Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальные подходы к обнаружению опухолеспецифичных молекул в крови онкологических больных с использованием ДНК-аптамеров

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальные подходы к обнаружению опухолеспецифичных молекул в крови онкологических больных с использованием ДНК-аптамеров"

На правах рукописи

Л /'

ЗАМАИ ГАЛИНА СЕРГЕЕВНА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К ОБНАРУЖЕНИЮ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧНЫХ МОЛЕКУЛ В КРОВИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-

АПТАМЕРОВ (НА ПРИМЕРЕ РАКА ЛЕГКОГО ЧЕЛОВЕКА)

03.01.04-биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

005550145

Новосибирск - 2014

005550145

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

д.м.н., профессор Салмина Алла Борисовна

Официальные оппоненты:

Франк Людмила Алексеевна, д.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биофизики СО РАН, в.н.с.

Воробьева Мария Александровна, к.х.н. Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, н.с.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН

Защита состоится «27» июня 2014 г. в 12.00 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8. /»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан «2Лу> 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н, доцент

Коваль В. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди всех видов онкозаболеваний рак легкого (РЛ) является наиболее распространенной формой злокачественных новообразований (Пономарева А.А., 2011). Он затрагивает более миллиона людей по всему миру (Артамонова Е.В., 2011) и составляет около 25 % всех смертей от рака (Агуа S.K., 2011, Sung H.J., 2008). Относительная пятилетняя выживаемость пациентов при раке легкого очень низка, она составляет 1315% для развитых стран (Fiorentino F.P., 2011) и 9% для развивающихся (Шевченко В.Е., 2007).

Несмотря на разнообразие существующих методов диагностики рака легкого, основная масса больных выявляется в IV стадии, когда исход лечения уже является неблагоприятным (Chen H.W., 2008, HofFman P.C., 2000, Mulshine J.L., 2005). Выявляемость больных с I-II стадиями составляет 26,5%, а больных с III-IV стадиями - около 66,4% (Левченко Е.В., 2006, Чиссов В.И., 2009). При этом 5-летняя выживаемость после лечения I стадии РЛ соответствует 70%, а IV стадии - менее 5% (Левченко Е.В., 2006).

Для выявления опухолеспецифичных мишеней могут использоваться аптамеры - одноцепочечные ДНК- или РНК-олигонуклеотиды, которые благодаря уникальным конформациям и пространственному расположению зарядов имеют высокую специфичность и сродство к заданным мишеням (Кульбачинский А.В., 2006). Аптамеры получают из ДНК- или РНК-библиотек путем технологии селекции (SELEX) (Ellington A.D., 1990), позволяющей осуществлять направленный отбор олигонуклеотидов к большому спектру биологических мишеней - от вирусных частиц до целых клеток. Благодаря высокой чувствительности аптамеров (Iliuk А., 2011) можно определять наличие циркулирующих раковых клеток или продуктов распада опухоли в крови больных онкологическими заболеваниями.

Аптамеры, специфичные для опухолей различных типов, обычно подбираются к целым раковым клеткам или рекомбинантным опухолевым белкам. В литературе описана селекция аптамеров к клеточным культурам некоторых гистологических типов РЛ и показана потенциальная возможность их применения для детекции раковых клеток легкого (Zhao Z., 2009; Chen H. W., 2008; Kunii T., 2011). Однако аптамеры, подобранные к целым раковым клеткам, являются специфичными только к поверхностным белкам, находящимся на клеточной мембране.

В крови больных онкологическими заболеваниями присутствуют не только циркулирующие опухолевые клетки, но и некротические клетки, экзосомы, мембранные микрочастицы, апоптотические тельца, микроэмболы, продукты распада опухоли, содержащие большое количество внутриклеточных молекул-мишеней. Возможность детекции в крови больных большего спектра молекулярных мишеней с помощью высокоаффинного и специфичного к ним пула аптамеров существенно расширяет диагностические возможности и создает предпосылки для

разработки более чувствительных методов выявления ранних стадий онкологических заболеваний.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось получение аптамеров на основе одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов к тканям аденокарциномы легкого человека и экспериментальное обоснование возможности их использования для выявления опухолеспецифичных молекул в образцах периферической крови больных.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. С помощью технологии БЕЬЕХ провести селекцию одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов к опухолевой ткани легкого человека и выбрать наиболее специфичный и аффинный пул аптамеров.

2. Разделить пул аптамеров на отдельные клоны с помощью бактериального клонирования, произвести секвенирование отдельных клонов аптамеров и на его основе осуществить синтез искусственных аптамеров.

3. Изучить свойства синтетических ДНК-аптамеров и выделить из них аптамеры, наиболее аффинные и специфичные к опухолевой ткани легкого человека.

4. Показать принципиальную возможность выявления циркулирующих опухолевых клеток и продуктов распада опухолевой ткани в образцах периферической крови с помощью аптамеров.

5. Определить белковые биомаркеры рака легкого методом аффинного обогащения с помощью аптамеров.

Научная новнзна.

1. Впервые проведена селекция аптамеров к тканям послеоперационного материала рака легкого человека (аденокарцинома легкого) с применением негативной селекции к условно здоровым тканям легкого и цельной крови здорового человека.

2. Получен уникальный пул аптамеров с высокой аффинностью и специфичностью к ткани аденокарциномы легкого человека.

3. Разработана новая методика выявления циркулирующих опухолевых клеток, циркулирующих опухолевых микроэмбол и апоптотических телец в периферической крови больных раком легкого человека.

4. Впервые методом аффинного обогащения с помощью аптамеров определены новые молекулы-кандидаты в биомаркеры аденокарциномы.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты расширяют представление о возможности использования аптамеров для диагностики онкологических заболеваний. Разработанный алгоритм селекции аптамеров и определения их специфичности к белкам-биомаркерам опухолевых клеток может быть применен для разработки диагностических тест-систем на основе аптамеров. Модификация стандартной технологии селекции аптамеров к опухолевым тканям легкого, описанная в работе, может быть применена для получения аптамеров для диагностики других раковых опухолей.

Практическая значимость работы заключается в том, что на основе полученных уникальных последовательностей ДНК аптамеров к опухолевым тканям легкого может быть разработан метод ранней диагностики рака легкого человека.

Апробация результатов. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе, 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 1 статья в зарубежном журнале. Результаты исследования были представлены на международном научном семинаре с молодежной школой "Биотехнология новых материалов и окружающая среда" (2011); на конференции молодых ученых в ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» (2012); на всероссийской конференции с международным участием «Научно-практические аспекты модернизации онкологической службы регионального уровня» (2012); семинарах ассоциированной Российско-Канадской лаборатории BioMeT и НИИ молекулярной медицины и патобиохимии ГБОУ ВПО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России (20122013); на международной конференции в Тайвани «13th Tetrahedron Symposium» (2012); на международной конференции в Италии «9nt Annual Meeting of the Oligonucleatide Therapeutics Society» (2013); на международной конференции в Англии «lst International Symposium and Exibition Aptamers 2014» (2014).

Структура и объем работы. Материал диссертации изложен на 137 страницах машинописного текста, иллюстрирован 36 рисунками, 8 таблицами. Работа состоит из введения, глав: обзор литературы; материалы и методы; результаты собственных исследований; обсуждения; выводов; списка литературы. Список литературы состоит из 162 источников, из которых 32 российских и 130 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Селекция аптамеров

Послеоперационный материал ткани аденокарциномы легкого человека и прилежащий к ней материал здоровой ткани легкого были любезно предоставлены Красноярским краевым клиническим онкологическим диспансером им. А.И. Крыжановского с одобрения Этического комитета при диспансере. Забор послеоперационного материала аденокарциномы легкого проводили с информированного согласия пациентов.

Селекцию аптамеров к тканям легкого проводили по технологии SELEX (Sefah К., 2012, Ellington A.D., 1990) путем чередования позитивной селекции к раковым тканям аденокарциномы легкого и негативной селекции к здоровым тканям легкого и цельной крови здоровых людей.

Ход селекции аптамеров отслеживали по наличию 80 нуклеотидной оцДНК в ПЦР-продукте с помощью агарозного гель-электрофореза (рис.1).

Рисунок 1 - Электрофореграмма конечных ПЦР-продуктов зкД1ПС-аптамеров к раку легкого человека полученных в ходе 8, 9,10,11 раундов селекции. Где 8, 9, 10, 11 - номер раунда селекции, «-» и «+» - отрицательный и положительный контроля, соответственно

Аффинность полученных пулов аптамеров к клеткам аденокарциномы легкого оценивали с помощью проточной цитометрии (рис.

2).

9 10

□спш аспзаа

Рисунок 2 - Интенсивность флуоресценции клеток рака легкого, связанных с пулами аптамеров разных раундов селекции.

Пул аптамеров 10 раунда селекции с наибольшей аффинностью связывания с клетками аденокарциномы легкого человека клонировали, секвенировали и синтезировали.

Было секвенировано 30 последовательностей, из которых было синтезировано ¡0 последовательностей. Синтезированные

последовательности аптамеров представлены в таблице 1.

Таблица 1. Последовательности синтезированных ДНК-олигонуклеотидов

№ Название клона Количество нуклеотидов Последовательность нуклеотидов

1 17 80 ctcctctgac tgtaaccacg cttttgtctt tagccgaatt ttactaagcc gggctgatca gcataggtag tccagaagcc

2 18 80 ctcctctgac tgtaaccacg tgcccgaacg cgagttgagt tccgagagct ccgacttctt gcataggtag tccagaagcc

3 110 80 ctcctctgac tgtaaccacg ttaggcgaga acatgtcagt acgtcgacgt tctacttgct gcataggtag tccagaagcc

4 118 80 ctcctctgac tgtaaccacg tgctggttcg tactacacga tatcgccgcc ggcgcgtaca gcataggtag tccagaagcc

5 224 80 ctcctctgac tgtaaccacg ccggtaaatt ctcctgacgc cggggtaagt ttctgaaatg gcataggtag tccagaagcc

6 183 80 ctcctctgac tgtaaccacg atttcgatcg ctctgagact gccaacgtcc caccattcgc gcataggtag tccagaagcc

7 2114 80 ctcctctgac tgtaaccacg tacagctgtt gaactggtag ggctacgcta acacatggtc gcataggtag tccagaagcc

8 2107 80 ctcctctgac tgtaaccacg cgcggtgaag ggtatatcca ctgcgtcccg tgccgtcggt gcataggtag tccagaagcc

9 29 80 ctcctctgac tgtaaccacg gggtatcttc gccatgtctg agagggttaa agctcgactt gcataggtag tccagaagcc

10 2108 80 ctcctctgac tgtaaccacg cccagagtca gtgcggccct tccttacagt ttacccccga gcataggtag tccagaagcc

2. Оценка аффинности и специфичности аптамеров

Аффинность аптамеров к клеткам аденокарциномы легкого и специфичность к нормальным клеткам легкого и лимфоцитам определялась с помощью проточной цитометрии. На рисунке 3 представлена диаграмма, обобщающая результаты анализа связывания аптамеров с клетками аденокарциномы легкого, нормальными клетками легкого и лимфоцитами.

На диаграмме видно, что количество клеток аденокарциномы легкого (в процентном соотношении), связавшихся с аптамерами, на порядок превышает количество нормальных клеток легкого и лимфоцитов, связавшихся с аптамерами. Это подтверждает, что полученные аптамеры могут быть использованы для детекции клеток аденокарциномы легкого в различных образцах.

к

^ ф «£> ^ V

ЧГ ЧГ ЧГ

1>

оУ

Аптамеры, проинкубированные с клетками аденокарциномы легкого

■ Аптамеры, проинкубированные с лимфоцитами

■ Аптамеры, проинкубированные с нормальными клетками легкого

Рисунок 3 - Связывание аптамеров с клетками аденокарциномы легкого, нормальными клетками легкого и лимфоцитами.

Кажущаяся константа диссоциации была определена для аптамера 18_80, обладающего наибольшей аффинностью к клеткам аденокарциномы легкого. На рисунке 4 отображена зависимость количества связавшихся с аптамерами клеток аденокарциномы легкого от концентрации аптамеров в обратных координатах Лайнуивера-Берка.

0,5

0,4

у = 2,0169х+ 0,0316 ^

0,3

0,2

-ОД -0,0

0,05 ОД 0,15 0,2

0,25

1/Концентрация аптамера, 1/нМ

Рисунок 4 - Зависимость количества связавшихся с аптамерами клеток аденокарциномы легкого от концентрации аптамеров в обратных координатах Лайнуивера-Берка.

Кажущаяся константа диссоцации аптамера 18_80 аденокарциномы легкого составила: Ка = 63,8±6,9 (нМ).

клетками

Полученная константа диссоцации лежит в наномолярном диапазоне, что говорит о высоком сродстве аптамеров к своей мишени.

3. Конфокальная микроскопия клеток аденокарциномы легкого, связавшихся с аптамерами и антителами к цитокератинам

Для того чтобы подтвердить специфичность связывания аптамеров с эпитопами, отличными от эпитопов связывания цитокератинов, была проведена конфокальная микроскопия клеток аденокарцинмы легкого, выделенных из послеоперационной ткани пациентов.

Результаты конфокальной микроскопии представлены на рисунках 5-7.

Из представленных рисунков видно, что аптамеры, меченые красной флуоресцентной меткой Су'З, связывались с отличными от цитокератинов эпитопами. Кроме того было показано, что аптамеры 183_80 и 110_80 (рис. 5, 7) проходили внутрь клеток, связываясь с клеточными ядрами. Аптамер 18_80 связывался с поверхностными структурам клеток аденокарциномы (рис. 6). Представленные результаты говорят о специфичности аптамеров как к вне- так и внутриклеточным белкам. Это может подтвердить, что мишенями для селекции аптамеров к измельченным тканям рака легкого, явился широкий спектр белков - от поверхностных до внутриклеточных.

¡¡I ¡в т

25 Ш'- * <г © * *,

Рисунок 5 - Конфокальная микроскопия клеток аденокарциномы легкого, проинкубированных с аптамером 110 80, меченым меткой Су'З (красный) и антителами к цитокератинам, мечеными меткой FITC (зеленый). 1А-2А -

фазово-контрастная микроскопия, 1В-2В - конфокальная лазерная микроскопия, наложение зеленого и красного каналов, 1С-2С - фазовый контраст и флуоресценция зеленого и красного каналов (наложение). Увеличение - 60Х.

Рисунок 6 - Конфокальная микроскопия клеток аденокарциномы легкого, проинкубированных с аптамером 18_80, меченым меткой Су'З (красный) и антителами к цитокератинам, мечеными меткой Р1ТС (зеленый). 1А-ЗА -

фазово-контрастная микроскопия, 1В-ЗВ - конфокальная лазерная микроскопия, наложение зеленого и красного каналов, 1С-ЗС - фазовый контраст и флуоресценция зеленого и красного каналов (наложение).

Увеличение - 60Х.

-:-5Д- В 18 В * 1С. " - ¡¡¡р Ж

2В - -V В

Ц ю

Рисунок 7 - Конфокальная микроскопия клеток аденокарциномы легкого, проинкубированных с аптамером 183_80, меченым меткой Су'З (красный) и антителами к цитокератинам, мечеными меткой РП'С (зеленый). 1А-2А -

фазово-контрастная микроскопия, 1В-2В - конфокальная лазерная микроскопия, наложение зеленого и красного каналов, 1С-2С - фазовый контраст и флуоресценция зеленого и красного каналов (наложение). Увеличение - 60Х. 8

4. Выявление опухолевых элементов в крови больных раком легкого человека

Для доказательства возможности потенциального использования аптамеров для выявления рака легкого человека по анализу образцов цельной крови больных был использован метод проточной цитометрии. Затрудняющие анализ эритроциты, находящиеся в образце разрушались с помощью лизирующего раствора OptiLize (Beckman Coulter Inc., США). Образцы крови окрашивали с помощью аптамера 18 80, меченого флуоресцентной меткой FAM. Для подтверждения наличия в крови больных циркулирующих опухолевых клеток, были приготовлены образцы, окрашенные моноклональными антителами к цитокератинам, мечеными флуоресцентной меткой FITC. Флуоресценцию аптамеров, связавшихся с раковыми клетками и продуктами распада опухоли, циркулирующими в крови, определяли на проточном цитометре. Результаты, полученные с помощью проточной цитометрии, представлены на рисунках 8 и 9.

2А

1В

w w «.' RI

Мй

28

W IV *f F11

wf W itf

зв

Шк "ЯпР^-' tli

h-J

Рисунок 8 - Анализ образцов крови больных раком легкого человека 3-4 стадий заболевания с помощью аптамеров. 1 А, 2А, ЗА - анализ образцов крови людей, больных раком легкого, выполненный с использованием аптамеров; 1В, 2В, ЗВ - анализ образцов крови людей, больных раком легкого, выполненный с использованием антител к цитокератинам.

[

1А 2А

Н* № № № 15' «; №

П.1 П.1

Рисунок 9 - Анализ образцов крови больного раком почки и здорового человека с помощью аптамеров и антител к цитокератинам. 1А, 1В - анализ образца крови больного раком почки 4 стадии заболевания, выполненный с использованием аптамеров или антител к цитокератинам, соответственно;

2А, 2В - анализ образца крови здорового человека, выполненный с использованием аптамеров и антител к цитокератинам.

Как видно из рисунка 8, аптамер обладал способностью связываться с молекулярными мишенями, присутствующими в крови больных раком легкого человека (рисунок 8, 1А, 2А, ЗА). Поскольку, при исследовании образцов крови больных раком легкого, окрашенных антителами к цитокератинам, также наблюдалась флуоресценция (рисунок 8, 1В, 2В, ЗВ), было предположено, что аптамер связывается с цитокератин-положительными мишенями, присутствующими в крови больных.

Из рисунка 9 видно, что при исследовании образцов крови больного раком почки и здорового человека, проинкубированных с аптамером, флуоресценции не наблюдалось (рисунок 9, 1А, 2А) ввиду отсутствия в крови больного раком почки и здорового человека молекулярных мишеней для аптамера. Наличие флуоресценции в образце крови больного раком почки, проинкубированного с антителами к цитокератинам говорит о присутствии цитокератин-положительных мишеней в крови больного (рисунок 9, 1В).

Для более точной идентификации мишеней, с которыми связываются аптамеры, использовали методы флуоресцентной и конфокальной микроскопии. Образцы крови инкубировали с гипотоническим раствором хлорида аммония для удаления эритроцитов и с гипотоническим раствором хлорида натрия для частичного разрушения лейкоцитов. После этого образцы

окрашивались аптамерами, мечеными красной флуоресцентной меткой Су'З, и антителами к цитокератинам, мечеными зеленой флуоресцентной меткой FITC, и исследовались с помощью конфокального микроскопа Olympus Fluoview 10vi (Olympus Optical Co., Япония) (рис. 10).

Из рисунка 10 видно, что аптамеры и антитела к цитокератинам связываются с различными эпитопами на циркулирующих опухолевых клетках в крови больного аденокарциной легкого.

Также готовились мазки, для приготовления которых полученные образцы, окрашенные аптамерами и антителами к цитокератинам, равномерно наносились на предметные стекла, фиксировались в метаноле и окрашивались с помощью краски Романовского-Гимза. Мазки исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии.

Результаты флуоресцентной микроскопии мазков образцов, фиксированных в метаноле и окрашенных по Романовскому-Гимза, приведены на рисунке 11.

Рисунок 10 - Конфокальная микроскопия образца крови пациента, больного аденокарциномой легкого человека, проинкубированного с антителами к

цитокератинам, мечеными флуоресцентной меткой Р1ТС (зеленый), и аптамерами, мечеными флуоресцентной меткой Су'З (красный). 1А-ЗА -

фазово-контрастная микроскопия; 1В-ЗВ - лазерная конфокальная микроскопия, наложение зеленого и красного каналов; 1С-ЗС - фазовый контраст и флуоресценция, наложение. Увеличение - 60Х.

1А 1В ••V . . т

гл Ъ* 2В ■■ т & ■ •г- .5 Щ.::?

ЗА ЗВ 1 »ШЯ&ф 'мшт Л**«*»

Рисунок 11 - Флуоресцентная микроскопия мазков, полученных из образцов крови людей больных аденокарциномой легкого (железистый рак легкого) (1,2) и железисто-плоскоклеточным раком легкого (3). Образцы крови окрашивались с помощью антител к цитокератинам, меченых флуоресцентной меткой РГГС (1А, 2А, ЗА), и аптамеров, меченых флуоресцентной меткой Су'З (1В, 2В, ЗВ). 1С-ЗС - световая микроскопия, 1А-ЗА, 1В-ЗВ-флуоресцентная микроскопия. Увеличение 100Х.

4.Анализ гистологических срезов с помощью аптамеров

Специфичность аптамеров к тканям аденокарциномы легкого также была проверена с помощью анализа гистологических срезов (рис. 12-13). Ткани фиксировались в 4% параформальдегиде, резались на микротоме и трижды отмывались раствором ТЯГТОЫ-ХЮО и фосфатным буфером, содержащим Са2+ и М§2+. После чего окрашивались с помощью аптамеров и антител к цитокератинам.

Из рисунка 12 видно, что срез, полученный из ткани аденокарциномы легкого, окрасился аптамерами, мечеными флуоресцентной меткой Су'З и антителами к цитокератинам, мечеными флуоресцентной меткой БИС. На рисунке 13 представлен гистологический срез хондрогемартомы легкого, проинкубированного с аптамерами, мечеными флуоресцентной меткой Су'З и антителами к цитокератинам, мечеными флуоресцентной меткой РГГС. Из рисунка видно, что отдельные клетки связались с антителами к цитокератинам, мечеными флуоресцентной меткой Р1ТС. Отсутствие свечения в красном диапазоне говорит о том, что аптамеры не связались с тканями хондрогемартомы легкого.

I

I

Рисунок 12 - Конфокальная микроскопия гистологического среза аденокарциномы легкого. 1А, 1В, 1С - контроль. 2А, 2В, 2С - срез, окрашенный аптамерами, мечеными флуоресцентной меткой Су'З (красный)

и антителами к цитокератинам, мечеными флуоресцентной меткой Р1ТС (зеленый). 1 А, 2А - фазовый контраст; 1В, 2В - флуоресценция, наложение зеленого и красного каналов; 1С, 2С - фазовый контраст и флуоресценция, наложение. Увеличение 10Х.

ШИЛ Ян ЩШш тш ЩШ штш |''V 1В ШЩ'МШвшШШи Шт тШШ ¡ШшшшвщШ нш яр» ' тшШШШ

ШЙ! ч ' Г" '«Ф ИР Ф ШШШ'1 цЦЦ шш ■ . ■ •« 'Ш

Рисунок 13 - Конфокальная микроскопия гистологического среза хондрогемартомы легкого. 1А, 1В, 1С - контроль. 2А, 2В, 2С - срез, окрашенный аптамерами, мечеными флуоресцентной меткой Су'З (красный)

и антителами к цитокератинам, мечеными флуоресцентной меткой Р1ТС (зеленый). 1А, 2А - фазовый контраст; 1В, 2В - флуоресценция, наложение зеленого и красного каналов; 1С, 2С - фазовый контраст и флуоресценция, наложение. Увеличение 10Х.

5. Выявление мишенен аптамеров — потенциальных биомаркеров рака легкого Для выявления биомаркеров, специфичных для аденокарциномы, было проведено выделение комплексов аптамеров с белками опухолевых тканей легкого. Подготовка белковых проб - мишеней аптамеров была проведена согласно модифицированной методике Ар1аВШ для поиска биомаркеров дендритных клеток (ВегегоувЫ М.\Л е1 а1., 2008).

Методом масс-спектрометрии как кандидат в мишени одного из аптамеров 183_80 был определен белок кате псин Б (Табл. 2)

Роль катепсина Б и его клиническое значение в развитии рака легкого является спорным, исследования, проведенные различными группами, показали, что катепсин Э может играть роль в регуляции роста и дифференцировке различных гистологических типов рака легкого (Оа^апо ЬеЮ, 2004).

Таблица 2. Значения показателей, полученных при обработке масс-спекгрометрических данных с помощью программы Мах(2иат 1.3 для белка кандидата в мишени аптамера 183_80.

Название белка Количество уникальных пептидов по которым был определен белок в образцах с аптамером в трех независимых экспериментах Коэффициент корреляции между содержанием белка в образцах с аптамером и ДНК-библиотекой в трех независимых экспериментах Отношение значений «LFQ intensity» в образцах с аптамером и ДНК-библиотекой в трех независимых экспериментах

1 2 3 1 2 3 1 2 3

Катепсин D 7 6 6 0,95 0,48 0,86 22,4 1,8 25,2

выводы

1. С помощью модифицированной технологии БЕЬЕХ, где в качестве позитивной мишени использовались измельченные ткани аденокарциномы легкого, а в качестве негативной мишени использовались нормальные ткани легкого и цельная кровь здоровых людей, были получены ДНК-аптамеры, показавшие специфичность и аффинность связывания с клетками аденокарциномы легкого человека. Аффинность пулов аптамеров, полученных в результате селекции определялась с помощью метода проточной цитометрии, результаты которой показали, что наибольшей аффинностью связывания с клетками аденокарциномы легкого обладает пул аптамеров 10 раунда селекции. В результате бактериального клонирования пула 10-го раунда селекции аптамеры были разделены на отдельные клоны. Было секвенировано 30 последовательностей аптамеров, из которых было синтезировано 10 последовательностей аптамеров.

2. Результаты, полученные с помощью проточной цитометрии, показали, что синтетические ДНК-аптамеры 17_80, 18_80, 110_80 обладают высоким сродством к своей мишени. Кажущаяся константа диссоциации комплекса аптамера 18_80 с клетками аденокарциномы легкого составила 63,8 ± 6,9 нМ.

3. Методом проточной цитометрии было показано, что синтетические ДНК-аптамеры с флуоресцентной меткой позволяют выявлять опухолеспецифичные мишени в клинических образцах периферической крови больных аденокарциномой легкого. Методами конфокальной и флуоресцентной микроскопии было показано, что синтетические ДНК-аптамеры позволяют детектировать циркулирующие опухолевые клетки, микроэмболы и апоптотические тельца в образцах периферической крови больных аденокарциномой легкого.

4. Проведен поиск белка-мишени аптамера 183-80 методом аффинного обогащения с последующим масс-спектрометрическим анализом. Показано, что наиболее вероятной мишенью аптамера является белок катепсин О.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Замай О. С., Замай Г. С.. Замай А. С., Еракев Е. Н., Замай Т. Н. Селекция аптамеров к опухолевой ткани легкого человека // Вестник Сибирского государственного аэрокосмического университета. -2011. -Т. 40. -№ 7. -С. 199-203.

2. Замай Г. С.. Коловская О. С., Глазырин Ю. Е., Оседко А. В., Замай А. С., Малышева Е. А., Савицкая А. Г., Крат А. В., Салмина А. Б., Котловский Ю. В., Замай Т. Н. Разработка технологии идентификации биомаркеров с помощью аптамеров на примере плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы // Сибирское медицинское обозрение. -2012.-Т. 78. -№ 6. -С. 9-13

3. Замай Т. Н., Замай А. С., Коловская О. С., Савицкая А. Г., Замай Г. С.. Крат Е. А., Решетнева И. Т., Малышева А. В.„ Зубкова О. А., Спивак Е.

A. Новые технологии создания средств диагностики и терапии на основе аптамеров // Сибирское медицинское обозрение. -2012. -Т. 77. -№ 5. -С. 3-7.

4. Замай Т. Н., Замай Г. С.. Замай А. С., Коловская О. С., Малышева Е. А., Савицкая А. Г., Крат А. В., Бельтюков В. К., Модестов А. А., Попов Д.

B., Петрова Л. Л., Труфанова Л. В., Зубкова О. А. Метод диагностики рака легкого человека с помощью одноцепочечных ДНК-олигонуклеотидов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. -2012. -Т. 2. -№ 5. -С. 452-454.

5. Zamay A., Zamav G.. Glazyrin Y., Zamay Т., Krat A., Modestov A., Zubkova O., Spivak E., Sukhovolskaya M., Kuznetsova S., Salmina A., Berezovski M., Kolovskaya O. DNA aptamers to human lung cancer adenocarcinoma shows antitumor effect // Oligos & Peptides - Chimica Oggi - Chemistry Today, -2014. -V. 32. -P.18-22.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю благодарность нашему творческому коллективу, без постоянной помощи и поддержки которого эта работа не могла бы состояться.

Особой признательностью хотелось бы отметить: профессора Университета Оттавы Березовского Максима Валентиновича за постоянную методическую поддержку по селекции аптамеров;

врача-онколога Красноярского Краевого Клинического Онкологического Диспансера им. А.И. Крыжановского Крата A.B. за плодотворное сотрудничество;

главного врача Модестова A.A. Красноярского Краевого Клинического Онкологического Диспансера им. А.И. Крыжановского за предоставление доступа к послеоперационному материалу;

научного сотрудника НИИ молекулярной медицины и патобиохимии Коловскую Ольгу за безотказную помощь и поддержку в проведении экспериментов;

доцента кафедры биохимии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Замай Анну Сергеевну за советы и помощь в работе.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации и Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (Государственный контракт№ 16.512.11.2090).

Отпечатано в полиграфическом центре «Печатный двор» 660041, г. Красноярск, ул. Марковского, д. 19. Тел.: (391)294-91-04 Подписано в печать 29.03.2014. Формат 60x90/16. Печать офсетная 2 усл. п. л. Заказ № 0756. Тираж 100 экз.