Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль устойчивости Escherichia coli K-12 к вирулентному фагу Cl

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самсонов, Виктор Васильевич, Москва

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ

МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи Экз. N 2

САМСОНОВ Виктор Васильевич

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ УСТОЙЧИВОСТИ ESCHERICHIA COLI Kl 2 К ВИРУЛЕНТНОМУ ФАГУ С1.

03.00.15. — Генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Руководитель к.б.н. Синеокий С. П.

Москва - 1998

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................................................................................3

L ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: "Структуры клетки, вовлеченные в процесс

фаговой инфекции и системы транспорта в Escherichia coli.".............. 6

1. Компоненты оболочки бактерий, как рецепторы фагов и колицинов. .......................................................................................................... 6

1.1. Основные компоненты наружной мембраны Escherichia coli. ...... 6

1.1.1. Основные пориновые белки. ...................................................... 6

1.1.2. АПС — основной компонент внешней мембраны. .............. 10

1.1.3. Фосфолипиды. ............................................................................. 14

1.1.4. Энтеробактериальный антиген и капсулярные полисахариды. ......................................................................................... 14

1.1.5. Белки — рецепторы фагов и колицинов, участвующие в специфическом транспорте. ................................................................ 15

1.2. Муреиновый слой. ................................................................................. 17

1.2.1. Молекулярная структура муреина и его связь с внешней

и цитоплазматической мембранами. ................................................... 17

1.2.2. Строительство муреинового слоя. ............................................. 18

1.3. Цитоплазматическая мембрана. ........................................................... 19

1.3.1. Липидные компоненты. ................................................................. 19

1.3.2. Белковые компоненты. ................................................................. 19

1.4. Периплазма и секреция белков. .......................................................... 21

1.4.1. Структура периплазматическош пространства. ...................... 21

1.4.2. Белки периплазмы. ........................................................................ 22

1.4.3. Машина экспорта. ......................................................................... 231.5. Белки участвующие в специфическом транспорте. ........................ 24

1.5.1.Внешыемембраныые транспортеры. .............................................. 24

1.5.2. ABC транспортеры. .......................................................................... 26

1.6. Транспорт аминокислот. ......................................................................... 28

1.6.1. Использование различных систем для транспорта одной АК.. 30 1.7. Транспорт витамина В12 ..................................................................... 32

2. Бактериальные белки используемые фагами и колицинами для проникновения в клетку. ................................................................................... 35

2.1. Транспорт колицинов. ............................................................................... 35

2.2. ТопВ и ТЫА зависимые транспортные системы и импорт макромолекул в Escherichia coli. .................................................................... 36

2.2.1. Свойства мутантов по гену tonB. .................................................. 36

2.2.2. Взаимодействие транспортеров и ТопВ. .................................... 37

2.2.3. Участие белков ЕхЬВ и ExbD в ТопВ зависимом транспорте. ................................................................................................... 38

2.2.4. Продукты генов tol и импорт макромолекул в Е. coli. .......... 38

2.2.5. Механизм транспорта макромолекул системой Tol. ............... 40

2.2.6. Взаимозаменяемость белков ТопВ — ЕхЬВ — ExbD и

TolA — TolQ — TolR. ....................................................................................... 40

2.3. Фаговая инфекция. ................................................................................... 41

П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .......................................................................... 46

1. Бактерии, фаги и плазмиды. ................................................................... 46

2. Среды и химикаты. .................................................................................... 48

3. Генетические методы. ................................................................................ 49

4. Утилизация витамина В12. .......................................................................... 49

5. Методы работы с ДНК. ............................................................................... 49

6. Анализ внутриклеточных белков. ............................................................. 51

7. Комплементационный анализ. ................................................................. 52

8. Анализ адсорбции фага С1. ....................................................................... 52

9. Фракционирование компонентов оболочки клеток. ........................... 52

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................. 54

1. Клонирование генов deiA и dcrB. .......................................................... 55

2. Локализация генов dcrA и dcrB внутри клонированных фрагментов ДНК и на физической карте Е. coli. .............................. 56

3. Анализ нуклеотидной последовательности генов dcrA и dcrB. ......... 59

4. Оперонная организация экспрессии гена dcrB. .................................. 60

5. Идентификация продукта гена dcrB.......................................................... 61

6. Локализация белка DcrB в мембранных фракциях. .......................... 62

7. Влияние наличия или отсутствия гена dcrA в клетке на экспрессию dcrB. .......................................................................................... 63

8. Утилизация витамина В12 в мутантах dcrA и dcrB. ............................. 64

9. Плейотропные эффекты, вызванные отсутствием или избытком

гена dcrA в клетке. .................................................................................. 66

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................. 68

ВЫВОДЫ ................................................................................^^ 72

ЛИТЕРАТУРА ......................................................................................................... 72

ВВЕДЕНИЕ, Актуалынюсть темы.

В последние годы были предприняты значительные усилия по изучению функций, синтеза, химического состава структурных компонентов оболочки грамотрицательных бактерий, особенно Escherichia coii и Salmonella typhymurium. Одним из способов, позволяющим находить минорные, несущественные в лабораторных условиях белки мембран, является изучение бактериальных мутантов по адсорбции соответствующих фагов и транспорту колицинов.

У энтеробактерий известно более 500 различных фагов, которые подразделяются на несколько групп на основе характеристики их нуклеиновых кислот, особенностей морфологии, антигенных различий, спектра хозяев и резистентности к некоторым агентам, таким, как эфир, хлороформ, нагревание (Ackerman H.W. 1987). Различные хвостовые отростки, длинные (сократимые или несократимые) или короткие, могут иметь разные рецепторные сайты на поверхности клетки. Из 500 проанализированных фагов энтеробактерий, 143 принадлежат к морфологическому типу с длинным несократимым хвостом (Ackeriman H.W. 1987). Это — самая большая группа фагов и у других видов бактерий.

Функция фагового рецептора заключается в опознавании специфических сайтов хвостового отростка фага, что является первым этапом взаимодействия клетки и фага, предшествующим инъекции ДНК вируса внутрь клетки. Обычно 1 фаг узнает только один белок, но существуют и исключения, когда фаг может использовать 2 или 3 различных белка в качестве рецепторов (Morona R. et al. 1984). Изучение фаговых рецепторов грамотрицательных бактерий имеет так же большое значение для практики: — биотехнологии (получение фагорезистентных штаммов продуцентов), эпидемиологии (фаштипирование и таксономия), — инфекционной патологии (при уропатогенной инфекции

наблюдается адгезия белка PapF пилей Е. coli, расположенных в конце нитей бактерий, с эпителием хозяина по типу взаимодействия белковых компонентов с рещепторными сайтами бактерий) (Lindberg F. et al. 1987).

Щель ш задачи шсследовашшя. Целью настоящей работы было фенотипическое и генетическое изучение мутаций, сообщающих клеткам штаммов Escherichia coli устойчивость к вирулентному фагу О. Для этого предполагалось исследовать влияние мутаций на функции клетки, клонировать гены, мутации в которых вызывают резистентность к О и установить локализацию продуктов этих генов в клетке.

В связи с этим ставились следующие задачи:

— исследование фенотипических свойств мутантов по адсорбции С1;

— клонирование фрагментов хромосомы Е. coli, содержащих гены dcr (deficiency of CI resistance), мутации в которых сообщают бактерии устойчивость к фагу О;

— локализация генов dcr путем субклонирования фрагментов полученных рекомбинантных фазмид, несущих изучаемые гены, на мультикопийыые векторы;

— определение нуклеотидной последовательности генов dcrA и dcrB;

— определение молекулярных весов продуктов генов по предсказанной аминокислотной последовательности и сравнение их с молекулярными весами, полученными при помощи экспериментов с максиклетками;

— определение местоположения белка DcrB в клетке;

— проверка возможного участия продуктов генов dcrA и dcrB в транспорте

витамина BJ2 в бактериях.

Новюшга ¡результатов* Идентифицировано три гена dcrA, dcrB и dcrC, контролирующих адсорбцию фага С1. Показано, что ген dcrC идентичен известному гену ЫиВ, ответственному

за адсорбцию фага BF23, некоторых колицинов и транспорт витамина В12, ген der А идентичен sdaC (транспортер серина), и последовательность dcrB совпадает с рамкой считывания ORF_o203, гипотетического гена, описанной Sofia et al. (1994). .

Определена нуклеотидная последовательность участков хромосомы, включающих гены dcrA и dcrB. Показана оперонная организация ORF__o221 и dcrB.

Идентифицирован продукт гена dcrB — процессируемый белок с мол. весом 18 кДа. Он локализован в периплазме и внутренней мембране.

Обнаружена супрессия фенотипа С1 резистентности в штаммах с точковыми мутациями в dcrB при введении в них гена dcrA/sdaC на мношкопийной плазмиде.

Показано, что клетки несущие мультикопийнуго плазмиду с геном dcrA/sdaC перестают нормально делиться и образуют филаменты на богатой среде при 42°С. Мутанты по гену dcrA в 3 раза устойчивее к Ь —лактамным антибиотикам, чем родительский штамм, что предполагает возможное dcrA на функционирование пенициллин — связывающих белков.

Предложена модель адсорбции фага С1.

шолучюгашшж результатов. Результаты изучения генетического контроля фагорезистентности в клетках Е. coli позволяют: — получить фашустойчивые штаммы продуценты;

— выявить детали механизма транспорта макромолекул клеткой;

— более детально представить механизмы взаимодействия хозяин — паразит.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ, L Комшогаешппы оболочки бактерий, как решртторы фагов ш колшшрнов.

Клеточная оболочка грамотрицательных бактерий, таких как Escherichia coli, имеет сложную структуру. Она состоит из внутренней или цитоплазматической мембраны, пептидогликанового слоя и внешней мембраны. Между внутренней мембраной и пептидогликаном имеется пространство, называемое периплазмой, где содержится ряд ферментов гидролиза и "связывающие белки". С оболочкой связаны существенные клеточные функции, такие как деление клетки, размер, репликация и разделение хромосомы, контроль синтеза макромолекул, морфогенез органелл и фагов, транспорт метаболитов и т. д.

Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий интенсивно изучалась в последние годы. Поэтому настоящий обзор может вместить только краткое изложение основных результатов исследований в этой области.

Внешняя мембрана содержит относительно небольшое количество белков. Среди них имеются муреиновый липопротеин, главные мембранные белки, и группа белков, которые служат рецепторами для фагов, колицинов и специфических транспортируемых веществ.

Поскольку порины идентифицированы и описаны для 32 видов бактерий (Hancock R.E. 1987.), а так же для наружных мембран митохондрий и хлоропластов эукариотических клеток (Benz R. 1985.), весьма вероятно, что основные мембранные белки выполняют одинаковые функции. Детальное изучение рецепторных белков фагов помогает исследовать транспорт специфических субстратов, и сделало возможным передачу генетического материала в отдаленные виды микроорганизмов путем фаговой трансдукции, в

частности за счет введения гена 1атВ, кодирующего рецепторный белок фага лямбда, в бактерии других видов: Agrjbacterium, Pseudomonas, Rizobium и др. (Ludwin R.A. 1987).

Порины кодируются генами отр¥, отрС и phoE Е. coli. Их продукты образуют относительно неспецифические поры или каналы, через которые могут проникать маленькие гидрофильные молекулы, преодолевая барьерный эффект внешней мембраны. Ген phoE уникален тем, что экспрессируется только в условиях голодания по фосфору. Таким образом, в обычных условиях синтезируются только QiripF и QnipC, но их относительные количества находятся под эффективным контролем осмотической активности среды и температуры. Общее количество поринов велико и относительно постоянно. Имеются обширные гомологии между нуклеотидными последовательностями генов отр¥, отрС и phoE. Белок OrnpF является рецепторным компонентом для фагов Tula и Т2, a OnipC — Tulb и Т4. Мутанты, резистентные к фагу Т2, имеют сниженное количество белка OrnpF. Фаг Т2 инактивируется in vitro смесью QixipF и ЛПС (липополисахарид). Отдельно OrnpF или АПС не обладают нейтрализующей активностью. Однако для инактивации мутантов по кругу хозяев нужен только белок OmpF. Недавно было выяснено, что фаг Т2 может пополнить список фагов, способных узнавать больше одного рецептора. Известно, что мутанты, резистентные к фагу Т2, возникают с низкой частотой. Это наблюдение заставило предположить, что фашрезистентность является следствием одновременных мутаций в нескольких генах. Было обнаружено, что мутация во вторичном локусе, кроме отрЕ, необходима для полной резистентности к фагу Т2. Этот локус назвали ttr (Т — two resistant). При дальнейших исследованиях установили, что он идентичен гену fadL, кодирующему мембранный белок, участвующий в транспорте длинноцепочечных жирных кислот Е. coli.

Предполагается, что более важным рецептором для фага Т2 является продукт гена fadL, а не белок OnipF (Morona R. et al. 1986.). Существует выраженная альтернатива выбора Т — четными фагами более одного рецепторнош сайта на поверхности хозяйской клетки, что может определяться более чем одним фаговым геном.

Кроме фагов Т —четной группы, некоторые лямбдоидные фаги также могут использовать пориновые белки в качестве рецепторов. Было замечено, ' что штаммы Е. coli, в которых отсутствует ОтрС, резистентны к лямбдоидному фагу 434. Очищенный белок ОтрС обладает способностью инактивировать фаги 434 и A,virh434. Добавление АПС не приводит к усилению нейтрализующей активности белка (Hamtke К. 1978). Штамм Е. coli В, в котором отсутствует этот порин, резистентен к фагу 434, что дополнительно указывает на то, что рецептором фага и является ОпарС. Интересно, что ген J фага X, который кодирует белок хвостовой нити фага, на 90% гомологичен J — гену лямбдоиднош фага 434. Однако фаг 434 не взаимодействует с рецептором фага X, белком — LaniB. Изменение по крайней мере 10% аминокислотной последовательности белка хвостовой нити фага существенно влияет на рецепторные взаимодействия с клеткой.

Другой лямбдоидный фаг, РА—2, имеющий много общего с фагом 434, также использует в качестве рецептора белок OnipC (Bassford P. et al. 1977). Некоторые пориновые белки могут выполнять взаимозаменяемые рецепторные функции. Так, белок LamB, являющийся рецептором фага X, может взаимодействовать с мутантами по кругу хозяев фага Tula — TPI, хотя в норме рецептором фага Tula является белок OnipF.

Белок LarnB секвенирован. Он имеет большое сходство с пориновыми белками: LainB образует тримеры, не вымываемые из мембраны SDS (тогда как

другие белки экстрагируются детергентами), имеет обширные участки "b — sheet" структуры и может быть связан с пептидогликаном.

Основной мембранный белок ОтрА, является мономером. Он похож на порины, но выходит из мембран при обработке SDS при низкой температуре. Мутанты по гену отрА имеют уменьшенную скорость транспорта различных веществ. Это трансмембранный белок, осуществляет связь с пептидогликановым слоем и образует комплекс с АПС (ЛПС защищает OnipA от случайного гидролиза), участвует в поддержании целостности наружной мембраны (Schweizer М. et ai 1978.). OimpA осуществляет не только барьерную функцию, но и служит рецептором для некоторых фагов Т —четной группы: Ох2, TuIP и КЗ (Hancock R.E. et al. 1978). Белок также необходим при конъюгативном скрещивании бактерий. Он определяет чувствительность клеток к колицинам К и L (Skurray R.A. et al. 1974). Увеличение дозы гена отрА приводит к падению уровня основных мембранных белков OimpF и ОпгрС, а также белка LaniB и липопротеина в наружной оболочке клеток. Дальнейшее увеличение продукции ОтрА является летальным для клетки. Наружные мембраны многих грамотрицательных бактерий содержат основной белок, который серологически родственен белку ОпарА из Е. coli К12. Белок ОтрА из Serratia marcescens и Enterobacter aerogenes определяет чувствительность к фагам КЗ и ОхЗ, но не активен в конъюгации. Ген отрА из Salmonella typhimurium так же клонирован в Е. coli. При этом, синтезируемый белок ОтрА, который по своей функции в конъюгации бактерий и восприятию колицинов не отличается от белка Е. coli, не может служить в качестве рецептора для специфических фагов КЗ и TuIP (Freudl R. et al. 1983).

Структурный ген белка PhoE локализован на 6 —й минуте хромосомы Е. coli (Tommassen J. and Lugtenberg В. 198L). По крайней мере три гена, pAoB, R, и М,

участвуют в регуляции экспрессии гена phoE. Белок PhoB является активатором транскрипции структурных генов. В свою очередь, на выражение гена phoB влияют продукты генов phoR и рАоМ. Мутанты по гену phoE резистентны к фагам Тс45 и Тс23 (Chai TJ.,Foulds J. 1978). Эти фаги имеют морфологию, схожую с морфологией Т —четных фагов, но отличаются по морфологии бляшек, урожайности на клетку и другим признакам.

Другим пориновьш белком является бе