Структура аптамерных ДНК/РНК - как основа для создания лекарственных препаратов и регуляторных элементов

Спиридонова, Вера Алексеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура аптамерных ДНК/РНК - как основа для создания лекарственных препаратов и регуляторных элементов
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структура аптамерных ДНК/РНК - как основа для создания лекарственных препаратов и регуляторных элементов"

На правах рукописи

Спиридонова Вера Алексеевна

Структура аптамерных ДНК/РНК - как основа для создания лекарственных препаратов и регуляторпых элементов

03.01.02 - биофизика 03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

4844255

Москва-2011

2 1 АПР 2011

4844255

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор

Розенфельд Марк Александрович

Доктор биологических наук

Карпова Ольга Вячеславовна

Доктор химических наук, профессор

Ямсков Игорь Александрович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 18 мая 2011 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля по адресу: Москва, ул. Косыгина, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института химической физики им. H.H. Семенова РАН

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета 002.039.01

канд. хим. наук Мазалецкая Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прошедшее десятилетие ознаменовалось существенным прорывом в использовании фундаментальных знаний о ДНК/РНК в прикладных работах. Бурный прогресс был связан с тем, что эти молекулы участвуют в хранении и передаче наследственной информации последующим поколениям. До недавнего времени нуклеиновые кислоты (НК) рассматривали как ленточные структуры, способные только к приему и передаче генетической информации. Открытие энзиматических функций, а теперь и регуляторных (ингибирующих), показало, что третичные структуры НК имеют сложную конфигурацию, что придает им новые свойства (функции) в комплексах с белками. В клетке ДНК/РНК-белковые взаимодействия служат основой её жизнедеятельности: экспрессия генома, синтез РНК в клетке, синтез белка, поэтому изучение структуры и функции нуклеопротеидных комплексов, с одной стороны, является актуальной фундаментальной задачей. С другой стороны, использование специфичности взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами в прикладных задачах стало приоритетным направлением в разработке различных тест-систем (биосенсоры), лекарственных препаратов.

В том, что две сложно организованные в пространстве макромолекулы (однотяжевая ДНК/РНК и белок) могут «узнавать» друг друга, нет ничего удивительного. Именно трехмерная структура биополимера определяет «узнавание» и является предметом исследования с помощью физических и физико-химических методов. Однако в ряде случаев различные по структуре природные РНК способны «узнавать» один и тот же белок, участвуя тем самым в регуляции некоторых процессов.

Изучение комплексообразования и стабильности бинарных модельных комплексов позволяет упростить задачи в биофизических исследованиях нуклеиново-белкового узнавания в сложных клеточных органеллах и разработать системы прикладного характера, например, технологии микро-матриц, биосенсоров и т.д.

Способность НК образовывать разнообразные сложные третичные структуры с новыми функциями позволила разработать метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment). Метод позволяет создавать искусственные бинарные нуклеопротеидные комплексы, в которых целевые фрагменты нуклеиновых кислот (аптамеры) могут проявлять новые функции, например, играть роль ингибиторов ферментов, регулировать экспрессию ряда генов (Gold, 1990; Szostak 1990).

Аптамеры (от лат. Aptus - подходящий) представляют собой однотяжевые молекулы ДНК и РНК длиной 40-100 нуклеотидов с достаточно сложной трехмерной структурой. Именно она обеспечивает

способность аптамеров специфически связывать различные молекулы, в том числе и белки. Специфичность данного комплексообразования сравнивают со сложнейшим процессом биосинтеза белковых "узнающих элементов" - антител, которые созданы природой в течение длительной эволюции.

В настоящее время в мировой практике комплекс антиген-антитело рассматривается как «золотой стандарт» специфического взаимодействия биомолекул. Это определило использование антител в медицинской диагностике и терапии. По способности образовывать специфический комплекс аптамеры, по сути, представляют собой функциональные аналоги антител, поэтому создание аптамеров, обладающих ингибирующим или активирующим воздействием на белки, совершенно актуально. Специфичность взаимодействия искусственного комплекса аптамер-белок, как правило, сравнивают с природным специфическим комплексом антиген-антитело. Константа диссоциации таких комплексов лежит в пределах 10-50 нМ.

В отличие от антител аптамеры мало иммуногенны, и их создание не требует использования живых систем.

Метод SELEX предоставляет принципиально иной путь биофизического поиска партнера с новой функцией. В настоящее время небольшие ДНК/РНК-аптамеры выделены для огромного числа белков. Поэтому генерация лекарственных форм на основе аптамеров представляется актуальнейшей проблемой. К достоинству аптамеров можно отнести и получение антидота к ним. Комплементарная последовательность к данному ДНК/РНК-аптамеру может служить антидотом, который будет приостанавливать действие аптамера в случае его передозировки.

Рассматривая аптамеры как перспективный класс новых медицинских препаратов, проводятся многочисленные биофизические, биохимические и медицинские исследования с целью дальнейшего их терапевтического применения. Аптамеры к VEGF (эндотелиальный фактор роста сосудов) уже используются при лечении ретинопатии глаз человека. Аптамеры к фактору Вилле-Бранда (участнику процесса свёртывания крови) проходят клинические испытания III фазы.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было создание ДНК/РНК аптамеров, изучение их структуры с помощью компьютерного моделирования, спектральных методов. Исследование процессов комплексообразования аптамеров с белками с использованием различных видов хроматографии, электрофорезов, поверхностного плазмонного резонанса, методов меченых атомов.

Было поставлено две задачи: во-первых, исследовать структуру природных комплексов рибосомных белков S7, которые специфически

связываются с РНК, и с помощью метода SELEX сконструировать РНК-аптамеры к термофильному белку, тем самым, отработав методические подходы. Во-вторых, используя метод SELEX, создать бинарные комплексы ДНК с ферментом тромбином, который не взаимодействует с нуклеиновой кислотой, изучить структуру полученных ДНК-аптамеров, ингибирующих активность фермента. Тромбин служит центральным звеном в реакциях свертывания крови. Его избыточная активность создает угрозу развития тромбозов.

Рибосомный белок S7, ключевой белок сборки и функционирования малой субчастицы прокариотических рибосом, образует природные комплексы с двумя различными по структуре молекулами РНК. Он связывается с 16S рРНК и инициирует сборку малой субчастицы рибосомы 30S, а также связывается с межцистронным фрагментом (МЦФ) матричной РНК (мРНК) стрептомицинового оперона, регулируя свой собственный синтез.

В работе были использованы два рибосомных белка из Escherichia coli (EcoS7) и Thermus thermophilus (TthS7). Термофильный белок TthS7 был выбран в качестве объекта, так как представляет собой природный мутант к белку EcoS7, а также в связи с отсутствием данных о регуляции синтеза данного белка в термофильных бактериях.

Вторую задачу решали, используя тромбин, сериновую протеиназу, которая играет ключевую роль в процессе свертывания крови. Тромбин не имеет природных комплексов с нуклеиновой кислотой. Ранее с помощью метода SELEX был получен 15-звенный фрагмент ДНК (Воск, 1992), который ингибировал фибриноген-гидролизующую активность тромбина. С помощью компьютерного моделирования была предложена 31-звенная нуклеотидная последовательность, которая также влияла на активность тромбина (Ikebukuro, 2005). Надо подчеркнуть, что тромбин обладает как прокоагулянтными, так и антикоагулянтными свойствами. Эти активности тромбина не были изучены в присутствии аптамерных ДНК. Наша задача состояла в исследовании структуры новых аптамеров, а также в изучении ингибирующих функций ДНК-аптамеров. Тромбин взаимодействует не только с фибриногеном, но и с клеточными PAR рецепторами ("Protease Activated Receptors") тромбоцитов, которые участвуют в процессе свертывания крови, поэтому планировали исследовать влияние аптамерных ДНК на агрегацию тромбоцитов, в которой участвуют PAR рецепторы.

Планировали решить следующие задачи.

1) Для изучения структуры и термодинамики природной системы, дифференциального узнавания различных РНК рибосомным белком S7 провести компьютерную аннотацию зоны контакта рибосомного

белка Thermus thermophilus (TthS7) с Tthl6S pPHK в составе термофильной рибосомы, используя данные рентгеноструктурного анализа (РСА). Провести компьютерное моделирование третичной структуры рибосомного белка Escherichia coli (EcoS7).

2) Изучить комплексообразование рибосомных белков S7 из Escherichia coli (EcoS7) и TthS7 с фрагментами 16S pPHK Е. Coli и делеционными фрагментами s/r мРНК Е. coli. Получить аптамеры к термофильному белку TthS7, специфически связывающиеся с ним, с помощью метода SELEX, отработав методы селекции.

3) Создать аптамерные ДНК к тромбину, провести компьютерное моделирование их структуры. Оценить эффективность ингибирующего действия аптамеров и их производных на активность тромбина в реакциях свертывания крови и агрегации тромбоцитов в условиях in vitro и in vivo.

4) Создать модифицированные производные аптамеров для защиты от действия нуклеаз. Оценить эффективность ингибирующего действия модифицированных аптамеров на активность тромбина и возможность подавления тромбообразования в модели in vivo.

5) Создать структуру аптамерной ДНК (антидота) и изучить конкурентное взаимодействие нуклеопротеидного комплекса аптамер-тромбин с комплементарной ДНК к аптамеру.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе были использованы термодинамические подходы при изучении бинарных нуклеопротеидных комплексов. Впервые они охарактеризованы с помощью таких понятий, как аффинность, специфичность, конкурентное связывание. Для детального изучения ДНК/РНК-белковых комплексов очень большое значение имеет получение корректных характеристик, например, кажущихся констант диссоциации, которые позволяют сравнить комплексы по сродству между собой. С учетом того, что бинарный комплекс образуется при взаимодействии двух конформационно лабильных макромолекул - РНК/ДНК и белка - необходимо было особое внимание уделять унификации их конформации. Любой препарат РНК практически всегда представляет собой набор различных конформеров, описываемых, например, в терминах "конформационного ландшафта" РНК (Russell, 2002). Видимо, поэтому изотермы связывания для РНК-белковых комплексов никогда не достигают Платовых значений в 100% -экспериментальный факт, который неоднократно, но без объяснений, констатировался в литературе. Конформационная гетерогенность может быть обусловлена не только процедурой выделения препарата РНК, белка. В связи с этим предложен подход, основанный на денатурации фрагментов рРНК, мРНК, РНК/ДНК-аптамеров при 90 °С с последующим резким охлаждением во льду. Для белков был предложен метод

ступенчатого диализа с целью постепенной сборки нативной структуры. Были рассчитаны кажущиеся константы диссоциации, как для природных нуклеопротеидных комплексов, так и для искусственных. Стандартные изотермы комплексов рибосомного белка с различными РНК были подвергнуты дальнейшему анализу с помощью преобразований Скэтчарда.

Новизна работы состоит в использовании комбинаторных библиотек нуклеиновых кислот (НК).

К началу работы не было данных о комплексе термофильного рибосомного белка S7 с регуляторным межцистронным фрагментом (МЦФ) мРНК стрептомицинового оперона E.coli. Оперой назван так потому, что мутации в этом опероне вызывают появление устойчивости штаммов бактерий к действию антибиотика стрептомицина за счет мутаций в гене белка S12. Не было данных о регуляторном районе синтеза данного белка в клетке. На основе рентгеноструктурных данных была предложена модель термофильной 30S субчастицы рибосомы (Ramakrishnan, 1999), в состав которой входит белок S7, но все биохимические данные о связывании S7 с рРНК и с мРНК были получены для мезофильного белка S7 E.coli (Nomura, 1994; Спирин, 1995).

Поэтому одной из задач было найти элементы связывания, ранее неизвестные, в структуре различных РНК с термофильным белком S7, используя комбинаторную библиотеку на основе мРНК. Надо отметить, что в методе SELEX используют небольшие фрагменты НК (30-100 нуклеотидных остатков), поэтому необходимо было отработать получение аптамеров, удовлетворяющих этим условиям. Методы и подходы, отработанные в экспериментах с комбинаторными библиотеками на белке, обладающем РНК-связывающей активностью, были применены к искусственным системам.

Развивая новое направление, создание лекарственных препаратов на основе нуклеиновых кислот, были получены и исследованы искусственные комплексы ДНК-аптамеров к тромбину. Используя опыт, полученный при селекции природной системы, был проведен отбор аптамеров к тромбину, и получены родственные нуклеотидные последовательности. Впервые найдено несколько аптамеров, обладающих высокой ингнбирующей активностью к тромбину SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, RSG55, RE31, ST43. Их структура охарактеризована с помощью КД-спектроскопии, молекулярной динамики (МД). Впервые искусственный комплекс аптамерная ДНК-тромбин был охарактеризован как бинарный нуклеопротеидный комплекс.

Совместно с сотрудниками Российского кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий (лаборатория проф. A.B. Мазурова) впервые было изучено влияние аптамеров на агрегацию тромбоцитов человека, что расширило представления о механизмах свертывания крови. Впервые исследованы изменения параметров

коагуляции плазмы крови в присутствии аптамеров по четырем показателям: тромбиновое время, протромбиновое время, АЧТВ (частичное тромбопластиновое время), амидолитическая активность. Предложено использовать данные аптамеры как лекарственные препараты при внутрисосудистом тромбообразовании. Получены патенты РФ: № 2401306, дата приоритета 17 декабря 2008 г., и № 2410432, дата приоритета 23 ноября 2009 г.

Проведены эксперименты по ингибированию тромбозов у животных в присутствии новых аптамеров на моделях артериального тромбообразования.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международном конгрессе по антителам « BIT Life Sciences, Antibody-2010», (Пекин, Китай, 2010); на съездах Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Санкт-Петербург, 2002; Новосибирск, 2008); на съезде физиологов СНГ (Кишинев, Молдавия, 2008); на Международной конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, Россия, 2008); на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008); на Всероссийских конференциях по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (Москва, 2007, 2009, 2011); на симпозиумах по химии протеолитических ферментов (Москва, 2002, 2008); International Symposium «Strategies on the Development of New Biological Products» (Сеул, Южная Корея, 1999); на Международном симпозиуме XVIth International Symposium on bioelectrochemistry and bioenergetics (Bratislava, Slovakia, 2001); на Российском конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001, 2007, 2008); на 7-ой конференции IUBMB "Receptor-Ligand Interactions. Molecular, Physiological and Pharmacological Aspects" (Bergen, Norway. 2002).

Личный вклад автора

В цикле исследований, составляющих диссертационную работу, автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов, в обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключается в непосредственном участии во всех этапах исследования - от постановки задачи, проведения экспериментов до обсуждения и литературного оформления полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Изучение структуры и термодинамики природной бинарной системы, дифференциального узнавания различных РНК рибосомным белком S7 прокариот,

- Создание плазмидных конструкций для получения фрагментов рибосомной и матричной РНК, проведение делеционного анализа межцистронного фрагмента мРНК E.coli, отработка метода SELEX при создании аптамерных РНК к термофильному рибосомному белку;

- Изучение структуры и термодинамики искусственной бинарной системы тромбин - аптамерная ДНК. Получение различных 31-звенных ДНК-аптамеров и их модифицированных аналогов;

- Изучение динамики и оптимальных условий сборки и стабильности базовых и модифицированных G-квартетов ДНК-аптамеров, которые ингибируют фибриноген-гидролитическую активность тромбина;

Исследование ингибирующего воздействия аптамеров на две прокоагулянтные реакции тромбина - свертывание фибриногена и активацию PAR-1 рецепторов;

- Изучение аптамерных ДНК в качестве ингибиторов внутрисосудистого тромбообразования на модельных клеточных системах (тромбоцитах), а также на животных моделях.

Структура работы и объем работы. Диссертационная работа изложена на 246 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и их обсуждение, материалы и методы, выводы и приложение. Материал иллюстрирован 75 рисунками и 8 таблицами. Библиографический указатель включает 248 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В данной работе использован сравнительный анализ структур природных и искусственных бинарных нуклеопротеидных систем. Параллельное изучение ДНК-/РНК-белковых взаимодействий для двух систем: природной и искусственной, дает возможность получать дополняющие друг друга независимые результаты.

Прежде чем приступить к созданию фрагментов РНК с определенными свойствами, было изучено образование специфичных комплексов белков EcoS7 и TthS7 с фрагментами рРНК и мРНК Е. coli с целью получения небольших (80-100 нуклеотидов) фрагментов РНК, что требуется при использовании метода SELEX.

Фантастические успехи, достигнутые при расшифровке супрамолекулярных структур рибосом, позволили воспользоваться данными рентгеноструктурного анализа при изучении бинарных нуклеопротеидных комплексов. Была проведена аннотация зоны контактов рибосомного белка с 16S рРНК термофильных рибосом и компьютерное моделирование белка EcoS7.

1.1. Компьютерная аннотация зоны контакта белка TthS7 с Tth 16S

рРНК в составе Tth30S, компьютерное моделирование третичной

структуры белка EcoS7

Благодаря расшифровке структур бактериальных рибосом методом РСА (Ramakrishnan, 1999, Wimberly 2000), стало возможным детальное изучение структур, как белков, так и их комплексов. На сегодняшний день остро стоит вопрос о корреляции данных РСА, полученных для рибосом Т. thermophilits, с биохимическими данными, накопленными для рибосом Е. coli. Рибосомы - это сложнейший нуклеопротеидный комплекс, образованный тремя рибосомными РНК и 55-ю рибосомными белками, который самособирается за счет специфичности взаимодействия между отдельными белками и рРНК.

Описание контактной зоны рибосомного белка с рибосомной рРНК в составе термофильной рибосомы помогает понять, какие группы вовлечены во взаимодействие. К началу данной работы структурные данные РСА были только для термофильных рибосом, а все биохимические и генетические данные известны только для рибосом E.coli. Для решения этой проблемы была предложена замена термофильного белка на мезофильный в структурных данных РСА, и обратно, в комплексах с РНК E.coli. Используя данные делеционного анализа, выявивших минимальный фрагмент Ecol6S рРНК, сохраняющий способность взаимодействовать с белком (Brakier-Gingras, 1994), было сделано компьютерное наложение структуры этого фрагмента на структуру Tthl6S рРНК, согласно данным РСА.

Далее было проведено компьютерное аннотационное описание зоны контакта Tthl6S рРНК и белка TthS7. С помощью программы Swiss PDB Viewer выявлены аминокислоты белка TthS7, удаленные от Tthl6S рРНК на расстояние от 2,5 Ä до 3,5 Ä с шагом 0,5 Ä. Собранные данные позволили приступить к моделированию третичной структуры белка EcoS7. На основании анализа трех структур S7, решенных методом РСА на тот момент, BstS7, TthS7 и его же в составе рибосомы Tth30S, было проведено моделирование третичной структуры белка EcoS7. Для этого выбран пакет программ SWISS-MODEL. Сравнение полученной модели структуры TthS7 с известными белками-аналогами приведено на рисунке 1.

При наложении третичных структур BstS7 и TthS7 с помощью программы Swiss pdb Viewer, оказалось, что белки обладают схожей структурой, они состоят из 6 а-спиралей и ß-шпильки. При сравнении структуры белка TthS7 в свободном состоянии и в составе рибосомы и белка BstS7 выявились их различия: разница наблюдается в конформации ß-шпильки и удлиненном неструктурированном N-конце белка. В составе рибосомы N-конец белка TthS7 зафиксирован.

íthS7 (1RSS)

BatS7 (1HUS)

TtftS 7 In (fbosome £coSS (1FJF) (model)

Рис. 1. Третичные структуры рибосомных белков S7, согласно данным РСА.

Модель EcoS7 оказалась наиболее близка структуре TthS7 в составе Tth30S. Метод компьютерного молекулярного моделирования для белка EcoS7 с помощью пакета программ SWISS-MODEL дает возможность анализа биохимической информации, а также прогноза для последующих экспериментов по изучению структурных аспектов РНК-белкового узнавания.

Согласно выбранной стратегии, следующим этапом исследования было изучение бинарных комплексов белков S7 in vitro биохимическими методами с обратным (по сравнению с in si/ico) переходом от гомологичного комплекса EcoS7 - EcolóS рРНК к гетерологичному -TthS7 - Eco 16S pPHK.

1.2. Комплексообразование рибосомных белков EcoS7 и TthS7 с фрагментами 16S рРНК Е. coli и делециоиными фрагментами str мРНК Е. coli. Получение аптамеров к термофильному рибосомному белку S7, специфически связывающихся с ним с помощью метода SELEX

Изучение природных специфических бинарных комплексов рибосомных белков S7 с фрагментами РНК поставило вопрос о влиянии рибосомных белков на конформационные изменения в структуре РНК. Чтобы перейти к созданию аптамерных РНК, далее проводили поиск делеционных фрагментов stmPHK Е. coli меньшей длины, но имеющих сродство к белкам, что требуется при использовании метода SELEX. Была продемонстрирована возможность сконструировать РНК-аптамеры с новыми функциями на основе РНК молекул, не связывающихся с белком.

1.2.1. Взаимодействие фрагментов EcolóS рРНК и EcoStr мРНК с белками EcoS7 и TthS7

Биогенез бактериальных рибосом связан с синтезом и поэтапным взаимодействием рибосомных белков с рРНК. Ранее было показано, что можно вычленить минимальные субдомены 16S рРНК, которые образуют бинарные комплексы с ключевым белком сборки рибосомы S7 (Brakier-Gingras, 1994). Чтобы изучать бинарные комплексы in vitro, нужно иметь достаточное количество белка. Для этого были разработаны экспрессионные системы генов двух рибосомных белков EcoS7 и TthS7 на плазмидах.

Выделенные и очищенные рибосомные белки EcoS7 и TthS7 образовывали комплексы с фрагментами Ecol6S рРНК и EcoStr мРНК. Степень комплексообразования определяли по количеству радиоактивного комплекса методом сорбции на нитроцеллюлозных мембранах, отработанным в ранних работах автора, и строили изотермы связывания (рис. 2 а, б).

[(51,пм [fjl.nM

Рис. 2. Изотермы связывания для комплексов Есо87 - Есо168 рРНК (а); 141187 -Есо168 рРНК (б). Исходная концентрация Есо168 рРНК - 20 нМ.

Кажущиеся константы диссоциации (кКа) РНК-белкового комплекса рассчитывали в координатах Скэтчарда (табл. 1).

Табл. 1. Кажущиеся константы диссоциации комплексов белков ЕсоБ7 и ТЛ87 с фрагментом Есо16Б рРНК.

EcoS7 TthS7

Eco16S рРНК Kd= 6,5 + 1,9 нМ Kd= 35,8 ± 9,3 нМ

EcoStr мРНК Kd= 55 ± 7 нМ Kd= 114 ± 11 нМ

Бактериальный рибосомный белок 87 выступает ключевым не только для сборки малой субчастицы рибосомы, он также участвует в регуляции экспрессии своего собственного цистрона, т.е. регулирует свой собственный синтез. Второй мишенью для 87 является МЦФ матричной

РНК (sir мРНК Е. coli) стрептомицинового оперона (рисунок 3). Интерес к изучению ifr-оперона определяется и практическим аспектом. Хромосомные мутации белка S12 приводят к фенотипу устойчивости к стрептомицину, что и определило название оперона. Связываясь с межцистроиным участком sir мРНК, белок S7 участвует в регуляции трансляции собственного гена.

г!

PS12V S7

ч_н_:

Ф51. rpsG

EF-G

tusA

EF-Tu

(t)

tu/A

AUOu « U-Mi

A CAAACUAJÜ1 — U-S4

"c»< IV *7: О

5Hf

U AA_ U A*

a с 11 с о с о

и А

С 9 Цд

u и и"

"о с ' G С и А " „ Ч I UUA'C

о с

1220

* * С - <i

970

1260

о с°\чии**иий-с VC й-С

Л1- «- С I . гЛ. I

i а 900 и-« ,23о/ 12S0

950 i IS I >

г ^ CA

1270

930 28 го"'

С rc v'

GGGCCCGCACAA11. ЧЛ и

•IIIIII -С

UOU UCCGOGC

1390 си 1380

A-U «г СА .

Л-НА^вС^Ои

1280

1300

1290

1320

Рис. 3. Схема стрептомицинового оперона (А), включающая последовательность генов рибосомных белков S12, S7, белковых факторов EF-G, EF-Tu. Представлены модели вторичных структур межцистронного фрагмента (МЦФ) S7-S12 sir мРНК (Б) и основного З'-концевого домена 16S рРНК (В). Спиральные участки пронумерованы от I до V, УФ-индуцируемые сшивки РНК с белком S7 указаны стрелками. На структуре МЦФ темным цветом выделены (UAA) стоп кодон гена белка S12, последовательность Шайна-Дапьгарно и AUG кодон гена белка S7. Контурами выделены идентичные участки в данных фрагментах РНК.

Межцистронный район различной длины от 800 нуклеотидов (Nomura, 1994) до 400 нуклеотидов (Brakier-Gingras, 1994) был определен как регуляторный в трансляции стрептомицинового оперона. В совместных работах с Головиным (Golovin, 2006) фрагмент, связывающий

рекомбинантный EcoS7, был сокращен до 143 нуклеотидов. Было показано, что МЦФ str мРНК способен образовывать как гомологичный, так и гетерологичный комплексы с рекомбинантными белками EcoS7 и TthS7 (рисунок 4, табл. 1).

Сравнивая константы диссоциации комплексов, можно сделать вывод, что оба белка способны высокоаффинно связываться с Ecol6S рРНК и EcoStr мРНК.

Рассматривая TthS7 как близкий структурный гомолог EcoS7, нужно отметить, что стабильность гомологичного комплекса EcoS7-Ecol6S рРНК оказалась в 6 раз выше, чем гетерологичного TthS7 - Ecol6S рРНК. Следовательно, можно использовать фрагменты РНК Е. coli в качестве базовых для поиска участков, высокоаффинно связывающихся с TthS7. В данном случае размер такого фрагмента составлял более 100 нуклеотидов, и вторичная структура мотива взаимодействующего участка рРНК оказалась разветвленной, что осложняло выбор селектируемого района, поэтому более перспективным оказался фрагмент EcoStr мРНК.

А Б

0 12 3 4 комплекс, нМ

4 6 3 10 комплекс. нГ,1

Рис.4. А) Изотермы связывания в координатах Скэтчарда комплексов EcoS7 -EcoStr мРНК; Б) Изотермы связывания в координатах Скэтчарда комплексов TthS7 -EcoStr мРНК. Концентрация EcoStr мРНК = 20 нМ.

Очевидно, что оба белка S7 (мезофильный и термофильный) способны эффективно образовывать бинарные комплексы с EcoStr мРНК. Нужно отметить, что в стрептомициновом опероне у термофилов этот межцистронный участок составляет всего несколько нуклеотидов. Регуляторный район для стрептомицинового оперона у термофилов не описан, хотя порядок и чередование генов в нем совпадают с опероном Е. coli. Это позволяет использовать для поиска регуляторного района гена белка TthS7 межцистронный участок sir мРНК, используя комбинаторные библиотеки.

Чтобы применить метод SELEX для получения РНК-аптамера, обладающего сродством к термофильному белку, необходимо было уменьшить размер участка и доказать, что, действительно, TthS7,

связываясь с вновь получаемым фрагментом, влияет на структуру данного района.

1.2.2. Изучение влияния белков Есо87 и Т(Ь57 на структуру фрагмента ЕсоБа-мРНК

Чтобы оценить влияние термофильного белка на данный участок РНК, была проведена химическая модификация фрагмента ЕсоБ^ мРНК в присутствии и в отсутствие белков. Для сравнения модификацию проводили как в комплексах с Есо87, так и в комплексах с ТЛ87 разными

ке оме смет

С и Л в I С И Ы Е Н'й Е Г1

* 5

-я ' - - и-А

-V.! « ■ -■■ |Р —к

и ,,ииис А-и/я

• - т I

ТЕ т С"СиА

~ с-с

-3 А-и

1 53456789 10 11 12 13 М

Рис. 5. А. Радиоавтограф электрофореза в ПААГ при анализе фрагмента ЕсоЭЦ-мРНК и его комплексов с белками ЕсоЭ7 и Т1Ь37 методом химической модификации. Дорожки 6, 9, 12 - модификация РНК; 7, 10, 13 - модификация РНК в присутствии 10-кратного избытка Есо87; 8, II. 14 - модификация РНК в присутствии 10-кратного избытка ПЬ87 реагентами КЕ, ОМБ и СМСТ, соответственно. Б. Предполагаемая вторичная структура Э12 - в7 межцистронного участка Есо51г мРНК. Стрелками указаны модифицируемые нуклеотиды: Я - модификация РНК, Е - модификация РНК в присутствии Есо57, Т - модификация РНК в присутствии 111157. реагентами: 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)-карбодиимид-М-толуолсульфонатом (СМСТ), кетоксалем (КЕ), диметилсульфатом (ЭМБ) при 37 °С.

В положении модифицированного нуклеотида транскрипция останавливается, и образуется набор фрагментов кДНК, которые разделяли электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях. Параллельно проводили реакции секвенирования контрольной РНК (рисунок 5).

Обнаружено, что оба белка, действительно, защищают от модификаций верхнюю часть шпильки в районе бифуркации -30 -40, что происходит, видимо, из-за прямого экранирования белками района связывания с РНК. Этот компактный район прямого взаимодействия белков с мРНК оказался удобным объектом для исследования бинарных комплексов, а также помогал выбрать участок для последующей селекции аптамеров.

1.2.3. Анализ связывания делецштиых фрагментов str мРНК E.coli

Чтобы приступить к экспериментам по селекции, необходимо было уменьшить размер узнаваемого фрагмента, поэтому был проведен систематический делеционный анализ МЦФ str мРНК.

Амплификацией ПЦР с помощью серии праймеров, один из которых содержал промотор Т7 РНК-полимеразы, были синтезированы фрагменты мРНК: EcoStr мРНК143 длиной 143 нуклеотида и с координатами -100 +43 (позиция +1 соответствует А инициаторного ко дона AUG цистрона S7); мРНКЮЗ с координатами -100 +3 (непосредственно сам межцистронный участок); а также укороченные производные межцистрона: мРНК84 (-91 -8); мРНК73 (-86 -14); мРНК61 (-81 -21) (рисунок 6).

Для полученной серии фрагментов мРНК определяли способность связывания двух рекомбинантных белков - гомологичного EcoS7 и гетерологичного TthS7. Был проведен анализ связывания делеционных фрагментов межцистрона sir мРНК Е. coli с белками EcoS7 и TthS7. Изотермы связывания для EcoS7 и TthS7 с фрагментами EcoStr мРНК получали с помощью фильтрации на нитроцеллюлозных мембранах.

103 84 73 61 AG(AU)

Рис. 6. Модели предполагаемой вторичной структуры межцистронного участка EcoStr мРНК. Делеционные фрагменты EcoStr мРНК. Позиция +1 соответствует А инициаторного кодона AUG цистрона S7; мРНКЮЗ с координатами -100 +3 (непосредственно сам межцистронный участок); мРНК84 (-91 -8); мРНК73 (-86 -14); мРНК61 (-81 -21). Шпилька (AG) построена на базе мРНК61 с дополнительными тремя G-C парами. Шпилька (AU) имеет замену неканонической пары А - G (-80/-22) на пару А - U. Контурами показаны районы, идентичные районам 16S рРНК. Стрелкой указана структура аптамера, полученного в результате селекции. Символами (+) и (-) обозначены те РНК. которые связываются с TtliS7.

Линеаризация изотерм связывания в координатах Скэтчарда показана на рисунке 7.

Делеция 40-ка нуклеотидов (мРНЮОЗ) и 19-ти нуклеотидов (мРНК84) кодирующей части цистрона S7 с З'-конца мРНК143 не приводит к изменению связывания. Однако делеция следующих десяти нуклеотидов (мРНК73) и тринадцати нуклеотидов (мРНК61), включая последовательность Шайна-Дальгарно цистрона S7, приводит к потере связывания с белком EcoS7.

Аналогичные результаты были получены для гетерологичных комплексов (рисунок 7Б). Белок TthS7 был способен связывать фрагменты мРНК143, мРНКЮЗ, мРНК84, также как белок EcoS7. Можно предположить, что благодаря высокой степени гомологии пространственных структур и сходному поведению в комплексообразовании с фрагментами мРНК E.coli, белки S7 из разных бактерий могут однотипно взаимодействовать с РНК, а их РНК-связывающие центры консервативны.

Рис. 7. А) Изотермы связывания белка EcoS7 с фрагментами EcoStr мРНК в координатах Скэтчарда. • мРНК143 KKd = 55 ±12 нМ; ■ мРНКШЗ KKd = 60 ± 25 нМ; ♦ мРНК84 KKd = 50 ±24 нМ .Б) Изотермы связывания белка TthS7 с фрагментами EcoStr мРНК. в координатах Скэтчарда. • мРНК143 KKd = 171 ±41 нМ; ■ мРНКЮЗ KKd = 230 ± 31 нМ; ♦ мРНК84 KKd = 182 ± 48 нМ. [EcoStr мРНК] = 20 нМ.

Следует подчеркнуть, что регуляторный район в стрептомициновом опероне у термофильных бактерий неизвестен, поэтому комплексообразование TthS7 с фрагментами EcoStr мРНК, возможно, показывает, что регуляторный участок для термофильного белка имеет сходную структуру.

1.2.4. Селекция аптамеров РНК на основе фрагмента EcoStr мРНК

Используя метод SELEX, стало возможным решить задачу по созданию фрагмента РНК на основе базовой структуры межцистрона E.coli, который узнавал бы термофильный белок TthS7. Надо еще раз отметить, что межцистронный участок S12-S7 в стрептомициновом опероне в термофильных бактериях мал, составляет всего несколько нуклеотидов, и в настоящее время неизвестен район, который регулирует экспрессию данных белков.

А Б

U А U А

(3 G G G

CA CA

C-G C-G

<-Ur A-U GUr A-U

u3 SüL^-u V U V

UUAAA \NHJpk-V yuAM LOit«»-U

CAAUUU,,„CAAA-U . UC AAUUU . CA A A-U

и b C~G ^^^^^^^^ f—'*

IV ZI ^^^ IV

Рис. 8. А - Структура рандомизированной шпильки (1024 варианта), которую использовали в селекции с белком Т1И37. Б — структура РНК-аптамера (из библиотеки «шпилька Аи»), константа диссоциации которого с белком составляет 70±21 нМ. Красным контуром обозначен участок, идентичный району 168 рРНК.

В классическом варианте БЕЬЕХ для создания таких РНК, как правило, используют полностью рандомизированную последовательность, но это приводит к появлению неприродного аналога структуры РНК, поскольку при селекции проходит отбор наиболее стабильных нуклеопротеидных комплексов. Мы использовали прием частичной рандомизации (рисунок 8).

В верхней части шпильки были рандомизированы пять нуклеотидов, которые, по-видимому, не взаимодействуют с белком непосредственно, т.е. исходная библиотека содержала 45 = 1024 варианта молекул РНК. На рисунке 7А представлены два варианта библиотек, которые были стабилизированы дополнительными тремя в-С парами в нижней части шпильки, а пятая пара А-С (аутентичная природной, -82/-20) была заменена на классическую пару А-И Библиотекам присвоили названия «шпилька Ав» и «шпилька АШ

Для молекул РНК один цикл отбора аптамеров включает реакцию транскрипции с матрицы ДНК, связывание РНК с иммобилизованным белком - мишенью, элюцию связавшейся обогащенной фракции РНК, синтез кДНК на обогащенной РНК и амплификацию ДНК с помощью ПЦР. Далее вновь получают обогащенную фракцию РНК и начинают новый цикл селекции.

Было проведено 10 циклов селекции с постепенным повышением строгости отбора. К десятому циклу кК<] комплекса обогащенной фракции РНК 141157 составила 87 нМ (рисунок 10). Эта фракция была клонирована в плазмиду рис 19. 70% клонов имели одинаковую последовательность нуклеотидов (рисунок 9). Были сделаны выравнивания первичных структур полученных молекул, и в каждой группе идентичных последовательностей проведено сравнение с исходными структурами: «шпилька АС» и «шпилька АШ. А

2 1 ОССТААССССАААССТТТТААСТТТТАААТСТСССТТТАААС-ССТАСАСТТТТССАСААТССТСАССС 68

4 1 бОСТААССССАААССТТТТААСТиТАААТЗТСССТТТАААС-ССТАСАСГПТССАСААТССТСАССС 68

5 1 СССТААвОССАААССТТГТААСТТТТАААТСТСССТТТАААС-ССТАСАСТТТТЗСАСААТССТЗАССС 68

6 1 ОеОТААСОССАААСОТТТТААСТШАААТОТСООТТТАААС-СОТАОАвТТТТСОАСААТССТбАССС 68

7 1 СССТААССССАААССТТТТААСТТТТАААТОТСССТТТАААС-ССТАСАСТТТТССАСААТССТСАССС 68 10 1 СССТААСОССАААССТТТТААСТТТТАААТСТСОСТТТАААС-ССТАСАОТТТТССАСААТССТСАССС 68

13 1 ООСТМОСССАААССТТТТААСТШАААТОТСООТТТАААС-СОТАСАОТТТТООАСААТССТСАССС 68

14 1 ОООТААОСССАААССТТТТААСТПТАААтеТСОСТТТАААС-СОТАвАОТТТтебАСААТССтеАССС 68

15 1 ООЗТААСЗССАААССТТТТААСТШАААТОТСООТТТАААС-ССТАСАОТТТТООАСААТССТОАССС 68

16 1 ООеТААСОССАААССТТТТААСТПТАААТСТСОСТТТАААС-СОТАОАОТТТТССАСААТССТОАССС 68 19 1 СССТААСеССАААССТТТТААСТГГТАААТСТСООТТТАМС-СбТАСАбТТТТОСАСААТССТСАССС 68

21 1 СССТААСеССАААСОТТТТААСТПТАААТСТССОТТТАААС-ССТАСАОТТТТаЗАСААТССТСАССС 68

22 1 ООСТААСбССАААСОТТТТААСШТАААТОТССОТТТАААС-СОТАОАОТТТТОСАСААТССтеАССС 68 шпилька

Ав 1 аввТААССССАААССТТГГААСТ-ТАААТОТСАААСТАААСТСаТАСАСТГПввАСААТССТвАССС 67

18 1 СССТААОбССАААСОТТТТААСТТТТАААТСТСООТТТАААС-ССТАОАОТТТгеСССААТССТОАССС 68 шпилька

Ав 1 СССТААССССАААССТТТТААСТ-ТАААТСТСАААСТАААСТССТАбАСТТТТССАСААТССТСАССС 67

24 1 ОООТААООССАААССТТТТААСТ-АААТОТСТОТТОАААТТСОТАОАСТТТТСОАСААТССТОАССС 67 шпилька

Ав 1 ОООТААООССАААСОТтААСТТАААТОТСАААСТАААСТСОТАСАЗТТГГСОАСААТССТОАССС 67

17 1 GGGTAAGGCCCAAACGTTTTAACTTTTAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 69 шпилька

AG 1 GGGTAAGGCC-AAACGTTTTAACTT--AAATGTCAAACTAAACTCGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 67

12 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTATATGTCAAACTAAACTCGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 67 шпилька

AG 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTAAATGTCAAACTAAACTCGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 67

3 1 GGGTAAGGCCCAAACGTTTTAACTTAAATGTCGTGTTAATCTCGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 68 шпилька

AG 1 GGGTAAGGCC-AAACGTTTTAACTTAAATGTCAAACTAAACTCGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 67

12AG 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTTTAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 68

11 AG 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTHTAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 68

2AG 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTIITAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 68

8AG 1 GGGTAAGGOCAAAGGTTTTAACTIITAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 68

9AG 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTTTAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 68

5AG 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTTTAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 68 шпилька

AG 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACT—TAAATGTCAAACTAAACTCGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 67

7AG 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTAAATGTCAAACTAAACTCGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 67 шпилька

AG 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTAAATGTCAAACTAAACTCGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 67

13AG 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTAAATGTCGGGTTAAACTCCTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 67 шпилька

AG 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTAAATGTCAAACTAAACTCGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 67

8AU 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTTTAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTTACCC 68

9AU 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTTTAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTTACCC 68

4AU 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTTTAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTTACCC 68

3AU 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTTrAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTTACCC 68

13AU 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTTTAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTTACCC 68 шпилька

AU 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACT-TAAATGTCAAACTAAACTCGTAGAGTTTTGGACAATCCTTACCC 67

12AU 1 GGGTAAGGCCMACGTrTTAACTnTAAATGTCGGGTTIAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTTACCC 68 6AU 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTTTAAATGTCGGGTTTAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTTACCC 68 шпилька

AU 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACT-TAAATGTCAAACTAAACTCGTAGAGTTTTGGACAATCCTTACCC67

2AU 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTTTAAATGTCGGTTTAAACCCCGTAGAGTTTTGGACAATCCTTACCC 70 шпилька

AU 1 GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACT-TAAATGTCAAACTAAACTC-GTAGAGTTTTGGACAATCCTTACCC67 TthPHKi GGGTAAGGCCAAACGTTTTAACTTTTAAATGTCGGTTTAAAC-CGTAGAGTTTTGGACAATCCTGACCC 68

Рис 9. Выравнивание первичных структур индивидуальных аптамеров к белку ТЛ87. А) аптамеры из библиотеки «шпилька АО» (эксперимент I); Б) аптамеры из библиотеки «шпилька АО» и «шпилька А11» (эксперимент 2).. Жирным выделен рандомизированный участок, подчеркнуты нуклеотидные вставки в полученных аптамерах. В конце каждой группы жирным шрифтом даны исходные последовательности.

0.25

Рис. 10. Изотермы связывания белка Т1Ь87 с фрагментами Есой^ мРНК в координатах Скетчарда. ♦ обогащенная фракция «шпилька Ав» (эксперимент 1) после 10 циклов селекции кК<] = 87 ± 23 нМ; А обогащенная фракция «шпилька А1_1» (эксперимент 2) после 4 циклов селекции кКл = 115 ± 45 нМ; ■ обогащенная фракция «шпилька Ав» (эксперимент 2) после 4 циклов селекции кК^ = 113 ± 16 нМ; «исходная библиотека «шпилька Ав» кК^ не определяется; Тисходная библиотека «шпилька Аи» (пунктир) кКа не определяется.

На основе библиотеки с рандомизированной нуклеотидной последовательностью длиной в 5 нуклеотидов получены аптамеры к белку ТЛ87. Согласно выравниванию структур, они были разбиты на семейства, и каждая обогащенная фракция была охарактеризована по сродству к белку. Было проведено комплексообразование на нитроцеллюлозных мембранах, построены изотермы связывания, которые позволили оценить сродство каждого семейства аптамеров к белку (рисунок 10).

После клонирования были изучены РНК-связывающие свойства индивидуальных аптамеров: т.н. «основной» аптамер, имеющий структуру, представленную в наибольшем числе клонов, связывался с белком с кК^ = 87 ± 23 нМ. Для сравнения на рисунке 11 приведены данные по связыванию белка ТЛ87 с природным фрагментом Есо81т мРНК84. Отчетливо видно, что полученные аптамеры имеют лучшее сродство к белку по сравнению с природным вариантом Есо81г мРНК84.

[комплекс], нМ

Рис. 11. Изотермы связывания белка 141187 с отдельным «основным» аптамером из библиотеки в координатах Скэтчарда: ■ «шпилька АО» кК,) = 87 ± 23 нМ; ▲ «шпилька АШ кКа = 70 ± 21 нМ. и с фрагментом Есо81г мРНК 84 ♦ кКа = 182 ± 48 нМ.

Однако в большинстве полученных вариантов, кроме рандомизированного, подверглись изменениям и другие участки молекулы РНК: произошла вставка двух и -61, -62 и делеция и -44. Чтобы проверить, являются ли мутации в константных частях следствием контаминации системы или случайным сбоем, который возник при амплификации на стадии полимеразных реакций, закрепился и оказался выгодным для связывания с белком, вытеснив другие варианты, был проведен ещё один отбор аптамерных РНК к белку ТА87 в более жестких условиях. Параллельно проводили селекции для библиотек «шпилька АС» и «шпилька Аи» (эксперимент 2). В результате 4-х циклов селекции было достигнуто обогащение библиотеки, аналогичное предыдущему опыту селекции (рисунок 11). После клонирования и секвенирования индивидуальных аптамеров оказалось, что как вставка, так и делеция в константных частях, присутствуют в подавляющем большинстве аптамеров. Это позволяет сделать вывод, что произошедшие изменения в константной части аптамеров необходимы для формирования таких структур РНК, которые способны наилучшим образом связываться с белком 87. То есть случайные ошибки, возникающие при полимеразных реакциях, закрепляются в процессе селекции. Наличие природных первичных структур среди отобранных молекул свидетельствуют о том, что исходная библиотека не содержала ошибок.

Опираясь на природные комплексы рибосомных белков, селекцией комбинаторной библиотеки РНК был создан участок связывания термофильного белка Б7 на основе межцистронного фрагмента мРНК, ранее не связывающего термофильный белок. Тем самым показана принципиальная возможность создания специфических участков

связывания для рнбосомных белков на основе рандомизированных библиотек.

Это позволило в дальнейшем направить исследования на создание аптамеров, молекулярных узнающих элементов, к белкам, не имеющим природных комплексов с нуклеиновыми кислотами (НК).

1.3. Создание аптамериых ДНК к тромбину, обладающих стабильной пространственной структурой и способностью связывать тромбин с высокой эффективностью и специфичностью in vitro. Оценка эффективности ингибирующего действия аптамеров на активность тромбина в реакциях фибрннолиза и агрегации тромбоцитов в условиях in vitro

Решение второй задачи было связано с созданием аптамерных ДНК к тромбину, не имеющему природных комплексов с НК. Отработав метод селекции на природной нуклеопротеидной системе, мы применили его к искусственной системе тромбин-аптамер с целью создания аптамерных ДНК, ингибирующих избыточную активность тромбина и тем самым влияющих на процессы тромбообразования в системе гемостаза.

Тромбин играет ключевую роль в системе свертывания крови, способствуя быстрому образованию тромбов. Избыточная активность тромбина грозит развитию внутрисосудистого тромбообразования, которое является причиной развития опасных заболеваний: инфаркт миокарда, нестабильная стенокардия, ишемический инсульт, тромбозы сосудов нижних конечностей и др. В настоящее время ведется активный поиск как прямых, так и непрямых ингибиторов тромбина.

Тромбин - это многофункциональная сериновая протеиназа. Несмотря на то, что тромбин по своей природе не является ферментом, способным связывать НК, он был первой протеиназой, для которой был получен аптамер методом SELEX (Воск, 1992). Было показано, что он взаимодействует с фибриноген-связывающей областью белка и ингибирует активность фермента (Tsiang, 1995). Согласно данным ЯМР (Schultze, 1994) и рентгеноструктурного анализа (РСА) (Padmanabhan, 1993), ДНК-аптамер 15ТВА (thrombin-binding aptamer) имеет структуру G-квадруплекса (рисунок 12). Восемь гуанинов создают два плоских G-квартета (структура «кресло»), связанных тремя петлями: две короткие ТТ петли и одна T-G-T. Ион калия выступает стабилизирующим фактором G-квадруплекса, который выполняет роль структурообразующего элемента для ДНК-аптамера к тромбину. Позиция калия координируется атомами кислорода гуанинов внутри G-квадруплекса. Также структура стабилизируется стэкинг-взаимодействиями нуклеотидов G8 и Т9 и верхним G - квартетом.

Рис. 12. А - Структура G-квартета в плоскости, в центре указан ион калия, который координирует карбонильные кислороды гуаниновых оснований, ниже дана проекция сбоку; В — структура 31ТВА, который состоит из структуры 15ТВА с фланкирующими комплементарными олигонуклеотидными последовательностями. В центре представлена структура 15ТВА

К моменту начала наших работ по селектированию был известен только один 15ТВА аптамер к тромбину. Поэтому мы выбрали его в качестве базового и предложили ряд ДНК-аптамеров, которые ингибировали прокоагулянтную активность фермента. Параллельно в ряде лабораторий мира проводили компьютерный дизайн структур аптамеров с ингибирующей функцией (Ikebukuro, 2005). Один из них, 31ТВА, обладал улучшенной ингибирующей активностью по сравнению с 15ТВА, но структурные данные для 31ТВА отсутствовали. Нашей целью было создание ДНК-аптамера, структурным элементом которого был G-квадруплекс, так как эта необычная структура похожа на G-квартеты, найденные в природных объектах, например, у теломерных ДНК (Lipps, 2009), в промоторных областях ряда вирусов (Wang, 1994).

1.3.1. Создание ДНК-аптамеров к тромбину

На основе 15ТВА была создана библиотека случайных последовательностей с вырожденным участком в 3 нуклеотида в петле. Используя иммобилизованный тромбин в качестве мишени, было проведено 6 циклов селекции, в результате которых произошло накопление олигонуклеотидов с исходной последовательностью, как наиболее эффективно связывающейся с тромбином. Далее структура 15ТВА была усложнена дополнительным двутяжевым участком длиной 8 нуклеотидов, в котором 6 пар были комплементарными. Сразу надо подчеркнуть, что это усилило ингибирующие свойства аптамеров. Полученные аптамеры можно рассматривать как двухдоменные, состоящие из структуры G-квадруплекса (структура «кресло»),

дуплексного района и соединяющего участка (шарнира). Были получены и исследованы следующие аптамеры: 15ТВА, 31 ТВ А, 8С50, БС51, 8052, 8053, 8054, 8055, ЯЕ31 и 8Т43. Ниже приведены нуклеотидные последовательности аптамеров, структура 15ТВА подчеркнута:

31ТВА dCACTGGTA GGTTGGTGTGGTTGG GGCCAGTG

SG50 dCACTGGTT GGTTGGTGTGGTTGG GGCCAGTG

SG51 dCACTGGTT GGTTGGTGTGGTTGG TGCCAGTG

SG52 dCACTGGCA GGTTGGTGTGGTTGG GGCCAGTG

SG53 dCACTGGAA GGTTGGTGTGGTTGG GGCCAGTG

SG54 dCACTGGTA GGTTGGTGTGGTTGG GGTCAGTG

SG55 dCACTGGTAT GGTTGGTGTGGTTGG GGTCAGTG

RE31 dGTGACGTA GGTTGGTGTGGTTGG GGCGTCAC

ST43 dGTGACGTAT GGTTGGTGTGGTTGG GGCGTCAC

Все они удлиняли тромбиновое время в сравнении с базовым 15ТВА (табл.3).

Табл.3 Тромбиновое время в присутствии аптамерных ДНК к тромбину. Точность определения ± 3 сек.

Аптамер 1мкМ 15ТВА 31 ТВ А SG50 SG51 SG52 SG53 SG54 RSG55 RE31 ST43

Тромбин овое время, сек 27 103 98 92 90 106 133 113 250 122

Молекулы 8050, 8051, 8052, 8053, 8054 и 118055 отличаются точечными заменами в области стыковки дуплекса со структурой «кресла». Замена Т7 на С7 или А7 и С26 на Т26 в последовательностях удлиняло тромбиновое время, что свидетельствовало об улучшении ингибирующей активности аптамеров. Но самое большое удлинение было зафиксировано при замене пятизвенного фланкирующего участка на комплементарный, при этом сохранялся дуплексный район. Таким образом, мы варьировали сочленение двух модулей, отбирая варианты, наиболее выигрышные с медицинской точки зрения. Было изучено влияние дополнительных комплементарных и некомплементарных олигонуклеотидов на структуру «кресла».

1.3.2. Компьютерное моделирование структур ДНК-аптамеров

Пространственная структура полученных аптамеров была неизвестна. Используя данные РСА 15ТВА (РОВ ГО ШАР), было проведено компьютерное моделирование представленных аптамеров. Центральный район каждого аптамера содержал последовательность 15ТВА; при этом аптамеры отличались фланкирующими комплементарными последовательностями и некомплементарными

петлями, соединяющие эти два домена.

С помощью программ PyMol v.0.99, пакеты 3DNA и GROMACS v.3.3, были построены структуры 31ТВА, RE31, ST43. Диаметр двухтяжевого участка и структуры «кресла» не совпадали по размерам, поэтому координаты двухтяжевого участка стыковали с координатами 15ТВА с помощью программы PyMol, после чего симуляцией молекулярной динамики (МД) проводили оптимизацию структур с помещенным в центр G-квадруплекса ионом калия для стабилизации структур. Симуляцией МД было показано, что получены устойчивые структуры. Рассматривая данные аптамеры как двухдоменные, можно констатировать, что они представлены двумя различными конформерами, обозначенными как "bulge" и "helix" (рис. 13).

5'- 3'-

Т4 ~| I АД8 С5 ~[ | С27 G6 ~1 j С36

" 1 I

j AS | /

/ I BSM I

<39 "1 j G53

C10 ~l | G22

Рис. 13. Схематическое изображение структур: А) 3 lTBA"bulge". Основания Т7, А8 и G24 образуют стэкинг трех оснований; Б) 3 lTBA"helix". Основания Т7 и G25 образуют неканоническую пару.

Отличие структур "bulge" и "helix" состоит в районе соединения структуры «кресла» (нуклеотиды G9, G10, G22, G23) со структурой дуплекса. В "helix" структуре происходит образование неканонической пары T7-G25, А8 частично перекрывается с G24 и стабилизируется за счет стэкинг - взаимодействия, и в целом образуется упорядоченная жесткая структура. Для "bulge" структуры, наоборот, происходит нарушение пары G6-C26, и основания Т7, А8 и G24 образуют стэкинг трех оснований. До сих пор такие элементы структуры наблюдали только для тРНК. Большую подвижность атомов в "bulge" структуре подтвердили методами молекулярной динамики.

В случае RE31 и его близкого гомолога ST43, тромбиновое время которых в тестовых реакциях максимально, было интересно сравнить модели этих структур с уже полученными для 31ТВА (рисунок 14).

5'- З1-

Структура ЯЕ31 резко отличается от структур 31ТВА, рассмотренных ранее. Нужно отметить другой характер взаимодействия центральной ТСТ-петли в-квадруплекса с верхним С-квартетом и шарнирным участком неспаренных оснований.

Итоговые структуры существенно различаются, несмотря на минимальные различия в последовательности. В структуре ЯЕ31 нуклеотиды С16-Т17 центральной петли (ТОТ) интеркалируют между верхним О-квартетом и первой парой участка неспаренных оснований 024-А8. Это стабилизирует структуру О-квартета, в результате чего происходит организация и ТТ-петель. Следующая пара некомплементарных оснований Т7 и в25 выстраивается в стэкинг друг с другом и с нижней парой некомплементарных оснований. Это вызывает разрушение пары С26-С6.

3- 5'- 3- 5'-

09,010,022, С23), справа — модель структуры аптамера ЭТ43 (О-квадруплекс составлен ,010,011, 023, 024).

В структуре БТ43, наоборот, с введением дополнительного Т9 нуклеотида в район шарнира появился наклон дуплексного участка. Структура становится асимметричной относительно вертикальной оси молекулы. Это приводит к образованию неканонической пары С25-Т7, а не имеющее пары основание А8 интеркалирует между 026 и 025.

1.3.3. Изучение ДНК-аптамеровметодом кругового дихроизма

Стабильность структур данных аптамеров было решено подтвердить плавлением, регистрируя изменения в спектрах КД. Известно, что для классической двухтяжевой формы ДНК характерен спектр КД с положительным максимумом около 270 нм и отрицательным максимумом, а структуре О-квадруплекса соответствует появление положительного максимума КД при 294-295 нм и отрицательного максимума при 268 нм. При увеличении температуры происходит постепенное снижение

максимумов кругового дихроизма, что отражает разрушение структуры в-квадруплекса, т.е. переход упорядоченная структура <-> клубок.

Полученные спектры КД 15ТВА при различных температурах приведены на рисунке 15. При повышении температуры происходит постепенное уменьшение максимумов при 246, 268 нм и 294 нм. Изменение молярно-дихроичного поглощения при 294 нм отражает изменение структуры только О-квадруплекса, и на основании данных значений была построена кривая плавления 15ТВА, Тпл 15ТВА составила 38,8 °С (рисунок 18, табл. 4).

Табл. 4. Температуры плавления аптамеров в присутствии 5 тМ КС1

аптамеры 15ТВА 31 ТВ А Р!Е31

Температура , С" 38,8±0,7 39,6±0,6 41,2±0,6

- 4°С

?С°С

. ЗС°С • 37°С • 4?С

- 4<3°С « 54°0

/ '■ ! 67" С • 76°С

/у .

ЬУ/

Рис. 15. Спектры КД 15ТВА в 20 тМ Трис-НС1 буфере, рН 7.5, 5 тМ КС1 при различных температурах.

Длина волны, нм

Спектры КД для 31ТВА показывают, что в тех же условиях происходит эффективное формирование О-квадруплекса: присутствуют аналогичные экстремумы КД при 246,268 и 294 нм (риснок 16).

а М

. «с

Рис. 16. Спектры КД 31ТВА в 20 мМ трис-НС1 буфере, рН 7.5, 5 мМ КС! при различных температурах.

Следует отметить, что значение максимума КД при 294 нм уменьшается по сравнению с 15ТВА на 20%, а абсолютное значение максимума КД при 268 нм увеличивается (на 30-35%), что связано, по-видимому, с вкладом комплементарного участка 31ТВА. Тпл 31ТВА, рассчитанная аналогично, составляет 39,6±0,6 °С, что сравнимо с Тпл для 15ТВА в пределах ошибки опыта (табл. 4).

В спектрах КД RE31 значение положительного максимума при 294 нм увеличивается в 1,5 раза по сравнению со спектрами для 31 ТВ А, при этом возрастает Тпл, что свидетельствует об изменении конформации молекулы, она стала более асимметричной (рисунки 17, 18). Это связано с измененными фланкирующими нуклеотидными последовательностями, что совпадает и с описанием моделей, построенных с помощью данных по МД.

Рис. 17. Спектры КД ЯЕ31 в 20 мМ трис-НС1 буфере, рН 7.5, 5 мМ КС1 при различных температурах

эга ио

Длина волны, нм

Таким образом, введение дополнительного модуля с различной нуклеотидной последовательностью может как увеличивать, так и уменьшать стабильность структуры в-квадруплекса.

Структуры всех полученных аптамеров образовывали структуры С-квадруплексов, что подтверждено спектрами КД (рисунок 19).

31ТВА

N50

N51

N53

N55

Рис. 19. Спектры КД 31ТВА, 8050, 8051, 8053, 8055 в 20 мМ Трис-НС1 буфере, рН 7.5, 5 мМ калия при 20 °С.

М » }10 М

Известно, что ион К+ стабилизирует структуру в-квадруплекса. Чтобы оценить влияние иона калия, были получены спектры КД 15ТВА в отсутствие ионов К+ (рисунок 20). В них присутствуют характерные экстремумы, но небольшие по величине, что свидетельствует о формировании О-квадруплекса, но при повышении температуры происходит быстрое падение максимума при 294 нм.

7*0 МО 280 300 320

Длина волны.нм

Рис. 20. Спектры КД 15ТВА в 20 мМ Трис-НС1 буфере, рН 7.5, в отсутствие калия при различных температурах.

Тпл в-квадруплекса 15ТВА без калия равна 25,20 С.

Для того, чтобы оценить вклад в-квадруплекса в структуру аптамера, был получен 31-звенный олигонуклеотид 31ТВА(014А) ёСАСТССТАССТТСАТСТССТТССССССАСТС с заменой в 14 на А14 (в 14А), которая препятствует образованию в-квадруплекса.

Рис. 21. Спектр КД 31ТВА(014А) в 20 мМ трис-НС1 буфере, рН 7.5 в присутствии 5 мМ КС1 при различных температурах.

200 2Л 240 ¿«3 200 ЭСО ЭХ 340 360

Можно заметить, что максимум 31ТВА (С14А) при 295 нм исчезает (рис. 21). Спектры данного олигонуклеотида при различных температурах представляют собой извилистую линию с отсутствием экстремумов, характерных для О-квадруплексов. Введение замены С14А, по-видимому, разрушило О-квадруплекс.

Чтобы оценить вклад коротких двухтяжевых участков, составляющих второй домен в данной структуре, были исследованы спектры КД 6-звенных фрагментов (01: <1САСТСО; 02: с)ССАОТО), фланкирующих структуру «кресло» при низких температурах.

длина волны, ни

Рис. 22 Спектры КД комплементарных двухтяжевых 6-звенных фрагментов в 31ТВА в 20 мМ трис-НС1 буфере, рН 7.5 в присутствии 40 мМ КС1 при 5°С. Для сравнения приведен спектр КД 15ТВА.

Спектры КД олигонуклеотидов 01 и 02 представляют собой слабо извилистую линию, что указывает на отсутствие какой-либо структуры, которая могла быть зафиксирована спектрами КД. В то же время спектр их эквимолярной смеси при низких температурах (5 °С) имеет характерный максимум при 270 нм, что свидетельствует о формировании данными олигонуклеотидами дуплекса (рисунок 22).

Чтобы ответить на вопрос, влияет ли наличие дополнительных фрагментов на формирование О-квадруплекса, был получен аптамер 31ТВА(БЗ,04) 5'-ёАСАСССТАССТТСетСТОС.ТТССООССАОТО. в котором структура О-квадруплекса была фланкирована некомплементарными последовательностями 03: с1АСАСССТА и 04: ООССАОЮ (рисунок 23 А, Б). Как следует из полученных спектров, О-квадруплекс у 31ТВА (03, Б4) в стандартных условиях не формируется. Сдвиг положительного максимума к 280 нм и образование плеча указывает на образование другой сложной структуры, возможно, неструктурированного клубка. О-квадруплекс не образуется даже при увеличении концентрации ионов калия до 100 мМ КС1 (рисунок 23 Б). По-видимому, отсутствие дуплекса не только не поддерживает структуру «кресла» в О-квадруплексе, а даже препятствует её образованию в присутствии высоких концентраций ионов калия.

А Б

Рис. 23. А - Спектр КД 31ТВА(03,04) в 20 мМ Трис-НС1 буфере, рН 7.5 в присутствии 5 мМ КС1 при 18°С. Б - Спектр КД ЗИВАфЗДМ) в 20 мМ Трис-НС1 буфере, рН 7.5 в присутствии 100 мМ КС1 при 20°С.

1.3.4. Комплексы ДНК-аптамеров с тромбином

Нами было изучено сродство данных аптамеров к тромбину в различных буферах и с различными препаратами фермента. Стабильность комплексов была оценена электрофорезом в полиакриламидном геле, фильтрованием на нитроцеллюлозных мембранах.

В присутствии увеличивающегося количества тромбина пропорционально возрастала доля удерживаемого аптамера (рисунок 24 А,

Б). Отсутствие ионов калия в буфере ухудшало комплексообразование в несколько раз (рисунок 24 Б). Было отмечено, что сродство ДНК-аптамера к тромбину с высокой удельной активностью (4500 ед. МН/мг) было почти в 20 раз эффективнее (10.2 нМ), чем для препаратов тромбина с активностью 1200 ед. Ы1Н/мг (160 нМ), как в первом, так и во втором буфере, которые отличаются наличием ионов калия. Буфер с ионом калия был выбран, как близкий по солевому составу к плазме крови.

Тромбин, нМ

5 0,3-

а о.1

Рис. 24. А. Изотермы связывания тромбина с аптамерной ДНК в буфере 20мМ трис-Ас (рН 7.4), 1 мМ СаС12, 140 мМ №С1, 5 мМ КС1, 1 мМ ]У^С12.: 1) препарат тромбина с активностью 1200 Ь11Н ед./мг, К,1=160±6.9 нМ; 2) препарат тромбина с активностью 4500 Ы1Н ед./мг, Ка= 10.2±1.9 нМ. Б. Изотермы связывания тромбина с аптамерной ДНК в буфере 20мМ трис-Ас (рН 7.4), 100 мМ №0, 1мМ Г^СЬ: 1) препарат тромбина с активностью 1200 Ы1Н ед./мг; 2) препарат тромбина с активностью 4500 МН ед./мг.

Для оценки связывания ДНК с тромбином на нитроцеллюлозных фильтрах препарат аптамсра метили у-32Р-АТФ. Для фиксирования комплекса с помощью электрофореза в ПААГ реакцию проводили при постоянной концентрации ДНК (80 и 100 нМ в различных случаях), и варьировали концентрацию тромбина в пределах 20-400 нМ. Инкубировав реакционную смесь при 5 °С не менее часа, комплексы белка с олигонуклеотидами отделяли от свободных олигонуклеотидов в 8 %-ом неденатурирующем ПААГ. В случае 31ТВА, ИЕ31 8Т43 и других олигонукдеотидов использовали окрашивание геля флуоресцентным

красителем SybrGreen. Комплексы, как с радиоактивной, так и с флуоресцентными метками детектировали на приборе FLUORESCENT IMAGE ANALYZER (FLA-3000 series), Fujifilm (рисунок 25).

в 7 3 uL/ J

■л

' ïè щ i К ш VI

Комплекс

Аптамер

¿J и Ы L/43 ь Ы у

S buuyUUl' i»

Комплекс

lilll А

ЧЯНЯИ Ama"c"

Рис. 25. Электрофореграммы комплексообразования тромбина с аптамерами в 8 %-ом неденатурирующем ПААГ. Суммарный объем реакционной смеси составлял в каждом опыте 25 мкл, реакцию проводили при постоянной концентрации ДНК и варьировали концентрацию тромбина в пределах 20-400 нМ: А - комплексообразование 15ТВА (150 нМ) с тромбином (20-400 нМ); Б - комплексообразование 31ТВА (80 нМ) с тромбином (20 - 150 нМ), В — комплексообразование ЛЕЗ 1 (80 нМ) с тромбином (20150 нМ); Г- комплексообразование 8Т43 аптамера (100 нМ) с тромбином (80 - 400 нМ).

Табл. 5. Константы диссоциации Кё, пМ, определенные методом

аптамер 15-ТВА 31ТВА RE31 ST43

Kd, пМ 50,4±17,1 10,2±2,2 7,2±2,1 12,1+2,4

В табл. 5 приведены кажущиеся константы диссоциации комплексов, полученных при электрофорезе в ПААГ. Важно заметить, что значения

констант диссоциации рассчитаны для комплексов в электрическом поле, т.е. в жестких условиях электрофореза, а не в растворе.

Рис. 26. Изотермы связывания аптамеров с тромбином в координатах Скэтчарда: А) 15ТВА, Б) 31ТВА, В) ЯЕ31, Г) 8Т43, согласно данным электрофореза в ПААГ.

Построение изотерм связывания для каждой серии опытов позволило оценить сродство нуклеиновых препаратов к белку (рисунок 26).

Очевидно, что наилучшей константой диссоциации обладает комплекс тромбина с ЯЕ31. 15ТВА обладал меньшим сродством к тромбину. Повышенное сродство ЫЕ31 аптамера к тромбину, видимо, связано с наличием двухтяжевого участка, который, возможно, дает дополнительные контакты с белком.

Одним из современных физических методов, который позволяет получить не только равновесные характеристики связывания, но и кинетические, является метод поверхностного плазмонного резонанса (ППР), используемый в приборах Биакор. С помощью ППР также было доказано образование комплексов аптамерных ДНК с тромбином (рисунок 27). В приборе Биакор один из взаимодействующих партнеров, лиганд, иммобилизован на поверхности биосенсора (чипа), а другой, аналит, растворен в буфере, который протекает над поверхностью чипа.

Образование и диссоциация комплекса между двумя взаимодействующими молекулами сопровождается ППР, который отражает изменение массы на поверхности чипа. Сигнал записывается в виде сенсограммы. Используя иммобилизованный тромбин на чипе СМ5, был получен сигнал с увеличением концентрации аптамера в аналите, но амплитуда сигнала была невелика. Было решено провести обратный эксперимент: иммобилизовать аптамер на чипе, а в аналите пропускать тромбин

различном концентрации.

100-1

40200 -20 -40-60

-ЮмкМ 31ТВА -1 мкМ 31ТВА -10 мкМ RE31 -1 мкМ RE31

8 бот

200 300 Время, с

Концентрация тромбина нМ

-270

-135

-67

-338

400 500 600

Ю 200 Время, с

Рис. 27. Сенсограммы: А - связывание аптамеров RE31 и 31ТВА с тромбином, иммобилизованном на чипе СМ5: Б - связывание тромбина с RE31-биотип, иммобилизованном на стрептавидиновом чипе. Приборный рисунок. Увеличение резонансного отклика при повышении концентрации тромбина в растворе: 5,4; 17; 34; 68; 135 и 270 нМ (кривые снизу-вверх).

Увеличение концентраций тромбина приводит к усилению сигнала. Это позволяет предположить, что данный метод может быть использован не только для качественного, но и количественного определения концентрации тромбина в растворимой фазе как аналог биосенсора.

Активность, "о

то

4Ш 500 600 700 И»

[Аптамер]. нГ.1

Рис. 28. Кривые ингибирования тромбина аптамером. концентрациях фибриногена: 1.- 19мкМ;2 — 26 мкМ; 3 -38 мкМ.

при различных

Было изучено влияние 31 ТВ А аптамера на ферментативную активность тромбина in vitro (рисунок 28). Было установлено, что аптамер

ингибирует гидролиз фибриногена при увеличении концентрации ДНК-аптамера вплоть до 700 нМ, что значительно превышало концентрацию фермента в реакции.

1.3.5. Тромбин - ключевой белок свертывания крови

Тромбин - это сериновая протеиназа, которая расщепляет пептидную связь, образованную аргинином или лизином в низкомолекулярных субстратах (амидолитическая активность). Тромбин играет центральную роль в процессах свертывания крови. Он гидролизует высокомолекулярный субстрат, фибриноген, до фибрина, а также расщепляет мембранный рецептор на тромбоцитах, способствуя их агрегации. Тромбин регулирует прямо противоположные реакции: свертывание крови, противосвертывание, фибринолиз и агрегацию тромбоцитов. Направленность (специфичность) его действия определяется тем, что в реакциях гидролиза высокомолекулярных субстратов участвуют как минимум, два участка молекулы тромбина - активный центр фермента и области специфичного «узнавания» ряда субстратов и кофакторов (экзосайт I и экзосайт II). При повреждении стенки кровеносных сосудов начинается каскад протеолитических реакций, где каждый предыдущий белковый фактор (протеаза) активирует каждый последующий (Струкова, 1997, 2001). Протромбин, синтезируемый печенью как неактивный предшественник, активируется X фактором в комплексе с V, а появившийся тромбин не только гидролизует фибриноген до фибрин-мономера - структурной основы тромбов, но и стимулирует свое образование, активируя белковые факторы V, VIII, XI, участвующие в гемостазе. Тромбин является наиболее мощным из известных индукторов активации тромбоцитов. Он специфически взаимодействует с PAR рецепторами, (рецепторы, активируемые протеазами) на мембране тромбоцитов и отщепляет пептид от внеклеточного N-конца их аминокислотной последовательности. Образующийся новый N-концевой фрагмент взаимодействует со специальным участком рецептора, что и приводит к активации и последующей агрегации тромбоцитов. Рост тромба сопровождается самополимеризацией фибрина с образованием протофибрилл с образованием больших узлов фибриновых молекул, ветвлением волокон с захватом агрегатов тромбоцитов и других клеток крови. Стабильность тромба повышается под действием XIII белкового фактора (трансглутаминазы), который образует изопептидные связи между боковыми цепями лизина и глутаминовой кислоты (Панченко, Добровольский, 1999).

Наиболее известные антитромбиновые препараты - это гепарин и его низкомолекулярные производные. Они подавляют функции тромбина, стимулируя активность антитромбина III, его главного эндогенного ингибитора. К числу недостатков гепарина относится непрямой характер

его действия, связывание с другими белками плазмы крови и клеток сосудистого русла, и такие нежелательные эффекты, как тромбоцитопения и непрямая активация тромбоцитов. Этими недостатками не обладают прямые ингибиторы тромбина - белок гирудин, выделенный из медицинских пиявок, и его производные (бивалирудин), а также некоторые низкомолекулярные органические соединения (аргатробан, мелагатран). Все они действуют на активный центр тромбина (или совместно на активный центр и центры связывания субстратов, называемых экзосайт I и экзосайт II) и, таким образом, ингибируют как его прокоагулянтные, так и антикоагулянтные эффекты. Прямые ингибиторы тромбина, полученные на основе ДНК-аптамеров, взаимодействуют лишь с участками связывания субстратов (на основе данных рентгеноструктурного анализа) (Padmanabhan, 1993). Они не вызывают иммуногенных реакций и могут быть основой для создания лекарственных препаратов, для лечения и профилактики тромбозов.

1.3.6. Ингибирование процессов свертывания крови ДНК-аптамерами

Было исследовано влияние аптамеров на две ключевые реакции тромбина - образование фибрина из фибриногена и стимуляцию агрегации тромбоцитов. Образование фибрина происходит в результате протеолитического отщепления от фибриногена фибринопептидов А и В. На поверхности тромбоцитов тромбин взаимодействует со специфическими PAR рецепторами.

Из полученных нами аптамеров были выбраны четыре: 15ТВА, 31ТВА, RE31 и ST43. Мы сравнивали наши результаты с литературными данными для 15ТВА. Для 31 ТВ А было известно только тромбиновое время, поэтому мы исследовали ингибирующие активности аптамеров RE31 и ST43, сравнивая их между собой и с литературными данными. Все аптамеры 15ТВА, 31ТВА RE31 и ST43 влияли на ингибирование процессов свертывания крови, не затрагивая процесс расщепления тромбином низкомолекулярного субстрата (амидолитическая активность). Все аптамеры при добавлении к плазме крови человека подавляли коагуляционную активность тромбина, удлиняя тромбиновое время, протромбиновое время и АЧТВ (рисунок 29 А, Б, В).

Тромбиновое время отражает скорость образования фибринового сгустка после добавления к плазме экзогенного тромбина, а протромбиновое время и АЧТВ - скорость образования сгустка при действии эндогенного тромбина. При измерении протромбинового времени свертывание активируется по внешнему пути (последовательная активация факторов VII, X, V и протромбина), а при измерении АЧТВ по внутреннему пути (последовательная активация факторов ХИ/прекалликреина, XI, IX, VIII, X и протромбина) (Панченко, Добровольский, 1999).

31 ТВ А 15ТВА

0,2 0,4 0,6 0,8 1 •RE31 Ч-31ТВА ST43 "в"15ТВА

Рис. 29. Влияние апгамеров ЯЕ31, 8Т43, 31ТВА и 15ТВА на свертывание плазмы крови человека. Агпамеры добавляли в указанных концентрациях к плазме крови человека и регистрировали тромбшювое время (используя тромбин человека) (А), протромбиновое время (Б) и АЧТВ (В). Во всех тестах регистрировали время образования фибриновош сгустка

О 0,2 0,4 0,6 0,8 1 •■RE31 "*"31ТВА ST43 15ТВА

Было показано, что RE31 обладает наиболее выраженным ингибирующим действием, чем остальные аптамеры. Тромбиновое время у RE31 (0,5мкМ) увеличивается более, чем в 10 раз, а для 15ТВА (0,5 мкМ) только в 3 раза. Протромбиновое время (активация свертывания крови по внешнему пути) при введении 1мкМ раствора RE31 увеличивается с 12 до 105 секунд, т.е. в 9 раз, а для 15 ТВ А (1мкМ) лишь в 1,5 раза. При изучении влияния аптамера на активацию внутреннего пути свертывания крови АЧТВ у RE31 (1мкМ) изменяется от 35 до 160 секунд, а для 15ТВА (1мкМ) от 30 до 50 секунд. При сравнении воздействия аптамера и гепарина 1мкмоль 15ТВА вызывает тот же эффект ингибирования, что и 0,15 единиц/мл гепарина, но за меньшее время АЧТВ. Ингибирующая способность у аптамера RE31 была выше, чем у 31 ТВ А, во всех трех тестах сходные эффекты (удлинение времени свертывания плазмы крови) наблюдались при более низких концентрациях RE31.

31 ТВ А, RE31, ST43 и 15 ТВ А не влияли на амидолитическую активность, т.е. ингибируют только присоединение высокополимерного субстрата (фибриногена) к тромбину (табл. 6). Активность тромбина по отношению к трипептиду, хромогенному субстрату "Chromozym ТН", который взаимодействует только с активным центром, не менялась.

Скорость расщепления хромогенного субстрата Той-СНу-Рго-А^-рЫА была одинаковой в отсутствие и в присутствии 1 мкМ аптамеров. Степень его расщепления, регистрируемая по увеличению оптической плотности при 405 нм, не снижалась в присутствии всех исследуемых аптамеров, что еще раз подтверждает, что аптамеры взаимодействуют с экзосайтами, не затрагивая активный центр.

Табл. 6. Амидолитическая активность тромбина в присутствии

аптамеров.

Аптамер (1мкМ) Контроль 15ТВА 31ТВА ЯЕ31 8Т43

ДА)05 / мин ± 0,002 0,257 0,259 0,273 0,259 0,262

Таким образом, аптамеры ингибировали образование фибрина, стимулированное как экзогенным тромбином, так и эндогенным тромбином, образующимся в результате активации коагуляционного каскада плазмы крови.

1.3.7. Влияниемутаитного аптамера на процесс свертывания крови

Изучая мутантный 31ТВА(014А), у которого один из гуаниновых

остатков заменен на аденин, так что в результате не собирается структура «кресло» (подтверждено КД спектрами, рисунок 21), было показано, что при концентрации 1 мкМ он не оказывал влияния на свертывание фибриногена. Тромбиновое время было 12,5 сек и 12,0 сек, как в присутствии 31ТВА(014А), так и без него, соответственно. АЧТВ составляло 32,2 сек и 30,0 сек как в присутствии, так и в отсутствие 1ТВА(С14А), соответственно.

1.3.8. Влияние аптамеров на агрегацию тромбоцитов

Известно, что тромбин взаимодействует с двумя высокомолекулярными субстратами: фибриногеном и РАЯ-1 рецептором тромбоцитов (безъядерных клеток крови). Аптамеры эффективно ингибировали как гидролиз фибриногена, так и агрегацию отмытых от плазмы тромбоцитов, индуцированную тромбином (рисунок 30).

Исследование агрегации тромбоцитов в присутствии 15ТВА, 31 ТВ А, ЛЕ31, БТ43 и 31ТВА(014А) аптамеров показало, что агрегация отмытых тромбоцитов, индуцированная тромбином в концентрации 0,1 ед/мл, полностью ингибируется ЯЕ31 при концентрации 0,05 мкМ , 31 ТВ А - при 0,1 мкМ, а 15ТВА - при 0,2 мкМ. Созданный аптамер ЯЕ31 обладает наибольшей ингибирующей активностью (рисунок 31). Как было показано ранее, он обладает более высоким сродством по отношению к тромбину, и, как следствие, он более эффективно ингибирует активность тромбина по сравнению с базовым 15ТВА аптамером.

Рис. 30. Ингибирование тромбин-индуцированной агрегации тромбоцитов аптамерами 15ТВА и 31ТВА. (а) К отмытым тромбоцитам не добавляли аптамеров (кривая 0) или добавляли 0,1 мкМ 31ТВА (кривая 1), 0,1 мкМ 15ТВА (кривая 2) или 1 мкМ 31ТВА(С14А) (кривая 3). Агрегацию тромбоцитов стимулировали добавлением 0,1 ед/мл тромбина (тромбин добавляли через 30 сек после начала регистрации светопропускания (% Т), и затем измеряли агрегацию в течение 4,5 мин. Представлены результаты одного из 3 воспроизводимых экспериментов, (б) Агрегацию тромбоцитов стимулировали 0,1 ед/мл тромбина в отсутствие аптамеров и в присутствии различных концентраций 31ТВА (кривая 1) и 15ТВА (кривая 2). Определяли максимальный уровень агрегации в % от контроля (без аптамеров, 100%).

и 1 7 3 4 !> Время, мин

100 1 б

80 V: \\

40 \ 1

0 .......'"'"■■■?

О 0,02 0,04 0,05 0,03 0,10

Артамеры, мкМ

Рис. 31. Сравнение эффектов ингибирования тромбин-индуцированной агрегации тромбоцитов человека аптамерами 11Е31 и 31 ТВ А. (а) К отмытым от плазмы тромбоцитам не добавляли аптамеров (кривая 0) или добавляли 0,025 мкМ ЯЕ31 (кривая 1) и 0,025 мкМ 31ТВА (кривая 2). Агрегацию тромбоцитов стимулировали добавлением 0,25 ед/мл тромбина человека (тромбин добавляли через 30 сек после начала регистрации светопропускания). Представлены результаты одного из 4 воспроизводимых экспериментов, (б) Агрегацию тромбоцитов стимулировали 0,25 ед/мл тромбина в отсутствие аптамеров и в присутствии различных концентраций ЯЕЗ1 (кривая 1) и 31ТВА (кривая 2). Определяли максимальный уровень агрегации в % от контроля (без аптамеров, 100%).

1.4. Создание модифицированных производных аптамеров. Оценка эффективности ингибирующего действия модифицированных аптамеров на активность тромбина и возможность подавления тромбообразования в модели in vivo

1.4.1. Свойства модифицированных аптамеров

При введении аптамеров в кровоток возникает проблема их стабильности и длительности действия в системе in vivo. На сегодняшний день используемые прямые низкомолекулярные прямые ингибиторы тромбина выводятся за 40 - 90 минут. Полученный активный аптамер RE31 выводился из кровотока за 10 минут, поэтому было предложено ввести химические модификации по 5'- и З'-концам молекулы. С одной стороны, вводимые группы должны были защищать от действия нуклеаз, с другой стороны, препятствовать выведению аптамера через почки. Известно, что для снижения скорости вывода лекарств через почки используют полиэтиленгликоль (ПЕГ) различной молекулярной массы. Поэтому одно из производных RE31 содержало ПЕГ группировки по обоим концам. Также было предложено вводить аминогруппу с помощью аминогексанола, как наиболее легко вводимую защиту. Были получены три варианта модифицированных производных аптамера RE31: PREP, PREA и AREP, где А - производное аминогексанола, Р - производное ПЕГ. Все три модифицированных соединения были проверены по двум тестам: тромбиновое время и протромбиновое время (рисунок 32).

А Б

О 0.1 0,2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

Аптамеры, мкМ »RE31 -PREP PREA-AREP

I120

к 100

<и

8-80

О) § 60

1 40

2 20 .

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Аптамеры, мкМ ■RE31 -PREP PREA -AREP

Рис. 32. Влияние аптамеров ЯЕ31, РЛЕ31Р, РЯЕ31А и АЯЕ31Р на свертывание плазмы крови человека. Аптамеры добавляли в указанных концентрациях к плазме крови человека и регистрировали тромбиновое время (используя тромбин человека) (А) и протромбиновое время (Б). Во всех тестах регистрировали время образования фибринового сгустка. На всех рисунках представлены результаты одного из 3-4 воспроизводимых экспериментов.

Из представленных графиков видно, что ингибирующая активность модифицированных аптамеров сохраняется, хотя и немного снижается в сравнении с исходным ЯЕ31. Наилучший результат был получен с АЯЕР, поэтому было изучено его комплексообразование с тромбином в полиакриламидном геле (рисунок 33). Отчетливо видно, что модифицированный аптамер АЯЕР образовывал комплекс с тромбином. Кажущаяся константа диссоциации составляла ~ 100 нМ. Это позволило приступить к модельным опытам на животных.

Аптамер

Рис. 33. Электрофореграммы комплексообразования тромбина с аптамерами в 8 %-ом неденатурирующем ПААГ. Суммарный объем реакционной смеси составлял в каждом опыте 25 мкл, реакцию проводили при постоянной концентрации АЯЕР 200 нМ. 1 - контроль, концентрацию тромбина варьировали в пределах 100-1500 нМ.

1.4.2. Изучение влияния ДНК-аптамеров на коагуляционную способность плазмы крови на животных моделях

Перед началом проведения экспериментов на животных было необходимо выяснить возможность существования видоспецифичности аптамеров по отношению к тромбинам разных экспериментальных животных. Наиболее удобными на этом этапе представлялось проведение экспериментов на крысах или кроликах. Использование более крупных животных (например, собак) потребовало бы большего расхода исследуемых аптамеров, а более мелких (например, мышей) - затруднило бы проведение неоднократного забора крови для исследования динамики подавления тромбиновой активности.

Исследование видоспецифичности проводили на 11Е31. Удлинение тромбинового времени в присутствии 11Е31 было существенно более выражено при стимуляции свертывания тромбином человека по сравнению с тромбином крысы (при некоторых концентрациях аптамера регистрировались 3-4-кратные различия), а при использовании тромбина кролика аптамер в применяемых концентрациях вообще не оказывал ингибирующего действия (рисунок 34). При этом в контрольных образцах (без аптамера) время образования сгустка было приблизительно одинаковым всех трех тромбинов - в среднем около 10 сек.

X. 1:

° >00 £

'2 150 зг

| 100

0.00 0.05 С.10 0.15 0.20 0.25 О.'ЗО С.35 Лптемср RE31. мкМ

Рис. 34. Действие аптамера RE31 на свертывание плазмы крови человека, стимулированное тромбином человека, крысы и кролика. Аптамер RE31 добавляли к плазме в указанных концентрациях и регистрировали тромбиновое время образования сгустка после внесения в пробу тромбина человека (кривая 1), тромбина крысы (кривая 2) и тромбина кролика (кривая 3). Представлены результаты одного из 3 воспроизводимых экспериментов.

В связи с тем, что в отличие от тромбина кролика, активность тромбина крысы достаточно эффективно подавлялась в присутствии аптамеров (хотя и в более высоких концентрациях, чем при использовании тромбина человека), для экспериментов in vivo в качестве экспериментального животного была выбрана крыса.

Данные по видоспецифичности аптамеров еще раз указывают на сходство в характеристиках аптамеров и антител, в данном случае с точки зрения их высокой специфичности по отношению к мишени.

1.4.3.1. Оценка эффективности ингибирующего действия модифицированных аптамеров на активность тромбина и возможность подавления тромбообразования в модели in vivo

Антитромботическую активность модифицированного аптамера проверяли на модели артериального тромбоза у крыс, индуцируемого обработкой сосуда раствором хлорного железа. Для изучения были использованы крысы самцы. Первоначально крыс наркотизировали, а затем послойно обнажали сосуд, и на открытую сонную артерию длиной в 2 см присоединяли датчик расхода кровотока, а также устанавливали катетер для введения соответствующих препаратов. После периода стабилизации кровотока (в течение 5-10 минут) осуществляли внутривенное болюсное введение аптамеров через катетер. В качестве контроля использовали введение 0,2 мл физиологического раствора. Через 10 минут к участку сонной артерии прикладывали тампон, смоченный 50 % раствором хлорного железа, что способствовало образованию тромба. В течение часа от установки аппликации хлорного железа вели регистрацию расхода кровотока. В ходе эксперимента следили за уменьшением или

остановкой кровотока и фиксировали время частоту остановки окклюзии кровотока. В контрольной пробе время окклюзии составляло 20 минут, масса тромба составляла около 8 мг. При введении аптамера время увеличивалось до 120 минут, при этом масса тромба была меньше 1 мг (рис. 35). Таким образом, были получены положительные результаты в модельных экспериментах (как на клеточных, так и на животных моделях). Высокая антитроботическая активность модифицированного аптамера позволяет утверждать, что на его основе может быть создана лекарственная форма, использующая фрагмент нуклеиновой кислоты.

Рис. 35. Действие аптамера AREP на тромбообразование in vivo (FeCb модель, крыса)

'-■. О 0.1 2 0.J '-'.4 О.: 0.6 AREP. иг/100 г веса

1.5. Создание антидота к аптамериой ДНК. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в нуклеопротеидном комплексе аптамер-тромбии

1.5.1. Создание антидота к аптамериой ДНК

Уникальное свойство нуклеиновых кислот образовывать комплексы с комплементарной олигонуклеотидной последовательностью позволило разработать антидот к ДНК аптамеру, который раскрывает структуру аптамера, изменяет структуру в-квадруплекса, тем самым разрушает комплекс аптамера с тромбином. Сравнивая прямые ингибиторы тромбина, низкомолекулярные (аргатробан, дабигатран), пептидной природы (гирудин, бивалирудин), для которых не получены антидоты, с ДНК-аптамерами, к которым имеются антидоты, нужно подчеркнуть, что это является большим преимуществом в использовании препарата в медицинской практике. Возможность синтезировать комплементарную последовательность (антидот) позволяет разработать пару, лекарство -антидот, что, безусловно, даст возможность регулировать введение препарата, и быстрой отмены его действия.

Первоначально разработка антидота была смоделирована на 31 ТВ А аптамере и комплементарной последовательности к нему. Поскольку в

структуру 31 ТВ А включены комплементарные последовательности, то представляется интересным оценить влияние данных участков на в-квадруплексную половину добавлением комплементарной олигонуклеотидной последовательности. С помощью спектров КД было показано разрушение структуры «кресло» в аптамере (рисунок 36).

Чтобы определить характер спектра в присутствии обеих форм, добавляли меньшее, чем нужно по стехиометрии, количество комплементарной цепи (рисунок 36). При добавлении комплементарного олигонуклеотида появляется плечо при 275-280 нм, что свидетельствует об образовании двухтяжевой ДНК. При избыточном количестве комплементарной цепи 31ТВА-геу аптамер полностью переходил в двухтяжевую структуру, т.е. образование двуцепочечной ДНК эффективно конкурирует с О-квадруплексной структурой, разрушая последнюю.

• гс'/31

' 31ТВА

» 31Т8А * геуЗ! (1 0.5) 31Т8А * геу31 (11)

* 31ТВА * геи31 (1:2)

Рис. 36. Спектры КД 31ТВА в буфере (20мМ трис-ацетат, 5 мМ КС1) в присутствии комплементарного олигонуклеотида геуЗ1 (соотношение концентраций 31 ТВА/ геуЗ 1 - 1:0.5, 1:1, 1:2 соответственно) при 18 "С.

Рассматривая 31 ТВ А как многообещающий противосвертывающий агент, комплементарный олигонуклеотид представляет собой антидот к 31ТВА.

1.5.2. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в нуклеопротеидном комплексе аптамер-тромбин

Разрушение комплекса аптамера ЯЕ31 с тромбином было продемонстрировано с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (рисунок 37).

Отчетливо видно, что при добавлении комплементарной олигонуклеотидной последовательности комплекс разрушается, а интенсивность полосы, соответствующей аптамеру, увеличивается. Следовательно, рассматриваемые комплементарные олигонуклеотиды могут выступать антидотами для быстрой отмены действия препарата, например, в случае его передозировки.

Рис. 37. Электрофореграмма комплексообразования тромбина с RE31 в 8 %-ом неденатурирующем ПААГ. Суммарный объем реакционной смеси составлял 25 мкл, реакцию проводили при постоянной концентрации ДНК (80 нМ) и тромбина (240 нМ). 1 - молекулярные маркеры, 2 - RE31, 3 - комплекс RE31 с тромбином, 4 - добавление комплементарного олигонуклеотида (200 нМ), 5 - добавление комплементарного олигонуклеотида (500 нМ).

Заключение

По своим свойствам: высоко аффинному и специфическому связыванию с молекулой мишенью и способности ингибировать ее активность, аптамеры напоминают моноклональные антитела. Однако в отличие от антител, они могут быть синтезированы химически, что упрощает возможности их технологичной наработки в больших количествах. А кроме того, в отличие от белковых молекул антител при введении в организм они не вызывают иммунных и аллергических реакций.

Выводы

1. Методами компьютерного анализа и моделирования in silico показано, что два белка-аналога EcoS7 и TthS7 по первичной структуре идентичны на 52 %, а в зоне РНК-белковых контактов в 30S субчастице - на 83 %. Получены гомологичные и гетерологичные комплексы EcoS7, TthS7 с фрагментом 16S рРНК с использованием белков EcoS7, TthS7, выделенных из суперпродуцентов E.coli. Определены константы диссоциации комплексов, что позволило сделать вывод о консервативности РНК-связывающего центра белков.

2. Делеционный анализ межцистронного фрагмента S12-S7 str мРНК показал, что для взаимодействия как с белком EcoS7, так и с TthS7 необходим фрагмент РНК около 84 нуклеотидов длиной, заключенный между терминирующим кодоном цистрона S12 и инициирующим кодоном цистрона S7.

3. Используя комбинаторную библиотеку на основе межцистронного регуляторного участка Ecostr мРНК с

рандомизированной пентануклеотидной последовательностью, создан фрагмент РНК, связывающий белок TthS7, который в начале эксперимента не обладал сродством к данному белку. Тем самым показана принципиальная возможность создания регуляторных участков трансляции рибосом в клетке.

4. Созданы ДНК-аптамеры к тромбину, которые обладали G-квадруплексной пространственной структурой и ингибировали прокоагулянтную активность фермента. Изучена их структура методами молекулярной динамики и кругового дихроизма. Подтверждено наличие структуры «кресла» как для 15ТВА, так и для 31 ТВ A, SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, RSG55, RE31 и ST43. Показано, что в присутствии комплементарной последовательности структура «кресла» раскрывается и переходит в двухтяжевую структуру.

5. С помощью электрофореза в неденатурирующих условиях показано образование комплексов аптамерных ДНК с тромбином in vitro, рассчитаны кажущиеся константы диссоциации, величины которых свидетельствуют о высоком сродстве данных аптамеров к тромбину.

6. Исследовано влияние 15ТВА и 31 ТВ A, RE31, ST43, SG50, SG51, SG52, SG53, SG54, RSG55 и их модифицированных производных на активность тромбина. Показано, что при добавлении к плазме крови человека аптамеры вызывали зависимое от дозы удлинение тромбинового времени, протромбинового времени и активированного частичного тромбопластинового времени. Это свидетельствует о влиянии аптамеров на процессы свертывания крови и тромбообразования.

7. Показано, что аптамеры ингибируют не только гидролиз фибриногена, но и активацию PAR-1 рецептора тромбоцитов. Это приводит к ингибированию процесса агрегации тромбоцитов человека и дополнительно замедляет процессы свертывания крови. В то же время аптамеры не влияют на амидолитическую активность тромбина.

8. Таким образом, исследуемые антитромбиновые ДНК-аптамеры, не влияя на активный центр тромбина, способны эффективно подавлять его две ключевые реакции - образование фибрина и стимуляцию агрегации тромбоцитов. Испытания на животных подтвердили антитромбиновую активность ДНК-аптамеров в процессах свертывания крови.

Список работ: Обзоры:

1. Спиридонова В.А. Аффинная хроматография, основанная на нуклеиново-белковых взаимодействиях // Итоги науки и техники, серия Молекулярная биология. Москва. 1975. Т. 4. С. 176-217; ISSN 0202-7070.

2. Копылов A.M., Спиридонова В.А.. Парк К-Х. Применение аптамеров в медицинской диагностике и терапии // Российский Химический Журнал. 1998. Т. 42. № 5. С. 89-96; ВАК.

3. Копылов A.M., Спиридонова В.А. Комбинаторная химия нуклеиновых кислот: SELEX // Молекулярная биология. 2000. Т. 34. № 6. С. 1097-1113; ВАК.

4. Спиридонова В.А. Молекулярные узнающие элементы - ДНК/РНК аптамеры к бекам // Биомедицинская химия. 2010. Т. 56. № 6. 639-656; ВАК.

Статьи:

5. Spiridonova V.A.. Gyenge L., Bogdanov A.A. RNA-protein interactions in the ribosomes HI. Complexing of ribosomal RNA with sepharose-bound ribosomal proteins // FEBS Lett. 1972. V. 20. № 2. P.209-212; (IF- 3,54.)

6. Спиридонова В.А.. Дьенге Л., Богданов A.A. Связывание рибосомных РНК с белками рибосом, ковалентно закрепленными на полимерных носителях // Биохимия. 1975. Т. 40. № 1. С. 83-88; ВАК.

7. Спиридонова В.А.. Каграманова В.К., Баратова J1.A., Голова Ю.Б., Чекулаева Л.Н., Манькин А.С. Клонирование гена рибосомного белка HS4 архебактерии Halobacterium halobium // Биоорганическая химия. 1988. Т. 14. № 1. С. 16-118; ВАК.

8. Spiridonova V.A.. Akhmanova A.S., Kagramanova V.K., Корке А.К.Е., Mankin A.S. Ribosomal protein gene cluster Halobacterium halobum: nucleotide sequence of the genes coding for S3 and L29 equivalent ribosomal proteins // Canadian J. of Biochemistry and Cell Biology. 1989. V. 35. № 1. P. 153-159.

9. Karginov A.V., Karginova O.A., Spiridonova V.A.. Kopylov A.M. In vivo assembly of plasmid-expressed ribosomal protein S7 of Thermus thermophilus into Echerichia coli ribosomes and conditions of its overexpression // FEBS Lett. 1995. V. 369. № 23. P. 158-160; (IF-3,54).

10. Исаева Л.В., Спиридонова В.А.. Люмович Д., Ковалева И.Е., Черноголов А.А., Усанов А.С., Лузиков В.Н. Синтез в Escherichia coli и свойства некоторых гибридных белков, составленных из модифицированного предшественника адрснодоксинредуктазы и укороченного предшественника адренодоксина // Биохимия. 1996. Т. 61. № 8. С. 1026-1033; ВАК.

11. Spiridonova V.A.. Golovin A.V., Drygin D.Yu., Kopylov A.M. An extremly high conservation of RNA-protein interactions during prokariotic str operon regulation // Biochem.Mol.Biol.Internat. 1998. V. 44. № 6. P. 1141-1146; (IF-3,58).

12. Птицин Л.P., Котельников M.A., Спиридонова В.А.. Копылов A.M., Егоров А. М. Селекция олигодезоксирибонуклеотидов, связывающих тироксин // Докл. РАН. 1999. Т. 364. № 2. С. 260-63; ВАК.

13. Рождественский Т.С., Рассохин Т.П., Анохина М.М., Головин А.В., Спиридонова В.А.. Копылов A.M., Делеционный анализ межцистронного района S12-S7 str mRNA E.coli для связывания термофильного рибосомного белка S7 // Вестн. Моск. Ун-та. 1999. Т. 40. №6. С. 375-380; ВАК.

14. Белякова М.М., Петрова Е.В., Спиридонова В.А.. Добров Е.Н., Копылов A.M., Егоров Ц.А., Витман-Лейбольд Б., Сангер В., Фотоаффинная модификация

тетрациклинового репрессора TetR° тетрациклином // Вести. Моск. Ун-та. 1999. Т. 40. № 6. С. 380-384; ВАК.

15. Spiridonova V.A.. Rozhdestvensky T.S., Kopylov A.M. A study of the thermophilic ribosomal protein S7 binding to the truncated S12-S7 intercistronic region provides more insight for a mechanism of regulation of str operon of E.coli И FEBS Lett. 1999. V. 460. № 2. C. 353-356; (IF- 3,54).

16. Beliakova M.M., Anokhina M.M., Spiridonova V.A.. Dobrov E.N., Egorov T.A., Wittmann-Liebold В., Orth P., Saenger W., Kopylov A.M. A direct photo-activated affinity modification of tetracycline transcription repressor protein TetR(D) with tetracycline // FEBS Lett. 2000. V. 477. № 3. P. 263-267; (IF- 3,54).

17. Рассохин Т.Н., Головин A.B., Петрова E.B., Спиридонова В.А.. Каргинова О.А., Т.С. Рождественский, Брозиус Ю., Копылов A.M. Изучение связывания белка S7 с фрагментом 926-986/1219-1393 16S рРНК - ключевого этапа сборки малой субчастицы прокариотических рибосом // Молекулярная биология. 2001. Т. 35. №4. С. 617-627; ВАК.

18. Spiridonova V., Rassokhin Т., Golovin A., Petrova Е., Rohzdestvensky Т., Pakhomova Ju., Kopylov A., A comparative thermodynamic study for both natural and artificial RNA/DNA-protein binary complexes // Bioelectrochim. 2002. V. 55. № 1-2. P. 95-97. (IF-2,65).

19. Спиридонова В.А.. Копылов A.M., Аптамерные ДНК-принципиально новые узнающие элементы для биосенсоров // Биохимия. 2002. Т. 67. № 6. С. 850-854; ВАК.

20. Спиридонова В.А.. Копылов A.M., Аптамеры как узнающие элементы для создания биосенсоров // Наукоемкие технологии. 2003. Т. 3. С. 34-40; ВАК.

21. Спиридонова В.А.. Рог Е.В., Дугина Т.Н., Струкова С.М., Копылов A.M., Аптамерные ДНК - ингибиторы тромбина нового типа // Биоорган, химия. 2003. Т. 29. № 5. С. 495-498; ВАК.

22. Anokhina MM, Barta A, Nierhaus КН, Spiridonova VA. Kopylov AM, Mapping of the second tetracycline binding site on the ribosomal small subunit of E.coli // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. № 8. P. 2594-2597; (IF- 6,88).

23. Golovin AV, Spiridonova VA. Kraal B, Kopylov AM, Mapping of contact of S12 -S7 intercistronic region of E. coli streptomycin mRNA with recombinant ribosomal protein S7 // FEBS Lett. 2006. V. 580. № 25. P. 5858-5862; (IF- 3,54).

24. Спиридонова B.A.. Лыгина A.C., Анохина M.M., Тупицын Н.Н., Получение функционально активного рекомбинантного интерлейкина-6 человека // Биохимия. 2007. Т. 72. № 4. С. 525-532; ВАК.

25. Спиридонова В.А.. Бессонов С.И., Тупицын Н.Н., Широков Д.А., Копылов A.M. Перспективы антицитокинотерапии. Получение РНК-аптамеров к интерлейкину-6 человека методом SELEX // Иммунология гемопоэза. 2007. Т. 2. С. 54-71; ISSN 1818-4820.

26. Сурдина А.В., Рассохин Т.И., Головин А.В., Спиридонова В.А., Крааль Б., Копылов A.M. Селекция случайных фрагментов РНК (SERF) как метод поиска участка регуляции трансляции стрептомициновой мРНК Е. coli рибосомным белком S7 // Биохимия. 2008. Т. 73. V. 6. С. 652-659; ВАК.

27. Добровольский А.Б., ТитаеваЕ.В.. ХаспековаС.Г.. Спиридонова В. А., Копылов A.M., МазуровА.В. Ингибирование активности тромбина аптамерами ДНК // Бюллетень экспериментальной биологической медицины. 2009. Т. 148. № 7. С. 41-45; ВАК.

28. Reshetnikov R., Golovin A., Spiridonova V.. Kopylov A., Sponer J., Structural dynamics of thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGGTTGG) quadruplex

DNA studied by large-scale explicit solvent simulations // J Chem.Theory Comput. 2010. V. 6. P. 3003-3014; (IF- 4,8).

29. Сурдина A.B., Рассохин Т.И., Головин A.B., Спиридонова B.A. Копылов A.M., Картирование регуляторного участка связывания рибосомного белка S7 со стрептомициновой мРНК E.coli II Биохимия. 2010. Т. 75. № 7. С. 841-850; ВАК.

30. Мазуров A.B., Титаева Е.В., Хаспекова С.Г., Сторожилова А.Н., Спиридонова В.А.. Копылов A.M., Добровольский А.Б., Свойства нового ДНК аптамера — прямого ингибитора тромбина // Бюллетень экспериментальной биологической медицины. 2010. Т. 150. № 10. С. 394-397, ВАК.

31. Спиридонова В.А.. Головин A.B., Копылов A.M., Добровольский А.Б., Мазуров A.B., ДНК аптамеры - ингибиторы тромбина, патент № 2401306, дата приоритета 17 декабря 2008 г

32. Спиридонова В.А.. Головин A.B., Копылов A.M., Добровольский А.Б., Мазуров A.B., Модифицированные ДНК аптамеры, ингибирующие активность тромбина, патент РФ № 2410432, дата приоритета 23 ноября 2009 г.

Подписано в печать 18.02.2011 Заказ №г18948, Тираж 150 штук Печать цифровая Типография «Печатай.ру» ИНН 7713268282 125299, г. Москва, Ленинский проспект, д. 35 +7 (495) 954-89-75 +7 (495) 666-25-96 www.pechatay.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Спиридонова, Вера Алексеевна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Метод SELEX.

1.1.2. Укороченные аптамеры.

1.1.3. Сравнение свойств антител с аптамерами.

1.2. Аптамеры как инструменты в биохимических исследованиях.

1.3. Аптамеры к антибиотикам.

1.3.1. Аптамеры к тетрациклину.

1.3.2. Аптамеры к стрептомицину.

1.3.3. Аптамеры к хлорамфениколу.

1.3.4 Аптамеры к аминогликозидам.

1.4. Аптамеры как биосенсоры.

1.5.Свойства аптамеров, ингибирующих биологическую активность белков

1.6. Аптамеры к белкам, не связывающим нуклеиновые кислоты.

1.6.1. Аптамеры к тромбину.

1.6.2. Аптамеры к фактору Vila.

1.6.3. Аптамеры к фактору 1Ха.

1.6.4. Аптамеры к протеиназе вируса гепатита С - NS3 (HSV-NS3).

1.6.5. Аптамеры к эластазе нейтрофилов человека.

1.6.6. Аптамеры к VEGF.

1.6.7. Аптамеры к основному ростовому фактору фибробластов.

1.6.8. Аптамеры к ростовому фактору PDGF.

1.6.9. Аптамеры к интерферону у человека.

1.6.10. Аптамеры к ангиопоэтину-2.

1.6.11. Аптамеры к белкам вируса гриппа.

1.7. Аптамеры к белкам, связывающим нуклеиновые кислоты.

1.7.1. Аптамеры к Та1>белку.

1.7.2. Аптамеры к ШУ-1 Яеу (ревертаза).

1.7.3. Аптамеры к ШУ обратной транскриптазе.

1.7.4. Транскрипционный фактор Е2Р.

1.7.5 Аптамеры к фактору МБ-кВ.

1.8. Аптамеры к антителам, к иммуноглобулинам.

1.8.1. Аптамеры к антителу МА20 к инсулиновому рецептору.

1.8.2.Аптамеры к моноклональному антителу (МаЬ) к ацетилхолиновому рецептору.

1.8.3.Аптамеры к иммуноглобулину Е.

1.8.4.Аптамеры к цитотоксичному антигену Т4.

1.9.Аптамеры к адгезивным молекулам.

1.9.1 .Аптамеры к Р-Селектину.

1.9.2.Аптамеры к Ь-селектину.

1.10.Аптамеры к антигену РБМА.

1.11.Аптамеры к белкам комплемента С5 человека.

1.12.Аптамеры к липопротеинам (не-панкреатическая секреторная фосфолипаза А2 человека.

1.13.Аптамеры к прионовым белкам -РгР50.

1.14.Аптамеры к патогенам (к трипанозоме).

2. Результаты и обсуждение.

2.1. Компьютерная аннотация зоны контакта белка ТШБ7 с ТіЬ 168 рРНК в составе ТШЗОБ, компьютерное моделирование третичной структуры белка Есо87.

2.2. Изучения структуры и термодинамики природной системы, дифференциального узнавания различных РНК рибосомным белком

Б7 прокариот.

2.2.2. Создание суперпродуцентов рибосомных белков S7 из различных организмов: Escherichia coli (EcoS7), Thermus thermophilics (TthS7). Отработка методов сворачивания белковой молекулы.

2.2.3. Изучение комплексообразование рибосомных белков S7 из Escherichia coli (EcoS7) и Thermus thermophilics (TthS7) с фрагментами 16S pPHK Е. coli и делеционными фрагментами sir мРНК£. coli.

2.2.3.1. Взаимодействие фрагмента Ecol6S pPHK с белками EcoS7, TthS7.

2.2.3.2. Изучение влияния белков EcoS7 и TthS7 на структуру фрагмента Ecol6S pPHK.

2.2.3.3. Взаимодействие фрагмента EcoStr мРНК с белками EcoS7 и TthS7.

2.2.3.4. Изучение влияния белков EcoS7 и TthS7 на структуру фрагмента

EcoStr мРНК.

2.2.4. Делеционный анализ str мРНК Е. Coli.

2.2.5. Анализ связывания делеционных фрагментов межцистрона str мРНК

Е. coli с белками EcoS7 и TthS7.

2.2.6. Селекция аптамеров РНК на основе фрагмента EcoStr мРНК.

2.2. Создание аптамерных ДНК к тромбину, обладающих стабильной пространственной структурой и способностью связывать тромбин с высокой эффективностью и специфичностью in vitro. Оценка эффективности ингибирующего действия аптамеров на активность тромбина в реакциях фибринолиза и агрегации тромбоцитов в условиях in vitro.

2.2.1. Создание ДНК-аптамеров к тромбину.

2.2.2. Компьютерное моделирование структур ДНК-аптамеров.

2.2.3. Изучение ДНК-аптамеров методом кругового дихроизма.

2.2.4. Комплексы ДНК-аптамеров с тромбином.

2.2.5. Изучение взаимодействия аптамера RE31 с тромбином методом плазмонного резонанса (ППР).

2.2.6. Тромбин - ключевой белок свертывания крови.

2.2.7. Ингибирование процессов свертывания крови ДНК-аптамерами.

2.2.8. Влияние мутантного аптамера на процесс свертывания крови.

2.2.9. Влияние аптамеров на агрегацию тромбоцитов.

2.3.Создание модифицированных производных аптамеров. Оценка эффективности ингибирующего действия модифицированных аптамеров на активность тромбина и возможность подавления тромбообразования в модели in vivo.

2.3.1. Свойства модифицированных аптамеров.

2.3.2. Действие модифицированных аптамеров на тромбининдуцированную агрегацию тромбоцитов.

2.3.3.Изучение влияния ДНК-аптамеров на коагуляционную способность плазмы крови на животных моделях.

2.3.4. Оценка ингибирующего действия модифицированных аптамеров на модели артериального тромбоза in vivo

2.4. Создание антидота к аптамерной ДНК. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в нуклеопротеидном комплексе аптамер-тромбин.

2.4.1. Структура антидота.

2.4.2. Изучение конкурентного взаимодействия аптамера к тромбину с антидотом в нуклеопротеидном комплексе аптамер-тромбин.

3. Материалы и методы.

3.1. Программы и схемы, использованные при компьютерном моделировании рибосомного белка EcoS7.

3.2. Клонирование рибосомных белков.

3.2.1. Клонирование TthS7.

3.2.2. Клонирование EcoS7.

3.3. Подготовка компетентных клеток и трансформация рекомбинантными плазмидами.

3.4. Определение наличия вставки в векторе.

3.5. Выделение рибосомных белков EcoS7 TthS7.

3.6. Синтез РНК in vitro с фрагментов ДНК, полученных ПЦР.

3.7. Выделение фрагмента 16S рРНЕС и фрагментов EcoStr мРНК Е. coli.

3.8. Работа с комбинаторной библиотекой РНК.

3.9. Комплексообразование РНК с рибосомным белком.

3.10. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов РНК через секвенирование ДНК по Сэнгеру.

3.11. Реакции радиоактивного мечения олигодезоксирибонуклеотидов.

3.12. Химическая модификация РНК.

3.13. Картирование модификаций и расщепления РНК, а также контрольное секвенирование.

3.14. УФ - индуцируемое «сшивание» комплекса РНК с белком.

3.15. Иммобилизация тромбина на CNBr-активированной сефарозе.

3.16. Работа с комбинаторной библиотекой ДНК.

3.17. Анализ фрагментов ДНК электрофорезом в агарозном геле.

3.18. Разделение цепей ДНК с помощью стрептавидиновых частиц.

3.19. Селектирование алтамеров к тромбину первым способом.

3.20. Селекция аптамеров к тромбину вторым способом.

3.21. Определение степени комплексообразования ДНК с тромбином.

3.22. Рестрикция нуклеиновых кислот.

3.23. Лигирование обогащенной фракции аптамеров с плазмидными ДНК.

3.24. Секвенирование аптамеров в составе плазмид.

3.25. Дизайн и структура базовых ДНК-аптамеров, взаимодействующих с тромбином.

3.26. Аптамеры к тромбину.

3.27. Исследования структур аптамеров с помощью метода кругового дихроизма.

3.28. Работа с тромбином.

3.29. Методика исследования связывания аптамеров с тромбином.

3.30. Иммобилизация аптамера RE31.

3.31 Модель артериального тромбоза у животных.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структура аптамерных ДНК/РНК - как основа для создания лекарственных препаратов и регуляторных элементов"

Прошедшее десятилетие ознаменовалось существенным прорывом в использовании фундаментальных знаний о ДНК в прикладных работах. Прошло около 20 лет с того момента, как появились первые публикации, в которых был описан новый метод селекции нуклеиновых кислот SELEX, и появился термин «аптамер». Метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) был разработан одновременно и независимо друг от друга в лабораториях Шостака и Голда (США) в 1990 году [1, 2]. Аптамеры представляют собой небольшие однотяжевые молекулы ДНК и РНК длиной 40100 нуклеотидов с достаточно сложной трехмерной структурой.

Именно сложная структура фрагментов нуклеиновых кислот обеспечивает способность аптамеров специфически связывать различные молекулы, в том числе и белки. Данный метод иррационального дизайна базируется на одновременном использовании такого огромного количества разнообразных мутантов (более 1018), которое трудно сопоставить с набором молекул, имеющих точечные мутации, при рациональном дизайне. Селекцию, проводимую с помощью метода SELEX, можно сравнить со сложнейшим процессом биосинтеза и отбора белковых «узнающих» элементов - антител, который природа создавала тысячелетиями. Получаемые аптамеры обладают высоким сродством к белкам-мишеням, сравнимым со сродством природных комплексов антиген-антитело.

На сегодняшний день имеется более 100000 ссылок на статьи, в которых используется термин аптамер. Это подчеркивает большой интерес к методу, к его возможностям, к получению таких аптамеров, которые можно использовать, как медицинские препараты, в тест-системах, как биосенсоры.

В 1990 году селекция in vitro была использована в работах Голда, Шостака, [1, 2], которые идентифицировали уникальные РНК структуры с новыми свойствами с измененной функциональностью: связывание с молекулами-мишенями, с энзиматической активностью. В публикации в журнале Nature Эллингтон и Шостак ввели понятие «аптамеры» [2]. В тоже время Голд [1] опубликовал работу о получении РНК с помощью процесса, названного SELEX.

В последующие годы аптамеры были получены для огромного количества мишеней: пептидов, малых молекул, гормонов и, конечно, белков. В качестве мишеней выбирались такие белки, которые играли центральную роль в развитии ряда болезней, в различных патологических процессах. Это создало прикладное направление для использования аптамеров в терапии.

На сегодняшний день показано, что класс аптамеров многолик. Параллельно с лекарственными средствами стало развиваться исследование мотивов РНК, названных «рибосвитчами». Эти природные «рибосвитчи» встроены в мРНК и под действием разных молекул могут влиять на экспрессию генов, т.е. могут служить регуляторными элементами, контролируя экспрессию генов как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции.

В настоящее время идея, согласно которой аптамеры могут регулировать (ингибировать) активность белков, сейчас перешла из стадии фундаментальных разработок в плоскость решения практических задач.

Целью данной работы было создание ДНК/РНК аптамеров, изучение их структуры с помощью компьютерного моделирования, спектральных методов. Исследование процессов комплексообразования аптамеров с белками с использованием различных видов хроматографии, электрофорезов, поверхностного плазмонного резонанса, методов меченых атомов.

С одной стороны, существуют белки, которые образуют природные специфические нуклеопротеидные комплексы, с другой стороны, огромное количество белков не имеют природных комплексов с НК.

Было поставлено две задачи: во-первых, исследовать структуру и термодинамику природной системы дифференциального узнавания рибосомным белком 87 различных РНК, и с помощью метода 8ЕЬЕХ сконструировать РНК-аптамеры к нему. Во-вторых, создать и изучить структуру искусственной системы аптамер-тромбин. Как известно, тромбин не взаимодействует с нуклеиновой кислотой.

В практическом аспекте целью работы было создание ДНК-аптамеров, ингибирующих тромбин, что может в дальнейшем стать основой для создания лекарственных антитромботических препаратов.

1. Обзор литературы «Селекция in vitro с целью получения функциональных ДНК/РНК аптамеров»

Одной из актуальнейших проблем в молекулярной биологии является изучение специфичности взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами (НК), которые регулируют жизненно важные процессы в клетке. В клетке ДНК/РНК-белковые взаимодействия служат основой её жизнедеятельности: репликация генома, экспрессия генов, транскрипция (синтез РНК), трансляция (синтез белка). Нуклеиновые кислоты обладают различными функциями, включая сохранение информации, узнавание различных белков, лигандов, катализ. Хорошо известно, что информация может сохраняться в последовательности нуклеотидов и прочитываться как последовательность азотистых оснований.

Согласно общепринятому мнению, за регуляцию всех метаболических и катаболических путей отвечают белки. В последнее десятилетие появились примеры обратного представления: управлять экспрессией и функцией белков можно с помощью НК, создавая генно-инженерные конструкции, или структуры типа триплексов, или антисенсовые последовательности, либо рибозимы, либо аптамеры. Аптамеры - небольшие молекулы РНК/ДНК, способные взаимодействовать с различными молекулами — мишенями. Они складываются в сложные трехмерные структуры, которые наделяют молекулы РНК/ДНК различными функциями, включая способность катализировать ряд химических реакций. Процесс селекции in vitro позволяет выделить из большого разнообразного набора молекул, называемого комбинаторной библиотекой, те последовательности НК, которые имеют высокое сродство к своей мишени.

Селекция in vitro — это экспериментальный метод, использующий пространственную структуру олигонуклеотида как объект исследования. Гибкость, которой обладают фрагменты однотяжевой РНК/ДНК, позволяет создавать набор шпилек, петель, выпячиваний, которые все вместе создают сложные трехмерные структуры, наделяющие молекулы новыми свойствами. Достаточно 25-30 нуклеотидов, чтобы сложить несколько отличных друг от друга вторичных структур. Например, молекула тРНК длиной 74 нуклеотида может быть представлена 1043 различными вариантами молекул [3]. Именно сложная структура обеспечивает способность аптамеров специфически связывать различные молекулы, в том числе и белки.

Комбинаторика или комбинаторный подход получил свое развитие как научное направление в математике, изучающей дискретные объекты, множества, сочетания, перестановки. В настоящее время комбинаторика широко используется, как составляющая любого исследования. Математический термин «комбинаторный» стал теперь и химико-биологическим. Использование основ комбинаторной химии нуклеиновых кислот позволило разработать метод иррационального дизайна полинуклеотидов (метод SELEX) для исследования проблем нуклеиново-белкового узнавания.

1.1. Метод SELEX

Термины: алтамер, SELEX появились около 20 лет назад и сразу приковали к себе внимание, т.к. давали возможность изучать фундаментальные процессы нуклеиново-белкового взаимодействия как для белков, образующих комплексы с нуклеиновыми кислотами, так и для белков, не имеющих природных комплексов с ДНК/РНК, путем одновременного введения большого числа мутаций в одном эксперименте. Эту селекцию in vitro, авторы назвали «эволюцией в пробирке» [1]. Метод SELEX предоставляет возможность подобрать комплементарного партнера, используя комбинаторную библиотеку НК.

Селекция начинается с генерации большой библиотеки НК с фиксированными 5'- и 3Л-концами и вырожденным районом длиной 30-60 нуклеотидов (рис.1). Такая библиотека содержит 1014—1015 вариантов молекул, которые сворачиваются в сложные трехмерные структуры. Химический синтез библиотеки проводят на синтезаторах в гетерогенной фазе, где первый нуклеотид цепочки прикреплен к стенке реактора. На начальных ступенях синтеза в реактор подаются однотипные модифицированные нуклеотидтрифосфаты (синтоны), которые четко направляют синтез по заданной программе. Когда синтез приближается к району, где должна присутствовать рандомизированная последовательность, то в реактор подаются сразу все четыре вида синтонов, и растущие монотонные цепочки нуклеотидов начинают приобретать черты многообразия. Если рандомизировать одну нуклеотидную позицию, то вариантов будет четыре, если рандомизировать два последовательных нуклеотида, разнообразие молекул возрастает до 16 вариантов, если три нуклеотида, то возникнет 64 варианта и т.д. При рандомизации района в 30 нуклеотидов число вариантов составляет 1017. Такая библиотека НК молекул, которые сворачиваются в сложные трехмерные структуры, инкубируется с белком.

Комбинаторную библиотеку РНК можно получить с помощью Т7РНК-полимеразы, вводя для неё промотор в константный район. Полученную РНК инкубируют с белком, и те молекулы РНК, которые связались с белковой мишенью, отделяют от несвязавшихся (рис.2). Связавшиеся РНК молекулы далее отделяют от белка и амплифицируют с помощью обратной транскриптазы и ПЦР, чтобы получить новый пул молекул с увеличенным сродством. Процесс повторяется обычно 10-15 раз до тех пор, пока максимальное количество аптамеров, имеющих сродство к мишени, в обогащенной фракции не будет ощутимо заметным. Далее аптамеры клонируют, как правило, в бактериальный вектор и секвенируют.

КОМБИНАТОРНАЯ БИБЛИОТЕКА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ константная часть вырожденный район константная часть

ДНК вССААТССА! ССАСАТСТ АСЬ'ААТТО I ГСАСТССАСАСТТОАСиААиС! Г

ИНК сасААио(ЗАиа^АСАисидссААиис иисАсиосАСАсиивдеоАдссии

- любой из А, С, С, Т (и)

Количество вариантов п

Длина вырожденной Количество вариантов последовательности

4 10

10 102

20 106

30 1017

40 ю23

60 ю37

120 ю72

Рис.1. Комбинаторная библиотека нуклеиновых кислот. Красным цветом выделен район, в котором буквой п обозначены последовательности случайных нуклеотидов. Любую позицию может занимать одно из азотистых оснований в, А, Т, С. Белым цветом отмечены нуклеотиды постоянного состава. Количество вариантов рассчитывают по формуле 4П, где п -длина вырожденной последовательности.

Полученные семейства аптамеров к данной мишени исследуют, сравнивая последовательности, складывая вторичные структуры. Аптамеры создают сложные структуры в виде стеблей с петлями, с карманами, используя необычные неканонические пары, искажения остова или повороты.

Для ДНК селекция начинается с комбинаторной библиотеки ДНК, у которой рандомизированный район фланкирован фиксированными последовательностями на 5'- и 3Л- концах. Для получения однотяжевых молекул используют либо асимметричный ПЦР, либо один из праймеров несет биотиновую метку, с помощью которой отделяют одну цепь ДНК от другой на колонках со стрептавидином.

Изучая семейства аптамеров, Голд с сотр. [4] отмечают существование оснований, которые однотипны и которые обеспечивают консервативную вторичную структуру доменов. Некоторые основания абсолютно консервативны. Последние очень часто встречаются у нуклеотидов в однотяжевой форме или в неканонической паре. Они непосредственно взаимодействуют с мишенью. Заранее предсказать детали формы этих участков (или большие поверхности, которые взаимодействуют с белком) очень трудно. Области олигонуклеотидов с наиболее характерными чертами всегда располагаются при областях связывания с белком и всегда используют, как правило, изгибы неканонических взаимодействий [4].

Сродство аптамеров к белкам, не имеющих природных комплексов с НК, пожалуй, не слабее, чем сродство аптамеров к белкам, связывающих НК [4].

Ключевой стадией метода 8ЕЬЕХ является отбор целевых аптамеров, способных связываться с молекулой-мишенью (рис.2). Функциональные целевые молекулы составляют лишь незначительную часть исходной

9 12 комбинаторной библиотеки: 1 аптамер приходится на 10 - 10 молекул.

ПЦР Амплификация * *

Исходная библиотека

ДНК

ДНК или транскрипция для РНК

Повторное связывание

Связывание с иммобилизованным тромбином

Ф*

Разделение цепей для ДНК или транскрипция для РНК знкзн Я

Жесткая элюция связавшихся молекул

ПЦР

Амплификация

Иммобилизация на С№г-сефарозе

Несвязавшаяся ДНК или РНК

Обогащенная фракция - Двутяжевая ДНК

- Однотяжееая ДНК или РНК

Рис.2. Схема метода БЕЬЕХ для получения ДНК- или РНК-аптамеров. Исходную рандомизированную библиотеку ДНК переводят в о дно цепочечную ДНК (оцДНК) и вводят в реакцию связывания с белком, предварительно иммобилизованным на колонке. РНК получают транскрипцией из исходной библиотеки, в структуру которой включена последовательность промотора для фаговой Т7 РНК полимеразы.

Селекция аптамеров основана на отличительных физических (или функциональных) свойствах комплекса аптамер - мишень. Большинство методов отбора аптамеров основано на возможности их физического отделения в виде комплекса с молекулой-мишеныо от основной фракции молекул библиотеки. Обычно при проведении селекции используются либо метод аффинной хроматографии, либо фильтрацию растворов комплекса на нитроцеллюлозных мембранах, либо различные виды электрофорезов [5-7].

При использовании аффинной хроматографии мишень-лиганд, как правило, иммобилизуют на полимерном носителе. Целевые олигонуклеотиды сорбируются на колонке с носителем и, таким образом, отделяются от исходных не связавшихся молекул. В качестве полимерного носителя чаще всего используется агароза и ее производные.

При использовании нитроцеллюлозных фильтров комплекс аптамера с белком сорбируется на мембране,- а несвязавшиеся аптамеры проходят, не задерживаясь. В методе гель-электрофореза используется различие в подвижности в полиакриламидном геле молекул исходной библиотеки и ее комплексов с мишенью. Так как РНК/ДНК аптамеры мечены радиоактивным фосфором, то поведение аптамеров контролируется методом радиоактивных индикаторов. В результате нескольких циклов селекции получается обогащенная фракция аптамеров, которая связывается с молекулой-мишеныо на несколько порядков сильнее, чем исходная библиотека (сравнивают кажущиеся константы диссоциации полученных комплексов).

На сегодняшний день опубликовано много обзоров с детальным описанием всех этапов данного метода [5-16].

Ряд авторов делали попытки исследовать, может ли новая функция быть получена из предсуществующей структуры [17]. Для этого использовали дизайн комбинаторных библиотек, в которые вводили определенные

Ар(юг ЛшгМоп сопйаш (К^ 10 цИ 300 «М 1пМ

-► I

I ' I

Рис.3. По оси абсцисс показано увеличение информационной сложности. На рисунке представлена вторичная структура каждой серии ГТФ-связывающих аптамеров. Они расположены согласно уменьшению констант диссоциации. Двигаясь слева направо, аптамеры приобретают все более сложные вторичные структуры. Звездочками указаны те элементы структуры, которые исходно были включены в комбинаторную библиотеку [17]. стабильные элементы структур: стебли, четырехнуклеотидные петли, псевдоузлы и шпильки, с целью повысить шанс получения структур с активной функцией.

В одном удачном примере была сконструирована библиотека из 2,5 х1014 молекул с внутренним стеблем и стабильной четырехнуклеотидной петлей, фланкированной 26-ю полностью случайными основаниями [17] Частично сконструированная библиотека была смешана с библиотекой, имеющей полноразмерный район со случайной последовательностью 2,5 х1014 молекул той же длины. Смесь библиотек была подвергнута селекции для высокоаффинного связывания с молекулами СГР . Было получено 11 различных семейств аптамеров с константами диссоциации комплексов с ОТР, которые варьировали от 8 мкМ до 9 нМ. Все они были выделены, охарактеризованы и показано, что с усложнением структуры увеличивается сродство к ОТР (рис. 3) [17].

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Спиридонова, Вера Алексеевна

Выводы

1. Методами компьютерного анализа и моделирования in silico показано, что два белка-аналога EcoS7 и TthS7 по первичной структуре идентичны на 52 %, а в зоне РНК-белковых контактов в 30S субчастице — на 83 %. Получены гомологичные и гетерологичные комплексы EcoS7, TthS7 с фрагментом 16S рРНК с использованием белков EcoS7, TthS7, выделенных из суперпродуцентов E.coli. Определены константы диссоциации комплексов, что позволило сделать вывод о консервативности РНК-связывающего центра белков.

3. Используя комбинаторную библиотеку на основе межцистронного регуляторного участка Ecostr мРНК с рандомизированной пентануклеотидной последовательностью, создан фрагмент РНК, связывающий белок TthS7, который в начале эксперимента не обладал сродством к данному белку. Тем самым показана принципиальная возможность создания регуляторных участков трансляции рибосом в клетке.

4. Созданы ДНК-аптамеры к тромбину, которые обладали G-квадруплексной пространственной структурой и ингибировали прокоагулянтную активность фермента Изучена их структура методами молекулярной динамики и кругового дихроизма. Подтверждено наличие структуры «кресла» как для 15ТВА, так и для 31 ТВ A, SGK52, SGK53, RSG54, RSG55, RE31 и ST43. Показано, что в присутствии комплементарной последовательности структура «кресла» раскрывается и переходит в двухтяжевую структуру.

6. Исследовано влияние 15ТВА и 31 ТВ A, RE31, ST43, SG52, SGK53, RGS54, RGS55 и их модифицированных производных на активность тромбина. Показано, что при добавлении к плазме крови человека аптамеры вызывали зависимое от дозы удлинение тромбинового времени, протромбинового времени и активированного частичного тромбопластинового времени. Это свидетельствует о влиянии аптамеров на процессы свертывания крови и тромбообразования.

Получены патенты: Спиридонова В.А., Головин A.B., Копылов A.M., Добровольский А.Б., Мазуров A.B. «ДНК аптамеры - ингибиторы тромбина», патент № 2401306, дата приоритета 17 декабря 2008 г и

Спиридонова В.А., Головин A.B., Копылов A.M., Добровольский А.Б., Мазуров A.B. «Модифицированные ДНК аптамеры, ингибирующие активность тромбина», патент РФ № 2410432, дата приоритета 23 ноября 2009 г.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Спиридонова, Вера Алексеевна, Москва

1. Tuerk С., GoldL. Systematic evolution ofligands by exponential enrichment RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase // Science. 1990. V. 249. № 4968. P. 505-510.

2. Ellington A.D., SzoztakJ. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands //Nature. 1990. V. 346. № 6287. P. 818-822.

3. Spiegelman S. An approach to the experimental analysis of precellular evolution // Q. Rev. Biophys. 1971. V. 4. № 2. P. 213-253.

4. GoldL., Brown D., He Y., Shtatland Т., Singer В., Wu Y. From oligonucleotide shapes to genomic SELEX: Novel biological regulatory loops // Proc. Natl. Acad. Sei USA. 1997. V. 94. №1.P. 59-64.

5. Wilson D.S., SzostakJ.W. In vitro selection of functional nucleic acids //

6. Annu.Rev.Biochem. 1999. V. 68. P. 611-647.

7. FamulokM., HartigJ.S., Mayer G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy // Chem.Rev. 2007. V. 107. № 9. P. 3715-3743.

8. Gold L., Polisky В., Uhlenbeck O., Yarns M. Diversity of oligonucleotide functions //Annu.Rev.Biochem. 1995. V. 64. P. 763-797.

9. Nimjee S.M., Rusconi C.P., Harriington R.A., Sullenger B.Ä. The Potential of aptamers as anticoagulants // Trends Cardiovasc Med. 2005. V. 15. № 1. P.41-45.

10. Brody E.N., GoldL. Aptamers as therapeutic and diagnostic agents // J Biotechnol. 2000. V. 74. № 1. P. 5-13.

11. Shamah S.M., HealyJ.M., CloadS.T. Complex target SELEX//Acc. Chem, Res. 2008. V. 41. № 1. P. 130-138.

12. Копылов A.M., СпиридоноваB.A. Применение аптамеров в медицинской диагностике и терапии // Молекулярная биология. 2000. V. 34. № 6. С. 1097-1113;

13. Кулъбачинский А.В. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням // Успехи биологической химии. 2006. Т. 46. С. 193-224.

14. Радъко СЛ., Рахметова С.Ю., Бодоев Н.В., Арчаков А.И. Аптамеры как перспективные аффинные реагенты для клинической протеомики // Биомедицинская химия. 2007. Т. 53. № 1. С. 5-24.

15. Спиридонова В. А. Молекулярные узнающие элементы — ДНК/РНК-аптамеры к белкам // Биомедицинская химия. 2010. Т. 56. № 6. С. 639-656.

16. Davis J.D., Szostak J. W. Isolation of high affinity GTP aptamers from partially-structured RNA libraries // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 2002. V. 99. № 18. P. 11616-11621.

17. Jayasena S.D. Aptamers: An Emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics // Clinical Chemistry. 1999. V. 45. № 9. 1628-1650.

18. Zhou J., Soontornworajit В., Snipes M.P., Wang Y. Development of a novel pretargeting system with bifunctional nucleic acid molecules // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. V. 386. № 3. P. 521-525.

19. Green L.S., JellinekD., JenisonR, OstmanA., Heldin C.H., JanjicN. Inhibitory DNA ligands to platelet-derived growth factor B-chain // Biochemistry. 1996. V. 35. № 45. P. 14413-14424. 25.Sayer N.M., CubinM., RhieA., Bullock M„ Tahiri-Alaoui A., James W.

20. White RR, Sullenger B.A., Rusconi C.P. Developing aptamers into therapeutics // J. Clin. Invest. 2000. V. 106. № 8. P. 929-934;

21. Doudna J.A., Cech T.R, Sullenger B.A. Selection of an RNA molecule that mimics a major autoantigenic epitope of human insulin receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. № 6. P. 2355-2359;

22. Rusconi C.P., Scardino E., Layzer J., Pitoc G.A., Ortel T.L., Monroe D., Sullenger B.A. RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa//Nature. 2002. V. 419. № 6902. P. 90-94;

23. Rimmele M. Nucleic acid aptamers as tools and drugs: recent developments // Chembiochem. 2003. V. 4. № 10. P. 963-971;

24. Kimoto M., Shirouzu M., Mizutani S., Koide IL, Kaziro Y., Hirao I., Yokoyama S. Anti-(Raf-l) RNA aptamers that inhibit Ras-induced Raf-1 activation // Eur J.Biochem. 2002. V. 269 № 2. P. 697-704;

25. Shi H., Hoffmann B.E., Lis J.T. RNA aptamers as effective protein antagonists in a multicellular organism // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1999. 96. № 18. P. 10033-10038;

26. Golovina A.Y., Bogdanov A.A., Dontsova O.A., Sergiev P.V., Purification of 39S ribosomal subunit by streptavidin affinity chromatography // Biochimie. 2010. V. 92. № 7. P. 914-917;

27. Famulok M., Blind M., Mayer G. Intramers as promising new tools in functional proteomics // Chem.Biol. 2001. V. 8. № 10. P. 931-939;

28. Cassiday L.A., Maher L.J. 3rd Yeast genetic selections to optimize RNA decoys for transcription factor NF-kappa B // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. № 7. P. 3930-3935;

29. Martell R.E., Nevins J.R., Sullenger B.A. Optimizing aptamer activity for gene therapy applications using expression cassette SELEX // Mol. Ther. 2002. V. 6. № 1. P. 30-34;

30. AA.Kreneva R.A., Perumov D.A. Genetic mapping of regulatory mutations of Bacillus subtilis riboflavin operon // Mol. Gen. Genet. 1990. V. 222. № 2-3. 467-469;

31. Nudler E., Mironov A.S. The riboswitch control of bacterial metabolism // Trends Biochem. Sci. 2004. V. 29. № 1. P. 11-17;

32. A6.Gelfand M.S., Mironov A.S., Jomantas J., Kozlov Y.I., Perumov D.A. A conserved RNA structure element involved in the regulation of bacterial riboflavin synthesis genes // Trends Genet. 1999. V. 15. № 4. P. 439-442;

33. Al.Nou X., Kadner R.J. Adenosylcobalamin inhibits ribosome binding to htuB RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 13. P. 7190-7195;

34. St or mo G.D., Ji Y. Do mRNA act as direct sensors of small molecules to control their expression? II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. № 17. P. 9465-9467;

35. Werstuck G., Green M.R Controlling gene expression in living cells through small molecule-RNA interactions II Science. !998. V. 282. № 5387. P. 296-298;

36. Nahvi A., Sudarsan N., Ebert M.S., Zou X., Brown K.L., Breaker R.R. Genetic control by a metabolite binding mRNA // Chem. Biol. 2002. V. 9. № 9. P. 1043-1049;

37. Winkler W., Nahvi A., Breaker R.R. Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression // Nature. 2002. V. 419. № 6910. P. 952-956;

38. Anokhina M.M., Barta A., Nierhans K.H., Spiridonova V.A., Kopylov A.M., Mapping of the second tetracycline binding site on the ribosomal small subunit of E.coli //Nucleic acids Res. 2004. V. 32. № 8. P. 2594-2597;

39. Berens C., Thain A., Schroeder R. A tetracycline-binding RNA aptamer // Bioorg.Med.Chem. 2001. V. 9. № 10. P. 2549-2556;

40. Suess B., Hanson S., Berens C., Fink B., Schroeder R., Hillen W., Conditional gene expression by controlling translation with tetracycline-binding aptamers // Nucleic acids Res. 2003. V. 31. № 7. P. 1853-1858;

41. Davies J., Gorini L., Davis B.D., Misreading of RNA codewords induced by aminoglycoside antibiotics // Mol. Pharmacol. 1965. V. 1. № 1. P. 93-106;

42. Tereshko V., Skripkin E., Patel D.J. Encapsulating streptomycin within a small 40-mer RNA // Chem.Biol. 2003. V. 10. № 2. P.175-185;

43. Burke D.H., Hoffmann D.C., Bown A., Hansen M., Pardi A., Gold L. RNA aptamers to the peptidyl transferase inhibitor chloramphenicol // Chem.Biol. 1997. V. 4. № 11. P. 833-843;

44. Moazed D., Noller H.F. Interaction of antibiotics with functional sites in 16S ribosomal RNA // Nature. 1987. V. 327. № 6121. P. 389-394;

45. Ramakrishman V., Ribosome structure and the mechanism of translation // Cell. 2002. V. 108 № 4. P. 557-572;

46. Q.Wang Y., Rando RR, Specific binding of aminoglycoside antibiotics to RNA //

47. Hartmuth K., Vornlocker H.P., Luhrmann R. Tobramycin affinity tag purification of spliceosomes // Methods Mol. Biol. 2004. V. 257. P. 47-64;

48. Tombelli S., Minunni M., Luzi E., Mascini M. Aptamer-based biosensors for the detection of HIV-1 Tat protein // Bioelectrochemistiy. 2005. V. 67. № 2. P. 135-141;

49. Ferreira G.N., da-Silva A.C., Tomé B. Acoustic wave biosensors: physical models and biological applications of quartz crystal microbalance // Trends Biotechnol. 2009. V. 27. № 12. P. 689-697;

50. Hianik T., Ostatnâ V., Zajacovâ Z, Stoikova E., Evtugyn G. Detection of aptamer-protein interactions using QCM and electrochemical indicator methods // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005. V. 15. № 2. P. 291-295;

51. Yao C., Qi Y, Zhao Y., Xiang Y., Chen Q., Fu W. Aptamer-based piezoelectric quartz crystal microbalance biosensor array for the quantification of IgE // Biosens. Bioelectron. 2009. V. 24. № 8. P. 2499-2503;

52. Treitz G., Gronewold T.M., Quandt E., Zabe-Kuhn M. Combination of a SAW-biosensor with MALDI mass spectrometric analysis // Biosens. Bioelectron. 2008. V. 23. № 10. P. 1496-1502;,

53. Li D., Song S., Fan C. Target-responsive structural switching for nucleic acid-based sensors // Acc. Chem. Res. 2010. V. 43. № 5. P. 631-641;

54. ST.Kara P., de la Escosura-Muniz A., Maltez-da Costa M, Guix M., Ozsoz M., Merkoci A. Aptamers based electrochemical biosensor for protein detection using carbon nanotubes platforms // Biosens Bioelectron. 2010. V. 26. № 4. P. 1715-1718;

55. SS.Tombelli S., Mascini M. Aptamers biosensors for pharmaceutical compounds // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2010. V. 13. № 7. P. 641-649;

56. Z/ B., Dong S., Wang E. Homogeneous analysis: label-free and substrate-free aptasensors // Chem. Asian. J. 2010. V. 5. № 6. P. 1262-1272;

57. Eyetech study Group Anti-vascular endothelial growth factor therapy for subfoveal choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration: phase II study results // Ophthalmology. 2003. V. 110. № 5. P. 879-881;

58. White R., Rusconi C., Scardino E, Wolberg A., Lawson J., Hoffman M., Sullenger B.A. Generation of species cross-reactive aptamers using "toggle" SELEX // Mol. Ther. 2001. V. 4. № 6. P. 567-573;

59. Rusconi C.P., Roberts J.D., Pitoc G.A., Nimjee S.M., White R.R., Quick G.Jr., Scardino E., Fay W.P., Sullenger B.A. Antidote-mediated control of an anticoagulant aptamer in vivo // Nat Biotechnol. 2004. V. 22. № 11. P. 14231428;

60. Aurup II, Siebert A., Benseier F., Williams D., Eckstein F. Translation of 2'-modified mRNA in vitro and in vivo I I Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. № 23. P. 4963-4968;

61. Eaton B.E., GoldL., Zichi D.A. Lef s get specific: the relationship between specificity and affinity // Chem. Biol. 1995. V. 2. № 10. P. 633-638;

62. EatonB.E., GoldL., Hicke B.J., JanjicN., Jucker F.M., SebestaD.P., Tarasow T.M., Willis M.C., Zichi D.A. Post-SELEX combinatorial optimization of aptamers // Bioorg. Med. Chem. 1997. V. 5. № 6. P. 1087-1096; '

63. Eaton B.E., Pieken W.A. Ribonucleosides and RNA I I Annual Review of Biochemistry. 1995. V. 64. P. 837-863;

64. Kusser W. Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitro selections: evolving evolution // Molec. Biotechnol. 2000. V. 74. № 1. P. 27-3 8;

65. NolteA., Klussmann S., BaldR., Erdmann V.A., FursteJ.P. Mirror-design of L-oligonucleotide ligands binding to L-arginine//Nat.Biotechnol. 1996. V. 14. № 9. P. 1116-1119;

66. Klussmann S., NolteA., BaldR., Erdmann V.A., FursteJ.P. Mirror-image RNA that binds D-adenosine // Nat.Biotechnol. 1996. V. 14. № 9. P. 1112-1115;

67. EulbergD., Klussmann S: Spiegelmers: Biostable aptamers // Chembiochem. 2003. V. 4. № 10. P. 979-983;

68. Hornby P.J. Designing spiegelmers to antagonise ghrelin // Gut. 2006. V. 55. № 6. P. 754-755;

69. Williams K.P., LiuX.-H., Schumacher T.N., Lin H.Y., Ausiello D.A., Kim P.S., Bartel D P. Bioactive and nuclease-resistant L-DNA ligand of vasopressin // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1997. V. 94. № 21. P. 11285-11290;

70. Leva S., Lichte A., Burmeister J., Muhn P., JahnkeB., Fesser D., ErfurthJ., Burgstaller P., Klussmann S. Spiegelmers: a novel approach toward GnRH antagonism // Chem. Biol. 2002. V. 9. № 3. p. 351-359;

71. НО.Панченко Е.П., Добровольский А.Б. В кн. Тромбозы в кардиологии. Механизмы развития и возможности терапии. Изд. «Спорт и культура». Москва. 1999. С. 55-74;

72. Струкова С.М. Тромбин регулятор процессов воспаления и репарации тканей //Биохимия. 2001. Т. 66. № 1. С. 8-18;

73. Coughlin S.K Thrombin signalling and protease-activated receptors // Nature. 2000. V. 407. № 6801. P. 258-264;

74. TsiangM., Jain A.K, Dunn K.E., Rojas M.E., LeungL.L., Gibbs C.S. Functional mapping of the surface residues of human thrombin // J.Biol.Chem. 1995. V.270. № 28. P.16854-16863;

75. Pechnik I., Madrazo J., Mosesson M. W., Hernandez I., Gilliland G.L., Medvad L. Crystal structure of the complex between thrombin and the central "E" region of fibrin // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 2004. V. 101. № 9. P. 2718-2723;

76. BockL.C., Griffin L.C., Latham J.A., Vermaas E.H., Toole J.J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin //Nature. 1992. V. 355. №> 6360. P. 564-566;

77. Wu Q., TsiangM., Sadler J.E. Localization of the single-stranded DNA binding site in the thrombin anion-binding exosite // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 34. P. 24408-24412;

78. Macaya R.F., Schultze P., Smith F. W., Roe J.A., Feigon J. Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1993. V. 90. № 8. P, 3745-3749;

79. Ikebukuro K., Okumura Y., Sumikara K, Karube I. A novel method of screening thrombin-inhibiting DNA aptamers using an evolution-mimicking algorithm //Nucl. Acid Res. 2005. V. 33. № 12. P. el08;

80. Paborsky L.R, McCurdy S.N., Griffin L. C., Toole J. J., Leung L.L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. №28. P. 20808-20811;

81. Wang K Y., McCurdy S., Shea R.G., Swaminathan S., Bolton P.H. A DNA aptamer which binds to and inhibits thrombin exhibits a new structural motif for DNA // Biochemistry. 1993. V. 32. № 8. P. 1899-1904;

82. Tasset D.M., KubikM.F., Steiner W. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes // J. Mol. Biol. 1997. V. 272. № 5. P. 688-698;

83. Bonder M.A., Koziolkiewicz M., Watala C. Aptamer inhibits degradation of platelet proteolytically activatable receptor, PAR-1, by thrombin // Thrombosis Research. 2001. V.' 104. № 3. P. 215-222;

84. Li W.X., Kaplan A. V., Grant G. W., Toole J. J., Leung L.L.K. A Novel Nucleotide-Based Thrombin Inhibitor Inhibits Clot-Bound Thrombin and Reduces Arterial Platelet Thrombus Formation // Blood. 1994. V. 83. № 3. P. 677-682;

85. Reyderman L., Stavchansky S. Pharmacokinetics and Biodistribution of a nucleotide-based thrombin inhibitor in rats // Pharmacetical Research. 1998. V. 15. № 6. P. 904-910;

86. KubikM.F., Stephens A. W., Schneider D., Marlar RA., Tasset D. High-affinity RNA ligands to human a-thrombin // Nucleic Acid Res. 1994. V. 22. № 13. P. 2619-2626;

87. Becker RC., Povsic 71, CohenM.G., Rusconi C.P., Sullenger B. Nucleic acid as antithrombotic agents; Opportunities in extracellular therapeutics // Thrombosis andHaemostasis. 2010. V. 103. № 3. P. 586-595;

88. Hwang J., Fauzi II, Fukuda K, Sekiya S., Kakiuchi N., Shimotohno K., Taira K, Kusakabe I., Nishikawa S. The RNA aplamer-binding site of hepatitis C virus

89. NS3 protease // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 279. № 2. P. 557-562;

90. Hwang J., Fauzi H., Fukuda K., Sekiya S., Kakiuchi N., Taira K, Kusakabe I., Nishikawa S., Analysis of aptamer binding site for HCV-NS3 protease by alanine scanning mutagenesis // Nucleic Acids Symp Ser. 2000. V. 44. P. 253-254;

91. Doring G. The role of neutrophil elastase in chronic inflammation // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1994. V. 150. № 6. P. 114-117;

92. Oleksyszyn J., Powers J. C. Irreversible inhibition of serine proteases by peptide derivatives of (alpha-aminoalkyl)phosphonate diphenyl esters // Biochemistry. 1991. V. 30. №2. P. 485-493;

93. Smith D., Kirschenheuter G.P., Charlton J., Guidot D.M., Repine J.E. In vitro selection of RNA-based irreversible inhibitors of human neutrophil elastase // Chem. Biol. 1995. V. 2. № 11. P. 741-750;

94. Charlton J., Kirschenheuter G.P., Smith D. Highly potent irreversible inhibitors of neutrophil elastase generated by selection from a randomized DNA-valine phosphonate libraiy// Biochemistry. 1997. V. 36. № 10. P. 3018-3026;

95. Bless N.M., Smith D., Charlton J., Czermak B.J., SchmalH., FriedlH.P., Ward P. A. Protective effects of an aptamer inhibitor of neutrophil elastase in lung inflammatory injury // Curr. Biol. 1997. V. 7. № 11. P. 877-880;

96. Rosen L.S., VEGF-targeted therapy: therapeutic potential and recent advances // Oncologist. 2005. V. 10. № 6. P. 382-391;

97. Pierce E.A., Avery R.L., Foley E.D., Aiello L.P., Smith L.E. Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor expression in a mouse model of retinal neovascularization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. № 3. P. 905-909;

98. Robinson G.S., Pierce E.A., Rook S.L., Foley E., Webb R, Smith L.E. Oligodeoxynucleotides inhibit retinal neovascularization in a murine model of proliferative retinopathy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 10. P. 4851-4856;

99. KvantaA., Algvere P. V., Berglin I., Seregard S., Subfoveal fibrovascular membranes in age-related macular degeneration express vascular endothelial growth factor// Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996. V. 37. № 9. P. 1929-1934;

100. Holash J., Maisonpierre P.C., Compton D., BolandP., Alexander C.R., Zagzag D., Yancopoulos G.D., WiegandS.J. Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF // Science. 1999. V. 284. № 5422. P. 1994-1998;

101. Ikebukuro K., Hasegawa II., Sode K. Selection and characterization of DNA aptamers against VEGF (165) with aptamer blotting method and its application // Nucleic Acids Symposium Series. 2007. V. 51. P. 399-400.

102. JellinekD., Green L.S., Bell C., Janjic N. Inhibition of receptor binding by high-affinity RNA ligands to vascular endothelial growth factor // Biochemistry. 1994. V. 33. № 34. P. 10450-10456;

103. Gragoudas E.S., Adamis A.P., Cunningham E. T. Jr., FeinsodM., Guyer D.R. Pegaptanib for neovascular age-related macular degeneration // N. Engl. J. Med. 2004. V. 351. № 27. P. 2805-2816;

104. JellinekD., Lynott C.K, Rifldn D.B., Janjic N. High-affinity RNA ligands to basic fibroblast growth factor inhibit receptor binding // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993. V. 90. №23. P. 11227-11231;

105. Heldin C.H. Structural and functional studies on platelet-derived growth factor // EMBO J. 1992. V. 11. № 12. P. 4251-4259;

106. Lindner V., Reidy M.A. Platelet-derived growth factor ligand and receptor expression by large vessel endothelium in vivo // Am. J. Pathol. 1995. V. 146. № 6. P. 1488-1497;

107. Green L.S., JellinekD., JenisonR., OstmanA., Heldin C.H., Janjic N. Inhibitory DNA ligands to platelet-derived growth factor B-chain // Biochemistry. 1996. V. 35. № 45. P. 14413-14424;

108. РойтА., Бростофф Дж., Meiui Д., Иммунология, М, «Мир», 2000, с.210;

109. KubikM.F., Bell С., Fitzwater Т., Watson S.R., Tasset D.M. Isolation and characterization of 2'-fluoro-, 2'-amino-, and 2'-fluoro-/amino-modified RNAligands to human IFN-gamma that inhibit receptor binding.// J. Immunol. 1997. V. 159. № l.P. 259-267;

110. J eon S.H., Kayhan B., Ben-Yedidia T., Arnon R.A. DNA aptamer prevents influenza by blocking the receptor binding region of the viral hemagglutinin // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. № 46. P. 48410-48419;

111. Sullenger B.A., Gallardo H.F., Ungers G.E., GilboaE., Overexprcssion of TAR sequences renders cells resistant to human immunodeficiency virus replication// Cell. 1990. V. 63. № 3. P. 601-608;

112. Sullenger B.A., Gallardo H.F., Ungers G.E., GilboaE,. Analysis of trans-acting response decoy RNA-mediated inhibition of human immunodeficiency virus type 1 transactivation// J. Virol. 1991. V. 65. № 12. P. 6811-6816;

113. Matsugami A., Tamura Y, Kudo M., UesugiS., Yamamoto R, Kumar P., Katahira M. Structure of RNA aptamer for HIV Tat complexed with Tat-derived peptide // Nucleic Acids Symp Ser (Oxf). 2004. V. 48. P. 111-112;

114. BohjanenP.R, ColvinRA., Puttaraju M., Been M.D., Garcia-Blanco M.A. A small circular TAR RNA decoy specifically inhibits Tat-activated HIV-1 transcription //Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. № 19. P. 3733-3738;

115. Lee T.C., Sullenger B.A., Gallardo H.F., Ungers G.E., GilboaE. Overexpression of RRE-derived sequences inhibits HIV-1 replication in CEM cells // New Biol. 1992. V. 4. № 1. P. 66-74;

116. Tuerk C., MacDougal S., Gold L. RNA pseudoknots that inhibit human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. № 15. P. 6988-6992;

117. Jaeger J., Restle T., Steitz T.A. The structure of HIV-1 reverse transcriptase' complexed with an RNA pseudoknot inhibitor // EMBO J. 1998. V. 17. № 15. P. 4535-4542;

118. Martell R.E., Nevins J.R\ Sullenger B.A., Optimizing aptamer activity for gene therapy applications using expression cassette SELEX // Mol. Ther. 2002. V. 6. № l.P: 30-34;

119. Mann M.J., Gibbons G.H., Hutchinson H., Poston RS., Hoyt E.G., Robbins R.C., Dzau V.J. Pressure-mediated oligonucleotide transfection of rat and human cardiovascular tissues //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. № 11. P. 64116416;

120. Ishizaki J., Nevins J.R, Sullenger B.A. Inhibition of cell proliferation by an RNA ligand that selectively blocks E2F function // Nat. Med. 1996. V. 2. № 12. P. 1386-1389;

121. Verma I.M., Stevenson J.K, Schwarz E.M., Van Antwerp D., Miyamoto S. Rel/NF-kappaB/I kappa B family: intimate tales of association and dissociation // Genes Dev. 1995. V. 9. № 22. P. 2723-2735;

122. Lebruska L.L., Maher L.J. Selection and characterization of an RNA decoy for transcription factor NF-kappa B // Biochemistry. 1999. V. 38. № 10. P. 3168-3174;

123. Zhang B., Roth R.A. A region of the insulin receptor important for ligand binding (residues 450-601) is recognized by patients' autoimmune antibodies and inhibitory monoclonal antibodies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. № 21. P. 9858-9862;

124. Lee S. W., Sullenger B.A. Isolation of a nuclease-resistant decoy RNA that selectively blocks autoantibody binding to insulin receptors on human lymphocytes // J. Exp. Med. 1996. V. 184. № 2. P. 315-324;

125. Hwang B., Lee S. W, Improvement of RNA aptamer activity against myasthenic autoantibodies by extended sequence selection // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 290. № 2. P. 656-662;

126. Hwang B., Han K., Lee S. W. Prevention of passively experimental autoimmune myasthenia gravis by an in vitro selected RNA aptamer // FEBS Lett. 2003. V. 548. №1-3. P. 85-89.

127. Sutton B.J., Gould H.J. The human IgE network // Nature. 1993. V. 366. № 6454. P. 421-428;

128. Wiegand T. W., Williams P.B., Dreskin S.C., Jouvin M.H., Kinet J.P., Tasset D. High-affinity oligonucleotide ligands to human IgE inhibit binding to Fc epsilon receptor// J. Immunol. 1996. V. 157. № 1. P. 221-230;

129. Chambers C.A., Kuhns M.S., Egen J. G., Allison J.P. CTLA-4-mediated inhibition in regulation of T cell responses: mechanisms and manipulation in tumor immunotherapy // Annu. Rev. Immunol. 2001. V. 19. P. 565-594;

130. Santulli-Marotto S., Nair S.K, Rusconi C., Sullenger B., Gilboa E. Multivalent RNA aptamers that inhibit CTLA-4 and enhance tumor immunity // Cancer Res. 2003. V. 63. № 21. P. 7483-7489;

131. Bevilacqua M.P., Nelson RM., Endothelial-leukocyte adhesion molecules in inflammation and metastasis // Thromb Haemost. 1993. V. 70. № 1. P. 152-154;

132. Jenison R.D., Jennings S.D., Walker D. W., Bargatze RF., Parma D., Oligonucleotide inhibitors of P-selectin-dependent neutrophil-platelet adhesion // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1998. V. 8. № 4. P. 265-279;

133. O'Connell D., KoenigA., Jennings S., Iiicke B., Han H.L., Fitzwater T., Chang Y.F., VarkiN., Parma D., VarkiA. Calcium-dependent oligonucleotide antagonists specific for L-selectin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 12. P. 58835887;

134. Watson S.R, Chang Y.F., Anti L-selectin aptamers: binding characteristics, pharmacokinetic parameters and activity against an intravascular target in vivo // Antisence Nucleic drug Dev. 2000. V. 10. № 2. P. 63-75;

135. LupoidS.E., Hicke B.J. Identification and characterization ofnuclease-stabilized RNA molecules that bind human prostate cancer cells via prostate-specific membrane antigen// Cancer res. 2002. V. 62. № 14. P. 4029-4033;

136. Nimjee S.M., Rusconi C.P., Sullenger B.A. B kh. «The aptamer handbook», ed. S.Klussmann, Wiley-VCH Verlag, Wienheim, 2006, P. 156-157;

137. Biesecker G., Dihel L., Derivation of RNA aptamer inhibitors of human complement C5 // Immunopharmacology. 1999. V. 42. № 1-3. P. 219-230;

138. Rintala E.M., Nevalainen T.J. Group phospholipase A2 in sera of febrile patients with microbiologically or clinically documented infections // Clin. Infect.Dis. 1993. V. 17. № 5. P. 864-879;

139. Bridonneau P., Chang Y.F., High-affinity aptamers selectively inhibit human nonpancreatic secretory phospholipase A2 // J.Med.Chem. 1998. V. 41. № 6. P. 778-786;

140. Proske D., GilchS., Wopfner F., SchatzlH.M., Winnacker E.L., FamulokM., Prion-protein-specific aptamer reduces PrPSc formation // Chembiochem. 2002. V. 3. № 8. P. 717-725;

141. Фролов A.O. Класс Kinetoplastidea. В юн.: Руководство по зоологии. Протесты. Часть 1. СПб, Наука, 2000, 211-256;

142. Ulrich Н., Magdesian М.Н. In vitro selection of RNA aptamers that bind to cell adhesion receptors of Trypanosoma cruzi // J.Biol.Chem. 2002. V. 277. № 23. P. 20756-20762,

143. Wimberly В. Т., White S. W., Ramakrishnan V. The structure of ribosomal protein S7 at 1.9A resolution reveals a beta-hairpin motif that binds double-stranded nucleic acids // Structure. 1997. V. 5. № 9. P. 1187-1198;

144. WimberlyB.T., Brodersen, D.E., Clemons W.M., Jr., Morgan-Warren, R.J., Carter A.P., Vonrhein C., Hartsch Т., Ramakrishnan V. Structure of the 30S ribosomal subunit//Nature. 2000. V. 407. № 6802. P. 327-339;

145. Guex K, Peitch M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modeling// Electrophoresis. 1997. V. 18. № 15. P. 2714-2723;

146. Hosaka H. Ribosomal protein S7: a new RNA-binding motif with structural similarities to a DNA architectural factor // Structure. 1997. V. 5. № 9. P. 11991208;

147. Головин А.В. Исследование бинарных комплеков РНК и рибосомного белка S7 эубактерий. Кандидатская диссертация. 2002. Москва. С. 44-49;

148. Studier F. W., Moffatt В. A. Use of bacteriophage Т7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes // J. Mol. Biol. 1986. V. 189. № 1. P. 113-130;

149. Steen R, DahlbergA.E., Lade B.N., Studier F. W., Dunn J.J., T7 RNA polymerase directed expression of the Escherichia coli rrnB operon. // EMBO J. 1986. V. 5. № 5. P. 1099-1103;

150. Dragon F., Brakier-Gingras L., Interaction of Escherichia coli ribosomal protein S7 with 16SRrna//Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. № 5. P. 1199-1203;

151. RussellR., ZhuangX., BabcockH.P., Millettl.S., Doniach S., Chu S., Herschlag D. Exploring the folding landscape of a structured RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 1. P. 155-160;

152. Chen S.J., Dill К.A., RNA folding energy landscapes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 2. P. 646-651,

153. Saito K, Mattheakis L.C., Nomura M, Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Ribosomal protein S7 inhibits coupled translation of S7 but not its independent translation // J. Mol. Biol. 1994. V". 235. № 1. P. 111-124; ~

154. Saito K, Nomura M., Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Structural and mutational analysis of the target site for translational repressor S7 // J. Mol. Biol. 1994. V. 235. № 1. P. 125-139;

155. Dragon F., Pay ant C, Brakier-Gingras L Mutational and structural analysis of the RNA binding site for Escherichia coli ribosomal protein S7 // J. Mol. Biol. 1994. V. 244. № 1. P. 74-85;

156. Golovin A.V., Spiridonova V.A., Kraal В., Кору lov A.M. Mapping of contact of S12 — S7 intercistronic region of E. coli streptomycin mRNA with recombinant ribosomal protein S7 // FEBS Lett. 2006. V. 580. № 25. P. 5858-5862;

157. Сурдина A.B., Рассохин Т.И., Головин A.B., Спиридонова В.А, Копылов A.M. Картирование регуляторного участка связывания рибосомного белка S7 со стрептомициновой мРНК E.coli II Биохимия. 2010. Т. 75. № 7. С. 841-850;

158. Leontis N.B., Westhof Е. The 5S rRNA loop E: chemical probing and phylogenetic data versus crystal structure // RNA. 1998. V. 4. № 9. P. 1134-1153.

159. Tsiang, M., Gibbs C.S., Griffin L.C., Dunn K.E., Leung L.K. Selection of a suppressor mutation that restores affinity of an oligonucleotide inhibitor forthrombin using in vitro genetics // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 33. P. 1937019376;

160. Tsiang M, Jain A.K., Dunn K.E., Rojas M.E., Leung L.L., Gibbs C.S. Functional mapping of the surface residues of human thrombin // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. № 28. P. 16854-16863;

161. Schultze P., Macaya R.F., Feigon J. Three-dimensional solution structure of the thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG) // J.Mol.Biol. 1994. V. 235. № P. 1532-1547;

162. Wang К Y., McCurdy S., Shea R.G., Swaminathan S., Bolton P.H. A DNA4aptamer which binds to and inhibits thrombin exhibits a new structural motif for DNA // Biochemistry. 1993. V. 32. № 8. P. 1899-1904;

163. Padmanabhan K, Padmanabhan K.P., Ferrara J.D., Sadler J.E., Tulinsky A., The structure of alpha-thrombin inhibited by a 15-mer single-stranded DNA aptamer//J.Biol.Chem. 1993. V. 268. №. 24. P. 17651-17654;

164. Lipps H., Rhodes D. G-quadruplex structures: in vivo evidence and function // Trends in Cell Biol. 2009. V. 19. № 8. P. 414-422;

165. Wang К Y., Swaminathan S., Bolton P.H., Tertiary structure motif of Oxytricha telomere DNA// Biochemistry. 1994. V. 33. № 24. P. 7517-7527;

166. Спиридонова B.A., Рог E.B., Дугина Т.Н. Струкова С.М., Копылов A.M., Аптамерные ДНК ингибиторы тромбина нового типа // Биоорган. Химия. 2003. Т. 29. № 5. С. 495-498;

167. Сердюк И.Н., Заккаи Н., Заккаи Дж. В кн. Методы в молекулярной биофизике. Изд-во «Книжный дом Университет». 2009. Москва. Т.1. С. 260272:

168. Добровольский А.Б., Титаева Е.В., Хаспекова С.Г., Спиридонова В.А., Копылов A.M., Мазуров А.В. Ингибирование активности тромбина аптамерами ДНК// Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2009. Т. 148. № 1. С. 41-45;

169. Мазуров А.В., Хаспекова С.Г. Титаева Е.В., Спиридонова В А., Копылов A.M., Добровольский А.Б. Свойства нового ДНК аптамера — прямого ингибитора тромбина //Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2010. Т. 150. № 10. С. 394397;

170. Bairoch A., Apweiler R. The SWISS-PROT protein sequence data bank and its supplement TrEMBL // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. № 1. P. 49-54;

171. PeitchM.C. ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools for automated comparative protein modeling//Biochem. Soc.Trans. 1996. V. 24. № 1. P. 274279;

172. Laemmli V.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685;

173. Маниатис Т., Фрич Э., СэмбрукД. Молекулярное клонирование, ed. А.А. Баев. 1984, Москва: "Мир";

174. Непсо К. The QIAexpressionist: The High-Level Expression & Protein Purification SystemQIAGEN. 1992, Hamburg;

175. Спиридонова В.А., Лыгина А.С., Анохина M.M., Тупицын Н.Н., Получение функционально активного рекомбинантного интерлейкина-6 человека // Биохимия. 2007. Т. 72. № 4. С. 525-532;

176. Spiridonova V.A., Golovin А. V., Drygin Ju., Kopylov A.M., An extremely high conservation of RNA-protein interactions during prokariotic str operon regulation // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. V. 44. № 6. P. 1141-1146;

177. Будкер В.Г:, Гиршович А.С., Гринева II.И., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г. Специфическая химическая модификация рибосом около мРНК-связывающего центра// Доклады АН СССР. 1973. Т. 211. № 3. С. 725-728;

178. Ellington A.D., Yarns М. "RNA-Protein Interactions: A Practical Approach, ed. C.Smith , Oxford University Press. 1998. P. 285-302;

179. Решетников Р.В., Головин A.B., Копылов A.M. Сравнение моделей 15-звенного ДНК-аптамера к тромбину с помощью симуляции молекулярной динамики // Биохимия. 2010. V. 75. № 8. С. 1124-1132;

180. Reshetnikov R., GolovinA., Spiridonova V, Kopylov A., SponerJ. Structural dynamics of thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGGTTGG) quadruplex DNA studied by large-scale explicit solvent simulations // J Chem.Theory Comput. 2010. V. 6. P. 3003-3014;

Информация о работе

Спиридонова, Вера Алексеевна
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Структура аптамерных ДНК/РНК - как основа для создания лекарственных препаратов и регуляторных элементов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы