Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Иммунобиология вируса иммунодефицита человека

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиология вируса иммунодефицита человека"

На правах рукописи

Карамов Эдуард Владимирович

ИММУНОБИОЛОГИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Кольцове - 2003

Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, Москва.

Официальные оппоненты:

академик РАМН, д.м.н., профессор Ершов Феликс Иванович академик РАМН, д.м.н., профессор Козлов Владимир Александрович д.б.н., профессор Щелкунов Сергей Николаевич

Ведущая организация:

Институт иммунологии Минздрава РФ

Защита состоится « 4 » ноября 2003 года в 9.00 на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Минздрава РФ по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « » 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Э.Г.Малыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Актуальность проблемы.

ВИЧ-инфекция стала самым опасным и широко распространенным инфекционным заболеванием в XXI веке. Ежегодно более 5 млн. человек заражаются вирусом иммунодефицита человека - этиологическим агентом ВИЧ-инфекции и ее терминальной стадии СПИДа. Со времени регистрации первых случаев болезни более 67 млн. человек были инфицированы и более 25 млн. уже умерло. Глобальное распространение, принявшее характер мировой эпидемии -пандемии, высокая смертность, передача вируса через кровь, внутриутробно и половым путем, отсутствие вакцины, микробицидов и широко доступных высокоэффективных и нетоксичных лекарств сделали проблему ВИЧ/СПИД одной из центральных в мировом здравоохранении. Открытый в начале 80-х гг. ВИЧ оказался лентивирусом, относящимся к семейству ретровирусов, для которых характерна интеграция в геном хозяина, длительная латенция и хроническая инфекция, высокая антигенная и генетическая изменчивость.

К настоящему времени во всем мире изолировано более тысячи штаммов ВИЧ, изучены нуклеотидные последовательности нескольких тысяч вирусов. А для 100 вирусов прочитана полная последовательность нуклеотидов и созданы молекулярные кпоны. Установлено, что многие изоляты ВИЧ сильно различаются по своим биологическим свойствам; более того в разных регионах мира циркулируют различные субтипы и рекомбинанатные формы ВИЧ. Создание коллекции и исследование свойств изолятов ВИЧ необходимо для решения как фундаментальных, так и прикладных задач, в том числе для разработки вакцины против ВИЧ/СПИД.

Со времени обнаружения С04 рецептора, считалось, что именно Т-хелперы являются главной мишенью ВИЧ. Последующие исследования показали, что ВИЧ фактически является пантропным вирусом, способным использовать множество дополнительных корецепторов и клеточных механизмов для проникновения и поддержания инфекции. Исследование механизмов проникновения ВИЧ, клеточных механизмов модуляции ВИЧ-инфекции является важным звеном в понимании патогенеза ВИЧ/СПИД. Жизненный цикл ВИЧ весьма сложен и включает несколько стадий. Поиск специфических ингибиторов различных этапов репликации ВИЧ позволяет открывать новые препараты для лечения ВИЧ/СПИД. Именно таким образом были найдены нуклеозидные/нукпеотидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптаз! I

I

ВИЧ. Актуальной остается задача поиска новых средств терапии ВИЧ/СПИД, в том числе комбинированной химиотерапии. До сих пор не решена проблема по разработке новых превентивных технологий на основе иммунобиологических препаратов - микробицидов, предотвращающих половую передачу ВИЧ и вакцин.

Настоящая работа выполнена в рамках плановых исследований НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, Государственной программы "Борьба с наиболее распространенными заболеваниями" по проблеме СПИД и Межведомственной научно-технической программы " Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего", РФФИ, РФТР.

2. Цели и задачи исследования.

Целью исследования было изучение иммунобиологических свойств ВИЧ, в том числе штаммов ВИЧ, циркулирующих на территории страны и поиск новых противовирусных средств, блокирующих размножение ВИЧ, а также разработка иммунобиологических препаратов - анти-ВИЧ микробицидов и анти-ВИЧ вакцины.

В соответствии с целями были поставлены задачи:

• выделить изоляты ВИЧ и изучить иммунобиологические свойства изолятов ВИЧ от российских ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом;

• исследовать иммунобиологические свойства сывороток крови, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц (иммунореактивность нейтрализационные свойства, систему комплемента);

• провести сравнительный анализ антигенной и генетической вариабельности ВИЧ на территории России (бывшего СССР);

• исследовать механизмы проникновения ВИЧ (стадии адсорбции, рецепции, фузии);

• изучить механизмы модуляции ВИЧ-инфекции

• определить антивирусный эффект ингибиторов различных стадий жизненного цикла ВИЧ;

• разработать кандидатные анти-ВИЧ микробициды и анти-ВИЧ вакцину.

3. Научная новизна работы.

При выполнении работы получены новые данные, имеющие как теоретическое, так и практическое значение.

Проведено массовое выделение отечественных изолятов ВИЧ от российских пациентов и создана коллекция штаммов ВИЧ.

Охарактеризованы субтипы (генотипы/серотипы/иммунотипы) и биологические свойства (скорость репродукции, синцитеобразующая активность, тропизм, спектр корецепторов, чувствительность к АЗТ) ВИЧ-изолятов. Обнаружена гетерогенность в кинетике репликации и репродуктивной активности изолятов.

Показано, что на ранних стадиях острой ВИЧ-инфекции in vitro происходит увеличение дегидрогеназной активности клеток, причем r/h варианты ВИЧ индуцируют больший сдвиг, чем s/l - вирусы.

Впервые описан дефект системы комплемента у ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом.

Показано, что главной особенностью ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД в России (бывшем СССР) является множественные и независимые проникновения различных субтипов ВИЧ. Концентрированная стадия эпидемии в России характеризуется преобладающей циркуляцией вирусов субтипа А с высокой степенью генетической гомогенности.

Сделан вывод, что для локальных очагов эпидемии ВИЧ/СПИД данные серотипирования коррелируют с результатами генотипирования. Исследовано влияние физико-химических свойств трипептидов, фланкирующих центральный тетрапептид V3 др120 ВИЧ, на характер взаимодействия с ВИЧ позитивными сыворотками. Предложена модель функционирования V3 петли др120 ВИЧ-1.

Впервые показано, что пептиды из др41 специфически подавляют ВИЧ-инфекцию, а степень подавления зависит от аминокислотной последовательности и наличия свободного N-конца молекулы пептида, а также от природы, заряда и пространственной организации носителя.

Показано, что пептидный фрагмент из С-конца V1 домена CD4 обладает ВИЧ ингибирующей активностью, обусловленной специфическим (электростатическим) взаимодействием cV3gp120.

Установлена роль интегриновых рецепторов в проникновении ВИЧ. Обнаружено, что аллостерический ингибитор интегриновых рецепторов - аджоен, способен подавлять образование ВИЧ-индуцированных синцитиев и продукцию вирусных антигенов.

Впервые обнаружено, что тепловой шок приводит к усилению репликации ВИЧ, при этом ВИЧ не индуцирует de novo синтеза БТШ, но сопровождается усилением синтеза некоторых клеточных белков. Впервые показано, что тепловой шок приводит к амплификации провирусной ДНК.

Получены уникальные клоны СЕМ-K перевиваемой Т-клеточной линии СЕМ с гиперэкспрессией CD95 и пониженной экспрессией CD4, устойчивые к заражению ВИЧ. Вирусы трансфектанты не приобретают новый фенотип и остаются тропными к CD4+ клеткам.

Изучено ингибирующее действие отечественных 3'-(5R-тетразолил)тимидинов и 2',3'- дидезоксинуклеозидов, их 5'-фосфитов и 5'-фосфитов 3'-азидо-2',3'- дидезоксинуклеозидов на репродукцию ВИЧ. Выявлено, что применение суммы фосфитов всех четырех 3'-азидо-2',3'-дидезоксинуклеозидов приводит к снижению цитотоксического эффекта. Впервые обнаружена анти-ВИЧ активность транс-дигидроксипиперидинов; исследована анти-ВИЧ активность природных и полусинтетических соединений на основе хитозанов и гуминовых кислот.

Предложена оригинальная кандидатная анти-ВИЧ вакцина на основе конъюгата химерного белка ВИЧ-1гес (24-41) с полиоксидонием, индуцирующая у иммунизированных животных сильный иммунопролиферативный ответ и образование нейтрализационных антител.

4. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выделено и изучено 100 отечественных изолятов ВИЧ-1. Охарактеризованы субтипы (генотипы/серотипы/иммунотипы) и биологические свойства (скорость репродукции, синцитеобразующая активность, тропизм, спектр корецепторов, чувствительность к АЗТ). Обнаружена гетерогенность в кинетике репликации и репродуктивной активности вирусных изолятов.

Показано, что на ранних стадиях острой ВИЧ-инфекции in vitro происходит увеличение дегидрогеназной активности клеток, причем r/h варианты ВИЧ индуцируют больший сдвиг, чем s/l - вирусы.

2. Впервые описан дефект системы комплемента у ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом.

3. Главной особенностью ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД в России (бывшем СССР) является множественные и независимые проникновения различных субтипов ВИЧ. Концентрированная стадия эпидемии в России характеризуется преобладающей циркуляцией вирусов субтипа А с высокой степенью генетической гомогенности.

4. Для локальных очагов эпидемии ВИЧ/СПИД данные серотипирования коррелируют с результатами генотипирования. Исследовано влияние физико-химических свойств трипептидов, фланкирующих центральный тетрапептид V3

gp120 ВИЧ, на характер взаимодействия с ВИЧ-позитивными сыворотками. Предложена модель функционирования V3 петли др120 ВИЧ-1.

5. Впервые показано, что пептиды из др41 специфически подавляют ВИЧ-инфекцию, а степень подавления зависит от аминокислотной последовательности и наличия свободного N-конца молекулы пептида, а также от природы, заряда и пространственной организации носителя.

Показано, что пептидный фрагмент из С-конца V1 домена CD4 обладает ВИЧ ингибирующей активностью, обусловленной специфическим (электростатическим) взаимодействием с V3gp120.

6. Установлена роль интегриновых рецепторов в проникновении ВИЧ. Обнаружено, что аллостерический ингибитор интегриновых рецепторов -аджоен, способен подавлять образование ВИЧ-индуцированных синцитиев и продукцию вирусных антигенов.

7. Впервые обнаружено, что тепловой шок приводит к усилению репликации ВИЧ, при этом ВИЧ не индуцирует de novo синтез БТШ, но стимулирует синтез некоторых клеточных белков. Впервые показано, что тепловой шок приводит к амплификации провирусной ДНК.

8. Получены уникальные клоны СЕМ-К перевиваемой Т-клеточной линии СЕМ с гиперэкспрессией CD95 и пониженной экспрессией CD4, устойчивые к заражению ВИЧ. Вирусы - трансфектанты не приобретают новый фенотип и остаются тропными к CD4+ клеткам.

9. Изучено ингибирующее действие отечественных 3'-(5Р-тетразолил)тимидинов и 2',3'- дидезоксинуклеозидов, их 5-фосфитов и 5'-фосфитов 3'-азидо-2',3'-дидезоксинуклеозидов на репродукцию ВИЧ. Выявлено, что применение суммы фосфитов всех четырех 3'-азидо-2',3'- дидезоксинуклеозидов приводит к снижению цитотоксического эффекта. Впервые обнаружена анти-ВИЧ активность транс-дигидроксипиперидинов; исследована анти-ВИЧ активность природных и полусинтетических соединений на основе хитозанов и гуминовых кислот.

10. Предложена оригинальная кандидатная анти-ВИЧ вакцина на основе конъюгата химерного белка ВИЧ-1 гее (24-41) с полиоксидонием, индуцирующая у иммунизированных животных сильный иммунопролиферативный ответ и образование нейтрализационных антител.

5. Практическая ценность. Исследование относится к разряду научно-

практических работ. Полученные нами данные о серотипах и субтипах ВИЧ-1,

циркулирующих в России, Беларуси и на Украине, важны для разработки вакцины против ВИЧ. Исследованный нами 5'-фосфит 3'-азидо-2',3'- дидезоксинуклеозид используется в клинической практике. По материалам диссертационной работы получены авторские свидетельства и патенты.

6. Личный вклад соискателя.

Работа выполнена лично автором на базе группы иммунохимии НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, ГНЦ Институт иммунологии МЗ РФ и лаборатории вирусологии Института прикладных исследований Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова Вклад автора состоит в планировании, организации и проведении экспериментальных исследований, теоретическом обобщении полученных результатов и формулировании выводов. Отдельные разделы работы выполнены совместно с сотрудниками других научных учреждений, что отражено в списке публикаций.

Соискатель приносит благодарность своим сотрудникам и соавторам.

7. Апробация работы.

Основные экспериментальные материалы и положения диссертации докладывались на следующих конференция:

- 1-10 международная конференция СПИД/РАК и родственные проблемы, Ст.-Петербург, 1992-2002 гг.

- конференция "Фундаментальные и прикладные вопросы СПИД, вирусных гепатитов и гриппа", Суздаль, 1988 г.

- Ill International Conference on AIDS, Washington, 1987;

- IV International Conference on AIDS, Stockholm, 1988;

- V International Conference on AIDS, Montreal, 1989;

- VI International Conference on AIDS, San Francisco, 1990;

- VII International Conference on AIDS, Florence, 1991;

- VIII International Conference on AIDS, 1992, Amsterdam, The Netherlands, 1924 July;

- X-th International Conference on AIDS, 1994, Yokohama, 7-12 August;

- Xl-th International Conference on AIDS, 1996, Vancouver, July 7-12;

- XII World AIDS Conference, 1998, June 28 - July 3, Geneva, Switzerland;

- XIII International Conference on AIDS, Durban, 2000;

- XIV International Conference on AIDS, Barcelona, 2002;

- Int.conf. on med. Biotechnology, Immunization and AIDS. , Leningrad, USSR, 1991;

VII meet. "Act. probl. allerg. immun. AIDS.", Kaunas, 1992;

Joint meeting "Progress in clinical virology", 1995, Prague, Czech Republic

10-14 September;

1s1 International Conference of the Мог Kaposi Research Foundation "AIDS and Cancer Research", 1996, Budapest, Hungary;

2nd International Conference of the Мог Kaposi Research Foundation "AIDS

and Cancer Research", 1998, Budapest, Hungary;

X-th International Congress of Virology, 1996, Jerusalem, 11-16 August;

ECEAR 1997, Stockholm;

EC EAR 2000, Madrid;

2-я Международная конференция по вирусным гепатитам и ВИЧ-инфекции, Минск, Беларусь, Май 13-14, 1999;

7th Conf. on Retroviruses and Opportunistic Infections, 2000, • January 30-February 2, San Francisco;

9th Conf. on Retroviruses and Opportunistic Infections, 24-28 Feb., 2002, Seattle, USA;

Int. Meeting of the Inst, of Human Virology, 2001, Sept. 9-13, Baltimore, Maryland;

AIDS vaccine 2001, Sept. 5-8, 2001, Philadelphia, USA;

Vaccines and Immunization 5th Int. Forum on global vaccinolgy, Minsk, Belarus,

15-16 Oct. 2001;

Vaccines and Immunization 6th Int. Forum on global vaccinolgy, Minsk, Belarus, 2002;

1st Int. conference "High medical technologies in XXI century", November 2-9, 2002, Spain, Benidorm.

Конференция «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва,

17-20 марта 2002г.;

Конференция РААКИ, Москва, 2001;

Конференция РААКИ, Москва, 2002.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Биологические свойства изолятов вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1).

Получена коллекция природных вариантов ВИЧ, изолированных от ВИЧ-инфицированных пациентов, в том числе проходивших курс АЗТ-терапии. Использовалась стандартная методика выделения МПК из гепаринизированной крови пациентов в градиенте фикола с последующей сокультивацией их с ФГА-стимулированными МПК здорового донора.

1.1 Изучение биологического фенотипа изолятов ВИЧ-1.

Изучена репликативная активность, цитопатогенность, способность к синцитиеобразованию полученных вариантов ВИЧ-1 в различных Т-клеточных системах.

Среди использованных Т-лимфобластоидных линий наиболее чувствительными оказались МТ-4, СЕМ, Jurkat-tat и CEM-SS. Однако репликация вирусов в каждой линии имела свои характерные особенности.

Сопоставляя кинетику репликации каждого вирусного варианта в различных Т-клеточных линиях, максимальное значение р24, определяемое методом ИФА, мы определили фенотип каждого изолированного вируса.

1.2 Изучение чувствительности изолятов ВИЧ-1 к азидотимидину.

Изучена чувствительность изолированных штаммов ВИЧ-1 к азидотимидину

(АЗТ). Клетки CEM-SS и Jurkat-tat заражали в присутствии различных концентраций АЗТ (0,01; 0,1; 1,0; 10,0; 100,0; мкМ) и после 4-х суток культивирования определяли продукцию вирусных антигенов в ИФА. Методом логарифмической интерполяции рассчитывали Ю5о для каждого изолята.

Из 30 изолятов ВИЧ-1 22 проявляли устойчивость к АЗТ в культуре клеток. Причем 3 АЗТ-устойчивых изолята были изолированы от пациентов, никогда не получавших азидотимидин. Для пациента PSST характерно то, что оба вирусных варианта, изолированных от него в разные периоды проявляют высокую устойчивость к АЗТ (Ю5о составляет 10 мкМ в одном случае и более 20 мкМ в другом). Для пациента PKVR отмечается появление АЗТ-устойчивого изолята в отсутствии АЗТ-терапии на более отдаленных сроках инфекции, тогда как первый изолят, полученный от него проявлял АЗТ-чувствительность.

Изоляты СВ1-22, СВ2-216, GR1-56, GR2-59 характеризуются SI - rapid/high -фенотипом, причем три из них проявляют высокую устойчивость к АЗТ. Пациенты СВ1 и СВ2 получали АЗТ-терапию в течение 2-х лет, пациент GR2 - 1

год, пациент GR1 - 6 месяцев. Определение фенотипа доминирующего вирусного варианта пациента играет существенную роль, как в прогностических целях, так и в целях своевременной Коррекции лечебной стратегии.

1.3. Изучение биологических особенностей in vitro первичных изолятов ВИЧ-1 субтипа А.

Нами получены штаммы ВИЧ-1 (обозначаемые далее как L2-1, L2-2.....L2-

15) от ВИЧ-1-инфицированных пациентов из Светлогорска. Большинство спектров иммунореактивности сывороток крови относятся к серотипу А/С, каноническому для светлогорского очага в начале эпидемии (к так называемому подсеротипу (А/С)с). Генетические исследования подтвердили результаты серологических исследований.

Все пробы от ВИЧ-инфицированных пациентов из Светлогорского очага эпидемии были отнесены к генотипу А.

Первичные изоляты ВИЧ-1 от пациентов из когорты L2 были выделены по стандартной методике. Удалось выделить семь первичных изолятов ВИЧ-1 (L2-6, L2-10, L2-12, L2-14, L2-15). Динамика накопления вирусных антигенов в супернатанте смешанных культур МПК представлена на рис. 1. Концентрация р24 ВИЧ-1 в точке максимальной продукции вирусных антигенов представлена в таблице 1.

Таблица 1. Максимальные концентрации р24 в супернатанте смешанных культур МПК для некоторых изолятов серии L2.

Изолят L2-4 L2-5 L2-6 L2-10 L2-12 L2-14 L2-15

[р24], нг/мл 0,09 0,03 0,32 0,07 0,05 0,06 0,12

Для характеристики клеточного тропизма изолятов, мы исследовали их способность репродуцироваться в клеточных линиях и373/С04/ССЯ5 и 11373/С04/СХСВ4, трансформированных для экспрессии корецептора ССИ5 для М-тропных и СХСЯ4- для Т-тропных вариантов ВИЧ-1.

Динамика накопления вирусных антигенов в указанных клеточных линиях представлена на рисунках 2а, 26. В качестве контроля использовали референс-штамм ВИЧ-1шв и ВИЧ-1Д2|6- Все изоляты серии 1.2 проявляли смешанный тропизм.

Мы предприняли попытку закрепить изоляты серии 1.2 в трех лимфобластоидных клеточных линиях: МТ-2, МТ-4, СЕМ ЫК". Наиболее высокий уровень репродукции первичных изолятов серии 1.2 наблюдается в линии МТ-2,

причем изолят 12-6 с высоким уровнем репродукции в МПК (см. табл. 1),

...........1.2-4; ...........1.2-5;-----12-6; - 12-14]

-----12-10;---Ь2-12;---1.2-15;

Рисунок 1. Динамика накопления вирусных антигенов, определяемая с помощью поликлонального ИФА, в супернатанте смешанной культуры МПК инфицированногоВИЧ-1 пациента и МПК здорового донора.

-L2-6;............ L2-10;............. L2-12;----L2-14;

----L2-15;---HIB;-----А216;

Рисунок 2а. Динамика накопления вирусных антигенов в супернатанте U373/CD4/CCR5, инфицированного некоторыми первичными изолятами ВИЧ1 из панели L2. В качестве контролей использовался референс-штамм ВИЧ-1/ HIB и ВИЧ-1/ А216. По оси абсцисс отложены сутки после инокуляции; по оси ординат - оптический сигнал (492 нм) в поликлональном ИФА.

----L2-6; ..............L2-10;-----L2-12;-----L2-14;

-L2-15;............ HIB;--A216;

Рисунок 26. Динамика накопления вирусных антигенов в супернатанте U373/CD4/CXCR4, инфицированного некоторыми первичными изолятами ВИЧ1 из панели L2. В качестве контролей использовался референс-штамм ВИЧ-1 /IIIB и ВИЧ-1 /А216. По оси абсцисс отложены сутки после инокуляции; по оси ординат - оптический сигнал (492 нм) в поликлональном ИФА.

размножался только в МТ-2. Отличительной особенностью является то, что все выделенные изоляты являются s/l, не образуют синцитии и не вызывают цитодеструкции.

Учитывая обнаруженную нами чрезвычайно высокую генетическую и серотипическую гомогенность вариантов ВИЧ из Светлогорского очага, изоляты серии L2 было бы правильно охарактеризовать как R5/X4. Указанная серо- и генотипическая гомогенность коррелирует с обнаруженной нами фенотипической гомогенностью изолятов ВИЧ-1 из группы L2. Эти данные наряду с результатами эпидемиологических расследований позволяют предполагать наличие единого источника заражения в Светлогорске.

1.4. Биологические свойства первичных изолятов ВИЧ-1 на различных стадиях инфекции.

Мы выделили 29 первичных изолятов от ВИЧ-инфицированных пациентов, наблюдаемых в Клинической инфекционной больнице N 2 г. Москвы. Всего было исследовано 34 образца крови, и таким образом, эффективность изоляции

2.5

3. 2.0

"Елюмры»'

Троьюжуакнте "

'ЙМпв^м'

1.5

1.0

0.5

0.0

Р2-Н8

Л Р«-5ирТ1 5 Р6-МГ4 ' Р4-ТНР1

фРо-сад я ре-саиб ®Рв-РВМС Р6-Н9 РЗ-СШ $8 Рб-свд •

• 1» Р4-С&Г Р5-ТНР1 • Р2-гирТ1 •

Р6-ТНР1 Р2-МТ4

Р4-СВЛ *Р5 МГ4 Р1&1РТ1 • РЗ-ЭирП • РЗ.СВМ ■ Р1-ТНР1 1) Р4-ЗирТ1 • РЗ-ТНР1 Я Р5-СВ4 ® Р4-Н9 • РШ"0 Р4-РВМС

Р5-РВМС *Р5-Нв рз-ремс • РЗ-Ми • ® Р4-МГ4

Р1-СШ Р1-Рвмс " - Р1МТ4 . Р1-Н» Р5-$ирТГ Р2-СВ4 Р2-СВ«т • рг-тнр1 •

<4 4 8 12 16 20 24 >28

Время достижения максимальной продукции антигенов ВИЧ (сутки после инокуляции)

Рис. 3 . Взаимосвязь между временем достижения максимальной продукции вирусных антигенов и величиной этого максимума, определяемого с помощью поликлонального ИФА. Бело-черными точками обозначено синцитиеобразование с выраженными "баллонами'У'цистернами". В целях экономии места на диаграмме, использованы следующие сокращения: Р1 -это 1МКЫ; Р2 - ШКМ; РЗ - ШЭК; Р4 - НЖС; Р5 - 1КМН; Р6 - 1У5Т

составила 85 %. Образцы крови, соответствующие изолятам ITRV-1 и ITRV-2, были получены от одного и того же пациента с интервалом в 3 месяца.

Шесть изолятов этой коллекции (INKN, IHKN, IHSK, IKRC, IKMH, IVST) от пациентов, находящихся на различных стадиях ВИЧ-инфекции (2А, 2Б, ЗА и ЗБ по классификации Покровского) исследованы на широкой панели культур клеток различного происхождения - лимфобластоидных (Н9, МТ-4, СЕМ, CEM-SS, » SupT1), моноцитарных (ТНР1) и бласт-стимулированных МПК здорового донора.

Культивирование проводили в течение 24 сут; мониторинг содержания вирусных антигенов осуществляли каждые 4 дня. * Очевидно, что наряду с классическими r/h вариантами, попавшими в левый

верхний угол графика и классическими s/l изолятами ВИЧ, разместившимся в нижнем правом углу, четко идентифицируются "неканонические" вирусы: "быстрые", но с невысоким и не увеличивающимся со временем уровнем репродукции. Кроме того, четко обнаруживается группа изолятов с промежуточными свойствами (рисунок 3).

Полученные данные показывают относительность существующих классификаций ВИЧ, природное многообразие свойств которого не просто рационально классифицировать.

1.5. Дегидрогеназная активность инфицированных клеток и биологические свойства различных вариантов ВИЧ-1.

Исследована динамика дегидрогеназной активности ряда перевиваемых клеточных линий в ответ на острую инфекцию in vitro вариантами ВИЧ-1 с различными биологическими свойствами. Для определения дегидрогеназной активности мы использовали МТТ-метод.

Выявлены следующие закономерности:

1. На ранней стадии острой ВИЧ-инфекции in vitro (1-3-и сутки после заражения) в инфицированных клетках происходит сдвиг дегидрогеназной активности в сторону ее увеличения, причем указанный сдвиг больше по абсолютной величине и продолжительности для r/h- (Zmb, Shm-I, RF), и меньше - для s/l-вариантов (Z1, Z2) ВИЧ-1.

2. Через некоторое время дегидрогеназная активность ВИЧ-инфицированных клеток снижается до уровня неинфицированного контроля (3-6-е сутки, в зависимости от вирус-клеточной системы).

3. Затем (5-7-е сутки) происходит снижение уровня дегидрогеназной активности ВИЧ-инфицированных клеток по сравнению с неинфицированным контролем.

4. Интенсивность указанных выше изменений монотонно (но не прямо пропорционально) возрастает с увеличением заражающей дозы.

Сделанные выводы относятся к опухолевым клеточным линиям, энзимологический спектр которых отличается от нормальных клеток. Поскольку динамика ВИЧ-индуцированного сдвига дегидрогеназной активности существенно зависит от биологических свойств, как вирусного варианта, так и клеток-мишеней, то описанный подход может оказаться полезным для доклинического изучения i

in vitro анти-ВИЧ эффективности химиопрепаратов.

1.6. Состояние отдельных компонентов комплемента у больных с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД).

Изучен ряд сывороток лиц с диагнозом СПИД. Для иммуноблот-анализа использовали кроличьи антисыворотки, специфичные к следующим компонентам и фрагментам: С1; С4, СЗс, СЗ, С5, а также мышиные моноклональные антитела, специфичные к СЗ и СЗа (МАТ 10).

Первоначально было исследовано 56 сывороток с МАТ 10. Полученные при этом данные свидетельствовали о том, что у больных СПИД происходит интенсивная активация ранних компонентов классического пути. Нормальный по сравнению с контролем уровень С5 позволяет предполагать, что альтернативный путь комплемента у больных СПИД не активирован или активирован слабо.

Как видно из рис. 4 (дорожка К), в ОСЗД с помощью 125I-MAT G-10 выявляется интенсивная полоса, соответствующая СЗ, и слабая, характеризующаяся Mr 140000. Анализ иммуноблотов сывороток больных СПИД показал, что лишь в одном случае (рис. 4, дорожка 2) наблюдается остаточное содержание СЗ (не более 10% от контроля), в то время как в остальных 26 данный белок практически отсутствует. В большинстве исследованных образцов обработка антителами MAT G-10 позволяет открыть большой фрагмент с Mr 140000 и два малых в зоне локализации СЗа. Один из этих двух соответствует СЗа (Mr 9200), другой, ранее не описанный, характеризуется меньшей молекулярной массой (Mr 8300). В отдельных сыворотках присутствует единственный из этих низкомолекулярных фрагментов (рис. 4. дорожки 12, 13, 2327). В сыворотках пяти больных ни СЗ, ни его СЗа- содержащие фрагменты не обнаруживаются (рис. 4, дорожки 4, 5, 8, 9, 19), однако присутствуют другие фрагменты, выявляемые с помощью анти-СЗс и анти-СЗс1- сывороток.

187 кД

140 «д

"ДО* 1

' ч, ¿ЬяСШ.я.4-* 4> -с, » . -- -. ' "

¿'»г' 'г ■

- „

- - X I

9.2 кД—

8.3 кД —Т., V Г"* .

Г1ЖМ-;

к 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27

Рисунок 4 а. Радиоавтограф иммуноблоттинга, полученный.с использованием 1251-МАТ 0-10. К-контроль (1,5 мкп ОСЗД); 1-27 сыворотки пациентов (1,5 мкл) со СПИД и СПК.

187кД'-г\

а

К 4 5 а 9 13 24 25 2616 17

187 КД Д

130 КД

1.

17 кД

6,5 кД

^, " /»'ЗЕК*'- : ~ - ,« - - <

к 4 5 8 9 13 24 25 2616 17

Рисунок 4 б. Радиоавтограф иммуноблоттинга, полученный с использованием АНТИ-СЗс- и анти С3-с1- сывороток (а и б соответственно). К-контроль (1,5 мкл ОСЗД); 4,5,8,9,13,24,25,26,16,17 - сыворотки пациентов (1,5 мкл) со СПИД и СПК (выборочно).

Данные об отсутствии цельной молекулы СЗ и о ее фрагментации подтверждаются анализом иммуноблотов выборочных сывороток больных СПИД, проявляемых с помощью анти-СЗс, анти-СЗс) и 1251-меченых вторых антител (рис. 4). В этих случаях наблюдается появление большого числа фрагментов, часть из которых ранее идентифицирована не была.

Мы исследовали расщепление а-цепи человеческого СЗ с помощью рекомбинантной протеазы ВИЧ-1 (RPH) и наблюдали образование СЗа и C3d фрагментов. Мы исследовали взаимодействие RPH и СЗ. В тесте IB с mAbs были обнаружены СЗа и C3d содержащие фрагменты в сыворотках ВИЧ-1 инфицированных пациентов. Исходя из полученных нами результатов можно сделать вывод о том, что RPH расщепляет молекулу а-цепи человеческого СЗ на несколько фрагментов. Таким образом, нельзя исключить, что вирусспецифическая протеаза способна гидролизовать комплемент с образованием иммуносупрессорных компонентов.

Глава 2. Антигенная и генетическая вариабельность ВИЧ-1.

2.1 УЗ-серотипы ВИЧ-1, представленные на территории России.

Мы изучили репрезентативность различных УЗ-антигенных вариантов ВИЧ-1 на территории России до 1995 года. Определена реактивность в ИФА V3-пептидов, имитирующих фрагменты \/3-области др120 изолятов ВИЧ-1 из США/Западной Европы и Африки, с сыворотками крови (CK) ВИЧ+ российских пациентов, инфицированных разным путем.

Показано, что \/3-лептидное тестирование позволяет уточнить тип вируса и пути его заноса, а также обнаружена существенная корреляция между способом инфицирования и преобладающим \/3-серотипом. Характеристики пептидной панели представлены на рисунке 5 и в таблице 2.

Для определения генетических характеристик вариантов ВИЧ-1, циркулировавших в России, Беларуси и Литве до начала современной эпидемии среди ВВН, образцы сывороток были получены от 20 инфицированных ВИЧ-1 лиц, представляющих основные группы риска: зараженных при гомосексуальных контактах ГБМ (п=7), лиц, инфицированным гетеросексуальным путем (п=6) и парентерально в результате медицинских манипуляций (п=3).

Таблица 2 Аминокислотные последовательности использованных пептидов*.

N Консенсус R311 К s I R 1 G3" Р G Q320 А F Y т т G3»

1 р108 - - - - Н - - R - - - - - -

2 р109 - - - - N - - R - - - - - -

3 р110 - - - - Р - - R - - - - - -

4 р112 S R G - R - 1 L А - Е

5 р115 - - R - т м - - - R V Y - - - -

6 р168 - - - V н - - - - - А - -

7 р169 - Е - V - - - т - - А - -

8 р170 - Q - т - - - - L - - N К

9 pVI

10 pVII - - - N F - - - - 1 - - -

11 pXII - S L - -

12 р1837 С - - - н - - R - - - - - -

13 р1838 С Т - - т - V - - R - -

14 р1839 с - G - - - - - R - V - А А Е

■ Нумерация аминокислотных остатков соответствует штамму ВИЧ-1 MN-

• Фланкирующие цистеины образуют дисульфидную связь.

Рисунок 5. Иерархические отношения между аминокислотными последовательностями использованных пептидов и соответствующими фрагментами консенсусов некоторых таксонов ВИЧ-1 (обозначены заглавными буквами)

Установленное значение нуклеотидной дистанции в \/3 др120 составляло 19%. Нуклеотидные последовательности, полученные из крови пациентов, инфицированных при гомосексуальных контактах были менее гетерогенны (нуклеотидная дистанция ~ 8%; дивергенция 2-12%), что характерно для вирусов этого субтипа. Нуклеотидные дистанции для вирусов, полученных из крови гетеросексуалов и для вирусов из крови парентерально зараженных пациентов,

составили ~ 13% (5-17%), и 25% (22-29%) соответственно.

Филогенетический анализ генетических последовательностей области \/3 гена ет, в сравнении с консенсусными последовательностями генетических субтипов ВИЧ-1, показал, что циркулировавшие в то время варианты ВИЧ-1 представляли субтипы А, В, С и С.

При этом наблюдалось различие в распределении субтипов между различными группами риска, но не в связи с географическим происхождением пациентов. Так, варианты ВИЧ-1, полученные от всех ГБМ как из Москвы, так и из Вильнюса, относились к субтипу В, в то время как варианты ВИЧ-1, полученные от всех инфицированных гетеросексуальным путем пациентов из Москвы и Минска, относились к субтипу С.

Пациент, инфицированный при проведении медицинских манипуляций на Юге России (так называемый элистинский случай), был инфицирован вирусов субтипа в, в то время как два других парентерально инфицированных пациента, не связанных эпидемиологически с элистинским случаем, были инфицированы вариантами ВИЧ-1 субтипов А и С.

Таким образом, мы обнаружили, что вплоть до 1995 года ВИЧ-инфекция на территории бывшего .СССР формировалась посредством множественных независимых заносов, что подтверждается высокой субтипической гетерогенностью вариантов ВИЧ-1, циркулировавших на территории России, Белоруссии и Прибалтики.

2.2 Изучение влияния аминокислотных замен в последовательности \/3-петли др120 на кросс-реактивность между различными субтипами ВИЧ-1.

Пептиды серии Р, использованные в данной работе, синтезированы Ю.Семилетовым и Г. Наврузбековым [Семилетов Ю.А., Ржанинова А.А., Гараев М.М., 1994\ на основе расчетов, сделанных М.Гараевым и Г.Наврузбековым по нуклеотидным последовательностям, определенным А.Бобковым и М.Гараевым [ВоЬкоуА., е/ а/., 1994].

Мы исследовали кросс-реактивность в ИФА сывороток российских пациентов, инфицированных различными субтипами ВИЧ-1 (А, В, С, О и в), с эпитопами \/3-петли субтипа в, изучили влияние точечных замен в пределах этого эпитопа на антигенные свойства различных субтипов ВИЧ-1.

Определение серотипа сывороток от Российских ВИЧ-1-инфицированных на панели УЗ-имитирующих пептидов идентично генетическому типированию для

субтипа В, однако в одной серологической группе оказываются сыворотки с генотипами С/А, A, D и G (далее обозначаемой как A+D+G). Мы использовали 61 сыворотку серотипа В, 15 - С, 38 - A+D+G.

Наши данные (см. таблицу 3) обнаруживают высокую кросс-реактивность с консенсусным пептидом Р1 для сывороток серотипа В (35,5 % реагирующих в ИФА сывороток), С (80,0 %), A+D+G (80,9 %) и N (41,0 %). В отличие от пептида Р1, одинаково высокой реакционной способностью с сыворотками различных серотипов (73,3-85,0 %) обладал пептид РЗ, представляющий собой гибрид -справа и слева от центрального GPGQ-мотива аминокислотные последовательности из пяти аминокислотных остатков аналогичны консенсусным субпоследовательностям субтипов В и С соответственно. Количество сывороток, реагирующих с Р2, у которого относительно Р1 и РЗ имеются замены по бокам от центрального мотива, оставалось очень высоким (60 %) только для субтипа С (табл. 3). При переходе же от РЗ к Р2 процент реагирующих сывороток наиболее сильно уменьшается для субтипа В.

Таким образом, сыворотки российских пациентов, принадлежащие различным серотипам ВИЧ-1 (В, С, A+D+G), обладают существенной кросс-реактивностью с \/3-имитирующими пептидами из субтипа G. Наиболее высока кросс-реактивность с пептидами, соответствующими всем трем вариантам V3-последовательностей субтипа G, для сывороток субтипа С (60-80 % реагирующих сывороток). Из трех пептидов наивысшей и одинаково высокой кросс-реактивностью со всеми сыворотками (порядка 80 %, независимо от серотипа) обладал пептид РЗ, имеющий химерную последовательность.

Замена Q на R в центральной GPGQ- последовательности (пептид Р4) приводила к резкому (примерно в 10 раз) уменьшению количества взаимодействующих сывороток серотипа С. Для сывороток других серотипов аналогичные изменения менее выражены. Для серотипа В количество сывороток, взаимодействующих с Р4, увеличивается примерно в 2 раза и составляет 62,3 %. Это согласуется с полученными нами ранее данными, согласно которым российские сыворотки субтипа В имеют серотип, характерный для США и Западной Европы (GPGR-мотив обнаруживается у европейских и североамериканских вариантов В-субтипа в 63 % случаев [Myers G., KorberB. etal.1995\). В отличие от серотипа В, для A+D+G-серотипа с Р4 взаимодействует примерно в 2 раза меньшее число сывороток, чем с пептидом Р1. В то же время, аминокислотные замены справа и слева от GPGQ-мотива оказывают менее

заметное воздействие на количество взаимодействующих сывороток для С- и A+D+G-серотипов, нежели для В.

Наряду с GPGQ, среди вариантов субтипа G также обнаруживается последовательность APGQ [Bobkov A., et al., 1994], GLGQ - часто обнаруживается в субтипе D из Уганды [Myers G., Korber В. et al., 1995], GPGK - в угандийских субтипах В и А. Эти замены в центральном мотиве влияют на структуру р-изгиба на вершине \/3-петли [Ghiara J.В., et al., 1994]. Пептиды Р9-Р11 имеют аминокислотные замены именно в центральном тетрамере \/3-петли. Для субтипа С замена Q в 4-ом положении центрального мотива на К или R значительно понижает антигенную активность эпитопа, нежели замены в 1-ом и 2-ом положениях. Для субтипа В, напротив, менее важно, какой аминокислотный остаток расположен в конце центрального мотива - Q, К или R. Однако, замена G на А в 1-ом положении сильно влияет на антигенную активность эпитопа; замена Р на L во 2-ом положении оказывает также достаточно сильное, но менее выраженное воздействие.

Таблица 3. Процент сывороток различных серотипов, реактивных в

ИФА с синтетическими пептидами Р1-Р11.

Серотип Пептид

ВИЧ-1 Р1 Р2 РЗ Р4 Р5 Р6 Р7 Р8 Р9 Р10 Р11

К К

I S S

1 S N R - Р - - - - - -

L F 1 - - - - - - - -

G - - - - - - - - - А

Р - - - - - - - - L -

G - - - - - - - - - -

Q - - R - - - - К - -

А - - - - V - - - - -

F 1 - - - - I - - - -

Y - - - - - - R - - -

Т т

Т т

В 35,5 8,6 75,9 62,3 31,1 16,4 16,4 6,6 41,0 14,8 4,9

С 80,0 60,0 80,0 9,1 63,6 72,7 36,4 36,4 18,2 27,3 36,4

A+D+G 80,9 30,0 85,0 50,0 81,6 76,3 52,6 63,2 29,3 19,5 36,6

N 41,0 20,0 73,3 17,6 50,0 35,3 8,8 26,5 9,0 3,0 0,0

В таблице 4 приведены частоты встречаемости аминокислотных последовательностей центрального тетрамера для субтипов А, В, С, О и в ВИЧ-1, суммированные по известным аминокислотным последовательностям УЗ-петли др120 ВИЧ-1 из России, Белоруссии и Литвы {Bobkov А., е? а/., 1994, Emeljanov А.,

et. al. 1996]. Здесь же указаны цифры по встречаемости соответствующих центральных тетрамеров в мире к 1995 г. по данным [Myers G., Korber В. et al., 1995], куда не успела войти большая часть последовательностей ВИЧ-1 с территории бывшего СССР.

Наибольшее разнообразие центрального тетрамера \/3-петли характерно для субтипа Вив России, и в мире (табл. 4). Большое количество вариантов г центрального тетрамера имеет место в России для субтипа G. Среди

центральных последовательностей субтипа В - GPGR (60 % в России), GPGK (24 %) и GPGQ (3 % в мире) - в России обнаруживаются редкая (APGS) и * уникальная (APGG) последовательности. Специфичные антигенные свойства V3-

петли показаны для сывороток субтипа В из Бразилии [Couto-Fernandez J.С., et.al., 1994\, связанные с особенностями аминокислотной последовательности. В отличие от Северо-Американских и Западно-Европейских вариантов субтипа В, в основном содержащих GPGR-тетрамер, в 50 % Бразильских вариантов субтипа В пролин (Р) во втором положении центрального мотива замещен на триптофан (W), метионин (М) или фенилаланин (F).

Для определения генетических характеристик вариантов ВИЧ-1, вызвавших вспышку инфекции в Светлогорске, и их возможной генетической связи с вариантами ВИЧ-1 из других очагов эпидемии, в 1996-1997 гг. были получены образцы сывороток от более чем 100 инфицированных ВВН, жителей Светлогорска. Из них, образцы от 20 ВВН были случайным образом отобраны для исследований. Генетические последовательности области V3 гена env и участка р17/р24 гена gag были получены от соответственно 20 и 12 ВВН из Светлогорска и сравнены с ранее полученными последовательностями из других очагов эпидемии.

Таблица 4. Встречаемость различных вариантов верхушечных тетрамеров \/3-петли среди субтипов ВИЧ-1, распространенных на территории России, Белоруссии и Литвы_

Верхушечн ый Регион

Литва Белоруссия Россия Бывший СССР Во всем мире'

тетрамер А В с О в А В с о б А в с О О А в с О б А В С Б о

вРОО СРвЯ АРвО ССДО СРЭН вРвК вР!^ СРСв GWGR АРвБ АРвв вРКК КОЯО 3 1 1 6 10 3 1 1 1 7 5 2 1 15 6 2 1 1 4 1 88 6 9 1 1 1 5 1 7 28 10 1 3 1 1 1 1 11 5 2 1 88 6 9 1 1 1 5 1 119 9 1 2 15 369 1 42 1 11 28 1 57 21 16 9 1 19 7

Общее число

известных последовательност ей данного субтипа 5 6 16 7 7 1 25 4 1 ш 7 46 11 8 111 138 519 57 88 11

* Приведены данные только о тех вариантах верхушечных тетрамеров \/3-петли, которые встречаются на территории России, Белоруссии и Литвы.

о ото

со >

» <

-J-J i :

• i

Т

и

TJ

«

< < < <

s I I

■ * «

I

S Э

s S

i I

if

u ra С VD O

К &

o

X

_a Ц

p

ra ш o

Щ <D

s I g °

II

-O <D X m ?ü

Ш

_ 3"

>. o. 4 s

Ä с ® &

2 tx i §

I|

o s

X DQ

Ш S ü o

(D T

s

Im

ш

О)

ra

en

0

1 -

Ю <

bí > о с

X О) & ?

ш

Анализ генетических последовательностей продемонстрировал чрезвычайно высокую гомогенность популяции ВИЧ-1, вызвавшей вспышку эпидемии в Светлогорске. Нуклеотидные последовательности области V3 вариантов ВИЧ-1, полученных от 12 из 20 пациентов, были идентичными, а оставшиеся 8 последовательностей имели от 1 до 7 нуклеотидных замен. В целом, 20 последовательностей имели всего 18 нуклеотидных замен по сравнению с построенной нами консенсусной последовательностью Светлогорского очага эпидемии, что соответствует средней нуклеотидной р-дистанции в 0,0033 (от 0 до 0,0260). При этом 8 последовательностей вирусов, полученных в 1996 - начале 1997 гг., были еще более гомогенными и имели всего 2 нуклеотидные замены по сравнению с консенсусом. Шесть из них (75%) были идентичны консенсусу. Последовательности 12 вирусов, полученных в ноябре 1997 г., статистически достоверно имели больше отличий от консенсуса (16 нуклеотидных замен, Т-тест, р<0,001), и только б из них (50%) были идентичны консенсусу. Высокая гомогенность популяции ВИЧ-1 из Светлогорска наблюдалась также и в области р17/р24. Филогенетические отношения между нуклеотидными последовательностями области V3 гена env (А) и gag (В) вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в г. Светлогорске представлены на рисунке 6.

2.3. Биологические свойства российских изолятов ВИЧ-1 и молекулярно-эпидемиологический мониторинг ВИЧ-инфекции на территории России и сопредельных стран.

Нами и другими авторскими коллективами было показано, что эпидемия ВИЧ возникла и развилась на территории бывшего СССР за счет множественных гетерогенных заносов из различных регионов мира. Мы обнаружили 6 субтипов ВИЧ-1 (А, В, С, D, F и G) на территории России и ближнего зарубежья. Другими авторскими коллективами [Bobkov A., et. al., 1994] описаны также субтипы Е и Н. Одновременная циркуляция 8 из 10 известных в настоящее время субтипов, характерна для ранней фазы эпидемии. В 1996-1997 гг. началась массовая интродукция субтипа А, поразившего внутривенных наркоманов на территории России, Украины и Белоруссии (рисунок 7).

Начиная с 1996 года молекулярный "портрет" эпидемии начал меняться. Появились локальные, серотипически гомогенные (и, возможно эпидемиологически связанные) очаги ВИЧ-1 инфекции серотипа А/С в Гомельской области Белоруссии и на юге/юго-востоке Украины. При этом, в последнем регионе наблюдалась серотипическая стратификация ВИЧ-1 (уже на ранней

стадии развития эпидемии): среди внутривенных наркоманов в Николаеве циркулирует серотип В, в Одессе, Донецке - А/С, а в Киеве и Крыму одновременно оба указанных серотипа.

Дальнейшее (1997 год) изучение серотипических свойств вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди Светлогорских ВВН, выявило увеличение разнообразия серотипов и появление в 21,4% случаев спектров реактивности, отличающихся от спектров типа А/С.

Обнаруженная нами серотипическая стратификация ВИЧ-1 указывает на то, что пути распространения ВИЧ-инфекции в России, Украине и Белоруссии, по-видимому, отличаются от таковых в США и Западной Европе.

Эпидемическая ситуация, сложившаяся в 1999 году, характеризуется значительным увеличением доли вирусов субтипа А и распространением нового ВИЧ-1 рекомбинанта gagA/envB рисунок 16. К 2000 году доля субтипа А возросла до 90%, при этом доля субтипа В - 3%, А/В - 5%.

Для того чтобы охарактеризовать субтипическое разнообразие вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди ВВН на территории бывших союзных республик (Россия, Беларусь, Украина), были изучены нуклеотидные последовательности области V3 env gp120 и области gag р17/р24, полученные из 42 образцов от ВИЧ-1-инфицированных ВВН (1996-1999). Генетический анализ показал, что эпидемия среди ВВН на территории бывшего СССР в основном вызвана тремя субтипами ВИЧ-1: субтип А, субтип В и третий рекомбинантНый - gagA/envB. Каждый из этих субтипов характеризуется высокой генетической гомогенностью (нуклеотидная дистанция в env регионе для каждого субтипа составляет приблизительно 2%). Вирусы субтипа А преобладают как в смысле географической распространенности, так и по количеству случаев инфицирования. Они выявляются у большинства ВИЧ-1-инфицированных ВВН на территории Украины и России и у всех ВВН в Беларуси. Рекомбинанты А/В обнаружены у ВВН в Калининградской области России. Таким образом, особенностью современной эпидемии ВИЧ-1 в России является преобладание субтипа А и А/В рекомбинанта, которые распространяясь среди ВВН являются причиной более 90% случаев инфицирования ВИЧ-1. При этом разница между вирусами, изолированными в различных регионах России, составляет не более 1-2% нуклеотидов, что свидетельствует о чрезвычайно высокой гомогенности внутри субтипов.

Распределение субтипов ВИЧ-1 в России до 1994 года.

с 16%

1.

Распределение субтипов ВИЧ-1 в России в 1999 году.

сл^дн

«% А/В

А 86%

2.

I

Рисунок 7. Распределение субтипов ВИЧ-1 в России.

1. 1994 год - около 1000 инфицированных ВИЧ-1, исследовано 200 сывороток от инфицированных ВИЧ-1 пациентов (200 серотипировано, из них 20 секвенировано).

2. 1999 год - около 20 000 инфицированных ВИЧ-1, серотипировано 1200 сывороток от инфицированных ВИЧ-1 пациентов, 100 образцов секвенировано.

Протекание ВИЧ-инфекции характеризуется многообразием клинических проявлений, связанных с патогенностью ВИЧ и его генетической изменчивостью, что свидетельствует о разнообразии биологических свойств вируса. Большое значение имеет изучение вирусного фенотипа, тропизма к клеткам различного происхождения, спектра используемых корецепторов, способности к синцитеобразованию, скорости и кинетики репликации, цитопатогенности. ' Большинство вирусных изолятов, полученных нами от ВИЧ-1-

инфицированных пациентов, относятся к И5Х4 вирусам, т.е. обладают двойным тропизмом, фенотипом и являются несинцитиеобразующими. Приблизительно ' 10% из недавно изолированных вирусных вариантов обладают устойчивостью к

АгТ, несмотря на то, что они были выделены из крови ВИЧ-1-инфицированных пациентов никогда прежде не получавших АгТ-терапии (таблица 5). Таблица 5. Биологические характеристики полученных изолятов ВИЧ-1.

Субти Кол-во Фенотип Спектр корецепторов Чувствительность к А2Т Путь инфицирования

п изолятов N31 Р!-Н СХСК4 ССИ5 ССК5/ СХСИ4 + -

А 20 0 20 0 20 0 8 12 20 0 ВВН

В 75 21 54 16 59 3 6 6 10 20 Гомосекс

А/С 3 1 2 .1 2 Гетеросекс

й 2 1 1 1 1

Таким образом, наши исследования и исследования других авторских коллективов свидетельствуют, что современная эпидемическая ситуация в России связана с интродукцией субтипа А ВИЧ-1 и нового рекомбинантного вируса дадА/ет/В. Эти два вирусных варианта обнаруживаются у ВИЧ-1-инфицированных ВВН и являются причиной более 90% случаев заражения. При этом вирусные изоляты, полученные в различных регионах России, отличаются друг от друга не более, чем на 1-2% нукпеотидов.

Следует отметить большую долю А2Т-устойчивых вариантов ВИЧ-1, причем для них характерны как 5-1, так и Я-Н фенотипы.

2.4 Анализ иммунологической гетерогенности ВИЧ-1: «аргинин-гпутаминовый триггер» в четвёртой позиции верхушечного тетрапептида \/3-петли др120.

Мы изучили гетерогенность спектров иммунореактивности 90 сывороток, полученных от ВИЧ-1-инфицированных пациентов. Спектры иммунореактивности определяли в твердофазном ИФА с использованием 11-ти синтетических

пептидов, имитирующих верхушечные эпитопы \/3-петли африканских, американо-европейских и южнорусских вариантов поверхностного гликопротеина др120 ВИЧ-1. Применение многомерного шкалирования позволило выявить два типа специфического взаимодействия ВИЧ-1-позитивных сывороток с \/3-имитирующими пептидами и сопоставить тип специфичности с аминокислотными последовательностями пептидов. Оказалось, что «переключателем специфичности» является «аргинин-глутаминовый триггер» в четвёртой позиции центрального тетрапептида.

Около 12% сывороток (11/90) - специфически реагируют с пептидами, имитирующими варианты \/3-петли американо-европейских вариантов В-субтипа ВИЧ-1; примерно 23% (21/90) - специфически взаимодействуют с \/3-эпитопами африканских вариантов и южно-российского в-субтипа ВИЧ-1. Группы пептидов {р108-р110} и {р168-170, р\/1, рХП}, взаимодействие сывороток с которыми имеет выраженную специфичность, обладают одним общим отличием друг от друга: первые содержат в четвертой позиции центрального тетрамера аргинин, а вторые - глутамин. Таким образом, «переключателем специфичности» является «аргинин-глутаминовый триггер» в четвертой позиции центрального тетрамера

вРв—. При этом, тетрамер ОРвО менее специфичен по отношению к

исследуемой панели сывороток.

2.5 Модель функционирования верхушечного эпитопа петли УЗ др120 ВИЧ-1 в составе комплекса с антителами

Мы исследовали влияние аминокислотных последовательностей верхушечного эпитопа \/3 др120 различных вариантов ВИЧ-1 и \/3-имитирующих синтетических пептидов на взаимодействие в ИФА сывороток с этими пептидами. Предложена модель, описывающая механизм взаимодействия 10 аминокислотных остатков на вершине эпитопа \/3 др120 ВИЧ-1 с антителами. Специфичность данного взаимодействия определяется аминокислотными остатками в положениях 315 и 320 петли \/3 (нумерация соответствует штамму ВИЧ-1 мы) и зависит от гидрофобности остатков 314,316,321-323.

Полученные результаты позволили выяснить роль трипептида, примыкающего к центральному тетрапептиду слева, во взаимодействии антител с верхушечного эпитопом N/3. Предложена модель функционирования верхушки петли \/3 в составе комплекса с антителом. Проведен анализ встречаемости различных аминокислотных остатков на вершине петли \/3 различных субтипов

ВИЧ-1 группы М и показано, что наиболее часто встречаются комбинации аминокислотных остатков, которые повышают эффективность взаимодействия верхушечного эпитопа УЗ с РаЬ-фрагментом антитела. Это позволяет предположить, что механизм функционирования верхушечного эпитопа УЗ в составе комплекса с антителом может реализоваться и в процессе межбелковых взаимодействий при проникновения вируса в клетку-мишень.

А

314-ая позиция

313-ая

позиция

/

312-ая

ПОЗИЦИЯ

Я /-V

А-

318-ая позиция

/

участок,

комплементарный 314-ой позиции V3

участок,

комплиментарный 313-ой позиции V3

/

-319-321-ая позиции

участок,

. комплементарный 318-ой позиции V3

участок,

комплиментарный 319-321-ой позиции V3

О

участок, комплиментарный 312-ой позиции V3

Fab

~Г

Fab

Рисунок 8 Схема взаимодействия 10 аминокислотных остатков на вершине петли V3 др120 ВИЧ-1 с Fab-фрэгментом антитела: а - в момент вхождения эпитопа V3 в зазор Fab; б - промежуточное состояние (пояснения в тексте).

Сопоставление полученных нами результатов с имеющимися данными позволяет предложить следующую модель взаимодействия антител с V3-имитирующими пептидами (рис. 8):

I. Три первых аминокислотных остатка центрального тетрапептида (положение 317-320) несут структурную нагрузку, обеспечивая образование изгиба на вершине петли V3.

И. Аминокислотные остатки в положении 314, 316 и 321-323 осуществляют гидрофобное, а 315 и 320 - негидрофобное взаимодействие с Fab-фрагментами.

III. Первоначально с Fab связывается правый трипептид (321-323), затем левый трипептид (314-316) протягивается мимо участка Fab, ответственного за связывание с остатком петли V3 в положении 320, увлекая за собой центральный тетрапептид, формируя конформацию конечного комплекса V3 с Fab.

Из положений I-III модели взаимодействия верхушечного эпитопа петли V3 с антителами следует:

1. Если консенсус V3 содержит в положениях 317 и 319 заместители с большим стерическим фактором, то для анализа иммунореактивности таких сывороток, описанная модель непригодна. Модель непригодна и в случае образования жестких поворотных структур вблизи центрального тетрапептида, заметно изменяющих конформацию верхушечного эпитопа петли V3.

2. Совпадение аминокислотных остатков в положении 315 и 320 приводит к тому, что положение 315 V3 оказывается комплементарным участку Fab, связывающему аминокислотный остаток 320 V3. Поэтому при протягивании мимо этого участка Fab аминокислотному остатку V3 в положении 315 может оказаться энергетически выгодно остаться в этом состоянии. Таким образом, не будет достигнута конечная конформация.

3. Замены в положениях 315 и 320 УЗ-имитирующих пептидов изменяют иммунореактивность сыворотки по отношению к ним тем больше, чем больше отличаются химические структуры заместителей от аутологичного консенсуса.

4. На иммунореактивность сыворотки к УЗ-имитирующим пептидам влияют гидрофобные свойства заместителей относительно аутологичного УЗ-консенсуса в положениях 314, 316, 321-323, причем:

а) низкая гидрофобность заместителей в положениях 314, 316, 321-323 V3-имитирующих пептидов относительно консенсуса V3 снижает иммунореактивность аутологичной сыворотки к этим пептидам, так как это снижает эффективность гидрофобного взаимодействия;

б) высокая гидрофобность заместителей в положениях 314, 316, 321-323 УЗ-имитирующих пептидов относительно консенсуса V3 снижает иммунореактивность и специфичность аутологичной сыворотки к этим пептидам, так как это экранирует взаимодействие аминокислотных остатков 315 и 320 с Fab.

Глава 3. Механизмы проникновения ВИЧ в клетку-мишень.

3.1 Синтетические фрагменты Сй4-рецептора: блокирование ВИЧ-инфекции in vitro и иммунореактивность с сыворотками ВИЧ-инфицированных лиц.

Настоящая работа являлась частью исследований по картированию молекул CD4 и др160 с помощью синтетических пептидов для локализации сайтов, принимающих участие в вирус-клеточном взаимодействии.

Были синтезированы пептиды, которые в большей части перекрывают функционально важные участки Vl-домена. Первый пептид, AZ-1, гомологичен СОЯ2-району, второй, AZ-2 (AZ-3),— СОЯЗ-району иммуноглобулинов.

Наши эксперименты показали, что синтезированный пептид 47-67 вызывал лишь 30% ингибирование образования синцитиев в Т-клеточной культуре Н9, зараженной штаммом RF, в концентрации 1,0x10"6 М, тогда как пептид 75-99 проявлял дозозависимое ингибирование и 100% подавление образования синцитиев наблюдалось при концентрации 1,0x10"5 М, а 50% - при концентрации 0,8x10"® М. Мы предполагаем, что синтетические пептиды, представляющие собой дгр720-связывающий эпитоп рецептора CD4, могут выступать антагонистами др720-индуцированного апоптоза.

3.2 Аджоен, как блокатор интегрин-зависимых процессов в системе клеток, инфицированных ВИЧ.

Аджоен - (Е,г)-4,5,9-тритиадодека-1,6,11-триен-9-оксид - представляет собой терпеноид, выделенный из экстрактов чеснока (Allium sativum), блокирует агрегацию тромбоцитов, индуцированную всеми известными на сегодняшний день агонистами, за счет аллостерической инактивации тромбоцитарного интегрина GP llb/llla.

Аджоен ингибировал слияние клеток линии Н9 с клетками хронически инфицированными H9/BH4-1RF с ED50 ~ 45 нМ.

Антивирусный эффект аджоена в отношении ВИЧ-инфекции изучался в клетках Н9, зараженных штаммом ВИЧ-1/RF, и в клетках линии СЕМ, зараженных штаммом ВИЧ-1/BRU.

Полученные результаты показали, что аджоен активно подавляет инфекцию ВИЧ-1/RF в клетках линииНЭ (ED50~25 мкМ); более выраженное ингибирующее действие Аджоена обнаружено для клеток линии СЕМ13, зараженных штаммом ВИЧ-1/BRU (EDso-5 мкМ).

,f<.....НИОНАЛЬНАЯ

ВЧБЛИОТЕКА С.Петербург

ОЭ 200 w

3.3 Исследование пептидов фузии ВИЧ-1. Анализ взаимосвязи структуры и функции.

3.3.1 Изучение влияния пептидов на искусственные липидные мембраны. Как мы показали ранее, минимальная длина пептида необходимая для проводящей активности в бислойной мембране составляет 10 аминокислотных остатков.

Затем мы обнаружили, что пептиды длиной не менее 15 а/к остатков и содержащие амфифильные аминокислотные остатки, увеличивают проводимость в липидном бислое. Более того, эти пептиды (р399, р512, р513) проявляют рН зависимую активность. Как показано ранее пептиды р414, р415 и р488 были активны как в нейтральной, так и кислой среде.

Р385 у которого полностью сымитирована N-концевая часть др41 и который начинается с первой заряженной аминокислоты Агд538, также обладает каналообразующей активностью при всех исследованных значениях рН.

Был рассчитан диаметр каналов, образуемых пептидом фузии в мембранах Монтала, он равен приблизительно 4нм и близок к размерам гидрофобной поры слияния, рассчитанной для вируса гриппа [Bentz J., 1990].

Нами показано, что необходимая минимальная длина пептида составляет 10-15 аминокислот, а формирование альфа-спиральной структуры в N-концевом участке др41 является необходимым условием его участия в дестабилизации липидной мембраны.

В экспериментах с пептидами из др41 ВИЧ-1 было подтверждено, что действие пептидов фузии на липидные мембраны зависит от последовательности аминокислотных остатков, длины пептида, вторичной и третичной структуры, а также наличия свободного N-конца. При этом особенно важно наличие мотива Phe-Leu-Gly, в особенности Phe8.

3.3.2 Изучение действия синтетических пептидов фузии, соответствующих N-концевой области др41 ВИЧ-1, на репликацию вируса. Анализ активности пептидов и их конъюгатов в тесте синцитиеобразования

Мы изучили специфичность действия пептидов фузии из др41 на ВИЧ-индуцированное слияние клеток.

Для решения этой задачи исследована активность различных пептидов ( в том числе: пептидов фузии ВИЧ (табл. 6), конъюгатов этих пептидов с BSA и синтетическими полимерами в тесте синцитиеобразования.

Таблица 6. Аминокислотные последовательности синтетических пептидов

фузии.

последовательность Код пептида

ВИЧдр120----» .....- др41

VQREKR AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAR

511 538

VGIGALFLGFLGAAG Р491

GALFLGFLGAAG Р488

ALFLGFLGAAG Р415

LFLGFLGAAG Р414

FLGFLGAAG Р411

FLGFLGAAGSTMGAR Р388

LFLGFLGAAGSTMGAK Р513

FLGFLGAAGSTMGAK Р512

LGFLGAAGSTMGAK Р511

GFLGAAGSTMGAK Р510

AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAK Р514

AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAR Р385

R AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAR Р525

VQREKR AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAR Р526

AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAK-2-CL-Z Р515

AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAK-BSA Р520

AVGIGALFLGFLGAAGSTMGAK-Suc-BSA Р554

BSA (бычий сывороточный альбумин) .

2-CL-Z (2-chloro-benzyloxucarbonyl)

PHSV не оказывал значительного влияния на ВИЧ-инфекцию, в отличие от 22-членного пептида фузии ВИЧ Р385, который при концентрации 10 цМ подавлял образование синцитиев на 90%. Гомологичная замена С-концевой аминокислоты Arg в пептиде Р385 на Lys в Р514 не влияла на активность пептида (Р514 обладал тем же действием на синцитиеобразование, что и Р385 с 50% ингибирующей концентрацией примерно 10"6 - 10"7 М). С другой стороны, Р525, который отличался от Р385 только одним аминокислотным остатком Arg513 (С-концевая аминокислота др120), не ингибировал образования синцитиев. Так как аминокислотная последовательность N-концевого участка др41, высвобождающегося в результате протеолитического нарезания др160, особенно важна для процессов ВИЧ-индуцированного клеточного слияния, то отсутствие активности у Р525 может указывать на специфичность действия пептидов фузии из др41 на ВИЧ инфекцию. Конъюгаты пептидов Р385 и Р514 с GEL (Р583.Р585); с CVM-ACP (сополимер N-винилпирролидона с ангидридом малеиновой кислоты) по N-концевой аминогруппе .(Р578), а также Р582 не проявляли никакой активности в этом тесте.

Данные электронномикроскопического исследования свидетельствуют о том, что Р385 из-за своей высокой гидрофобности в водных растворах образует нитевидные агрегаты, причем некоторые кристаллические образования наблюдались в культуральной жидкости даже в световой микроскоп.

Исследование иммунореактивности пептидов показало, что кроличьи пептидные антисыворотки к Р385 реагировали в ELISA с адсорбированным на пластике Р385 и С-концевым Р388 с титром 1:3200, тогда как гидрофобная N-концевая часть пептида не обладала антигенной активностью. В то же время, единичная гомологичная замена С-концевого аргинина в Р385 на лизин в Р514 привела к изменению иммунологических свойств, хотя не влияла на другие свойства пептида.

3.3.3 Исследование влияния пептидов на репликацию ВИЧ-1.

Эффективность ингибирующего действия пептидов на репликацию ВИЧ определяли по титру вирусного антигена при изучении супернатанта в ИФА. Наиболее активным оказался конъюгат P514-BSA (Р554), который в концентрации 10 мкМ полностью блокировал продукцию ВИЧ антигена. Следует подчеркнуть, что антивирусный эффект Р554 сравним с таковым для декстран сульфата в близких концентрациях.

Для изучения влияния носителей на антивирусное действие пептидов использовались конъюгаты Р385 и/или его аналога Р514 с различными синтетическими или природными полимерами. Конъюгирование Р514 с бычьим сывороточным альбумином - BSA (Р554) или синтетическим полимером CMV-ACP (Р580) по лизиновой эпсилон-аминогруппе привело к усилению анти-ВИЧ активности пептидов (табл. 7).

С другой стороны, у конъюгата Р385 с CMV-ACP по N-концевой NH2-rpynne (Р578) подавляющее действие на ВИЧ инфекцию полностью отсутствовало.

Было также исследовано влияние микроокружения на ингибирующее действие пептида. Р514 в комплексе с отрицательно заряженным синтетическим полимером (Р580) проявлял такую же активность, подавляя ВИЧ инфекцию, как и комплекс Р514 с BSA (Р554) (табл. 7). Однако, введение положительно заряженной аминокислоты, аргинина, в молекулу полимера снижало блокирующее действие конъюгата (Р582). Р514 конъюгированный с желатином (Р583, Р585) не был активен ни в тесте синцитиеобразования, ни в ИФА, независимо от заряда молекулы полимера. Такая потеря антивирусной активности может быть обусловлена третичной структурой комплекса. Для того,

что бы подтвердить заключение о том, что пептиды фузии и их конъюгаты могут воздействовать топько на первую стадию жизненного цикла ВИЧ и не влияют на события после интеграции вирусного генома, было исследовано действие конъюгатов на хроническую ВИЧ инфекцию (клеточная линия НЭ/ВИЧИия). Ни один из изученных препаратов не проявил никакого значительного эффекта в этом эксперименте.

Таблица 7. Подавление репликации ВИЧ-1 в клетках Н9 в присутствии препаратов пептидов фузии.

Шифр пептидов Концентрации (мкг/мл) Титр антигена ВИЧ

контроль 270

Р385 10 30

1 90

Р525 10 90

1 270

Р554 10 <10

1 30

Р578 10 90

1 270

Р580 10 10

1 90

Р582 10 270

1 270

Р583 10 270

1 270

Р585 10 270

1 270

3.3.4 Обнаружение стадии жизненного цикла ВИЧ, являющейся мишенью для пептидов фузии др41

С целью определения точной мишени для ингибирующего действия пептидов, было исследовано влияние Р385 на адсорбцию ВИЧ. Для этого З53-меченый вирус инкубировали с клетками линии Н9 в течение 30 мин. при комнатной температуре в присутствии'или отсутствии пептида, после чего клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием и в супернатанте измеряли уровень радиоактивности. Результаты показали отсутствие какого-либо ингибирующего действия на вирусную адсорбцию. Во всех экспериментах адсорбировалось около 50% меченого вируса.

По данным ПЦР-анализа ясно, что Р580 и Р554, которые наиболее активно ингибировали образование синцитиев и продукцию вирусного антигена, подавляют также образование провирусной ДНК.

Для исключения возможности воздействия препаратов пептидов непосредственно на обратную транскриптазу, была проведена стандартная обратнотранскриптазная реакция в присутствии и отсутствии препаратов. Ни один из пептидов не оказал значительного влияния на активность фермента. Таким 1

образом, можно сделать вывод о том, что пептиды из др41 ВИЧ направленно ингибируют процесс проникновения вируса в клетку.

Изученный нами длинный пептид фузии ВИЧ-1 (22 аминокислотных остатка) и его конъюгат с BSA эффективны уже в концентрации 10"6 - 10"7 М. Четкая корреляция данных, полученных в трех независимых тестах (тест ингибирования синцитиеобразования, иммуноферментный анализ и полимеразная цепная реакция), может служить доказательством того, что действие синтетических пептидов из др41 на ВИЧ инфекцию является специфичным и зависит не только от аминокислотной последовательности пептида, но и от заряда и пространственной организации носителя. Исследованные нами препараты пептидов не проявляли токсического действия в культуре клеток в использованных концентрациях, поэтому они могут представлять интерес с точки зрения применения их в качестве химиотерапевтических средств.

3.3.5 Суммарные данные позволили нам сформулировать оригинальную концепцию механизма проникновения ВИЧ в клетку:

На первом этапе вирион адсорбируется на поверхности клетки, связываясь с СОР2-учзстком CD4 молекулы, в основном за счет гидрофобных сил, после чего происходят конформационные превращения и CDR3-y4acTOK CD4 электростатически взаимодействует с V3 петлей др120. Поскольку др120 представлен в вирионе в виде олигомера, т.о. является поливалентным лигандом, О

то параллельно происходит связывание V3 участка с дополнительным клеточным рецептором (хемокиновые рецепторы и интегриновые рецепторы). Оба процесса резко меняют конформацию gp120-gp41 комплекса, приводят к экспонированию "

домена "слияния" и тесно сближают его с клеточной мембраной. Экспонирование гидрофобных цепей вблизи поверхности клеточной мембраны приводит к ее дегидратации, после чего домен "слияния" внедряется в липидный бислой клетки. Что приводит к одновременной дестабилизации вирусной и клеточной мембран,

которая заканчивается их слиянием. В результате - геном вируса проникает в клетку.

Из этой концепции следует, что многоэтапный процесс проникновения вируса в клетку может быть заблокирован на различных стадиях ингибиторами адгезии, рецепции, фузии. Такие ингибиторы являются одновременно и инструментом фундаментального исследования, и отправной точкой молекулярного дизайна новых противовирусных средств.

Глава 4. Механизмы модуляции ВИЧ-инфекции.

4.1 Изучение механизмов амплификации провирусной ДНК и усиления репликации ВИЧ-1 в условиях теплового шока.

Мы изучили механизмы обнаруженных нами ранее феноменов амплификации провирусной ДНК и усиления репликации ВИЧ-1 в условиях теплового шока (ТШ).

В ходе отработки условий для эффективной индукции теплового шока проведено сравнительное изучение содержания и синтеза белков теплового шока (БТШ) в клетках перевиваемых линий Н9 и Н9/ВИЧ-1 HIB (содержат провирусную ДНК) при нормальной и (37°С) и повышенной (42°С) температурах.

Показано, что клетки Н9 характеризуются значительной скоростью биосинтеза и достаточно высоким уровнем конститутивных форм БТШ. Методом Вестерн-блота при использовании специальных моноклональных антител к индуцибельной и конститутивной формам БТШ с молекулярной массой 72кДа установлено наличие 3-х конститутивно синтезируемых форм БТШ72. Аналогичные исследования клеток, хронически зараженных ВИЧ-1 (Н9/ВИЧ-1 IIIB) показали, что спектр синтезируемых белков в этих клетках отличен о такового в клетках Н9. Обнаруживается дополнительный синтез белков р75, р74, р40, р37, имеющих клеточное происхождение. Функция этих белков пока неизвестна. Показано, что в клетках Н9/ВИЧ-1 HIB БТШ72 конститутивно синтезируются при 37°С с такой же скоростью, как и в клетках Н9. При этом синтеза индуцибельных белков изоформ БТШ72 не наблюдается (рисунок 9).

При повышении температуры до 42°С в течение 60 мин. в клетках Н9 и H9/IIIB наблюдается резкое усиление синтеза БТШ с молекулярными массами 72кДа, 88кДа, ЮОкДа и 110кДа. Помимо усиления синтеза этих белков наблюдается активный синтез de novo индуцибельного компонента БТШ72, представленного еще в четырех изоформах, одна из которых является

I I

+ -__±

- Ч«5г .• -110 -100 \ * • ¡-110 -100

¿f ф • ® . iJZ-ш - 72 t : »r* * ЧГ ь* 9 - 72

• • ч , ■• • I ♦А ®

Н9, 37° С

Н9/ВИЧ-1 HIB, 37°С +

Н9/ВИЧ-1 HIB, 42°С

Рисунок 9 . Флюорофаммы двумерных электрофорезов белков, синтезируемых в культурах клеток Н9 и Н9/ ВИЧ-1 HIB при различных температурах. Приведены правые верхние квадранты флюорограмм. Сбоку указаны молекулярные массы синтезируемых БТШ в кДа. А-актин.

доминирующей. Наблюдаемые изменения белкового синтеза сопровождаются повышением вирусной продукции в зараженных клетках.

Мы изучили возможность амплификационной транспозиции ВИЧ в условиях ТШ, выраженной в амплификации провируса. Что бы проверить эту гипотезу была получена модель инфицированных клеток с фиксированным уровнем интеграции ВИЧ.

С помощью высоко чувствительного метода количественной оценки провирусной ДНК в зараженных клетках (разработанного в нашей лаборатории [Yolov A.A., et. а/., 7995]) было проведено изучение кинетики репликации ВИЧ:

Было показано, что в выбранных условиях заражения профиль накопления суммарной провирусной ДНК свидетельствует о множественной реинфекции. В присутствии AZT в концентрации 1цМ количество провирусной ДНК снижается в сотни раз по сравнению с контролем (без AZT) при тех же условиях заражения см. табл. 8

На протяжении всего срока инфекции (10 суток) в этой системе сохраняется постоянно низкий уровень провирусной ДНК, свидетельствующий об отсутствии реинфекции.

Таблица 8. Уровень ДНК ВИЧ-1 в культуре инфицированных клеток с различным содержанием А2Т.

КОНЦЕНТРАЦИЯ [AZT], цМ ВРЕМЯ, ДНИ ЭКСПЕРИМЕНТА; t=0 - тепловой шок

5 6 7 8 9 10

Число Контр, кп. 520 238 306 300 1072 1430

Копий ТШ кл. [AZT)=1 114 240 238

ДНК Контр.кл 318 858 715 953 3574 4306

ВИЧ на ТШ-кл. [AZT]=0,1 71 317 1244 1970

500 кл. Контр.кл. 35742 71484 107647

ТШ-кл. [AZT]=0 143 1144 9531 12867 85116

Клетки, подвергавшиеся ТШ, оказались менее способными развивать вирусную инфекцию по механизму реинфекции. Однако, несмотря на сниженное содержание копий провирусной ДНК в таких клетках наблюдается равная по сравнению с контролем продукция вируса. Эти данные указывают на более активное состояние провирусной ДНК при тепловой стимуляции клеток. В результате этих исследований была в деталях отработана модельная система для изучения амплификации провируса ВИЧ при стрессорном воздействии теплового шока (ТШ).

Впервые нами показано, что индукция ТШ при 41,5°С инфицированных лимфобластоидных клеток (Н9/ВИЧ-1 РР) вызывает амплификацию провируса ВИЧ (табл.9).

Таблица 9. Амплификация провируса в условиях теплового шока.

Количество ДНК ВИЧ/клетку время, часы после ТШ

-3 7 10 13 19 25 37 49 73 92

к-клетки 0,2 0,2 0,1 0,2 0,3 0,2 0,5 0,8 0,8 3,6

ТШ-клетки 0,2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,7 0,8 2,8 5,7 20

Наблюдаемый эффект развивается в первые часы после ТШ и в дальнейшем самоподдерживается. По сравнению с контрольными клетками, содержание вирусной ДНК в клетках, стимулированных ТШ, в 3-5 раз выше.

Полученные данные свидетельствуют, что в условиях ТШ, возможно, ВИЧ реализует другую программу жизненного цикла, проявляя ретротранспозонную активность. Механизм амплификации провируса нами точно не установлен, но не исключено, что амплификационная транспозиция интегрированного провируса осуществляется без образования РНК-интермедиата, на что косвенно указывает использование в клеточной системе AZT в концентрации, как было показано выше, эффективно блокирующей синтез ДНК.

4.2 СЕМ-К - клоны перевиваемой линии Т- клеток человека, устойчивые к ВИЧ-инфекции.

4.3.1 Получение клеточных клонов и их характеристика.

Нами получена новая клеточная модель СЕМ-К, представляющая собой Т-лимфоциты человека. Чувствительная к заражению ВИЧ-1 лимфобластоидная линия СЕМ была успешно трансплантирована на бестимусных мышей BalB/C (nude/nude), и получен перевиваемый опухолевый штамм.

Изучена чувствительность полученных линий СЕМ-К4, СЕМ-К7 и СЕМ-К20 к заражению ВИЧ-1. Родительские клетки СЕМ успешно заражались ВИЧ-1, в отличие от дочерних кпонов.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что после пассирования на животных чувствительная к заражению ВИЧ-1 лимфобластоидная линия СЕМ утратила способность к заражению вирусом Свойство устойчивости к заражению ВИЧ-1 для клеток СЕМ-К остается постоянным и сохраняется при длительном культивировании клеток в суспензии (более 300 пассажей в культуре).

Для определения экспрессии клеточных рецепторов мы использовали панель моноклональных антител к поверхностным антигенам лимфоцитов человека. Выводы, которые можно сделать на основании полученных антигенных характеристик, таковы: 1) родительская линия СЕМ и полученные линии СЕМ-К являются Т-лимфоцитарными, поскольку на их поверхности присутствуют рецепторы, характерные для Т-лимфоцитов человека - CD3, CD5, CD7, CD45; 2) на поверхности клеток СЕМ-К в отличие от родительских практически перестают экспрессироваться такие антигены как CD26, CD25, CD45, CD71 и, что особенно интересно, не выявлена экспрессия антигена CD4; 3) на поверхности клеток СЕМ-К наблюдается значительная в сравнении с клетками СЕМ экспрессия антигена Fas (APO-1/CD95) - антигена, опосредующего апоптоз.

Анализируя полученные результаты, очевидным представляется механизм устойчивости клеток СЕМ-К к воздействию вируса - практически отсутствует экспрессия CD4 - главного рецептора для ВИЧ.

Еще одним важным, на наш взгляд, обстоятельством' является экспрессия С095-рецептора на поверхности полученных клеток СЕМ-К. Установлено, что именно Fas (APO-1/CD95) является одним из антигенов, опосредующих апоптоз [Trauth B.C., 1989, Yanehara S., 1989]. Интересно то, что при наличии экспрессии Fas-антигена культуры клеток СЕМ-К длительное время сохраняют свою жизнеспособность в нестандартных условиях: в среде без FCS, при низком содержании С02. В то же время, родительские клетки СЕМ не отличаются высокой экспрессией CD95, но недостаток углекислого газа и/или низкое содержание эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) приводят их к быстрой гибели. Возможно, в клетках СЕМ-К запускается механизм анти-апоптоза.

Таким образом, в результате пассирования CD4+- клеточной линии СЕМ на бестимусных мышах мы получили клоны CD4- клеток, устойчивые к заражению ВИЧ. Отсутствие экспрессии CD4 на клеточной поверхности, возможно, связано с цитогенетическими изменениями родительских клеток - отсутствием гена, кодирующего рецептор CD4, изменение его локализации в результате хромосомных перестроек или внутригенным дефектом.

Цитогенетическое исследование клеток СЕМ-К7 и СЕМ-К20 показало, что их кариотип соответствует кариотипу человека. Родительская линия СЕМ характеризуется 2п=47 числом хромосом, тогда как клетки СЕМ-К7 и СЕМ-К20 отличаются возникновением полиплоидности: 2п=90. Наблюдается появление

дополнительных перестроенных хромосом, а в ряде хромосом зарегистрированы разрывы по отдельным онкогенам.

С нашей точки зрения, интересным представляется то, что и в линии СЕМКУ и в линии СЕМ-К20 в сравнении с исходной появляются новые перестроенные хромосомы, однако, перестройки не затрагивают 12-ю хромосому: в ней не выявлено нарушений структуры. Однако открытым оставался вопрос о локализации гена СЭ4 в самой хромосоме. После гибридизации ДНК хромосом ¡п эНи с ДНК-зондом в 100 метафазных пластинках для каждой из исследуемых линий зерна серебра были локализованы в районе р11 для СЕМ-К7 и в районе р12 для СЕМ и СЕМ-К20. Следовательно, предположение о том, что отсутствие экспрессии Сй4 связано с изменением места локализации гена, его кодирующего, не подтвердилось.

Таким образом, в результате пассирования на бестимусных мышах С04-позитивной, чувствительной к заражению ВИЧ лимфобластоидной клеточной линии СЕМ впервые получены штаммы С04-негативных Т-лимфобластоидных клеток человека СЕМ-К, утерявшие чувствительность к заражению ВИЧ-1. Полученные штаммы клеток могут служить новой моделью для исследования механизмов взаимодействия вируса с клеткой-мишенью.

С целью поиска возможного, С04-независимого механизма ВИЧ-инфекции мы поставили задачу получить вирусное потомство в СР4-клетках СЕМ-К и изучить его свойства. Для этого мы воспользовались методом трансфекции. В наших экспериментах мы использовали кпон клеток СЕМ-К7 и плазмиду НХВ 20.

Полученные в этом эксперименте данные, бесспорно, свидетельствуют о том, что при внедрении з С04-иегативные клетки СЕМ-К7 и в С04-позитивные клетки СЕМ плазмиды ВНХ 20, содержащей полноразмерный геном ВИЧ-1, произошла репродукция вирусного материала, в результате чего образовались новое, полноценное вирусное потомство. Новые вирусы способны заражать пермиссивные для ВИЧ-1, С04-позитивные клеточные линии, но не вызывают инфекции в клетках СЕМ-К7. Это означает, что вирусы, полученные в не экспрессирующих С04 клетках СЕМ-К, не аттенуированы. Вирусное потомство не обладает новым фенотипом, идентично исходному штамму ВИЧ-1, и остается тропным к С04-позитивным клеткам.

Таким образом, в изученной нами модели генетическая конституция вируса и его фенотипические свойства (тропизм) не изменяются в результате экспрессии в клетках, утерявших рецепторы для проникновения ВИЧ-1.

Глава 5. Ингибиторы различных стадий жизненного цикла ВИЧ.

5.1 Изучение влияния производных природных нуклеозидов и их 5-фосфитов на репродукцию вируса иммунодефицита человека.

В работе, было изучено действие 2',3'-дидезоксинуклеозидов (Т, А, в, С) и их 5'-фосфитов, а также 5'-фосфитов 3'-азидо-2',3'-дидеэоксинуклеозидов на репродукцию ВИЧ в культуре клеток МТ-4. Структурные формулы изученных соединений приведены на рис. 10.

Защитный эффект препаратов сравнивали с активностью хорошо изученного азидотимидина (АСТ, АЗТ).

Рисунок 10. Структура производных нуклеозидов и их фосфитов, использованных в работе.

В

R,:-H

В R2 В r2

I = ddT Thy H IA = HpddT Thy HO—P(0)(H)-

И = ddA Ade H IIA = HpddA Ade HO—P(0)(H)-

III = ddG Gua H IIIA = HpddG Gua HO—P(0)(H)-

IV = ddC Cyt H IVA = HpddC Cyt HO—P(0)(H)-

смесь 1 — ddT+ddA+ddG+ddC в эквимолярных количествах,

смесь 2 — HpddT+HpddA+HpddG+HpddC в эквимолярных количествах.

В настоящей работе был синтезирован полный набор 5-фосфитов (гидрофосфонатов) З-азидо-21, З'-дидезоксинукпеозидов I—IV.

R,: -Ns

R2: НО—Р(0)(Н)-В: IB = тимин-1-ил IIB = аденин-9-ил HIB = гуанин-9-ил IVB = цитозин-1-ил

5.1.1 Подавление репродукции ВИЧ 5'-фосфитами 3' - азидо- 2',3'-дидезоксинуклеозидов.

Из анализа этих результатов можно сделать следующие выводы. 1. Все фосфиты IB—IVB проявляют активность в подавлении ВИЧ в культуре

45

клеток МТ4. При этом индекс селективности для них достаточно высок (особенно для IB). Этот показатель был выше для IB по сравнению с AZT в 5 раз. По абсолютной активности в подавлении продукции ВИЧ соединения этого ряда можно расположить в следующем порядке - IB > IIB > HIB > IVB, что несколько отличается от такового для соответствующих им нуклеозидов, хотя во всех случаях анти-ВИЧ активность 5' фосфитов выше, чем у соответствующих нуклеозидов (табл. 10). t

2. Их активность также выше, чем для соответствующих 3'-азидо-2,3'-дидезоксинуклеозидов, а коэффициент селективности либо почти такой же, как

для нуклеозидов, либо значительно выше. '

3. Токсичность вместе взятых четырех фосфитов I—IV в 2—3 раза меньше, чем токсичность каждого из них в отдельности.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности изучения аналогов фосфатов нуклеозидов как потенциальных препаратов против синдрома приобретенного иммунодефицита человека (СПИД).

5.1.2. Изучение действия 2',3'-дидезоксинуклеозидов и их 5'-фосфитов на репродукцию ВИЧ.

Еще одним классом соединений, изученных нами в качестве ингибиторов репликации ВИЧ в культуре клеток, являлись 2',3'-дидезоксинуклеозиды (Т, A, G, С) и их 5'-фосфиты. Полученные данные показывают, что изученные соединения обладают выраженным ингибирующим эффектом на репродукцию ВИЧ в культуре клеток, причем наиболее сильными антивирусными препаратами этого ряда являются IV и IVA, индекс селективности которых по своему порядку сравним с таковым для АЗТ. Использование препаратов III, IV, IA, IIIA и IVA в концентрации от 0,1 до 1 мкм обеспечивает более чем 90%-ное снижение содержания вирусных белков в инфицированной культуре; для соединений I, II эта концентрация составляет 1-10 мкм. Хотя методом ИФА нам не удалось <•

выявить снижения продукции ВИЧ-специфических антигенов при использовании НА в концентрациях до 10 мкМ, данные OTP показывают, что и этот препарат ингибирует репродукцию ВИЧ. "*

Сравнение ED50 и индексов селективности изученных 5-фосфитов и соответствующих нуклеозидов показывает, что использование таких аналогов монофосфата для II и III позволяет повысить противовирусный эффект этих соединений. В случае IA наблюдается снижение активности, а анти-ВИЧ эффект IV и IVA приблизительно равен друг другу при несколько меньшей токсичности

последнего (табл. 10).

Таблица 10. Определение цитотоксичности и антивирусной активности изучавшихся производных дидезоксинуклеозидов, их 5'-фосфитов и 5'-

фосфитов азидонуклеозидов.

препарат CD50, мкМ ED50, мкМ Индекс селективности

AZT 72 0,07 1029

1 180 1,23 146

II 236 14,1 17

III 222 8,0 28

IV 115 0,06 1917

IA 136 1,31 104

НА 205 9,2 22

IIIA 202 4,6 44

IVA 212 0,12 1767

IB 102 0,02 5100

IIB 104 0,3 347

HIB 140 0,9 156

IVB 104 >1 <104

Смесь IB-IVB 250 0,09 2778

5.2 3'-(5-Я-тетразол-2-ил)тимидины, проявляющие антивирусную активность.

3'-(тетразол-2-ил) тимидин I и 3'-(5-метилтетразол-2-ил) тимидины II были испытаны на наличие антивирусной активности на модели ВИЧ-1. Было показано, что производные 3'-(тетразол-2-ил) тимидин - I и 3'-(5-метилтетразол-2-ил) тимидины - II являются малотоксичными для клеточных моделей и эффективно ингибируют репликацию ВИЧ-1 в культуре инфицированных клеток.

5.3 Анти-ВИЧ-1 активность транс-дигидроксипиперидинов.

Обнаружена анти-ВИЧ активность каштаноспермина, одного из 32 возможных

оптически активных стереоизомеров. Предполагается, что ингибирование ВИЧ происходит в результате неполного гликозилирования белка оболочки вируса, в процессе которого клеточная глюкозидаза использует молекулу иминосахара вместо О-глюкозы.

По результатам испытаний транс-3,4-дигидроксипиперидины показали заметную анти-ВИЧ активность и низкую токсичность (табл. 11), а транс-3,4-дигидроксипиперидиновый фрагмент действительно является фармакофором.

Таблица 11. Анти-ВИЧ активность, токсичность и

химиотерапевтический индекс некоторых производных пиперидина

№ п/п номер Соединения % инфекции при концентрации (мкг/мл) для линии клеток ВИЧ-1шш ED» мкг/мл CDso мкг/мл Терапевтический индекс

100 10 1 0.1 0.01

1 1 17,0 18,0 73,0 115,1 - 2,7 310 115

2 2 93,9 94,4 95,8 101,2 - >100 195 <2

3 3 87,7 80,9 87,5 91,3 - >100 190 <2

4 4 89,9 89,7 94,4 98,3 - >100 210 <2

5 5 87,6 84,7 80,0 110,6 - >100 750 <7,5

6 6 97,7 98,1 73,2 71,0 - >100 1600 <16

7 6/1" 15,0 16,0 76,0 93,0 - 2,8 1300 460

8 6/2"* 93,2 97,1 77,3 98,0 - >100 1030 <10

9 7 14,0 48,0 37,0 102,0 - 0,6 650 1080

10 7/1" - 45,0 108,7 109,0 100 8,6 725 85

11 8 93,8 95,7 72,8 92,6 - >100 410 <4

12 9 95,7 100,3 89,8 99,1 - >100 740 <7

13 10 57,7 95,2 94,9 95,8 - 160 450 3

14 11 21,5 52,0 100,0 102,0 - 12 1100 90

15 12 94,8 95,1 84,3 101,8 - >100 1670 <16

16 Ставудин #*** 400

17 Азидотим дин (AZT) **** 1000

* на клетках Sup Т1; ** в виде гидрохлорида; *** в виде 3,4-диацетата; **** Литературные

данные

5.4 Антивирусная активность олипифата и его фракций на модели ВИЧ-инфекции.

Мы исследовали эффективность препарата "Олипифат" и его фракций в отношении ВИЧ-инфекции. Основу препарата составляют гуминовые кислоты.

Олипифат мало токсичен и обладает высоким анти-ВИЧ эффектом. Терапевтический индекс олипифата, составляющий 3 ООО - 5 ООО , ставит его в один ряд с хорошо известными ингибиторами ВИЧ, такими как AZT.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что на протяжении 7 пассажей в присутствии олипифата не удается зарегистрировать сколько-нибудь заметного нарастания вирусной репродукции.

1. Олипифат обладает четко выраженным анти-ВИЧ эффектом in vitro.

2. Действие олипифата выражается в снижении инфекционной активности вируса до нулевых значений в течении I пассажа, если применяемые концентрации составляют 2,5 - 0,025 мкг/мл и в течение 2-х пассажей при концентрациях 0,0025 - 0,00025 мкг/мл.

3. В результате проведения серии "слепых" пассажей с I по VII в присутствии олипифата увеличения вирусной репродукции обнаружено не было. Таким

образом, в модельной ВИЧ-инфекции "острого" типа получить резистентные к олипифату вирусные варианты не удается.

Глава 6. Разработка вакцин против ВИЧ/СПИД.

6.1 Изучение специфической активности химерного рекомбинантного белка гес(24-41).

Мы провели исследование специфической активности антигена гес(24-41), содержащего полноразмерный внутренний белок р24 ВИЧ-1 и N -концевой участок др41 ВИЧ-1. Рекомбинантный белок индуцировал высокие титры специфических антител у лабораторных животных (мышей и кроликов) в твердофазном ИФА и хорошо определялся в ИБ.

6.2 Иммуногенные свойства конъюгата рекомбинантного белка гес(24-41) с полиоксидонием.

Иммуногенные свойства конъюгата полиоксидония с рекомбинантным белком гес(24-41) были исследованы на лабораторных животных. Результаты приведены в таблице 12.

Из таблицы 12 следует, что применение полиоксидония способствовало повышению иммуногенности препарата при иммунизации животных низкими дозами и свидетельствует о том, что применение полиоксидония способствует росту титров антител.

Таким образом, применение полиоксидония в составе конъюгата способствует увеличению иммуногенности антигена при иммунизации низкими дозами, что позволяет снизить иммунизирующую дозу препарата.

Таблица 12. Титры антител* в сыворотках мышей после второй иммунизации чистым гес(24-41), его конъюгатом с полиоксидонием [гес(24-41)-ПО], белком, прошедшим все стадии конъюгации, но без добавления Полиоксидония в реакционную смесь [гес(24-41) обр.] и нативного белка в ПАФ, определенные непрямым ИФА. Иммунизирующие дозы 10 мкг антигена на животное.

Антиген на твердой фазе Иммунизирующий антиген

гес(24-41) гес(24-41)-ПО гес(24-41)обр. гес(24-41)в ПАФ

гее их др41 200 1600 100 6400

гес р24 6400 50000 12800 200 000

гее (24-41) 6400 50000 12800 200 000

•по 15 животных в группе, приведены средние значения

6.3 Исследование нейтрализующей активности сывороток мышей, иммунизированных гес (24-41).

Нейтрализующую активность иммунных сывороток определяли в тесте нейтрализации на модели острой инфекции лимфобластоидных клеток МТ4, при этом использовали референс - штамм ВИЧ-1/1ПВ, который активно реплицируется в Т лимфобластоидных клеточных линиях in vitro. Показано, что гес(24-41) вызывает у животных образование антител, нейтрализующих ВИЧ-1. Индекс нейтрализации составил 54,9% при разведении сыворотки 1:50.

6.4 Изучение пролиферативной активности клеток животных, иммунизированных гес (24-41).

Как видно из таблицы 13, сигнал клеток иммунных животных был в 10 раз выше по сравнению с сигналом клеток неимунных животных через 48 часов после введения антигена. Через 72 часа после введения антигена разница в сигналах не наблюдалась, т.к. S-фаза митоза миновала. Визуально в обеих группах, у иммунных мышей, наблюдалось образование бластов. В культурах лимфоцитов интактных мышей бласты отсутствовали. Таким образом, иммунизация рекомбинантным антигеном вызывает антиген - специфическую пролиферацию у животных.

Таблица 13. Включение 3Н-тимидина через 48 и 72 часов после иммунизации животных гес(24-41).

Экспериментапьная группа Включение 3Н-тимидина (срм на 106 клеток)

Через 48 часов Через 72часа

Клетки селезенки иммунных мышей 10000±300 2200+200

Клетки селезенки интактных мышей 1000 ±50 2200±500

Клетки лимфоузлов иммунных мышей 5000±100 1800±150

Клетки лимфоузлов интактных мышей 600±100 1500±50

Изученный нами рекомбинантный белок может представлять перспективную кандидатную анти-ВИЧ вакцину.

Глава 7. Разработка микробицидных препаратов. Микробициды - новое направление в борьбе с ВИЧ-инфекцией.

7.1 Сульфатированные производные хитозана как ингибиторы ВИЧ-инфекции.

Мы изучили группу веществ из класса сульфополисахаридов — сульфатированные производные хитозана (ХТ).

Хитозан-/?[поли-(1~4)глюкозамин] — дезацетилированное производное хитина ракообразных.

Как видно из таблицы 14, практически все изученные производные ХТ и хитина не оказывают токсического действия вплоть до концентрации 500 мкг/мл. При увеличении концентрации до 5000 мкг/мл большинство соединений дают незначительный токсический эффект и только препарат ХТ-\/ в этой концентрации вызывает гибель клеток на 40—50% больше, чем в контроле. Таким образом, можно сказать что, несмотря на различия в структуре и молекулярной массе, практически все исследованные производные ХТ и хитина малотоксичны. Полученные данные убедительно демонстрируют, что некоторые из изученных нами сульфатированных производных ХТ (ХТ-\/И и ХТ-\/Ш) являются ингибиторами, как вирусной репликации, так и синцитиеобразования.

Дальнейшие исследования показали, что пептиды из \/3-области ВИЧ снимают ингибирующее действие сульфатированных производных ХТ в тесте синцитиеобразования. Мы полагаем, что механизмы подавления ВИЧ-инфекции препаратами ХТ и пептидами из VI домена С04 имеют общую стадию — электростатическое взаимодействие с положительно заряженными аминокислотами в 1Ч-конценой зоне УЗ др120.

Таблица 14. Оценка терапевтического индекса сульфатированных производных хитозана, декстрансульфата и А2Т.

Препарат ЭД50, мкг/мл ТД50, мкг/мл ТД50/ЭД50

РЭ 8000 3,6 5 000 1 389

А1Т 0,03 50 1 667

ХТ-У1 0,5 >5 000 >10 000

ХТЛ/ 0,9 4 900 5 444

ХТ-УП 0,22 >5 000 >22 727

ХТ-УШ 0,12 >5 000 >41 667

ЭД5о - концентрация вещества, подавляющая репликацию вируса в клетках Н9 на

50%.

ТД50 - концентрация вещества, вызывающая снижение жизнеспособности клеток Н9 на 50%.

Терапевтический индекс определялся отношением ТД50/ЭД5о.

Хитозансульфаты могут стать основой для разработки перспективных микробицидов - гелевых и мазевых композиций, блокирующих половую передачу ВИЧ.

выводы

1. Выделено и изучено 100 отечественных изолятов ВИЧ-1. Охарактеризованы субтипы (генотипы/серотипы/иммунотипы) и биологические свойства (скорость репродукции, синцитеобразующая активность, тропизм, спектр корецепторов, чувствительность к АЗТ). Обнаружена гетерогенность в кинетике репликации и репродуктивной активности вирусных изолятов.

Показано, что на ранних стадиях острой ВИЧ-инфекции in vitro происходит увеличение дегидрогеназной активности клеток, причем r/h варианты ВИЧ индуцируют больший сдвиг, чем s/l - вирусы.

2. Впервые описан дефект системы комплемента у ВИЧ-инфицированных и больных СПИДом.

3. Главной особенностью ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД в России (бывшем СССР) является множественные и независимые проникновения различных субтипов ВИЧ. Концентрированная стадия эпидемии в России характеризуется преобладающей циркуляцией вирусов субтипа А с высокой степенью генетической гомогенности.

4. Для локальных очагов эпидемии ВИЧ/СПИД данные серотипирования коррелируют с результатами генотипирования. Исследовано влияние физико-химических свойств трипептидов, фланкирующих центральный тетрапептид V3 др120 ВИЧ, на характер взаимодействия с ВИЧ-позитивными сыворотками. Предложена модель функционирования V3 петли др120 ВИЧ-1.

5. Впервые показано, что пептиды из др41 специфически подавляют ВИЧ-инфекцию, а степень подавления зависит от аминокислотной последовательности и наличия свободного N-конца молекулы пептида, а также от природы, заряда и пространственной организации носителя.

Показано, что пептидный фрагмент из С-конца V1 домена CD4 обладает ВИЧ ингибирующей активностью, обусловленной специфическим (электростатическим) взаимодействием cV3gp120.

6. Установлена роль интегриновых рецепторов в проникновении ВИЧ. Обнаружено, что аллостерический ингибитор интегриновых рецепторов -аджоен - способен подавлять образование ВИЧ-индуцированных синцитиев и продукцию вирусных антигенов.

7. Впервые обнаружено, что тепловой шок приводит к усилению репликации ВИЧ, при этом ВИЧ не индуцирует de novo синтеза БТШ, но сопровождается

усилением синтеза некоторых клеточных белков. Впервые показано, что тепловой шок приводит к амплификации провирусной ДНК.

8. Получены уникальные клоны СЕМ-К перевиваемой Т-клеточной линии СЕМ с гиперэкспрессией СР95 и пониженной экспрессией С04, устойчивые к заражению ВИЧ. Вирусы трансфектанты не приобретают новый фенотип и остаются тропными к СР4+ клеткам.

9. Изучено ингибирующее действие отечественных 3'-(5Р-тетразолил)тимидинов и 2',3'- дидезоксинуклеозидов, их 5'-фосфитов и 5'-фосфитов 3'-азидо-2',3'-дидезоксинуклеозидов на репродукцию ВИЧ. Выявлено, что применение суммы фосфитов всех четырех 3'-азидо-2',3'- дидезоксинуклеозидов приводит к снижению цитотоксического эффекта. Впервые обнаружена анти-ВИЧ активность транс-дигидроксипиперидинов; исследована анти-ВИЧ активность природных и полусинтетических соединений на основе хитозанов и гуминовых кислот.

10. Предложена оригинальная кандидатная анти-ВИЧ вакцина на основе конъюгата химерного белка ВИЧ-1 гес(24-41) с полиоксидонием, индуцирующая у иммунизированных животных сильный иммунопролиферативный ответ и образование нейтрализационных антител.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Карамов Э.В., Сидорович И Г., Николаева И А Микробициды - новое направление в борьбе с ВИЧ-инфекцией// Сб. трудов "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии , Москва, 2002, т. 1,432-440

2. Карамов Э.В., Корнилаева Г.В., Павлова ТВ, Тургиев А.С, Козлов АП, Сидорович ИГ., Хаитов Р.М. Биологические свойства российских изолятов ВИЧ-1 и молекулярно-эпидемиологический мониторгинг ВИЧ-инфекции на территории России и сопредельных стран //Аллергия, Астма и Клиническая иммунология , 2001., 5., 6-11.

3. Karamov E.V., Yaroslavtseva N.G, Shchelkanov M.Yu, Martovitski D.V., Lukashov V.V., Kozlov A P., Papuashvili M N., Goudsmit J , and Khaitov R.M. Antigenic and genetic relations between différent HIV-I sybtypes in Russia Immunology and Infectious Diseases, 1996, V6, p. 15-24.

4. Карамов Э В., Корнилаева Г В., Резцова В В , Беркович A M , Филов В А , Антивирусная активность олипифата и его фракций на модели ВИЧ-инфекции. В книге: «Опыт доклинического исследования на примере Олипифата», Ника, Ст.-Петербург, 2002, стр. 185198.

5. Карамов Э.В., Лукашов В.В. «Резистентность к азидотимидину при инфекции вируса иммунодефицита человека». Молекулярная биология, 1994, N1, стр.7-20.

6. Карамов Э.В., Лукашов В.В, Тарусова H В, Корнилаева Г.В., Родова MA, Куханова M К, Краевский А А. Подавление вируса иммунодефицита человека в культуре клеток 5'-фосфитами 3'-азидо-2', З'-дидезоксинуклеозидов. II Молекулярная биология, 1990, т. 24, №6, с. 1695-1701.

7. Карамов Э.В , Лукашов В В . Горбачёва А П , Макарова Т.В., Корнилаева Г.В., Тарусова H Б , Куханова М.К., Краевский А А. Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека в культуре клеток 5'-фосфитами 2',З'-дидезоксинуклеозидов Молекулярная биология, 1992, т26, N1, стр. 201-207.

8 КарамовЭВ, Сахурия И.Б , Щелканов М Ю., БуруноваВ.В, Ярославцева Н.Г., ПавловаТ.В , Корнилаева Г. В. Новые подходы к химиотерапии ВИЧ-инфекции //ЖМЭИ. - 1999, №1, с. 84-86.

9. Карамов Э В., Щелканов М Ю„ Юдин А Н , Горбачёва А П , Бурунова В В., Славский А.А , Лукашов В В., Ярославцева H Г. Молекулярно-эпидемиологические особенности вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди внутривенных наркоманов на территории бывшего СССР//ЖМЭИ -1999, №1, с.:39-41.

10. Щелканов М Ю , Сахурия И.Б, Бурунова В В, Пашкова Т А, Абэлян А В , Павлова Т В , Корнилаева Г.В , Карамов Э В. Дегидрогеназная активность ВИЧ-инфицированных клеток при анализе результатов МТТ-теста // Иммунология - 1999 - N 1, с. 37-41.

11. Щелканов М.Ю., Еремин В.Ф., Сахурия И Б , Бурунова В В , Павлова Т.В , Корнилаева Г.В , Карамов Э В. Дегидрогеназная активность инфицированных клеток и биологические свойства различных вариантов ВИЧ-1. Биохимия, 1999, 4,431-6.

12. Щелканов М.Ю., Пашкова T.A., Сахурия И Б, Папуашвили М.Н., Карамов Э.В. Анализ биологических характеристик первичных изолятов ВИЧ-1 с помощью метода главных компонент//Вопросы вирусологии -1998 - N3 -С. 117-121.

13. ПашковаТА, Ярославцева H.Г., Щелканов М Ю., Папуашвили М Н , Сахурия И Б , Корнилаева Г.В., Карамов Э В. Биологические свойства первичных изолятов ВИЧ-1 различных серотипов II Вопросы вирусологии. -1998 , 6 , 256-261.

14. Shchelkanov М Yu , Yudin A.N., Antonov A.V , Stankov N.S., Vedenov A.A., Karamov E V. Variability Analysis of HIV-1 gp120 V3 Region- I. Point Estimators for the Amino Acid Distribution Characteristics II J. Biomol. Struct. Dyn -1997. - V. 15. - N 2. - P. 217-229.

15. Shchelkanov M.Yu., YudiriAN., Antonov A. V., SoinovL.A., ZaluninV.V., Vedenov AA, Karamov E.V. Variability Analysis of HIV-1 gp120 V3 Region: II. Hierarchy of taxons//J. Biomol Struct Dyn - 1997 - V. 15. - N 2. - P. 231-241.

16. Козлов А П., Емельянов А В , Веревочкин С В , Карамов Э В. «Закономерности ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД». Рус. Журнал "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы 1997, т.1, №1, 528

17. Shchelkanov M.Yu , StarikovNS, Yaroslavtcev I.V., Yudin AN, Antonov A. V., Novak I L„ Vedenov A A , Karamov E.V. Variability Analysis of HIV-1 gp120 V3 Region- III Distinctions between various sets of peptide fragments derived from the sequences belonging to different HIV-1 taxons // J. Biomol Struct Dyn. - 1997. - V. 15. - N 3. - P. 537-546.

18. Shchelkanov M.Yu, StankovNS, Yaroslavtcev I.V., Tsvetkov P.O., Yudin AN, DenisovMV, SlavskyAA, VedenovAA, Karamov E.V. Variability analysis of HIV-1 gp120 V3 region-IV. Distribution functions for intra- and inter-subtype amino acid Hamming distances//J. Biomol. Struct. Dyn. - 1998. - V. 15. - N 5. - P. 877-885.

19. Shchelkanov M.Yu., Soinov L.A, Zalunin V.V, Gumennyi D A., Yudin A N.. Natan A.A., Kireev V.B , Karamov E.V. One-parameter discrete model of the genetic diversity II J. Biomol. Struct. Dyn. -1998. -V. 15.-N 5.-P. 887-894.

20. Shchelkanov M.Yu., SoinovL.A., Zalunin VV, Stankov N.S , Natan AA, Kireev V.B, Karamov E.V. Dependencies of Substitution Steps Number on Hamming Distance are Identical for One-parameter Discrete Models of Both Direct and Parallel Genetic Diversity//J. Biomol. Struct Dyn. -1998. -V.16.-N.1... - P.133-138.

21. Карамов Э.В., Лукашов B.B., Корнилаева Г.В, Павлова Т.В, Тургиев А.С, Козлов А П Биологические свойства российских изолятов ВИЧ-1 и молекулярно-эпидемиологический мониторгинг ВИЧ-инфекции на территории России и сопредельных стран II Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы , 2001, V.5, №2, р. 55-59.

22 Щелканов М Ю , Ярославцева Н Г, Юдин А Н , Еремин В.Ф., Пыжова Н С., Семилетов Ю А, Абэлян АВ, Титов Л П., КарамовЭВ Анализ иммунологической гетерогенности ВИЧ-1-I «Аргинин-глутаминовый триггер» в четвертой позиции верхушечного тетрапептида УЗ-петли др120//Молекулярная биология -1998 -T32.-N4.-C 717-728.

23. Щелканов М Ю., Ярославцева Н.Г., Юдин А Н , Ерёмин В Ф., Пыжова Н С., Семилетов Ю А, Абэлян А В., Титов Л.П., КарамовЭВ Анализ иммунологической гетерогенности ВИЧ-1: II. Влияние свойств аминокислотных остатков, фланкирующих С-конец верхушечного тетрапептида УЗ-петли gp120 II Молекулярная биология. - 1998. -Т.32- N 4. - С. 729-734

24. Щелканов М.Ю., Ярославцева Н Г, ЕмельяновАВ, Сахурия И Б., Абэлян А В , Верёвочкин С В., Козлов А П , Карамов Э В Модель функционирования верхушечного эпитопа УЗ-петли gp120 ВИЧ-1 в составе комплекса с антителами//Молекулярная биология. - 1998, том 32., 6., 1062-1074.

25 Lukashov V.V., Cornelissen М.Т.Е., Goudsmit J , Papuashvilli M.N., Rytik P.G., Khaitov R.M, Karamov E.V. and De Wolf F. Simultaneous introduction of distinct HIV-1 subtypes into different risk groups in Russia, Byelorussia and Lithuania. AIDS, 1995, v.9, p 435-439

26. Щелканов М Ю., Ярославцева Н Г., Юдин А Н, Мирсков Ю.А, Ерёмин В.Ф., Титов Л.П., Рытик П.Г., Карамов Э.В. Анализ серологических свойств ВИЧ-1 из очага эпидемии в Гомельской области Белоруссии (1996 г.) II Вопросы вирусологии. -1998. - N 5, с. 220-229

27. Щелканов М.Ю., Ярославцева Н.Г., Набатов А А., Машарский А.Э., Юдин А Н , Мирсков Ю А, Ченцова Н.П., Кобыща Ю.В., Козлов А П , Карамов Э.В. Серотипическая стратификация ВИЧ-1 в популяции внутривенных наркоманов на юге\юго-востоке Украины // Вопросы вирусологии. -1998. -T.43-N 4.-С.176-182.

28. Lukashov V., Karamov Е„ Eremin V., Titov L , Goudsmit J. "Extreme founder effect in an HIV type 1 subtype A epidemic among drug users in Svetlogorsk, Belarus." / AIDS RESERCH and human retroviruses, 1998, V. 14, N 14,1299-1303

29. Щелканов M Ю„ Сойнов Л.А., Залунин В В . Славский А А, Сахурия И.Б., Бурунова В.В , Ярославцева Н Г., Карамов Э.В, Хаитов Р М. Определение дистантности спектров иммунореакгивности при серотипировании ВИЧ II Иммунология. -1999. - N 1, с 35-37.

30. Щелканов М Ю., ЮдинА.Н, Ерёмин В.Ф , Гадынская Н И , Ярославцева Н Г., Карамов Э.В. Увеличение серотипической гетерогенности ВИЧ-1 в Светлогорском очаге (1996) через год после начала вспышки эпидемии II Вопросы вирусологии , 1999, 4,174-177.

31. Ярославцева Н Г., Лукашов В В, Папуашвили М Н , Прокопенко В Д, Хаитов Р М , Карамов Э В. \/3-серотипы ВИЧ-1, представленные на территории России. Иммунология, 1996, N3, стр. 17-21.

32. Щелканов М.Ю., Ярославцева Н Г., Юдин А Н , Бурунова В В., Горбачева А П , Славский А А, Ольшанский А.Я., Голиков В А, Карамов Э.В Серотипический профиль эпидемии ВИЧ-1 в Москве II Вопросы вирусологии. -1999, №5, с 224-229.

33. Щелканов М.Ю., ЮдинА.Н., Бурунова В В , Горбачёва А.П., Славский А.А, Папуашвили М Н , Ярославцева Н.Г., Сидорович И Г., Османов С., Хаитов P.M., Карамов Э В. Циркуляция вариантов ВИЧ-1 серотипа А/С в популяции наркоманов Твери, применяющих наркотики внутривенно // Иммунология - 1999. - N 1, с. 30-35

34. Ярославцева Н.Г., ЩелкановМЮ., ЮдинА.Н., Наврузбеков ГА, СемилетовЮА, Карамов Э.В. Влияние аминокислотных замен в последовательности УЗ-петли GP120 на серологическую кросс-реактивность между различными субтипами ВИЧ-1. Молекулярная биология, 1997, т.31, N2, стр.338-343.

35. Слепушкин В А, Меликян Г.Б., Сидорова М В , Корнилаева Г.В., Чумаков В.М , Азьмуко А.А, Андреев С.М , Калмансон А.Э., Карамов Э.В Взаимодействие пептидов, соответствующих N-концевым участкам легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа (НА-2) и трансмембранного гликопротеина вируса иммунодефицита человека (др 41), с искусственными и естественными липидными мембранами. II Биологические мембраны , 1990, том 7, №3, с. 261-272.

36 Slepushkin V.A., Melikyan G В, Sidorova M.V., Chumakov V.M , Andreev S M, Manukyan R A , Karamov E.V. Interaction of human immunodeficiency virus (HIV-1) fusion peptides with artificial lipid membranes. // Biochem Biophys. Res. Commun , 1990,172, 952-957.

37. Андреев С M., Мещерякова Д В, Азьмуко А А, Корнилаева Г.В, Карамов Э.В. и др II Синтетические фрагменты CD4 рецептора' блокирование HIV-инфекции in vitro. // Иммунология, 1991,5, 15-18.

38. Slepushkin V.A., Andreev S M , Sidorova M.V., Melikyan G.B, Grigoriev V.B., Chumakov V.M , Gnnfeld A E, Manuakyan R.A., Karamov E.V Investigation of human immunodeficiency virus fusion peptides. Analysis of interrelations between their structure and function. AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1992, V.8, p 9-18.

39. Татаринцев A.B , Вржещ П В., Ершов Д Е., Щеголев А А., Тургиев А.С, Карамов Е.В, Корнилаева ГВ, Макарова Т.В., Фёдоров НА, Варфоломеев СД Блокирование аджоеном интегрин опосредованных процессов в системе ВИЧ-инфицированных клеток. Вестник РАМН, 1992, N11-12, стр.6-10

40. Tatarintsev A.V., Vrgeshch'P.V., Schegolev АА, Yershov D Е., Turgiev AS., Varfolomeyev S.D., Kormlayeva G.V., Makarova T.V., Karamov E.V. Ajoene antagonizes integrin-dependent processes in HIV-infected T-lymphoblasts. AIDS, 1992, V.6, N10, p.1215-1217.

41. Slepushkin V.A, Kornilayeva G.V., Andreev S.M , Sidorova M.V., Petrukhina А О, Matsevich G.R., Raduk S.V., Grigoriev V.B., Makarova T.V., Lukashov V.V., Karamov E.V. Inhibition of Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) Penetration into Target Cells by Synthetic Peptides mimicking the N-terminus of the Transmembrane Glycoprotein Virology, 1993, V.194, p 3-11.

42. Mesheryakova D.V., Andreev S M., Tarasov S.M , Sidorova M.V., Vafina M.V., Kornilayeva G.V., Karamov E.V., Khaitov R.M. CD4-denved peptide and sulphated polysaccharides have similar mechanism of anti-HIV activity based on electrostatic interaction with positively charged gp120 fragments. Molecular Immunology, 1993, V.30, N11, p993-1001.

43. Мещерякова Д., Андреев С М , Тарасова С О , Сидорова М.В., Вафина М.Г., Корнилаева Г.В., Хаитов P.M., Карамоа Э.В. "Механизм анти-ВИЧ активности сульфатированных полисахаридов и пептидных фрагментов из Dl-домена молекулы CD4." Иммунология, 1993, N3, стр.9-15.

44. Грибкова Н В , Еремин В.Ф , Вотяков В И , Щелканов М.Ю., Пашкова Т.А , Карамов Э В. Подавление репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) цитокиноподобным антивирусным фактором. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1996, N5, стр 27-29.

45. Tarussova N В., Kukhanova М.К., Krayevski А А, Karamov E.V., Lukashov V.V., Komilayeva G.V., Rodina M.A., Galegov G A Inhibition of human immunodeficiency virus (HIV) production by 5'-hydrogenphosphonates of 3'-azido-2', З'-dideoxynucleosides // Nucleosides and Nucleotides , 1991, v. 10, N 1-3, p. 351-354.

46. Krayevski A A., Tarussova N.B , Kukhanova M К, Balzarini J , DeClercq E , Karamov E V., Lukashov V.V. Investigation of DNA biosynthesis catalyzed by DNA polymerases: approach of synthesis of compounds with anti-HIV activity. // Nucleic Acids Symp. Ser., 1991.; 24:13-16.

47.Корнилаева Г.В, МакароваТВ, Гамза-заде А И., Скляр А М , Насибов С М., Карамов С М «Сульфатированные производные хитозана как ингибиторы ВИЧ-инфекции.» Иммунология, 1994, N2, стр.6-12.

48.Сидорович И Г., Николаева И А , Шевалье А Ф , Игнатьева Г А, Карамов Э В , Хаитов P.M. Проблемы и перспективы разработки вакцины против ВИЧ/СПИДА. II Аллергия, Астма и Клиническая иммунология , 2001., 5, 3-5

49.Biberfield G , Deinhardt F., Habermehl К., Karamov E, et al Report on WHO informational discussion on AIDS Vaccine development, immunological and virological evaluation of vaccines and standardization of procedures II WHO, Geneva, 1987, p. 1-11.

50.McGowan J., Schield G„ Esparza J., Karamov E. Report of informal discussion on the "WHO AIDS Reagent project" II WHO, Geneva, 1988, p 1-8

51.Arthur L, Desrosiers R., Esparza J , Karamov E , et al Report of a WHO informal consultation on animal models for HIV infection and AIDS //WHO, Geneva, 1988, p 1-28

52. Esparza J. and Karamov E. Meeting report WHO consultation on animal models for HIV infection and AIDS //AIDS, 1988, V.2., p. 223-225.

53. Duncan J., Simon F., Ho D., Karamov E, Khaitov R , et al. Report of WHO workshop on synthetic peptides in HIV diagnostics and AIDS related research//AIDS, 1991., V. 5., p. WH01-WH09.

54. Anderson R., Barre-Sinousi F., Bradoc J., Burke D., Essex M., Fenyo E-M., Karamov E, F. McCutchan et al. Implications of HIV variability for transmission: scientific and policy issues II AIDS, 1997., 11., UNAIDS1-UNAIDS15.

Список основных тезисов международных научных конференций, опубликованных по теме

диссертации.

1. Karamov Е. Molecular mechanism of HIV replication and several approaches to anti-HIV treatment// Int. conf on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok, 1-5 July 1991, p 17.

2. Karamov E V., Komilayeva G.V., Makarova T.V., Tatanntsev A.V., Vrzheshch P., Schegolev A., Yershov D., Fedorov N., Turgiev A. Cytotoxic effect of ajoene on neoplastic T-cells is possibly related to ifs action on integnns. J. of Cellular Biochemistry, 1992, V.3, p.168

3. Karamov E.V. Molecular mechanism of HIV cell entry. Abstract Book of 2-nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", 1993, St.-Petersburg, Russia, November 29 - December 3, p.12.

4. Lukashov V V., Cornelissen M T E., Papuashvili M N , Karamov E.V., Goudsmit J., de Wolf F. Genetic and antigenic variability of V3-loop of the human immunodeficiency virus type 1 in patients from Russia. Abstract Book of 2-nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", 1993, St -Petersburg, Russia, November 29 - December 3, p.14.

5. Karamov E.V. Genotyping Variation of HIV-1: implication for therapy. Abstract Book of International Conference "Baltic Against AIDS",1994, St.-Petersburg, Russia, March 1-4, p.14.

6. Karamov E.V. Natural history of HIV infection in the former USSR. Joint meeting "Progress in clinical virology", 1995, Prague, Czech Republic 10-14 September, p 21 (S2/14).

7. Karamov E.V., Lukashov V.V., Yaroslavtseva N G , Chaplinskas S , Eremin V., Rytik P., Papuashvili M, Khaitov R. Molecular history of HIV-infection in the ex-USSR. Abstract Book of 3-nd International Conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", 1995, St.-Petersburg, Russia, May 22-26, p 27.

8 Karamov E.V., Yaroslavtseva N.G , Lukashov V.V., Rytik P G , Kozlov A P., Shchelkanov M Yu , Martovitski D.V., Eremin V.F., Chaplinskas S A Natural history of HIV-infection in the former USSR. XI-th International Congress on AIDS, 1996, Vancouver, July 7-12, v.1, TuB2245, p 307.

9 Karamov E, Yaroslavtseva N G., Shchelkanov M , Yudin A , Lukashov V, Eremin V, Rytic P, Kozlov A , Chaplinskas S A, Goudsmit J. Natural history of HIV-infection in the former USSR. 2-nd Europian Conference on Expenmental AIDS Research, Stockholm, Sweden, May 31-June 3,1997, 65-P1.

10. Karamov E., Shchelkanov M.Yu , Yaroslavtseva N G , Verevochkin S.V., Kozlov A P., Eremin VPh, Titov L.P. Sera- and genotyping of HIV-1 variants circulating on the territory of the former USSR II In Abstract Book of 12-th World AIDS Conference, 1998, June 28 - July 3,Geneva, Switzerland -Geneva, 1998. - P. 126 (N 13205).

11. Karamov E, Kornilayeva G., Pavlova Т., Turgiev A, Ulmasov K. Heat shock-induced replicative transposition of proviral HIV-1 DNA. In- Abstract Book of 13-th World AIDS Conference, 2000, Durban. [MoPeA2025J.

12. Karamov E. HIV-AIDS epidemic in the former Soviet Union (FSU): a virologist's view. // 16th IUSTI European Congress 2000 on STDs and AIDS.- Sept 3-5 - 2000 - Budapest - Hungary.- p. 104.

13. Karamov E, Kornilayeva G , Pavlova Т., Turgiev A, Kozlov A Biological properties of Russian HIV-1 isolates 5-th Europian Conference on Experimental AIDS Research, Madrid, Spain, 16-19 June, 2000, P8.

14. Карамов Э В., Шуйская M , Корнилаева Г.В , Черняк Б В .Теплова В В Исследование влияния ВИЧ-1 на развитие апоптоза в клеточных линиях Jurkat и Jurkat-Bcl-xL. Материалы 8-ой Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», 19-24 мая 2000г., Санкт-Петербург, Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, T.4; Ns 1; с 62.

15. Корнилаева Г.В., Шуйская М А, Карамов Э В Кросс-резистентность AZT-устойчивых штаммов ВИЧ-1 к фосфазиду. Материалы 8-ой Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», 19-24 мая 2000г., Санкт-Петербург, Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, T.4; Ns 1; с.74.

16 Карамов Э.В., Корнилаева Г.В, Павлова T В, Тургиев А.С. Механизмы амплификации проаирусной ДНК и усиления репликации ВИЧ-1 в условиях теплового шока. Материалы 9-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», 27 мая-1 июня 2001 г, Санкт-Петербург, Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, Т.5; № 1; с.10.

17. Карамов Э.В , Чередникова T.B, Адохина Л И., Жердева А И., Ольховский И.А. Молекулярно-эпидемиологический мониторинг ВИЧ-инфекции на территории России и Украины. Материалы 9-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», 27 мая-1 июня 2001 г, Санкт-Петербург, Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, Т.5; № 1; с 11.

18 Карамов Э.В, Корнилаева Г.В , Филов В А, Бланко Ф Ф., Беркович А.М Исследование анти-ВИЧ свойств олипифата. Материалы 9-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы», 27 мая-1 июня 2001 г, Санкт-Петербург, Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, T 5; Ns 1; с 89

19 Карамов Э В , Корнилаева Г.В , Павлова T В Получение клонов T-клеток человека, устойчивых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека II Международный симпозиум «Биология клетки в культуре», Санкт-Петербург, Россия, 16-18 октября 2001 года, Цитология, 2001, том 43, №9, стр. 861.

20. Karamov Е., Turgiev А, Pavlova Т., Kornilayeva G. Towards the development of the Russia human immunodeficiency virus (HIV) vaccine. 5-th Int Forum on Global Vaccinolgy, 15-16 Oct. 2001, Minsk, Belarus, p.19, PS2-5.

21. Karamov E., Blokhina N, Malyshev N, Mobarhan A., Kornilayeva G., Pavlova Т., Turgiev A, Cherednikova T. Hepatites infection markers HIV infected individuals. 5-th Int. Forum on Global Vaccinology, 15-16 Oct. 2001, Minsk, Belarus, p 43, P17.

22. Карамов Э.В. Микробициды - новые подходы к борьбе с ВИЧ/СПИД. 10-я Международная конференция «СПИД, рак и родственные проблемы», 26 мая-31 мая 2002 г, Санкт-Петербург, Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, T.6; № 1; с 60.

23 Карамов Э.В, Корнилаева Г.В., Филов В А., Беркович AM. Изучение механизма действия Олипифата - ингибитора ВИЧ-инфекции (in vitro) 10-я Международная конференция «СПИД, рак и родственные проблемы», 26 мая-31 мая 2002 г, Санкт-Петербург, Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, Т.6, № 1, с 81.

24. E.V. Karamov, G V. Kornilaeva, T.V. Pavlova, A S Turgiev, K. Nelson Molecular Epidemiology of HIV-1 Infection in Russia II XIV International AIDS Conference 2002, July 7-12, Barcelona, Spain, [TuPeC4791]

25. Карамов Э.В, Корнилаева Г.В, Павлова Т В, Сидорович И.Г., Хаитов Р.М, Салихов Ш.И..Микробициды-новые подходы к борьбе с ВИЧ/СПИД // Респ конф «Медико-социальные проблемы ВИЧ-инфекции, парентеральных вирусных гепатитов и инфекции, передаваемых половым путем г. Минск, Белоруссия 27-18 ноября 2002 г. стр 66.

Патенты.

1. Островский В А., Иванова Н В., Хохрякова Н Р , Поплавский В С., Студенов Е.П., Гулевский С.Г., Малин А А., Карамов Э В., Пашкова Т А Патент на изобретение №2124020 3'-(5R-TeTpa3on-2-ил)тимидины, проявляющие антивирусную активность, и способ из получения. Зарегистрирован: г. Москва, 27 декабря 1998 года

2. Руднева И.А, Карамов Э.В., Гочакова T.A, Черных А.И., Мамаева О.А, Плясунова О А, Покровский А Г. Патент на изобретение №1554370 Штамм перевиваемых клеток моноцитов человека - продуцент вируса иммунодефицита человека I типа. Зарегистрирован г. Москва, 19 марта 1993 года.

i

I

3. Карамов ЭВ., Филов В А, Корнилаева Г В , Петухов Д.В , Пинчук Б.Т., Резцова В В. Патент на изобретение №2172345 Способ подавления репродукции вируса иммунодефицита человека. Зарегистрирован: г. Москва 20 августа 2001 года

4. Карамов ЭВ., Пашкова Т.А., Ревазова Е.С., Барышников А Ю , Руднева И.А., Кущ А А., Гущина ЕА., Корнилаева Г.В. Патент на изобретение №2102477 Штамм перевиваемых клеток человека СЕМ-К, устойчивый к ВИЧ-инфекции. Зарегистрирован, г. Москва 20 января 1998

5. Пахомов В.И , Соколов А Е., Карамов Э В , Костюнин В И., Корнилаева Г.В , Пашкова Т А , Щелканов М.Ю. Патент на изобретение №2084212 Способ повышения резистентности клеток к патогенному действию вируса иммунодефицита человека и подавление его репродукции. Зарегистрирован' г. Москва 20 июля 1997 года

6. Гришина Г.В., Карамов ЭВ., Корнилаева ГВ, Зефиров Н.С., Чумаков Т.И. Патент на изобретение №2198658 Способ подавления репродукции вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1). Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ г. Москва, 20 февраля 2003 года.

к

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

Заказ 158 Тираж 100 экз.

Р133 12

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Карамов, Эдуард Владимирович

Часть I. Общая характеристика работы.

1.1 Актуальность проблемы

1.2 Цели и задачи исследования.

1.3 Научная новизна работы.

1.4 Основные положения, выносимые на защиту.

1.5 Практическая ценность.

1.6 Личный вклад соискателя.

1.7 Апробация работы. 15 Часть И. Обзор литературы. Общие сведения о молекулярной биологии ретровирусов.

1. Геномная организация ретровирусов на примере ВИЧ-1.

2. Организация вириона.

3. Жизненный цикл ВИЧ-1.

3.1. Проникновение в клетку

3.2. Репликация.

3.3. Морфогенез и рилизинг.

4. Антигенная и генетическая вариабельность ВИЧ.

5. Биологические свойства ВИЧ.

6. Механизмы слияния оболочки ВИЧ с клеточной цитоплазматической мембраной (фузия).

7. Резистентность к азидотимидину при инфекции вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). щ 8. Проблемы и перспективы разработки вакцины против ВИЧ/СПИДа. 88 9. Разработка микробицидных препаратов. Микробициды - новое направление в борьбе с ВИЧ-инфекцией. 92 Часть III. Собственные исследования.

Глава 1. Материалы и методы. 96 1. Биологические свойства первичных изолятов ВИЧ-1 различных серотипов.

1.1 Пациенты.

1.2 Клеточные линии.

1.3 Мононуклеары периферической крови (МПК) здоровых доноров

1.4 Изоляция вирусных вариантов

1.5 Изоляты и штаммы ВИЧ-1.

1.6 Определение числа жизнеспособных клеток с помощью 1) МТТ-теста и 2) исключающего витального красителя трипанового синего

1.7 Определение биологического фенотипа изолятов ВИЧ-1.

1.7.1 Заражение МПК

1.7.2 Заражение клеток линий Н9, МТ-4, СЕМ, CEM-SS, Sup Т1 и ТНР

1.7.3 Заражение индикаторных монослойных клеточных линий U373.CD4.

1.7.4 МТ-2-тест.

1.7.5 Испытание антивирусной активности AZT.

1.8 Детекция антигенов ВИЧ-1 в культуральных супернатантах и плазме крови ВИЧ-инфицированных пациентов.

1.8.1 Иммуноферментный анализ.

1.8.2 Определение TCID50. 102 ^ 1.8.3 Обратнотранскриптазная реакция (OTP).

1.8.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR).

1.8.5 Реакция непрямой иммунофлюоресценции (НИФ). 104 ф 1.9 Определение серотипа ВИЧ-1.

2. Изучение биологических свойств первичных изолятов ВИЧ-1: взаимосвязь между спектром клеточного тропизма, характером цитопатологии и клиническими особенностями течения инфекции.

3. Изучение дегидрогеназной активности инфицированных клеток и биологических свойств различных вариантов ВИЧ-1.

3.1 Клеточные линии

3.2 Определение 50%-ной инфекционной дозы (TCID50; 50% Tissue Culture Infectious Dose

3.3 Изоляты и штаммы

3.4 Определение концентрации корового антигена р24 ВИЧ

3.5 Измерение активности обратной транскриптазы

3.6 МТТ-метод

3.7 Изменение дегидрогеназной активности

3.8 Статистическая обработка.

4. Анализ биологических характеристик первичных изолятов ВИЧ-1 с помощью метода главных компонент.

5. Комплексная диагностика in vitro анти-ВИЧ эффективности AZT.

5.1 Пациенты.

5.2 Азидотимидин (AZT).

5.3 Определение цитотоксичности (CI; Cytotoxity Index) AZT

5.4 Определение анти-ВИЧ эффективности AZT (EI; AZT Efficiency

Index) на модели МПК пациента.

5.5 Определение AZT-чувствительности и индекса выживания клеток линии Н9, инфицированных первичными изолятами ВИЧ-1. Индекс выживания (VI; Viability Index) МПК.

5.6 МПК здоровых доноров

5.7 Изоляция ВИЧ.

5.8 Лимфобластоидная линия

6. Изучение расщепления СЗ-компонента комплемента в сыворотках пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД).

7. Изучение влияния аминокислотных замен в последовательности V3-петли gpl20 на антигенную кросс-реактивность между различными субтипами ВИЧ-1.

7.1 Сыворотки.

7.2 Синтетические пептиды.

7.3 Поликлональный сэндвич-ИФА для определения содержания вирусных антигенов.

7.4 ИФА на основе синтетических пептидов.

8. Изучение антигенной и генетической вариабельности ВИЧ-1.

8.1 Сыворотки

8.2 Синтетические пептиды

8.3 Конкурентный ИФА на основе синтетических пептидов.

8.4 Обработка результатов.

8.5 Иерархический кластер-анализ.

8.6 Многомерное шкалирование.

8.7 Метод главных компонент.

8.8 Двумерная ординация.

8.9 Вычисления 122 Ф 8.10 Генотипирование.

9. Изучение механизмов проникновения ВИЧ в клетку-мишень.

9.1 Синтетические пептиды. ф 9.2 Липидные бислои.

9.3 Липосомы.

9.4 Слияние липосом

9.5 Клеточные культуры

9.6 Вирус.

9.7 Определение ТСГО

9.8 Изучение цитотоксических свойств.

9.9 Тест синцитиеобразования.

9.10 Испытание антивирусной активности

9.11 Испытание действия конъюгатов пептида фузии

9.12 Исследование взаимодействия ВИЧ с клеткой.

9.13 Обратнотранскриптазная реакция.

9.14 Получение пептидных антисывороток.

9.15 Электронно-микроскопическое исследование препаратов пептида.

9.16 Твердофазный иммуноферментный анализ (непрямой вариант)

10. Изучение механизмов модуляции ВИЧ-инфекции при тепловом шоке.

10.1 Условия индукции теплового шока.

10.2 Двумерный электрофорез

11. СЕМ-К - клоны лимфобластоидных клеток человек, устойчивые к ВИЧ-1.

11.1 Получение клонов.

11.2 Электронно-микроскопическое исследование клеток СЕМ-К.

11.3 Проведение цитогенетического анализа.

11.4 Получение ДНК-зонда для выявления гена рецептора CD4.

11.5 Изучение экспрессии антигенов на поверхности клеток СЕМ-К.

11.6 Проведение трансфекции методом электропорации.

12. Ингибиторы различных стадий жизненного цикла ВИЧ.

12.1 Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека в культуре клеток 5'-фосфитами 2',3 - дидезоксинуклеозидов.

12.2 Сульфатированные производные хитозана (СПХ).

12.3 Аджоен.

12.4 Пиперидины.

12.5 Олипифат

12.6 Характеристика клеточных линий и условий культивирования.

12.7 Вирусы.

12.8 Изучение цитотоксических свойств.

12.9 Исследование антивирусной активности.

12.10 Тест синцитиеобразования.

12.11 Иммуноферментный анализ.

12.12 Метод рекластрирования

12.13 Определение активности обратной транскриптазы.

12.14 Титрование ТСШ

13. Изучение механизмов анти-HIV активности ряда сульфатированных полисахаридов и пептидных фрагментов из первого домена молекулы СД4.

13.1 Сыворотки.

13.2 Синтетические пептиды.

13.3 ИФА. (непрямой вариант). 141 (С 13.4 ИФ А (конкурентный вариант).

13.5 ИФА (снятое ингибирующего действия DS пептидами в растворе).

13.6 Модификация пептидов.

13.7 Тест синцитиеобразования

13.8 Иммунизация кроликов

14. Изучение иммунологических свойств сывороток макак, иммунизированных TBI (кандидатом для анти-ВИЧ вакцины).

14.1 TBI (Т- and B-cell epitopes containing immunogen)

14.2 Изучение иммуногенной активности белка TBI

14.3 Изучение иммунологических свойств сывороток обезьян

14.4 Исследование иммунореактивности сывороток обезьян, иммунизированных TBI

14.5 Изучение нейтрализационных свойств сывороток.

15. Исследование нейтрапизационной активности сывороток мышей, иммунизированных гес (24-41).

15.1 гес(24-41).

15.2 Исследование нейтрализующей активности иммунных сывороток

15.3 Иммуногенность рекомбинантных белков ВИЧ

15.4 Изучение специфической активности гес(24-41) в ИФА.

15.5 Изучение специфической активности гес(24-41) в иммуноблоте.

15.6 Иммуногенные свойства конъюгата рекомбинантного белка гес(24

41) с Полиоксидонием.

15.7 Изучение пролиферативной активности клеток животных, иммунизированных гес (24-41).

Глава 2. Результаты и обсуждение.

Раздел 1. Биологические свойства ВИЧ-1.

1. Биологические свойства изолятов вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1).

1.1 Природные (wild) изоляты ВИЧ-1 и их биологические свойства.

1.2 Изучение биологического фенотипа изолятов ВИЧ-1.

1.3 Биологические свойства первичных изолятов ВИЧ-1 различных серотипов.

1.4 Изучение чувствительности изолятов ВИЧ-1 к азидотимидину.

2. Изучение биологических особенностей in vitro первичных изолятов ВИЧ-1 субтипа А, циркулирующих среди внутривенных наркоманов на территории бывшего СССР.

3. Биологические свойства первичных изолятов ВИЧ-1: взаимосвязь между спектром клеточного тропизма, характером цитопатологии и клиническими особенностями течения инфекции.

4. Анализ биологических характеристик первичных изолятов ВИЧ-1 с помощью метода главных компонент. Подходы к классификации.

5. Биологические свойства первичных изолятов ВИЧ-1 на различных стадиях инфекции.

6. Дегидрогеназная активность инфицированных клеток и биологические свойства различных вариантов ВИЧ-1.

7. Изучение расщепления СЗ-компонента комплемента в сыворотках пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД).

7.1 Состояние отдельных компонентов комплемента у больных с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД).

7.2 Глубокое расщепление СЗ-компонента комплемента в сыворотках пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД).

0 13 Расщепление а-цепи человеческого СЗ с помощью рекомбинантной протеазы ВИЧ-1 (RPH) с образованием СЗа и C3d фрагментов.

8. Разработка экспериментально-клинической тест-системы для комплексной диагностики in vitro анти-ВИЧ эффективности AZT.

9. Анализ развития ВИЧ-инфекции по данным количественных определений вирусоспецифических ДНК и РНК.

9.1 Изучение репликации изолятов ВИЧ, обладающих AZT-устойчивым фенотипом.

9.2 Динамика изменения вирусологических и генетических маркеров репликативной активности ВИЧ в ходе терапии.

9.3 Анализ нуклеиновых кислот ВИЧ в ходе развития инфекции in vivo.

9.4 Изучение комплексности квазивидов ВИЧ-1 in vivo. 236 Раздел 2. Антигенная и генетическая вариабельность ВИЧ-1.

2.1 V3 -серотипы ВИЧ-1, представленные на территории России.

2.2 Изучение влияния аминокислотных замен в последовательности УЗ-петли gpl20 на антигенную кросс-реактивность между различными субтипами ВИЧ-1.

2.3 Серотипический профиль эпидемии ВИЧ-1 в Москве.

2.4 Изучение вариантов ВИЧ-1 серотипа А/С, циркулирующих популяции внутривенных наркоманов г. Тверь.

2.5 Серотипическая стратификация ВИЧ-1 в популяции внутривенных наркоманов на юге\юго-востоке Украины.

2.6 Анализ серологических свойств ВИЧ-1 из очага эпидемии в Гомельской области Белоруссии (1996 г.)

2.7 Нарастание серотипической гетерогенности ВИЧ-1 в

Светлогорском очаге (1996) через год после начала вспышки эпидемии.

2.8 Биологические свойства российских изолятов ВИЧ-1 и молекулярно-эпидемиологический мониторинг ВИЧ-инфекции на территории России и сопредельных стран.

2.9 Анализ иммунологической гетерогенности ВИЧ-1: «аргинин-глутаминовый триггер» в четвёртой позиции верхушечного тетрапептида V3 -петли gp120.

2.9.1 Иерархическая классификация коротких аминокислотных фрагментов, соответствующих использованным пептидам.

2.9.2 Иерархическая структура иммунореактивности в ИФА исследуемых сывороток по отношению к V3-имитирующим пептидам.

2.9.3 Многомерное шкалирование.

2.10 Анализ иммунологической гетерогенности ВИЧ-1: влияние свойств аминокислотных остатков, фланкирующих С-конец верхушечного тетрапептида УЗ-петли gp120.

2.10.1 Метод главных компонент.

2.10.2 Двумерная ординация.

2.11 Модель функционирования верхушечного эпитопа петли V3 gpl

ВИЧ-1 в составе комплекса с антителами

2.12 Соответствие рассматриваемой модели данным рентгеноструктурного анализа и известным закономерностям изменчивости V

2.13 Соответствие рассматриваемой модели экспериментальным данным.

2.14 Гипотеза о применимости рассматриваемой модели к механизму межбелковых взаимодействий при проникновении ВИЧ в клетку.

2.15. Применение модели для предсказания антигенных свойств V3имитирующих пептидов

Раздел 3. Механизмы проникновения ВИЧ в клетку-мишень.

1. Синтетические фрагменты СБ4-рецептора: блокирование ВИЧ-инфекции in vitro и иммунореактивность с сыворотками ВИЧ-инфицированных лиц.

2. Аджоен, как блокатор интегрин-зависимых процессов в системе клеток, инфицированных ВИЧ.

2.1 Изучение влияния аджоена на процессы слияния клеток на модели синцитиеобразования.

2.2 Изучение анти-ВИЧ активности Аджоена.

2.3 Исследование токсического действия аджоена на опухолевые клетки.

2.4 Обсуждение роли интегриновых рецепторов в процессе проникновения ВИЧ в клетку-мишень.

3. ВИЧ-1 gpl20 может блокировать адгезию, опосредованную CD2

LFA3.

4. Исследование пептидов фузии.

4.1 Взаимодействие пептидов, соответствующих N-концевым участкам легкой цепи гемагглютинина вируса гриппа (НАг) и трансмембранного гликопротеина вируса иммунодефицита человека (gp 41), с искусственными и естественными липидными мембранами.

4.2 Исследование пептидов фузии ВИЧ-1. Анализ взаимосвязи структуры и функции.

4.2.1 Изучение влияния пептидов на искусственные липидные мембраны.

4.2.2 Изучение действия синтетических пептидов фузии, соответствующих N-концевой области gp41 ВИЧ-1, на репликацию вируса. Анализ активности пептидов и их конъюгатов в тесте синцитиеобразования

4.2.3 Данные электронномикроскопического исследования и изучения иммунореактивности пептидов

4.2.4 Исследование влияния пептидов на репликацию ВИЧ 1(ELISА)

4.2.5 Обнаружение стадии жизненного цикла ВИЧ, являющейся мишенью для пептидов фузии gp

4.2.6 Обсуждение механизмов действия синтетических пептидов фузии, соответствующих N-концевой области gp

5. Суммарные данные позволили нам сформулировать оригинальную концепцию механизма проникновения ВИЧ в клетку

Раздел 4. Клеточные механизмы устойчивости к ВИЧ-инфекции.

1 Тепловой шок и вирус иммунодефицита человека.

2. Изучение механизмов амплификации провирусной ДНК и усиления репликации ВИЧ-1 в условиях теплового шока.

3. Индукция провируса в условиях теплового шока.

4. Исследование наличия антител против белков теплового шока в сыворотках ВИЧ-инфицированных пациентов.

5. СЕМ-К - клоны перевиваемой линии Т- клеток человека, устойчивые к ВИЧ-инфекции.

5.1 Получение клеточных клонов и их морфологическая характеристика.

5.2 Ретрансплантация опухоли СЕМ

5.3 Характеристика некоторых особенностей клеток СЕМ-К.

5.4 Изучение чувствительности клеток СЕМ-К к ВИЧ-1.

5.5. Изучение механизмов устойчивости клеточных клонов СЕМ-К к

ВИЧ-1 инфекции.

5.6 Изучение экспрессии антигенов на поверхности клеток СЕМ-К.

5.7 Цитогенетическое исследование клеток СЕМ-К.

5.8 Получение в клетках СЕМ-К вирусного потомства и изучение его свойств.

Раздел 5. Ингибиторы различных стадий жизненного цикла ВИЧ.

1. Изучение влияния производных природных нуклеозидов и их 5'фосфитов на репродукцию вируса иммунодефицита человека.

1.1 Разработка клеточной модели для скрининга ингибиторов репродукции ВИЧ.

1.2 Подавление репродукции ВИЧ 5'-фосфитами З'-азидо- 2',3'дидезоксинуклеозидов.

1.3 Изучение действия 2',3'-дидезоксинуклеозидов и их 5-фосфитов на репродукцию ВИЧ.

1.4 3'-(5-11-тетразол-2-ил)тимидины, проявляющие антивирусную активность.

2. Исследование репликации ВИЧ-1 in vitro под воздействием некоторых комбинаций химиопрепаратов.

2.1 Изучение влияния комбинации рибавирина и 5 - фосфитов 2', 3', дидезоксинуклеозидов на репродукцию ВИЧ-1.

2.2 Исследование комбинации азидотимидина и гидроксимочевины или ее аналогов на репликацию АЗТ-устойчивых вариантов ВИЧ-1.

3. Анти-ВИЧ-1 активность транс-дигидроксипиперидинов.

4. Антивирусная активность олипифата и его фракций на модели

ВИЧ-инфекции.

4.1 Олипифат и его противовирусные свойства.

4.2 Изучение цитотоксических свойств олипифата.

4.3. Изучение антивирусных свойств олипифата.

4.4 Изучение возможности возникновения резистентности к олипифату.

Раздел 6. Разработка вакцин против ВИЧ/СПИД.

1 . Изучение иммуногенности рекомбинантных белков ВИЧ.

1.1. Иммуногенность рекомбинантных белков ВИЧ-1 оценивалась по результатам иммунизации лабораторных животных (мышей).

1.2 Изучение специфической активности химерного рекомбинантного белка гес(24-41).

1.3. Изучение специфической активностиггес(24-41) в ИФА.

1.4. Изучение специфической активности гес(24-41) в иммуноблоте.

1.5 Исследование специфической активности сывороток мышей, иммунизированных гес (24-41).

1.6 Иммуногенные свойства конъюгата рекомбинантного белка гес(24

41) с полиоксидонием.

1.7 Исследование нейтрализующей активности сывороток мышей, иммунизированных гес (24-41).

1.8 Изучение пролиферативной активности клеток животных, иммунизированных гес (24-41).

2. Изучение иммунологических свойств сывороток макак, иммунизированных TBI (кандидатом для анти-ВИЧ вакцины).

2.1. Исследование развития гуморального и клеточного иммунного ответа у животных, иммунизированных иммуногенами TBI, HGP

30 и МАР-2.

2.2. Изучение иммунологических свойств сывороток обезьян, иммунизированных TBI.

2.3. Исследованы иммунореактивности сывороток обезьян, иммунизированных TBI.

2.4. Нейтрализационные свойства сывороток. 449 Раздел 7. Разработка микробицидных препаратов. Микробициды — новое направление в борьбе с ВИЧ-инфекцией.

1. Сульфатированные производные хитозана как ингибиторы ВИЧ-инфекции.

2. Исследование соотношения антивирусной и антикоагулянтной активностей сульфатированных производных хитозана.

3. Механизм анти-ВИЧ активности ряда сульфатированных полисахаридов и пептидных фрагментов из первого домена молекулы СД

3.1 Влияние модификации пептидов на их иммунореактивность.

3.2. DS блокирует взаимодействие между адсорбированными на твердой фазе пептидами и антителами из ВИЧ-положительной сыворотки.

3.3 DS взаимодействует с пептидами а растворе.

3.4. Снятие ингибирующего действия DS пептидами в растворе в тесте T^f синцитиеобразования.

3.5 Сопоставление свойств ряда сульфатированных полианионов.

3.6. Механизм ингибирующего действия пептида из VI CD4, по-видимому, аналогичен механизму антивирусной активности сульфатированных полисахаридов.

ВЫВОДЫ

Список опубликованных работ по теме диссертации

Введение Диссертация по биологии, на тему "Иммунобиология вируса иммунодефицита человека"

1.1. Актуальность проблемы.

ВИЧ-инфекция стала самым опасным и широко распространенным инфекционным заболеванием в XXI веке. Ежегодно более 5 млн. человек заражаются вирусом иммунодефицита человека - этиологическим агентом ВИЧ-инфекции и ее терминальной стадии СПИДа. Со времени регистрации первых случаев болезни более 67 млн. человек были инфицированы и более 25 млн. уже умерло. Глобальное распространение, принявшее характер мировой эпидемии - пандемии, высокая смертность, передача вируса через кровь, внутриутробно и половым путем, отсутствие вакцины, микробицидов и широко доступных высокоэффективных и нетоксичных лекарств сделали проблему ВИЧ/СПИД одной из центральных в мировом здравоохранении. Открытый в начале 80-х гг. ВИЧ оказался лентивирусом, относящимся к семейству ретровирусов, для которых характерна интеграция в геном хозяина, длительная латенция и хроническая инфекция, высокая антигенная и генетическая изменчивость.

К настоящему времени во всем мире изолировано более тысячи штаммов ВИЧ, изучены нуклеотидные последовательности нескольких тысяч вирусов. А для 100 вирусов прочитана полная последовательность нуклеотидов и созданы молекулярные клоны. Установлено, что многие изоляты ВИЧ сильно различаются по своим биологическим свойствам; более того в разных регионах мира циркулируют различные субтипы и рекомбинантные формы ВИЧ. Создание коллекции и исследование свойств изолятов ВИЧ необходимо для решения как фундаментальных, так и прикладных задач, в том числе для разработки вакцины против ВИЧ/СПИД.

Со времени обнаружения CD4 рецептора, считалось, что именно Т-хелперы являются главной мишенью ВИЧ. Последующие исследования показали, что ВИЧ фактически является пантропным вирусом, способным использовать множество дополнительных корецепторов и клеточных механизмов для проникновения и поддержания инфекции. Исследование механизмов проникновения ВИЧ, клеточных механизмов модуляции ВИЧ-инфекции является важным звеном в понимании патогенеза ВИЧ/СПИД. Жизненный цикл ВИЧ весьма сложен и включает несколько стадий. Поиск специфических ингибиторов различных этапов репликации ВИЧ позволяет открывать новые препараты для лечения ВИЧ/СПИД. Именно таким образом были найдены нуклеозидные/нуклеотидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ и ингибиторы протеазы ВИЧ. Актуальной остается задача поиска новых средств терапии ВИЧ/СПИД, в том числе комбинированной химиотерапии. До сих пор не решена проблема по разработке новых превентивных технологий на основе иммунобиологических препаратов — микробицидов, предотвращающих половую передачу ВИЧ и вакцин.

Настоящая работа выполнена в рамках плановых исследований НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, Государственной программы "Борьба с наиболее распространенными заболеваниями" по проблеме СПИД и Межведомственной научно-технической программы " Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего", РФФИ, РФТР.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Карамов, Эдуард Владимирович, Москва

1. Varmus Н. Retroviruses. // Science., 1988., v. 240., p. 1427-1433.

2. Bushman В., Fujiwara Т., Cragle R. Retroviral DNA integration directed by HIV integration protein in vitro. // Science., 1990., v. 249., p. 1555-1558.

3. Hauber J., Perkins A., Heimer E.P., Gullen G.R. Trans-activation of HIV gene expression is mediated by nuclear events. // PNAS US., 1987., v. 84., p. 6364-6386.

4. Weeks K., Ampe C., Schultz S. et al. Fragments of the HIV-1 tat protein specially bind TAR RNA. // Science., 1990., v. 249., p. 497-500.

5. Mallim M., McCarn D., Rusche J., Hauber J. et al. HIV-1 structural gene expression requires binding of the rev trans-activator to its RNA target sequence. // Cell., 1990., v. 60., p. 675-683.

6. Ovod V., Lagerstedt A., Ranki A. Immunological variation of immunohistochemical localization of Nef demonstrated with monoclonal antibodies. // AIDS., 1992., v. 6., p. 25-34.

7. Cheng-Mayer C., Lannello P., Shaw K. et al. Differentional effects of nef on HIV replication: implications for viral pathogenesis in the host. // Science., 1989., v. 246., p. 1629-1632.

8. Cohen E., Terwilliger E., Jalinoos Y. et al. Identification of HIV-1 vpr product and function. // J. Acad. Imm. Def. Syn., 1990., v. 3., p. 11-18.

9. Haseltine W.A. Molecular biology of AIDS virus: ten years of discovery hope for the future. // Plenary lecture, International AIDS symposium., 1991, June 16-21, Florence., Italy.

10. Haseltine W.A. Molecular biology of AIDS virus: ten years of discovery hope for the future. // In: Science Challenging AIDS. Basel: Karger, 1992., p. 71-106.

11. Gelderblom H.R., Ozel M., PauliG. Morphogenesis and morphology of HIV. Structure-function relations. // Arch. Virol., 1989., v. 106., p. 1-13.

12. Luban J, Bossolt KL, Franke EK, Kalpana GV, Goff SP. Human immunodeficiency virus type 1 Gag protein binds to cyclophilins A and B. // Cell 1993 Jun 18;73(6): 1067-78.

13. Kan N.C., Franchini G., Wong-Staal F. Identification of HIV sor gene product and detection of antibodies in human sera, //science., 1986., v. 231., p. 144-148.

14. Saib A, Puvion-Dutilleul F, Schmid M, Peries J, de The H. Nuclear targeting of incoming human foamy virus Gag proteins involves a centriolar step. J Virol 1997 Feb;71(2):l 15561.

15. Strebel K., Klimkait Т., Martin M.A. a novel gene of HIV-1, vpu, and its 16 kilodalton product. //Science., 1996., v. 14., p. 121-123.

16. Sodeik В, Ebersold MW, Helenius A. Microtubule-mediated transport of incoming herpes simplex virus 1 capsids to the nucleus. J Cell Biol 1997 Mar 10;136(5):1007-21.

17. Cocchi, F., A. L. DeVico, A. Garzino-Demo, S. K. Arya, R. C. Gallo, and P. Lusso. 1995. Identification of RANTES, MlP-la, MlP-lb as the major HIV-suppressive factors producedby CD8+ T cells. Science270:1811-1815.

18. Feng, Y., С. C. Broder, P. E. Kennedy, and E. A. Berger. 1996. HIV 1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane, G protein-coupled receptor. Science 272;872-877.

19. Alkhatib, G., C. Combadiere, С. C. Broder, Y. Feng, P. E. Kennedy, 1996, CC CRK5: aRANTES, MlP-la, MlP-lb, receptoras fusion cofactorfor macrophage-tropicHIV-1. Science 272:1955-1958.

20. Dragic, Т., V. Litwin, G. P. Allaway, S. R. Martin, Y. Huang, K. A. Nagashirna, C. Cayanan, P. J. Maddon, R. A. Koup, J. P. Moore, and W. A. Paxton. 1996. IIIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CRK-5. Nature 381:667-673.

21. Schwartz, J.-M. Heard, I. dark-Lewis, D. F. Legler, M. Loetscher, M. Baggiolini, and B. Moser. 1996. The CXC chemokine SDF-1 is the ligand for LESTR/fusin and prevents infection by T-cell-line-adapted HI V-l. Nature 382:833-835.

22. Karamov E.V.// VIII Int. Conf. on AIDS, Amsterdam The Netherlands, 1992, PoA 2456.

23. Tatarintcev A.V., Vrzheshch P.V., Schegolev A.A., Ershov D.E., Turgiev A.S., Karamov E.V. et al. Ajoene antagonizes integrin-dependent processesin HIV-infected T-lymphoblasts.// AIDS, 1992, v. 6., №10., p. 1212-1215.

24. De'Clercq E., Yamamoto N., Pauwels R. et al. Highly potent and selective inhibition of HIV-1 by the bicyclam derivate JM3100. // Antimicr. Agents and Chemot., 1994., p. 668674.

25. De Clercq E. Inhibition of HIV infection by bicyclams, highly potent and specific CXCR4 antagonists. // Mol Pharmacol 2000 May;57(5):833-9.

26. De Clercq E. Novel compounds in preclinical/early clinical development for the treatment of HIV infections. // Rev Med Virol 2000 Jul-Aug;10(4):255-77.

27. De Clercq E. Hamao Umezawa Memorial Award Lecture: "An Odyssey in the Viral Chemotherapy Field". // Int J Antimicrob Agents 2001 Oct;18(4):309-28.

28. De Clercq E. New developments in anti-HIV chemotherapy. // Curr Med Chem 2001 Nov;8(13):1543-72.

29. Gerlach LO, Skerlj RT, Bridger GJ, Schwartz TW. Molecular interactions of cyclam and bicyclam non-peptide antagonists with the CXCR4 chemokine receptor. // J Biol Chem 2001 Apr 27;276(17): 14153-60.

30. Liu H, Wu X, Newman M, Shaw GM, Hahn BH, Kappes JC. The Vif protein of human and simian immunodeficiency viruses is packaged into virions and associates with viral core structures. J Virol 1995 Dec;69(12):7630-8.

31. Goncalves J, Korin Y, Zack J, Gabuzda D. Role of Vif in human immunodeficiency virus ^ type 1 reverse transcription. J Virol 1996 Dec;70(12):8701-9.

32. Simon JH, Malim MH. The human immunodeficiency virus type 1 Vif protein modulates the postpenetration stability of viral nucleoprotein complexes. J Virol 1996 Aug;70(8):5297-305.

33. Sova P, Volsky DJ. Efficiency of viral DNA synthesis during infection of permissive and nonpermissive cells with vif-negative human immunodeficiency virus type 1. J Virol 1993 Oct;67(10) :6322-6.

34. Madani N, Kabat D. An endogenous inhibitor of human immunodeficiency virus in human lymphocytes is overcome by the viral Vif protein. J Virol 1998 Dec;72( 12): 10251 -5.

35. Simon JH, Gaddis NC, Fouchier RA, Malim MH. Evidence for a newly discovered cellular anti-HIV-1 phenotype. Nat Med 1998 Dec;4(12):l 397-400.

36. Chowers MY, Spina CA, Kwoh TJ, Fitch NJ, Richman DD, Guatelli JC. Optimal infectivity in vitro of human immunodeficiency virus type 1 requires an intact nef gene. J Virol 1994 May;68(5):2906-14.

37. Miller MD, Warmerdam MT, Gaston I, Greene WC, Feinberg MB. The human immunodeficiency virus-1 nef gene product: a positive factor for viral infection and replication in primary lymphocytes and macrophages. J Exp Med 1994 Jan 1 ;179(1): 10113.

38. Chowers MY, Pandori MW, Spina CA, Richman DD, Guatelli JC. The growth advantage conferred by HIV-1 nef is determined at the level of viral DNA formation and is independent of CD4 downregulation. Virology 1995 Oct l;212(2):451-7.

39. Schwartz O, Marechal V, Danos O, Heard JM. Human immunodeficiency virus type 1 Nef increases the efficiency of reverse transcription in the infected cell. J Virol 1995 Jul;69(7):4053-9.

40. Aiken C, Trono D. Nef stimulates human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA synthesis. J Virol 1995 Aug;69(8):5048-56.

41. Pandori MW, Fitch NJ, Craig HM, Richman DD, Spina CA, Guatelli JC. Producer-cell modification of human immunodeficiency virus type 1: Nef is a virion protein. J Virol1996 Jul;70(7):4283-90.

42. Bukovsky AA, Dorfman T, Weimann A, Gottlinger HG. Nef association with human immunodeficiency virus type 1 virions and cleavage by the viral protease. J Virol 1997 Feb;71(2):1013-8.

43. Welker R, Kottler H, Kalbitzer HR, Krausslich HG. Human immunodeficiency virus type 1 Nef protein is incorporated into virus particles and specifically cleaved by the viral proteinase. Virology 1996 May l;219(l):228-36.

44. Bukrinsky MI, Sharova N, Dempsey MP, Stanwick TL, Bukrinskaya AG, Haggerty S, Stevenson M. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc Natl Acad Sci U S A 1992 Jul 15;89(14):6580-4.

45. Cohen EA, Dehni G, Sodroski JG, Haseltine WA. Human immunodeficiency virus vprproduct is a virion-associated regulatory protein. J Virol 1990 Jun;64(6):3 097-9.f

46. Lu YL, Bennett RP, Wills JW, Gorelick R, Ratner L. A leucine triplet repeat sequence (LXX)4 in p6gag is important for Vpr incorporation into human immunodeficiency virus type 1 particles. J Virol 1995 Nov;69(ll):6873-9.

47. Paxton W, Connor RI, Landau NR. Incorporation of Vpr into human immunodeficiency virus type 1 virions: requirement for the p6 region of gag and mutational analysis. J Virol 1993 Dec;67(12):7229-37.

48. Kondo E, Mammano F, Cohen EA, Gottlinger HG. The p6gag domain of human immunodeficiency virus type 1 is sufficient for the incorporation of Vpr into heterologous viral particles. J Virol 1995 May;69(5):2759-64.

49. Mahalingam S, Khan SA, Jabbar MA, Monken CE, Collman RG, Srinivasan A. Identification of residues in the N-terminal acidic domain of HIV-1 Vpr essential for virion incorporation. Virology 1995 Feb 20;207(l):297-302.