Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Цитологические, генетические и протеомные изменения в крови крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Цитологические, генетические и протеомные изменения в крови крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза"

На правах рукописи

Трофимов Олег Владимирович

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ, ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ПРОТЕОМНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ИНФИЦИРОВАННОГО ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п - ОН ¿'ЛЗ

Новосибирск - 2013

005061279

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменский государственный университет».

доктор биологических наук, профессор, Пак Ирина Владимировна

Храмцов Виктор Викторович,

доктор ветеринарных наук, профессор, ГНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» Россельхозакаде-мии, заведующий лабораторией;

Батенёва Наталья Владимировна,

кандидат биологических наук, ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет», доцент кафедры

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии (ВИЭВ)

Защита состоится « 02 » июля 2013 г. в 12-00 на заседании диссертационного совета Д 006.045.01 при ГНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ а/я 8; тел./факс (383)348-44-62, E-mail: dis.ievsidv@list.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии

Автореферат разослан «А5~ » мая 2013 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. ветеринар, наук

Г.М. Стеблева

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лейкозы - гетерогенная группа злокачественных заболеваний крови. Точные молекулярные механизмы возникновения и развития лейкозов до сих пор не установлены.

В Российской Федерации лейкоз крупного рогатого скота распространен повсеместно (М.И. Гулюкин и др., 2005). Высокий уровень заболеваемости отмечается в целом ряде регионов (В.А. Апалькин, 2005; Г.А. Симонян, 2005; О.В. Морозова, 2008; И.М. Донник и др., 2009, 2010; М.А. Амироков и др., 2011; М.П. Семененко и др., 2011; Г.А. Горячева, 2012). Ежегодно увеличивается количество неблагополучных пунктов, растет число выявленных инфицированных BJIKPC и больных лейкозом животных.

Первые случаи лейкоза крупного рогатого скота в нашей стране были официально зарегистрированы в 1965 году. Многочисленные попытки справиться с распространением заболевания в большинстве случаев оказались безуспешными (М.И. Гулюкин и др., 2005). Это связано с целым рядом причин: широким распространением инфекции в сельскохозяйственных предприятиях и личных подсобных хозяйствах граждан, отсутствием средств терапии и профилактики и т.д. Добиться успехов в решении этой проблемы можно лишь благодаря разработке системы, включающей меры по ограничению, профилактике, диагностике заболевания и лечению животных. Такая система может быть создана только на основе знания механизмов возникновения и развития лейкоза. В последние годы учеными достигнуты значительные успехи в изучении возбудителя болезни - вируса лейкоза крупного рогатого скота (BJIKPC), а также расшифровке патогенетических особенностей проявления инфекции (N. Gillet et al., 2007). Однако, молекулярные механизмы развития заболевания исследованы недостаточно. Это делает особенно актуальной задачу по изучению генетических и эпигенетических изменений, происходящих в организме животных, больных лейкозом.

Цель и задачи исследования. Цель исследования — изучение цитологических, генетических и протеомных изменений в крови, происходящих при лейкозе крупного рогатого скота.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать гистологические изменения в крови инфицированных животных.

2. Провести анализ цитогенетических нарушений в лимфоцитах инфицированных животных.

3. Изучить изменения белкового состава сыворотки крови инфицированных животных.

4. Разработать методические подходы к обнаружению в крови животных провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота на основе рестрик-ционного анализа.

Научная новизна. Впервые описан ряд цитогенетических и протеомных изменений, происходящих в крови при лейкозе крупного рогатого скота. Продемонстрировано, что частота встречаемости микроядер в лимфоцитах инфицированных животных в 18 раз выше, чем у интактных животных. Показано,

что ВЛКРС-инфекция сопровождается повышением концентрации отдельных белков сыворотки крови: кластерина, транстиретина, ретинол-связывающего белка. Предложены новые методические подходы к молекулярной диагностике лейкоза крупного рогатого скота на основе рестрикционного анализа провирус-ной ДНК.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в выявлении отдельных цитологических, генетических и протеомных изменений в крови крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза, которые могут быть использованы для уточнения механизмов развития заболевания.

Полученные результаты могут быть использованы в области молекулярной диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Результаты проведенных исследований внедрены в учебный процесс на кафедре экологии и генетики Тюменского государственного университета и используются при чтении лекций по дисциплинам «Молекулярная генетика», «Общая цитогенетика» и при проведении большого специализированного практикума «Методы молекулярной генетики».

По результатам исследований опубликовано учебно-методическое пособие «Методы молекулярной генетики», утвержденное на заседании учебно-методической комиссии Департамента биологии Тюменского государственного университета (протокол № 17 от 06.12.2010).

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и получили положительную оценку на Всероссийской научной конференции «Интеллект-2008» (г. Красноярск, 2008 г.); Всероссийской научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (г. Томск, 2010 г.); Международной научной конференции «Студент и научно-технический прогресс» (г. Новосибирск, 2011 г.); Всероссийской научной школе «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» (г. Казань, 2012 г.); межкафедральных семинарах в Тюменском госуниверситете (2008-2013 гг.).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Ветеринария», «Современные проблемы науки и образования»).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка сокращений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 20 рисунков. Список цитируемой литературы включает 380 источников, в том числе 312 на иностранном языке.

Положения, выносимые на защиту: 1. В крови животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, повышается частота встречаемости бластных клеток, аномальных форм лимфоцитов, а также лимфоцитов, содержащих микроядра.

2. В сыворотке крови животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, происходят изменения белкового состава, повышается содержание кластерина, транстиретина, ретинол-связывающего белка.

3. Рестрикционный анализ ДНК без предварительной ее амплификации может применяться в качестве метода молекулярно-генетической диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю д.б.н., проф. И.В. Пак за ценные советы и помощь при подготовке диссертации. Отдельную благодарность автор выражает ректору Уральской государственной сельскохозяйственной академии (УрГСХА), д.б.н., проф., акад. РАСХН И.М. Донник за научное консультирование, помощь при выполнении работы и опубликовании результатов исследований. Автор признателен своим учителям и первым научным руководителям д.в.н., проф. [Г.С. Сивкову|, д.б.н., проф. [P.M. Цою|. Автор благодарит д.б.н., чл.-кор. РАН А.Б. Четверина и сотрудников лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН за помощь в освоении молекулярно-биологических методов исследования.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2008 по 2012 гг. на кафедре экологии и генетики и в Центре биотехнологии и генодиагностики Тюменского государственного университета. Сбор материала для исследований осуществляли в 20082010 гг. совместно с сотрудниками Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной энтомологии и арахнологии Россельхозакадемии. В хозяйствах, расположенных на юге Тюменской области, собирали цельную кровь и сыворотку от животных (крупный рогатый скот), показавших РИД-положительную реакцию на лейкоз. Пробы были собраны от 160 коров. В качестве контроля использовали цельную кровь и сыворотку от 55 животных, показавших РИД-отрицательную реакцию на лейкоз. Все особи принадлежали к черно-пестрой породе, были примерно одного возраста (от 1 года до 1,5 лет) и одного пола (самки).

Мазки крови животных готовили по стандартной методике (Г.И. Роскин, 1951). Выявление активности миелопероксидазы проводили по методу Ваш-бурна, модифицированному Лилли (Р. Лилли, 1969). Препараты рассматривали с использованием микроскопа «Axiostar» (фирмы «Zeiss») с добавлением иммерсионного масла при увеличении в 1000 раз. Фотографирование производили фотоаппаратом «Power Shot А640» (фирмы «Canon»).

Определение общей концентрации белка в образцах сыворотки крови проводили по методу Бредфорда (М.М. Bradford, 1976) с использованием спектрофотометра «SmartSpec Plus» (фирмы «Bio-Rad»), Для анализа протеомных изменений в сыворотке крови крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза, применяли метод ДСН-электрофореза по Лэммли (U.K. Laemmli, 1970) и метод двумерного электрофореза белков (Р.Н. O'Farrells, 1975) с использованием системы «Protean IEF Cell», камер «Mini-Protean Tetra Cell» и

«Protean II XL 2-D» (фирмы «Bio-Rad»). Для визуализации белковых молекул в геле их окрашивали серебром (B.R. Oakley et al., 1980).

Для получения аналитических количеств ДНК из цельной крови применяли модифицированный метод выделения ДНК с использованием мягкого детергента Triton Х-100 (J. Albert and Е.М. Fenyo, 1990). Для очистки раствора нуклеиновых кислот от белков проводили фенольную депротеинизацию с последующим спиртовым осаждением (J. Sambrook et al., 1989). ДНК, выделенную из крови, обрабатывали эндонуклеазами рестрикции EcoRI и Pstl (фирмы «Fermentas»), Количество и длину образовавшихся фрагментов ДНК (продуктов гидролиза) оценивали посредством электрофореза в 0,8% агарозном геле (G.S. Hayward and M.G. Smith, 1972) в камере «SE-1» (фирмы «Helicon»). После проведения электрофореза молекулы ДНК в геле окрашивали бромистым этидием.

Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам (Г.Ф. Лакин, 1990), а также с использованием статистического пакета прикладных программ «Microsoft Excel», «Statistica». Анализ расположения сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции и расчет длины фрагментов ДНК проводили с помощью программы «Vector NTI» (фирмы «Invitrogen»). Для сравнительного анализа про-теомных карт использовали программу «PDQuest» (фирмы «Bio-Rad»).

2.2 Результаты исследований и обсуждение 2.2.1 Гистологические и цитогенетические изменения в периферической крови животных, инфицированных вирусом лейкоза КРС

К настоящему времени достаточно полно изучены и подробно описаны изменения, возникающие в системе кроветворения при лейкозе (В.П. Шишков, 1977; З.А. Бутенко, 1978; Е.Б. Владимирская, 1984; Л.Г. Бурба и др., 1988; Л.А. Песоцкая и др., 1991; П.Н.Смирнов и др., 1992; В.А. Крикун, 2002; Ю.П. Смирнов, 2002; С.Н. Магер, 2005; В.И. Околелов и др., 2005). Отмечено, что лейкоз характеризуется глубокими поражениями кроветворной ткани с появлением в крови и увеличением количества в кроветворных органах недифференцированных клеток (Г.А. Симонян и Ф.Ф. Хисамутдинов, 1995).

Для получения более полной картины процессов, происходящих в организме больных лейкозом животных на уровне гемопоэтических и лимфоидных клеток, был проведен гистологический анализ мазков крови инфицированных ВЛКРС (РИД-положительных) и контрольных (РИД-отрицательных) животных. В задачу исследований не входил подсчет числа форменных элементов крови у больных и здоровых особей. В настоящей работе основное внимание было уделено изменениям в структуре клеток и перестройкам генетического материала, которые, с нашей точки зрения, изучены недостаточно полно.

Гистологический анализ мазков крови от 160 коров, показавших РИД-положительную реакцию на лейкоз, выявил наличие во всех образцах скоплений бластных клеток (рис. 1). У данных животных отмечали различную частоту встречаемости бластных клеток (от 10% до 84% от общего числа просмотренных клеток) (рис. 2). Очевидно, это связано со степенью развития заболевания. Следует отметить, что скопления бластных клеток в мазках крови встречались

и у контрольных животных, но реже (у 3,6% особей) и с меньшей частотой (519% от общего числа просмотренных клеток) (рис. 2).

'М

Рисунок 1 - Скопление бластных клеток на препарате крови животного, инфицированного ВЛКРС. Увеличение в 1000 раз

□ РИД-положительные □ РИД-отрицательные

Частота встречаемости бластных клеток, %

Рисунок 2 - Средняя частота бластных клеток в мазках крови животных, инфицированных ВЛКРС

В крови РИД-положительных животных были отмечены аномальные формы лимфоцитов, морфологически отличные от нормы (рис. ЗГ): тени Боткина-Гумпрехта (рис. ЗА), Ридеровские формы (клетки Ридера; рис. ЗБ), а также лимфоциты с рыхлой структурой хроматина (рис. ЗВ), которые отсутствовали у контрольных животных или встречались в этой группе с невысокой частотой (табл. 1).

Рисунок 3 - Лимфоциты в мазках крови крупного рогатого скота. Увеличение в 1 ООО раз. А - тени Боткина-Гумпрехта; Б - Ридеровские формы; В - лимфоциты с рыхлой структурой хроматина; Г - нормальный лимфоцит

Таблица 1 - Частота встречаемости аномальных форм лимфоцитов _в периферической крови животных, %_

Тип клеток Группа животных

РИД-положительные | РИД-отрицательные

число клеток

шт. х ± т, % ШТ. х ± т, %

Лимфоциты с рыхлой структурой хроматина 1519 18,26 ±0,42* 0 0

Тени Боткина-Гумпрехта 1610 19,35 ±0,43* 0 0

Ридеровские формы 375 4,51 ±0,23* 37 1,06 ±0,17

Всего аномальных лимфоцитов 3504 42,12 ±0,54* 37 1,06 ±0,17

Нормальные лимфоциты 4816 57,88 ±0,54* 3458 98,94 ±0,17

Число просмотренных клеток 8320 100 3495 100

Всего животных, экз. 160 55

Примечание: * - различия между группами достоверны при а < 0,001

Общая частота встречаемости лимфоцитарных аномалий составила у инфицированных животных 42,12%. У особей контрольной группы к аномальным относилось чуть более 1% лимфоцитов, причем лимфоцитов с рыхлой структу-

рой хроматина, а также теней Боткина-Гумпрехта обнаружено не было. Исследуемые группы достоверно различались как по общей частоте встречаемости аномальных лимфоцитов, так и по частотам встречаемости каждой из форм аномалий.

Особое внимание в наших исследованиях было уделено изменениям ядерного материала лимфоцитов. В последние годы достаточно широкое применение получил микроядерный тест, как метод оценки состояния генетического аппарата клетки в условиях действия факторов различной природы (радиации, химических загрязнителей, вирусов и др.) (H.H. Ильинских и др., 1998; C.B. Баранов и Т.В. Кузнецова, 2007).

В лимфоцитах периферической крови РИД-положительных животных наблюдали появление микроядер двух типов. Микроядра I типа (рис. 4А) представлены в форме дополнительного ядра, меньшего по размеру, чем основное. Микроядра II типа (рис. 4Б) представлены мелкими образованиями, число которых может достигать пяти и более на одну клетку. Данные о частоте встречаемости таких нарушений приведены в таблице 2.

.А

Рисунок 4 - Микроядра в лимфоцитах животных, показавших РИД-положительную реакцию на лейкоз. Увеличение в 1000 раз. А - микроядра I типа; Б - микроядра II типа

Таблица 2 - Частота встречаемости микроядер в лимфоцитах периферической _крови животных, %_

Тип клеток Группа животных

РИД-положительиые | РИД-отрицательные

число клеток

шт. х ± m, % шт. х ± m, %

Лимфоциты с микроядрами 1 типа 196 2,36 ±0,17* 0 0

Лимфоциты с микроядрами II типа 493 5,92 ± 0,26* 16 0,46 ±0,11

Всего лимфоцитов с микроядрами 689 8,28 ± 0,30* 16 0,46 ±0,11

Нормальные лимфоциты 7631 91,72 ±0,30* 3479 99,54 ±0,11

Число просмотренных клеток 8320 100 3495 100

Всего животных, экз. 160 55

Примечание: * - различия между группами достоверны при а < 0,001

У РИД-положительных животных суммарная частота встречаемости лимфоцитов с микроядрами составила 8,28%, причем наибольшая их доля приходилась на микроядра II типа (5,92%). В то же время у животных контрольной группы общая доля лимфоцитов, содержащих микроядра, составила 0,46%, а клеток с микроядрами I типа выявлено не было. Исследуемые группы животных достоверно различались по частоте встречаемости лимфоцитов, содержащих микроядра каждого из двух типов, а также по общей частоте встречаемости лимфоцитов с микроядрами.

В ранее проведенных исследованиях (M.W. Schnurr et al., 1994) отмечалось, что в клетках при лейкозе крупного рогатого скота могут накапливаться хромосомные и геномные нарушения различной этиологии: приобретение дополнительных малых хромосом, трисомия, Робертсоновские перестройки и др. Формирование микроядер в лимфоцитах животных, инфицированных BJIKPC, по-видимому, является следствием подобных изменений и свидетельствует о нарушении стабильности генетического аппарата клеток больных животных.

2.2.2 Изменения белкового состава сыворотки крови животных, инфицированных вирусом лейкоза КРС

С целью получения сведений об изменениях, происходящих при лейкозе КРС, на уровне белков сыворотки крови был проведен электрофоретический анализ. Методом ДСН-электрофореза проанализировали 160 проб сыворотки крови от РИД-положительных коров и 55 проб от РИД-отрицательных коров. В сыворотке крови крупного рогатого скота обнаруживали от 12 до 18 отдельных мажорных белковых фракций, обладающих различной электрофоретической подвижностью. Стабильно выявляли следующие группы белков: альбумины, а-глобулины, Y-G-глобулины, у-А-глобулины, гаптоглобины, трансферрины, белки S-фракции (табл. 3).

Таблица 3 - Характеристика мажорных белковых фракций, выявляемых

в сыворотке крови крупного рогатого скота

Группа белков Число фракций Относительная электрофоретическая подвижность

Альбумины 1 1,00

а-глобулины 2 0,87-0,92

Y-G-глобулины 1 0,82

у-А-глобулины 2 0,77-0,70

Гаптоглобины 2 0,65-0,60

Трансферрины 3 0,55-0,50

S-фракция 7 0,25-0,38

В образцах сыворотки крови контрольных животных обнаруживали от 15 до 18 белковых фракций, соответствующих вышеперечисленным группам. У РИД-положительных животных выявляли меньшее количество фракций — от 12 до 15 (рис. 5). Таким образом, все исследованные особи распределились на 7 фенотипических классов: с 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 белковыми фракциями.

1 2 М

ш т

#

Рисунок 5 - Мажорные белковые фракции сыворотки крови коров.

1,2 — препараты сыворотки крови. М - маркер молекулярной массы.

Электрофорез в 12% полиакриламидном геле. Окрашено серебром

Анализ распределения белковых фенотипов (по числу мажорных фракций в сыворотке) выявил значительные различия между двумя группами животных (рис. 6). У подавляющего большинства (85,6%) инфицированных животных отмечены 2 фенотипа: с 12 белковыми фракциями (62,5%) и 13 белковыми фракциями (23,1%). У остальной части РИД-положительных животных (14,4%) выявлено 15 мажорных белковых фракций сыворотки крови. В то же время, у 92,7% контрольных (РИД-отрицательных) животных в сыворотке крови было представлено от 17 до 18 фракций. При электрофоретическом исследовании белков сыворотки крови инфицированных и здоровых животных был выявлен только один фенотипический класс, встречающийся в обеих исследуемых группах. К нему относились животные, у которых обнаруживалось 15 мажорных белковых фракций. Следует отметить, что частота этого фенотипа в группе здоровых животных была в 1,97 раза ниже, чем в группе РИД-положительных животных.

Исследование белкового состава сыворотки крови животных с использованием ДСН-электрофореза позволило получить лишь предварительные результаты, свидетельствующие о различии протеомов сыворотки больных и здоровых животных. Детальному изучению подобных эпигенетических изменений, происходящих в крови инфицированных животных, препятствует невысокая разрешающая способность самого метода. Одномерный электрофорез не позволяет диагностировать изменения, происходящие на уровне минорных белков, представленных в низких концентрациях. Между тем большинство регулятор-ных и сигнальных белков в сыворотке крови, содержание которых могло суще-

ственно измениться вследствие вирусной инфекции, относится именно к категории минорных. Поэтому в дальнейших исследованиях использовали метод двумерного электрофореза с целью более детального изучения протеомных изменений в крови инфицированных животных, а также поиска возможных маркеров лейкоза КРС в области минорных белковых фракций.

Рисунок 6 - Встречаемость особей с определенным количеством мажорных белковых фракций, выявляемых в сыворотке крови

Для двумерного электрофореза отбирали по 1 мкл сыворотки крови от каждого из животных. Была получена серия электрофореграмм для обеих исследуемых групп крупного рогатого скота. Пример электрофореграммы белков сыворотки крови РИД-отрицательных (контрольных) животных представлен на рисунке 7, аналогичная электрофореграма для РИД-положительных животных - на рисунке 8.

Электрофоретический анализ показал, что в сыворотке крови животных, инфицированных ВЛКРС, достоверно выявляются четыре белковых спота, отсутствующих в контроле. Сопоставление полученных данных с известными протеомными картами (R. Wait et al., 2002) сыворотки крови крупного рогатого скота (Bos taurus) черно-пестрой породы позволило идентифицировать белки, представленные этими слотами. Было выяснено, что один спот (рис. 8/1) соответствует кластерину, один спот (рис. 8/2) - ретинол-связывающему белку сыворотки крови, и два спота (рис. 8/3, 8/4) - изоформам транстиретина. Данные об этих белках представлены в таблице 4.

Рисунок 7 - Белки сыворотки крови животных, показавших РИД-отрицательную реакцию на лейкоз, фракционированные методом двумерного электрофореза. Градиент рН при изоэлектрофокусировании: от 3 10 (линейный). ДСН-электрофорез в 12% ПААГ. Окрашено серебром

Рисунок 8 - Белки сыворотки крови животных, показавших РИД-положительную реакцию на лейкоз, фракционированные методом двумерного электрофореза. Градиент рН при изоэлектрофокусировании: от 3 до 10 (линейный). ДСН-электрофорез в 12% ПААГ. Окрашено серебром. Стрелками указаны споты, не выявленные у животных контрольной группы

Таблица 4 - Белки сыворотки крови РИД-положительных животных, _не выявленные у животных контрольной группы_

Название белка Идентификационный номер в базе данных UniprotKB (http://www.uniprot.org/uniprot/) Номера слотов на рисунке 8

Кластерин PI7697 1

Ретинол-связывающий белок PI 8902 2

Транстиретин 046375 3,4

Известно, что данные белки выполняют важную роль во многих биологических процессах: участвуют в пролиферации клеток и дифференцировке тканей, регуляции клеточного цикла, апоптозе, репарации ДНК, межклеточных взаимодействиях, транспорте липидов, гормонов и витаминов, регуляции иммунных процессов (I.P. Trougakos and E.S. Gonos, 2002; I.P. Trougakos et al.,

2004; S. Pucci et al., 2004; B. Shannan et al., 2006; S.J. Richardson, 2007; F. Rizzi and S. Bettuzzi, 2008, 2010). Увеличение их концентрации может быть связано с процессом канцерогенеза, а также с повышением напряженности иммунной системы.

2.2.3 Обнаружение провирусной ДНК вируса лейкоза КРС в крови методом рестрикционного анализа

Для выявления провирусной ДНК BJIKPC в крови животных использовали метод рестрикционного анализа. Из образцов цельной крови, полученных от инфицированных BJIKPC (РИД-положительных), а также контрольных (РИД-отрицательных) коров, выделяли суммарную ДНК. Полученную ДНК обрабатывали рестриктазами EcoRI и Pstl. Анализ фрагментов, образующихся в результате гидролиза ДНК, проводили при помощи электрофореза в 0,8% агароз-ном геле.

Для анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и интерпретации полученных результатов использовали базу данных GenBank. Эта база данных содержит достаточно большое количество записей нуклеотидных последовательностей отдельных генов различных штаммов и изолятов BJIKPC. Сведения о таких последовательностях появляются, как правило, в результате секвенирования относительно коротких ПЦР-продуктов (D. Beier et al., 2001) или рестрикционных фрагментов (R.Z. Mamoun et al., 1990), обычно содержащих только один вирусный ген. Однако, результатов полногеномного секвенирования отдельных штаммов BJIKPC встречается сравнительно немного. Так, к концу 2012 года полноразмерные геномы были секвенированы лишь у 7 штаммов (изолятов) данного вируса (табл. 5). К ним, в частности, относятся: один штамм североамериканского происхождения (J.M. Coffin, 1997), один штамм японского происхождения (N. Sagata et al., 1985), два аргентинских штамма (S. Dube et al., 2000, 2009) и три изолята вируса из Уругвая (G. Moratorio et al., 2012).

Таблица 5 - Общие сведения об известных нуклеотидных последовательностях _полноразмерных геномов различных штаммов (изолятов) ВЛКРС*_

№ штамма № записи в GenBank Название штамма (изолята) Происхождение Длина, п.н. Дата записи

1 AF033818 Без названия США 8419 17.02.2004

2 К02120 Без названия Япония 8714 02.12.2006

3 AF257515 Без названия Аргентина 8588 11.12.2000

4 FJ914764 Ага41 Аргентина 8585 28.09.2009

5 НЕ967301 LSI Уругвай 8710 12.12.2012

6 НЕ967302 LS2 Уругвай 8710 12.12.2012

7 НЕ967303 LS3 Уругвай 8710 12.12.2012

* - по базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotideA

С помощью программы «Vector NTI» нами были проанализированы все известные к настоящему времени последовательности кДНК геномной РНК

ВЛКРС, в результате чего были теоретически рассчитаны количество и размеры фрагментов, образующихся в результате расщепления провирусной ДНК различных штаммов вируса, эндонуклеазами рестрикции ЕсоМ и РвИ. Результаты проведенного анализа представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Расчетная длина фрагментов, образующихся в результате эндонуклеазного расщепления провирусной ДНК различных штаммов _ (изолятов) ВЛКРС рестриктазами ЕсоМ и РвИ_

Рестриктаза № Штамм (изолят) вируса

фрагмента 1 2 з 4 5 6 7

Расчетная длина фрагментов, п.н.

ЕсоМ 1 7719 7923 7930 7927 7928 7928 7928

2 700 791 658 658 782 782 782

РэН 1 5242 5336 5206 5204 5327 5327 5327

2 1436 1435 1436 1436 1436 1436 1436

3 1343 1086 1086 1085 1087 1087 1087

4 457 462 462 462 462 462

5 398 400 398 398 398 398 398

Примечание: Номера штаммов (изолятов) вируса взяты из таблицы 5

Электрофоретический анализ фрагментов, полученных в результате расщепления ДНК из крови инфицированных ВЛКРС (РИД-положительных) и контрольных (РИД-отрицательных) животных эндонуклеазами рестрикции, показал следующее. При обработке тотальной ДНК, выделенной из крови инфицированных животных, образуется четыре дополнительных РвИ-фрагмента и два дополнительных ЕсоМ-фрагмента, отсутствующих у контрольных особей (рис. 9). Размеры и количество фрагментов ДНК, полученных экспериментально (рис. 9), соответствуют теоретически рассчитанным (табл. 6). Это свидетельствует о том, что данные фрагменты действительно являются продуктами эндонуклеазного расщепления ДНК-копии геномной РНК ВЛКРС, присутствующей в клетках крови инфицированных животных.

Набор ЕсоМ-фрагментов не позволяет сделать вывод о принадлежности исследуемого вируса к определенному штамму. Это вызвано тем, что прови-русные ДНК всех известных штаммов ВЛКРС при расщеплении рестриктазой ЕсоМ дают сходные по длине (и электрофоретической подвижности) продукты (табл. 6). Однако, набор Рей-фрагментов указывает на то, что исходный вирусный генотип, очевидно, принадлежит к североамериканскому типу или близкородственному ему штамму, так как все остальные известные изоляты ВЛКРС образуют не четыре, а пять Рей-фрагментов. Расщепление провирусной ДНК североамериканского штамма вируса не приводит к образованию фрагмента №4 длиной 457/462 п.н. (табл. 6). Данный фрагмент не был выявлен и экспериментально (рис. 9).

_Ей!_ _ЕсоЮ

РИД + РИД - РИД + РИД-

1 2 3 4 5 6 М 7 8 9 10 11 12

тт «м »ж» - •• '' ■■ фщ »» -

Рисунок 9 - Препараты ДНК после обработки эндонуклеазами рестрикции Рей и ЕсоШ. 1-12 - препараты ДНК из крови. М - маркер молекулярной массы

(АУНтсНП). Электрофорез в 0,8% агарозном геле. Окрашено бромистым этидием. Числами обозначены длины фрагментов ДНК в парах нуклеотидов

Результаты исследований, проведенных ранее И.М. Донник и М.В. Петропавловским на основе ПЦР-ПДРФ-анализа полиморфизма гена еиу (И.М. Донник и М.В. Петропавловский, 2010), продемонстрировали принадлежность большинства изолятов ВЛКРС в Тюменской области к австралийской подгруппе вирусов. К сожалению, в литературе отсутствуют данные о секвенировании полноразмерного генома ВЛКРС австралийской подгруппы. Известна лишь последовательность 5'-концевого фрагмента генома австралийского изолята А1 вируса лейкоза КРС (I. Сои^оп е1 а1., 1990). Это делает затруднительным сравнение геномов североамериканского штамма ВЛКРС и штаммов австралийской подгруппы. По-видимому, североамериканский изолят может быть генетически близок вирусам австралийской подгруппы. Однако, для уточнения этой информации требуются дополнительные исследования.

Необходимо отметить, что вышеописанный подход, в значительной степени универсален. Во-первых, с помощью этого метода можно выявлять различные штаммы вируса (с последующей их дифференцировкой). Во-вторых, его применение, на наш взгляд, не ограничивается использованием строго определенных рестриктаз (РвИ и ЕсоШ). Существенным преимуществом данного подхода является его сравнительно невысокая стоимость. Проведение рестрик-ционного анализа не требует наличия амплификатора, достаточно лишь твердо-

тельного термостата, поскольку реакция является изотермической. В целом, метод рестрикционного анализа может успешно применяться для молекулярной диагностики лейкоза КРС и выступать в качестве одной из эффективных и недорогих альтернатив другим диагностическим подходам.

3 ВЫВОДЫ

1. Выявлены значительные изменения в крови животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, затрагивающие морфологические и генетические особенности клеток, белковый состав сыворотки крови.

2. В крови всех животных, показавших РИД-положительную реакцию на лейкоз, выявлены скопления бластных клеток, встречающихся с различной частотой: от 10 до 84%. Аналогичные скопления бластных клеток, встречающихся с частотой от 5 до 19%, наблюдали у 3,6% животных, показавших РИД-отрицательную реакцию на лейкоз.

3. В крови животных, показавших РИД-положительную реакцию на лейкоз, отмечается наличие различных форм аномальных лимфоцитов: теней Боткина-Гумпрехта, клеток Ридера, а также лимфоцитов с рыхлой структурой хроматина.

4. У животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, в сравнении с контролем, в 18 раз увеличена частота встречаемости лимфоцитов, содержащих микроядра.

5. В сыворотке крови животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, обнаруживается от 12 до 15 мажорных белковых фракций; у животных контрольной группы - от 15 до 18 мажорных белковых фракций.

6. У животных, показавших РИД-положительную реакцию на лейкоз, установлено повышенное содержание в сыворотке крови кластерина, транстиретина, ретинол-связывающего белка.

7. Рестрикционный анализ ДНК без предварительной ее амплификации с использованием эндонуклеаз рестрикции ЕсоМ и Рей возможно применять для обнаружения в крови ДНК-копий генома ВЛКРС.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны новые методические подходы к молекулярной диагностике лейкоза крупного рогатого скота на основе рестрикционного анализа провирус-ной ДНК, без предварительной ее амплификации.

По результатам исследований подготовлено учебно-методическое пособие «Методы молекулярной генетики», утвержденное на заседании учебно-методической комиссии Департамента биологии Тюменского государственного университета (протокол №17 от 06.12.2010).

Результаты исследований используются в учебном процессе на кафедре экологии и генетики Тюменского государственного университета при чтении лекций по дисциплинам «Молекулярная генетика», «Общая цитогенетика» и при проведении большого специализированного практикума «Методы молекулярной генетики».

5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Донник, И.М. Цитогенетические и протеомные подходы к поиску маркеров лейкоза крупного рогатого скота / И.М. Донник, А.Т. Татарчук, Ю.Ф. Водиченков, О.В. Трофимов, И.В. Пак, ¡Г.С. Сивков], C.B. Деркач // Ветеринария. - 2012. - № 2. - С. 26-29.

2. Трофимов, О.В. Продукты эндонуклеазного расщепления ДНК как молекулярные маркеры лейкоза крупного рогатого скота / О.В. Трофимов // Современные проблемы науки и образования. — 2012. - № 1; URL: http://www.science-education.ru/101-5427.

3. Трофимов, О.В. Возможности протеомного анализа в выявлении молекулярных маркеров для диагностики рака / О.В. Трофимов, И.В. Пак // Интеллект - 2008: Сб. материалов Всерос. науч. конф. Часть II. - Красноярск, 2008. - С. 394-396.

4. Трофимов, О.В. Некоторые цитогенетические и протеомные изменения в крови при лейкозе крупного рогатого скота / О.В. Трофимов, В.М. Екимова, Е.А. Читаева, И.В. Пак, [Г.С. Сивков! И Тр. Томского государственного университета. - 2010. - Т. 275. - С. 233-237.

5. Трофимов, О.В. Эпигенетические изменения в крови при лейкозе крупного рогатого скота / О.В. Трофимов, В.М. Екимова, Е.А. Читаева, И.В. Пак, [Г.С. Сивков| // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии: материалы Всероссийской молодежной науч. конф. - Томск, 2010. -С. 106-107.

6. Трофимов, О.В. Рестрикционный анализ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / О.В. Трофимов // Студент и научно-технический прогресс: материалы XLVIII Международ, науч. конф. - Новосибирск, 2011. - С. 209.

7. Трофимов, О.В. Новые генетические и белковые маркеры лейкоза крупного рогатого скота / О.В. Трофимов, И.В. Пак // Биоматериалы и нанобиомате-риалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности: тез. докл. Всероссийской молодежной научной школы. - Казань, 2012. - С. 29.

Подписано в печать 23.05.2013 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать Riso. Усл. печ. л. 0,93. Тираж 100 экз. Заказ 120.

Отпечатано с готового набора в типографии ООО «Вектор Бук».

625004, г. Тюмень, ул. Володарского, 45. Тел. (3452) 46-54-04,46-90-03.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Трофимов, Олег Владимирович, Тюмень

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Трофимов Олег Владимирович

ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ, ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ПРОТЕОМНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ИНФИЦИРОВАННОГО

ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., проф. И.В. Пак

Тюмень - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................4

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................10

1.1 Общая характеристика лейкоза крупного рогатого скота.......................10

1.2 Распространение заболевания.....................................................................12

1.3 Меры борьбы с заболеванием.....................................................................14

1.4 Вирус лейкоза крупного рогатого скота....................................................15

1.4.1 Строение вириона..................................................................................16

1.4.2 Структурная и функциональная организация генома........................17

1.4.3 Основные гены и продукты экспрессии генов, их роль в процессе трансформации клетки...................................................................................21

1.5 Особенности взаимодействия ВЛКРС с клеткой......................................27

1.6 Механизмы передачи инфекции.................................................................29

1.7 Гуморальный и цитотоксический иммунные ответы, сопровождающие ВЖРС-инфекцию..............................................................................................30

1.8 Механизмы вирусной индукции канцерогенеза.......................................31

1.9 Патоморфологические изменения при лейкозе крупного рогатого скота.....................................................................................................................34

1.10 Диагностика лейкоза крупного рогатого скота.......................................36

1.10.1 Гистологические методы диагностики..............................................37

1.10.2 Серологические методы диагностики...............................................38

1.10.3 Молекулярно-генетические методы диагностики............................41

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............................................46

2.1 Материал исследований..............................................................................46

2.2 Гистологический анализ мазков крови......................................................47

2.3 Электрофоретический анализ белков сыворотки крови..........................48

2.4 Рестрикционный анализ ДНК, выделенной из крови...............................51

2.5 Методы обработки данных..........................................................................55

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.................................56

3.1 Гистологические и цитогенетические изменения в периферической крови животных, инфицированных вирусом лейкоза КРС...........................56

3.2 Изменения белкового состава сыворотки крови животных, инфицированных вирусом лейкоза КРС..........................................................70

3.3 Обнаружение провирусной ДНК вируса лейкоза КРС в крови методом рестрикционного анализа..................................................................................82

4 ВЫВОДЫ............................................................................................................94

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ...............................................................95

6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................................96

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................98

ПРИЛОЖЕНИЯ...................................................................................................144

ВВЕДЕНИЕ

Лейкозы - гетерогенная группа злокачественных заболеваний крови. Точные молекулярные механизмы возникновения и развития лейкозов до сих пор не установлены. В злокачественных клетках с высокой частотой выявляются мутантные гены, в норме ответственные за пролиферацию и дифференцировку кроветворных клеток-предшественников (Д. Баскаран и др., 2010). В настоящее время во многих лабораториях мира ведутся работы, направленные на изучение свойств «лейкозных онкогенов» и их вклада в развитие лейкозов у человека и животных.

В настоящее время лейкоз КРС является причиной основных экономических потерь при разведении крупного рогатого скота (М.С. Wu et al., 1989; J. Brenner et al., 1990; R.M. Jacobs et al., 1991; F.L. Pollari et al., 1992; Y. Da et al., 1993; K.G. Trono et al., 2001; D.D. Motton and G.C. Buehring, 2003; S.L. Ott et al., 2003; J.K. Rhodes et al., 2003). Экономический ущерб от лейкоза достигает значительных размеров и складывается из недополучения молока, приплода, ограничений в реализации молока и племенного молодняка, преждевременной выбраковки коров и быков-производителей, утилизации туш, расходов на проведение оздоровительных мероприятий (Г.А. Гаврилова, 2003).

Лейкоз крупного рогатого скота встречается на всех континентах. Болезнь распространена в целом ряде стран Восточной Европы: Болгарии, Хорватии, Эстонии, Латвии, Польше, Румынии, Украине. Высокий уровень заболеваемости отмечается в Северной и Южной Америке (R.M. Jacobs et al., 1995; J.L. D'Angelino et al., 1998; K.G. Trono et al., 2001; J.A. Van Leeuwen et al., 2005; 2006; G. Rama et al., 2011). Напряженная эпидемиологическая ситуация наблюдается также и в некоторых азиатских странах (S. Meas et al., 2000; G.H. Suh et al., 2005; Z. Trainin and J. Brenner, 2005; K. Murakami et al., 2011).

В Российской Федерации лейкоз крупного рогатого скота распространен повсеместно (М.И. Гулюкин и др., 2005). Высокий уровень

заболеваемости отмечается в целом ряде регионов (В.А. Апалькин, 2005; Г.А. Симонян, 2005; О.В. Морозова, 2008; И.М. Донник и др., 2009, 2010; М.А. Амироков и др., 2011; М.П. Семененко и др., 2011; Г.А. Горячева, 2012). Ежегодно увеличивается количество неблагополучных пунктов, растет число выявленных инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом животных.

Первые случаи лейкоза крупного рогатого скота в нашей стране были официально зарегистрированы в 1965 году. Многочисленные попытки справиться с распространением заболевания в большинстве случаев оказались безуспешными (М.И. Гулюкин и др., 2005). Это связано с целым рядом причин: широким распространением инфекции в сельскохозяйственных предприятиях и личных подсобных хозяйствах граждан, отсутствием средств терапии и профилактики и т.д. Добиться успехов в решении этой проблемы можно лишь благодаря разработке системы, включающей меры по ограничению, профилактике, диагностике заболевания и лечению животных. Такая система может быть создана только на основе знания механизмов возникновения и развития лейкоза. В последние годы учеными достигнуты значительные успехи в изучении возбудителя болезни - вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), а также расшифровке патогенетических особенностей проявления инфекции (N. Gillet et al., 2007). Однако, молекулярные механизмы развития заболевания исследованы недостаточно. Это делает особенно актуальной задачу по изучению генетических и эпигенетических изменений, происходящих в организме животных, больных лейкозом.

Важнейшей составляющей борьбы с лейкозом является разработка эффективных методов своевременной диагностики данного заболевания. В настоящее время для выявления лейкоза крупного рогатого скота используют серологические, молекулярно-генетические, гистологические, клинический, патоморфологический и некоторые другие методы. Наиболее широко и успешно применяются серологические и молекулярно-генетические методы

диагностики: реакция иммунодиффузии (РИД), иммуноферментный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Реакция иммунодиффузии проста в исполнении и широко внедрена в ветеринарную практику. Основным ее недостатком является невысокая чувствительность (П.Н. Смирнов, 2007), что нередко приводит к получению ложноотрицательных результатов. Метод иммуноферментного анализа характеризуется более высокой чувствительностью по сравнению с РИД (1. \¥а\уге1аел\ас2 е1 а1., 1989), однако, также не может применяться для диагностики лейкоза на ранних стадиях заболевания, когда титр вирусоспецифических антител еще невысок (и. Еуегшапп е1 а1., 1986; Г.А. Гаврилова и др., 2004). Молекулярно-генетические методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота (в частности, ПЦР) превосходят серологические методы в чувствительности и специфичности (В.А. Агольцов и др., 2012). Однако, повсеместному применению полимеразной цепной реакции для ранней диагностики лейкоза крупного рогатого скота препятствует высокая стоимость проведения анализа. Решением этой проблемы может стать разработка новых эффективных молекулярно-генетических методов диагностики, не требующих использования дорогостоящего оборудования, а также нахождение новых молекулярных маркеров данного заболевания.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - изучение цитологических, генетических и протеомных изменений в крови, происходящих при лейкозе крупного рогатого скота.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Выявить в крови инфицированных животных наиболее характерные цитологические изменения, которые могут иметь диагностическое значение.

2. Провести анализ цитогенетических нарушений в лимфоцитах инфицированных животных.

3. Изучить изменения белкового состава сыворотки крови инфицированных животных.

4. Разработать методические подходы к обнаружению в крови животных провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота на основе рестрикционного анализа.

Научная новизна. Впервые описан ряд цитогенетических и протеомных изменений, происходящих в крови при лейкозе крупного рогатого скота. Продемонстрировано, что частота встречаемости микроядер в лимфоцитах инфицированных животных в 18 раз выше, чем у интактных животных. Показано, что ВЛКРС-инфекция сопровождается повышением концентрации отдельных белков сыворотки крови: кластерина, транстиретина, ретинол-связывающего белка. Предложены новые методические подходы к молекулярной диагностике лейкоза крупного рогатого скота на основе рестрикционного анализа провирусной ДНК.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в выявлении отдельных цитологических, генетических и протеомных изменений в крови крупного рогатого скота, инфицированного вирусом лейкоза, которые могут быть использованы для уточнения механизмов развития заболевания.

Полученные результаты могут быть использованы в области молекулярной диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Результаты проведенных исследований внедрены в учебный процесс на кафедре экологии и генетики Тюменского государственного университета и используются при чтении лекций по дисциплинам «Молекулярная генетика», «Общая цитогенетика» и при проведении большого специализированного практикума «Методы молекулярной генетики» (приложение 1).

По результатам исследований опубликовано учебно-методическое пособие «Методы молекулярной генетики» (приложение 2), утвержденное на заседании учебно-методической комиссии Департамента биологии

Тюменского государственного университета (протокол № 17 от 06.12.2010) (приложение^.).

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и получили положительную оценку на Всероссийской научной конференции «Интеллект-2008» (г. Красноярск, 2008 г.); Всероссийской научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (г. Томск, 2010 г.); Международной научной конференции «Студент и научно-технический прогресс» (г. Новосибирск, 2011 г.); Всероссийской научной школе «Биоматериалы и нанобиоматериалы: Актуальные проблемы и вопросы безопасности» (г. Казань, 2012 г.); межкафедральных семинарах в Тюменском госуниверситете (2008-2013 гг.).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Ветеринария», «Современные проблемы науки и образования»).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка сокращений, списка литературы и приложений. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 20 рисунков. Список цитируемой литературы включает 380 источников, в том числе 312 на иностранном языке.

Положения, выносимые на защиту:

1. В крови животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, повышается частота встречаемости бластных клеток, аномальных форм лимфоцитов, а также лимфоцитов, содержащих микроядра.

2. В сыворотке крови животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, происходят изменения белкового состава, повышается содержание кластерина, транстиретина, ретинол-связывающего белка.

3. Рестрикционный анализ ДНК без предварительной ее амплификации может применяться в качестве метода молекулярно-генетической диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю заведующему кафедрой экологии и генетики Тюменского государственного университета, д.б.н., профессору Ирине Владимировне Пак за ценные советы и всестороннюю помощь при подготовке диссертации. Отдельную благодарность автор выражает ректору Уральской государственной сельскохозяйственной академии (УрГСХА), д.б.н., профессору, академику РАСХН Ирине Михайловне Донник за научное консультирование, помощь при выполнении работы и опубликовании результатов исследований. Автор признателен своим учителям и первым

научным руководителям, д.в.н., профессору [Геннадию Сергеевичу Сивкову,

д.б.н., профессору [Рольфу Максимовичу Цою]. Также благодарит сотрудников кафедры экологии и генетики Тюменского государственного университета за поддержку и советы при выполнении работы. За помощь в сборе материала автор признателен сотрудникам Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной энтомологии и арахнологии (ГНУ ВНИИВЭА) Россельхозакадемии. Автор благодарит д.б.н., члена-корреспондента РАН Александра Борисовича Четверина и сотрудников лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН за помощь в освоении молекулярно-биологических методов исследования.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Общая характеристика лейкоза крупного рогатого скота

Первое сообщение о лейкозе крупного рогатого скота было сделано А. Лейсерингом (А. Leisering, 1871), который еще в 1871 г. описал наличие желтоватых узелковых утолщений в увеличенной селезенке коровы. Действительно, изменения в селезенке, вследствие формирования опухолей, являются одними из самых показательных клинических проявлений лейкоза крупного рогатого скота. Такие опухоли, как правило, являются результатом локального скопления трансформированных B-лимфоцитов. Помимо селезенки, эти клетки могут также проникать в другие ткани: печень, сердце, глаза, кожу, легкие и лимфатические узлы (А. Burny et al., 1987; L. Willems et al.; 1999; S. Meas et al., 2002).

Лейкоз крупного рогатого скота, как правило, развивается поэтапно. В патогенезе лейкоза выделяют четыре основных стадии: инкубационную, начальную (бессимптомную), развернутую (стадию клинико-гематологического проявления болезни) и терминальную (опухолевую) (A.C. Донченко и др., 2003).

Исходя из эпидемиологических различий, можно выделить два типа лейкоза крупного рогатого скота: энзоотический лейкоз КРС (инфекционное заболевание, вызываемое вирусом семейства Retroviridae, классифицируемым как вирус лейкоза крупного рогатого скота - ВЛКРС), а также спорадический лейкоз КРС, который, в отличие от энзоотического, не передается. Точная причина спорадического лейкоза КРС неизвестна. Вирусный (энзоотический) лейкоз КРС может протекать в форме персистентного лимфоцитоза (S.J. Kenyon and С.Е. Piper, 1977; J.F. Ferrer et al., 1978), который характеризуется постоянным и относительно стабильным ростом числа B-лимфоцитов в периферической крови. Стадия персистентного лимфоцитоза считается доброкачественной формой болезни - результатом накопления ^трансформированных лимфоцитов. При этом у большинства инфицированных животных заболевание протекает бессимптомно, а доля

зараженных вирусом клеток периферической крови составляет менее 1%. Несмотря на гематологические изменения, персистентный лимфоцитоз животных формируется при отсутствии других явных клинических признаков заболевания, но может приводить к формированию опухолей и развитию острой фазы болезни (J.F. Ferrer et al., 1978; 1979).

Формирование опухолей является наиболее заметным клиническим проявлением ВЛКРС-инфекции. Лимфомы или лимфосаркомы (J.F. Ferrer, 1980; A. Burny et al., 1988) встречаются менее чем у 5-10% инфицированных животных, преимущественно взрослого возраста: старше 4-5 лет. Лимфосаркомой называют локальную пролиферацию В-лимфоцитов, которая происходит в различных органах и тканях и, нередко, приводит к гибели. Животные с лимфосаркомой почти всегда умирают внезапно, либо через несколько недель или месяцев после появления клинических признаков. Кроме того, трансформированные В-клетки могут вызывать увеличение лимфатических узлов и приводить к лимфоме. Развитию опухолей необязательно предшествует стадия персистентного лимфоцитоза, но эт