Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПЦР_детекция вирусов и бактерий, взаимодействие нуклеиновых кислот микроорганизмов с противомикробными и противоопухолевыми препаратами

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лиманский, Александр Петрович, Харьков

¡' г^гшт ттиДАТлА

! ~------------наук II

! Начальник отдела

62 11/74

ХАРЬКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ИММУНОЛОГИИ ИМ И.И. МЕЧНИКОВА

ПЦР-ДЕТЕКЦИЯ ВИРУСОВ И БАКТЕРИЙ. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПРОТИВОМИК-РОБНЫМИ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМИ ПРЕПАРАТАМИ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Волянский Юрий Леонидович,

доктор медицинских наук, профессор

На правах рукописи

Лиманский Александр Петрович

УДК 615:579:578.825:577.1

03.00.07 - микробиология

Харьков- 1998

СОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ................................................5

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................5

Раздел 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................. 14

1.1. Общие сведения о плавлении нуклеиновых кислот..................... 14

1.1.1. Методы исследования плавления ДНК.................................14

1.1.2. Профиль плавления, его характеристики.............................. 16

1.1.3. Плавление ДНК как метод исследования особенностей нуклеотидной последовательности.................................... 18

1.1.4. Тонкая структура профилей плавления ДНК........................ 20

1.2. Полимеразная цепная реакция................................................ 24

1.2.1. Механизм ПЦР............................................................... 24

1.2.2. Использование ПЦР для детекции инфекционных возбудителей.................................................................. 36

1.2.3. Анализ ПЦР тест-систем для детекции ВЬУ........................ 41

1.2.4. Анализ ПЦР тест-систем для детекции СМУ........................44

1.2.5. Правила проведения ПЦР-диагностики.............................. 47

1.3. Комплексы нуклеиновых кислот с биологически активными соединениями и антибиотиками............................................. 51

1.3.1. Механизмы взаимодействия антибиотиков

с нуклеиновыми кислотами............................................. 51

1.3.2. Методы исследования взаимодействия

нуклеиновая кислота — лиганд..........................................55

1.3.3. Специфичность взаимодействия полинуклеотидов с антибиотиками...............................................................57

Раздел 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................65

2.1. Компьютерный анализ геномов из баз данных

ЕМВЬ/ОепВапк.................................................................. 65

2.2. Полимеразная цепная реакция................................................73

2.2.1. Подготовка клинического материала..............................73

2.2.2. Проведение амплификации.......................................... 74

2.2.3. Визуализация амплифицированного продукта............... 75

2.3. Плавление ДНК.................................................................. 75

2.3.1. Термостатированная камера................. .........................75

2.3.2. Измерение температуры................................................78

2.3.3. Установка для плавления ДНК.......................................80

2.3.4. Получение дифференциальных профилей плавления.........82

2.4. Нуклеиновые кислоты......................................................... 84

2.4.1. ДНК микроорганизмов................................................ 84

2.4.2. Полинуклеотиды.........................................................85

2.4.3. Плазмидная ДНК рАОЗ известной последовательности... 85

2.4.4. Буферные растворы......................................................86

2.5. Спектральные исследования комплексов ДНК-лиганд...............87

2.5.1. Приготовление комплексов ДНК-лиганд........................ 87

2.5.2. Спектрофотометрическое титрование........................... 89

2.5.3. Расчет констант ассоциации ДНК с лигандами............... 89

Раздел 3. ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

БАКТЕРИАЛЬНОЙ И ВИРУСНОЙ ЭТИОЛОГИИ

МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.................. 93

3.1. Neisseria meningitidis............................................................ 93

3.2. Cytomegalovirus.................................................................. 98

3.3. Bovine leukemia virus......................................................... 102

3.4. Вирусы гепатита В, С......................................................... 107

Раздел 4. КОМПЛЕКСЫ АНТРАЦИКЛИНОВЫХ И АКРИДИНОВЫХ

ПРЕПАРАТОВ С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ............... 113

4.1. Комплексы акрихина и 9-аминоакридина с ДНК

Calf thymus и Salmon sperm при pH 5,20-6,90........................ ИЗ

4.2. Комплексы акрихина и 9-аминоакридина с ДНК

Calf thymus и Salmon sperm при pH 9,20-10,70........................ 121

4.3. Комплексы аклациномицина А с ДНК микроорганизмов.........124

Раздел 5. ПЛАВЛЕНИЕ КОМПЛЕКСОВ ДНК ПЛАЗМИДЫ рАОЗ И

ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ С АНТИБИОТИКАМИ........................ 131

5.1. Комплексы полинуклеотидов с аклациномицином А

и адриамицином...............................................................131

5.2. Комплексы ДНК рАОЗ с аклациномицином А и адриамицином.................................................................. 136

ВЫВОДЫ.......................................................................................... 145

ЛИТЕРАТУРА....................................................................................147

ЦИТИРУЕМЫЕ ИСТОЧНИКИ............................................................ 147

РАБОТЫ АВТОРА.............................................................................. 162

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВЛ КРС - вирус лейкоза крупного рогатого скота;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ИФА - иммуноферментный анализ;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

ФЭУ - фотоэлектронный умножитель;

BLV - bovine leukaemia virus, вирус лейкоза крупного рогатого скота;

HCMV - human cytomegalovirus, цитомегаловирус человека;

dNTP - смесь нуклеотидов (дезоксинуклеозидтрифосфатов);

EtBr - этидий бромистый;

HAV - hepatitis A virus, вирус гепатита А;

HBsAg - hepatitis В surface antigen, поверхностный антиген вируса гепатита;

HBV - hepatitis В virus, вирус гепатита В;

HCV - hepatitis С virus, вирус гепатита С;

HDV - hepatitis D virus, вирус гепатита D;

HGV - hepatitis G virus, вирус гепатита G;

HIV - human immunodeficiency virus, вирус иммунодефицита человека; HLA - human leukocyte antigen, антиген лейкоцитов человека; N. meningitidis - Neisseria meningitidis, нейсерия; Tan - температура отжига; Tm—температура плавления.

ВВЕДЕНИЕ

Бурное развитие прикладных молекулярно-генетических методов анализа привело к возникновению нового направления в диагностике инфекционных и наследственных заболеваний с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР кардинально изменил возможности молекулярной микробиологии и медицинской диагностики [1,2].

Диагностические методы, основанные на использовании ПЦР, имеют чрезвычайно высокие чувствительность (теоретически возможно детектировать одну молекулу, практически -10 молекул инфекционного агента [3-5] и специфичность; являются прямыми, поскольку позволяют детектировать непосредственно фрагмент генома возбудителя, а не опосредованный отклик, как в случае некоторых применений иммуноферментного анализа. К числу других положительных качеств метода необходимо также отнести возможность 100 % специфичности и скорость получения конечного результата.

Можно выделить следующие основные направления использования ПЦР для решения задач молекулярной микробиологии:

- молекулярно-генетический анализ и ранняя диагностика инфекционных агентов вирусной и бактериальной этиологии. ПЦР-детекция позволяет выявлять возбудителей, геном которых представлен и РНК, и ДНК;

- выявление генов, играющих центральную роль в резистентности к разным заболеваниям и в развитии врожденных патологий.

ПЦР базируется на эффекте плавления нуклеиновых кислот, т.е. в основе ПЦР лежат процессы денатурации и ренатурации ДНК. Внутримолекулярное плавление - одно из наиболее важных явлений, которые можно наблюдать в ДНК. Детальное понимание процесса плавления важно для изучения функциональных свойств ДНК, поскольку метаболизм этой молекулы в клетке сопровождается нарушением нативной В-конформации. В процессе функционирования в ДНК происходят конформационные преобразования, возникают новые структуры, и, как правило, все такие перестройки возникают с разрушением

исходной спиральной структуры молекулы. Такие важные генетические процессы, как репликация, рекомбинация, транскрипция, суперспирализация (в случае наличия инвертированных повторов) происходят с раскрытием двойной спирали ДНК. Понимание всех особенностей плавления ДНК важно и при использовании явления внутримолекулярного плавления ДНК как метода, который позволяет анализировать особенности конформации ДНК при комплексо-образовании с лигандами.

Еще относительно недавно многие исследователи считали, что этот метод исчерпал свои возможности для изучения взаимодействия нуклеиновых кислот с низкомолекулярными лигандами. Однако ситуация коренным образом изменилась в середине 70-х годов, когда благодаря появлению прецизионных спектрофотометров и методик выделения ДНК был открыт эффект тонкой структуры профилей плавления ДНК. В исследованиях ДНК наступил качественно новый этап, названный известным японским ученым А^аёа "эрой тонкой структуры кривых плавления" [6]. Потом снова, в середине 80-х годов, казалось, методы молекулярной биологии окончательно вытеснили плавление ДНК и другие биофизические методы. Но наступает новая эпоха в молекулярной биологии и молекулярной медицине - эпоха полимеразной цепной реакции, которая основана на...плавлении ДНК. Этот метод предоставляет уникальную возможность изучать единичные копии молекул ДНК или фрагментов генома. И поэтому полностью логичным выглядит то, что мы продолжили наши исследования в области ПЦР и ее возможных применений.

Достигнутый в настоящее время прогресс в изучении молекулярных механизмов взаимодействия синтетических и природных биологически активных соединений с нуклеиновыми кислотами позволил выявить основные закономерности процесса комплексообразования. Эти знания являются основой для понимания механизмов таких процессов, как мутагенез, канцерогенез. В то же время комплексы нуклеиновых кислот с низкомолекулярными лигандами являются модельными соединениями для изучения общих принципов белково-нуклеино-вого взаимодействия и регуляции экспрессии генов. Низкомолекулярные лиган-

ды, взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами, распространены при проведении цитологических, биохимических, молекулярно-генетических исследований. Они используются как флуоресцентные метки для высокочувствительного детектирования нуклеиновых кислот, а также как маркеры погибших клеток, регуляторы генной активности. В цитогенетическом анализе широкое распространение получил метод дифференциального окрашивания хромосом. Несмотря на рутинное применение разных видов окрашивания метафазных хромосом (MX), природа дифференциального окрашивания хромосомных полос не установлена. С одной стороны, принято считать, что чередующиеся полосы на MX не могут быть объяснены только расхождением в АТ-составе оснований полос; образующиеся полосы должны отличаться структурной организацией фрагментов хромосом. С другой стороны, для G-, Q-, R-методов окрашивания MX используют красители Гимза, акрихин, дауномицин, считающиеся АТ-спе-цифичными. Однако литературные данные относительно специфичности этих лигандов, а также других красителей, использующихся для дифференциального окрашивания хромосом (антрациклиновых антибиотиков, современных циани-новых лигандов YOYO, ТОТО), крайне противоречивы [7-16].

Актуальность темы. В лабораторной диагностике используют несколько методов индикации возбудителей: иммуноферментный анализ (ИФА), который позволяет выявлять белки микроорганизмов; непрямой ИФА, с помощью которого детектируют антитела к возбудителям; реакция иммунодиффузии в агаре (РИД), электрофорез в полиакриламидном геле и иммуноблотинг. При массовом скрининге наиболее широко используются РИД и ИФА. В клинической микробиологии находят широкое применение молекулярно-биологические методы исследований. Для выявления и идентификации патогенных микроорганизмов используют методы молекулярной гибридизации, полимеразной цепной реакции, рестрикционный анализ хромосомной и плазмидной ДНК.

Традиционные микробиологические методы диагностики характеризуются значительной длительностью исследования, большой трудоемкостью, не всегда надежны и часто не позволяют в полной мере оценить биологические свойства

возбудителя. В связи с этим важной задачей является разработка новых ускоренных, прямых высокочувствительных и специфичных методов диагностики, которые обеспечивают раннее выявление возбудителя и изучение его биологических свойств. Этим требованиям наиболее полно соответствует метод детекции, основанный на использовании ПЦР, который позволяет на протяжении нескольких часов эффективно определять в разных биологических материалах наличие микроорганизмов, которые с трудом или не культивируются in vitro, и идентифицировать факторы патогенности. ПЦР открыла широчайшие возможности в диагностике ряда инфекций бактериальной этиологии, таких, как дифтерия, туберкулез, менннгококковая инфекция, хламидиоз [17-20].

В странах СНГ существуют лаборатории и центры молекулярной диагностики, использующие ПЦР как подтверждающий метод для детекции вирусных и бактериальных возбудителей. Однако широкое внедрение ПЦР в клиническую практику тормозится из-за некачественного выбора в большинстве случаев олигонуклеотидных праймеров (основных компонентов тест-систем ПЦР, отвечающих за специфичность метода). При рутинном использовании ШДР-детекции возникают трудности в интерпретации результатов, поскольку совпадение данных ИФА и ПЦР-анализа по выявлению ДНК составляет 60-100 %, а для РНК - до 60 % [21]. В связи с этим является актуальным создание методики конструирования праймеров для ПЦР-детекции.

Разработка тест-систем для ПЦР-детекции инфекционных возбудителей бактериальной и вирусной этиологии и внедрение их в практику диагностических лабораторий позволит существенно повысить уровень и качество ранней диагностики.

Некоторые биологически активные соединения являются распространенными противоопухолевыми препаратами. Исследования механизма специфичного взаимодействия лиганд - нуклеиновая кислота необходимы для определения наилучших сайтов связывания противоопухолевых лекарств с нуклеиновыми кислотами. Особый интерес вызывают антрациклины - для них показано, что именно взаимодействие с нуклеиновыми кислотами отвечает за их противо-

опухолевую активность. Несмотря на большое количество работ по различным аспектам специфичности при взаимодействии этих антибиотиков с нуклеиновыми кислотами, особенности этого явления к моменту начала наших исследований еще не были полностью установлены, а некоторые экспериментальные результаты противоречили друг другу.

Связь работы с научными программами, планами, темами. Диссертационная работа связана с плановой тематикой лаборатории экспериментально-прикладной молекулярной диагностики ХНИИМИ: НИР ЦФ.16.97 "Разработка экспресс-метода ранней молекулярной диагностики и идентификации менингококков", № госрегистрации 0197U014326; НИР ЦФ.4.26.98 "Разработка метода ранней молекулярной диагностики и идентификации листерий. Изучение особенностей организации генома возбудителя", № госрегистрации 0198U002480.

Цель и задачи исследования. Целью исследования стала разработка метода ранней молекулярной детекции инфекционных возбудителей на основе по-лимеразной цепной реакции, а также изучение особенностей специфичности взаимодействия противомикробных акридиновых препаратов акрихина и 9-аминоакридина и противоопухолевых антрациклиновых антибиотиков аклаци-номицина А и адриамицина с ДНК микроорганизмов. Исходя из существующего состояния проблемы взаимодействия биологически активных соединений с нуклеиновыми кислотами, предусматривалось выполнение следующих задач:

1. Рассмотреть модели плавления и взаимодействия амплифицируемого продукта и праймеров при проведении полимеразной цепной реакции, а также подходы, позволяющие увеличить чувствительность ПЦР-детекции.

2. Создать универсальный метод конструирования тест-систем для ПЦР-детек-ции, который учитывает особенности организации генома инфекционного возбудителя, а также термодинамику плавления праймеров и продукта ГИДР.

3. Провести компьютерный анализ последовательностей секвенированных изо-лятов Neisseria meningitidis, цитомегаловируса человека, вирусов гепатита В, С и G, вируса лейкоза крупного рогатого скота из баз данных EMBL и GenBank и определить фрагменты геномов инфекционных агентов со 100 % степенью го-

мологии.

4. Сконструировать тест-системы для однораундовой и двухраундовой (гнездовой) ПЦР-детекции вирусов гепатита В, С, Neisseria meningitidis, цитомегалови-руса человека, вируса лейкоза крупного рогатого скота.

5. Провести экспериментальные и теоретические исследования специфичности и чувствительности разработанных тест-систем для ПЦР-детекции цитомегало-вируса человека.

6. Провести экспериментальное сравнение сконструированных тест-систем для ПЦР-детекции BJIКРС с существующими тест-системами.

7. Разработать экспериментальный метод определения специфичности взаимодействия биологически активных соединений с нуклеиновыми кислотами, позволяющий выявлять специфичность лигандов по отношению к AT- или GC-богатым фрагментам ДНК.

Научная новизна полученных результатов. Все приведенные в работе данные получены автором впервые.

Впервые предложен универсальный алгоритм конструирования тест-систем для ПЦР-детекции, в котором учитываются особенности организации генома инфекционного агента, а также термо