Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селекция ДНК-аптамеров к бактериям S. enteritidis и S. typhimurium, их свойства и применение

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Селекция ДНК-аптамеров к бактериям S. enteritidis и S. typhimurium, их свойства и применение"

На правах рукописи

ОС*-

КОЛОВСКАЯ ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

СЕЛЕКЦИЯ ДНК-АПТАМЕРОВ К БАКТЕРИЯМ 5. ЕЛТ£Я/77/>/5 И 5. ТТРНШишиМ, ИХ СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2014

005550094

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский федеральный университет»

Научный руководитель:

к.б.н., доцент Титова Надежда Митрофановна

Официальные оппоненты:

Амстиславская Тамара Геннадьевна, д.б.н. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, с.н.с.

Веньяминова Алия Гусейновна, к.х.н. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, зав. лабораторией

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН

Защита состоится «27» июня 2014 г. в 10.00 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан «..? '■,•» / //-.Г- 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.х.н, доцент р

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Разработка технологии создания новых средств диагностики и терапии - одно из наиболее актуальных направлений развития современной персонализированной медицины. В последнее время в качестве лекарственных препаратов стали использовать биофармацевтики, среди которых все более популярными становятся аптамеры, представляющие собой фрагменты однонитевой РНК или ДНК. При взаимодействии комплементарных участков цепи олигонуклеотиды образуют уникальные трехмерные структуры, способные к различного рода взаимодействиям и связям с функциональными группами молекулярных мишеней, что определяет их способность к специфическому связыванию (Кульбачинский А.В., 2006; Радько С.П. и др., 2007; Спиридонова В.А., 2010; Patel D.J., Suri А.К., 2000; Spiridonova V.A., Kopylov A.M., 2002; Iliuk A.B. et al., 2011). Благодаря своей уникальной конформации, аптамеры могут связываться с любыми биологическими мишенями, что создает основу для разработки эффективных диагностических и терапевтических препаратов.

Преимущества аптамеров заключаются в том, что их можно химически синтезировать, модифицировать красителями, метками, токсинами, что позволяет использовать их в различных целях. Кроме того, аптамеры термостабильны, а при потере аффинности их свойства могут быть легко восстановлены (Iliuk A.B. et al., 2010). И, наконец, аптамеры неиммунногенны и нетоксичны (Ulrich H., 2006).

Спектр применения аптамеров, обладающих высоким сродством к мишеням, достаточно широк - от визуализации и количественной детекции мишеней (Iliuk A. et al., 2011) до использования их в качестве терапевтических препаратов или для адресной доставки лекарственных средств (Давыдова А.С. и др., 2011; Ulrich H., 2006).

Одним из наиболее важных объектов для селекции аптамеров, наряду с другими, являются бактериальные клетки, что вызвано необходимостью очень быстро и точно определять наличие патогенов в биологических жидкостях и пищевых продуктах, поскольку известно, что до 30% населения промышленно развитых стран ежегодно страдает болезнями пищевого происхождения. Из всех возбудителей кишечных инфекций наибольшую опасность представляют сальмонеллы вследствие того, что они вызывают генерализацию инфекционного процесса, часто заканчивающегося эндартериитом, циррозом печени, септическим артритом, менингитом, остеомиелитом, пневмонией и другими заболеваниями (Pegues D.A. et al., 2005).

В связи с распространением кишечных инфекций остро стоит проблема определения их возбудителей, как в продуктах питания, так и в биологических жидкостях, поскольку успешный прогноз в лечении

инфекционных заболеваний зависит от ранней идентификации микроорганизма, анализа его патогенности и лекарственной устойчивости.

Существующие методы детекции микроорганизмов варьируют по времени исследования: от 30 минут до 24 часов (Дубинина И.Г. и др., Сакаль H.H., 1993) и, к тому же, по-прежнему существует проблема недостаточной чувствительности и специфичности этих методов, поскольку необходимо не просто определить наличие патогена, но и установить его жизнеспособность.

Кроме того, в настоящее время отмечается рост количества высокопатогенных штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, эффективность лечения которых напрямую зависит от резистентности бактерий к применяемым в лечении антибиотикам. Инфекции, вызываемые резистентными микроорганизмами, чаще приводят к летальному исходу и затрудняют борьбу с инфекционными заболеваниями, поскольку пациенты остаются носителями заболевания на протяжении длительного времени, что способствует передаче устойчивых штаммов другим людям. В связи с постоянным повышением лекарственной устойчивости бактерий медицина нуждается в быстрых, обладающих высокой точностью методиках определения степени резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

Недостатки традиционных способов диагностики и терапии позволяют преодолеть методы с использованием аптамеров, хотя опыт их применения для детекции возбудителей кишечных инфекций ограничен (Joshi R., 2007; Dwivedi Н.Р., 2007).

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось получение аптамеров к двум серотипам сальмонелл - S. enteritidis и S. typhirmirium, обладающих разной патогенностью и чувствительностью к антибиотикам, и исследование их диагностических и терапевтических свойств.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать уникальные последовательности ДНК-агггамеров к S. enteritidis и S. typhimurium с помощью технологии cell-SELEX, определить их специфичность и аффинность и выбрать из них наиболее специфичные к S. enteritidis и S. typhimurium.

2. Разработать на основе ДНК-аптамеров способ выявления возбудителей сальмонеллеза (S. enteritidis и S. typhimurium) в биологических жидкостях.

3. Исследовать биологический эффект ДНК-аптамеров к S. enteritidis и S. typhimurium.

4. Разработать на основе ДНК-аптамеров способ определения антибиотикоустойчивости.

Научная новнзна.

1. Впервые получены ДНК-аптамеры к S. enteritidis.

2. Впервые показано, что смесь синтетических ДНК-аптамеров к S. enteritidis и S. typhimurium подавляют бактериальный рост, что показывает

возможность создания на основе ДНК-аптамеров антибиотиков нового поколения.

3. Впервые аптамеры были использованы для создания метода определения чувствительности сальмонелл S. enteritidis и S. typhimurium к антибактериальным препаратам.

Теоретическая и практическая значимость.

На основе полученных уникальных последовательностей аптамеров к бактериям 5. enteritidis и S. typhimurium могут быть разработаны диагностические тест-системы для определения возбудителей сальмонеллеза и определения их антибиотикоустойчивости. Кроме того, ДНК-аптамеры могут стать основой создания бакгериостатических препаратов для лечения сальмонеллеза и средством адресной доставки антибактериальных препаратов.

Апробация результатов. Основные положения диссертации опубликованы в 6 статьях, в том числе, 3 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 3 - в зарубежной печати. Результаты исследования представлялись на конференции с международным участием «Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний», 2012 (г. Красноярск), X съезде научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации, 2012 (г. Москва), семинарах ассоциированной Российско-Канадской лаборатории BioMeT, Международном Симпозиуме 13th Tetrahedron Symposium, 2012 (Тайбэй, Тайвань) и Международной конференции OTS, 2013 г. (Неаполь, Италия).

Структура и объем работы. Материал диссертации изложен на 117 страницах машинописного текста, иллюстрирован 39 рисунками, 8 таблицами. Работа состоит из введения, глав: обзор литературы; материалы и методы; результаты собственных исследований; заключения; выводов; списка литературы. Список литературы состоит из 173 источников, из которых 12 - российских и 161 — зарубежный.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Селекция аптамеров

Получение аптамеров к сальмонеллам проводили путем селекции одноцепочечных ДНК-аптамеров из ДНК-библиотек N80 методом систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) (Berezowski М. et al., 2008). Селекцию аптамеров к сальмонеллам осуществляли с использованием технологии cell-SELEX путем чередования позитивной и негативной селекции (Рис.1).

1. Негативная селекция к смеси бактерии

Амплификация

Отбор несвязавшихся аптамеров

2. Позитивная селекция к Salmonella

Отделение от не связавшейся ДНК

Бактерии 1КП£лыбоэдшн«ся для П-»НТИЙНОЙ с*лекции

Бактерии. использовавшиеся для нолтиеиои селекции

у

V

оцДНК

(нблиотехэ

5olmonetb Enteritidis him Typhinwriuni

SolnmncHo Typhinwriuni или Enteritidil. mepAHnietmf odpofoпюнные SolnionclkH. Stophylotoiois ourpoi, Euhttithio coli, Ptendomonoi oeruginofa и Citrobacter fretindi

Рисунок 1 - Схема селекции аптамеров к сальмонеллам

Селекция проходила на протяжении 12 раундов. В результате селекции были получены пулы аптамеров к S. enteritidis и S. typhimurium. Для детекции флуоресценции одноцепочечных ДНК, меченных А1еха-488, использовали гель-документирующую систему GBOX/EF2-E (Рис. 2).

Исследование аффинности и специфичности аптамеров разных раундов селекции проводили с помощью методов проточной цитометрии. Связывание аптамеров с клетками S. enteritidis достигало максимального значения к 7 раунду селекции и составляло 100% (Рис.3). С оцЦНК-библиотекой связывалось около 10% бактериальных клеток S. enteritidis. Связывание ДНК-аптамеров с S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa и С. freundi не превышало 10%. Для S. typhimurium пул аптамеров 7 раунда селекции так же, как и для S. enteritidis, оказался наиболее аффинным и специфичным. Связывание

4

аптамеров 7 раунда селекции с бактериальными клетками S. typhimurium составило 60%. С оцДНК библиотекой связывалось около 10% бактериальных клеток. Связывание ДНК-аптамеров с S. aureus, Е. coli, Р. aeruginosa и C.freundi не превышало 10% (Рис.4).

Salmonella Enteritidis Salmonella Typhimurium

оцДНК

Щ -Ai «и» в* *"» (N801

аа»«" <М» «м <ш <•» ят Праймер

(N20)

Библ 3456789 10 11 Библ 3456789 10 11

Номер раунда селекции Номер раунда селекции

Рисунок 2 - Электрофореграммы конечных ПЦР-продуктов оцДНК-

аптамеров

% связавшейся с бактериальными клетками ОцДНК

КО 90 80 70 G0

mm

•«J-

■ Селекция к Salmonella Enteritidis

ШНВЬЛЩг

V Vе V <r V* V V V S' </ </

Рисунок 3 - Аффинность и специфичность связывания ДНК-аптамеров к S.

enteritidis.

Наиболее аффинные и специфичные к бактериям-мишеням пулы аптамеров были клонированы и секвенированы. Секвенирование клонов аптамеров было реализовано в McGill University и Genome Quibec Innovation Centre, Канада. В результате секвенирования были получены полные сиквенсы всех клонов аптамеров к S. enteritidis и S. typhimurium. Из них было синтезировано 10 последовательностей олигонуклеотидов к 5. enteritidis и 8 последовательностей олигонуклеотидов S. typhimurium. Синтезированные последовательности аптамеров представлены в таблицах 1 и 2.

5

% сажавшейся с бактериальными клетками оцДНК

Рисунок 4 - Аффинность и специфичность связывания ДНК-аптамеров к

IурЫтипит

Таблица 1. Последовательности наиболее специфичных аптамеров к 5. епГегШсИх (БЕ)

Аптамер Последовательность

Ж-3_80 СТССТСТСАСТОТААССАСОТСООСААСААООТСАСССООАОААО АТСОСТООТСАААСТССАТАООТАОТССАОААОСС

БЕ- 3_60 ТСОССААСААОСТСАСССООАОААОАТСООТООТСАААСТОСАТА ООТАСТССАОААОСС

Ж-6_80 СТССТСТОАСТСТААССАСОТААССТАССААААТОТТСОАТТСОАТ СТТСТАСТОООТТОСАТАОСТАОТССАОААОСС

Ж-6_60 ТАССААААТОТТООАТТСОАТОТТСТАСТООСТТССАТАОСТАОТС САОААОСС

5£-20_80 СТССТСТСАСТСТААССАСОСАСАААООСТСОСОСАТСОТОТСТАС 0ТТСТТАСД0А00Т0САТА00ТА0ТССА0АА0СС

БЕ- 20_60 СТССТСТСАСТСТААССАСОСАСАААООСТСОСОСАТСОТОТСТАС 0ТТСТТАСА0А00Т

Ж- 22_80 СТССТСТСАСТСТААССАСООАОТТААТСААТАСААООСОООААСА ТСТТСОСОСТОССОСАТАОСТАОТССАОААОСС

Ж- 22_60 СТССТСТСАСТОТААССАСОТАТАСОСОСТТСССССТТАОТСАТАСО ААСТСАТТСААТС

Ж-11_60 СТССТСТОАСТСТААССАСОААСОАТТСААОААСТСТТОСТТОТСО ОСТТАТТТТССССА

5£-34_80 СТССТСТСАСТОТААССАСОТСССОСТАААСОССООСТСАТССТТА ТССТТТТСАТТССАОСАТАООТАОТССАОААОСС

Для наиболее специфичных синтетических ДНК-аптамеров к 5. еШепйсИя и (урИтипит были определены кажущиеся константы

диссоциации с помощью метода обратных координат Лайнуивера-Берка. Значения кажущихся констант диссоциации представлено в таблице 3.

Таблица 2. Последовательности наиболее специфичных аптамеров к 5. IурЫтипит (Б Т)

Аптамер Последовательность

БТ-180 СТССТСТСАСТСТААССАСССАСТТААТСААТАСААООСССОААСАТ ССТТООСООТСССОСАТАООТАСТССАОААОСС

БТ-\ 40 ОАСТТААТСААТАСААООССОСААСАТССТТСССССТСС

БТ- 6_60 ОССТСТААООСТСАССТТСААОСССССООАСТААССТССТСОСАТАО СТАОТССАОААОСС

БТ-12_80 СТССТСТСАСТСТААССАСООТСОТТТСАТСАСТАТТОООССТТТСТС АТСТСОСТАОТСОСАТАОСТАОТССАОААОСС

БТ-12_60 СТССТСТОАСТСТААССАСООТСОТТТСАТСАСТАТТООССТТТОТОА ТСТСОСТАСТ

БТ- 20_80 СТССТСТСАСТСТААССАСОАТТОТАСАССАТСТССАОАОАТТТТСО ОСАСОАООАТСАТСОСАТАОСТАОТССАОААОСС

БТ-20 40 АТТСТАСАССАТСТОСАОАОАТТТТСООСАССАООАТСАТ

57-3 3_60 СТССТСТСАСТСТААССАСООТСООАОАОАТССТАТАСААТСТТОТА АООСОАТООАССО

Таблица 3. Значение кажущихся констант диссоциации (К^) для клонов и пулов 5. еМегШсИя и 5.1урЫтипит

Номер клона, пула Значение К^, нМ

БЕ-3 (60 нуклеотидов) 7,8±0,8

БЕ-6 (80 нуклеотидов) 53,0±5,5

БЕ-6 (60 нуклеотидов) 6,3±0,9

8Е-11 (60 нуклеотидов) 6,9±0,8

БЕ- 20 (80 нуклеотидов) 28,0±2,6

БЕ-20 (60 нуклеотидов) 7,1 ±0,8

БЕ-22 (80 нуклеотидов) 30,0±4,0

БЕ-22 (60 нуклеотидов) 5,3±0,6

8Е-34 (80 нуклеотидов) 56,0±5,7

БЕ пул 7 12,0±1,5

БТ-1 (40 нуклеотидов) 5,3±0,6

БТ-2 (80 нуклеотидов) 37,0±4,2

БТ-6 (60 нуклеотидов) 13,0±1,6

БТ-12 (60 нуклеотидов) 4,5±0,6

БТ-20 (80 нуклеотидов) 22,0±2,5

8Т-20 (60 нуклеотидов) 4,7±0,5

БТ-ЗЗ (60 нуклеотидов) 51,0±6,3

БТ пул 7 7,0±0,8

2. Оценка биологического эффекта аптамеров к S. enteritidis и S.

typhimurium

Для определения биологического эффекта ДНК-аптамеров использовали олигонуклеотиды, обладающие высокой аффинностью и специфичностью к S. enteritidis и S. typhimurium. Оценку биологического эффекта ДНК-аптамеров осуществляли классическим бактериологическим методом по определению количества колониеобразующих единиц сальмонелл после инкубации суспензии бактерий с разными концентрациями синтетических аптамеров и смесью синтетических аптамеров. Выяснено, что подавление роста колоний S. enteritidis проявлялось при воздействии аптамера SE-20_60 (60 нуклеотидов) и составляло 43±4% (Рис.5), аптамер ST-12_60 (60 нуклеотидов) подавлял рост бактерий S. typhimurium на 62±12% (Рис.6).

Подавление роста колоний Salmonella Enteritidis, % от контрольного образца

1

1 8 ! « I „

5

II 3 | S 8 а

О О 1Л Ф «

и с л л ^

S с 00 I I ю I ч> I 00 ш I с « о • « 61 с V t-

о N 8 О N W н N ¡л J4 SI ч т V» 1 & < г § | 1 Is I

401 43± 13± 321 9± 731 10± ill 231

13.8 4.1 1.5 4.6 5.3 15.1 4.2 3.3 2,9

Рисунок 5 - Биологический эффект аптамеров на рост S. enteritidis Подавление роста колоний Salmonella Typhimurium, % от контрольного образца

ll-ltl

1 J I Л ,. ■ - Л

с а

S i

61 351 -281 391 621 401 111 571 751 91 -51 321

0.4 7.4 3.4 4.7 12.2 7.8 0.2 9.2 15.4 2.4 0.6 10.3

Рисунок 6 - Биологический эффект аптамеров на рост S. typhimurium

8

Максимальное подавление роста было вызвано смесью синтетических ДНК-аптамеров. Смесь синтетических ДНК-аптамеров к 5. еШегШсИя снижала бактериальный рост на 73±15%, а смесь синтетических ДНК-аптамеров к 5. IурЫтигшт - на 75±15%. ОцЦНК библиотека не оказывала существенного влияния на рост колоний.

Жизнеспособность сальмонелл, проинкубированных с индивидуальными ДНК-аптамерами, их смесью, ДНК-библиотекой и случайной последовательностью олигонуклеотидов оценивали по изменению величины мембранного потенциала, который определяли с помощью флуоресцентного красителя родамина (Што-123). Результаты измерений представлены на рисунке 7.

Рисунок 7 - Жизнеспособность бактерий 5. ¡урЫтипит и 5. еМегШсЛя, измеренная с помощью флуоресцентного красителя Шюс1агтпе 123. (А) 5.

еШегШсНь и (О) 5. 1урЫтиг/ит. Голубым цветом показаны графики контрольных образцов сальмонелл, зеленым - термически обработанных бактерий, черным и оранжевым - бактерий 5. епгегШс!^ и 5. ¡урЫтипит, проинкубированных в течение 30 мин с пулами 5. ететШя и 5. ¡урИттгшт, соответственно, и агггамерами 8Е-20 и Я Г -12, фиолетовым - начальной опДНК библиотеки. Красным цветом показан уровень флуоресценции бактерий без КЬо-123. Флуоресцентная микроскопия бактерий 5. етегШсИч с Шю-123 в бактериях после инкубации в течение 18 часов с 1мкМ библиотекой оиДНК (В), синтетического пула аптамеров 8Е-7 (С). Флуоресцентная микроскопия бактерий 5. 1урЫтгтит с Иго-123. О) 5.

typh.imu.rium после инкубации с 1мкМ синтетически синтезированного аптамера БТ-12 (60 нуклеотидов) с Юю-123. Увеличение *100 3. Определение антибиотикоустойчивости сальмонелл

В работе впервые предложен и описан способ оценки антибиотикоустойчивости сальмонелл с помощью ДНК-аптамеров к 5. IУрЫтигтт и 5. еп(егИШя, основанный на способности ДНК-аптамеров связываться только с живыми сальмонеллами. В качестве доказательных методов были использованы классические бактериологические методы, в том числе культивирование сальмонелл на питательной среде в чашках Петри. Анализ образцов бактерий, обработанных антибактериальными препаратами показал соответствие методов: бактериологического (Табл.4) и проточно-цитометрического с использованием ДНК-аптамеров (Табл.5). Важным преимуществом использования аптамеров для определения чувствительности к антибактериальным препаратам является скорость проведения анализа и получения результата.

Таблица 4. Оценка чувствительности бактерий 5. /урЫтигтт и 5. еШегШЖя к антибиотикам классическим бактериологическим методом.

Тип пробы Количество колоний, ед. 5. 1урЫтигтт Количество колоний, ед. S. enteritidis

Контроль(п=3) 637±30 500±47

Цефотаксим (п=3) 0 (стерильно) 0 (стерильно)

Азитромицин (п=3) 11±3 8±1

Флемоксин (п=3) 0 (стерильно) 0 (стерильно)

Негативный контроль (п=3) (термически обработанные бактерии) 0 (стерильно) 0 (стерильно)

Таблица 5. Оценка чувствительности бактерий 5. /урЫтигтт и етегШсИя к антибиотикам с помощью аптамеров к 5. /урЫтигтт и Б. еМегШсИя

Тип пробы Уровень флуоресценции (%) бактерий БлурЫтипит. связавшихся с аптамером БТ 12_60 Уровень флуоресценции (%) бактерий S.enteritidis, связавшихся с аптамером 8Е 20_60

Контроль(п=3) 55 97,4

Цефотаксим (п=3) 0 7

Азитромицин (п=3) 0,1 0

Флемоксин (п=3) 0,3 9

Негативный контроль (п=3) (термически 0 0

обработанные бактерии) __

4. Детекция сальмонелл S. enteritidis и S. typhimurium с помощью аитамеров в клеточных суспензиях, клинических образцах и биологических жидкостях

Для детекции сальмонелл в клеточных суспензиях, клинических образцах и биологических жидкостях использовали аптамеры с наилучшей аффинностью к S. enteritidis и S. typhimurium - SE_20 и ST_12 с флуоресцентной меткой А1еха-488. Эти аптамеры хорошо связывались с сальмонеллами и в меньшей степени - с ДНК-библиотекой, бактериями Е. coli, S. aureus, С. freundi, P. aeruginosa и сальмонеллами, подвергшимися термической обработке.

На первом этапе исследований для выявления возбудителей сальмонеллеза использовали модельные суспензии с различным соотношением бактерий. Первый вариант модельной суспензии состоял из бактерий S. typhimurium, вторая клеточная суспензия включала в себя бактерии S. typhimurium и S. enteritidis в соотношении 1:1 и третья клеточная суспензия состояла только из бактерий серотипа S. enteritidis. Результаты анализа этих суспензий с помощью ДНК-аптамеров методом проточной цитометрии представлены на рисунках 8,9. На рисунке 8 представлены результаты, полученные с применением аптамера SE_20, а на рисунке 9 - с применением аптамера ST_12. Аптамер SE_20 связывался с S. enteritidis, а аптамер ST_12 - с S. typhimurium. Анализ связывания сальмонелл с помощью аптамеров SE_20 показал, что в клеточной суспензии, содержащей только бактерии S. typhimurium пик флуоресценции сдвинут влево относительно клеточной суспензии, содержащей только бактерии S. enteritidis. Клеточная суспензия, состоящая из бактерий S. typhimurium и S. enteritidis, давала промежуточный пик флуоресценции. Противоположные результаты были получены при анализе этих же клеточных суспензий с помощью аптамеров ST 12.

Overlay

Бактерии, связанные с SE_20 Рисунок 8 - Выявление бактерий S. enteritidis с помощью аптамеров SE_20 в клеточных суспензиях, состоящих из S. enteritidis и S. typhimurium. 1 - клеточная суспензия, состоящая только из S. typhimurium; 2 - клеточная

суспензия, состоящая из 5. еп1егШск$ и 5.СурЫтигшт в соотношении 1:1; 3 -клеточная суспензия, состощая только из б1. еШегШсЧя

Overlay

Рисунок 9 - Выявление бактерий 5. ¡урЫтипит с помощью аптамеров 8Т_12 в клеточных суспензиях, состоящих из 5. егйегШсИв и 5. ¡урЫтипит. 1

- клеточная суспензия, состоящая только из 5.1урЫтипит; 2 - клеточная суспензия, состоящая из 5. еШегШсИя и 5.¡урЫтипит в соотношении 1:1; 3 -клеточная суспензия, состощая только из 5. еМегШсИя

Дальнейшие испытания аптамеров были проведены на клеточных суспензиях, полученных из смывов с тушек кур. Проведенный с помощью проточной цитометрии анализ этих суспензий показал, что в смывах с куриной тушки присутствуют сальмонеллы серотипа 5. еЫегШсИя (Рис.10). Для доказательства того, что пик флуоресценции в смывах с куриных тушек был связан с присутствием в суспензии сальмонелл еЫегШсИй, кур искусственно контаминировали сальмонеллами 5. IурЫтипит или 5. еп¡егШЛэ, после чего снова делали измерения. Исследования показали, что в суспензии, представляющей собой смыв с тушки, контаминированной бактериями серотипа 5. еМегШсИя, пик флуоресценции, вызванный наличием бактерий 5. еМегШсИэ, связанных с аптамерами, сдвигался. Анализ клеточной суспензии, проведенный с помощью аптамеров к Б. IурЫтипит, не выявил присутствия бактерий этого серотипа в исследуемом образце. Но при искусственной контаминации тушки бактериями 5. /урЫтипит появлялся пик, свидетельствующий о присутствии в клеточной суспензии бактерий серотипа 5. /урЫтипит (Рис. 11).

Таким образом, проведенные исследования показали, что ДНК-аптамеры могут быть использованы для выявления возбудителей сальмонеллеза 5. егиегШсИз и 5. ¡урЫтипит в клеточных суспензиях.

ИБакгерш саятанкыесЭТО

|

бактерии окрашенные аптамером ^ПО я смыве с икса птицы, искусственно зараженного 5Т [1] Империи окрашенные аптамером я сшн с мяса птицы, искусственно зараженного?^ Бактерии окрашенные аптамером &Е20всн«ывес ингактнотомлса птицы Неокрашенные бактерии в смыве с интактного мяса птицы

Интенсивность флуоресценции

411

Оли

□ ли дли

»1

□ #1 □ »1 □ »1

число % сгт общего числа

69 659 100.00

67 981 100,00

69 756 100.00

73 035 100.00

19 953 28.М

39 077 57.-18

13 771 19.7-1

1 0.00

Рисунок 10 - Выявление 5. еЫегШсИв в смывах с образцов куриной тушки (черная кривая); куриной тушки, контаминированной 5. еЫегШсИя (синяя кривая); куриной тушки, контаминированной 5.1урЫтипит (зеленая кривая); красная кривая соответствует неокрашенным бактериям. Выявление 5. егаегШеШ проведено с помощью аптамера 8Е-20

Интенсивность флуоресценции

; Неокрашенныебактериивемыаесимтттомлсаетицы Бактерии окрашенные агпамером 6Т12 в смыве с мяса птицы искусственно зараженною Ы О Бактерни<крашенныеагпамером£Е20всмывеснк1акт)югомжл(Пицы

Бактерии окрашенные агпамером 5П? в смыве с мяса птицы искусственно мрамеииого 5Т число % от общего числа

70 №5 100.00 60 455 100.00 69 762 100,00

71 в» 100.00 0 N.'1

56 0.09 И 0.02 1 520 2.12

Рисунок 11 - Выявление 5. ¡урЫтипит в смывах с образцов куриной тушки (черная кривая); куриной тушки, контаминированной 5. еЫегШсНь (синяя кривая); куриной тушки, контаминированной 5.1урЫтипит (зеленая кривая); красная кривая соответствует неокрашенным бактериям. Выявление 5. ¡урЫтипит проведено с помощью аптамера БТ-12_80

Помимо модельных экспериментов по выявлению сальмонелл были проведены испытания ДНК-аптамеров на клинических образцах, полученных из Роспотребнадзора. Исследования клинических образцов, содержащих & еЫегШсИя и 5. ¡урЫтипит, проводили с помощью аптамеров БЕ_20 и БТ_12 на проточном цитометре.

Для создания протокола использовали сальмонеллы, которые не были связаны с аптамерами и поэтому не давали флуоресценции в заданном гейте. Кроме того, проверяли перекрестную связываемость для определения уровня неспецифического связывания - аптамеры к 8Е_20 проверяли на связываемость с Б. IурЫтипит, а аптамеры - на связываемость с Б.

еп1епйсИ$ (Рис.12), поскольку хорошо известно, что аптамеры, как и

моноклональные антитела, обладают способностью неспецифически связываться с различными мишенями. Кроме того, ДНК-аптамеры исследовали на аффинность и специфичность. Аффинность аптамеров определяли при их инкубации со своими мишенями - S. enteritidis или S. typhimurium (Рис.13), специфичность ДНК-аптамеров определяли при их инкубации с другими бактериями - Е. coli и Р. aeruginosa. При исследовательских испытаниях клинических образцов уровень неспецифического связывания аптамеров учитывали.

Примеры определения содержания сальмонелл S. enteritidis и S. typhimurium в клинических образцах с помощью аптамеров SE_20 и аптамеров ST_12 методом проточной цитометрии приведены на рисунках 14,15. Исследования показали, что в одном клиническом образце присутствуют сальмонеллы серотипа S. enteritidis, в другом - S. typhimurium.

g-07-22 1609 049.LMD

S-07-23 1337 205.LMD

FS Un

FS ün 102e

Рисунок 12 - Перекрестная связываемость - S. typhimurium (аптамер SE_20), S. enteritidis (аптамер ST_12)

-07-22 2102 192.LMD 81-07-22 1856 128-LMD

-а о - ¥

ST (233 события)

FS Lin юг"

FS Lin

Рисунок 13- Определение уровня связываемости аптамеров с мишенью - S. enteritidis с аптамером SE_20, S. typhimurium с аптамером ST_12.

-07-22 1611 OSO.LMO S-07-22 210S 194.LMD

—в 8 /в---f?

FS Un

tStl^k-Sf'i^'r

FS Lin

Рисунок 14 - Образец 2011(39). В образце находится S. enteritidis

Рисунок 15 - Образец 2012(59). В образце находится 5. ¡урЫтигтт

Для проверки результатов исследования клинических образцов, полученных методом проточной цитометрии с помощью аптамеров, проводили генотипирование сальмонелл, находящихся в этих образцах. Сопоставление результатов, полученных с помощью ДНК-аптамеров к 5. enteritidis и 5. гурЫтигтт методом проточной цитометрии и генотипирования, показало их полное соответствие.

ВЫВОДЫ

1. С помощью технологии cell-SELEX, где в качестве позитивных мишеней были использованы живые бактерии S. enteritidis или S. typhimurium, а в качестве негативных, термически обработанные сальмонеллы и живые бактерии Е. coli, S. aureus, P. aeruginosa и С. freundi, были получены ДНК-аптамеры с высокой аффинностью и специфичностью к наиболее распространенным и патогенным серотипам сальмонелл - S. enteritidis и S. typhimurium. Пулы 7 раунда

селекции, с наилучшими характеристиками связывания, были клонированы и секвенированы, 10 ДНК-аптамеров - к S. enteritidis и 8 ДНК-аптамеров - к S. typhimurium были синтезированы и использованы в исследованиях.

2. Показано, что кажущиеся константы диссоциации (Kd) аптамеров для S. enteritidis и S. typhimurium лежат в области наномолярных значений. Наименьшую кажущуюся константу диссоциации имеет аптамер ST-12_60 (4,5 нМ), наибольшую - SE-34_80 (56 нМ).

3. Разработан способ идентификации двух серотипов сальмонелл - S. enteritidis и S. typhimurium в клеточных суспензиях с помощью ДНК-аптамеров методом проточной цитометрии.

4. Разработан способ определения антибиотикоустойчивости сальмонелл S. enteritidis и S. typhimurium с помощью ДНК-аптамеров, основанный на способности аптамеров связываться только с живыми бактериями.

5. Вьиснено, что смесь синтетических ДНК-аптамеров к S. enteritidis и S. typhimurium подавляет рост колоний бактерий более чем на 70%.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Замай Т.Н., Замай А.С., Замай О.С.. Салмина А. Б., Перьянова О. В., Решетнева И. Т., Дмитриева Г. М., Остапова Т. С., Замай Г. С., Еркаев Е. Н. Новый перспективный способ идентификации возбудителя сальмонеллеза // Вестник новых медицинских технологий. -2011. -Т. 18. -№ 4. -С.36-39.

2. Labib М. В., Zamay A. S., Kolovskava О. S.. Reshetneva I. Т., Zamay G. S., Kibbee R. J., Sattar S. A., Zamay T. N., Berezovski M. V. Aptamer-Based Impedimetric Sensor for Bacterial Typing // Anal. Chem. -2012.-V. 84. -№ 19.-P. 8114-8117.

3. Labib M. В., Zamay A. S., Kolovskava O. S.. Reshetneva I. Т., Zamay G. S., Kibbee R. J., Sattar S. A., Zamay T. N., Berezovski M. V. Aptamer-based Viability Impedimetric Sensor for Bacteria // Anal. Chem. (Letter). -2012. -V.84. -№ 21. -P. 8966- 8969.

4. Замай Т. H., Замай А. С., Коловская О. С.. Савицкая А. Г., Замай Г. С., Крат А. В., Решетнева И. Т., Малышева Е. А., Зубкова О. А., Спивак Е. А. Новые технологии создания средств диагностики и терапии на основе аптамеров // Сибирское медицинское обозрение. — 2012. -V.5. -№ 77. -С.3-7.

5. Замай Т. Н., Савицкая А. Г., Замай А. С., Дубынина А. В., Коловская О. С.. Решетнева И. Т., Кузнецова С. А., Замай Г. С., Титова Н. М., Петрова Л. JL, Труфанова JL В., Перьянова О. В. Определение чувствительности возбудителей сальмонеллеза Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium к антибактериальным препаратам с помощью метода проточной цитометрии // Известия Самарского

научного центра Российской академии наук. -2012. -Т. 14. -№ 5. -С. 455- 459.

6. Kolovskava О. S.. Savitskaya A. G., Zamay Т. N.. Reshetneva I. Т., Zamay G. S., Erkaev Е. N., Wang X. В., Wehbe М. В., Salmina А. В., Perianova О. V., Zubkova О. A., Spivak Е. A., Mezko V. S., Titova N. М„ Berezovski М. V., Zamay A. S. Development of Bacteriostatic DNA Aptamers for Salmonella // Journal of Medicinal Chemistry. -2013. -V. 56. -№4. -P. 1564-1572.

Отпечатано в полиграфическом центре «Печатный двор» 660041, г. Красноярск, ул. Марковского, д. 19. Тел.:(391)294-91-04 Подписано в печать 29.03.2014. Формат 60x90/16. Печать офсетная 2 усл. п. л. Заказ № 0757. Тираж 100 экз.