Экспериментальное обоснование применения иммунологических методов в оценке предрасположенности к заболеванию крупного рогатого скота лейкозом

Дудоладова, Татьяна Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Экспериментальное обоснование применения иммунологических методов в оценке предрасположенности к заболеванию крупного рогатого скота лейкозом
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальное обоснование применения иммунологических методов в оценке предрасположенности к заболеванию крупного рогатого скота лейкозом"

На правах рукописи

Дудоладова Татьяна Сергеевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ОЦЕНКЕ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ЗАБОЛЕВАНИЮ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ЛЕЙКОЗОМ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 ОЕЗ 2С;2

Новосибирск, 2012

005010575

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственных наук

доктор ветеринарных наук, профессор Бажин Михаил Аристоклевич

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Логинов Сергей Игоревич,

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник Разумовская Валентина Владимировна

ГНУ Уральский научно-исследовательский ветеринарный институт Россель-хозакадемии

Защита состоится «28» февраля 2012г. в «13—» часов на заседании диссертационного совета Д 006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозака-демии по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский район, п. Красно-обск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел/факс (383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в Сибирской научной сельскохозяйственной библиотеке Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « » января 2012 г.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь Ґ

диссертационного совета ^ Г. М. Стеблева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лейкоз крупного рогатого скота широко распространен в Российской Федерации и наносит значительный экономический ущерб животноводству. Падеж и вынужденная выбраковка животных, утилизация туш и органов при убое, нарушение воспроизводительной функции больных коров, а также ограничения, связанные с реализацией продукции в неблагополучных хозяйствах - все это приводит к потерям, которые особенно ощутимы в племенном животноводстве (Л.Г. Бурба с соавт., 1988; Т.П. Кудрявцева, 1990; А.Т. Борзяк, 1990; И.Н. Петров, 1999; П.Н. Смирнов, 1992, 2005; И.М. Донник, 1999; М.И. Гу-люкин, 1985, 2002, 2005; В.В. Разумовская, 2004; С.И. Логинов, 2005; В.В. Храм-цов, М.А. Амироков, 2006 и др.).

Изучение иммунологических особенностей в развитии онкологических заболеваний человека и животных является одним из наиболее развивающихся и результативных направлений в медицине, ветеринарии, общей биологии.

Одной из наиболее конструктивных концепций ветеринарной лейкозологии является, выдвинутая В.П. Шишковым (1977), вирусо-иммуногенетическая концепция (теория).

Объяснить причину случаев отсутствия лейкозного процесса у инфицированных животных невозможно, учитывая только один вирусный фактор. Это можно сделать лишь, исходя из вирусо-иммуногенетической теории. Большая роль в развитии гемобластозов отводится иммунологическому состоянию организма и генетической предрасположенности или устойчивости к лейкозу.

По данным П.Н. Смирнова с соавт. (1992) количественные изменения в содержании Т- и В-лимфоцитов в периферической крови телят при экспериментальном инфицировании ВЛКРС и телят, родившихся от больных хроническим лимфолейкозом коров-онкорнавирусоносителей, достоверно отличаются от таковых у здоровых телят в различные возрастные периоды постнатального развития, и могут быть определены как иммунологический дефект. При этом роль ВЛКРС как иммунодепрессанта безусловна.

Более того, сам ВЛКРС вызывает у молодых животных иммунодефициты клеточного и иммуноглобулинового типов, способствуя активации инфекционного процесса в неблагополучном по лейкозу стаде крупного рогатого скота (В.Н. Сюрип с соавт., 1998).

В неблагополучных по лейкозу хозяйствах с высокой заболеваемостью имеются значительные в процентном отношении группы животных так называемого повышенного риска с иммунодефицитом, который проявляется нарушением соотношения Т- и В-субпопуляций иммунокомпетентных клеток, содержанием лимфоцитов с рецепторным фенотипом, характерным для недифференцирован-

ных клеток, неспособных выполнять иммунологические функции (В.А. Крикун, М.И. Гулюкин, 1999).

Существующие методы исследования позволяют выявить, и то не очень надежно, лишь инфицированных и больных лейкозом животных (В.М. Нахмонсон, Е.А. Дун, 1986; В.В. Храмцов, 1995, 2003; О.А. Верховский, 2002; М.И. Гулюкин, 2005; С.И. Логинов, 2005; А.Н. Шаров, 2006;

Н.Г. Двоеглазов, 2009), а тогда как для эффективных оздоровительных мероприятий необходимо иметь методы выявления животных не только с явной инфекционной патологией, но и с предрасположенностью к лейкозу (В.П. Шишков, 1977).

Совершенствование методов и средств иммунодиагностики возможно на основе знаний иммунологического статуса животных. Открытие ведущей роли Т- и В-лимфоцитов в иммунитете, их клеточной кооперации с макрофагами, разработка методов идентификации иммунокомпетентных клеток создают в совокупности условия для более объективной оценки иммунного статуса животных. Особенно актуальны результатыисследования по изучению иммунологического статуса при лейкозе крупного рогатого скота с использованием реакций розетко-образовния, которые могут быть использованы для совершенствования существующих методов иммунодиагностики лейкоза.

Цель работы: изучить в сравнительном аспекте иммунный статус здорового, инфицированного и больного лейкозом крупного рогатого скота и обосновать применение иммунологических методов для оценки предрасположенности животных к заболеванию.

Задачи исследований:

1. Определить инфицированность и заболеваемость лейкозом крупного рогатого скота на территории Омской области.

2. Определить иммунологические параметры у интактного и инфицированного ВЛКРС молодняка крупного рогатого скота.

3. Определить иммунологические параметры у интактных, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров.

4. Разработать способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

Научная новизна. Проведено ранжирование районов Омской области на

три группы с различным уровнем инфицированное™ животных вирусом лейкоза крупного рогатого скота и уровнем гематологического проявления лейкоза.

Определены иммунологические показатели у коров и молодняка крупного рогатого скота различных периодов постнатального развития в хозяйствах с различной эпизоотической обстановкой по лейкозу. Установлено, что дифференциация субпопуляций лимфоцитов в крови крупного рогатого скота позволяет более точно оценить его иммунный статус при лейкозной инфекции. Впервые показано, что наиболее стабильным признаком в иммунной системе больного и инфициро-

ванного скота, свидетельствующим об иммунной недостаточности, является увеличение общего числа лимфоцитов и уменьшение числа Т-лимфоцитов с рецептором к эритроцитам барана.

Дано экспериментальное обоснование применения иммунологических методов в оценке предрасположенности крупного рогатого скота, к заболеванию лейкозом, основанное на определении в крови животных процентного содержания общего числа лимфоцитов и Т-лимфоцитов, выведении коэффициента отношения (К0) количества лимфоцитов к числу T-лимфоци гов. При К0>4,3 животное считают больным или с повышенным риском к заболеванию лейкозом, предполагаемые для учета иммунологических показателей позволяют повысить достоверность и точность диагностики лейкоза. Новизна исследований подтверждена патентом РФ № 2379683 «Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота» от 20.01.2010 г.

Практическое значение работы. Выявлены иммунологические показатели, позволяющие наряду с традиционными методами дополнительно выявить до 46,6% больных животных повышенного риска заболевания лейкозом.

Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций: «Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе», утвержденные ученым советом ГНУ Всероссийский НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозакадемии (протокол № 3 от 2 апреля 2009 года) и секцией «Инфекционная патология животных» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 4 от 13 ноября 2009 года). Получена золотая медаль «Innovations for investments to the future» «Центра Международного Делового Сотрудничества» Американо-Российского Делового Союза (ARBU) за «Способ диагностики лейкозакрупного рогатого скота» (2010г.).

Основные теоретические положения и экспериментальные данные, изложенные в диссертационной работе, используются при чтении лекционных курсов ветеринарным специалистам по эпизоотологии, вирусологии, иммунологии и инфекционным болезням в Институте ветеринарной медицины ФГОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВНИИБТЖ (2007-2010 гг.); межрегиональной научнопрактической конференции, посвященной 85-летию СибНИВИ-ВНИИБТЖ (Омск, 2007); межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 180-летию аграрной науки Сибири (Омск, 2008); XI международной научнопрактической конференции по научному обеспечению АПК азиатских территорий (Новосибирск, 2008); межрегиональной научно-практической конференции (Омск, 2009); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной памяти И.А. Косилова (Омск, 2009); II Сибирском ветеринарном конгрессе (Но-

восибирск, 2010); международной научной конференции молодых ученых, посвященной 40-летию СО Россельхозакадемии (Новосибирск, 2010); международной научно-практической конференции, посвященной памяти выдающегося организатора Сибирской ветеринарной науки А.В. Копырина (Омск, 2010); международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию СибНИВИ-ВНИИБТЖ (Омск, 2011).

Публикация материалов исследования. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК РФ («Ветеринария и кормление»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 5 рисунками. Список литературы включает 325 источника, в том числе 65 иностранных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Омской области.

2. Иммунный статус молодняка крупного рогатого скота и коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств.

3. Оценка предрасположенности к заболеванию крупного рогатого скота лейкозом на основе определения иммунологических параметров.

За помощь в выполнении работы выражаем большую благодарность сотрудникам лабораторий Е.Ю. Секину, B.C. Власенко, В.Г. Ощепкову и А.Н. Новикову.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследования

Работа выполнена в лаборатории диагностических исследований и частично в секторе иммунитета и специфической профилактики туберкулеза Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Российской академии сельскохозяйственных наук в период с 2006 по 2010 гг.

Объектом исследования служил интактный, инфицированный BJIKPC и больной лейкозом крупный рогатый скот разных возрастных групп из хозяйств благополучных и неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота в Омской области.

Предметом исследования были пробы периферической крови, сыворотки крови и геномная ДНК, выделенная из крови животных.

Эпизоотологический ретроспективный анализ по лейкозу крупного рогатого скота в Омской области на глубину восьми лет (2002-2009гг.) проведен на основании данных ветеринарной отчетности Главного управления ветеринарии Омской области и документации районных ветеринарных лабораторий, станций по борьбе с болезнями животных.

Гематологические изменения у животных оценивали по «лейкозному ключу». Подсчет абсолютного, относительного количества лейкоцитов и лейкоформу-лу определяли путем микроскопирования мазков крови (Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота - М., 2000).

Микроскопические исследования крови проводили на исследовательском микроскопе проходящего и отраженного света для медико-биологических исследований Imager А1 с биометрической обработкой в программе Axio Vision версии 4.7.

Для выявления серопозитивных животных-носителей ВЛКРС применяли реакцию иммунодиффузии (РИД) согласно наставлению по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота, изготовленный ФГУП Курская биофабрика - фирма «БИОК», 25.06.2008 год, серия № 17, контроль № 17.

Выделение образцов ДНК и исследование их в ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле проводили при помощи тест-системы «Лейкоз КРС-провирус», согласно инструкции по применению, производства ФГУН ЦНИИ «Эпидемиологии» г. Москва, изготовлен 14.10.10., серия 14.10.10., на приборе «Ampli-4» производства «ДНК-Технология».

В процессе работы пользовались иммунологическимитестами: реакцией спонтанного розеткообразования (Е-рок) - определяли количество Т-лимфоцитов в периферической крови; реакцией непрямого глобулинового розеткообразования (ЕА-рок) - количество лимфоцитов-киллеров; реакцией комплементарного розеткообразования (ЕАС-рок) - количество В-лимфоцитов; реакцией антиген-связывающегорозеткообразования (EL-рок) с эритроцитами быка, антигеном вируса лейкоза крупного рогатого скота, из набора для серологической диагностики лейкоза (ФГУП Курская биофабрика - фирма «БИОК», изготовлен 14.05.2008 год, серия № 7, контроль № 7). Постановку и учет реакций розеткообразования проводили в соответствии с существующими методическими рекомендациями (М.А. Бажин с соавт., 1989 и др.).

Статистическую обработку цифрового материала проводили в программе Excel из пакета Microsoft Office. Уровень значимости вариационных рядов оценивали параметрическим t-критерием Стьюдента.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Омской области

Анализ результатов серологических и гематологических исследований, проведенных в Омской области за период с 2002 по 2009 гг., показал, что, несмотря на определенные успехи в проведении противолейкозных мероприятий, инфекция ВЛКРС регистрируется во всех 32 административных районах Омской области. На 1.01.2010 года 0,9-44% коров общественного стада являлись РИД-положительными, а количество гематологически больных животных достигало 1,6% от числа исследованных.

Ранжирование районов области по степени напряженности эпизоотической ситуации позволило выделить три группы территорий с различным уровнем виру-соносительства и случаев заболевания животных лейкозом крупного рогатого скота.

1-я группа - уровень инфицированности коров ВЛКРС не превышал 10% (Азовский, Марьяновский, Одесский, Омский, Русско-Полянский, Седелышков-ский и Щербакульский районы);

П-я группа - уровень вирусоносительства 11-30% (Большереченский, Болыде-Уковский, Горьковский, Знаменский, Исилькульский, Калачинский, Ко-лосовский, Кормиловский, Крутинский, Любинский, Москаленский, Муромцев-ский, Называевский, Нововаршавский, Оконешниковский, Павлоградский, Полтавский, Саргатский, Таврический, Тарский, Тевризский, Тюкалинский, Усть-Ишимский и Черлакский районы);

Ш-я группа - уровень вирусоносительства более 30% (Нижне-Омский и Тюкалинский районы).

Полученные данные позволяют сделать вывод, что проблема ликвидации лейкоза в Омской области, так же как и во многих других регионах Сибири и во всей РФ, остается достаточно актуальной, регистрируются как вирусоносители ЛКРС, так и гематологически больные животные.

На основании полученных результатов составлены картограммы при анализе которых установлено неравномерное распространение на территории Омской области инфекции лейкоза.

2.2.2. Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе

2.2.2.1. Иммунный статус у интактного и инфицированного ВЛКРС молодняка крупного рогатого скота

Установлено, что в возрасте 1-2 месяца количественный состав иммуноком-петентных клеток периферической крови у телят, родившихся от здоровых коров и

вирусоноситеяей различен. У телят, родившихся от матерей-вирусоноси телей, количество иммунокомпетентных клеток достоверно снижается.

Для установления наиболее стабильного признака, отражающего иммунный статус животных определен коэффициент отношения процентного содержания общего числа лимфоцитов к различным субпопуляциям лимфоцитов (Т-, В-лимфоциты, Т-киллеры и Т-лимфоциты, распознающие антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота).

У телят, полученных от инфицированных коров, коэффициент отношения к субпопуляциям достоверно выше.

В крови телят в возрасте 4—6 месяцев, родившихся в благополучном и неблагополучном по лейкозу стадах, определяли количество иммунокомпетентных клеток в абсолютном содержании. Исследовано 80 телят, по 40 от здоровых коров и вирусоносителей.

Определено, что количество иммунокомпетентных клеток в крови телят, родившихся от здоровых и от матерей-вирусоносителей, имеет существенное различие.

В итоге установлено, что у телят, родившихся от инфицированных коров достоверно (Р<0,001) увеличивается число лейкоцитов 8,72±0,45 тыс/мкл, ЕА-рок 3,19±0,43 тыс/мкл и ЕЬ-рок 5,54±0,43 и ЕАС-рок 1,82±0,19 тыс/мкл; (Р<0,01), а общего числа лимфоцитов (0,85±0,10 тыс/мкл) и Е-рок (1,00±0,19 тыс/мкл) достоверно снижается.

Определяли коэффициент отношения процентного содержания лимфоцитов к различным субпопуляциям (Т-, В-лимфоциты, Т-киллеры и Т-лимфоциты, распознающие антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота).

У телят, родившихся от инфицированных коров, коэффициент отношения лимфоцитов к В-лимфоцитами и Т-лимфоцитам, распознающим антигены вируса лейкоза крупного рогатого скота, по отношению к здоровым телятам достоверно увеличивается (3,62±0,23; 5,13±0,39 тыс/мкл; Р<0,01) и (1,28±0,08;

б,40± 1,04 тыс/мкл; Р<0,001), соответственно. В то время как коэффициент отношения лимфоцитов к Т-лимфоцитам и Т-киллерам у инфицированных телят резко снижается (3,65±0,47; 2,16±0,15 тыс/мкл; Р<0,01) и (4,01±0,40; 2,37±0,26 тыс/мкл; Р<0,01).

В периферической крови молодняка крупного рогатого скота из хозяйств с различной эпизоотической обстановкой, в возрасте 12-14 месяцев определяли количество иммунокомпетентных клеток в абсолютном содержании. Исследовано 80 животных, из них 40 здоровых из благополучного хозяйства и 40 инфицированных (положительно реагирующих в РИД) из неблагополучного хозяйства по вирусу лейкоза крупного рогатого скота. Обобщение результатов этих исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Средние показатели иммунологических параметров у молодняка в возрасте 12-14 месяцев, тыс/мкл

Показатель Г руппа молодняка Р

здоровые, М±т инфицированные, М±т

Лейкоциты 5,02±0,39 8,84±0,40 <0,001

Лимфоциты 1,64±0,26 2,96±0,28 <0,001

Т-лимфоциты (Е-рок) 1,52±0,19 0,59*0,16 <0,001

Т-киллеры (ЕА-рок) 1,45±0,19 2,48±0,23 <0,001

В-лимфоциты (ЕАС-рок) 0,41 ±0,07 0,99±0,11 <0,001

Т-лимфоциты, распознающие антиген (ЕЬ-рок) 0.94±0,09 1,83±0,24 <0,005

У молодняка, положительно реагирующего в РИД, зарегистрировано достоверное (Р<0,001) снижение числа Е-рок. Данный показатель является общим признаком для животных, инфицированных и больных лейкозом крупного рогатого скота. У них исчезала или отмечалась крайне низкая способность (до 18% у одного животного) образовывать Е-розетки с эритроцитами барана.

Отмечено достоверное увеличение содержания ЕА-, ЕАС-, ЕЬ-рок и лейкоцитов (Р<0,001).

Коэффициенты отношения процентного содержания лимфоцитов к различ-нымсубпопуляциямприведены в таблице 2.

Таблица 2 - Коэффициенты отношений лимфоцитов к субпопуляциям иммуно-компетентных клеток, у молодняка в возрасте 12-14 месяцев

Огношекке, % Группа животных, М±т Р

здоровые инфицированные

Лимфоциты/ Т-лимфоциты 3,75±0,36 18,57±5,38 <0,005

Лимфоциты/ Т-киллеры 4,04±0,38 17,39±5,06 <0,005

Лимфоциты/ В-лимфоциты 11,49±1,56 6,11±0,77 <0,005

Лимфоциты/ Т-лимфоциты, распознающие антигены 3,10±0,35 5,02±0,63 <0,01

Из таблицы 2 видно, что у инфицированного молодняка в возрасте 12-14 месяцев резко увеличивается коэффициент отношения лимфоцитов к Т-лимфоцитам (Р<0,005), Т-киллерам (Р<0,005) и Т-лимфоцитам, распознающим антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота (Р<0,01). Коэффициент отношения лимфоцитов к В-лимфоцитам у инфицированного молодняка достоверно ниже, чем у здорового (Р<0,005).

Иммунный статус у телок в возрасте 16-18 месяцев (телки в случном возрасте) определяли путем подсчета иммунокомпетентных клеток в абсолютном содержании. Исследовали 40 проб крови от животных 16-18 месяцев из хозяйств с

различной эпизоотической ситуацией по лейкозу крупного рогатого скота, причем из неблагополучного хозяйства отбирали, только РИД-положительных телок (табл. 3).

Таблица 3 - Средние показатели иммунологических параметров у телок

в возрасте 16-18 месяцев, тыс/мкл

Показатель Группа телок, М*т Р

здоровые инфицированные

Лейкоциты 4,12*0,21 8,88*1,29 <0,001

Лимфоциты 1,26±0,17 2,67±0,38 <0,005

Т-лимфоциты (Е-рок) 1,59*0,11 1,09*0,14 <0,01

Т-киллеры (ЕА-рок) 1,03±0,10 2,38*0,31 <0,001

В-лимфоциты (ЕАС-рок) 0,93*0,10 3,98*0,79 <0,001

Т-лимфоциты, распознающие антиген (ЕЬ-рок) 0,81*0,06 1,64*0,32 <0,05

У инфицированных животных, зарегистрировано достоверное снижение числа Е-рок, что является общим признаком для инфицированного лейкозом крупного рогатого скота. В тоже время содержание ЕАС-рок, ЕА-рок и ЕЬ-рок у инфицированных животных достоверно (Р<0,001) возрастает в 2 и более раза.

Определение коэффициента отношения процентного содержания общего числа лимфоцитов к различным субпопуляциям, показало (табл. 4), что у инфицированных телок достоверно увеличивается отношение лимфоцитов к Т-лимфоцитам (Р<0,001) и Т-лимфоцитам, распознающим антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота (Р<0,001) и уменьшается отношение лимфоцитов к Т-киллерам (Р<0,05) и В-лимфоцитам (Р<0,001).

Таблица 4 - Коэффициенты отношений лимфоцитов к субпопуляциям иммуно-компетентных клеток у телок в возрасте 16-18 месяцев_____________________

Отношение, % Группа животных, М±т Р

здоровые инфицированные

Лимфоциты/ Т-лимфоцкты 2,11*0,146 4,79*0,453 <0,001

Лимфоциты/ Т-киллеры 3,39*0,300 2,42*0,247 <0,05

Лимфоциты/ В-лимфоциты 3,69*0,342 1,73*0,087 <0,001

Лимфоциты/ Т-лимфоцкты распознающие антигены 3,44*0,277 6,89*0,916 <0,001

2.2.2.2. Иммунный статус у здоровых, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров

Определили иммунный статус у 40 здоровых коров, 40 инфицированных и 40 больных коров. Больные коровы положительно реагировали в РИД с подтвер-

ждением диагноза гематологическим методом. В крови коров определяли количество иммунокомпетентных клеток в абсолютном содержании (табл. 5).

Таблица 5 - Средние показатели иммунологических параметров в крови крупного рогатого скота, тыс/мкл

Показатель Группа коров, М±ш

здоровые инфици- рованные Р больные Р

Лейкоциты 4,45±0,261 8,39±0,811 <0,001 12,52±2,476 <0,005

Лимфоциты 1,22±0,057 2,07±0,275 <0,005 1,б5±0,1б9 <0,005

Т-лимфоциты (Е-рок) 2,77±0,163 1,30*1,95 <0,001 1,58±0,186 <0,001

Т-киллеры (ЕА-рок) 1,45±0,154 5,69±0,853 <0,001 2,50±0,324 <0,005

В-лимфоциты (ЕАС-рок) 1,39±0,154 3,83±0,468 <0,001 0,79±0,165 <0,005

Т-лимфоциты, распознающие антигены (ЕЬ-рок) 1,3!±0,168 3,93±460 <0,001 2,74±0,582 <0,05

В результате анализа было установлено, что у инфицированных ВЛКРС животных по отношению к здоровым увеличивается общее число лейкоцитов (Р<0,001), ЕА-рок (Р<0,001), ЕАС-рок (Р<0,001) и ЕЬ-рок (Р<0,001).

У больных животных общее количество лейкоцитов достоверно Р<0,005 больше, чем у здоровых. Тогда как общее число лимфоцитов у больных коров по сравнению со здоровыми животными не имеет большого различия. Содержание ЕАС-рок у больных коров уменьшается в 2 раза. Количество ЕЬ-рок достоверно (Р<0,05) возрастает в среднем в 2 раза.

Общим признаком является значительное снижение числа Т-лимфоцитов, в среднем в 2 раза, относительно здоровых коров (Р<0,001). У инфицированных животных отмечали крайне низкую способность Т-лимфоцитов образовывать розетки с эритроцитами барана. Таких среди инфицированных коров - 90%, а среди больных - 80%. Для инфицированных и больных животных характерно высокое содержание лейкоцитов и лимфоцитов. Определили коэффициент отношения процентного содержания лимфоцитов к субпопуляциям (табл. 6).

Таблица 6 - Коэффициенты отношений лимфоцитов в процентах к субпопуляциям иммунокомпетентных клеток в крови коров, М±т

Отношение, % Г руппа коров, М±т

здоровые инфициро- ваниые Р больные Р

Лимфоциты/Т-лимфоциты 3,07±0,389 6,74±1,051 <0,005 8,83±1,415 <0,001

Лимфоциты/Т-киллеры 2,54±0,325 1,26*0,120 <0,001 1,48±0.148 <0,005

Лимфоциты/В-лимфоциты 2,67±0,335 1,37±0,121 <0,01 17,50±6,449 <0,001

Лимфоциты/Т-лимфоциты распознающие антигены 2,65±0,163 1,70±0,156 <0,001 3,94±0,357 <0,001

Достоверно ниже коэффициент отношения лимфоцитов к Т-киллерам по сравнению со здоровыми животными у инфицированных (Р<0,001) и больных (Р<0,005).

Достоверно выше, чем у здоровых животных (в 2 и более раза) коэффициент отношения лимфоцитов к Т-лимфоцитам у инфицированных (Р<0,005) и больных (Р<0,001) животных.

Коэффициент отношения лимфоцитов к Т-лимфоцитам, распознающие антиген ВЛКРС, у инфицированных животных достоверно ниже (Р<0,001), а у больных лейкозом коэффициент достоверно выше (Р<0,005) относительно здоровых животных.

Таким образом, было определено, что у больных и инфицированных ВЛКРС коров содержание Т-лимфоцитов ниже в 2 раза, чем у здоровых животных. Коэффициент отношения лимфоцитов к Т-лимфоцитам у больных и инфицированных животных выше в 2 и более раза, чем у здоровых коров.

2.2.2.З. Иммунологические показатели в оценке предрасположенности к заболеванию крупного рогатого скота лейкозом

В ходе исследования нами было установлено, что стабильным признаком в иммунной системе больного и инфицированного ВЛКРС, свидетельствующим об иммуЕшой недостаточности, является крайне низкая способность Т-лимфоцитов образовывать розетки с эритроцитами барана, что более выражено у старших возрастных групп животных. При этом другие иммунологические показатели менее информативны и не позволяют выявить больных или с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупного рогатого скота. Учитывая эту закономерность, мы приступили к созданию нового информативного метода диагностики ВЛКРС.

Сущность данного метода состоит в том, что у животного проводят забор проб периферической крови, определяют процентное содержание общего числа лимфоцитов в мазке крови и Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразо-вания с эритроцитами барана (Е-рок), определяют коэффициент отношения (К0):

_ число лимфоцитов

Ка——....... — ■■ ■■

число Т-лимфоцитов

Увеличение этого коэффициента указывает на иммунную недостаточность, вызванную вирусом лейкоза, и является наиболее стабильным признаком в иммунной системе. При К0< 4,2 животное считают здоровым, при К0> 4,3 животное считают больным или с повышенным риском к заболеванию. Этот метод позволяет дополнительно выявлять до 46,6 % животных с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупного рогатого скота.

С целью экспериментальной апробации иммунологического метода исследовали 30 коров, в том числе, 10 здоровых из благополучного по лейкозу крупного рогатого скота стада, 10 интактных коров, из неблагополучного по лейкозу

стада, 10 больных коров (положительно реагирующих в РИД с подтверждением диагноза гематологическим методом).

Установлено, что у инфицированных достоверно возрастает число лейкоцитов, В-лимфоцитов и Т-антиген-реактивных лимфоцитов, у больных животных достоверно увеличиваетсяколичество лейкоцитов и общее числолимфоцитов. Содержание В-лимфоцитов у инфицированных коров значительно выше (50,7±2,74 тыс/мкл; Р<0,001), тогда как у больных оно ниже (13,0±2,47 тыс/мкл; Р<0,001). Общим признаком для инфицированных и больных лейкозом крупного рогатого скота является достоверное (Р<0,001) снижение числа Т-лимфоцитов относительно здоровых животных.

Анализируя коэффициенты отношения лимфоцитов к Т-лимфоцитам установили^ здоровых животных К0 <3,5; у инфицированных - К0 > 4,3; у больных варьирует от 4.88 до 16,4.

В неблагополучном по лейкозу крупного рогатого скота хозяйстве исследовали также телят, полученных от коров-вирусоносителей, в возрасте 4-6 месяцев и 12-14 месяцев в сравнении с телятами этих же возрастных групп из благополучного по лейкозу крупного рогатого скота хозяйства (табл. 7). Телята всех возрастных групп не реагировали в РИД.

Из 15-ти телят 4-6 месячного возраста, полученных от коров-вирусоносителей, 14 признаны здоровыми (К0 не превышал 3,4), одно животное признано больным (Ко=17,0). Эти данные подтверждены гематологическим методом исследования по «лейкозному ключу».

У телят из благополучного хозяйства К0 варьировал в пределах от 1,1 до 3,6, указывая на отсутствие у них вируса лейкоза.

Из 15 животных в возрасте 12-14 месяцев из неблагополучного по лейкозу крупного рогатого скота хозяйства гематологическим методом выявлено 7 больных животных, тогда как иммунологическим методом - 14 животных, что позволило дополнительно выявить 7 (46,66%) инфицированных и с повышенным риском к заболеванию ВЛКРС животных. У телят этого же возраста из благополучного хозяйства К0варьировал в пределах от 1,1 до 2,3.

При исследовании 20 коров, содержащихся в пункте по передержке инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота, выявлено РИД положительных - 20, гематологическим методом — 11, а иммунологическим способом (К,> 4,3) - 18 коров (табл. 7). У 20 коров из благополучного хозяйства это отношение варьировало в пределах от 2,5 до 3,9.

Таблица 7 - Результаты исследования животных различных возрастных групп в неблагополучном по лейкозу хозяйстве

Возрастная группа Количество животных Выявлено

РИД (+) гематологическим методом иммунологи- ческим способом дополнительно

животных %

4-6 месяцев 15 - 1 1 -

[2-14 месяцев 15 - 7 14 +7 +46,6

коровы 20 20 11 18 -2 -10

Таким образом, иммунологический способ диагностики позволяет дополнительно выявить (до 46,6%) больных и с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупного рогатого скота.

2.2.3. Оценка стад крупного рогатого скота по лейкозу с использованием иммунологического метода в совокупности с традиционными

Для оценки иммунологического способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота в производственных условиях нами проведены исследования на ферме СПК «Шанс» Саргатского района Омской области с неясной обстановкой по лейкозу. Методом случайной выборки сформировали три группы по 15 животных:

1-я группа - животные из благополучного по лейкозу хозяйства (контроль);

Н-я группа-животные из фермы №1 СПК «Шанс»;

Ш-я группа - животные из фермы №2 СПК «Шанс».

Установлено, что у коров П-й группы (опытная) количество лейкоцитов и лимфоцитов достоверно увеличивается по отношению к 1-й группе (контрольная). Число Е-року животных опытных групп снижено (РОДИН). Снижение этого показателя является общим признаком для инфицированных и больных лейкозом коров.

Коэффициент отношения (К„) лимфоцитов к Т-киллерам между группами существенно не отличается. Ко лимфоцитов к В-лимфоцитам и Т-антиген-реактивным лимфоцитам к вирусу лейкоза у коров опытных групп достоверно выше.

Животных из СПК «Шанс», с К0 лимфоцитов к Т-лимфоцитам равным 6,71 (Р<0,001) можно считать инфицированными и с повышенным риском к заболеванию. .

Дополнительно к гематологическому и иммунологическому методам на ферме СПК «Шанс» проводили серологические (РИД) и молекулярногенетические (ПЦР) исследования (табл. 8). По полученным данным видно, что в исследованных группах выявлены как серопозитивные, так и гематологически больные животные.

Таким образом, СПК «Шанс» Саргатского района отнесен к неблагополучным по лейкозу крупного рогатого скота.

Таблица 8 - Результаты диагностических исследований коров из ферм СПК «Шанс»

Ферма Количество животных Выявлено

РИД(+) гематологическим ■ методом иммунологическим методом ПЦР

№1 15 7 3 13 11

№2 15 13 3 12 8

На ферме № 1 два животных положительно реагируют во всех четырех методах исследования и признаны больными лейкозом крупного рогатого скота.

Одно животное, положительно реагировавшее в трех методах исследования (в том числе предлагаемый способ диагностики), также признано больным. Отрицательный результат РИД можно объяснить понижением титра специфических противовирусных антител в сыворотке крови исследуемого животного за пределы чувствительности данного метода, по причине определенного физиологического состояния, а также иммунологической супрессией, инициированной воздействием негативных факторов внешней среды, паразитами.

Шесть животных положительно реагировали в трех методах, однако гематологический метод не выявил большого количества лимфоидных клеток различной степени зрелости, поэтому данная группа животных признана инфицированной вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Две коровы считаем инфицированными, так как Ко> 4,3 и получен положительный результат в полимеразной цепной реакции.

Два животных считаем с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупного рогатого скота, так как у них Ко> 4,3 и отрицательные результаты в остальных методах диагностики.

Здоровыми от вируса лейкоза крупного рогатого скота признаны 2 животных, показавших отрицательные результаты во всех четырех методах исследования.

На ферме № 2 три животных положительно реагируют во всех четырех методах диагностики и являются больными лейкозом крупного рогатого скота. Пять коров признаны инфицированными, так как положительно реагируют в трех диагностических методах исследования на лейкоз, а по «лейкозному ключу» категории больных не соответствуют.

Одно животное отнесено к категории повышенного риска к заболеванию лейкозом крупного рогатого скота, так как в утвержденных реакциях на лейкоз реагировало отрицательно, а иммунологическим методом - К0>4,3.

Три животных являются РИД-положительными с коэффициентом отношения Ко>4,3, а гематологическим методом и в ПЦР получены отрицательные результаты, следовательно, эти животные признаны инфицированными. Отрицательный результат в ПЦР можно объяснить чувствительностью и специфичностью лабораторных диагностических тестов на лейкоз.

Н.Г. Двоеглазов (2009) отмечает, что значительный процент случаев несовпадений данных ПЦР с результатами серологических исследований свидетельствует о низком уровне провирусной ДНК, находящейся ниже предела чувствительности ПЦР. Нельзя исключать и возможность региональной вариабельности провирусной ДНК в исследуемых образцах в месте посадки праймеров.

Два животных являются РИД-положительными с К0< 4,3 и отрицательными результатами гематологического исследования и ПЦР. Возможно, положительный результат в РИД, связан с неспецифическими реакциями.

Отрицательно реагировало по всем методам диагностики лейкоза и признано здоровым одно животное, которое и не отнесено к группе животных с повышенным риском к заболеванию лейкозом.

Следовательно, в СПК «Шанс» Саргатского района Омской области выявлены животные, здоровые с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупного рогатого скота, инфицированные, а также больные, что позволяет признать хозяйство неблагополучным по лейкозу крупного рогатого скота.

3. ВЫВОДЫ

1. Изучена инфицированность и заболеваемость по лейкозу крупного рогатого скота на территории Омской области, составлена эпизоотологическая карта области. Проведено ранжирование административных районов на группы с различным уровнем инфицированности и гематологическим проявлением болезни. При этом установлено, что лейкоз имеет распространение во всех 32 административных районах области с показателем инфицированности варьирующим от

0,9 до 44% и гематологически больных — от 0 до 1,6%.

2. Определены иммунологические параметры, позволяющие выявлять животных больных, инфицированных ВЛКРС и с повышенным риском к заболеванию путем выведения коэффициента отношения (К.) процентного содержания общего числа лимфоцитов и Т-лимфоцитов, который у здоровых животных составляет Ко<4,2; у инфицированных - Ко>4,3; у больных животных - варьирует в пределах от 4,9 до 16,4.

3. Разработан и апробирован в условиях производства иммунологический способ в комплексе со стандартными методами диагностики лейкоза, который повышает достоверность оценки эпизоотического состояния стада и дополнительно выявляет до 46,66% больных и с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупного рогатого скота.

4. У коров, инфицированных ВЛКРС, в крови регистрируется высокое содержание общего числа лейкоцитов, В-лимфоцитов и Т-антиген-реактивнь£Х лимфоцитов; у больных лейкозом - высокое число лейкоцитов, лимфоцитов при значительном снижении розеткообразующих В- и Т-лимфоцитов (Р<0,001).

5. У молодняка крупного рогатого скота в возрасте 12 месяцев и старше, инфицированного ВЛКРС, определяются признаки, свидетельствующие об иммунной недостаточности (Ко>4,3). Другие иммунологические показатели: В-лимфоцитов, Т-киллеров, Т-антиген-реактивных лимфоцитов менее информативны и не могут быть использованы для диагностики.

6. У телят в возрасте до 2 месяцев, полученных от инфицированных коров, показатели иммунологических параметров снижаются, тогда как к 6-месячному возрасту уровень Т-киллеров, В- и Т-антиген-реактивных лимфоцитов повышается (Р<0,001).

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанные методические рекомендации «Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе», утвержденные ученым советом ГНУ Всероссийский НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозакадемии (протокол №3 от 2 апреля 2009 года) и секцией «Инфекционная патология животных» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №4 от 13 ноября 2009 года) необходимо использовать в научно-исследовательских лабораториях, занимающихся диагностикой лейкоза крупного рогатого скота и институтах, проводящих исследования в области разработки новых методов и средств иммунологической защиты животных от других инфекций.

Разработанная эпизоотологическая карта лейкозной ситуации в Омской области, позволяет оперативно отслеживать зоны максимального, среднего и минимального распространения инфекции и динамику заболеваемости крупного рогатого скота.

Теоретические и экспериментальные материалы по оценки иммунного статуса при лейкозе целесообразно использовать в зоошшенерных и ветеринарных высших учебных заведениях, в лекционных курсах по эпизоотологии и вирусологии.

Предлагается метод для выявления больного и инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота, в крови которых определяют процентное содержание общего числа лимфоцитов и Т-лимфоцитов методом спонтанного ро-зеткообразования, коэффициент отношения (Кс) содержания лимфоцитов к числу Т-лимфоцитов. При К0 равном 4,3 и более, животное считают больным и с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота. Способ позволяет повысить достоверность и точность диагностики.

5. СПИСОК РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Власенко, В. С. Выявление животных с повышенным риском к заболеванию вирусом лейкоза крупного рогатого скота / B.C. Власенко, Т.С. Дудоладова, М.А. Бажин, А.Н. Новиков // Веткорм — 2008. - № 4 — С. 8-9.

2. Патент РФ № 2379683 2008122655/15 Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота / М.А. Бажин, B.C. Власенко, Т.С. Дудоладова,

А.Н. Новиков, заяв, от 4.06.2008 опубл. 20.01.2010, Бюл. №2.-6 с.

3. Реутова, Т. С. Сравнительная оценка методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Т.С. Реутова, Е.Ю. Секин // Патология сельскохозяйственных животных и пути ее профилактики: материалы VI межрегион. науч.-практ. конф., посвящ. 85-летию СибНИВИ-ВНИИБТЖ. Вып.2 - Омск, 2007. - С. 136-142.

4. Дудоладова, Т. С. Современные методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота (Обзор) / Т.С. Дудоладова, Е.Ю. Секин //Диагностика, лечение и профилактика болезней животных в условиях Сибири и Урала: материалы VII межрегион. науч.-практ. конф., посвящ. 180-летию аграрной науки Сибири. -Омск, 2008. — С-122-126.

5. Власенко, В. С. Иммунный статус инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота / B.C. Власенко, Т.С. Дудоладова, М.А. Бажин,

A.Н. Новиков, В.А. Мироненко //Развитие АПК азиатских территорий: тр. XI ме-ждународ. науч.-практ. конф. - Новосибирск, 2008. - Т.2. - С. 48-51.

6. Дудоладова, Т. С. Выявление животных с иммунной недостаточностью, вызванной вирусом лейкоза крупного рогатого скота / Т.С. Дудоладова // Патология продуктивных и непродуктивных животных, рыб и птиц. - Омск, 2009. - С. 48-53.

7. Власенко, В. С. Иммунный статус у здорового и родившегося от матерей, инфицированных вирусом лейкоза, молодняка крупного рогатого скота /

B.C. Власенко, Т.С. Дудоладова, М.А. Бажин, А.Н. Новиков, В.А. Мироненко // Патология продуктивных и непродуктивных животных, рыб и птиц. - Омск, 2009. - С. 23-29.

8. Дудоладова, Т. С. Сравнительная характеристика иммунного статуса молодняка крупного рогатого скота при лейкозе / Т.С. Дудоладова // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: тр. IV Между-народ. науч. конф. молодых ученых, посвящ. 40-летию СО Россельхозакадемии. -Новосибирск, 2010. - Т. 2. - С. 48-52.

9. Дудоладова, Т. С. Иммунная недостаточность у молодняка крупного рогатого скота, вызванная вирусом лейкоза / Т.С. Дудоладова // Актуальные вопросы веттеринарной медицины: материалы II Сибирского ветеринар, конгресса / Новосибирский гос. аграр. ун-т. - Новосибирск, 2010. - С. 328-329.

10. Дудоладова, Т. С. Иммунологическая диагностика лейкоза у молодняка крупного рогатого скота / Т.С. Дудоладова // Актуальные проблемы инфекционных и незаразных патологий животных: материалы Международ. науч.-практ. конф., посвящ. памяти выдающегося организатора Сибирской ветеринарной науки А.В. Копырина. -Омск, 2010. - С. 216-217.

Подписано к печати 16.01.2012. Формат бумаги 60x84, 1/ 16. Печать оперативная. Гарнитура Times New Roman.

Уел. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано с оригинал-макета в типографии ООО «Вариант-Омск» 644043, г. Омск, ул. Фрунзе 1,корп. 3,оф. 13. Тел./факс: 211-600

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Дудоладова, Татьяна Сергеевна, Омск

61 12-3/698

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БРУЦЕЛЛЕЗА И ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

Дудоладова Татьяна Сергеевна

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

На правах рукописи

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

доктор ветеринарных наук, профессор Бажин М.А.

0мск-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................4

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................10

1.1 Основные концепции канцеро-(лейкозо)-генеза........................10

1.2 Общие сведения об иммунной системе...................................14

1.2.1 Система лейкоцитарных антигенов.......................................14

1.2.2 Т-, В- и А- системы лимфоидных клеток...............................15

1.2.3 Иммунный ответ при лейкозах и

лимфопролиферативных состояниях...............................................21

1.3 Методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота...............25

1.3.1 Клиническая диагностика..................................................26

1.3.2 Гематологический метод диагностики..................................27

1.3.3 Патоморфологический метод исследования............................29

1.3.4 Серологические методы диагностики лейкоза

крупного рогатого скота.................................................................31

1.3.4.1 Реакция иммунодиффузии в геле агара (РИД).......................31

1.3.4.2 Метод иммуноферментного анализа (ИФА).........................33

1.3.5 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)...................................35

1.3.6 Вирусологический метод...................................................38

1.4 Заключение по обзору литературы.........................................39

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы...........................................................43

2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.........................................46

2.2.1 Эпизоотологическая обстановка по лейкозу крупного рогатого скота в Омской области...............................................46

2.2.2 Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота

при лейкозе...........................................................................59

2.2.2.1 Приготовление маркера для определения

Т-лимфоцитов, распознающих антиген ВЛКРС.............................59

2.2.2.2 Иммунный статус у интактного и инфицированного

ВЛКРС молодняка крупного рогатого скота................................60

2.2.2.3 Иммунный статус у здоровых, инфицированных

ВЛКРС и больных лейкозом коров..............................................68

2.2.3 Иммунологические показатели в оценке предрасположенности к заболеванию крупного

рогатого скота лейкозом..........................................................72

2.2.4 Оценка стад крупного рогатого скота по лейкозу с использованием иммунологического метода в

совокупности с традиционными.................................................77

3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ....................85

4 ВЫВОДЫ..........................................................................90

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДОЖЕНИЯ..........................................92

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................93

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................129

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Лейкоз крупного рогатого скота широко распространен в Российской Федерации и наносит значительный экономический ущерб животноводству. Падеж и вынужденная выбраковка животных, утилизация туш и органов при убое, нарушение воспроизводительной функции больных коров, а также ограничения, связанные с реализацией продукции в неблагополучных хозяйствах - все это приводит к потерям, которые особенно ощутимы в племенном животноводстве (Л.Г. Бурба с соавт., 1988; Т.П. Кудрявцева, 1990; А.Т. Борзяк, 1990; И.Н. Петров, 1999; П.Н. Смирнов, 1992, 2005; И.М. Донник, 1999; М.И. Гулюкин, 1985, 2002, 2005; В.В. Разумовская, 2004; С.И. Логинов, 2005; В.В. Храмцов, М.А. Амироков, 2006 и др.).

Ранняя и точная диагностика лейкоза лежит в основе профилактических и оздоровительных мероприятий. В связи с этим особое значение приобретает разработка доступных для практики эффективных иммунологических методов прижизненной диагностики лейкоза. Развитие любой иммунной реакции происходит в результате взаимодействия различных элементов иммунной системы, активность которых контролируется на уровне системы и всего организма.

Вирусологический аспект теории характеризуется ведущей ролью РНК-содержащего вируса в этиологии заболевания. Данная концепция интегрирует в себе два неотделимых этиопатогенетических механизма лейкозного процесса - онковирусную инфекцию, как предлейкозное

состояние, и собственно лейкозный процесс (неоплазию). Инфицирование животного вирусом лейкоза крупного рогатого скота еще не равнозначно развитию лейкоза. Более того, определенная часть инфицированного ВЛКРС стада остается длительное время, а иногда и всю жизнь, несмотря на персистирующую в организме инфекцию, клинически здоровой. Объяснить причину случаев отсутствия лейкозного процесса у инфицированных животных, учитывая только один вирусный фактор, невозможно. Это можно сделать лишь, исходя из вирусо-иммуногенетической теории. Большая роль в развитии гемобластозов отводится иммунологическому состоянию организма и генетической предрасположенности или устойчивости к лейкозу.

По данным П.Н. Смирнова с соавт. (1992), количественные изменения в содержании Т- и В-лимфоцитов в периферической крови телят при экспериментальном инфицировании ВЛКРС и телят, родившихся от больных хроническим лимфолейкозом коров-онкорнавирусоносителей, достоверно отличаются от таковых у здоровых телят в различные возрастные периоды постнатального развития, и могут быть определены как иммунологический дефект. При этом роль ВЛКРС как иммунодепрессанта безусловна.

Все эти явления, симптомы приобретают большую прогностическую значимость: их появление и нарастание свидетельствует о развитии иммунной недостаточности. Имеются неопровержимые доказательства, что при многих формах иммунодефицитных состояний у крупного рогатого скота и, особенно у молодняка усиливается как лимфоцитарная (хромосомная) персистенция ВЛКРС, так и экстенсивность, и интенсивность инфицирования животных. Более того, сам ВЛКРС вызывает у молодых животных иммунодефицита клеточного и иммуноглобулинового типов, способствуя активации инфекционного процесса в неблагополучном по лейкозу стаде крупного рогатого скота (В.Н. Сюрин с соавт., 1998).

нарушением соотношения Т- и В- субпопуляций иммунокомпетентных клеток, содержанием лимфоцитов с рецепторным фенотипом, характерным для недифференцированных клеток, неспособных выполнять иммунологические функции (В.А. Крикун, М.И. Гулюкин, 1999).

Существующие методы исследования позволяют выявить только инфицированных и больных лейкозом животных, однако для эффективных оздоровительных мероприятий необходимо иметь методы выявления животных как с явной инфекционной патологией, так и с предрасположенностью к лейкозу.

Совершенствование методов и средств иммунодиагностики возможно на основе максимально возможных знаний иммунологического статуса животных. Открытие ведущей роли Т- и В-лимфоцитов в иммунитете, их клеточной кооперации с макрофагами, разработка методов идентификации иммунокомпетентных клеток создают в совокупности условия для более объективной оценки иммунного статуса животных.

Особенно актуальны результаты исследования по изучению иммунологического статуса при лейкозе крупного рогатого скота с использованием реакций розеткообразовния, которые могут быть применимы для совершенствования существующих методов иммунодиагностики лейкоза.

Цель и задачи исследований.

Изучить в сравнительном аспекте иммунный статус здорового, инфицированного и больного лейкозом крупного рогатого скота и обосновать применение иммунологических методов для оценки предрасположенности животных к заболеванию.

Для достижения цели были определены следующие задачи:

1. Определить инфицированность и заболеваемость крупного рогатого скота лейкозом на территории Омской области;

2. Определить иммунологические параметры у интактного и инфицированного ВЛКРС молодняка крупного рогатого скота;

3. Определить иммунологические параметры у интактных, инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров;

4. Разработать способ диагностики лейкоза крупного рогатого

скота.

Научная новизна.

Проведено ранжирование районов Омской области на три группы с разной степенью распространения инфекции и частотой гематологического проявления лейкоза крупного рогатого скота.

Дано экспериментальное обоснование применения иммунологических методов в оценке предрасположенности крупного рогатого скота, к заболеванию лейкозом. Определены иммунологические параметры, позволяющие выявлять животных больных, инфицированных ВЛКРС и с повышенным риском к заболеванию путем выведения коэффициента отношения (К0) процентного содержания общего числа лимфоцитов и Т-лимфоцитов, который у здоровых животных составляет К0<4,2; у инфицированных К0>4,3; у больных животных варьирует в пределах от 4,9 до 16,4. Новизна исследований подтверждена патентом РФ № 2379683, от 20 января 2010 года.

Практическая ценность работы.

Выявлены иммунологические показатели, позволяющие наряду с традиционными методами дополнительно выявить до 46,6% больных или с повышенным риском к заболеванию лейкозом крупного рогатого скота.

Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций: «Оценка иммунного статуса у крупного рогатого скота при лейкозе», утвержденные ученым советом ГНУ Всероссийский НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных Россельхозакадемии (протокол №3 от 2 апреля 2009 года) и секцией «Инфекционная патология животных» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №4 от 13 ноября 2009 года). Получена золотая медаль и диплом «Innovations for investments to the future» «Центра Международного Делового Сотрудничества» Американо-Российского Делового Союза (ARBU) за «Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота» (2010г.).

Основные теоретические положения и экспериментальные данные, изложенные в диссертационной работе, используются при чтении лекционных курсов ветеринарным специалистам по эпизоотологии, вирусологии, иммунологии и инфекционным болезням в Институте ветеринарной медицине ФГОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВНИИБТЖ (2007-2010гг.); межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 85-летию СибНИВИ-ВНИИБТЖ (Омск, 2007); межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 180-летию аграрной науки Сибири (Омск, 2008); XI международной научно-практической конференции по научному обеспечению АПК азиатских территорий (Новосибирск, 2008); VIII межрегиональной научно-практической конференции: Патология продуктивных и непродуктивных животных, рыб и птиц (Омск, 2009); Всероссийской научно-практической конференции посвященной памяти И.А. Косилова (Омск, 2009); II

Сибирском ветеринарном конгрессе (Новосибирск, 2010); международной научно-практической конференции, посвященной памяти выдающегося организатора Сибирской ветеринарной науки A.B. Копырина (Омск, 2010); международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию СибНИВИ-ВНИИБТЖ (Омск, 2011).

Основные положения диссертации, выводы и практические предложения доложены, обсуждены на межлабораторном заседании ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии и рекомендованы к защите (протокол № 2).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Омской области;

2. Иммунный статус молодняка крупного рогатого скота и коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств;

Публикация результатов исследований.

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК РФ «Ветеринария и кормление». Патент РФ № 2379683, от 20 января 2010 года «Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота» (ВНИИБТЖ). Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 5 рисунками. Список литературы включает 325 источника, в том числе 65 иностранных авторов.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Основные концепции канцеро-(лейкозо)-генеза

Среди злокачественных новообразований особая роль отводится лейкозам. Это связано с тем, что лейкозы остаются пока фатальным заболеванием, поражающим человека и животных (В.М. Бергольц с соавт., 1978; Л.Г. Бурба, 1979; Т.П. Кудрявцева, 1980, 1981; В.П. Шишков, 1988; П.Н. Смирнов, 1992; А.Г. Незавитин, 1995 и др.).

Изучение лейкозов считают наиболее интенсивной точкой роста наших знаний о причинах и механизмах опухолевой трансформации клеток и развития опухолевого процесса (В.П. Шишков, 1984, 1986; Ф.Л. Киселев с соавт., 1990).

Открытие онкогенных вирусов, клеточных протоонкогенов и факторов роста (P.A. Кукайн с соавт., 1982, 1985; Р.В. Петров, 1982; Г.М. Роничевская, 1983; Ф.Л. Киселев с соавт., 1990; Н.М. Temin, 1971; R.A. Weise, 1984) позволило более четко представить общую концепцию вирусного канцерогенеза. Канцерогенез является многостадийным процессом.

Н.М. Temin в 1971 году выдвинул противовирусную гипотезу вирусного канцерогенеза, которая дополнила механизм, применительно к РНК-содержащим онковирусам, репликация которых, опосредована через ревертазу (обратную транскриптазу) и ДНК клетки. По мнению Н.М. Temin, протовирус - это нормальный компонент ДНК клетки, участвующий в процессе дифференциации клетки и не несущий никаких опухолевых генов.

Отечественные и зарубежные данные по канцерогенезу позволили Г.П. Георгиеву (1981) создать «промоторную» теорию канцерогенеза, которая объединила все существующие теории злокачественной бласттрансформации (вирусную, химическую, радиационную, мутационную). Согласно данной теории опухолевая трансформация является результатом выхода из-под контроля потенциального онкогена, входящего в состав генома хозяина. Этот факт может иметь место при попадании

клеточного онкогена под сильный промотор экзогенных ретровирусов или мобильного диспергированного гена вследствие транспозиции.

R.J. Huebner (1969) сформулировал гипотезу вирогена - «вирусного онкогена». Гипотеза предполагает, что в геноме каждой нормальной клетки заложена информация в виде ДНК-провируса, равноценная информации генома онкорнавируса. Эта гипотеза постулировала существование нового класса вирусов — эндогенных, а также то, что онкогены являются частью генетического материала клетки. Онкогены при этом в нормальной клетке находятся в репрессированном состоянии (L. Szilard, 1960; R.J. Huebner, 1969, 1970). Таким образом, интеграция генома вируса в геном клетки (интегративный тип воздействия) сама по себе не ведет к развитию патологического процесса и не однозначна малигнизации. Поэтому опухолевое превращение клетки не является следствием интегративного взаимодействия вируса и клетки.

Не исключено также, что клеточные гены, от которых, видимо, произошли онкогены ретровирусов, могут участвовать в развитии опухолей, индуцированных не обязательно вирусами, а и другими агентами (В.М. Жданов, 1978; А.Д. Альтштейн, 1973).

Е.В. Грутненко (1977) считает, что первоначально вирусы онкогена не имели. Включение в их геном клеточного гена было бы возможно, если бы это событие не снижало вероятность распространения вируса у природных хозяев. То есть этот клеточный ген мог быть онкогеном только у неприродны�

Информация о работе

Дудоладова, Татьяна Сергеевна
кандидата биологических наук
Омск, 2012
ВАК 06.02.02

Диссертация

Экспериментальное обоснование применения иммунологических методов в оценке предрасположенности к заболеванию крупного рогатого скота лейкозом - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы