали положительными через 1 мес после вакцинации. Через 2 месяца после вакцинации все 5 кроликов этой группы стали положительно реагировать в ИФА и уровень антител повышался до 3 мес от начала эксперимента. Через . 1 мес после ревакцинации титры антител к BJIKPC возросли у всех кроликов этой группы и достигли максимальных значений за весь период опыта, но спустя еще 1 мес снизились в 2 раза.
В группе вакцинированных штаммом L-BLV-K10 в течение трех месяцев не было зафиксировано образования антител к BJIKPC; через 1 месяц после ревакцинации у двух кроликов титры антител к BJI КРС составили 1:32 и 1.64, соответственно, тогда как в РИД все кролики этой группы реагировали отрицательно в течение всего опыта.
Из трех кроликов, вакцинированных штаммом WR-BLV-K10, только у одного в ИФА не выявлено антител к BJI КРС. У двух других кроликов через 2 мес после инокуляции РВОВ титр антител к BJI КРС составил 1:32. В РИД все кролики этой группы реагировали отрицательно в течение всего опыта. г
Все три кролика, вакцинированных штаммом \VR-BLV-K4-tk-, продуцировали антитела в титрах, превышающих диагностический, уже через месяц после инокуляции. В РИД в этот срок реагировали положительно сыворотки крови двух кроликов, у которых титры в ИФА составляли, соответственно, 1:256 и 1:512. Титр сыворотки крови кролика, отрицательно прореагировавшего в РИД, в ИФА составлял 1:64.
Спустя месяц после инокуляции трем кроликам штамма РВОВ WR-BLV-K4-tk+, все они реагировали положительно в РИД и ИФА, причем титры в ИФА составляли 1:256-1:512, а спустя 2 месяца - 1:512-1:1024.
На основании результатов ИФА можно расположить рекомбинантные штаммы по мере убывания антигенных свойств следующим образом:
WR-BLV-K4tk5+ > WR-BLV-K4tk-> L-BLV-K4 > WR-BLV-K10 > L-BLV-K10. ' '
Наибольшей антигенной активностью обладал штамм на основе WR с восстановленным фенотипом tk и продуцирующий полный продукт гена
env; наимение активным был штамм на основе Lister, продуцирующий только gp 51 без 3 последних аминокислот.
С целью установления зависимости между уровнем специфических антител к gp51 BJI КРС. после вакцинации и наличием защитного эффекта при контрольном заражении были проведены испытания экспериментальной серии вакцины против инфекции, вызываемой вирусом лейкоза крупного рогатого скота на 27 овцах, содержавшихся на базе Ставропольской НИВС. В опыте 14 овцам дважды с интервалом 6 мес подкожно вводили рекомбинант-ный штамм вируса осповакцины WR BLV-K4tk+ в дозе 10Е7 БОЕ/животное и через 10 мес от начала эксперимента - внутримышечно 2 мл инактивированно-го препарата ВJIKPC с активностью в РИД 1:16.
В контроле находилось 6 овец, которым вводили исходный штамм вируса осповакцины WR. Две контрольные овцы одновременно с опытными получили инъекцию инактивированного ВЛКРС. Через 13 мес от начала: эксперимента провели контрольное заражение всех овец лейкоцитами инфицированной ВЛКРС овцы. Через три месяца после контрольного заражения от четырех овец в опыте и трех в контроле была поставлена биопроба на овцах. Наблюдения за овцами, находящимися в опыте и контроле, продолжались в течение 2 лет.
Гематологические показатели у всех овец в течение эксперимента не выходили за пределы нормы. По результатам РИД до контрольного заражения все овцы были серонегативными. При гистологическом исследовании материала от павших овец контрольной группы не было установлено изменений, характерных для лейкоза. **'
Динамика развития иммунного ответа на вакцинацию и контрольное заражение овец в опыте и контроле, по данным ИФА, отличалася значительными индивидуальными особенностями. Овцы, имевшие сходную динамику развития гуморального иммунного ответа, были объединены в отдельные подгруппы, среди которых в опыте: 1 .Незаразившиеся овцы, прореагировавшие на вакцинацию (п=4); 2.Незаразившиеся овцы, слабо или не прореагировавшие на вакцинацию (п=2); З.Заразившиеся овцы с сильным иммунным ответом на контрольное заражение (п=4); 4.3аразившиеся овцы с супрессией иммунного ответа на контрольное заражение(п=4); в контроле: 1. Заразившиеся овцы, праймированные культурой FLK(n=2); 2. Заразившиеся овцы, не праймированные культурой FLK(n=2); 3. Незаразившиеся овцы, не праймированные культурой FLK (п=2). Из контрольных овец 3 выбыли до постановки биопробы. Сравнение результатов биопробы и ИФА показало, что у заразившихся ове^ положительную реакцию в ИФА наблюдали стабильно в течение 1 - 12-мес после контрольного заражения, тогда как у незаразившихся овец антитела исчезали к окончанию эксперимента или образование антител не было отмечено в течение всего периода наблюдений.
Таблица 4
Образование антител к ^51 ВЛ КРС у овец после вакцинации
Вакцинирующий материал Вакцинация
1-я 2-я РЪК
\У11-ВЬУ-К4ьк+ +РЬК 0/14 7/14 9/14
\УИ + РЪК- 0/2 0/2 0/2
0/4 0/4 -
Примечание: в числителе - количество животных с антителами, в знаменателе - количество исследованных животных.
Таблица 5
Протективное влияние вакцинации рекомбинантном \УК-ВЬУ-К41к+
Группа жи- Ответ на вак- Число животных % за-
вотных цинацию ре- щиты
комбинантом всего защищено
Вакциниро- Четкий 4 4 100
ванные Р/Ы>2,5
(\VR-BLV- Слабый 3 2 67
К4£к+) 2,0<Р/№с2,5
Отрицатель- 7 1 14
ный
Р/Ы<2,0
Контроль- Р/Ы<2,0 6 2 33
ныe(WR)
В таблице 4 представлены итоговые данные об образовании антител к щэ51 ВЛКРС у вакцинированных и контрольных животных. Как видно из таблицы, ни у одного животного не появились антитела после первой вакцинации, а после второй вакцинации антитела появились только у половины вакцинированных животных. Дополнительная инъекция инактивированного ВЛКРС из клеток ПЛС оказала незначительное влияние на продукцию антител
у двух животных. У контрольных животных антител к §р51 ВЛКРС не обнаружено.
В таблице 5 показаны данные о протективном эффекте вакцинации. Как видно из таблицы, 6 из 7 животных, продуцировавших антитела к §р51 ВЛКРС, былк защищены от развития инфекции . Особенно четко защитный эффект наблюдался у животных с выраженным ответом на вакцинацию (4 из 4). Животные, не ответившие на вакцинацию, а также контрольные животные, не были защищены (не заразились 1 из 7 и 2 из 6, соответственно). Следует отметить, что использованная для заражения доза ВЛКРС вызвала инфекцию у 66,67% контрольных животных.
Помимо протекгивного эффекта, у трех животных, слабо или совсем не прореагировавших на вакцинацию, наблюдалась определенная задержка в развитии ВЛКРС-инфекции, о чем можно было судить по латентному периоду в появлении антител. В то же время, у 2 животных, получивших полную вакцинацию, и у 2 животных, инокулированных инактивированным ВЛКРС, наблюдалось ускорение иммунного ответа после заражения вирусом.
Результаты проведенного эксперимента показывают, что рекомбинант \та-ВЬУ-К4&+ был способен вызывать образование антител к яр51 ВЛКРС только у половины вакцинированных животных и только после двукратной вакцинации. Наблюдалась четкая зависимость между ответом на вакцинацию и протекгивным эффектом последней: защитный эффект обнаружен только у животных, ответивших на вакцинацию рекомбинантным вирусом образованием анти-£р51 ВЛКРС- антител.
Как показали результаты исследований по разработке варианта непрямого ИФА с видоспецифическими антителами, очистка антигена, осо-бененно в условиях крупномасштабного производства, часто сопряжена со значительными трудностями технического характера и при этом качество полученного продукта может не оправдать затрат на его получение. В качестве альтернативного метода получения антигена ВЛКРС, удовлетворяющего требованиям ИФА, предложен способ, предусматривающий использование в качестве антигенсодержащего сырья бессывороточных питательных сред, который позволил упростить процедуру очистки антигена и повысить специфичность анализа. При исследовании сывороток крови животных различных видов и возрастных категорий , свободных от ВЛКРС, естественно и экспериментально инфицированных ВЛКРС, иммунизированных препаратами реком-бинантных вирусов осповакцины, экспрессирующих продукты гена еп\' ВЛКРС, а также молока и молозива коров была продемонстрирована высокая чувствительность и специфичность метода, что позволяет рекомендовать его для широкого использования в практике для проведения оздоровительных мероп риятий при лейкозе крупного рогатого скота.
выводы
1. Разработан вариант непрямого иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Метод позволяет выявлять специфические к BJIKPC антитела в сыворотке крови, молозиве и молоке. В отличие от реакции иммунодиффузии в геле, предлагаемый метод является количествешшм, что позволяет использовать его для оценки динамики инфекционного процесса при лейкозе крупного рогатого скота.
2. Для проведения реакции разработан способ изготовления антигена вируса лейкоза из культуральной жидкости культуры клеток FLK с использованием бессывороточных синтетических поддерживающих сред, позволяющий исключить применение дорогостоящей и дефицитной сыворотки крови эмбрионов коровы и повысить специфичность иммуноферментного анализа. Выход антигена из одного литра культуральной жидкости для непрямого иммуноферментного анализа прииспользовании бессывороточных сред составляет около 700 доз.
3. Оптимизированы режимы проведения иммуноферментного метода выявления антител к BJIKPC. Оптимальная величина pH для адсорбции антигена BJIKPC на планшете составляет 7,2-7,4; температурный оптимум для реакции испытуемых сывороток с иммобилизованным антигеном и конъю-гатом антивидовых антител составляет 18-20°С при длительности 1,5 часа.
4. В экспериментальных условиях установлено наличие антител к вирусу у телят, инфицированных BJIKPC in utero. У свободных от BJIKPC телят период двукратного снижения титра антител составлял в среднем 22,8 суток. У телят, инфицированных BJIKPC in utero, темп снижения титра антител в колостральный период был ниже и характеризовался значительными индивидуальными колебаниями. Уровень антител в сыворотке крови телят на высоте колострального иммунитета коррелирует с уровнем антител в сыворотке крови и молозиве матерей.
5. Показана возможность использования молока и молозива в качестве материала исследования в непрямом ИФА, что позволит предотвратить распространение инфекции и снизит затраты на проведение исследований. Содержание антител к BJIKPC в секрете вымени и сыворотке крови инфицированных BJIKPC коров коррелирует между собой. В первые сутки после отела в тигры антител в молозиве в 28,1 раза выше, чем в сыворотке крови, полученной' после отела, и в 5,4 раза выше, чем в сыворотке крови, полученной через 3,5 мес после отела; через месяц титры антител в молоке в 17,6, а через 3,5 мес - в 28,2 раз ниже, чем в сыворотке крови. Показано преимущество применения метода ИФА для исследования молока, по сравнению с РИД.
Методом непрямого- ИФА изучена динамика развития гуморального иммунного ответа на введение вируссодержащего материала у крупного рогатого скота. Появление антител в низких титрах отмечали в единичных слу-
чаях в течение первых 15-20 суток от начала эксперимента. На 25-60-с сутки все животные становились положительными и происходило резкое повышение уровня антител. В течение третьего-шестого месяца с момента введения вируссодержащего материала титры антител снижались. У части животных спустя 6-7 месяцев 'от начала эксперимента, титры антител вновь повышались, по сравнению с предыдущим периодом. Динамика развития гуморального иммунного ответа на антигены ВЛКРС, но с некоторыми колебаниями длительности указанных этапов, сохранялась независимо от дозы инфекционного материала. Увеличение дозы заражающего материала приводило к усилению и ускорению развития иммунного ответа. У экспериментально инфицированных животных антитела к ВЛКРС методом ИФА были выявлены на 4-5 недель раньше, чем в РИД.
7. При широком производственном испытании непрямого иммунофер-ментного метода выявления ВЛКРС-инфекции,разница между выявлением положительно реагирующих в РИД и ИФА животных не превышала 5,3%.
8. Метод непрямого ИФА для выявления антител к ВЛКРС использовали при изучении на кроликах антигенных свойств рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, в геном которых встроены фрагменты гена епу ВЛКРС. Опыт показал, что введение экспрессирующих гликопротеидный антиген ВЛКРС рекомбинантов, вызывает образование специфических антител. По антигенной активности штаммы располагались следующим образом: Ч¥Ы-ВЬУ-К4&+ > \\гК-ВЬУ-К40с-> Ь-ВЬУ-К4 > УШ-ВЬУ-КЮ > Ь-ВЬУ-КЮ. Антитела к др51 методом ИФА были выявлены на 1-2 месяца раньше, чем в РИД.
9. Метод ИФА использовали для оценки гуморального иммунного ответа на прививку рекомбинантного штамма вируса осповакцины \VIl-ВЬУК4&+ овцам. Установлено, что зашитые свойства вакцины коррелировали с уровнем поствакцинальных анти^51 -антител.
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ
1. Макарова Л.А., Валихов А.Ф., Иванова Л.А., Васин A.B. Анализ антигенных компонентов, вируса лейкоза крупного рогатого скота.// Труды ВИЭВ,- т 54,- 1981,- спр.91-95.
2. Мурватуллоев С.А., Гулюкин М.И., Иванова Л.А. Пренатальное и постнатальное инфицирование телят вирусом лейкоза крупного рогатого скота.// Мат-лы респ. конференции "Ветеринарные проблемы индустриального животноводства"-Тарту,- 1983,- т.З."Лейкозы",-стр.240-244.
3. Шишков В.П., Бурба Л.Г., Иванова Л.А. Методические рекомендации по определению антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферменгного анализа.// Москва.- 1983,- 10 с.
4. Иванова Л.А. Выявление иммунного ответа на вирус лейкоза крупного рогатого скота иммуноферментным методом.// В сб."Актуальные проблемы ветеринарии в промышленном животноводстве",- Москва.- 1983,-стр.99-100.
5. Гулюкин М.И., Бурба Л.Г., Иванова Л.А. Результаты серологических и морфофункциональных исследований крови телят от инфицированных вирусом лейкоза и больных лимфолейкозом матерей.//"Ветеринария",- 1985.-№11;- стр.32-38.
6. Шишков В.П., Бурба Л.Г., Валихов А.Ф., .Иванова Л.А., Макарова Л.А. Иммуноферментный метод определения антител к ви русу лейкоза крупного рогатого скота.//Бюллетень ВИЭВ.-1985,- вып.58,- стр. 23- 25.
7; Гулюкин М.И., Бурба Л.Г., Васин A.B., Иванова Л.А., Кузнецова Е.В. Экспериментальное воспроизведение лимфолейкоза на теля-тах.//"Ветеринария",- 1987,-№2,- стр.22-28.
8. Иванова Л.А., Гулюкин М.И., Антителообразование на ранних стадиях развития ретровирусной инфекции.//Мат-лы Всесоюзн. конференции "Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных",- Таш-кент.-1984.-стр. 52-53.
9. Гулюкин М.И., Иванова Л.А., Замараева Н.В. Экспериментальное воспроизведение лейкоза на телятах.//Бюллетень ВИЭВ.-1988.-вып.б7,-стр.13-1б.
10. Макарова Л.А., Иванова Л.А., Михалева Е.А. Выделение и очистка антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота из культуральной жидкости вируспродуцирующей культуры и его применение в иммунологических методах.//Бюллетень ВИЭВ,- - 1988,- вып.67,- стр.6-7.
11. Иванова Л.А., Гулюкин М.И., Васин A.B., Листкова H.A., Шишков В.П., Бурба Л.Г. Персистенция колостральных антител к вирусу лейкоза у телят.//Труды ВИЭВ,-1991,- т.70. - стр.16-21.
12. Валихов А.Ф., Кузьмичев B.C., Иванова J1.A., Сверчков A.B., Макарова Л.А., Ильюшенко С.Б., Бендукидзе К.А., Захарова Л.Г., Гриненко Н.Ф., Кряжевская М.В., Альтштейн А.Д., Бурба Л.Г., Шишков В.П. Иммуноген-ность рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего оболочечный гликопротеид вируса бычьего лейкоза.//Труды ВИЭВ.- т.70. - 1991.- стр.В9-97.
13. Валихов А.Ф., Кузьмичев B.C., Иванова Л.А., Сверчков A.B., Бурба Л.Г., Шишков В.П., Альтштейн А.Д., Бендукидзе К.А., Захарова Л.Г., Гриненко Н.Ф., Кряжевская М.В. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантов вируса осповакцины, экспрессирующих env ген вируса лейкоза крупного рогатого скота.//Тезисы докл. Всес. научно-практической конф." Проблемы оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота. -Новосибирск.-1990.-стр.76-77.
14. Иванова Л.А., Гулюкин М.И., Васин A.B., Замараева Н.В., Тиме-рина Е.М. Опыт использования секретов молочной железы коров для выявления антител к вирусу лейкоза.//Бюллетень ВИЭВ,- 1996,- вып.77,- стр. 67.
15. Иванова Л.А. Разработка иммуноферментного анализа для диагностики лейкоза крупного рогатого скота.//Бюллетень ВИЭВ.-1996,- вып.77,-стр. 71.
16. Гулюкин М.И., Симонян Г.А., Замараева Н.В., Макарова Л.А., Иванова Л.А., Листкова H.A., Васин A.B. Научные основы профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота.//Труды ВИЭВ,- 1999.- т.72,- стр. 38-47.
17. Иванова Л.А., Макарова Л.А., Васин A.B., Валихов А.Ф., Альтштейн А.Д., Захарова Л.Г., Абакин С.С. Развитие гуморального иммунного ответа на вакцинацию рекомбинантной вакциной и контрольное заражение овец вирусом лейкоза крупного рогатогоскота.// Труды ВИЭВ.- 1999,- т. 72.стр. 181-191.
18. Иванова Л.А. Опыт применения иммуноферментного анализадля выявления антител к вирусу лейкоза на заключительном этапеоздоровле-ния.//Труды ВИЭВ.- 1999.- т.72,- стр. 202-209.
20. Щекотурова Т.В., Романова В.А., Щекотуров A.B., Иванова Л.А. Исследование на лейкоз в РИД и ИФА секрета молочной железы ко-ров.//Труды ВИЭВ,- 1999,-т.72.- стр. 213 - 214.
21. Васин A.B., Гулюкин М.И., Иванова Л.А., Замараева Н.В. Экспериментальная ВЛКРС-инфекцияилимфолейкозу овец.//Труды ВИЭВ- 1999.-т.72 стр. 224- 231.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванова, Людмила Александровна
1. Введение.
Терминология и сокращения.
2. Обзор литературы
2.1. Классификация ретровирусов.
2.2. Клиническая картина и стадии развития лейкозного процесса у крупного рогатого скота.
2.3. Спектр хозяев и пути передачи ВЛ KPG.
2-4. Геном и особенности репликации ВЛКРС.
2.5. Морфология, строение, био- и физико-химические свойства ВЛКРС.
2.6. Методы диагностики.
2.7. Методы выявления антител к ВЛКРС.
2.8 Иммуноферментный анализ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и испытание метода иммуноферментного анализа для диагностики лейкоза крупного рогатого скота"
Актуальность проблемы Лейкоз крупного рогатого скота -наиболее широко распространенное опухолевое заболевание сельскохозяйственных животных, вызываемое ретрэвирусом .
Начало заболевания, вызываемого ВЛКРС, протекает бессимптомно и единственным и постоянным признаком заражения служит ; продукция антител к антигенам вируса, а также наличие инфициро- ; ванных лимфоцитов, в геном которых встроен провирус.
В Российской Федерации лейкоз распространен повсеместно. В 45 из 75 субъектов РФ уровень инфицирования крупного рогатого скота вирусом лейкоза (ВЛКРС) составляет 10 -50% и имеет тенденцию к повышению. В связи с крайне неблагополучной эпизоотической ситуацией по лейкозу и отсутствием средств специфической профилактики, особое значение приобретает совершенствование ме- I годов прижизненной диагностики, как основы мер борьбы с данным заболеванием.
За последние 20 лет, в связи с разработкой и внедрением в практику серологического метода - реакции иммунодиффузии в геле агара (РИД) для выявления инфицированных ВЛКРС животных, стало возможным массовое проведение диагностических исследований. Этот метод по простоте, надежности и низкой стоимости превосходит другие тесты, применяемые для диагностики инфекции, вызываемой ВЛКРС и, вместе с тем, обладает высокой специфичностью и воспроизводимостью.
Однако, вследствие недостаточной чувствительности РИД оздоровление неблагополучных по ВЛКРС-инфекции хозяйств, основанное на этом методе, продолжается, как правило, в течение нескольких лет и требует проведения многократных поголовных взятий крови , что увеличивает риск заражения крупного рогатого скота ВЖРС и снижает эффективность противолейкозных мероприятий.
Таким образом, проблема совершенствования методов выявления антител к ВЛКРС является актуальной.
Цель и задачи исследования. Основной целью исследований явилась разработка иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого Скота.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
- отработать оптимальные условия изготовления антигена вируса лейкоза для использования в иммуноферментном анализе;
- отработать условия выявления антител в сыворотке крови и секрете вымени крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа и испытать его на различных категориях животных;
- изучить возможность применения иммуноферментного анализа для оценки антигенной активности штаммов рекомбинантного вируса осповакцины, зкспрессирующих поверхностный гликопротеид ВЛКРС.
Научная новизна. Разработан способ изготовления антигена
ВЛКРС для иммуноферментного анализа с использованием бессывороточных поддерживающих смен питательной среды вируспроду-цирующей культуры ПК.
С помощью ИФА изучены:
- особенности гуморального иммунного ответа на индуцируемую ВЖРС инфекцию у экспериментально инфицированных животных;
- динамика снижения титров антител в молоке в первой половине лактации;
- соотношение титров антител в сыворотоке крови и молозиве матерей и сыворотке крови их потомства;
- динамика распада пассивно приобретенных колостральных антител к ВЛКРС;
- антигенные и иммуногенные свойства рекомбинантных штаммов вируса осповакцины.
Практическая значимость работы Результаты проведенных исследований использованы при разработке:
- "Методических рекомендаций по определению антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа", рассмотренных и одобренных на заседании секции отделения ветеринарии ВАСХНЙЛ, М., 1983 г.
- НТД на опытную партию набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (Технические условия, Временная инструкция по изготовлению и контролю),утвержденных Главным управлением ветеринарии МСХ СССР, 1985 г.
- Стандарта СЭВ "Диагностика лейкоза крупного рогатого скота"1987 г;
- Лабораторного регламента изготовления и контроля диагностического набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, утвержденного директором ВИЭВ, 1988г.
- Авторского свидетельства №1582395 "Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота", зарегистрированное в Госреестре изобретений СССР 1 апреля 1990г., приоритет от 26 января 1989 г.
- Правил по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота, утвержденным приказом министра сельского хозяйс7 тва и продовольствия РФ , регистрационнй № 1799 ,1999 г.
- Методических рекомендаций по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, 2000 г. 8
Терминология и сокращения ВЛКРС - вирус лейкоза крупного рогатого скота
ЕД - единица действия ИФА - иммуноферментный анализ МТП - планшет для микротитрования РИД - реакция иммунодиффузии в геле агара ПЭГ - полиэтиленгликоль ЩР - полимеразная цепная реакция РВОВ - рекомбинантный вирус осповакцины BLV - bovine leukemia virus (вирус лейкоза крупного рогатого скота
D - оптическая плотность
FLK - культура клеток почки эмбриона овцы, хронически инфицированная вирусом лейкоза gp51 - гликопротеид ВЖРС с молекулярной массой 51 кДа Bat - линия клеток легкого летучей мыши, хронически инфицированная вирусом лейкоза TEN - трис-буфер, содержащий ЭДТА-Na и NaCl, pH 7,2
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Иванова, Людмила Александровна
4. ВЫВОДЫ
1. Разработан вариант непрямого иммуноферментного анализа для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Метод позволяет выявлять специфические к ВЛКРС антитела в сыво-ротоке крови, молозиве и молоке. В отличие от реакции иммуно-диффузии в геле, предлагаемый метод является количественным, что позволяет использовать его для оценки динамики инфекционного процесса при лейкозе крупного рогатого скота.
2. Для проведения реакции разработан-способ изготовления антигена вируса лейкоза из культуральной жидкости культуры клеток FLK с использованием бессывороточных синтетических поддерживающих сред , позволяющий исключить применение дорогостоящей и дефицитной сыворотки крови эмбрионов коровы и повысить специфичность иммуноферментного анализа. Выход антигена из одного ; литра культуральной жидкости для непрямого иммуноферментного анализа при использовании бессывороточных сред составляет около 700 доз.
3. Оптимизированы режимы проведения иммуноферментного метода выявления антител к ВЛКРС. Оптимальная величина pH для адсорбции антигена ВЛКРС на планшете составляет 7,2-7,4; температурный оптимум для реакции испытуемых сывороток с иммобилизованным антигеном и коньюгатом антивидовых антител составляет 18-20°С при длительности 1,5 часа.
4. В экспериментальных условиях установлено наличие антител к вирусу у телят, инфицированных ВЛКРС in utero. У свободных от ВЛКРС телят период двукратного снижения титра антител составлял в среднем 22,8 суток . У телят, инфицированных ВЛКРС in utero, теш снижения титра антител в колостральный период был ниже и характеризовался значительными индивидуальными колебаниями. Уровень антител в сыворотке крови телят на высоте ко-лострального иммунитета коррелирует с уровнем антител в сыворотке крови и молозиве матерей.
5. Показана возможность использования молока и молозива в качестве материала исследования в непрямом ИФА, что позволит предотвратить распространение инфекции и снизит затраты на проведение исследований. Содержание антител к ВЛКРС в секрете вымени и сыворотке крови инфицированных ВЛКРС коров коррелирует между собой. В первые сутки после отела в титры антител в молозиве в 28,1 раза выше, чем в сыворотке крови,полученной после отела, и в 5,4 раза выше, чем в сыворотке крови, полученной через 3,5 мес после отела; через месяц титры антител в молоке были в 17,6, а через 3,5 мес - в 28,2 раз ниже, чем в сыворотке крови. Показано преимущество применения метода ИФА для исследования молока, по сравнению с РИД.
6. Методом непрямого ИФА изучена динамика развития гуморального иммунного ответа после введения вируссодержащего материала у крупного рогатого скота. Появление антител в низких титрах отмечали в единичных случаях в течение первых 15-20 суток от начала эксперимента. На 25-60-е сутки все животные становились положительными и происходило резкое повышение уровня антител. В течение третьего-шестого месяца с момента введения вируссодержащего материала титры антител снижались . У части животных спустя 6-7 месяцев от начала эксперимента, титры антител вновь повышались, по сравнению с предыдущим периодом. Динамика развития гуморального иммунного ответа на антигены ВЛКРС, но с некоторыми колебаниями длительности указанных этапов, сохранялась независимо от дозы инфекционного материала. Увеличение дозы заражающего материала приводило к усилению и ускорению развития иммунного ответа. У экспериментально инфицированных животных антитела к ВЛКРС методом ИФА были выявлены на 4-5 недель раньше, чем в РИД.
7. При широком производственном испытании непрямого имму-ноферментног о метода выявления ВЛКРС-инфекции, разница между выявлением положительно реагирующих в РИД и ИФА животных не превышала 5,3%.
8. Метод непрямого ИФА для выявления антител к ВЛКРС использовали при изучении антигенных свойств рекомбинантных штаммов вируса осповакцины, в геном которых встроены фрагменты гена епу ВЛКРС, на кроликах. Опыт показал, что введение экспрессиру-ющих гликопротеидный антиген ВЛКРС рекомбинантов, вызывает образование специфических антител. По антигенной активности штаммы располагались следующим образом: да-вьу-Шк+ > т-в1ч-мьк-> ь-виг-К4 > ш-вьу-кю > ь-вьу-кю
Антитела к £р 51 методом ИФА были выявлены на 1-2 месяца ; раньше, чем в РИД.
9. Метод использовали для оценки гуморального иммунного ответа на прививку рекомбинантного штамма вируса осповакцины '*Т?-ВЬУК41к+ овцам. Установлено, что защитные свойства вакцины коррелировали с уровнем поствакцинальных анти-|гр51-антител.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Людмила Александровна, Москва
1. Альтштейн А.Д., Тарасишин Л.А., Захарова Л.Г. и др. Выявление общей антигенной детерминанты в главном внутреннем белке неродственных онкорнавирусов.//Вопр.вирусол.-1980.-№2.-с.196-201.
2. Безгин В. М. Промышленная технология производства биологических препаратов для диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота./ Дисс. на соиск.степени доктора биологических наук, Москва.-1999.- 51 с.
3. Берни А. Вирус бычьего лейкоза; новая концепция для старой болезни.//Журн.Всес.Хим. об-ва.-1986.-т.ХХХ1.- №3. с.299
4. Бурба Л.Г. Профилактика и борьба с лейкозом крупного рогатого скота.//Вестник с.-х. науки.-1986.-№10.-с. 109-113.
5. Валихов А.Ф. ,Надточей Г. А., Ваганова Н.Б. и др. Вирус типа С в культуре лимфоцитов крови коров, больных лейкозом.//Ветеринария.-1974.-№4.-с. 43-45.
6. Валихов А.Ф.Изучение онкорнавируса,выделенного при лейкозе крупного рогатого скота.//В кн. Проблемы экспериментальной онкологии лейкозов человека и животных( под ред.Л.М.Шабада, В.П.Шишкова).М.,Колос.-1979.-с.205-213.
7. Валихов А.Ф.Биологические свойства вируса лейкоза крупного рогатого скота.Диагностика и профилактика инфекции.//Дисс. доктора биол. наук.-М.- 1992.- 360 с.
8. Васин A.B., Гулюкин М.И., Бурба Л.Г., Кунаков A.A. Экспериментальная ВЛКРС инфекция и лимфолейкоз овец.//Ветеринария. -1991.- №6.-стр.20-21.
9. Винкеле P.A., Мелдрайс Я.А. Муровска М.Ф. и др. Молекуляр-но-биологическое исследование BLY-продуцирующей культуры клеток FLK.//Интеграционные вирусы.-Рига.-1985.-с.50-85.
10. Воллер А. ,Бидуэлл Д., Бартлет А. Иммуноферментные реакции вдиагностической медицине.- Бюлл.ВОЗ.,1977.- т.53,№ 1.-стр.1-120.
11. Галеев Р.Ф., Валихов А.Ф., Мурватуллоев С.А. Трансплацентарная передача ретровируса лейкоза (БЛВ) от инфицированных коров потомству.//Тезисы доклада Всес. конф. "Распознавание и меры борьбы с лейкозами человека и животных. "-М.-1982.-е. 196-197.
12. Галеев Р.Ф. Инфекционность крови в зависимости от персис-тентного лимфоцитоза и титров антител к гп51 и п24 антигенам ВЛ КРС.//Лейкозы и опухолевые болезни с/х животных. Труды ВИЭВ 1991.- т.70.- с.80-83.
13. Галеев Р.©."Теоретическое обоснование, экспериментальное подтверждение путей передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота, усовершенствование методов диагностики и мер борьбы с ним".// Автореферат докт.дисс.-Казань, 2000 г.
14. Генов И.Н., Цуцумански В. Значиенито на слюнката и колост-рата при предовне на левкозата и говедата.//Вет.-мед. науки.- 1984.- т.21.-№7-8.- с.68-73.
15. Гриненко Н.Ф., Тарасишин Л.А., Валихов А.Ф.и др. Сравнение нескольких методов выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота .//Вопр.вирусол.-1980.- №3.-с.281-284.
16. Гудюкин М.И., Бурба Л. Г., Иванова Л. А. Результаты серологических и морфофункциональных исследований крови телят от инфицированных вирусом лейкоза и больных лимфолейкозом матерей. //Ветеринария. -1985.-JÜ17- с. 32-38.
17. Гулюкин М.И., Васин A.B., Замараева Н.В. Пути передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота/'/Ветеринария.- 1990.-№1.- стр.27-31.
18. Дебабов В.Г. Локальная амплификация нуклеиновых кислот-новый метод исследования.//Молекулярная биология.-1990-т.24вып.2, -стр.304- 308.
19. Егоров A.M. Предисловие к изданию.//ИНиТ, серия "Биотехнология "-т.3.-"Неизотопные методы иммуноанализа", под ред. А.М.Егорова- М. ,-1987.-с.3-4.
20. Жданов В.М., Парфанович М.И., Ершов Ф.И. и др. Выделение лейковируса из линии клеток лимфатического узла теленка.// Ветеринария -1974.-с. 45-46.
21. Зайдес В.М., Еерезин В. Э.,Жданов В.М. Гликопротеиды оболо-чечных вирусов животных как трансмембранные белки. //Вопр. виру сол.-1987-т. 31.-N32. -с. 133-148.
22. Игудин Л.И., Орлов С.Д., Шалунова Н.В. и др. Способ очистки сыворотки крови крупного рогатого скота .//Вопр.вирусологи-ию-1980.- №5.-с.640-641
23. Инструкция по борьбе с лейкозом крупного рогатого ско-та.//Утверждена Главветрупром.-М.-1989 г.
24. Коломиец А.Г., Коломиец Н.Д. Молекулярно-биологическая характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота.//Экс-перим. онкология.-1984.-т.6.-№ 1.-с.3-10.
25. Конычева В.В., Ильинская Т.Н., Чапенко C.B. и др. Развитие ранних проявлений инфекции, вызванной вирусом лейкоза крупного рогатого скота в эксперименте.// Сельхоз.биология 1986 . -№2 . -стр . 97- 100 .
26. Красноперов В. А. Эффективность системы оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота в условиях Свердловской области.// Автореф. канд.дисс.-Москва.- 1999.23 с.
27. Крикун В.А., Салимов Х.С., Петровский Г.С., и др.Иммунный ответ у телят и ягнят, экспериментально зараженных онкорна-вирусом крупного рогатого скота.//В кн. : "Этиология и иммунодиагностика лейкоза крупного рогатого скота".-Рига. -1979. -стр. 67-70.
28. Крикун В.А. Лейкоз крупного рогатого скота (биологические свойства возбудителя, особенности распространения и меры борьбы).// Дисс. на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук в виде научного доклада.- Москва.-1999.-с.50.
29. Кузнецова Н.В., Кузнецов Н.В., Симояян Г.А. Использование полимеразной цепной реакции для выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота.// Ветеринария- 1997. -№5.- с.12-15.
30. Кукайн P.A.,' Нагаева Л.И., Ложа В.П. и др.Биохимическая и биологическая характеристика онкорнавируса типа С, изолированного от больного лейкозом крупного рогатого скота//В кн.: Вирусы рака и лейкоза.-М. ,1974.-с. 92-99.
31. Кукайн P.A., Нагаева Л.И., Ложа В.П. и др. Диагностика рет-ровирусной (БЛВ) инфекции крупного рогатого скота с помощью иммуноферментного метода.//В сб. Вирусы рака и лейкоза.-М.-1981.-с.57-59
32. Кукайн Р.А.,Нагаева Л.И.,Ложа В.П. и др. Вирус лейкоза крупного рогатого скота.//Под ред. Р.А.Кукайн, Л.И.Нагаевой. -Рига,"Зинатне"-1982.- 175 с.
33. Кукайн P.A., Нагаева Л.И., Куделева Г.В. и др. Изучение динамики накопления материнских антител у новорожденных телят бурой латвийской породы и напряженности пассивного иммунитета.// Научно-техн. бюлл. СО ВАСХНЙЛ. -1985. -№25. с. 32-38.
34. Кукайн P.A., Нагаева Л.И., Чапенко C.B. и др: 0 выявлении антител к BLV у крупного рогатого скота в хозяйствах Литовской ССР.// В сб.Теорет. и практ. вопросы ветеринарии.-Тарту.-1978. с.61.
35. Кумков В.Т., Крикун В.А.Реакция связывания комплемента при лейкозе крупного рогатого скота.//В сб." Лейкозы".-Тарту.-1979.- т. 2.-с. 88
36. Лещинская Н.П., Покровская Е.Е., Пономарева Н.П. Методические подходы к определению балластных белковых компонентов в тканевой PC-вирусной вакцине.//В сб. "Проблемы конструирования гриппозных вакцин.- Л.- 1988.- Ci 161-166.
37. Мазуренко H.H. Структура и свойства белков ретровирусов типа С.//Вопр. вирусологии.-1980.-№6. с. 644-654.
38. Михалева Е.А., Завальный М.А. Оптимизация условий продукции антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота в перевиваемой культуре клеток.//Доклады ВАСХНИЛ.-1986.-М8.- с.29-31.
39. Москалик P.C., Жуцкая Л.Е., Агоп Г.К., Шевченко Е.Б. Выяснение контаминации ВЛ КРС спермы и крови больных лейкозом или сероположительных быков./ Ветеринария.- 1987.- № 11.-с.48-51.
40. Мурватуллоев С. А. Трансплацентарная передача ВЛКРС от матери потомству.//Бюлл.ВИЗВ.- 1983.-вып.50.-е.13-14
41. Надточей Г.А., Валихов А.Ф., Вурба Л.Г., Горбатов В.А. Морфологическая характеристика и иммунологические свойства он-корнавируса типа С крупного рогатого скота.//Доклады ВАСХ-НИЛ.-1976.- т.5.-е.31-33.
42. Нагаева Л.И.} Брацславская О.И., Бандерс У.Т. 0 синцитиеоб-раэовании в культурах клеток эмбрионов крупного рогатого скота, инфицированных бычьим лейкоэным вирусом.//В сб.: Теоретические и практические вопросы ветеринарии.-Тарту. -1979. -с. 30- 36.
43. Новохатский A.C. ,Хлябич Г.Н.Теория и практика лабораторной диагностики синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).//ВИНИТИ.-М.-1992.- 221с.
44. Орлянкин Б.Г. Классификация и номенклатура РНК-содержащих вирусов позвоночных. Обзор. //"Сельскохозяйственная биология 2.-1996.-№2. с.3-24
45. Орлянкин Б.Г., Гулюкин М.И., Замараева Н.В., Кунаков К.Ю. Таксономия ретровирусов и характеристика вируса лейкоза крупного рогатого скота.//Труды ВИЭВ.- 1999.-т.72.- с.16-21.
46. Парфанович М.И.,Баранов А.Е., Казак Н.Ф. и др. Обнаружение онкорнавируса в культурах клеток тканей больных лейкозом коров.//Ветеринария.-1974.-Ш.- с.47-49.
47. Поспелова A.B. Выделение плазматических мембран клеток животных.//в кн."Современные методы в биохимии" под ред. В.Н.Ореховича. М.- Медицина.-1977.-с.326-320.
48. Правила по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота.// Утверждены Департаментом Ветеринарии МСХ РФ.-М.- 1999 г.
49. Прохватилова Л.Б.Разработка методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота с использованием синтетических пептидов и олигокуклеотидов. /Автореф. дисс. канд. биол. наук.-Владимир. 1998.- 25 с.
50. Прохватилова Л. Б., Ломакин А.И., Колосов С.Н. и др. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота методом полимераз-ной цепной реакции.// Вестник РАСХН.-1998.- >65.-с.65-68.
51. Рассулин Ю.Ю., Федорова H.A., Речинский В.О., Парфанович М.Й. Обнаружение провируса вируса лейкоза крупного рогатого скота в лейкоцитах периферической крови крупного рогатого скота методом ДНК-гибридизации.//Вопр.вирусол.-1988.-№1.-стр.58-63.
52. Симонян Г.А. Методы прижизненной диагностики лейкозов.//В кн." Лейкозы и злокачественные опухоли животных". -M.-1988.-C.133-154;
53. Симонян Г.А. Клинико-гематологическая и цитоморфологическая характеристика различных форм лейкозов и их диагностика. .//В кн." Лейкозы и злокачественные опухоли животных". -М.-1988.-с.154-173.
54. Симонян Г.А.,Хисамутдинов Ф.Ф. Ветеринарная гематоло-гия//М.,Колос.-1995.- с.128-142.
55. Стасенко B.C. Чувствительность лабораторных животных к он-корнавирусу крупного рогатого скота //Лейкозы и опухоли животных: Труды ВИЭВ.-1981.-т.54.-с.87-90.
56. Стасенко B.C. Изучение инфекционности онкорнавируса крупного рогатого скота для лабораторных животных// Распознавание и меры борьбы с лейкозами человека и животных: Тез.докл. Воес. конф. 22-24 сент. 1982г.-Белая Церковь.-1982.-с.207.
57. Тарасишин Л. А. и др. 0 возможном происхождении вируса лейкоза крупного рогатого скота: перекрестная антигенная реактивность с вирусами лейкоза-саркомы птиц. //Докл.АН СССР.-1980.- 250 №4.-с.980-983.
58. Тарасов В.Н. Культуры клеток в вирусологии. //Итоги науки и техн.- ВИНИТИ.- сер.Вирусология.-1990.- т.19.- 256 с.
59. Шишков В.П. Опухоли и лейкозы животных ( биологические, экономические и ветеринарно-медицинские аспекты).//В сб. "Проблемы экспериментальной онкологии и лейкозов человека и животных".-М.-1979.- с.11.
60. Adam Е. ,Kerkhofs P. , Mammerickx M. et al. The CI?EB,ATF-1 and ATF-2 transcription factors from bovine leukemia virus-infected В lymphocytes activate viral expression . //J . V i roi .- 1996 .- v . 70 .- 1 990- 1 999
61. Agxesti A., Ponti W., Rocchi M. et al. Use of polymeraseto diagnose bovine leukemia virus infection at birth.//Amer.J.Vet.Res.-1993.-v.54.-N
62. Albrecht A., Garcia de Lima E., Geldermann H. u.a. Untersuchungen über die Epidemiologie der enzootischen Rinderle-ukose und die Wirksamkeit des derzeitigen Leukosebekamp-fungsVerfahrens in Ni edersachsen.//Zbl.Vet.Med.1. B.-1974.-v.21.-S.520-539.
63. Alexandersen S., Carpenter S., Christensen J. et al., Identification of alternatively spliced mRNAs encoding potential new regulatory proteins in cattle .infected with bovine leukemia virus.//J. Virol.-1993.-p.39-52.
64. Altaner C., Ban J., Zajac V., et al. Isolation and characterisation of cell clones producing various amounts of bovine leukosis virus.// Folia biol.-1985.-v.31.-N2.-p.l07-114.
65. Altaner C., Merza M., Altanerova V., Morein B. Envelope glycoprotein gp51 of bovine leukemia virus is differently glycosylated in cells of various species and organ origin. //Vet. Immunol.Immunopathol.-1993.-v.36.-p.163-177.
66. Ballagi-Pordany A.,Klintevall K., Merza M., et al. Direct detection of bovine leukemia virus infection: practical applicability of a double polymerase chain reaction.//!. Vet.Med.B.-1992.- v.39.-p.69-77.
67. Baltimore D. RNA-dependent DNA-polymerase in virions of RNA-tumour viruses. //Nature.-1970.-v.226.-p.1209.
68. Ban J. ,Gieciova E., Orlik 0., Altaner C. Use of monoclonal antibodies in an ELISA for the diagnosis of bovine leukemia virus infection.//J.Virol.Meth.-1990.-v.30.-p.79-88.
69. Bauer,T., Wiegand D., Manz D. Vergleichende serologische Untersuchungen an Blut- und Milchproben zur Diagnostik der enzootischen Leukose des Rindes mittels des AGIDT und das ELISA. // Dtsch.tierarzt1.Wschr.-1984.-v.91.-s.313-317.
70. Baumgartener L.E. Pathology of lymphosarcoma in sheep induced with bovine leukemia virus //Cancer Res.-1976.-v.36.-p.2365-2373.
71. Bause.J.,Schmidt F.-W. Zur Persistenz präzipitierender An-ticorper im Blutserum leukoseinfizierter Rinder unter besonderer Berucksichtung des Kalbzeitpunktes. //Tierarzt 1.Umschau.-1980.-v.35.- №10 s.642-649.
72. Behrens F., Ziegelniaier R., Toth T. u.a. Rinderleukose-Di-agnostik: ELISA ein neues Verfahren.// Berl.u.Munch. Tierärztliche Wochenschrift.- 1979.-v.92, H.22.-5.429-432.
73. Belak S., Ballagi-Pordany A.Application of polymerase chain reaction (PCR) in veterinary diagnostic virolo- ; gy.//Vet.Res.Commun.-1993.-v.17.-p.55-72.
74. Bex F.,Bruck C., Mammerickx M. et al. Humoral antibody response to bovine leukemia virus infection in cattle and sheep.//Cancer Res.-1979,-v.39.- p.1118-1123.
75. Biancifiori F., Cenci G. ELISA test for detection of antibodies to enzootic bovine leukosis virus.//Fourth Intern. Symp. on bovine 1eukosis.-Brussels-Luxembourg. -1982. -p. 167-171.
76. Bolognesi D.P., Mantalero R.C., Frank H., Schaf er W. Assembly of type C oncornaviruses; a model.//Science. -1979.-v.199.-№4325.- p.183-186.
77. Bruck C., Mathot S.,Porteteile D. et al. Monoclonal antibodies define eight independent antigenic regions on the bovine leukemia virus (BLV) envelope glycoprotein gp51.//Virology . -1982a. -v. 122. -p. 342-352.
78. Bruck C., Porteteile D., Burny A., Zavada J. Topographical analysis of BLV gp51 epitopes involved in viral functions .//Virology.-1982b.-v.122.-p.353-362.
79. Bruck C., Porteteile D., Zavada J., Burny A. Molecular dissection of bovine leukemia virus envelope glycoprotein(BLV gp51) by monoclonal antibody study.//Modern trends in human leukemia.V.(Neth R.,ed.).-Berlin. -1983.-p.222-226.
80. Bruck C., Rensonnet N., Porteteile D. et al.Biologically active epitopes of bovine lekemia virus glycoprotein gp 51 .-Their dependence on protein glycosylation and genetic variabi1ity.//Virology.-1984.-v.136.-n 1.-p.20-31.
81. Bukelskiene V. Kraujo serumo reguliacinio vaidmens tyrimas kultivuotu MH-22A lasteliu adaptaciniame procese in vivo.// Daktaro disertacijos santrauka.- Vilnius.-1999.- p.24.
82. Burny A., Cleuter Y., Dandoy C. et al. La leucemia bovine: systeme modele de leucemogenesation par un retrovirus.// Ann.Med.Vet.-1986. -v.130.-No 4.- p.287-294.
83. Burny A., Bex F., Bruck C. et al. Biochemical studies on enzootic and sporadic types of bovine leukosis.//In: Antiviral mechanisms in the control of neoplasia.(P.Chand-re,ed.).-1978a.-p.83-99
84. Burny A., Bex F., Chantrenne H., et al. Bovine leukemia virus involvement in enzootic bovine leukosis.//Adv.Cancer Res.-1978.-v.28.-p.251-311.
85. Burny A., Bruck C. ,Chantrenne H. et al. Bovine leukemia virus: Molecular biology and epidemiology.//In: Klein G.,ed.
86. Viral Onkology.-N-Y.- Raven Press.-1980.-p.231-289.
87. Burny A., C.Bruck., Y. Cleuter.et al.Bovine leukaemia virus: a tantalising story.//Viruses and Cancer.- 37th Symp.Soc.Gen. Microbiol.-Warwick.-Apr. 1985- Cambridge.-1985. -p.197-216
88. Burny A., Cleuter Y., Dandoy C. et al. Leukemogenesis by transactivating retroviruses: bovine leukemia virus as a model system.//Concepts and Theor.Carcinogenesis.- Proc. 4th Annu. Symp.Eur.Organ. Coop.Cancer Prev.Stud.(ECP).-Drag-ge.-1987.-p.77-85.
89. Burny A., Cleuter Y., Kettmann R. et al. Bovine leukaemia: Facts and hypotheses derived from the study of an infectious cancer. //Vet.Microbiology. 1988.-v.17.-p.197-218.
90. Buxton B.A., Hinkle N.C., Schultz R.D. Role of insects in the transmission of bovine leucosis viruspotential for transmission by stable flies, horn flies and tabani-des.//Arn. J. Vet.Res.-1985.-v.46, 1.-p. 123-126.
91. Calafat J., Hageman P.C., Ressang A.A. Structure of C-type virus particles in lymphocyte cultures of bovine origin. //J.Natl.Cancer Inst.-1974.-v.52.-p.1251-1257.
92. Calafat J., Mastenbroek N., Quak J. Studies on bovine leukemia: III. The hematological and serological response of sheep and goats to infection with whole blood from leukae-mic cattle.//Zbl.Vet.Med.B.-1976.-v.23.-p.662-668.
93. Calafat J., Ressang A.A. Ultrastructures of bovine leukemia virus.Comparison with other RNA tumor viruses.//In: Bovine leucosis:Various methods of molecular virology.-CEC,Luxembourg. (A.Burny,ed.).-1977.-p.13-30.
94. Callahan R., Lieber,M.M., Todaro G.J. et al.Bovine leukemia virus genes in the DNA of leukemic cattle.//Seience.-1976.-v.192.-p.1005-1007.
95. Cockerell G.L., Rovnak J.The correlation between the direct and indirect detection of bovine leukemia virus infection in cattle.//Leukemia Research.-1988.-v. 12,No.6-pp.465-469.
96. Copeland T.D., Morgan M.A. ,0roszlan S. Complete amino acid sequence of a nucleic acid binding- protein of bovine leukemia virus.//FEBS Lett.-1983.-v.156.-p.37-40.
97. Cornefert-Jensen F., Have W.C., Stock N.D. Studies on bovine lymphosarcoma:Formation of syncytia and detection of virus particles in mixed cultures.//Int. J.Cancer.-1969.-v.4.-p.507-519. ' ji
98. Cornefert-Jensen F., Stock N.D., Marshak R.R. Detection of a bovine virus associated with syncytial formation in mixed cell cultures.//Bibl.Haemat.-1970.-v.36.-p.453-464.
99. Coulston J., Daniel R.C.W.,Lavin M.F. Integration of bovine leukemia virus at all stages of enzootic bovine leukosis.//Arch. Virol. -1991.-v. 119.-p. 13-23.
100. Cowley J.A., Molloy J.B. Dimmock O.K. et al. Infectivity of bovine leukaemia virus infected cattle; An ELISA for detecting antigens expressed in in vitro cultured lymphocytes. //Vet.Microbiology. -1992. -v. 30. -p. 137-150.
101. Cullen B.R. Human immunodeficiency virus as a prototypic complex retrovirus.//Journal of virology.-1991.-1053-1056.
102. Dekegel D., Mammerickx M., Burny A., et al. Bovine leukemia virus(BLV):a bovine oncorna virus.//Sem.etude int. actual, prod. bovines.-1978.-p.277-283.
103. Demirhan I., Altanerova V., Chandra A. et al.Characterization of the RNA dependent DNA polymerase of bovine leukemia virus.// Anticancer Res.-1996.-v.16.-p.2501-2505.
104. Depelchin A., Letesson J.J., Lostrie-Irussart N. et al. Bovine leukemia virus(BLV)-infected B cells express a marker similar to the CDS T cell marker.//Immunology Letters.-1989.-v. 20.-p. 69-76.
105. Dequedt F., Ketfcmann R., Burny A., Willems L. Mutations in the p53 tumor-supressor gene are frequently associated with bovine leukemia virus-induced leukemogenesis in cattle but not in sheep.//Virology.-1995.-v.209.-p.676-683.
106. Derse D. Trans-acting regulation of bovine leukemia virus mRNA processing.//!.Virol.-1988.-v.62,n 4.-p.lll5-1119.
107. Deschamps J., Kettmann R., Burny A. Experiments with cloned complete tumor-derived bovine leukemia virus information prove that the virus is totally exogenous to its target animal species.//J.Virol.- 1981.-v.40.-p.605-609
108. Deshayes L.,Levy D., Parodi A.L., Levy J. Proteins of bovine leukemia virus. I.Characterisation and reactions with natural antibodies.// J.Virol.-1977a.-v.21.-p.1056-1060
109. Deshayes L,. Levy D.,Parodi A.L. Identification of structural polypeptides of bovine leukemia virus.//In: Bovine leucosis. Various methods of molecular virology.-1977b.-p.57-67
110. Deshayes L,. Levy D., Parodi A., Levy J.P. Spontaneous immune response of bovine leukemia virus infected cattle against five different viral proteins.//Intern.J.Cancer. -1980. -v. 25 ,N4. -p. 503- 508.
111. Devare S.G., Stephenson J.R., Sarma P.S. et al. Bovine lyp-hosarcoma: development of a radioimmunologic technique for detection of etiologic agents.// Science 1976.-v.194pp.1428-1430.
112. Devare S.G.,Chander S., Samagh B.S., Stephenson J.R. Evaluation of radioimmunoprecipitation for the detection of bovine leukemia virus infection in domestic cattle.//J.Immunol. -1977.-v.119.-p.277-282.
113. Devare S.G., Oroszlan S., Stephenson J.R. Application of radioimmunological techniques to studies of the epidemiologic involvement of bovine leukemia virus in lymphosarcoma of domestic cattle.//Ann.Rech.Yet.-1978.-v.9-p.689-697.
114. Dietschold B., Kaaden O.R., Frenzel B. Subunit and fine structure of glycoprotein of bovine leukemia virus. //Ann.rech.vet.-1978.-v.9,No4.-p.613-617.
115. Diglio C.A., Ferrer J.F. Induction of syncytia by the bovine C-type leukemia virus.//Cancer res.-1976.-v.36. -1056-1067.
116. Dimmock C.K.,Roger R.J., Chung Y.S.et al.Differences in the lymphoproliferative response of cattle and sheep to bovine leucosis virus infection.// Vet.Immunol.and Immunopat-hol.-1986. -v.11.-p.325-331.
117. Dolz G.Untesuchungen zur Diagnose der Rinderleukose in Costa Rica unter Verwendung verschiedener Nachweisvervahren (Immunodiffusion, ELISA,Western Blot).//Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades beim Fachbereich
118. Veterinärmedizin.-Giessen-1990.-162S.
119. Drescher B., Rossler H., Venker P., Wittmann W. Purification and characterization of bovine DNA polymerase .//Arch.f.Geschwulstf.-1979.-v.49.-p.569-579.
120. Driscoll D.M.,Olson C. Bovine leukemia virus associated antigens in lymphocyte cultures.//Am. J. Vet. Res.-1977.-v. 38. -p.1897-1898.
121. Eaves F.W., Molloy J.B., Dimmock C.K.,Eaves L.E. A field evaluation of the polymerase chain reaction procedure for the detection of the bovine leukaemia virus proviral DNA in cattle,//Vet .Microbiol.-1994.-v. 39.-pp. 313-321.
122. Eloit M., Torna B., Vuillaume A. et al.Depistage de la leu-cose bovine enzootique par le test ELISA applique au lait ! de melange:etude d'un modele theorique.//J.Biol.Standardization. -1986.-v.14.- p.67-74.
123. Eloit M., Vuillaume A., Duret C. et al.Etude de l'évolution des anticorps de la leucose bovine enzootique dans le lait au cours de la lactacion.//Rec.Med.Vet.-1987.-v.163. -p.555-560.
124. Eloit,M., Hillion,E., Argente G.et al. Depistage de la leucose bovine enzootique par le test ELISA sur lait de melange dans un département a faible prevalence de l'infection leucosique./ZRev.Med.Veter.-1988.-v.139, No3.-p.293-299.
125. Eloit M., Lamy F., Glevarec M. et al. Detection of bovine leukemia virus antibodies in bulk tank milk using an ELISA test:improvement of the predictive value of results by repeated testing. //Biologicals.- 1990. -v. 18. -p. 19-23.
126. Eloit M., Kuzmak J., Dheiller M. et al. Comparison of performances of four EL1SA kits in the detection of BLV antibodies in bulk tank milk or concentrated lactoserum from herds with low prevalence of infection. //Biologi-cals.-1990b.-v.18.-p.55-59.
127. Engvall E., Quantitative enzyme immunoassay (ELISA) in microbiology.//Med. biol.-1977.-v.55.-p.193-£00.
128. Fechner H., Kurg A.,Geue L. et al.Evaluation of polymerase chain reaction(PCR) application in diagnosis of bovine leukaemia virus (BLV) infection in naturally infected cattle.//J. Vet.Med.B.-1996.-v.43.- NolO.- p.621-630.
129. Ferencz G., Balla E., Horvath Z., Kassai T. Szavasmarhak es juhok szarvasmarhaleukozis-virusfertozottsegenek kimutatasa enzirnes immunadszorpcios vizsgalat (EL ISA) utj an//Magyar Allatorvosok Lapja.-1979.-v-34,n.1£.-p.799-801.
130. Ferrer J.F., Avila L., Stock N.D.-Serological detection of type C viruses found in bovine cultures.//Cancer Res.-1972.-v.32.- N9.-p.1864-1870.
131. Ferrer J.F.,Abt D.A., Bhatt D.M., Marshak R. Studies of the relationship between infection with bovine C-type virus, leukemia and persisten lymphocytosis in cattie.//Cancer Res.-1974-v.34,N4.-p.893-900.
132. FerrerJ.F., Piper C.E., Abt D.A. et al. Natural mode of transmission of the bovine C-type leukemia virus (BLV).// Bibl.Haematol.-1976.-v.43.-p.235-237.
133. Ferrer J.F., Piper C.E., Abt D.A., Marshak R.R. Diagnosis of bovine leukemia virus unfection:Evaluation of serologic and hematologic tests by a direct infectivity detection assay. //Amer. J. Vet. Res. -1977a. -v. 38. -p. 1977-1981.
134. Ferrer J.F., Piper C.E., Baliga V. Diagnosis of BLV infection in cattle of various ages.//In:Bovine Leucosis.-Various methods of Molecular Virology.- CEC, Luxembourg.(A.Burny,ed.).-1977.- p.323-336.
135. Ferrer J.F., Cabradilla C.D. The phenomenon of polykaryocy-tosls induced by BLV in mixed cultures; specificity, macha-nisms and application to the diagnosis of BLV infection in cattle.//Ann.rech.Vet.-1978.-v.9.-p.721-728.
136. Ferrer J.F. ,Marshak R.R.,Abt D.A., Kenyon S.J. Persistent lymphocytosis in cattle; its cause, nature and relation to lymphosarcoma.//Ann. Rech. Vet-1978-v, 9.-p. 851-857.
137. Ferrer,J.F., Marshak,R.R. ,Abt D. A. Kenyon,S.J. Relationship between lymhosarcoma and persistent lymphocytosis in cattle. A review. //J. Am. Vet. Med. Assoc. -1979- V.175.-p.705-708*
138. Ferrer J.F. Bovine lymphosarcoma.//Adv.Vet. Sei. Comp. Med. -1980.-v.24.-p.1-68).
139. Ferrer J.F., Kenyon S.J., Gupta R. Milk of dairy cows frequently contains a leukemogenic virus.// Science. -1981.-v.213,n.28.-p.1014-1016.
140. Ferrer J.F.,Piper C.E. Role colostrum and milk in the natural transmission of the bovine leukemia virus.//Cancer Res.-1981.-v.41.-p.4906-4909.
141. Foil L.D., French D.D., Hoyt P.G. et al. Transmiss ion of bovine leukemia virus by Tabanus fuscicosta-tus.//Am.J.Vet.Res.-1989.-v.50. No.10. -p.1771-1773.
142. Forschner E., v.Keyserlingk-Eberius M. Enzootishe Rinderlu-kose:Aktuelle Verlaufskontrolle und Sicherung der Beurtei-lungskontinuitat des ID-testes durch routinemassigen Einsatz eines Prufsets.//Dtsch.tierartzl.Wsch.-1980.- v.87,No 9.-S.338-342.
143. Forschner E., Bunger I., Detection of IBR/IPV, EBL and Brucellosis anribodies in samples of bulk milk with using asimple method for concentration of the antibodies. //Dtsch.Tierarztl.Wsch.- 1986. -v. 93.- S.112-115.
144. Frenzel B. Kaaden O.R., Mussgay M. Purification of glycoprotein from bovine leukemia virus (BLV). //Z. Natur-forsch.-1977.- H32.-5301-304.
145. Fossum C.Bovine lymphoid cells and monocytes,identification and function.//Thesis,Sveriges Lantbruksuniversitet.-1985.-p.1-33.
146. Fossum C., Burny A., Portetelle D. et al.Detection of B and T-cells, with lectins or antibodies, in healthy and bovine leukemia virus-infected cat11 e.//Yet. Immunol.and. Immunopat-hol.-1988.-v.18.-p.269-278.
147. Gauthier T., Launais M., Guillemain B. et al. Evaluation of EL ISA, RIA, EPI and AGID tests in the diagnostic bovine leukemia virus infection.//5th Inter. Symp.on bovine leukosis. (O.C.Straub, ed.)-1984.-v.38.-p.398-399.
148. Gielkens.A.L. J.,A.A.Ressang A.A., Jzermann J., QuakJ.:Test protocol of an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) for the detection of antibodies against bovine leukosis vi-rus//Vet.Quart.-1981.-v.3. -No.1.-p.34-37.
149. Ghysdael J., Kettmann R., Buray A. Translation of bovine leukemia virus genom information in heterologous protein synthesizing systems programmed with virion RNA and in cell-lines persistently infected by BLV.//Ann.Rech.Vet.-1978v.9-p.627-634.
150. Ghysdael J.} Kettmann R., Burny A. Translation of bovine leukemia virus virion RNAs in heterologous protein-synthesizing systems.//J.ViroL- 1979.-v.29,No3.-p.1087-1098.
151. Ghysdael J.,Bruck C.,Kettmann R. Burny A. Bovine leukemia virus.// Curr.Top. Microboil.Immun.-1984.-V.112-p.l-19.
152. Gilden R.V., Long C.W., Hanson M. et al. Characteristics of the major internal protein and RNA-dependent DNA polymerase of bovine leukemia virus.//J.Gen. Virol .-1975.-v. 29. pp.305-314
153. Graves D.C.}, Diglio C.A., Ferrer J.F. "A reverse transcriptase assay for detection of bovine leukemia virus .//Am.J.Vet.Res.-1977v.38.-p.1739-1744.
154. Graves D.C. ,McQuade M., K.Weibel: Comparison of the enzyme linked immunosorbent assay with an early polykaryocytosis inhibition of antibodies to bovine leukemia virus. ; //Am.J.Vet.Res.-1982.-v.43.- p.960-966
155. Gross L. Oncogenic viruses.//2nd edition.-Pergamon,Ox-ford.-1970.
156. Guillemain B., Mamoun R., Levy D. et al.Early polykariocy-tosis inhibition:a simple quantitative in vitro assay for the detection of bovine leukemia virus infection in cattle . //Europ . J . Cancer .- 1978 .- v. 14 . -p. 811-827 .
157. Gupta P., Ferrer J.F. A critical comparison of the virus neutralization, radioimmunoprecipitation and immunodiffusion tests for the serological diagnosis of BLV infection. //Aim. rech. vet. -1978. -v. 9.-No4 -p.683-688.
158. Gupta P.,Ferrer J.F. A critical comparison of the virus neutralization, radioiranunoprecipitation and immunodiffusion tests for the serological diagnosis of BLV infection. //Ann. Rech. Vet. -1978. -v. 9-p. 633-688.
159. GuptaP., Kashmiri S.V.S., Ferrer J.F. Transcriptional control of the bovine leukemia virus genome:Role and characterization of a nonimmunoglobulin plasma protein from bovine leukemia virus-infected cattle.//J. Virol. -1984. -v. 50. -p. £67-270.
160. Gupta P., Chatterjee R., Cai Q.Prevalence of the plasma bovine leukaemia virus blocking factor in cattle from a commercially dairy herd.//Vet. Rec.-1989.v.125.-p.5-6.
161. Haas L., Divers T., Casey J.W. Bovine leukemia virus gene expression in vivo.//J. Virol.-1992.- v.52-p.6223-6225.
162. Hammar L., Merza M., Malm K. et al. The use of two-phase systems to concentrate and purify bovine leukemia virus outer envelope protein gp51.// Biotecnology and Applied Biochemistry. -1989. -v. 11 . -p. 296-306.
163. Hammar L., Eriksson S., Malm K., Morein B. Concentration and purification of feline leukaemia virus(FeLV) and its outer : envelope protein gp70 by aqueous two-phase systems.// J.of Virol.Meth.-1989.-v.24.-p.91-102.
164. Heeney J.L., Valli V.E., Montesanti J.Alterations in humoral immune response to bovine leukaemia virus antigens in cattle with lymphoma.//J.gen.Virol.-1988.-v.69.-p.659-666.
165. Hoff-Jorgensen R. An international comparison of different laboratory tests for the diagnosis of bovine lekosis: suggestions for international standardization.//Vet.Immunol.and Immunopatho1.-1989.-v.22.-No3. p.293-297.
166. Islas A.,Montes G.,Lopez J.,Rojas K.Leucosis enzootics bovina: inducción experimental de la infebcion con dos fuentes del virus.// Archivos de Medicina Veterinaria. -1996.-v.28,Nol.- 117-120.
167. Itohara S.,0ikawa I.,Terui S., Mizuno Y. Infectivities of bovine leukemia virus in peripheral blood lymphocytes from naturally infected cattle and their relation to persistent lymphocytosis and antibody titers.//Jpn. J. Vet.Sci.-1985.-v.47. p.807-810.
168. Johnson R.,Kaneene J.B.,Andersen S.M. Bovine leukemia virus: duration of BLV colostra! antibodies in calves from commercial dairy herds.//Prevent. Vet .Med. -1987. -V4. -p. 371-376.
169. Johnson R., Kaneene J.B. Bovine leukemia virus.Part II ^Zoonotic potential molecular epidemiology, and an animal model. //Continuing education article No8.-The compendium.-North American Edition.-Food animal. -1991. ■-v.13.-NolO.-p.1631-1639.
170. Johnson E.S.Dalmas D., Noss J., Matanoski G.M. Cancer mortality among workers in abbatoirs and meatpacking plants: an update.//Am.J.Ind.Med.-1995.-v.27.-p.389-403.
171. Johnson E.S.,Griswold C.M. Oncogenic retroviruses of cattle, chickens and turkeys; potential infectivity and oncogenicity for humans.// Med.Hypotheses.-1996.-v.46.-p.354-356.
172. Kaaden 0., Dietzschold B., Straub D.C. Beitrag 2ur Isolierung einer RNA-abhangigen DNA-polymerase aus Lymphozyten eines an lymphatischer leukose erkrankten Rindes.//Zbl.Bac-teriologie originale A.-1972.-v.220.-S.101-105.
173. Kaaden O.R Aktuelle Fragen der Rinderleukoseforschung und bekämpfung.//Dtsch.tierarztl .Wsch.- 1982.- v.87.-S.41-43.
174. Kaaden O.-R.»Fischer W., Meermann A., Liebisch A. Transmission of BLV by ixodes ricinus ticks.//In;Current Topics -in Vet.Med.and Anim.Sci.-1982.-v.l5.-p.348-358.
175. Kaaden O.-R. LangeS., Romanowski W. et al.Transient vire-mia with bovine leukemia virus in bulls.//Zbl.Vet.-Mtd.-1982-B.29.- 269-p.22
176. Kabeya H.,Ohashi K.,Ohishi K.et al.An effective peptide vaccine to eliminate bovine leukaemia virus (BLV) infected cells in carrier sheep.//Vaccine.-1996.-v.14,Nol2.-p. 1118-1122.
177. Kajikawa 0. ,Koyama H.,Sasaki T. et al. Studies on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies in cattle infected with bovine leukemia virus// Jpn. J . Vet . Sei . -1983- v. 45, n. 3. -p. 347-353.
178. Kelly E.J., Jackson M.K., Marsolais G. et al. Early detection of bovine leukemia virus in cattle by use of the polymerase chain reaction.//Amer.J.Vet.Res.-1993.-v.54,No2.-p.205-209.
179. Kenyon S.J.,Ferrer J.F., McFeely R.A., Graves D.C.-Induction of lymphosarcoma in sheep by bovine leukemia virus.// J.Natl.Cancer.Inst.-1981.-v.76.-1151-1163.
180. Kettmann R., Mammerickx M., Dekegel D. et al. Quelques properties biochimiques du virus associe a la leukose bovine (BLV).//Arch.Inter.Physiol.Biochem.-1975.-v.88.-p.193-194.
181. Kettman R., Portetelle ,D., Mammerickx,M. et al. Bovine leukemia virus: An exogenous RNA oncogenic vi-rus.//Proc. Natl . Acad. Sei .USA.-1976.-v. 73.-p. 1014-1018.
182. Kettmann R., Burny A., Cl eut er Y. et al. Distribut ion of bovine leukaemia virus proviral sequences in tissues of bovine, ovine and human origin.//Ann.Rech.Vet.-1978.-v.9.-p.837-844.
183. Kettmann,R., Meunier-Rotival,M.,Cortadas J. et al. Integration of bovine leukemia virus DNA in the bovine genome.//Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-1979.-v. 76 ,HolO.-pp. 4822-4826.
184. Kittel berger R.,Layborn B.J. ,Diack D.S. et al. Evaluation of electrophoretic immunoblOtting for the detecton of antibodies against the bovine leukosis virus in cattle.//J. Virol. Meth.- 1996.-v.61,Nol-2.-p.7-22.
185. Klintevall K., Nasi und K. ,Svedlund G. et al. Evaluation of an indirect ELISA for the detection of antibodies to bovine leukaemia virus in milk and serum.//J.Virol .Meth. -1991. -v. 33. -p. 319-333.
186. Klintevall K., Ballagi-Pordany A., Naslund K., Belak S.Bo-Vine leukaemia virus: rapid detection of proviral DNA by nested PCR in blood and organs of experimentally infected calves.//Yet.Microbiology.-1994.-v.42- p.191-204.
187. Klintevall K. Bovine leukaemia virus: course of infection and means of detection.// Dissertation.- Uppsala.- 1995. -57 p.
188. Komori H., Ishiguro N., Horiuchi M. et al. Predominant p53mutations in enzootic bovine leukemic cell lines.// Vet. Immunol. Immunopathol.-1996.-v.5S.-p.53-63.
189. SOO.Kono Y., Hatakeyama H., Ishikawa H., Sentsui H. Antibody titers in cattle clinically and subclinically infected with bovine leukemia virus.//Vet. Microbiology.-1981.-v. 6.-p. 167-170.
190. Kono Y., Sentsui H., Miyamoto T. et al.Changes in antibody titers in cattle infected clinically and subclinically with bovine leukemia virus.// Int.J.Cancer. -1982.-V.30.-p.655-657.
191. Kono Y., Sentsui H., Arai K. et al. Serological methods, to detect calves infected in utero with bovine leukemia virus.// Jpn.J.Yet.Sci.-1983.-V.45,N4.-p.453-461.
192. Kozaczynska B.Modification of the ELISA for the determination of antibodies of IgGl,IgG2 and IgM classes in the serum of bovine leukaemia virus-infected animals.//Bulletin of the Veterinary Institute in Pulswy.- 1996.-v.40,No 1.17-23.
193. Levkut M., Lesnik F., Balent P. et al.Manifestacna forma encefalitozoonozy u kralikov plemena cincila/ZSlivensky Ve-terinarsky Casopis.-1977.-v.22, No3.- p.135-137.
194. Levy D., Deshayes L., Parodi A.L. et al. Bovine leukemia virus specific antibodies among french cattle. II.Radioimmunoassay with the major structural protein BLV(p24).//Int.J.Cfnc.-1977,-v.20-p.543
195. Lewin H.A., Wu Ming-che, Nolan T.J.,Stewart J.A. Peripheral B lymphocyte percentage as an indicator of subklinical progression of bovine leukemia virus infection.//J. Dairy Sci.-1988.-v.71,No9.-p.2526- 2534.
196. Li ebermann H. ,Wittmann W., Müller M. Neue Erkentnisse bei der enzootischen Rinderleukose.//Mh. Yet.Med.-1981.- v.36.-s. 69-74.
197. Long C.W., Henderson L.E., Oroszlan S., Isolation and characterization of low molecular weight DNA binding proteins from retroviruses.//Virology.- 1980.-v.104.-p.491-496;
198. Losieczka K. Prenatalne zakazenia cielat wirusem BLV (bovine leukemia virus)//Medycina Yeterynaryona.-1986.-v.42. n.10.- p.595-597.
199. Lowry D.H., Rosehbrough N. J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent.//J. Bi-ol.Chem.-1951.-v.193,N 1.,p.265-273.
200. Maas-Inderwiesen F., Albrecht A., Bause I. et al. Zum Einfluss der Leukosebekampfung auf die Entwicklung der enzootischen Rinderleukose in Niedersachsen.//Dtsch.tierart-ztl.Wschr.- 1978.-v.85.-S.309-313.
201. Mammerickx M., Portetelle D., Burny A. Experimental cross-transmission of bovine leukemia virus (BLV) between serial animal species.//Zbl.Vet.Med. B.-1981.-v.28.-p.69-81.
202. Mammerickx,M., Portetelle D., Bruck 0., Burny A. Le diagnostic de la leucose bovine enzootique a l'aide d'un test immuno-enzymatique(ELISA) impliquant un anticorps monoclonal. //Ann.Med.Vet.-1984a.-v.128.- p.55-63.
203. Mammerickx,M., Portetelle D.,Nys J., Burny A. Le depistage de masse de la leucose bovine enzootique en Belgique a l'aide d'un test immunoenzymatique(ELISA) effectue sur melanges de serums.//Ann.Med. Yet.-1984b.-v. 128.-p.455-465.
204. Mammerickx,M., Portetelle D.,Nys J. , Burny A. Rapid detection of bovine leukemia virus infection in a large cattle population with an ELISA performed on pooled sera grouped by herd.//Zbl.Vet.Med.B.-1985b.- v.32.-p.601-608.
205. Mammerickx M., Portetelle D., Burny A. The diagnosis of enzootic bovine leukosis.//Comp. Immun.Microbiol infect.Diseases.-1985.-v. 8.-No 3/4-p. 305-309.
206. Mammerickx,M., Portetelle D., Burny A. Application of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) involving monoclonal antibody for detection of BLV antibodies in individual or pooled bovine milk samples.//Zbl. Vet .Med. B.-1985.-v. 32.-p. 526-533.
207. Mamoun R.Z., Astier T., Guillemain B.,Duplan J.F. Bovine lymphosarcoma: processing of bovine leukemia virus-coded protein.//J.Gen.Virol.-1983.-v.64.- №12.- p.2791-2795.
208. Mamoun R.Z., Morisson M., Rebeyrotte N.et al. Sequence variability of bovine leukemia virus env gene and its relevance to the structure and antigenicity of the glycoproteins. //J. Virol. -1990- v. 64, No9.-p.4180-4188.
209. Manz D, Die Milch als Uniersuchungmaterial fur die Diagnostik der enzootischen Leukose des Rindes.// Dtsch.tie-rarztl.Wschr.-19Ql.-v.88.- s.169-171.
210. Manz D.»Wiegand D., Behrens F., Ziegelmeier R. Vergleichende serologische Untersuchungen an Blut und Milch zur Diagnostik der enzootischen Leukose des Rindes. // Zbl.Vet.Med.B.-1981.-v.28.-S.280-291.
211. Marin C., De Lopez N.M., Alvarez L.et al. Humoral spontaneous response to bovine leukemia virus infection in zebu, sheep, buffalo and capibara.// 4th Int.Symp. on bovine leu-kosis.Bologna, Nov.5-7.(O.C.Straub, ed.)-1982.-p.310-319.
212. Maris P., Nougayrede Ph., Perrin G.Leucose bovine enzooti-que application de la technique E.L.I.S.A. a la detection des anticorps.//Comp. Immun.Microbiol.infect.Dis.-1983.-v.6* -p. 45-55.
213. Matthaeus W. Heterogeneous properties of BLV-precipitating immunoglobulins in bovine leukemic sera.//Ann. Ree. Vet.-1978.-v. 9,H 4 .-p.635-641.
214. Matt.haeus W., Straub 0.0. The immune responce of normal and leukotic cattle to IBR-IPV-Virus.//In: Bovine leukosis: Various methods of molecular virology.-1977.-p.271-288.
215. Matthaeus W., Straub O.C. Schlotterer E. Demonstration of bovine leukemia virus specific precipitating IgM antibodies in Immune complexes.//Curr. Topics in Vet.Med. and Animal. Sei.-1982.-v. 15.-p. 123
216. McDonald,H.C.,Ferrer J.F. Detection, quantitation and characterisation of major internal virion antigen of the bovine leukemia virus by radioimmunoassay. //J. Natl. Cane. Inst.,-1976.-v.57- pp.875-882.
217. Meirom R., Brenner J., Gluckman A.et al. Humoral and cellular responses in calves experimentally infected with bovine leukemia virus(BLV) .//Yet. Immunol.and Immunopat-hol.-1985.-v.9.-p.105-114.
218. Merza M. Studies on the purification of bovine leukemia virus envelope glycoprotein( gp51), its integrity and immuno-genicity into iscom.//Thesis,SLU info/repro.-Uppsa-la.-1991.-p.1-30.
219. Meyer,U.,Schilow W.F.,Starick E.,u.a. Vergleich der Empfindlichkeit des Enzymimmunoassay und des Agargel-Immundiffus inst est es fur die Bestimmung von Antikörpern gegen das bovine Leukosevirus.Z/Arch.exper. Yet.med.-1983-v.37.-No.5.-S.661-666.
220. Meyer U. ,W.F.Schilow. Der Enzym-Immunoassay fur die Bestimmung von Antikörpern gegen das bovine Leukosevi-rus//Arch.exp. Vet.med.- 1984-v.38.- No2.-s.210-222.
221. Meyer Ü.,Schilow W.F., Wittmann W. u.a.Ergebnisse des Einsatzes des Enzymimmunoassay bei der Bekämpfung der enzoo-tischen Rinder leukose in der DDR.//Tag. -Ber. Akad.Landwirt-sch.-Wiss. DDR. -1984.-No228.-s. 41-47.
222. Miller J.M., Miller L.D., Olson C., Gillette K.G. Virus-like particles in phytogemagglutinin-stimulated lymphocytecultures with reference to bovine lymphosarcoma. //J . Nat 1 . Cancer . Inst 1969 . -v. 43. p. 1297-1305
223. Miller J.M., Olson C. Precipitating antibody to an internal antigen of C-type virus associated with bovine lymphosarco-ma.//J.Natl.Cancer Inst.,-1972.-v.49,No5.,-p.1459-1462
224. Miller J.M. ,Yan der Maaten M.J.Serological detection of bo- ; vine leukemia virus infection. // Yet. Microbiol. -1976a.-v.1.- p.195-202.
225. Miller J.M., Van der Maaten M.J. Serological response of cattle following inoculation with bovine leukemia vi- ' rus.//Bibl.Haemat.-1976b.-v.43.-p.187-189.
226. Miller J.M., Van Der Maaten M.J.Use of glycoprotein antigen in the immunodiffusion test for bovine leukemia virus antibodies.//Eur. J. Cancer.-1977a.-v. 13.- No 12.- p. 1369-1375.
227. Miller J.M., Van Der Maaten M.J., Phillips M. Studies of a ; glycoprotein associated with bovine leukemia virus.//In¡Bovine leukosis: various methods of molecular virology( A.Burny, ed.).-1977b.-p.69-81.
228. Miller J.M., Van Der Maaten M.J. Infectivity test of secretions and excretions from cattle infected with bovine leukemia virus.//J.Natl. Cancer Inst.-1979.-v.62.-No. 2.-p.425-429.
229. Mi ller J.M., Van Der Maaten M.J. The biology of bovine leukemia virus infection in cattle.//Cold Spring Harbor Conference on Cell Proliferation. -1980. -v. 7. -p. 901-909.
230. Mims C.A.Pathogenesis of viral infections of the fetus. //Prog.Med.Virol.-1968.-V.10.-p.194-237.
231. Molloy J.B., Walker P. J. ,Baldock,F.Ch. et al.An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine leukemiavirus p24 antibody in cattle. //J. Virol. Meth.-1990.-v.28.-p.47-58.
232. Molloy J.B., Dimmock,C.K., Eaves,F.W. et al. Control of bovine leukemia virus transmission by selective culling of infected cattle on the basis of viral antigen expression in lymphocyte cultures.//Vet. Microbiol.-1994.-v.39.-p.323 -333.
233. Muller M., Wittmann W., Liebermann H.u.a. Der Einfluss der Verfutterung von BLV-inaktiviertem Kolostrum und BLV-freiem Ammenkolostrum auf die Leukoseinfektionsrate bei Kal-bern.//Mh.Vet.-Med.-1985. -v.40.-S.709-712.
234. Mussgay M. ,Kaaden O.R. Progress in studies on the etiology and serologic diagnosis of enzootic bovine leukosis.// Curr.Top.Microbiol.Immunol.-1978.-v.79.-p.43-72.
235. Olson C., Baumgartener L.E. Pathology of lymphosarcoma in sheep induced with bovine leukemia virus.//Cancer Res.-1976. -v.36.-p.2365-2373.
236. Olson C., Driscoll D.M. Bovine leucosis;Investigation of risk for man.//J.Amer.vet.Med.Ass.-1978.-v. 173.-1470-1472
237. Onuma M., Olson C., Driscoll D.M. Properties of 2 Isolated antigens associated with bovine leukemia-virus infection// J.Natl.Cancer Inst.-1976.-v.57,-p.571-578.
238. Onuma M., Wada M., Yasutomi Y.et al. Supression of immunological responses in rabbits experimentally infected with bovine leukemia virus.// Vet.Microbiol.-1990.-v.25.-p. 131-141
239. Olson C., Hoss H.e., Miller J.M., Baumgartener L.E. Evidence of bovine C-type ( leukemia) virus in dairy cattle. //J.Am.Vet.Med Assoc.- 1973.- v.163.- p.355-357.
240. Olson C., Kaia R. ,Stauffacher R., Zehner E. Development of bovine leukosis virus infection in cattle. A preliminary study.//Ann.rech.vet.-1978. v.9.-p.845-849.
241. Onuma M., Olson C., Baumgartener L.E., Pearson L.D. An ether-sensitive antigen associated with bovine leukemia virus infection.//J.Natl.Cancer Inst.- 1975.- v.55.-p.1155-1164.
242. Otachel-HawranekJ.,Korfanty E.,Szachnowski S.et al. Przy-datnosc testu ELISA do wykrywania przeciwcial przeciw wiru-sowi EBB w poj edynczych i zbiorczych probach mleka .//Medy-cyna Weterynaryjna.-1995.-v.51,No 7-402-404.
243. E66.0tachel-Hawranek J. Uwalniane stad krow woj.Wroclawskiego od enzootycznej bialaczki.//Medycyna Weterynaryjna.-1996.-v.52,No9.- 587-590.
244. Pallesen U. Konzentrierung von leukoseantikorpern in Hof-tankmilchen(mittels eines Dialysesystems) zur Untersuchung im ELISA-system.//Dtsch.Tierarztl.Wschr.-1986.-v.93. ,No7.-S.319-320.
245. Patrascu I.V., Ooman S., Sandu I.et al. Specific protection against bovine leukemia virus infection conferred on cattle by the Roman inactivated vaccine BL-VACC-RO.//Rev.Ro-um.Med.-1980.-v.31, n 2.-p.95-102.
246. Paulsen J., Rudolph R., Schliesser T. Experimentelle Übertragung der lymphatischen Leukose des Schafes.// Zbl.Vet.Med.B-1975.-v. 22.-p.737-748.
247. Paulsen J., Rohde W., Pauli S. et al. Comparative study of ovine and bovine C-type particles./Bibl.haematol.-1976.-v.43.-p.190-192.
248. Perlberg K.-W., Miko A., Weiss R. u.a. Untersuchungen zum Nachweis von Antikörpern gegen das bovine Leukosevirus bei neugeborenen Kalbern mit Hilfe eines Enzymimmuntests im Vergleich zum Immunodiffusionstest.//Mh.Vet.-Med.-1984.-v.39.-S.129-133.
249. Perrin B., Fedida M. La concentración du lait pour le de-pi stage de la leucose bovine enzooti-que.//Bull.inf.lab.serv.vet.-1986.—No23.-p.41-45.
250. Phillips M., Miller J.M., Van der Maaten M.J. Isolation of a precipitatiin glycoprotein antigen from cell cultures persistently infected with bovine leukemia virus . //J . Nat 1 . Cancer Inst .- 1 978. v . 60 , Nol .- p . 213-217 .
251. Piper C.E., Ferrer J.F., Abt D. A., Marshak R.R. Postnatal and prenatal transmission of the bovine leukemia virus under natural- conditions.//J.Natl.Cancer Inst.-1979.-v.62.- ¡ p.165-168.
252. Portetelle D., Kettmann R., Mammerickx M. et al. Biochemical characterization of bovine leukemia virus.// Bibl.Haematol.-1976.- n43.-p. 363-365.
253. Pórtete lie D., Ghysdael J., Bumy A. et al. Metrizamide, a new reagent for purification of RNA oncogenic viruses, associated with bovine enzootic leukemia and human leukemia. //Arch, intern. physiol. biochim.-1977.-v.85.No 1.- p. 194.
254. Portetelle D., Bruck C., Mammerickx M., Burny A. Use of monoclonal antibody in an ELISA test for the detection of antibodies to bovine leukaemia virus.//J.Vi-rol.Meth.-1983.-V.6.- p.19-29
255. Portetelle D., Mammerickx M., Burny A. Use of two monoclonal antibodies in an ELISA test for the detection of antibodies to bovine leukaemia virus envelope protein gp51.//J.Virol.Meth.1989.-v.23,No 2.-p.211-222.
256. Portetelle D.,Nuttinck,M., Maistriaux R,M.et al. Le diagnostic de 1'infection par le virus de la leucemie bovi- ; ne(BLV) a l'aide d'un test immuno-enzymatique (ELISA) de competi t ion//Ann. Med. Vet.-1989.-v. 133. p. 23-30.
257. Powers M.A., Grossman D., Kidd L.C., Radke K. Episodic oc- j curence of antibodies against the bovine leukemia virus rex 1 protein during the course of infection in sheep.//J.Virol. -1991.-. -p.4959-4965.
258. Ressang A.A.- Transmission experiments with EBL virus in sheep and goats.//Vet.Microbiol.-1976. -v.1.- p.359.
259. Ressang A.A., Baars J. C., Calafat J.et al.Studies on bovine leukemia.111.The haematological response on sheep and goats to infection with whole blood from leukemic cattle.// Zbl.Vet.Med.-1976.-v.23.- p.662-667.
260. Ressang A.A., Gielkens A.L.J., Quak S. et al. Studies on bovine leukosis.VI.Enzyme linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to bovine leukosis virus.//Ann.Rech. Vet.-1978, v.9.-No4.- p.663-666;
261. Ressang A.A.,Gielkens A.L.J.,Quak J.,Mastenbroek N., Studies on bovine leukosis.VII.Further experience with an ELISA for the detection of antibodies to bovine leukosis vi-rus//Vet.Quart.-1981,-v.3n.l- p.31-33.
262. Rice N.R., Stephens R.M., Burny A. et.al. The gag and pol genes of bovine leukemia virus: nucleotide seguence and analysis.//Virology.-1985.-v.l43, No 2.- p.357-377.
263. Ristau E.,Wittmann V. Immunantworten des Rindes auf das bovine Leukosevirus und ihre pathogenetische Bedeutung (Ubersichtreferat) . //Mh.Vet.-Med.-1985.- B.40.- N16.-S. 545-548.
264. Romero C.H.,Aguiar A.A., Zanocchi H.G.et al. Susceptibility of the water buffalo (Bubalus bubalis) to enzootic bovine leukosis virus.//Pesq.Vet.Bras.-1982.-v.l.-p. 137-140.
265. Rosen C.A.,Sodroski J.G., Willems L.et al. The 3' region of bovine leukemia virus genome encodes a trans-activator protein.//EMBO Journal.-1986, v.5-NolO.-p.2585-2589.
266. Rossler H., Burkhardt h., Rosental S. et al. Influence of different culture conditions on BLV expression in permanently infected FLK cell lines.//Folia biol(CSSR).-1985.-v.31.-N4.-p.273-283.
267. Rulka J., Buzala E. Diagnostyca en200tyc2ney bialaczki byd-la przy uzyciu testu seroneutralizacji.//Medycyna Weteryna-ry3na.-1996.-v.52,Noll.-p. 708-711.
268. Sagata N., Ogawa Y., Kawamura J. et al. Molecular cloning of bovine leukemia virus DNA integrated into the bovine tumor cell genome.//Gene.-1983.-v.26,No 1.-p.1-10.
269. Sagata N., Yasunaga T.,Ogawa Y. et al.Bovine leukemia virus: unique structural features of its long terminal repea-tes and its evolutionary relationship to human T-cell leukemia virus.//Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-1984.-v.81,n 15.-p.4741-4745.
270. Sagata N., Yasunaga T., Tsuzuku-Kawamura J.et al. Complete nucleotide sequence of genome of bovine leukemia virus:Its evolutionary relationship to other retroviruses.//Proceedings of the National Academy of Science of the USA.-1985a.-v.82.-p.677-681.
271. Sagata N.,Tsuzuku-Kawamura J. ,Nagayoshi-Aida et al. Identification and some biochemical properties of the major Xblgene product of bovine leukemia virus. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1985b.- -v.82- p.7879 -7883.
272. Sargeant J.M. Kelton D.F. Martin S.W., Mann E.D. Evaluation of bulk-milk ELISA test for the classification of herd-level bovine leukemia virus status.//Preventive Veterinary Medicine.-1977.-v.31,No 3-4.-p.223-23D.
273. Scholz D., Bossmann H., Rossler H. u.a. Produktion des bovinen Leukaemia- Virus in permanenten infizierten fötalen Lamm-Nierenzell en (Optimierungsversuche).//Mh.Vet.Med.-1984. -B.39.-H. 21.- -S.733-738.
274. Scholz D. ,Miko A.,Bossmann H. u.a. Versuche zur Antigenge-winnung fur den Aufbau eines Mikro-Enzymimmunoassay zum Nachweis von Antikörpern gegen das Bovine Leukämie-Virus. //Mh. Vet. -Med. -1985. -B. 41. -H. 2. -s. 37-42.
275. Schlegel H.L. Die Entwicklung und bekämpfung der enzootisc-hen Rinderleukose in Niedersachsen von 1963 bis 1975.//Berl.-Munch. ti erarztl. Wschr.-1976. v. 89.-s. 473-477.
276. Schuurs A.H.W.M., van Weemen B.K. Enzyme-immunoassay.//Clin. Chim. Acta.-1977.-v.81.-p.1-40
277. Sentsui H., Thorn R.M., Kono Y., Ferrer J.F. Haemagglutina-tion by bovine leukemia virus.//J.Gen.Yirol.-1982.-v.59.-p.83-89.
278. Sherman M.P.,Ehrlich G.D., Ferrer J.F.et al. Amplification and analysis of specific DNA and RNA sequences of bovine leukemia virus from infected cows by polymerase chain reaction. //J. Clin. Microbiol.-1992.-v.30 No.l.- p.185-191.
279. Stott M.L.,Thurmond M.C., Dunn,S.J. et al. Integrated bovine leukosis proviral DNA in T helper and T cytotoxic/supressor lymphocytes. //J. Gen. Virol.- 1991. v. 72.- pp.307-315.
280. Stock N.D., Ferrer J.F. Replicating C-type virus in Phytohämagglutinin- treated buffy-coat cultures of bovine origin. //J.Natl.Cancer.Inst.-1972.-v.48.-p.985-996.
281. Straub O.C. Preliminary results of a new sanitation Programm for the eradication of enzootic bovine leukosis.// Ann.Rech.Yet.-1978.-v.9-p.895-898.
282. Severini M., Rutili D., Fruganti G. et- al. Experimental transmission of enzootic bovine leukosis in calves.//Current Topics Vet.med. and Anim.Sci.-1982.-v.15.- p.253.
283. Takashima 1., Olson C. Relation of bovine leukosis virus production on cell growth eyele. //Arch-.Virol.^-1981.-v.69.-N2.-p.141-148.
284. Takahashi K. ,Kono Y. Development of practical ELISA for detection of antibodies to bovine leukemia virus:a comparison of its sensitivity with that of virus neutralisation and agar gel immunodiffusion tests//Jpn J.Vet.Sei.-1985.-v.47,n.2.- p.193-200.
285. Temin H.M. »Mizutani S. RNA-dependent DNA-polymerase in virions of Rous sarcome virus.//Nature.-1970.v.226.-p.1211.
286. Todd.D.j Adair B.M. ,Wibberley G. An enzyme-linked immunosorbent assay for enzootic bovine leukosis virus antibodies// Vet.Ree.-1980.-v.107, n8.- p.124-126.
287. Todd D., Adair B.M., Wibberly G. Use of control antigen to improve the enzyme-1inked immunosorbent assay for enzootic bovine leukosis antibodies.//Vet.Ree.-1982.- v.110.- p.307-308.
288. Tolle A. Zur Beurteilung quantitativer hamatologischer Befunde im Rahmen der Leukose-Diagnostik beim Rind//Zbl.Vet.Med. B.-1965.-v.12.-s.281-290.
289. Toma B., Vuillaume A., Manet G. et al.Depistage de la leu-cose bovine enzootique par application du test ELISA sur le lait.//Rec.Med.Vet.-1984.-v.160.-p.53-61.
290. TomaB., Vuillaume A., Prévost P.et al. Depistage de la le-ucose bovine enzootique a l'aide du test ELISA applique au lait melange et au lait individuel.//Ann. Rech. Vet.-1986.-v. 17, Nolp. 75-83.
291. Trainin Z., Meirom R., Gluckmann A., Comparison between the immunodiffusion and the immunofluorescence tests in the diagnosis of bovine leukemia virus .//Ann.Rech.Vet.-1978.-v.9.-No4.- p.659-662.
292. Thurmond M.C., Carter R.L., Ruhr D.M., Burridge M.J. Decay of colostral antibodies to bovine leukemia virus with application to detection of calfhood infecti-on.//Vet.Res.-1982.-v.43,N 7.-p.1152-1155.
293. Uckert W.,Wunderlich,V., Ghysdael,J.et al. Bovine leukemia virus(BLV) structural model based on chemical crosslin-king studies.//Virology.-1984.-v. 133.-p386-392.
294. Uckert W.,Hertling I.,Kraft R. et al.Structural components of bovine leukemia virus: further biochemical and immunological characterization of major structural proteins and glycoproteins.//Virus Res.-1986.-v.4,No4.-p 343-356.
295. Ungar-Waron H., Avraham R., Gluckmann A., Trainin Z. Reduced immunocompetence of antibodies produced in leucemic cattle.//Ann.Rech. Vet.-1978.- v.9.-No4.- 815-821.
296. Van der Maaten M.J., Miller J.M. Replication of bovine leukemia virus in monolayer cell culture.//Bibliotheca Haema-tologica.-1976a.-v.43. p.255- 259.
297. Van der Maaten, M.J., Miller J.M. Replication of bovine leukemia virus in monolayer cell cultures.//Bibl.Haematoi.-1976b.-v.43.-p.360-362.
298. Van der Maaten,M.J., and Miller J.M. Serological evidence of transmission of bovine leukemia virus in chimpanzees.//Vet. Microbiol.-1976c-v. 1.-p. 351-357.
299. Van Der Maaten M.J.,Mi11er J.M. Sites of in vitro replication of bovine leukemia virus in experimentally infected cattle.//Ann.Rech.Vet.-1978.-v.9.No4- p.831-835.
300. Van Der Maaten M.J.,Miller J.M., Schmerr M.J.F. Effect of colostral antibidy on bovine leukemia virus infection of neonatal calves.//Am. J.Vet.Res.-1981.-v.42.N6.-p. 1498-1500.
301. Wilesmith J.W. , Straub 0.0. Lorenz R.J.Some observation on the epidemiology of bovine leukosis virus infection in a large dairy herd.//Res.Vet.Sei.-1980.-v.28.-NolO.-p.55.
302. Wi t tmann W., Star ick E., Liebermann H. Zur Anwendung des Immunodiffusions t es t e s bei der serologischen Diagnose der en-zootischen Rinderleukose.//Mh.Vet.Med.- 1983.- B.38.-S.281.
303. Wittmann W., Liebermann H., Gareiss G., Muller M. Neue Er-kentnisse bei der Bekämpfung der enzootischen Rinderleukose.//Tagungsber. Akad. Landwirtschaftswiss.DDR. ,-1984.-v.228. -s.17-26.
304. Wittmann W., Muller M., Starick E. Zur Role der Milch bei der Ubertragung des bovinen Leukosevi-rus.//Mh.Yet.Med.-1989. -v.45. -s.185-187.
305. Wyatt C.R., Wingett D., White J.S. e.a. Persistent infection Df rabbits with bovine leukemia virus sassociated with development of immune dysfunction//J.Virol. -1989.-v.63,Noll.-p.4495-4506.
306. Xie B.,0yamada T.,Yoshikawa H. Detection of proviral DNA of bovine leukaemia virus in cattle by a combination of in-si-tu hibridization and the polimerase chain reaction.//J. Comp.Pathology.-1997.-v.116,Nol.-p.87-96
307. Yoshinaka Y., Kafcoh I., Copeland T.D.et al. Bovine leukemia; virus protease:purification,chemical analysis and in vitro processing of gag precursor polyproteins.//J. Virol.-1986.-v.57,N03.-p. 826-832.
308. Yoshiikawa T., Yoshikawa,H., Koyama H., Tsubaki ,S.Prelimi- , nary attempts to eradicate infection with bovine leukemia virus from a stock farm in Japan.//Jpn. J. Yet.Sci.-1982.-V.44.- p.831-834.
309. Zandomeni R.O., Carrera-Zandomeni,M., Esteban E.et al. Induction and inhibition of bovine leukaemia virus expression in naturally infected cells.// J.Gen.Virol .-1992.-v.73.-pp.1915-1924.
310. Zavada J., Cerny L., Zavadova Z.et al.A rapid neutralization test for antibodies to bovine leukemia virus with use of rhabdovirus pseudotipes.//J.Natl.Cancer. Inst.-1979.-v.62.-p.95-101.
-
Иванова, Людмила Александровна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2000
-
ВАК 03.00.23
- Эпизоотология и меры борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Республике Дагестан
- Анализ современных методов диагностики и ветеринарно-санитарная экспертиза мяса при лейкозе крупного рогатого скота
- Эпизоотология, иммунобиологический статус коров-матерей и телят, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота
- Цитологические, генетические и протеомные изменения в крови крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза
- Молекулярная генодиагностика лейкоза крупного рогатого скота
