Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и экспрессия генов GAG и ENV вируса иммунодефицита человека в векторных системах на основе генома вируса Синдбис

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия генов GAG и ENV вируса иммунодефицита человека в векторных системах на основе генома вируса Синдбис"

^ #

<ф л На правах рукописи

МОШКОВ Дмитрий Андреевич

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ОАО И ЕЫУ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА В ВЕКТОРНЫХ СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ ГЕНОМА ВИРУСА СИНДБИС

03.00.15. - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1008

Работа выполнена на унитарном государственном московском предприятии по производству бактерийных препаратов Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор биологических наук

кандидат биологических наук

Официальны* оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В. П. Щипков

доктор биологических наук, профессор Ф.П. Филатов Ведущая органиаация:

НИИ вирусных препаратов РАМН

Защита диссертации состоится "/■?" ^>-¿-^-^1998 г. в " / "час, на заседании диссертационного совета К • 063.22.16 в российском университете дружбы народов по адресу : 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке российского университета дружбы народов.

(117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.)

Автореферат рагослан" ^У " - 199в г.

С. Б. Алексеев И.З. Зайцев

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент

"у О. Б. Гигвни

Актуальность проблемы. Развитие современной биотехнологии требует разработки генно-инженерных конструкций для получения белков, которые полностью соответствуют природным аналогам с точки зрения их третичной структуры и гликозилирования.

Наиболее пригодны для этих целей эукариотические экспрессионные системы, в которых белки проходят естественный соматический процессинг. Векторные конструкции, использующие мощный репликативный аппарат РНК-сод ержащих вирусов, позволяют достигать значительных показателей выхода рекомбинантного продукта - от 10 до 25% от содержания белка в культивируемых клетках.

В своей работе мы занимались разработкой модельных рокомбинантных конструкций, содержащих гены env и gag вируса иммунодефецита человека на основе l^i^r^uniur Нол прлИяннп интересовали конструкции.

- —ца<cJdHa О^ц^й Ohlflg^ ЩЦ^ВВЫХ

антигенов Env и Gag. Именно эти антигены актуальны не только с теоретической точки зрения, но и на практике и для создания диагностических препаратов. Они позволят повысить быстроту и точность анализа в сравнении с сегодняшними диагностическими тест-системами.

Кроме этого в работе исследована возможность получения иммунного ответа in vivo на целевые антигены Env и Gag после введения рекомбинантных РНК

Цели и задами исследования. Целью настоящей работы являлось получение рекомбинантных конструкций на основе вируса Синдбис, несущих в своем составе гетерологичные гены env и gag вируса иммунодефецита человека.

При достижении этой цели решались следующие задачи:

1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pS!N/rep5/env, содержащей под промотором субгеномной РНК вируса Синдбис ген env вируса иммунодефицита человека.

2. Конструирование рекомбинантной плазмиды pSIN/rep5/gag, содержащей под промотором субгеномной РНК вируса Синдбис ген gag вируса иммунодефицита человека.

3. Получение вирусспецифического гуморального иммунного ответа при введении лабораторным животным текомбинантных РНК.

Научная новизна. Впервые получены рекомбинантные конструкции с полными генами gag и env вируса иммунодефицита человека первого типа на основе вируса Синдбис. Осуществлена экспрессия генов env и gag в составе рекомбинантной РНК вируса Синдбис. Показан гуморальный иммунный ответ на вирусные антигены при введении лабораторным животным рекомбинантных РНК.

Практическая аначимость. Результаты диссертации приняты к использованию для создания тест-систем нового поколения и при получении рекомбинантных вакцин нового поколения в рамках Федеральной целевой программы "Вакцинопрофилактика" на УГ МПБП МЗ РФ.

Положения и результаты выносимые на защиту:

1. Впервые полумены генно-инженерные конструкции

РНК-содержащего вируса с полными генами gag и env вируса иммунодефицита человека первого типа.

2. Получена рекомбинантная плазмида pSIN/rep5/env, содержащая под промотором субгеномной РНК вируса Синдбис ген env вируса иммунодефицита человека.

3. Получена рекомбинантная плазмида pSIN/rep5lgag, содержащая под промотором субгеномной РНК вируса Синдбис ген gag вируса иммунодефицита человека. '.

4. Впервые осуществлена экспрессия генов env и gag в составе рекомбинантной РНК вируса Синдбис.

5. Показан гуморальный иммунный ответ при иммунизации лабораторных животных рекомбинантными РНК SIN/rep5/env и pSIN/rep5/gag.

Апробация работы. По ходу выполнения

исследований результаты для обсуждения

представлялись на научных конференциях: 2-ая международная конференция "СПИД, рак и ретровирусы человека" 1993 г. С-Петербург, 3-я международная конференция "СПИД, рак и связаные проблемы" 1995 г. С-Петербург, Augustusburg conference of advanced science "Viral infections in Pregnancy", 1997, Augustusburg, Saxony, Germany.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, перечень которых представлен в конце автореферата.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 87 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатом и обсуждения экспериментальных исследований и библиографического указателя, включающего 121 источник. Работа проиллюстрирована 25 рисунками и 4 таблицами.

Материалы и методы.

Анализ последовательностей нуклеотидов и аминокислот, выбор праймеров и статистическую обработку данных выполняли на компьютере Power Macintosh 120 (процессор Motorola 604), используя программы SeqeD 1.0, DNA Stridor, Amplify DNASIS, PROSIS, PrimerOl, PC Gene и др. для IBM/PC ( процессор Intel 486 и . выше). Данные по первичной структуре нуклеиновых кислот и белков получены через Internet из банка данных NCBI.

Анализ распределения гидрофильных и гидрофобных участков для поиска предполагаемых антигенных детерминант осуществляли по программе DNA Stricter по методике Kyte and Doolittle и Hoop and Woods,

Плазмида pBH10 содержит последовательности изолята ВИЧ-1 (HTLV-IIIB), клонированного из вируса, размноженного в клетках линии Н9.

Плазмида pS!Nrep5 и набор хелперных плазмид любезно предоставлены доктором C.M.Rice, содержат структурные и неструктурные гены вируса Синдбис, а также полилинкерную область для клонирования и экспрессии целевых фрагментов.

Лраймеры для проведения ЛЦР рассчитывали с помощью программ Primer и Amplify.

Цепную полимеразную реакцию для

амплифицирования требуемых фрагментов ДНК проводили стандартному протоколу.

После проведения ПЦР-реакции зоны

амплифицированных фрагментов вырезали из агарозного геля, иммобилизировали на ДЕАЕ-фильтр, элюировали, переосаждали этиловым спиртом и растворяли в деионизованной воде.

Лигирование проводили по стандартной процедуре.

Электропорацию проводили в кюветах объемом 0,10,2 мл в аппарате Gene Pulsar фирмы BioRad (CUJA).

Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с помощью щелочного метода по Манниатис.'

Рекомбинантную РНК SIN/Rep5íenv и SIN/Rep5/gag ; синтезировали in vitro с помощью транскриптазной реакции,- РНК разводили в свободной от РНКазы воде в концентрации 2 мкг на 50 мкл. Для увеличения стабильности РНК в раствор добавляли ингибитор нуклеаз из плаценты человека (РНКазин) в количестве 10 ед. на 50

r-fl-Tfcrtaa. У i-¡L-ait, ") й'

i

внутримышечно, белым крысам по 2 - 5 мкг рекомбинантной РНК. Через 7 суток иммунизацию повторяли при той же

Идентификацию вирусспецифических антител проводили методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА).

Количество бляшкообраау ющих единиц (БОЕ) определяли на монослое клеток GMK (перевиваемая линия клеток почки зеленой мартышки).

Результаты исследований и их обсуждение

Схема клонирования, выбранная нами на основании анализа последовательностей генов gag и env, и структуры вектора SIN/Rep5, представлена на рисунке 1.

A '>!,<:j trm s-, © 2__О © О

«К,; 5' 1 © ?

Сор СН I I Пестр!* yi;[f и

Helper

Рис;1. Схема клонирования генов env (А) и gog (В) ВИЧ-1 в вектор pSIN/rep5. pi - полилинкер, sg - субгеномный промотор. Helper - помощник, D- делеция по белкам репликативного комплекса. 1,2,3,4 - консервативные области генома.

Рассчитанные праймеры для клонирования генов env и gag представлены в таблице 1, где показана первичная структура праймеров для ПЦР.

Таблица!

g°g 1 g°g 2

+ ggactcggcttgctgaagcgc tagagcttcctttagttgccc + gatgggtgcgagagcgtcagt ttggtttccatcttcctggca

0П V 1 env 2

+ gagcagaagacagtggcaatg cccaccccatctgctgctggc + agtggcaatgagagtgaagga gctgctcccaccccatctgct

Проводили ПЦР и анализировали продукты ПЦР электрофорезом. Электрофорез (рис.2) показывает, что полосы ДНК имеют заданные параметры.

UnMj • l*SE t

СП»

Рис.2. Электрофорез ПЦР продуктов в 0.8 % агароэном

геле.

"Работы по конструированию рекомбинантной ДНК с генами gag и env позволили получить плазмиды pSIN/rep5/env, содержащие ген env под промотором

субгеномной РНК вируса Синдбис, и плазмиды pSIN/rep5/gag, содержащие под этим же промотором ген gag. В результате появилась возможность изучения рекомбинантных векторов экспрессирующих гены ВИЧ на основе вируса Синдбис.

Клоны, содержащие рекомбинантные pSIN/rep5/env и pSIN/rep5/gag, накапливали в количествах, необходимых для получения РНК транскрипцией in vitro. Полученную рекомбинантну ю РНК анализировали в электрофорезе (рис.3). Оказалось, что выход РНК в реакции достаточен для трансфекции клеток И заражения животных.

Рис.3. Электрофорез в агарозном геле транскрибируемых in vitro рекомбинантных РНК на матрицах pSIN/rep5/lgag и pSIN/rep5//env.

Выход РНК, транскрибируемой с рекомбинантных плазмид pSIN/rep5/env и р81Ы/гер5/гог.^аг,таппяп пт ?П пп

30 мкг на реакцию. При реакции транскрипции (для защиты РНК при последующей трансфекции от рибонуклеаз) мы при^ .чяли копирующие производные гуанозина mGpppG или mGppppmG.. Содержащиеся на '5'-конце кэпирующие нуклеотиды повышают инфекционность вирусных РНК по крайней мере в 1000 раз.

РНК, получаемая при указанных выше условиях с рекомбинантных плаэмид, была инфекционна при заражении мышей в мозг и при электропорации в клетки. Мыши-сосунки, инфицированные в мозг, на 2-3 сутки проявляли симптомы заболевания, идентичные тем, что наблюдаются у сосунков, зараженных штаммом НЯЗР вируса Синдбис. У них наблюдали парезы конечностей, утрату координации движений и затем гибель.

Полученные данные вместе с •результатами электрофореза позволяют предположить, что наличие вставок не отразилось на способности рекомбинантного вируса размножаться в организме мышей. Следующей задачей было изучение способности рекомбинантных вирусов Синдбис экспрессировать целевые гены.

Векторную рекомбинантную РНК,

транскрибированную с плазмидной рекомбинантной ДНК, и хелперную РНК, несущую структурные гены вируса Синдбис, смешивали в пропорции 1:1 в буфере для электропорации. Трансфекцию клеток ВНК-21 проводили с помощью электропорации. Рекомбинантный вирус Синдбис, содержащий гены ВИЧ, накапливали в культуре клеток ВНК-21, и затем этим вирусом инфицировали монослой клеток вМК с целью определения биологической активности вируса. Накопление рекомбинантного вируса в культуре клеток составляло 5,5-6,5 1д ЦПД50/мл. Соответствующие разведения вируса, накопленного в клетках, наносили на монослой клеток вМК. После адсорбции вируса в течение 1 часа при 37 гр. С инокулят удаляли и на клеточные монослои наносили агаровое покрытие, содержащее кроме питательной среды,

адаптированной для клеток вМК, еще 0,75% агара О/^со. На третьи сутки на первичное агаровое покрытие наслаивали вторичное агаровое покрытие такого же состава, но содержащее нейтральный красный, который окрашивал живые клетки в красный цвет, но не усваивался клетками, разрушенными вирусом. В результате через несколько часов проявлялись негативные колонии. При сравнении биологической активности по бляшкообразованию у рекомбинантних вирусов SIN/Rep5/env и SIN/Rвp5/gag и у векторного вируса 31Ы/Нер5 мы не выявили отчетливых различий. Не обнаружили и видимых различий в морфологии негативных колоний(рис. 4)

..................................... р ■■ ... • 5 ! : /1 |Шя few«*. л. : • j • Г........." ""ТТ" гй у . - i. i • i , -t i i-

Sin/Rep5 HRSP Sin/Rep5/env HRSP Sin/Rep5Igag HRSP

Рис.4. Сравнение бляшкообразу ющей активности рекомбинантных вирусов SIN/Rep5/env и SIN/Rep5/gag и векторного вируса SIN/Rep5.

Выделение тотальной вирусной РНК из инфицированых клеток и постановка РТ-ПЦР на ней показали наличие втавок генов gag и env вируса иммунодефицита человека первого типа в геноме вируса Синдбис, что видно из рисунка 5. На электрофорезе видны четкие зоны амплифицируемых фрагментов, малое количество проведенных циклов свидетельствует о

значительном количестве тотальной вирусной рекомбинантной РНК в образцах трансфицируемых клеток.

Рис.5. Электрофорез ДНК продуктов РТ-ПЦР вирусной рекомбинантной РНК, в 2.0% агарозном голе. S/R5/E1, S/R5/E2, S/R5/G1, S/R5/G2 - зоны соответствующие рекомбинантному потомству Синдбис/env и Синдбис/gog.

Проведенное изучение S-фенотипа позволяет сделать заключение о сохранении аттенуированности рекомбинантных форм HRSP варианта штамма AR 339 вируса Синдбис и о возможности проведения анализа экспрессии генов env и gag в организме лабораторных животных. Такое подробное изучение фенотипа рекомбинантных вирусов Синдбис, несущих различные гены двух отличающихся таксономически вирусов, проделано впервые и имеет несомненную ценность для конструирования рекомбинантных вакцинных штаммов нового поколения.

Синтез РНК, иммунизацию животных, анализ вирусспецифических антител осуществляли как описано в материалах и методах.

Данные, представленные в таблице,

свидетельствуют, что в ответ к продуктам Gag и Env на введение РНК внутримышечно развивается иммунный ответ регистрируемы* в реакции ИФА.

Таблица 2. Титры антител, выявляемые с помощью реакции ИФА в сыворотках крови белых крыс, иммунизированных векторной РНК.

Номер определения SIN/Rep5/env SIN/Rep5/gag Контрольные животные г

1 1.10000 1:10000 нет

2 1:10000 1:10000 нет

3 1:10000 1:10000 нет

Титры антител к Gag и Env в сыворотках крови крыс, иммунизированных рекомбинантной РНК, превышают титры антител при натуральной ВИЧ-инфекции у человека.;

Изучение современных концепций привело к выводу, о том, что для создания иммунитета против любого вируса или антигена целесообразно применять векторы на основе быстрореп лицирующихся РНК-сод ержащих вирусов- с высоким уровнем экспрессии. На данный момент наиболее адекватной и эффективной системой экспрессии является векторная система на основе альфавирусов, что и было доказано в представленой работе.

выводы

1. Впервые получены рекомбинантныа конструкции вируса Синдбис с полными генами gag и onv вируса иммунодефицита человека первого типа.

2. Получена рекомбинантная плазмида pSIN/rep5/env, содержащая под промотором субгеномной РНК вируса Синдбис ген env вируса иммунодефицита человека.

3. Получена рекомбинантная плазмида pSIN/rep5/gag, содержащая под промотором субгеномной РНК вируса Синдбис ген gag вируса иммунодефицита человека.

4. Впервые осуществлена экспрессия генов env и gag в составе рекомбинантной РНК вируса Синдбис.

5. Показан эффективный синтез in vivo моноспецифических антител против антигенов ВИЧ Env и Gag после введения соответствующих рекомбинантных РНК лабораторным животным.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

1. Мошков А.Е,, Урываев Л.В., Мошков Д.А., Маренникова С.С. "Перспективы использования РНК-содержащих вирусов в качестве векторов". Вопр. Вирусол., 1993. № 3, с.98-101.

2. Moshkoff А. Е., Evstigneev V. I., Moshkoff D. A. The choice of vector for vaccine development against AIDS-related complex. Abstracts of 2-nd International conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", St. Petersburg, 1993, p.27

3. Moshkoff D. A., Moahkoff A. E. , Zaitsev I.Z. The model systems for estimation of the safety and effectivity of vaccine against AIDS-associated complex. Abstracts of 3-rd International conference "AIDS, Cancer and Related Problems', St. Petersburg, 1995, p.32.

4. Moshkoff D. A., Alexeev S.B., Moshkoff A. E., Zaitsev I.Z. Sindbis virus recombinants expressing immunogenic proteins of HIV-1. Abstracts of Augustusburg conference of advanced science "Viral infections In Pregnancy", September 27th-29th 1997, Augustusburg, Saxony, Germany, 1997, p. 21.

Мошков Дмитрий Андреевич (Россия)

'Клонирование и экспрессия генов gag и env вируса иммунодефиците человека в векторных системах на основе геноме вируса Синдбис "

Области, кодирующие гены gag и env вируса иммунодефицита человека первого типа, из плаэмиды рВНЮ были клонированы в векторе SIN/Rep5 на основе Си-^нс даа,-|-ц---------------------- -

структурных белков. Рекомбинантные вирусы SIN/Rвp5/env и SIN/Rвp5/gag после электропорации их в эукариотические клетки линии ВНК21 (клетки почки хомяка) давали высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков. Посла■введения лабораторным животным только одной ракомбинантной РНК без помощника {PHK-SIN/Rep5/env и PHK-SIN/Rвp5/gag) был получен интенсивный гуморальный иммунный ответ на вышеупомянутые белки ВИЧ-1. В работе показано, что самореплицирующиеся векторы экспрессии на основе РНК

Dmitry A. Moshkotf (Russia).

"Slndbls virus recombinants expressing Immunogenic proteins of

HIV-I*

The immunodeficiency virus type 1 (HIV-1, from pBH10) gag and env coding domains were cloned into SIN/Rep5 vector in order (o determine tha structural protein expression ability. Electroporated into eucaryote BHK 21 (baby hamster kidney) cells SIN/Rep5/env and SIN/Rep 5/gag recombinant vectors displayed high expression level of recombinant protein. Injection of one part of RNA (SIN/Rep5/env or SIN/Rep5/gag) without a helper in laboratory animals resulted in generation of significant humoral response on the mentioned protein.

The study indicates that self-replicative expression vectors based on RNA viruses are actual in the field of vaccination prophylactic and for viral infections assays.

29.04.Sar._OtfT.er.;In. _IuO_3aK. 569

Tan» ?y;;,H, 0nrc-:cr!K!W3t?, is