Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Технологии получения и использования ДНК-аптамеров для разработки новых средств диагностики и терапии

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Технологии получения и использования ДНК-аптамеров для разработки новых средств диагностики и терапии"

На правах рукописи

ЗАМАИ АННА СЕРГЕЕВНА

ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДНК-АПТАМЕРОВ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ

03.01.04 биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

4 ДЕК 2014

005556229

Новосибирск - 2014

005556229

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Салмина Алла Борисовна Ph.D., профессор Березовский Максим Валентинович

Официальные оппоненты:

Ильичев Александр Алексеевич доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биоинженерии Федерального бюджетного учреждения науки Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор»;

Гуляева Людмила Федоровна доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук; Покровский Андрей Георгиевич доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет».

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт терапии и профилактической медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится «¿¿^» Pg^&vJj? 2014 г. в /&>часов на заседании диссертационного совета Д^001.034^01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу; 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН и на сайте http://niibch.ги

Автореферат разослан «_» _2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Русских Галина Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Разработка новых методов диагностики и терапии является одной из наиболее актуальных задач биологии и медицины, направленной на развитие персонализированной медицины, основная цель которой — выявление специфических молекулярных маркеров и адресное воздействие на них для достижения нужного терапевтического эффекта. Согласно современным технологиям, выявление молекулярных маркеров реализуется посредством: (1) определения и сравнения протеомов нормальных и патологических клеток; (2) выявления статистически значимых качественных и количественных различий в составе белков; (3) верификации идентифицированных биомаркеров.

Таким образом, поиск и идентификация молекулярных маркеров — сложный многоэтапный процесс, который, тем не менее, не всегда приводит к положительным результатам, поскольку при поиске маркеров необходимо качественно и количественно сравнить между собой композицию из сотен тысяч белков. Небольшое число белков присутствует в подавляющей массе, а специфические белки содержатся в клетках, как правило, в следовых количествах и при их идентификации могут быть утеряны. По этой причине количество молекулярных маркеров, успешно применяемых в клинических исследованиях для диагностики различных патологий, крайне мало.

Иной подход в поиске молекулярных маркеров заключается в технологии, позволяющей использовать аптамеры для аффинного обогащения специфических для определенного заболевания белков с последующей их идентификацией или без нее.

Аптамеры представляют собой фрагменты одноцепочечной РНК или ДНК, которые, благодаря уникальной трехмерной конформации, способны с высокой степенью аффинности и селективности связываться с функциональными группами своих биологических мишеней (Ellington А., Szostak J., 1990; Tuerk С., Gold L„ 1990; Spiridonova V.A., Kopylov A.M., 2002). Функционально аптамеры представляют собой аналоги естественных антител, обладающих в силу своих физико-химических свойств и способа получения рядом преимуществ по сравнению с естественными антителами, такие как стабильность, слабая иммуногенность (Ulrich H., 2006). Благодаря способности связываться со своей мишенью аптамеры могут изменять функциональное состояние клетки, в частности, проявлять противоопухолевую активность (Keefe A.D., 2010; Meyer С., 2011). Для выявления начальных стадий патологических процессов требуются очень чувствительные методы, позволяющие определять даже незначительные биохимические изменения, которые не могут быть идентифицированы с помощью традиционных методов исследований.

Выбор аптамеров основан на скрининге большого числа последовательностей в библиотеках in vitro, благодаря чему удается подобрать аптамеры с высокой специфичностью практически к любой мишени — от маленьких неорганических ионов до интактных клеток. Выбранный пул аптамеров можно амплифииировать, а, зная последовательность нуклеотидов в нем, химически синтезировать с высокой чистотой любое необходимое количество. Простота химической структуры позволяет модифицировать аптамеры с помощью любых функциональных групп для различных целей. Кроме прочего, аптамеры гораздо стабильнее антител, что делает их незаменимыми при работе с высокими температурами и экстремальными значениями рН. Варьируя условия селекции, используя различные рандомизированные библиотеки олигонуклеотидов, вводя дополнительные стадии селекции с использованием разного оборудования, можно добиться получения аптамеров с желаемыми характеристиками.

Не существует универсальной технологии селекции, подходящей для любых объектов, поэтому для получения аптамеров требуется постоянная оптимизация. Несмотря на многообразие способов селекций, исследователи сталкиваются с проблемами неспецифического связывания и повторяющихся последовательностей нуклеотидов в аптамере к определенной мишени. Технологию SELEX можно применять к разнообразным мишеням, но не для всех молекул можно подобрать аптамеры. Так, селекция к гидрофобным и отрицательно-заряженным (с фосфатными группами) молекулам достаточно затруднительна.

Особенностью селекции является «слепой» выбор аптамеров, т.е. исследователь заранее не знает конкретных сайтов связывания олигонуклеотида с молекулой. Поэтому в некоторых случаях требуются дополнительные исследования взаимодействий аптамер-мишень и идентификация эпитопов связывания. Кроме того, вся процедура получения высокоаффинных и специфичных аптамеров занимает достаточно много времени и выполняется, в основном, вручную, несмотря на существование автоматизированных роботизированных станций и микрочиповых платформ для селекции (Hybarger et al., 2006). Таким образом, несмотря на растущее число публикаций по созданию новых способов селекции и их оптимизации, разработка технологий создания аптамеров с желаемыми характеристиками для различных мишеней все еще актуальна.

Цель исследования

Разработка технологии создания аптамеров и аптаконструкций с заданными свойствами для адресной доставки средств диагностики и терапии к различным биологическим мишеням.

Задачи исследования

1. Адаптировать универсальную технологию SELEX для получения аптамеров с заданными свойствами к вирусам, бактериям, целым клеткам, органеллам и тканям.

2. Адаптировать метод in vivo SELEX для получения аптамеров с заданными свойствами на примере последовательностей, проходящих через гематоэнцефалический барьер.

3. Разработать методику селекции для получения аптамеров к заданным эпитопам.

4. Разработать метод и получить средства адресной доставки аптамеров к внутриклеточным мишеням.

5. Разработать способы диагностики рака легкого человека на основе аптамеров.

6. Создать электрохимические биосенсоры на основе аптамеров для идентификации микроорганизмов и вирусов, определения их жизнеспособности, анализа аффинности и эпитоп-специфичности аптамеров.

7. Разработать технологию получения комплекса онколитических вирусов с аптамерами для улучшения их терапевтических свойств.

8. Определить биологические эффекты аптамеров на раковые и бактериальные клетки.

9. Разработать технологию поиска белковых мишеней аптамеров.

Научная новизна работы

1. Впервые проведена селекция ДНК-аптамеров к тканям рака легкого человека с применением негативной селекции к условно здоровым тканям легкого и цельной крови здорового человека.

2. Впервые получены последовательности аптамеров с высокой селективностью к аденокарциноме и плоскоклеточному раку легкого, способные идентифицировать циркулирующие опухолевые клетки крови онкобольных.

3. Разработаны новые способы диагностики рака легкого, основанные на идентификации циркулирующих опухолевых клеток с помощью аптамеров.

4. Найдена новая последовательность ДНК-аптамеров, вызывающая апоптоз клеток рака легкого человека in vitro.

5. Впервые для доставки внутрь клеток аптамеров с противоопухолевыми свойствами in vitro и in vivo использовали арабиногалактан.

6. Впервые были получены ДНК-аптамеры к бактериям двух серотипов сальмонелл — S. enteritidis и S. typhimurium, обладающие бактериостатическим эффектом, что показывает возможность создания на основе ДНК-аптамеров антибактериальных препаратов нового поколения.

7. Впервые ДНК-аптамеры были использованы для создания метода определения чувствительности сальмонелл S. enteritidis и S. typhimurium к антибактериальным препаратам.

8. Впервые на основе ДНК-аптамеров был разработан метод выявления возбудителей сальмонеллеза S. enteritidis и typhimurium в биологических жидкостях и продуктах питания.

9. Впервые получены аптамеры к онколитическим вирусам.

10. Идея маскирования вирусов от нейтрализующих антител с помощью аптамеров является новой и впервые применена к вирусу везикулярного стоматита.

11. Разработаны новые электрохимические биосенсоры на основе аптамеров для идентификации и определения жизнеспособности микроорганизмов.

12. Созданы биосенсоры для определения аффинности аптамеров и определения их эпитоп-специфичности.

13. Впервые проведена масс-спектрометрическая идентификация мишеней аптамеров, выделенных с помощью аффинного обогащения.

Положения, выносимые на защиту

1. С помощью технологии SELEX in vitro получены высокоспецифичные ДНК-аптамеры к онколитическим вирусам, бактериям S. enteritidis и S. typhimurium, anti-VSV антителам, опухолевым клеткам асцитной карциномы Эрлиха, опухолевым тканям легкого человека, цитокератинам, in vivo - аптамеры, проходящие через гематоэнцефалический барьер.

2. На основе полученных ДНК-аптамеров можно идентифицировать циркулирующие опухолевые клетки в крови онкобольных, бактерии S. enteritidis и S. typhimurium в биологических жидкостях и смывах с пищевых продуктов, онколитические вирусы.

3. На основе ДНК-аптамеров созданы биосенсоры для определения жизнеспособности и типирования микроорганизмов, детекции опухолевых клеток (флуоресцентная и конфокальная микроскопия, электрохимические датчики, микрофлуидные устройства).

4. ДНК-аптамеры обладают противоопухолевым эффектом в условиях in vitro и in vivo.

5. ДНК-аптамеры к сальмонеллам S. enteritidis и S. typhimurium обладают бактериостатическим эффектом.

6. Метод аффинного обогащения с помощью аптамеров с последующей масс-спектрометрической идентификацией позволяет находить мишени аптамеров.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты работы будут востребованы для изучения проблем узнавания на молекулярном уровне и передачи информации в биологических системах. Новая универсальная технология селекции аптамеров к определенным эпитопам может быть применена для любых мишеней. Новые алгоритмы селекции ДНК-аптамеров с заданными свойствами,

предложенные в работе, могут быть использованы для получения биологически активных молекул и биосенсоров для медицинских целей.

Разработанные технологии использования ДНК-аптамеров в качестве молекулярных зондов с заданной специфичностью к определенным мишеням могут быть применимы для создания автоматизированных методов диагностики. Разработанные аптасенсоры (флуоресцентные, электрохимические, мирофлуидные) могут быть адаптированы для любых других пар аптамер/мишень и применяться как в научных целях, так и в практическом здравоохранении.

Результаты работы по исследованию структуры и функциональной активности аптамеров, выявление их биологического действия, особенно противоопухолевого и бактериостатического эффектов, могут быть использованы при создании терапевтических средств для медицинских целей.

Технологии поиска белковых мишеней аптамеров могут быть использованы в научных целях для выявления в белках-мишенях консервативных и функционально-активных участков и при изучении биологической активности макромолекул. Этот подход позволит решать проблемы функционирования белков и их комплексов с ДНК в биологических объектах, изучения молекулярной организации активных комплексов, выяснения путей метаболизма и их взаимосвязей.

Степень достоверности результатов

Результаты получены на современном оборудовании с использованием стандартизированных методик и программ.

Селекция аптамеров проведена с использованием термоциклера SeiisoQuest (Германия), Eppendorf (США). Контроль селекции аптамеров осуществляли с использованием гель-документирующей системы GBOX/EF2-E.

Секвенирование последовательностей аптамеров было проведено «Génome Québec Innovation Centre» (Канада). Последовательности аптамеров были синтезированы «Integrated DNA Techonologies» (США).

Определение аффинности и специфичности аптамеров проводили на проточном цитометре Beckman Coulter FC-500, Galios (США).

Результаты анализировали с использованием программного обеспечения: Kaluza 1.1, MaxQuant 1.3, SIMCA, FlowJo, FlowingSoftware 2.5.1, Microsoft Excel 2007, Origin 6.0, базе данных UniProtKB/Swiss-Prot.

Внедрение результатов исследования

Методический материал по селекции аптамеров включен в курс лекций по биотехнологии для студентов 5 курса КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России.

Полученные аптамеры и методики используются в научно-исследовательской работе лаборатории на базе НИИ Молекулярной

медицины и патобиохимии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России при создании тест-систем для выявления возбудителей сальмонеллеза и циркулирующих опухолевых клеток.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 334 страницах машинописного текста и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 140 рисунками, 15 таблицами. В список литературы включено 17 отечественных и 345 зарубежных источников литературы.

Апробация работы

Результаты исследования представлялись на всероссийской конференции с международным участием «Научно-практические аспекты модернизации онкологической службы регионального уровня» (2012); X съезде научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (2012); семинарах ассоциированной Российско-Канадской лаборатории BioMeT (2011-1014); Jasper Innovation Forum Global North 2050 (Джаспер, Канада, 2011); 94th Canadian Chemistry Conference and Exhibition Chemistry and Health (Монреаль, Канада, 2011); 3 international conference on connections of biophysical and biophysiological research at CSMU (Чиа-и, Тайвань, 2012); Международном Симпозиуме 13th Tetrahedron Symposium, (Тайбэй, Тайвань, 2012); 2nd China-Canada Systems Biology Symposium (CCSB) and the 19th Methods in Protein Structure Analysis (Оттава, Канада, 2012); 20th International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. (Монреаль, Канада, 2012); Oligonucleic acid Therapeutic Society, 2013 г. (Неаполь, Италия), Aptamers in Medicine and Perspectives (Неаполь, Италия 2013), Europa 2013 Scientific Meeting.-Saint-Malo, France, 2013; 1st International Symposium and Exibition Aptamers (Оксфорд, Великобритания, 2014), Advances in Biodetection & Biosensors, (Берлин, Германия, 2014).

Публикации

Основные положения диссертации опубликованы в 23 статьях. 14 из которых - в зарубежных журналах, 9 — в российских журналах, рекомендованных ВАК, 3 патентах и 22 тезисах на зарубежных конференциях.

Личный вклад автора

Автором были самостоятельно спланированы эксперименты и сформулированы научные гипотезы, лично проведено большинство

исследований и проанализированы полученные результаты. Публикации по результатам исследований были написаны совместно с коллегами творческого коллектива лаборатории. Все главы диссертации были написаны автором самостоятельно.

Численное моделирование траектории частиц в микрофлуидном биочипе с помощью диэлектрофореза осуществлено при участии д.ф.-м.н., профессора В.В. Денисенко. Сепарацию опухолевых клеток в микрофлуидном биочипе с помощью диэлектрофореза проводили совместно с профессором Чун-Пин Дженом (Тайвань). Масс-спектрометрические исследования были проведены ассистентом кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Глазыриным Ю.Е.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации и Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (Государственный контракт № 16.512.11.2090; Государственный контракт № 16.512.11.2107).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследований были: опухолевая ткань легкого человека, бактерии S.enteritidis и S.typhimitriiim, асцитная карцинома Эрлиха, клеточные линии Vero, HuH-7, А549, MRC-5, онколитические вирусы Vesicular stomatitis и Vaccinia JX594.

Для селекции использовали одноцепочечную библиотеку ДНК-аптамеров длиной 80 нуклеотндов (N40), в которой центральная область из 40 нуклеотндов рандомизирована и ограничена с обеих сторон сайтами гибридизации для праймеров длиной 20 нуклеотндов (5'-СТС СТС CTG TG А ТАА CCA CG-(N) 40-GCATAG GTA GTC CAG AAG СС-3').

В одноцепочечной библиотеке ДНК-аптамеров длиной 100 нуклеотндов (N60) центральная область из 60 нуклеотндов рандомизирована и ограничена с обеих сторон сайтами гибридизации для праймеров длиной 20 нуклеотидов (5'-СТС СТС TGA CTG ТАА CCA CG(N) (N1)(N)(N1) (N)(N1)(N) (N1)(N2)(N2) (N2)(N2)(N) (N1)(N)(N1) (N)(N1)(N) (N1)(N)(N1) (N2)(N2)(N2) (N)(N1)(N) (N1)(N)(N1) (N)(N1)(N) (N1)(N2)(N2) (N2)(N2)(N) G CAT AGG TAG TCC AGA AGC С), где N = 45:05:45:05 A/C/G/T; N1 = 05:45:05:45 A/C/G/T; N2 = 25:25:25:25 A/C/G/T.

Синтетические аптамеры были мечены с 5'-конца метками FAM и Су-3 в центральной рандомизированной части аптамера. Все олигонуклеотиды были синтезированы в Integrated DNA Technologies (Iowa, USA).

Исследования были проведены с использованием проточного цитометра Beckman Coulter Cytomics FC 500; флуоресцентных микроскопов

Olympus BX 41 и Olympus Fluoview lOvi (Olympus Optical Co., Япония); Nanodrop 2000 Thermoscientific; вакуумной центрифуги Scan Vac VacSafe 15 (LaboGene ApS, Denmark); гель-документирующей системы GBOX/EF2-E; камеры для горизонтального электрофореза; амплификатора; камеры j.i-Slide Chemotaxis (IBIDI Integrated BioDiagnosis, США); масс-спектрометра Orbitrap; электрохимического анализатора (США); спектрофлуориметра Aminco Bowman Series 2, Thermo Spectronic (США); флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss Axiostar plus, Microm HM 650V и др.

Работа выполнена на базе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого. Часть работ по пробоподготовке выполнена на базе Красноярского краевого клинического онкологического диспансера им. А.И. Крыжановского. Часть исследований была проведена в Университете Оттавы (Оттава, Канада) и Национальном Чунг Ченг Университете (Чиа-И, Тайвань).

Все исследования осуществлялись в строгом соответствии с документами, регламентирующими этические нормы проведения исследований с использованием биологического материала человеческого происхождения (решение Локального этического комитета КрасГМУ № 37/2012 от 31.01.2012, решение Локального этического комитета КККОД № 8/2011 от 16.03.2011). Манипуляции с животными проводили в соответствии с рекомендациями «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health» и были одобрены этическим комитетом Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого и этическим комитетом Красноярского краевого онкологического диспансера им. А.И. Крыжановского.

Для анализа данных использовали программы «Kaluzal.l», «Microsoft Office Exel 2007», «CELL F Imaging software for Life Science Microscopy», «MaxQuant 1.3».

1. Селекция ДНК-аптамеров, определение аффинности и специфичности связывания естественных пулов аптамеров

В работе описаны авторские стратегии in vitro и in vivo получения высокоспецифичных ДНК-аптамеров к онколитическим вирусам, бактериям S. enteritidis и S. typhimurium, опухолевым тканям легкого человека (рис.1), anti-VSV антителам, асцитным клеткам карциномы Эрлиха и цитокератинам, in vivo — ДНК-аптамеров, проходящих через гематоэнцефалический барьер (рис.2).

(йделезав юшжтся

Неги*»«* «Я&ЦЙ* с улеэдмикрсвй

Отдам»!« неев«8ШИ£Я

j^. Пезягшш тяжу*

\ ¿ Огяшмв

.¿Ж/ ?«в»авшю«» аиамро»

Негативная о

аашерев к ¿йвяирвааняе

раса шт

Í. ствяцш

* «w«cu баж»а})мй

Отбор лжпяхаацпися

Z Позитивная сит&сция к ЗШхшЯа

Рисунок 1 — Схема in vitro селекции ДНК-аптамеров к опухолевой ткани легкого (слева) и возбудителям сальмонеллеза (справа).

/ Схема селекции аптамеров in vivo \

Инъекция библиегте^и жг&лврт

Выдеятн-и разных отделов 3-ÍQ рщндт

гояозншо мозга

Амаяификацмл аптамеров т igfti,,- разных отдало© гъяоынеяъ мозга

V. ^ У

Рисунок 2 - Схема ¡n vivo селекции ДНК-аптамеров, проходящих через гематоэнцефалический барьер.

Селекцию аптамеров с использованием технологии cell-SELEX (Sefah К., 2010) проводили из одноцепочечных библиотек ДНК-аптамеров из 80 или 100 нуклеотидов в течение нескольких раундов позитивной и негативной селекции с обогащением пула последовательностями, наиболее специфичными и аффинными к мишеням. Перед каждым раундом селекции и другими экспериментами оцДНК-библиотеку или пул денатурировали в

течение 5 минут при 95°С, после чего 10 минут ренатурировали на льду. В первом раунде проводили позитивную селекцию.

Несвязавшиеся с мишенями олигонуклеотиды отмывали центрифугированием несколько раз, при этом объем промывочного буфера и количество отмывок мог варьировать. Связавшиеся олигонуклеотиды, находящиеся в осадке после центрифугирования, отделяли от биологической мишени с помощью их денатурирования в ТЕ-буфере при 95°С с последующим осаждением с помощью центрифугирования. Далее надосадок, содержащий аптамеры, собирали и проводили симметричную и асимметричную полимеразные цепные реакции.

Второй и все последующие раунды начинали с негативной и заканчивали позитивной селекцией. Во время негативной селекции аптамеры-кандидаты предыдущего раунда инкубировали в тех же условиях с теми мишенями, с которыми связывание нежелательно. После удаления центрифугированием последовательностей, связавшихся с негативными мишенями, проводили позитивную селекцию аптамеров по описанному выше принципу. Количество раундов селекции зависело от типа мишени и варьировало от 4-х до 13-ти раундов.

2. Использование ДНК-аптамеров для идентификации биологических

мишеней

Пулы аптамеров с характеристиками, наилучшим образом удовлетворяющие потребностям в диагностике и терапии, после бактериального клонирования были секвенированы. Для проведения дальнейших исследований использовались только синтетические ДНК-аптамеры. ДНК-аптамеры использовали для идентификации циркулирующих опухолевых клеток в крови онкобольных, онколитических вирусов и бактерий еМегШсИя и 5. (урЬ/тиг/ит.

Аффинность и специфичность синтетических ДНК-аптамеров к опухолевой ткани легкого, исследованная с помощью проточной цитометрии, показана на рисунке 3. Выявление опухолевых клеток легкого, меченных ДНК-аптамерами и антителами к цитокератинам, с помощью конфокальной микроскопии представлено на рисунках 4 и 5. Идентификация циркулирующих опухолевых клеток в крови онкобольных с помощью ДНК-аптамеров, проиллюстрирована рисунком 6.

..........................................................................................

1 щ * 1 щ

3 ......|..................| т щ

1 II ж Ц I

Iи -Я- с а к I

I" ......■......Ц......1 Ж..... 1 ,....

ц .....н.....| ......Я......ж.....я 8 1

.....|§

1 " 1...... I. 1 «г Щ а -* г г- ,.. г

« 4> # -г" г* * £ £ ^ 4*

Рисунок 3 - Аффинность и специфичность ДНК-аптамеров к опухолевой

ткани легкого.

шттш.. а&ша 1в 'Ф А ' 'ЩШ& ' Ш МВ? ■ ■ 1 И11д0111РД1у111 ШЩЁШ^ЩШ ШШШМШЯВШпЯт

ШШв® ■к шш ШщшЩШШШШ 28 ■ , . *; . *Щ ШМЩ|

Рисунок 4 — Клетки аденокарциномы легкого, связанные с аптамерами 110 80, меченными меткой Су'З (красный) и антителами к цитокератинам, меченными меткой Р1ТС (зеленый). Увеличение - 60Х.

' V 1В

• 28 2С <и

Рисунок 5 - Клетки аденокарциномы легкого, проинкубированные с аптамерами 183 80. меченными Су'З (красный) и антителами к цитокератинам, меченными ПТС (зеленый). Увеличение - 60Х.

Рисунок 6 - Образцы периферической крови больного аденокарциномой легкого, окрашенные с помощью антител к цитокератинам, меченных флуоресцентной меткой FI ТС (IB, 2В, ЗВ), и аптамеров, меченных флуоресцентной меткой Су'З (1С, 2С, ЗС). 1А, 2А, ЗА —световая микроскопия, 1В, 1С, 2В, 2С, ЗВ, 3С — флуоресцентная микроскопия.

Увеличение — 100Х. Исследования по выявлению возбудителей сальмонеллеза были проведены в различных жидкостях с различным количеством бактерий. Для исследований были выбраны аптамеры с наилучшей аффинностью и специфичностью к S.enteritidis и S.typhimurmm, которые хорошо связывались с сальмонеллами и гораздо в меньшей степени - с ДНК-библиотекой, бактериями E.coli, S.aureus, C.freundi, Р.aeruginosa и сальмонеллами, подвергшимися обработке высокой температурой.

Исследования были проведены на смывах с кур, купленных в торговой сети, и культурах, полученных из клинических образцов. Исследования, проведенные на смывах кур из торговой сети, показали наличие в них сальмонелл серотипа S.enteritidis (рис.7). Для доказательства того, что флуоресценция связана с наличием сальмонелл S.enteritidis, кур дополнительно искусственно контаминировали сальмонеллами, а затем вновь делали смывы (рис.8).

1..1 Бактерии окраииные ашэшром 5Е20вшыег с мяса птицы, ис«усствеинозарзжгиюто5Г Ы Бактерии гафашашые жгамером БЕ20в ошпесмяса птицы, искуссгаешюзаражгмюга 5Е

Г] Нв№рашениькЬа}{тер«« есмьш^ с «шктногоый!*2 птицы

Ой 69 659 «»,оо

67981 100,(Ю

□ А« Ш56 100,00

□л 73 035 КО,00

□« 19953 28,64

0« 39077 57,«

□« 13 771 19,74

0« 1 0,00

Интенсивность флуоресценции

Рисунок 7 - Выявление Б.еп¡егШсИэ в смывах с образцов куриной тушки (черная кривая); куриной тушки, контаминированной Б.еМегШсИя (синяя кривая); куриной тушки, контаминированной Xгур/гипигшт (зеленая кривая); красная кривая соответствует неокрашенным бактериям. Выявление 5'.е/КегШсИя проведено с помощью аптамера 8Е-20_80.

Кроме смывов с куриных тушек и модельных экспериментов с использованием ДНК-аптамеров к сальмонеллам проведено исследование 128 клинических образцов, полученных из Роспотребнадзора. Испытания клинических образцов, содержащих возбудителей сальмонеллеза Ъ.еМегП'кИх и Б^рЫтиг'пчп, проводили с помощью ДНК-аптамеров на проточном цитометре. Исследования клинических образцов с помощью ДНК-аптамеров показали реальную возможность их использования для создания метода выявления возбудителей сальмонеллеза.

У Неочищенные бактерии в таыве с икгасииго «о пжцы

О Бактерии мраштме «памерсм Я12 в сжывесмяса птицыияусственно зараженного 5£ бактерии окрзшше атажрш 5П2 в шмес ша пищынауспиенчо зара*»»го5Г

число % от обцего числе

70195 100.00

» 455 100,00

та 130.00

АН 71 838 100,00

0 N/4

К 0,0?

11 0.02

1520 2.12

Иетенавшьфлуоресцещй*

Рисунок 8 - Выявление $АурЫтиг 'тт в смывах с образцов куриной тушки (черная кривая); куриной тушки, зараженной 5.етегШсНа (синяя кривая);

15

куриной тушки, зараженной S.typhimurium (зеленая кривая); красная кривая соответствует неокрашенным бактериям. Выявление S.typhimurium проведено с помощью аптамера ST-12_80.

3. Биосенсоры на основе иммобилизованных ДНК-аптамеров для детекции бактерий, вирусов и опухолевых клеток

Аптамеры обладают высокой специфичностью по отношению к своим мишеням, что является хорошим основанием для их использования в качестве основы биосенсоров для индикации определенных молекул или процессов. Применение аптамеров позволяет решать важнейшие задачи биологии и медицины, направленные на распознавание специфических молекулярных маркеров. Одним из наиболее перспективных способов детекции является электрохимический биосенсор, представляющий собой устройство, сочетающее в себе электрохимический блок трансдукции и детектор, где аптамеры являются элементом распознавания.

В нашей работе мы использовали ДНК-аптамеры для разработки биосенсоров для типирования микроорганизмов, измерения жизнеспособности бактерий и вирусов, количественного и качественного анализа аптамерных последовательностей, определения аффинности, специфичности аптамеров, эпитопов связывания аптамеров и идентификации циркулирующих раковых клеток.

Биосенсор на основе аптамеров для оценки жизнеспособности бактерий (AptaVISens-B), измеряющий импеданс, был разработан на примере сальмонеллы S.typhimurium. В основе датчика предлагаемого биосенсора лежит способность аптамеров селективно связываться только с живыми бактериями. Разработанный датчик основан на аптамерах к живым S.typhimurium, модифицированных гиоловыми группами и иммобилизированных на наночастицах золота, напечатанных на угольных электродах GNPs-SPCE.

Электрохимический импеданс (EIS) измеряли, используя различное содержание бактерий. Сопротивление представлялось суммой реальной и мнимой Z компоненты. Связывание между бактериями и соответствующими аптамерами блокировало перенос электрона из раствора на поверхность электрода, что было связано со стерическими препятствиями от громоздких бактериальных клеток. Кроме того, отталкивание между отрицательно заряженной поверхностью бактериальной клетки и окислительно-восстановительными анионными зондами [Fe(CN)6]3"/4~ способствовало увеличению межфазного сопротивления, наблюдающегося при связывании бактерий с соответствующими аптамерами (рис.9).

Рисунок 9 — Схема электрохимического сенсора на основе аптамеров для идентификации бактерий (слева) и результаты измерения сопротивления с помощью электрохимического биосенсора после иммобилизации аптамеров и инкубации с бактериями (справа). Скорость сканирования 100 м У/сек, где (а) чистый электрод; (Ь) электрод с иммобилизованными аптамерами к Л'. 1урЫтигЫт\ (с) блокировка 0,1 мМ 2-меркаптоэтанолом. (В) Отношения спектров импеданса (-гт против гге) (а) 1х 103, (Ь) 0,5 х Ю4, (с) 1 х Ю4, (с!) 0.5 х Ю5, и (е) 1 х 105 КОЕ/мл 5. гурЫтигтт в буфере БРВв. Правая вставка представляет схему измеренных данных. Левая вставка - калибровочный график зависимости сопротивления от переноса заряда (ЯСТ) относительно логарифмической зависимости концентрации 5. ЦрЫтипит. Спектры импеданса представлены от 100 кГц до ОД Гц.

4. Биологические эффекты ДНК-аптамеров Отличительной особенностью аптамеров является то. что они могут применяться как для идентификации мишеней, так и в качестве терапевтических средств. При этом аптамеры могут вызывать разные биологические эффекты при связывании со своей мишенью, подавляя или, наоборот, индуцируя ее биологическую активность.

4.1 Биологический эффект аптамеров к возбудителям сальмонеллеза

Исследования биологического эффекта аптамеров к возбудителям сальмонеллеза оценивали классическим бактериологическим методом (рис.10). Выявлено, что в целом синтетические аптамеры подавляли рост бактерий. Ингибирование роста колоний Б.етегШсИв проявлялось при

воздействии аптамера БЕ-20_60 и составляло 43±4%, аптамер ЭТ-12_б0 подавлял рост бактерий 8.1урЫтигтт на 62±12%. Максимальное подавление роста было вызвано пулами аптамеров. Пул аптамеров к Б.еМегИкНй снижал бактериальный рост на 73±15%, а пул аптамеров к Б.1урЫтигтт — на 75±15%. ОцДНК-библиотека не оказывала существенного влияния на рост колоний бактерий (рис.11). В то же время некоторые аптамеры вызывали увеличение роста колоний сальмонелл по сравнению с контролем.

щшшшяЖ

^ииирИ

• .-Ж

Рисунок 10 — Подавление роста колоний сальмонелл БЛурЫтючит с помощью пула аптамеров к БЛурЫтигшт. Слева — контроль, справа - рост колоний после инкубации бактерий с аптамерами.

ПодавМййе роста колоний $а1тепе11а ТурМтаИит, % ОТ котральжго образца

» --—..............................................—-———------. . .

1

ШЩ ш

1.......................■______

! в ■ и 1 в _

I I I I I I йл *

1 I II I

Й ®

£ ^

о а ьа ш зн би т п± т т и -я т <м и м «.? т и м « п.» м « ш

Рисунок 11 - Бактериостатический эффект аптамеров на рост Х(урЬштггит. 4.2 Маскирование онколитических вирусов от нейтрализующих антител

с помощью аптамеров

Терапия онколитическими вирусами - один из многообещающих методов лечения рака, селективность которого обеспечена репликацией вирусов в раковых клетках. Одним из самых больших препятствий для использования терапии онколитическими вирусами является иммунная система, так как вирусы могут выводиться из кровотока благодаря нейтрализации их антителами (пАаЬв) прежде, чем он достигнет опухолевых клеток.

Нами был предложен и осуществлен способ маскировки онколитических вирусов аптамерами, для чего с использованием конкурентной селекции были выбраны ДНК-аптамеры к онколитическому

18

вирусу везикулярного стоматита (VSV), а также против его антигенсвязывающего фрагмента (FAB) поликлональных антител анти-VSV. Способность отдельных аптамеров защищать вирус от Nabs тестировали с помощью количественного анализа очагов инфекции на культурах клеток Vero. Для обнаружения очагов инфекции, каждый из которых образует один вирус, использовали YFP-экспрессирующие вирусы VSV (рис.12).

Рисунок 12 - Скрининг анти-VSV аптамеров в 96-луночном планшете. YFP-

VSV(lxl04 PFU) инкубировали с различными аптамерами при 37°С в течение 1 часа. Затем в лунки добавляли анти-VSV Nabs в разведении 1/2000, инкубировали 5 минут и добавляли к монослою клеток Vero.

Процент инициирования VSV-инфекции определяли с применением стандартного теста на культурах клеток по подсчету очагов инфекции для каждого вируса и по сравнению с положительным контролем, который состоял из 100 вирусных частиц. Две дозы аптамеров самых высоких концентраций (1 и 10 мкМ) показали самый высокий потенциал инфицирования, в то время как экранирующий эффект аптамеров с концентрациями ниже 10 нМ был значительно снижен (рис.13). Интересно отметить, что пулы аптамеров анти-VSV и анти-nAbs индивидуально показали рост инфицированности по сравнению с незащищенными вирусами на 20 %.

Serum nAbsAptamcrs_VSV Aptamers

vsv

Infection (% )

Ш +

Ш

+

я

DNA Library DNA Library

DNA Library

Ц

ml

Я

0

100 + 7

ÍSM

15 ± I

17 ±2 61 ± 3

16 ±2 20 ±5

Рисунок 13 — Тест на способность вирусов инфицировать клетки в присутствии нейтрализующих антител при наличии и в отсутствие аптамеров. NAbs предварительно инкубировати с 1 мкМ анти-nAbs аптамеров или чистым PBS. Комплекс затем инкубировали с VSV (100 вирусных частиц), предварительно выдержанных с анти-VSV аптамерами или чистым PBS, и добавляли к монослою клеткок Vero в 12-луночный планшет. (А) клетки, инфицированные VSV в присутствии nAabs (0% инфекционности); (В) клетки, инфицированные VSV без nAabs (100% инфекционности); (С) клетки, инфицированные VSV в присутствии nAabs, и пулов энти-nAabs и анти-VSV аптамеров; (D) клетки, инфицированные VSV в присутствии nAbs и библиотеки ДНК в качестве контроля. Результаты дополнительных контрольных экспериментов представлены в таблице.

Сочетание пулов аптамеров для вирусов и антител имело самый большой защитный эффект и инфицирование возрастало от 0 до 61%, что предполагало синергетический механизм. В среднем 30% очагов инфекции были сформированы вирусом при его инкубации с нативной ДНК-библиотекой в качестве неспецифического контроля.

С целью повышения эффективности аптамеров, мы протестировали возможность использования мультивалентных аптамеров. Для этой цели были сконструированы димеры и тетрамеры, в которых аптамеры соединены олигонуклеотидными мостиками (рис. 14,15).

Рисунок 14 - Общая схема конструирования димеров и тетрамеров с использованием мостиков 1 и 2.

100

-= 80

о £

с 60 >

СЛ

> 40 о

S?

20 0

Рисунок 15 - Оценка эффективности ди- и тетрамеров. Анализ, показывающий, инфицирование VSV с использованием немодифицированных пулов аптамеров, ди мерных или тетрамерных пулов

для VSV, Nabs.

43 Противоопухолевый эффект ДНК-аптамеров Противоопухолевую активность аптамеров исследовали in vitro и in vivo. Исследования in vitro были проведены на первичной культуре опухолевых клеток аденокарииномы легкого и нормальных клетках легкого. Результаты работы показали, что аптамер 183_80 обладал противоопухолевым эффектом, стимулируя апоптоз опухолевых клеток легкого, не влияя на нормальные клетки.

Эксперименты in vivo по оценке противоопухолевого эффекта аптамеров проводили на мышиной модели асцитной карциномы Эрлиха с использованием аптамера к асцитным клеткам NAS-24. Исследования показали, что на 5-й день рост асцитной карциномы у мышей, которым вводили аптамер NAS-24, эффективно подавлялся, причем это было вызвано активацией процесса апоптоза опухолевых клеток (рис.13).

Number of cells ¡n adenocasxínoma, 103

В

AG AG+ Aptamer Apta тег

Leve! of necrosis and apoptosís in adenocareínoma ceíis, % «I 50

# Necrosis Ш ApOptOSÍS

AGfAptamer Aptamer

Рисунок 13 — In vivo противоопухолевая активность ДНК-аптамеров и их комплексов с арабиногалактаном на 5 день лечения. (А) Общее число клеток в опухоли. (В) уровень некроза и апоптоза в асцитных клетках на 5 день

лечения.

5. Внутриклеточная доставка нуклеотидов с помощью арабиногалактана

В настоящее время в фундаментальной биологии для исследовательских целей и в практической медицине для терапевтических целей начинают широко применяться клеточные технологии. Посредством введения в клетку различных биологически активных молекул регулируют функциональное состояние клетки, вызывая в ней пролиферативные процессы, дифференцировку или апоптоз, корректируют генетические повреждения или контролируют экспрессию генов. Особенно перспективным является введение в клетку аптамеров. Однако одним из наиболее важных ограничений при использовании аптамеров для исследовательских и терапевтических целей является сложность их транспортировки во внутриклеточное пространство.

Применяемые способы доставки в клетки нуклеиновых кислот — электропорация, нуклеофекция, тепловой шок, магнитные частицы, вирусные вектора - имеют ряд недостатков, и, в первую очередь, низкую специфичность и малую эффективность. В частности, прп электропорации в бислойной липидной мембране возникает локальная перестройка структуры, приводящая к появлению сквозного водного канала. Такой тип введения нуклеиновых кислот в клетку является достаточно травматичным, поскольку

повреждает структуру мембраны. Обратимые изменения в мембране возникают и при введении нуклеиновых кислот с помошыо метода теплового шока, когда происходит расплавление мембраны и формирование пор. Введение нуклеиновых кислот с помощью вирусных векторов для организма недостаточно безопасный способ.

Широкое применение получила трансфекция с помощью наноконтейнеров, в качестве которых используют антитела к определенным антигенам на поверхности клеток-мишеней и другие вещества, позволяющие использовать механизмы лиганд-опосредованного эндоцитоза. В клетках печени, лимфоцитов, почек и других органов обнаружены асиалогликопротеиновые рецепторы, специфически связывающие белки, несущие концевые галактозильные группы. Лигандами для таких рецепторов могут быть не только гликопротеины, но и другие полимеры с присоединенными концевыми или боковыми галактозильными группами. Вследствие этого такие полимеры, а также их комплексы с ДНК при контакте с клетками печени подвергаются эндоцитозу.

В качестве доказательных методов для исследования возможности природных полисахаридов способствовать трансфекции олигонуклеотидов в клетки были использованы проточная цитометрия и флуоресцентная микроскопия (рис. 14).

Доставка олигосахарндами ДНК, в основном, осуществляется с помощью эндоцитоза через асиалогликопротеиновые рецепторы (ASGPR) на клеточных мембранах. (Groman E.V., 1994). Чтобы подтвердить, что АГ-опосредованная доставка связана с ASGPR, мы использовали конкурентный лиганд для ASGPR. асиалофетуина (ASF) из эмбриональной телячьей сыворотки, обладающий большим сродством к этому рецептору. ASF является галактоз-содержащим концевым гликопротеином с тремя N-связанными гликанами. Проточная цитометрия показала, что ASF ингибирует АГ-опосредованную доставку одноцепочечной ДНК и FITC-меченого АГ в HUH-7 клетках гепатокарциномы (рис.15). Интересно, что сам по себе ASF не вносил одноцепочечную ДНК в клетки, таким образом, ясно, что уникальные комплексы образуются именно между АГ и ДНК. Кроме того, мы не наблюдали доставку одноцепочечной ДНК в ASPGR -негативные клетки Vero (рис.15). Следовательно, в переносе ДНК через ASGPR АГ является ключевым медиатором.

а

Рисунок 14 — (а) Гистограммы, полученные с помощью проточной цитометрии, показывающие экспрессию ЕвРР в клетках различных тканей через 26 часов после внутрибрюшинного введения плазмиды рЕОРР-Ш в комплексе с арабиногалактаном (зеленая кривая), только плазмиды рЕвРР-N1 (синяя кривая), только арабиногалактана (черная линия), контрольные интактные клетки (красная кривая). (Ь) Люминесцентная микроскопия срезов

/

органов: мозга, печени, почек и селезенки после внутрибрюшинного введения комплексов pEGFP-Nl и AG в PBS и только pEGFP-Nl в PBS.

Fluorescence intensity

Fluorescence intensity

Fluorescence intensity

Рисунок 15 - Проточная цитометрия анализа АГ-опосредованной доставки

FAM-меченной библиотеки оцДНК в присутствии ASF. (1) А IT-опосредованная доставка оцДНК в НиН-7 клетки. (2) интернализация FITC-меченного AG в НиН-7 подавляется асиалофетуином. (3) АГ не доставляет оцДНК в клетки Vero, не имеющие ASGPR. Красная кривая представляет

контроль (интактные клетки); зеленая - клетки с 6 мг/мл ASF и 200 нМ библиотеки оцДНК; оранжевая - клетки с 18 мг/мл ASF, 2 мг/мл АГ и 200 нМ библиотеки оцДНК; фиолетовая — клетки с 6 мг/мл ASF, 2 мг/мл АГ и 200 нм библиотеки оцДНК; голубая - клетки с 2 мг/мл АГ и библиотеки 200 нм

оцДНК.

7. Использование ДНК-аптамеров к возбудителям сальмоиеллеза S.enteritidis и S.typhimurium для определения их антибиотикоустойчивости

Разработка новых технологий определения лекарственной устойчивости бактерий к действию антибиотиков - одно из наиболее востребованных направлений современной медицины. Актуальность таких разработок определяется усилением распространения полирезистентных штаммов сальмонелл (Егорова С.А., 2010; Козлова Н.С., 2001 ; Jean S.S., 2006; Nataro J.P., 2007; Parkhill J., 2001; Shanahan P.M.A.. 2000; Su L.H.. 2005; Villa L., 2002; Ridley A„ 1998; Lavvson A.J., 2002). Заболевания, вызванные этими штаммами, отличаются более длительным инкубационным периодом и тяжелым течением заболевания, поскольку множественная лекарственная устойчивость бактерий является основной причиной, снижающей эффективность антибактериальной терапии.

В настоящее время стала возможной диагностика различных бактериапьных инфекций (Lee J.-О.. 2008; Tombelli S., 2008; Micklefield J.. 2001). в том числе и сальмоиеллеза с помошыо одноцепочечных ДНК аптамеров. Интерес к аптамерам растет, поскольку они, являясь функциональными аналогами естественных антител, способны заменить их в

диагностических тест-системах различных модификаций (Lee J.-O., 2008; Tombelli S., 2008). Для селекции ДНК-аптамеров к возбудителям сальмонеллеза в качестве негативных мишеней нами были использованы бактерии S.enteritidis и S.typhimurium, подвергшиеся действию высокой температуры, т.е. потерявшие жизнеспособность. Следовательно, выбранные нами аптамеры связывались только с живыми бактериями и не связывались с неживыми. Учитывая такую особенность ДНК-аптамеров, мы использовали ее для разработки способа определения устойчивости сальмонелл к антибиотикам.

В качестве препаратов, подавляющих рост сальмонелл, применяли антибиотики цефотаксим, азитромицин и флемоксин. Для определения антибиотикоустойчивости сальмонелл к этим препаратам бактерии культивировали 24 часа при 37°С в присутствии антибиотиков.

Для контроля оценки антибиотикоустойчивости бактерий S.enteritidis и S.typhimurium применяли классические бактериологические методы. В частности, одним из показателей жизнеспособности бактерий стала оценка мутности проб, зависящая от скорости роста бактерий. Проведенный с помощью этого метода анализ показал, что рост бактерий в контрольных пробах без добавления антибиотиков был значительно выше, чем в опытных образцах с антибиотиками. Только контрольная проба имела повышенную мутность раствора после 24-часовой инкубации при 37°С, тогда как все опытные пробы после суточной инкубации с антибиотиками оставались прозрачными. Таким образом, согласно данному методу исследования, сальмонеллы S.enteritidis и S.typhimurium были чувствительными ко всем используемым нами антибактериальным препаратам.

Для уточнения полученных результатов мы применили другой классический бактериологический метод — культивирование сальмонелл на питательной среде в чашках Петри. Культивирование бактерий, обработанных антибактериальными препаратами, показало, что азитромицин, в отличие от других антибиотиков, не полностью подавлял рост бактерий S.enteritidis и S.typhimurium. Очевидно это было связано с механизмом воздействия азитромицина (азитромицин, в отличие от других использованных нами антибиотиков, обладает не бактерицидным, а бактериостатическим действием).

Таким образом, оба метода, использованные нами для определения чувствительности бактерий к антибиотикам, имели сходные результаты. Исследования, проведенные методом проточной цитометрии с использованием ДНК-аптамеров, показали, что сальмонеллы S.enteritidis и S.typhimurium после обработки антибактериальными препаратами не связываются с аптамерами (рис.16).

Таким образом, данные об антибиотикоустойчивости бактерий, полученные при помощи классического бактериологического метода, не отличались от данных, полученных методом проточной цитометрии с использованием аптамеров. В то же время использование аптамеров для

определения чувствительности к антибактериальным препаратам обладало двумя важными преимуществами - быстротой определения и меньшими трудозатратами. Метод определения на основе аптамеров позволяет получать точные данные о жизнеспособности бактерий в присутствии антибактериальных препаратов и, соответственно, судить о степени антибиотикоустойчивости, присущей исследуемым микроорганизмам.

О »лупряцптц«! аятзиера 5Е-20_60 гатганюто с швыии 5-МетЙМя пост« суточной иняубацж с фямвжином О Флуоресценции .-щшот !>£-20_И связанного г »»выям яосле (уточном инкубации сцефошснмдал

и Флуоресценцда аптшера БЕ-20_6С связанного с живыми 5^втегШи после сутсином интсуэаций саэйтромицином

Флуоресценцт зщадера 5Е-20_бС святаинио с живыми 5сотсгШ* О Флуоресценция этттвера 5Е -20 6С святанняо с 5.ел(тШи после 15 мин воздшсгеяя тештерзтуги* 95"С

Интенейеиеетъ флуоресценции

и Флуоресценция агттэмерз5Т-12 60 связанного с жхв&иии после суточной инкубации г фле*оксино*!

О Флуоресценция аптакера 5Т-1г_60 шязашопз с посте сутсм^той инкубзтрти с цефтгаксшом

. Флуоресценция аптамерэ 5Т-связанного с живыми 5.Т)рЬ/тш1тт после суточной инкубз!|«1 еазитромит;мноя ; Флуоресценция аттмера$?~12 60 связанного г имвъши ЗхурЫпшит

' Флуоресценция зптамерэ Я-12_60 связанного с ОЛурЫтяшт после 15 мин воздейстеия температуры 95"С

Интенсивность флуоресценции

Рисунок 16 —Оценка антибиотикоустойчивости бактерий 5.ей(егШсИя и ЪЛурЬ^гтгтт с помощью аптамеров.

7. Выявление биомаркеров с помощью аптамеров методом аффинного

обогащения

Аптамеры могут использоваться в качестве инструмента для поиска новых белковых маркеров. В частности, с помошью аптамеров, специфически связывающихся с различными вне- и внутриклеточными белками раковых клеток, можно находить потенциальные белковые биомаркеры рака, а затем идентифицировать их с помошью методов масс-спектрометрии.

Идентификация белков, выделенных из опухолевых клеток с помощью аптамеров, проводилась с помощью модифицированной нами технологии Ар1аВШ (ВегегоуБк! М.У., 2008; БИа^иап Э., 2008). Биомаркеры рака легкого выделяли из опухолевых тканей аденокарциномы легкого с помощью

27

аптамеров, обладающих наибольшей аффинностью к опухолевым клеткам легкого.

Поиск белка-кандидата в мишени аптамера был осуществлен методом исключений из результатов, полученных с помощью масс-спектрометрии, распространенных белков контаминантов и белков, присутствующих в контрольных пробах (в которых белки выделялись из ткани с использованием ДНК-библиотеки).

Белки, определенные программой не менее чем по 5 уникальным пептидам, встречающиеся во всех трех сериях независимых экспериментов в каждой из повторностей и имеющие положительный коэффициент корреляции, рассматривались в качестве кандидатов в мишени аптамера. Таким образом, наиболее вероятной мишенью аптамера 183 80 стал белок Катепсин Б. В таблице представлены статистические данные, полученные программой МахСЗиаЩ 1.3 для кандидата в белки-мишени аптамера 183_80 Катепсина О.

Таблица. Значения показателей, полученных при обработке масс-спектрометрических данных с помошью программы МахОиаЩ 1.3 для белка-кандидата в мишени аптамера 183 80.

Название белка Количество уникальных пептидов, по которым был определен белок в образцах с аптамером в трех независимых экспериментах Коэффициент корреляции между содержанием белка в образцах с аптамером н ДНК-библиотекой в трех независимых экспериментах Отношение значений «LFQ intensity» в образцах с аптамером и ДНК-библиотекой в трех независимых экспериментах

1 2 3 1 2 j 1 2 3

Катепсин D 7 6 6 1,0 0,5 0,9 22 4 1,8 25.2

Катепсин D принадлежит к семейству пептидаз AI и является кислой протеазой, участвующей во внутриклеточном распаде белка, он содержится в лизосомах, меланосомах и может секретироваться во внеклеточное пространство. Катепсин D участвует не только в деградации внутриклеточных белков, но также и в других важных биологических процессах, таких как процессинг, активация и деградация полипептидных гормонов, факторов роста и рецепторов (Barrett A.J., 1977; Authier F., 1995; Dunn A.D., 1991; Metaye Т., 1997), регуляция апоптоза (Ollinger К., 2000; Roberg К., 2002; Takuma К., 2003; Bidere N., 2003; Shibata M., 1998; Deiss L.P., 1996), ремоделирование и обновление тканей (Barrett A.J., 1977), активация латентных форм предшественников других протеолитических ферментов (Van der Stappen J.W., 1996), активация нейрофилов и лейкоцитов

(Vétvicka V., 1994), моноцит-опосредованный фибрпнолиз (Vétvicka V.. 1995; Simon D.I., 1994). Ряд исследований показал, что уровень катепсина D является прогностическим фактором для различных типов рака (Vétvicka V., 2008).

В заключении представлено обобщение полученных результатов и перспективы их использования в диагностике и терапии социально-значимых заболеваний. В целом работа представляет собой комплексный подход, включающий в себя стратегию получения ДНК-аптамеров к различным биологическим мишеням, технологию их использования для идентификации и регуляции их функционального состояния.

Типовая схема селекции и проверки аффинности и специфичности аптамеров для диагностики и терапии в биологии и медицине:

1. Селекция аптамеров:

• позитивная селекция ДНК-аптамеров к мишеням с использованием маскирующей ДНК для уменьшения неспецифического связывания;

• негативная селекция с объектами, нежелательными для связывания в зависимости от планируемого использования аптамеров;

• выбор наиболее аффинного и специфичного пула аптамеров и проверка возможности его использования для определенных задач.

2. Получение синтетических аптамеров:

• клонирование наиболее подходящего для определенных задач пула(ов) аптамеров;

• секвенирование клонов аптамеров;

• анализ нуклеотидной последовательности аптамеров и синтез наиболее стабильных полных и укороченных ДНК с различными модификациями.

3. Определение физико-химических параметров и биологических функций аптамеров:

• исследование специфичности и аффинности индивидуальных аптамеров;

• определение констант диссоциации;

• исследование возможности применения аптамеров для диагностики;

• выбор оптимальных методов детекции в зависимости от мишени и структурных особенностей аптамера;

• исследование биологических эффектов аптамеров.

4. Определение белков-мишеней аптамеров с использованием масс-спектрометрии.

На рисунке 17 представлена схема алгоритма селекции и проверки специфичности аптамеров для создания средств диагностики и терапии (на примере создания средств детекции клеток рака легкого и

29

опухолеспецифичных молекул в образцах периферической крови больных раком легкого человека).

Фундаментальные бкомедициисме и маууко-клинические исследования

Банк проекта I

I БД проекта

Требования специфично:™ биомаркера

Методы | протсомадм I

Клетки рана легкого

Управление Хранение Хранение

материалов данных

^Охарактеризованные?'

Зхспери ментальны© рамные проекта

Вход

Технология ЗЕ1ЕХ

Бйблиот^а ДНК- опигонуклестлдов

Экспериментальные данные

Селекция аптамерса и выбор лучшего пула

Рзковь» и нормальные тками легкого, кровь здорового человека

Рмктвяы Амглифигатор Гепь-эпеп рофореэ Гепь-яокументигг/ющая система Проточный цитометр

Ресурсы

Выход

А/пз«еры-бмосенсори чувствительные (

веткам рака легкого

человек*

Метод офннного обогащения

батюв-йиомаркеров

опухолевых клеток

Определение белковчиишенеи

Бело« Клтвлсин О оиошркер рака легкого

Инт&рнет-{к?сурсы[ и БД биои>.форуатики

ПО протеоинсго анализа ОгЫТгар

Банк проекта Масс-спектрометр

Исследование физико-химических свойств аптамеров

Научная литература Протечный цитомегр

Гос.?адание| | Гос.шнфакп I

БД

* проекта Охарактэрнэоаанные материалы Коифмагьмый

иэксп.домме микроскбп

проекта Фруорвсуентнуй микроскоп

Исследование возможности и разработка методов применения аптамеров

^интети^с^ие а л та меры

Проточный! Ц»ТОГИ8Тр Микротом

Мтод анализа гистологически срезов

Метод детектирования:

ЦОК. микрммбол, апыштииескш тапец

ВД проема Банк проекта БД патентов

Рисунок 17 - Схема алгоритма селекции и проверки специфичности аптамеров для создания средств диагностики и терапии (на примере средств детекции рака легкого и опухолеспецифичных молекул в образцах периферической крови больных раком легкого)

выводы

1. Включение в технологию SELEX новых стадий, существенно уменьшающих число неспецифических последовательностей, таких как строгая негативная селекция, преинкубация с маскирующей ДНК, увеличенный объем и количество промывок, позволило получать ДНК-аптамеры с заданными свойствами к различным мишеням, таким как аденокарцинома легкого человека, асцитные клетки карциномы Эрлиха и их ядра, бактерии S.enteritidis и S.typhimurhim, онколитические вирусы, антитела.

2. Новая модификация in vivo SELEX, при которой библиотека или пул аптамеров вводят мыши внутримышечно и экстрагируют ДНК-аптамеры из тонких срезов головного мозга, применима для получения транспортных молекул, проходящих через гематоэнцефалический барьер.

3. Методика селекции аптамеров к заданным эпитопам отличается от известных применением принципа конкурентного вытеснения менее аффинных лигандов молекулами, имеющими большее сродство к мишени. С помощью данного метода были получены аптамеры к цитокератииам и онколитическому вирусу везикулярного стоматита.

4. Разработан метод адресной доставки аптамеров в опухолевые клетки к внутриклеточным мишеням на основе природного полисахарида арабиногалактана, проносящего оцДНК в клетку через асиалгликопротеиновые рецепторы с эффективностью 76% в клетки HuH-7 in vitro и асцитные клетки карциномы Эрлиха с эффективностью 46% in vivo.

5. Оптический, электрохимический и микрофлуидный сенсоры применимы для диагностики рака легкого человека на основе аптамеров и дают возможность идентифицировать от 1 до 10° раковых клеток в 2 мл крови.

6. Электрохимические бносенсоры на основе аптамеров для идентификации микроорганизмов и вирусов, определения их жизнеспособности, анализа аффинности и эпитоп-специфичности аптамеров являются высокочувствительными, с пределом обнаружения для бактерий 600 КОЕ/мл, для вирусов -330 PFU.

7. Аптамеры можно использовать в качестве маскирующих молекул для защиты онколитических вирусов от нейтрализующих антител с целью улучшения их терапевтических свойств. Максимальная эффективность защиты 79% достигается при одновременном использовании

32

тетрамерных форм аптамеров к онколитическим вирусам и нейтрализующим антителам.

8. Определены биологические эффекты аптамеров на раковые и бактериальные клетки. Найдены последовательности аптамеров, стимулирующие апоптоз, пролиферацию, или останавливающие деление раковых клеток, и аптамеры, обладающие способностью подавлять рост сальмонелл 5,еп1егШсИ.ч и Б./урШтигшт.

9. Оптимальной технологией поиска белковых мишеней аптамеров является схема, состоящая из аффинного выделения белковых мишеней аптамеров, магнитной сепарации компексов белок-мишень, диссоциации комплексов ДНК с белком, фрагментирования белка, фракционирования пептидов и масс-спектрометрической идентификации белков по пептидам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Chen G-H. Isolating and concentrting rare cancerous cells in large sample volumes of blood by using dielectrophoresis and stepping electric fields / Chen G-H., Huang C-T., Wu H-H., Zamay T.N., Zamay A.S., Jen C-P /7 BioChip Journal. -2014. - V 8 (2). - P.67-74.

2. Muharemagic, D. Aptamer-Facilitated Protection of Oncolytic Virus from Neutralizing Antibodies / D. Muharemagic, Anna S. Zamay. Shahrokh Ghobadloo, Laura Evgin, Anna Savitskaya, John C. Bell, and Maxim V. Berezovski // Molecular Therapy - Nucleic Acids. -2014. -3. -el67. doi:10.1038/mtna.2014.19.

3. Zamay, A.S. DNA aptamer to human lung adenocarcinoma shows antiumor effect'/ A.S.Zamay, G.S.Zamay, Y.E.Glazyrin, T.N.Zamay, A.V.Krat, A.A.Modestov, O.A.Zubkova. E.A.Spivak. M.A.Sukhovolskaia, S.A.Kuznetsova, A.B.Salmina, A.A.Gargaun, M.V.Berezovski, O.S. Kolovskaya // Oligos & Peptides - Chimica Oggi - Chemistry Today. -2014. -V.32(2). -P. 18-22.

4. Kolovskaya, O.S. DNA-aptamer/'protein interaction as a reason of apoptosis and proliferation stop in ehrlich ascites adenocarcinoma cells / O.S. Kolovskaya, T.N. Zamay, A.S. Zamay, Y.E. Glazyrin, E.A. Spivak, O.A. Zubkova, A.V. Kadkina, E.N. Erkaev, G.S. Zamay. A.G. Savitskaya, L.V. Trufanova, L.L. Petrova, M.V.Berezovski // Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. -2014. -V.8(l). -P.60-72.

5. Zamay, Tatyana N. DNA-Aptamer Targeting Vimentin for Tumor Therapy in Vivo / Tatyana N. Zamay, Olga S. Kolovskaya, Yury E. Glazyrin, Galina S. Zamay, Svetlana A. Kuznetsova, Ekaterina A. Spivak, Mohamed Wehbe, Anna G. Savitskaya, Olga A. Zubkova, Anastasia Kadkina, Xiaoyan Wang, Darija Muharemagic, Anna Dubynina, Yuliya A. Slieina, Alia B. Salmina, Maxim V. Berezovski, Anna S. Zamay // Nucleic Acid Therapeutics. -2014. -V.24(2). -P. 160-170.

6. Chiang P-J. Quantitative evaluation of the depletion efficiency of nanofractures generated by nanoparticle-assisted junction jap break down for protein concentration / Chiang P-J., Kuo C-C., Zamay T.N., Zamay A.S., Jen C-P. // Microelectronic Engeneering. -V. 115.- P.39-45.

7. Kolovskaya, O. Development of Bacteriostatic DNA Aptamers for Salmonella / Olga Kolovskaya, Anna Savitskaya, Tatiana Zamay, Irina Reshetneva, Galina Zamay, Evgeny Erkaev, Xiaoyan Wang, Mohamed Wehbe, Alia Salmina, Olga Perianova, Olga Zubkova, Ekaterina Spivak, Nadezhda Titova, Yury Glazyrin, Vasily Mezko, Maxim Berezovski, Anna Zamay // Journal of Medicinal Chemistry. -2013. -V.56(4). -P.1564-1572.

8. Labib, M. Multifunctional Electrochemical Aptasensor for Aptamer Clone Screening, Vims Quantitation in Blood and Viability Assessment / Labib, M.; Zamay, A.S.; Berezovski, M.V. //Analyst. -2013. -V.138. -P.1865-1875.

9. Labib, M. Aptamer-based Viability Impedimetric Sensor for Bacteria / M.Labib, A.S.Zamay, O.S.Kolovskaya, I.T.Reshetneva. G.S.Zamay, R.J.Kibbee, S.A.Sattar, T.N.Zamay, M.V.Berezovski // Analytical Chemistry (Letter). -2012. -V.84(21). -P.8966-8969.

10.Labib, M. Aptamer-based Impedimetric Sensor for Bacterial Typing / M.Labib, A.S.Zamay, O.S.Kolovskaya, I.T.Reshetneva, G.S.Zamay, R.J.Kibbee, S.A.Sattar, T.N.Zamay, M.V.Berezovski // Analytical Chemistry (Letter). -2012. -V.84(19). -P.8114-8117.

11.Muharemagic, D. Anti-Fab Aptamers for Shielding Virus from Neutralizing Antibodies / D.Muharemagic, M.Labib, S.M.Ghobadloo, A.S.Zamay, J.C.Bell, M.V.Berezovski // Journal of the American Chemical Society. -2012. -V. 134(41). -P. 17168-17177.

12.Labib, M. Electrochemical Differentiation of Epitope-Specific Aptamers / M .Labib, A.S.Zamay, D.Muharemagic, A.V.Chechik, J.C.Bell, M.V.Berezovski // Analytical Chemistry. -2012. -V.84(5). -P.2548-2556.

13.Labib, M. Aptamer-Based Viability Impedimetric Sensor for Viruses / M.Labib, A.S.Zamay, D.Muharemagic, A.V.Chechik, J.C.Bell, M.V.Berezovski // Analytical Chemistry (Letter). -2012. -V.84(4). -P.lSHIS^. Featured in Chemical & Engineering News "Biosensor Spots Viable Viruses" and Wiley-VCH ChemVews Magazine "Virus Detection - Dead or

Alive".

14.Labib, M. Electrochemical Sensing of Aptamer-Facilitated Virus Immunoshielding / M.Labib, A.S.Zamay, D.Muharemagic, A.V.Chechik, J.C.Bell, M.V.Berezovski /7 Analytical Chemistry. -2012. -V.84(3). -P.1677-1686.

15.Замай, Т.Н. Микрофлуидные устройства в диагнсотике онкологических заболеваний / Т.Н.Замай, С.С.Замай, А.Г.Борисов, А.А.Савченко, Г.С.Замай, О.С.Коловская, А.С.Замай, В.С.Мезько /7 Сибирское медицинское обозрение. -2013. - № 5. - С.4-10.

16.Денисенко, В.В. Математическое моделирование живых клеток в многоэлектродном устройстве / В.В.Денисенко, С.С.Замай, А.С.Замай /7 Вестник СибГАУ.'-2013. -В.4(50). -С.13-18.

17.3амай, Г.С. Разработка технологии идентификации биомаркеров с помощью аптамеров на примере плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы / Г.С.Замай, О.С.Коловская, Ю.Е.Глазырин, А.В.Оседко, A.C.Замай, Е.А.Малышева, А.Г.Савицкая, А.В.Крат, А.Б.Салмина, Ю.В.Котловский, Т.Н. Замай // Сибирское медицинское обозрение. -2012. -№6. -С.9-13.

18.Замай, Т.Н. Определение чувствительности возбудителей сальмонеллеза Salmonella Enteritidis Salmonella Typhimurium к антибактериальным препаратам с помощью метода проточной цитометрии / Т.Н.Замай, А.Г.Савицкая, А.С.Замай, А.В.Дубынина, О.С.Коловская. И.Т.Решетнева. С.А.Кузнецова. Г.С.Замай, Н.М.Титова, Л.Л.Петрова, Л.В.Труфанова, О.В.Перьянова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. -2012. -Т.14.№5(2). -С.455-459.

19.Замай, Т.Н.Новые технологии создания средств диагностики и терапии на основе аптамеров / Т.Н.Замай, A.C. Замай, О.С.Коловская, А.Г.Савицкая, Г.С.Замай, А.В.Крат, И.Т.Решетнева, Е.А.Малышева, О.А.Зубкова, Е.А. Спивак // Сибирское медицинское обозрение. -2012. -Т.5(77). -С.3-7.

20.Замай, Т.Н. Метод диагностики рака легкого человека с помощью одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов / Т.Н.Замай. Г.С.Замай,

A.С.Замай, О.С.Коловская, Е.А.Малышева, А.Г.Савицкая, А.В.Крат,

B.К.Бельтюков, А.А Модестов., Д.В.Попов, Л.Л.Петрова, Л.В.Труфанова, О.А.Зубкова, Е.А.Спивак // Известия Самарского научного центра РАН. -2012. -№5 (2). -С.452-454.

21.Замай, О.С. Селекция аптамеров к опухолевой ткани легкого человека / О.С.Замай, Г.С.Замай, А.С.Замай, Е.Н.Еркаев, Т.Н.Замай /7 Вестник Сибирского государственного аэрокосмического университета. -2011. -№7 (40). -С.220-225.

22.Замай, Т.Н. Аптамеры - биофармацевтические препараты диагностики и терапии нового поколения / Т.Н.Замай, А.С.Замай, А.Б.Салмина, Е.А.Пожиленкова // Сибирское медицинское обозрение. -2011. -Т.5(71). -С.3-9.

23.Замай, Т.Н. Влияние экзогенных низкомолекулярных веществ на регуляцию опухолевого роста / Т.Н.Замай, А.С.Замай, M.Berezowski, Н.А.Бородина, Замай О.С., Рогозин Д.Ю., Чечик A.B. // Сибирское медицинское обозрение. -2011. -Т.5(71). -С.30-33.

24.Замай A.C., Замай Т.Н., Березовский М.В., Салмина А.Б., Замай О.С., Замай Г.С. Патент на полезную модель. Диагностическая тест-система на основе аптамеров// № 117150, приоритет от 16.11.2011 г., зарегистрирован 20.06.2012 г.

25.Замай Т.Н., Савицкая А.Г., Коловская О.С., Замай A.C., Замай Г.С. Патент на изобретение. Способ определения чувствительности микроорганизмов рода Salmonella к антибактериальным препаратам. //' №2518372, приоритет от 29 октября 2012 г., зарегистрирован 8 апреля 2014 г.

26.Замай A.C., Замай Г.С., Коловская О.С., Замай Т.Н., Березовский М.В. Способ селекции аптамеров к заданным белковым мишеням на поверхности клеток. // №2518368, приоритет от 29 октября 2012 г., зарегистрирован 8 апреля 2014 г.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю благодарность нашему творческому коллективу, без постоянной помощи и поддержки которых, плодотворного обсуждения идей, планов экспериментов и полученных результатов эта работа не могла бы состояться.

Выражаю свою искреннюю благодарность Дарье Мухаремаджик, Махмуду Лабибу. Лоре Евгин, Мохаммеду Веббе. Назрин Хан, Анне Савицкой, Юрию Глазырину, Ольге Зубковой. Екатерине Спивак, Марии Трусовой, Юлии Шейной, Галине Замай, Ольге Коловской и Алексею Чечику за помощь в проведении экспериментов, анализе данных, плодотворные обсуждения результатов, вдохновение и повсеместную поддержку.

Особой благодарностью хотелось бы отметить Максима Валентиновича Березовского, Татьяну Николаевну Замай, Джона С. Белла, Чун-Пин Джена, Аллу Борисовну Салмину, Андрея Анатольевича Савченко, Романа Александровича Зубарева, Ольгу Владимировну Перьянову, Ирину Тимофеевну Решетневу, Алексея Васильевича Крата, Андрея Арсеньевича Модестова, Анатолия Васильевича Светлакова. Германа Александровича Кочетова, Ирину Александровну Севастьянову, Валентину Александровну Крастасюк, Дениса Юрьевича Рогозина и Ивана Павловича Артюхова без постоянной помощи и поддержки которых, обсуждения идей, планов экспериментов, полученных результатов, конструктивной критики, и добрых слов эта работа не могла бы состояться.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации и Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы (Государственные контракты: №16.512.11.2107, №16.512.11.2090, №14.512.11.0086), Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности 06/11, 2011, 09/12 2012., Правительства Канады NSERC Strategic Project.

Подписано к печати 22 октября 2014 г. Формат 210x148 1/16. печ.л. 1,25 Заказ № 4751. Тираж 100 экз.

Отпечатано в компании «Печатный двор» г. Красноярск, ул. Марковского, 19 тел.: 266-12-90