Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и экспрессия генов структурных белков HTLV-I в бактериях Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия генов структурных белков HTLV-I в бактериях Escherichia coli"

Pi 6 од-

z I» апр &

На правах рукописи

УДК 578.828.11: [578.74+578.083.24]

САНКОВ Михаил Николаевич

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ HTLV-I В БАКТЕРИЯХ Escherichia coli

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

•АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москза - 1995 год

Работа выполнена в лабораториях биотехнологии и вирусов лейкозов НИИ вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ Доктор биологических наук А.Ф.БОБКОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ Доктор биологических наук, профессор В.В.МЕСЯНЖИНОВ Кандидат медицинских наук О.А.ПАВЛИШ

ВЕДУШЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ Московский НИИ вирусных препаратов РАМН

Защита диссертации состоится 1995 г. в часов на

заседании специализированного совета Д 001.20.01 при НИИ вирусология имени Д.И.Иваяовскоп> РАМН по адресу 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИ вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН.

Реферат разослан

1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

Н.П.КОСЯКОВА

(

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Т-лнмфогропшй вирус человека I типа (HTLV-I) этиологически ассоциирован с развитием Т-клеточной лейкемия взрослых (ATL), (Yoshida et al., 1982;Poiesz et al.,1980) и некоторыми Эйдами неврологических расстройств, таких, как тропический спастичаский парапарез и хронические прогрессивные мкелопатии (Bhagavati et al.,1988; Bortholeneu et al., 1986; Roman et al., 1987; Vernant et al., 1987)..

Несмотря на интенсивное исследование этого вируса, особенно в лабораториях СВА а Японии, в мире до сих пор отсутствует эффективные способы профилактики и лечения HTLV-1-инфек-цяя. Более того, современная практическая медицина не располагает иаденными средствами, позволяющими однозначно ти-пировать этот возбудитель.

Работы в этом направлении ведутся уяе с 1980 г. и включают в себя исследования по созданию эффективных методов обнару-вения вирус-специфических антител в сыворотках крови носителей и больных с поноцьп различных вариантов иммуноферментных методов. В последние годы большое внимание такяе уделяется способам выявления вирусного генома методами молекулярной гибридизации я цепной полимеразвой роеакции (PCR). Однако, в первом случае постановка диагноза затруднена из-за относительно больного числа лоанопозитнвных в неопределенных результатов, связанных с применением в качестве антигенов вирусных лизатов; вторая группа методов требует дорогостоящего оборудования и соблюдения специальных условий для работы. Очевидно, что в целях соверпенствования диагностических тестов, направленных ;а выявление антител к HTLV-I, перспективным направлением является разработка методов, основанных fta использовании вирус-специфических антигенов, получаемых с помощью новых технологий: реконбинантных' белков и синтетических пептидов.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящей работы явилось создание птаммов бактерий - продуцентов рекомбинантных белков, содержащих основные анти-

генные детерминанты структурных белков HTLV-I н разработка на основе этих гибридов лабораторных вариантов тест-систем для выявления антител к этому вирусу.

В связи с этим в задачи исследования входило:

1) конструирование рекомбинантных плазмид, • содернапих фрагменты ДНК областей gag и env HTLV-I;

2) изучение стабильности гибридных плазмид и иммунологических свойств синтезирующихся под их контролем гибридных белков;

3) разработка лабораторных вариантов тесг-систеа для определения антител к структурным белкам HTLV-I на основе гибридных белков;

4) изучение чувствительности н специфичности полученикх тест-систем на панелях полокителькых, условно половительных и отрицательных сывороток;

5) получение данных о наличии антител к HTLV-I у здоровых доноров и лиц, больных различим.«! формами гемобластозов.

НАУЧНАЯ НОЕИЭЯЛ РАБОТЫ

В результате проведенной работ сконструированы рекомби-йактние плазмиды püd'.-I и pESG, обеспечивающие в несущих их бактериях Escherichia coli КВ101 высокий уровень синтеза гибридных полйпептидов, содержащих антигенные детерминанты структурных белков HTLV-I. Плазмиды защищены патентами Российской Федерации. Изучены стабильность рекомбинантных плазмид и иммунологические свойства кодируемых ими гибридных белков. Получены данные о распространении HTLV-I среди здоровых доноров к больных различными формами гемобластозов в отдельных регионах Европейской части Российской Федерации.

Практическое значение работы заключается в разработке лабораторных вариантов тест-систем для выявления антител к структурным белкам HTLV-I в сыворотках инфицированных, пригодных для использования в практической медицине.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ:

1) Сконструированные рекомбинантные плазмиды рвсШ, pGdpro, рВЕ1 и рЕБй детерминируют синтез белков, способных взаимодействовать с антителами к структурным белкам НПУ-1.

2) Элиминация К-концевих последовательностей вЛС- и ЕНУ-предшественников из состава гибридных белков существенно повышает'их стабильность.

3) Рекомбинантные белки, кодируемые плазмидами рСМН и рЕБв, могут быть использованы в лабораторных вариантах тест-систем для обнаружения антител к структурным белкам НТЬУ-1.

4) Инфицированность НТХУ-1 среди здоровых доноров и лиц, больных различными формами гемобластозов, составляет менее 0,11% и 0,18Х, соответсвенно.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы были доложены на V конференции Российс-* кой Федерации "Новые направления биотехнологии" в г.Пущи-но-на-Оке (1992 год) и на научном семинаре в отделе нолекуляр-ной вирусологии НИИ вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН (1995 год).

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертационная работа состоиг«Из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных резу^> -татов и выводов. Объем работы составляет 135 страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 4 таблицами и 19 рисунками. Список литературы состоит из 161 наименования.

А

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЭКСПРЕССИЯ ФРАГМЕНТОВ ГЕНА чае HTLV-T В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ Escherichia coti. . .

В работе в качестве источника провирусной ДНК HTLV-I использовали плазмиду рМТ2 (Pesce all.1987, Richardson et al. 1990), содержащую вставку Sstl-фр.агмента размером 3,5 тыс. пар нуклеотидов (тпн) в плазмидном векторе pSP65 и кодирующуг большую часть генома вируса. Плазмида была любезно предоставлена д-рон R.Gallo (США).

Экспрессия фрагмента гена gag HTLV-I а составе плазмидного вектора pUC18.

На первом этапе работы для экспрессии гена gag . HTLV-I i клетках бактерий Е.. coli использовали Eco47III-HindIII фрагмент плазмвды рМТ2 с координатами 845-3048 нуклеотидных па] (нп), кодирующий практически весь GAG-предшественник. Это' фрагмент, размером 2103 нп был элвирован из агарозкого геля i лигирован с плазмидным вектором pUC18 (Yanisch-Perron et al 1985), гидролизованным рестриктазами'Sisal и HindlII. При изу чении спектра белков, синтезировавшихся под контролем получен ной плазмиды pEHgagl мы выявляли полипептид с расчетной моле кулярной массой 48 кДа. Полученный гибридный полипептид бы способен специфически взаимодействовать с HTLV-1-полокительно сывороткой, однако уровень его синтеза был невысок и составля менее от тотального белка клетки. Наряду с мажорным поли пептидом с молекулярной массой -48 кДа, в клетках Е.со] DH5/pEHgagl обнаруживалось также четыре дополнительных поли пептида с молекулярными массами 45, 43, 41 и 33 кДа, отсутс твовавших в белковых экстрактах клеток, несущих векторн} плазмиду, которые также реагировали с сыворотками инфицирова! них лиц.

Экспрессия фрагментов гена gag HTLV-I в векторах серии

PUR290-292.

Для увеличения уровня синтеза реконбинантных полипептидов, обладающих антигенными свойствами GAG-предшественника, мы предприняли попытку экспрессии соответствующих фрагментов HTLV -I в плазмидных векторах серии pUR290-292 (Ruther and Kuller-Hill 1983). Особенностью векторов серии pUP. является локализация полилинкерной области в С-кокце гена lacZ, кодирующего полную последовательность бета-галактозидазы. Встраивание фрагмента чужеродной ДНК в векторы этой серии осуществляют в полилинкер, расположенный между терминирующим и последним значащим триплетом гена бета-галактозидазы. Такая конструкция этих векторов позволяет получать гибридные белки, N-концевая часть которых представлена полноразмерной бета-галактозидазой, а С-конец - белковыми продуктами клонируемого гена или его фрагмента.

Конструирование плазмиды pGag516.

Для получения плазмиды, содержащей последовательность гена gag, был использован Eco47.III- HlndIII-фрагмент генома HTLV-I, кодирующий большую часть (без 8 Н-концевых аминокислотных остатков) GAG-предшественника. Этот фрагмент, с координатами 845-3048.цн, выделенный из плазмиды рМТ2, содержащей полный геном вируса, был.лигирован с ДНК вектора pUC9, гидро-лизнрованной рестриктазами Hindll и Hindlll (рис. 1). После трансформации клеток бактерий E.coli была отобрана промежуточная плазмида размером около 4,8 тыс/ пар нуклеотидов, получив-иая название рЕ1. Далее BanHI-Hindlll фрагмент плазмиды рЕ1 был переклонироваи в полилинкерную последовательность вектора pUR291, гидролизованного BauHI и Hindlll. В результате нами была отобрана рекомОиаантная плазккда, __ получившая название pGagS16, в которой рамка считывания бета-галактозидазы совпадала с фазой считывания гена gag.HTLV-I.

Изучение продуктов экспрессии плазмиды pGagSIö.

Рекомбинантная плазмида pGag516 была способна определять синтез гибридного белка с расчетной молекулярной массой в 163J24 Да. Схема этого гибридного полипептида представлена на рис.2. В составе гибридного белка присутствовал практически весь GAG-предшественник (без 25 N-концевых нуклетидных пар). Однако, при электрофоретическом анализе белков, синтезирующихся в клетках бактерий Е.соП/ pGag516, мы обнаруживали лишь един дополнительный полипептид с молекулярной массой 130 кДа; который на электрофореграмме выглядел в виде размытой полосы. Молекулярная масса гибридного белка и уровень его синтеза был» юте расчетных. И только при анализе белков, синтезирующихся бактериями E.coli HB101/pGag516, с помощью метода иммуноблота мы обнаруживали гибридный полипептид с молекулярной массой 16Е кДа (рис.3), реагировавший с HTLV-1-позитивной сывороткой. Кроме того, на нитроцеллюлозных мембранах мы обнаруживали еще несколько вирус-специфических полос, соответствующих белка» меньшего молекулярного веса.

Наблюдая это распределение белков мы пришли к выводу, чт< низкий выход белка с молекулярной массой 165 кДа может быи связан с его протеолитичсской деградацией, возможно, при участки вирус-специфической протеазы, которая кодируется клонируемым фрагментом и может синтезироваться в клетках бактерий п< механизму сдвига рамки. Возможность реализации указанного механизма в клетках бактерий была продемонстрирована на пример! зякспрессии гена gag-pol вируса иммунодефицита человека в составе мультикопийных векторов (Saitoh et al., 1990).

Получение плазмиды pGdpro и изучение белков, синтезирующихся

под се контролем.

С целыо повышения стабильности рекомбинантного полипепти да мы элиминировали участок нуклеотидной последовательности координатами 2150-2520 пн, примыкающий к 3' -концу гена ga iiTLV-I, которой кодирует вирус-специфическую протеазу (Handma et al.,1584). Для этого был использован Биа1-фрагмент(870 195?. пн) генома HTIV-I, который был; "вырезан из плазмид

re 3 + и 3

pUCP ,

Рис. 1. Схема получения рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности гена gag HTLV-I (выделены жирными линиями). ЕЗ - Eco47.HI; Н2 - Hindll; НЗ - HindHI; S - Sraa I; R1 - EcoRI; В - ВашН1; К - Kcol.

pEHgagl и встроен в вектор pUC5 по Saal-cafiTy (рис.1). Далее в полученную плазмиду pSaal по сайту EcoRI, в котором одноцепо-чечные концы достроила фраглентоа Нленова ДНК-полимеразы I, был встроен линкер, содержащие участок узнавания для рестрик-тазы Hlndlll (CCAAGCTTGC). Полученную таким образом плазмиду назвали pHcol (рис.1). BaoHI -Hlndlll фрагмент pNcol был "Затем переклонирован по одноименным сайтам векторной плазмиды PÜR290. В итоговой конструкции, обозначенной pGdpro, ранки считывания бета -галактозидазы и . фрагмента гена gag HTLT-1 совпадали.

Однако, анализируя спектр белков, синтезирующихся под контролем плазмиды pGdpro, мы вновь не обнаруживали рекомби-нантного белка с молекулярной массой, соответствующей расчетной (159141 Да). Как и в случае рекомбиианта, .синтезируемого под контролем плазмиды pGagS16, лишь исследование экстракта бактерий E.coli HBlßl/pGdpro методом иммуноблота позволило выявить рекомбинантный полипептид близкий к расчетному (рис.3). Важно отметить, что и в этой случае мы выявляли другие вирус-специфические полипептиды меньшей молекулярной массы (рис.3). Таким образом, удаление области, кодирующей вирус-специфическую протеазу не приводило к стабилизации синтезируемого гибридного белка..

Конструирование плазмиды pGdN и изучение продуктов ее экспрессии в клетках бактерий.

Из данных электрофоретического анализа белков, синтезиру-. емых под контролем гибридных плазмид pGag516 и pGdpro следовало, что кодируемые ими гибридные белки оказывались нестабильными в клетках бактерий Е. coli НВ101. При этом расчет молекулярных масс синтезируемых продуктов позволил установить, что возможный участок, обладающий повышенной чувствительостью к прэтеиназам клетки, кодируется областью генома вируса с координатами 870-1253 пн. Для элиминации указанной области, ДНК плазмиды pGdpro была гидролизована Ncol+BamHI, а затем больший из двух фрагментов (размером 5,9 тпн) был лигирован "сам на себя" после достроки "липких концов" с помощью фрагмента Кленова I (рис.1). ,

САС

\2.5Ъ {1952. $

¡рида^ ------

| \\9г>» ; \е>г>51 «

Р 19

р гл

р\?

915*

[р|? 1 Р24 р\5

\ 1

^-СоЦ _ р2.А

I

Рис. 2. Схема гибридных САй-белков. ЕЗ - Eco47.HI; Б - Бша I; N - Нсо1; НЗ - Н1п(Ш1.

"^ЩТ:!' ¿¿J

{.i.VJc^-i'fe-JS^s •

кД*

- 165

_115

_ 92.

Li

1 Z 3» 4

Рис. 3. Анализ белков, синтезирующихся в клетках бактерий Е. coli под контролем рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности гена gag, с помощью метода иммуноблота с ''TLV-I-специфической. сывороткой. 1 - pGag516; 2 - pGdpro; 3 pGdH; 4 - pUR290.

Полученная плазмнда pGdü способна детерминировать синтез белка с расчетной молекулярной массой 145007 Да. Электрофоре-тический анализ белкоз, синтезирующихся в клетках E.coli HBlßl /pGdH при окрашивании Кунасси R-250 позволил выявить присутствие белка сходного колекулярного веса, а объем продукта синтезирующегося под контродем плазмяды pGdH, был сравним с уровнен синтеза бета-галактозидазы. Как следует из рис.3, этот ре-кснбипантный полипептид был способен взаимодействовать с вирус-специфическими антителами сыворотки крови инфицированных HTLV-I.

Таким образом, полученная нами плазмида pGdN в составе зысококопийного вектора pUR290 синтезирует gag-специфический белок расчетного молекулярного веса, который способен реагировать с сыворотками инфицированных HTLV-I людей. За счет использования векторов серии pUR290-292 в конечном итоге удалось достичь высокого выхода HTLV-I-специфического рекомбинантного полипептида, который составляет до 30% от тотального клеточного белка.

ЭКСПРЕССИЯ ФРАГМЕНТОВ ГЕНА env HTLV-I В БАКТЕРИЯХ

Конструирование плазмиды рМСЮ.

Первоначально нами была получена промежуточная конструкция, содержащая вставку PvuII-EcoRI фрагмента генома HTLV -I с координатами 5273-8760 пн по сайтам Smal и EcoRI в векторе pUC19 (Yanisch-Perron et. al.1985.). Эта плазмида, названная р!1С1, содержала большую часть (без 71 нуклеотидного остатка на Б'-концз) гена env (рис. 4).

С целью получения плазмиды, способной кодировать гибридный белок, содержащий практически полную последовательность ENV-предшественнкка, Pstl -фрагмент плазмиды рМС1 (1478 пн последовательности env HTLV-I) клонировали в составе вектора pUR291 (рис.4), также гидролизированного ф.ерментом Pstl. Таким образом, нами была получена рекомбинантная плазмида, обозначенная рИС10, теоретически способная детерминировать синтез гибридного белка в составе которого присутствовала большая часть (без 24-х N-концевых аминокислотных остатков) ENV-пред-

2.2

шествеиника HTLV-I (рис. 5). Расчетная молекулярная иасса гибридного белка составяла 167768 Да.

Однако, сравнительный злектрофорзтвчоскиГг анализ белкой, синтезируемых с клетках бактерий E.coll IBlOl/pKClO, с белкой клеток, несущими векторкув пяазикду pült£9i, ко позволил cöua-рунить дополнительных белков. Болоо того, в зкстршгеах клеток, содорпацнх плазыиду pliC10, с поиоцыз катода'кявувобяота кя. такге не выявляли белков,способных к .споцифочоскоку взаимодействию с антителами сывороток• прфадвровгшшя .'WlV-l. -jut 'как фаза считывания вирус-сасцифйчоскоЗ сосяздоватояьпости в гибридной плазмиде р"С1£ из была ларуЕоца, otcfsotsт тпЗридцого полипептида, по-впдимому, било связало с ого протеоянткческой деградацией. При этой, в связи с тва, что в рЩРт^одераацшс клетках присутствовал балок, по иолалукрроЗ иассе к уровво синтеза сходный с бата-галакгозйдазой, ш прздполоЕнлп. что наиболее доступные для клеточных протевпаз участки располагаются в Н-концевой части EHV-првдвзственпака.

Конструирование плазли^ы рВЕ! и анализ продукты ее экспрессии. '.".'.•'■••; '.Ч-''':'■':.. .

Изучение распределения гидрофобных в гидрофильных остатков в составе гибридного белка с покоцьвпрогракгщ PCGEKE позволяет предполоаить, что возкощтй участок, обладающий повышенной чувствительостьв к протеиназаы клеткинаходитсяв районе стыка gp46 и р21. Для, эламвнацин указанно?} области, ДНК плазмиды рМС1, кодирующей практически полную последовательность поверхностного глнкопротеива gp46, ; бшга гидролизована' BamHI, после чего нанболыанб фрагмент размером 0;85 тпн был выделен из агарозного геля. Полученный BanHI-фрагмент бил встроен в вектор pUR29i; гидролнзированный BaaHI, путейдиги-рования с использованием ДНК лигазы фагаТ4 (рис.4). Полученная таким образом рекомбинангная плазмида, названная рВЕ1, была способна кодировать рекомбинантный белок с расчетной молекулярной массой 149262 Да.

Однако, электрофоретический анализ экстрактов клеток бактерий E.coll НВ101/рВЕ1 продемонстрировал лишь фоновый уровень экспрессии белка с расчетной моекулярной массой, который выявлялся при окрашивании Coumassi R-250 только в виде неясной, размытой полосы. В то ке время, гибридный белок, кодируемый

Рис. 4. Схена получения ргкскбинаитинх плазиид, содержащих последовательности гена cnv HTLV-I (впдолекы знрными лини-яки). Р2 - PvuII; R1 - EccRI; S - Saa I; Pol - PstI; 3 -BamHI; SGI - SalGI. •

пазмидой pBEl, оказывался несколько более стабилЪнш, чем ре-комбинантный полипептнд, синтезирующийся под контролем плазыи-ды рМС10, так как практически неразличимый при окрапиванни Counassi R-250 гибридный белок с расчетной молекулярной иассой все se выявлялся с помощью иммуноблота при использованием сывороток от инфицированных HTLV-I людей (рис.6).

Конструирование плазмиды pESG и анализ продуктов ее экспрессии.

Для повышения уровня синтеза белка, обладающего антиген-Vr- гг •..'•*выми свойствами gp46, SaiGI-фрагмент плазмиды pBEl (рис.4) - ч был субклонирован в состав вектора pUR291. Полученная плазмида

pESG содержала в своем с- таве фрагмент генома HTLV-I с координатами 5694-6120 п.н. Таким образом, pESG должна была детерминировать синтез белка с расчетной молекулярной массой 134517 Да, в котором > отсутствовали Н-концевые последовательности gp46, по -видимому, определяющие нестабильность гибридных ENV-специфических полипептидов в клетках бактерий (рис. 5). В то же время, элиминация этих последовательностей, вероятно, не должна была существенно влиять на антигенные свойства синтези-' руемого продукта, так как, по данным (Chein et al. 1989), основные антигенные детерминанты gp46 расположены именно на С-конце.

Действительно, при электрофоретическом анализе белков. клеток бактерий E.coli HB10i/pESG мы обнаруживали полипептид с молекулярной массой 134 кДа, близкой к расчетной, который отсутствовал в клетках, несущих векторную пазмиду. Полученный рекомбинантный белок обладал способностью взаимодействовать с антителами, присутствующими в контрольных HTLV-1-позитивных сыворотках (рис.6). Продукция рекомбинантного белка с молекулярной массой 134 кДа в бактериях была все же несколько ниже (2-4% от тотального клеточного белка), чем обычно наблюдаемый выход гибридов при использовании данной векторной системы (Williams et al. 1982). Это обстоятельство, по-видимому, связано с высокой нестабильностью продуктов гена env HTLV-I в бактериях Е. coli.

5275 565Ц 612.0 6751

..... ^ | | [е\Ь2. I 1 6665 | 1 1

еыу 1 я^^б ?г\

! Г I I РХ< • 1

ЯР 46

I

Рис. 5. Схема гибридных ЕКУ-белков. Р2 - РуиП; 5 - гаЮГ; В - ВаиН1; Рэ1 -РэМ.

12 3 4

Рис. 6. Анализ белков, синтезирующихся в клетках бактерий Е. coli под контролем рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности гена env, с помощью метода иммуноблота с HTLV-I-специфической сывороткой. 1 - рМС10; 2 - рВЕ1; 3 -pESG; 4 - pUR290.

РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К СТРУКТУРНЫМ БЕЛКАМ HTLV-I С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ.

Использование рекомбинаптных антигенов для детекции антител к вирус-специфическим белкам методом иммуноблота.

Учитывая тот факт, что полученные нами реконбинантные белки, содержащие в своем составе фрагменты GAG- и ENV-пред-вественников HTLV-I, обладали способностью специфично взаимодействовать с антителами сывороток крови HTLV-1-инфицированных лиц, мы изучили возноаность их применения при проведении скрининга сывороток крови методом иммуноблота. Этот метод является высокоспецифнчным, достаточно быстрым н, кроме того, признан в качестве одного из официально-подтверждающих в лабораторном тестировании. В соответствии с критериями ВОЗ (Weekly Epidemiological Record,1991), при использовании в качестве антигена вирусного лнзата результат иммуноблота считается положительным только в случае одновременного выявления антител к продуктам гена gag (р53,р24 или р19) н гена env (gp62/63 или gp46).

Методом иммуноблота было проанализировано 48 сывороток, которые были разбиты на три группы. В первую группу вошли сыворотки, полученные от НТЬУ-Г-инфицированных пациентов в США, Японии, Великобритании н республиках СНГ. Эти образцы предварительно были охарактеризованы в коммерческих иммуноферментных тест-системах, в коммерческом иммуноблоте и, в ряде случаев, с помощью метода цепной полимеразной реакции. Все эти сыворотки были положительными согласно критериям, принятым ВОЗ. Во° вторую группу.вошло несколько сывороток, позитивных в коммерческих нммуно-ферментных тест-системах, по отрицательных при анализе в коммерческом иммуноблоте фирмы "DuPont" (ложно-положительные сыворотки). И, наконец, к третьей группе мы отнесли сыворотки, слабо положительные и сомнительные в коммерческих нммуно-ферментных тест-системах и дававшие неопределенный результат при анализе их методом иммуноблота. Эти образцы реагировали с некоторыми белками при использовании коммерческих конфирматорных тестов, но не могли быть оценены как положительные по критериям ВОЗ. (Эти сыворотки были предварительно

охарактеризованы нами как неопределенные образцы.)

В качестве отрицательного контроля нами были использованы сыворотки, полученные от здоровых доноров и охарактеризованные как HTLV-I-отрицательные при использовании коммерческих имиуно -ферментных тест-систем.

Все сыворотки (21 образец) из первой группы (HTLV-1-пози-тивные) специфически взаимодействовали с генно-инженерным" ENV-антигеном (HB101/pESG), и только 3 сыворотки из этой группы не прореагировало с G^G-специфическим антигеном (HB101/pGdN) и не могли быть признаны позитивными в соответствии с критериями ВОЗ. Однако, для окончательных выводов о чувствительности данного метода необходимо исследование большего числа образцов.. Из семнадцати сывороток с неопределенным статусом лишь две реагировали с ENV-белком (HB101/pESG), а во всех остальных случаях результат был отрицательным. Десять ложно-положительйых сывороток из третьей группы не реагировали с нашими антигенами при их испытании в иммуноблоте. Сыворотки, полученные от здоровых доноров (всего этим методом было проанализировано 12 образцов) в условиях наших экспериментов не реагировали ни с GAG-, ни с ENV-белком.

Использование HTLV-I специфических антигена! в слот-диагностикуме для анализа сывороток крови.

Аналогичные результаты были получены нами при использовании рекомбинантных антигенов в "слот-диагностикуме". В этом случае препараты частично очищенных антигенов наносились штрихами на нитроцеллюлозный фильтр без предварительного разделения белков с помощью электрофореза.

Вирус-специфические антигены полученные в виде телец включения из клеток суперпродуцентов E.coli HB101/pESG (ENV), HB101/pGdN (GAG), а также препарат бета-галактозидазы из клеток штамма HB101/pUD290 (отрицательный контроль) после растворения в ЗМ мочевине наносились на нитроцеллюлозную мембрану штрихом. Вирус-специфические антигены в двух концентрациях наносили на расстоянии 0,5 см от верхнего и нижнего краев, а контрольные полосы, содержащие бета -галак&зидазу (для удобства сравнения) - в центре. Оценку наличия антител в сыворотках крови проводили путем сравнения интенсивности окрашивания по-

лос, соответствующих рекомбинаитным белкам, с полосой, соответствующей контрольному препарату бета-галактозидазы. При обследовании того же пула сывороток этим методом мы наблюдали полное совпадение результатов с данными иммуноблота.

Использование рекомбинантных антигенов для выявления антител к структурным белкам HTLV-1 в сыворотках крови иммуноферментным методом на 96-тилуночных планшетах.

С целью изучения возможностей использования полученных нами рекомбинантных антигенов для проведения первичного скрининга сывороток нами был разработан лабораторный вариант имму-ноферментной тест-системы, позволяющий осуществлять анализ сразу большого числа образцов. Эти исследования осуществлялись совместно со старшим научным сотрудником фирмы "Илья Мечников" при Институте вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова РАМН М.Р.Бобковой. В этом методе частично очищенные рекомбинантные антигены сорбировались на 9б-тилуночных планшетах.

В результате анализа описанной выше панели сывороток все HTLV~I положительные сыворотки первой группы (см. Еыие) прореагировали в непрямом варианте ИФА с вирус-специфическими белками, а все сыворотки с неопределенным результатом (17 образцов) и все ложно-положительные (10 образцоа) дали отрицательные результаты.

С целью определения специфичности этой тест-системы нами было дополнительно проверено 110 HTLV-I-отрицательных сывороток, ранее охарактеризованных с помощью коммерческих тест-систем. В результате анализа этой панели 3 сыворотки давали сла-бопоожительный сигнал, что соответствует 97%ной специфичности исследуемого теста.

Анализ сывороток, полученных от лиц из групп риска и or, здоровых доноров, на наличие HTLV-l-специфических антител.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что полученные нами рекомбинантные антигены могут быть использованы для анализа сывороток крови человека на наличке антител к продуктам генов gag и env HTLV-I. С помощью разработанного нами лабораторного варианта иммуно-ферментного метода обнаружения антител к структурным белкам HTLV-I мы проанализн-

ровали две панели сывороток. Первая панель состояла из 543 образцов, полученных от лиц, больных различными формами гемоб-ластозов, и была собрана в Москве, во Всероссийском Гематологическом Центре РАИН. В основном это были взрослые пациенты с острым лимфобластным лейкозом, острым миелобластным лейкозом, хроническим лимфолейкозом или хроническим миелолейкозом. Вторая панель состояла из 858 сывороток, полученных от здоровых* доноров на территории Европейской части Российской Федерации.

Позитивные в ИФА образцы анализировались затем с помощью метода иммуноблота с рекомбииантными антигенами, а, в ряде случаев, с помощью коммерческого конфирматорного теста фирмы "DuPont". В результате такого скрининга ни один из образцов ие был признан положительны.., * на основании чего можно сделать вывод о том, что частота встречаемости HTLV-I в исследуемых

популяциях не превышает 0,18% и 0,11%, соответственно.

>

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов получены рекомби-нантные плазмиды, детерминирующие в бактериях Escherichia coll, синтез гибридных полипептидов, обладающих антигенными свойствами структурных белков Т-лимфотропного вируса человека I типа. Показано, что стабильность таких гибридов в бактериальных клетки существенно повышается после элиминации из их состава Н-концевых последовательностей вирус-специфических белков.

Показано, что рекомбинантные белки, синтезирующихся в бактериях могут быть использованы в качестве антигенов в различных лабораторных вариантах тест-систем, как конфирмационных, так и скрининговых. С помощью разработанных методов обнаружения антител к структурным белкам HTLV-I в сыворотках крови было проверено 1400 сывороток от здоровых доноров и больных различными формами гемобластозов. В результате такой проверки не было обнаружено сывороток, дающих позитивный результат, что свидетельствует, по-видимому, о низкой инфицированности HTLV-I в Российской Федерации.

ВЫВОДЫ

1. Получен набор рекомби'--.нтных плазмид, содернацих различные фрагменты генов gag и env Т-лимфотропного вируса человека I типа.

2. Плазмиды pGdN и pESG обеспечивают в клетках E.coli штамма НВ101 высокий уровень синтеза рекомбинантных полипептидов, обладающих антигенными свойствами белков HTLV-I Г ; (р24,р17) и ENV (gp46), соответственно.

3. Элиминация Н-концевых последовательностей GAG- к ENV-предшественников существенно повышает устойчивость гибридных полипептидов к действию бактериальных протеиназ.

4. На основе полученных рекомбинантных антигенов,, содер-ващих фрагменты структурных белков HTLV-I, разработаны лабораторные варианты тест-систем для выявления антител к белкам GAG и ENV HTLV-I.

5. В результате анализа антител к продуктам генов gag и env HTLV-I в 1400 образцах сывороток крови, полученных в Европейской части России от больных различными формами лимфоблас-тозов и здоровых доноров, не было обнаружено положительных образцов .

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Санков М.Н., Бобков А.Ф., Гараев М.М. -"Экспрессия .„ GAG-предшественника вируса Т-клеточного лейкоза I типа (HTLV-I) в клетках бактерий Escherichia coli". "Вопросы вирусологии", 1991, No 4. с.325-326.

2. Санков М.Н., Бобков А.Ф., Гараев И.М. -"Конструирование штаммов E.coli - продуцентов гибццдных полипептидов с антигенными свойствами GAG-предшественника HTLV-I". Тезисы докладов V Всероссийской конференции "Новые направления биотехнологии", » 18-22 мая 1992 г., г. Пущино-на-Оке, с.66.

3. Санков Н.Н., Бобков А.Ф., Гараев И.К. -"Экспрессия GAG-предшественника b«f -л Т-клеточного лейкоза человека типа I в клетках Escherichia coli: изучение стабильности и анти-геннных свойств вирус-специфических гибридных белков". "Молекулярная генетика, микробиология, вирусология", 1993, No 5, с.31-34.

4. Гараев М.М., Бобков А.Ф., Санков М.Н. -"Рекомбинантная пазмида pGdN, определяющая синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса Т-клеточного лейкоза человека I типа, способ ее конструирования и втамм бактерий Escherichia coli - продуцент гибридного белка, обладающего антигенными свойствами вируса". Заявка No 93-058018/13(058064) с приоритетом от 30.12.93 г.

5. Санков М.Н., Вобков А.Ф., Гараев М.М. -"Экспрессия гена поверхностного гликопротеида gp46 вируса Т-клеточного лейкоза чеовека типа I (HTLV-I) в бактериях". "Молекуярная генетика микробиология, вирусоогия", 1994, No 3, с.23-25.

6. Гараев М.М., Бобков А.Ф., Санков.М.Н. -"Рекомбинантная плазмида pESG, определяющая синтез гибридного белка, обладающего антигенными свойствами поверхностного гликопротеида оболочки вируса Т-клеточного лейкоза человека I типа, способ ее конструирования и штамм бактерий Е coli HB101/pESG - продуцент гибридного белка". Заявка No 94-030309(030320) с приоритетом от 16.08.94 т.