Новая DcrA-DerB зависимая система транспорта ДНК бактериофагов в Escherichia coli K-12

Самсонов, Валерий Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Новая DcrA-DerB зависимая система транспорта ДНК бактериофагов в Escherichia coli K-12
ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Новая DcrA-DerB зависимая система транспорта ДНК бактериофагов в Escherichia coli K-12"

На правах рукописи

Самсонов Валерий Васильевич

НОВАЯ DcrA-DcrB ЗАВИСИМАЯ СИСТЕМА ТРАНСПОРТА ДНК БАКТЕРИОФАГОВ В ESCHERICHIA COLI К-12

03.00.05 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в ВКПМ Государственного Научно-Исследовательского Института Генетики и Селекции Промышленных Микроорганизмов (ФГУП ГосНИИГенетика)

Научный руководитель:

Доктор биологических наук С.П. Синеокий

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук профессор Н.К. Янковский Кандидат биологических наук В.А. Лившиц

Ведущая организация:

Институт Молекулярной Генетики РАН

диссертационного совета Д 2/?.(?13,01 при Государственном Научно-Исследовательском Институте Генетики и Селекции Промышленных Микроорганизмов (11?545, Москва, 1-й Дорожный проезд, дом 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИГенетика.

Защита состоится «

2003г на заседании

Автореферат разослан « Э

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат биологических наук В.И. Щербакова.

Актуальность темы-Механизмы транспорта различных веществ внешней среды через оболочку бактерий, таких как сахара, аминокислоты, комплексы железа, витамины, антибиотики, нуклеиновые кислоты интересуют ученых с давних пор. И этот интерес не ослабевает, подогреваясь интересом создания искуственных мембран. Именно поэтому в последние годы предпринимаются значительные усилия по изучению функций, синтеза, химического состава структурных компонентов оболочки грамотрицательных бактерий, особенно, Escherichia coli и Salmonella typhymurium.

Транспорт различных веществ внешней среды через мембраны бактерий осуществляется специфическими транспортными белками. Сравнение их структуры и аминокислотных последовательностей указывает на консерватизм данных макромолекул не только бактерий, но также многих транспортеров клеток животных. Таким образом, изучение бактериальных транспортных систем исключительно важно для нашего понимания общих механизмов переноса веществ через клеточную мембрану. Наличие общих структурных мотивов и эволюционирующих областей предполагает, что многие транспортеры содержат центральный модуль, образующий трансмембранный канал, через который растворенные вещества могут проникать в клетку. Механизмы энергизации можно рассматривать как вторичные характеристики, добавленные к этим фундаментальным транспортирующим единицам.

Следствием широкомасштабного использования антибиотиков в медицине стало возникновение и распространение патогенных штаммов бактерий, обладающих устойчивостью ко многим из них. В связи с этим в последнее время ожила идея фаготерапии, т.е. использование природных фагов или их продуктов (убивающие белки разного типа), а также бактериальных продуктов, часто контролируемых дефектными профагами или плазмидами (бактериоцины), для лечения бактериальных инфекций. Транспортные системы клеток используются многими фагами для инфекции, а бактериоцинами для достижения соответствующих мишеней внутри бактерий. Одной из функций хвостовых белков фага является опознавание специфических участков рецептора, находящегося в клеточной оболочке. Это первый этап взаимодействия клетки и фага, предшествующий инъекции вирусной ДНК внутрь клетки. Обычно один фаг узнает только один белок внешней мембраны, но существуют и исключения, когда фаг может использовать два или три различных белка в качестве рецепторов (Morona R. et al. 1984). Вторым этапом инфицирования является инъекция ДНК фага внутрь клетки. Для этого некоторым вирусам необходимы дополнительные белки внутренней мембраны или'п—™»™»- ——

Одним из способов, позволяющим находить минорные, несущественные в лабораторных условиях белки мембран, является изучение бактериальных

мутантов, дефектных по адсорбции соответствующих фагов и транспорту бактериоцинов. В тоже время, чтобы увеличить возможности фаготерапевтических методов лечения необходимо: 1 ) исследование механизмов бактериальной устойчивости, свойственных данному виду бактерий, и относительная частота возникновения спонтанных мутаций, приводящих к даному виду устойчивости ;2) исследование способности фагов преодолевать разные типы устойчивости (расширение коллекций, отбор мутантов и т.п.);3) осуществление поиска новых фагов, использующих разные рецепторы для адсорбции (В.Н. Крылов. 2001).

Исходя из вышеизложенного, изучение мембранных белков необходимых для проникновения фагов в клетку грамотрицательных бактерий имеет большое значение для практики:

в биологии, для более полного понимания процессов транспортировки макромолекул через оболочку бактерий и механизмов взаимодействия систем хозяин-паразит; в биотехнологии, для получения фагоустойчивых штаммов -продуцентов;

в эпидемиологии, для фаготипирования и таксономии; в медицине, для развития методов фаготерапии; в генной инженерии, для конструирования новых векторов.

Цель и задачи исследования.Целью настоящей работы было:

определить возможность участия белков DcrA и DcrB в транспорте макромолекул внешней среды, на примере инфекции фагов, совместно с различными белками внешней мембранны, подобно хорошо изученным системам внутренней мембраны Топ, Toi и Pel;

идентификация соответствующих белков внешней мембраны; уточнение механизма инфицирования бактерий фагами, для которых необходимы продукты генов der А и dcrB\ определение возможных функций этих белков в клетке.

В связи с этим ставились следующие задачи:

выделить из окружающей среды новые фаги, процесс инфицирования которых зависит от продуктов генов dcrA и dcrB\ идентифицировать гены, продукты которых являются рецепторами для выделенных фагов;

уточнить механизм проникновения выделенных фагов внутрь клетки и этапы, на которых участвуют продукты генов der к и rfcrB;

охарактеризовать выделенные фаги;

изучить влияние белков DcrA и DcrB на проницаемость внешней мембраны в процессе адсорбции соответствующих бактериофагов. Новизна результатов.!? данной работе:

применен оригинальный метод поиска новых бактериофагов с заданными свойствами;

выделен из окружающей среды и частично охарактеризован новый бактериофаг, названный С6, для адсорбции которого необходимы продукты генов der А и dcrB\

идентифицирован рецептор, необходимый для адсорбции данного фага, белок внешней мембраны FhuA.;

система FhuA-зависимого транспорта макромолекул пополнилась дополнительным компонентом. Показано, что белок внешней мембраны FhuA в процессах транспорта функционально может быть связан не только с "Топ" системой, но и с ещё одной новой системой "DcrAB";

показано, что белки DcrA и DcrB в процессах инфицирования фагами действуют совместно и функционально могут связываться, по крайней мере, с двумя различными белками внешней мембраны BtuB и FhuA.

показано участие белков DcrA и DcrB во второй стадии адсорбции фага - инъекции, т.е. перенос фаговой ДНК через мембрану;

показано влияние белков DcrA и DcrB на формирование открытого канала во внешней мембране в процессе адсорбции фагов С1 и С6 на поверхности бактерии;

показано, что фаги С1 и С6 обладают способностью к общей транедукции, что крайне редкое явление для фагов Е. coli. предложена новая стратегия конструирования векторов, основанная на использовании бактериофагов в качестве факторов контр-селекции.

Научно-практическая значимость работы и практическое

использование_полученных_результатов.Научно-практическая

значимость работы:

предложена новая модель проникновения ДНК фага в клетку, что позволяет расширить представления о механизмах транспорта макромолекул через клеточную мембрану,; показано функциональное взаимодействие белка внешней мембраны FhuA с белками DcrA и DcrB, позволяя дополнить данные о разнообразии функциональных взаимодействий различных компонентов оболочки бактерий в процессе инфекции фагов;

показана роль белков DcrA и DcrB в процессе инфекции бактериофагов. Комплекс DcrAB определен как новая полифункциональная система Е. coli, подобная Ton, Toi, Pel; сконструирован новый вектор, в основе которого использование гена dcrB в качестве маркера при селективном отборе.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации

докладывались на межлабораторном семинаре ГосНИИГенетика (2003). По результатам работы опубликована одна развернутая статья.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 204 наименования. Диссертация содержит 16 рисунков и 10 таблиц.

1. Бактерии, фаги и плазмиды. Описание использованных в работе бактериальных штаммов и плазмид дано в таблицах III-1,2. Таблица III-1. Штаммы Escherichia coli К12.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штамм

Генотип

BKnM(CGSC#: 3591) BKnM(CGSC#: 2849) ВКПМ ВКПМ BKnM(CGSC#:4315) ВКПМ ВКПМ

Источник

CR63

AB 2849

В-7321

В-3718

KL209

В6619

N99

lamB supD mer А tsx siipE aroC

W3350 ompC::Tn5 rcsC173 W3350 ompFv.TnlO

metEv.TïïlO Hfr sup53 malB KL209 btuBl galKT

W3350 galKT ВКПМ (CGSC#: 5976)

В 6817 W3350 dcrA60:\CKY ВКПМ

В 6884 W3350 dcrB20::RSM (KmO ВКПМ

В 6882 W3350 dcrB20::RSM (Kmr), dcrA60:\CAT данная работа

С 600 supEAA, thi-\, thr-\, leuB6, lacY\,jhuA2\, mcrA ВКПМ (CGSC#: 3004)

В 7119 POP3 malT::Tnl0 ВКПМ

В 2416 W3110 lacZ::Tnl0 ВКПМ

В 6887 W3350 C6'JhuA' (W3350C6R5 группа 1) данная работа

W3350C6R-n (где п от 1 до 100), W3350 С6Г данная работа

Таблица III-2. Плазмиды, применяемые в данной работе.

Плазмиды Характеристика Размер Источник

PRK404 10.6 тпн ВКПМ

pDcrA pRK404::cfovi 12.6 тпн ВКПМ

pDcrB pUC19 v.dcrB 5.7 тпн ВКПМ

pFhuA pUC19 v.fliuA 5.6 тпн данная работа

pUC19 2.7 тпн ВКПМ

pDcrB-Tc pDcrB ::Tcr 8.6 тпн данная работа

pDcrB-gpr pDcrB с участком ДНК 7.7 тпн данная работа

фага 173

ВКПМ - Российская Национальная Коллекция Промышленных Микроорганизмов. ГНИИГенетика. Российская Федерация. Москва. 1-ый Дорожный пр-д., д 1.

2 CGSC# - Е. coli Genetic Stock Center 830 Kline Biology Tower MCD Biology Department 266 Whitney Ave., PO box 208103 Yale University, USA.

Все фаги (PI vir, T4gt7, CI, BF23, X, ф80, T5, T6, Tula, TuII*, Tl, 434) взяты из ВКПМ, C6 выделен из сточных вод в ходе данной работы.

2. Среды и реактивы. Штаммы Е. coli выращивали при температуре 37°С (бактерии несущие плазмиду pDcrA, при 30°С) в жидкой или на агаризованной среде LB (Maniatis, Т., et. al.,1982) или на минимальной среде М9 и М63 (Maniatis, Т., et. al.,1982) с необходимыми добавками - глюкоза (0.4%), аминокислоты (40 мкг/мл), тиамин (10 мкг/мл), витамин В12 (от 1 до 10 нг/мл), стрептомицин (Sm) -50 мкг/мл, ампицилин (Ар) - 100 мкг/мл, канамицин (Km) -100 мкг/мл, тетрациклин (Тс) - 10 мкг/мл, хлорамфеникол (Cm) - 20 мкг/мл.

3. Поиск фагов, процесс инфекции которых зависит от белков DcrA или

DcrB. Для поиска использовались два изогенных штамма: штамм дикого типа W3350 (см. табл. 1-1) и производный от него штамм W3350 dcrA,В", У которого отсутствуют внутримембранный белок DcrA и периплазматический белок DcrB (Likhacheva., et al. 1996). Поиск осуществлялся в сточных водах животноводческих ферм. Пробы сточных вод центрифугировались, надосадочная жидкость освобождалась от бактерий стерилизацией хлороформом. В ней содержалось приблизительно 4500 бактериофагов на мл. Экспоненциально растущие клетки штаммов W3350 DcrAB- и W3350, были собраны, повторно ресуспендированы в 0,1 мл стерилизованных хлороформом сточных вод (соотношение концентраций W3350dcrA,B" к W3350 как 1:10) и залиты в агаризованный верхний слой на чашки с богатой средой. Мутные негативные колонии (возможно DcrAB-зависимые или умеренные бактериофаги) были проверены на способность инфицировать штаммы W3350 dcrA", W3350 dcrB', W3350 dcrA'(pDcrA), W3350 dcrB'(pDcrB) и W3350.

Фаги, растущие на штаммах W3350dcrA"(pDcrA), W3350dcrB"(pDcrB) и W3350, но не растущие на штаммах W3350dcrA" либо W3350dcrB" далее отбирались для работы.

4. Генетические методы. Для трансдукции с помощью фагов PI vir (Miller, J.H., 1972) и T4gt7 (Wilson, G.G., et.al., 1979) были использованы стандартные методы. Инактивация генов dcrA и dcrB с помощью кассет, несущих ген антибиотикоустойчивости, проводилась по методике, как описано ранее (Winans, S.C., et. al., 1985).

5. Методы работы с ДНК. Выделение хромосомальной, плазмидной и фаговой ДНК, трансформацию плазмидной ДНК и трансфекцию фаговой ДНК проводили по методикам, описанным Маниатисом с соавторами (Maniatis., et al. 1982).

Реакции рестрикции, лигирования, затупления концов ДНК, фосфорилирования и дефосфорилирования проводили согласно методикам, описанными Маниатисом с соавторами (Maniatis, Т., et al.,1982) и в соответствии с протоколами, разработанными фирмой "Promega". В работе использовались ферменты НПО "Фермент" (Вильнюс), "Promega" (США) в условиях, рекомендованных изготовителем.

Электрофорез ДНК проводили в агарозных гелях в трис-ацетатном буфере с бромистым этидием (1 мкг/мл). Фрагменты ДНК выделяли из легкоплавкой агарозы по методике, описанной в сборнике (Maniatis, Т., et. al.,1982).

6. Клонирование fhuA гена Е. coli К12. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) была осуществлена амплификация нуклеотидной

последовательности гена fhuA Е. coli. Праймеры для ПЦР были подобраны, исходя из секвенса хромосомы Е. coli, фланкирующего данный ген (5'-ctg gat сса tct tta taa taa tea t-3' и 5'-ctg gat cct tac gca gtg caa aag tg-3'). Для реакции использовалась AmpliTaq ДНК полимераза (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, Calif.). Параметры ПЦР: 30 циклов; денатурация ЗОсек при температуре 94°С; отжиг - ЗОсек при 55°С; продолжительность реакции синтеза цепи ДНК 3 мин при 72 °С. Результат ПЦР: один фрагмент длиной 2900 н.п. Этот фрагмент клонирован на плазмидный вектор pUC19. Результирующая плазмида была названа pFhuA и применялась для комплементационного анализа бактериальных штаммов, содержащих мутацию fhuA гена.

7. Комплементационный анализ. Комплементация мутаций в генах fliuA, der А и dcrB осуществлялась при трансформации соответствующих плазмид и анализировалась при помощи адсорбционного анализа и высева на газон с соответствующим фагом.

8. Анализ адсорбции С1 и С6 фагов. При анализе адсорбции фагов хозяйский штамм W3350 служил позитивным контролем, а фагоустойчивые штаммы BtuB" или FhuA" - негативным. Эти контрольные штаммы обрабатывались параллельно с мутантными по генам dcrA и dcrB. Разведение ночной культуры бактерий 1:100 в свежем бульоне Luria-Bertani подращивали при 37°С до 5x108 клеток/мл. Клетки отмывались в 0.8 % растворе NaCI и ресуспендировались в исходном объеме данного раствора.

Далее объединяли и перемешивали 100 мкл фаговой суспензии (5X10

фага/мл), 100 мкл бактериальной суспензии с концентрацией 5X10 клеток/мл и добавляли хлорамфеникол до конечной концентрации 100 мг/мл. Смесь инкубировали при 37°С 10 мин. Бактерии осаждали центрифугированием (I2.000xg, 3 мин) и 100 мкл надосадочной жидкости высевали в верхний слой вместе со штаммом дикого типа на агаризованную LB-среду. Количество неадсорбированных фаговых частиц сравнивалось с исходным количеством фаговых частиц, высеваемых в качестве контроля (Fralick., et al. 1990).

9. Получение мембранных фракций клеток Е. coll Для получения мембранной фракции клеток мы использовали метод описанный Zaror et al. (1988). Бактерии выращивали в 250 мл колбах содержащих LB-бульон с соответствующими антибиотиками до поздней экспоненциольной фазы роста, осаждали, ресуспендировали в 3 мл 10 мМ Tris-HCL (pH 8.0) и разрушали ультразвуком. Лизат клеток был отделен от интактных клеток центрифугированием при 12000xg в течение 20 мин. Супернатант далее подвергли ультрацентрифугированию при 40000xg 12 мин (Beckman TÍ65 rotor). Осадок мембранных белков был тщательно ресуспендирован в

физиологическом растворе.

10. Тест на чувствительность к SDS. Клетки выращивали при 37°С в LB-среде до значения оптической плотности OD6oo=0.5. Затем их отмывали и ресуспендировали при 20°С в 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0.2% глюкозе, 0.5 мМ КС1, 1 мМ СаС12, 1 мМ MgS04, рН 7.2, доводя OD600 до 0.20-0.35. Начало отсчета времени считали от момента добавки фагов С1 или С6, а SDS (от 0.5 до 1,5% конечной концентрации) добавляли на 2 мин позже. Далее, через определенные интервалы времени, измерялось OD6oo клеточной суспензии (Bonhivers., et al. 1996).

11. Измерение необратимости адсорбции фагов. 0,5 мл экспоненциально растущей бактериальной культуры (5x108 клеток/мл), не чувствительной к бактериофагу из-за мутации в dcrA или dcrB гене, был смешан с суспензией бактериофага (множественность инфекции 1). После 10 минут адсорбции при 30 °С, клетки отмывали от не адсорбированного бактериофага в LB бульоне. Клетки с адсорбированными бактериофагами были, затем высеяны на чувствительный к фагу бактериальный газон W3350. После ночной инкубации при 30°С проводили подсчет негативных колоний, которые доказывали бы обратимость адсорбции.

12. Электронная микроскопия. Для получения электронных микрофотографий фага С6 его очищали, осаждали на сетке, фиксировали и окрашивали как описано в работе Lundrigan с соавторами (М. D. Lundrigan et al. 1983). Исследование проводилось на электронном микроскопе Siemens Elmiskop 101.

Для получения электронных микрофотографий фагов, адсорбированных на клетке, брали 4x109 клеток/мл, смешивали их с соответствующими фагами при множественности 20 фагов/кл, проводили педварительну адсорюбцию 20 мин при 37°С. Клетки с адсорбированными фагами готовили для электронной микроскопии как описано Scandella et al.(1974). Исследование проводилось на электронном микроскопе Siemens Elmiskop 101.

13. Выход фага. Выход фагов С1 и С6 определяли по методу описанному Birge (Birge, Е. А. 1981). Клетки инфицировали с множественностью инфекции 0,1. После 7 мин инкубации клетки разводили в подогретой до 37°С среде и, разделив на несколько пробирок, инкубировали еще 25 мин. После этого содержимое каждой пробирки высевали в верхний слой с добавлением чувствительной к фагу культуры на агаризованную LB-среду. Выход фага подсчитывали по БОЕ (БляшкоОбразующим Единицам).

14. Анализ инактивации бактериофага. Анализ инактивации бактериофага проводили по (Mondigier., et al. 1995) с некоторыми

модификациями. 10 мкл фаголизата (титр: ЗхЮ7 в мл) было смешано с 90 мкл раствора, содержащего мембранные фракции DcrA" или DcrA+ клеток. После 10 минуты инкубации при 30°С были отобраны аликвоты по 10 мкл и разбавлены 500-кратно в воде. После интенсивного перемешивания аликвоты по 100 мкл были смешаны с 5 мл верхнего агаризованного слоя, содержащего 200 мкл бактериальной суспензии Е. coli W3350 (OD^H), и разливался на LB агаризованную среду.

15. ПЦР амплификация рибосомальных фрагментов. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) была осуществлена амплификация нуклеотидной последовательности рибосомального фрагмента Е. coli, который содержался в ДНК, выделенной из частиц бактериофагов Cl и Сб. Праймеры для ПЦР были подобраны, исходя из секвенса хромосомы Е. coli, фланкирующего данную область (8f-5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и 1492r-5 '-GGTTACCTTGTTACG АСТТ-3 '). Для реакции использовалась AmpliTaq ДНК полимераза (Perkin-Elmer Cetus, Foster City, Calif.). Параметры ПЦР: 30 циклов; денатурация ЗОсек при температуре 94°С; отжиг - ЗОсек при 50°С; продолжительность реакции синтеза цепи ДНК 2 мин при 72 °С. Результат ПЦР один фрагмент длиной 1500 н.п.

Результаты.

Выделение бактериофагов, зависящих от продуктов dcrA и dcrB генов, но не от btuB. Продукты генов dcrA и dcrB располагаются соответственно во внутренней мембране и периплазме. Из литературных данных известно несколько белковых систем внутренней мембраны (Топ, Toi и Pel), которые в процессе выполнения своих обязанностей в клетке могут функционально связываться с различными белками внешней мембраны (Phc.IV-I). Так «То1»-система функционально может взаимодействовать с такими белками внешней мембраны как Tsx, OmpF и BtuB в процессе проникновения внутрь клетки колицинов группы «А», а также с белками F-пилей в процессе инфекции нитчатыми фагами Я, М13, fd. «Топ»-система взаимодействует с FecA, FepA, FhuA, BtuB, lut и Cir белками в процессе транспорта витамина В12 и феррихромов, а также в процессе инфекции фагами Т1 и ф80 и проникновении колицинов группы «В». И, наконец, «Ре1»-система, которая функционально взаимодействует с белками LamB и ОтрС в процессе инфицирования фагами X и 434, соответственно. Для того чтобы определить могут ли белки DcrA и DcrB функционально взаимодействовать с другим белком внешней мембраны отличным от белка BtuB, мы решили использовать фаги в качестве инструмента.

ÇolA Vit .В 12

m ~

ColB Tl,phi8n 434 ?

Toi Ton ™ Der

Рис. IV-1. Функциональные связи Ton, Toi, pel систем и возможные функциональные связи DcrAB системы.

Для этого осуществили поиск новых бактериофагов в образцах сточных вод с животноводческих ферм Московской и Рязанской областей, нормальное развитие которых зависит от продуктов генов ёсгА и ёсгВ.

Поиск бактериофагов осуществляли в образцах сточных вод с животноводческих ферм Московской и Рязанской областей. Для направленного выявления интересующих нас фагов был применен новый метод отбора из негативных колоний (НК), образованных на смешанном газоне пермиссивных для искомых фагов (\V3350) и изогенных, но непермиссивных клеток (\V3350dcrAB) (Рис.1У-2.).

Сточные хода . ж-' "

Мутные НК (умеренные Ясные НК фаги не кии ¿сгАВ-захисимые фаги , зависящие от ДсгА и <кгВ

Двойной газон

W3350 и W3350<lcrAB-

ТО350 У73350 \V3350dcrA- Ш3350 ТОЗЗОДсгВ-<кгА- (рОсгА) <1сгВ- (рВсгВ) Рис.1У-2. Схема отбора фагов, для развития которых нужны ОсгА и ЭсгВ.

На таком газоне вирулентные бактериофаги, не зависящие от функционирования генов dcrA и dcrB, должны образовывать светлые НК, а умеренные и зависящие от этих генов бактериофаги, - мутные НК. Сточные воды титровали на предмет определения концентрации фаговых частиц. На двойной газон высевали такой титр, чтобы количество НК существенно не превышало 100. Экспоненциально растущие клетки штаммов W3350dcrAB" и W3350, были собраны, и повторно ресуспендированы в 0,1 мл стерилизованных хлороформом сточных вод соответствующего титра (соотношение концентраций W3350dcrA,B" к W3350 как 1:10). Данную смесь вносили в агаризованный верхний слой на чашки с богатой средой. Бактериофаги из мутных НК проверялись на способность инфицировать W3350dcrA" (В6817), W3350dcrB" (В6884), W3350dcrA' (pdcrA), W3350dcrB' (pdcrB) и W3350. Бактериофаги, выросшие на dcr+ хозяевах, но невыросшие ни на одном из der мутантов, были отобраны и далее проанализированы на штаммах btuB" и btuB+.

Бактериофаг Сб. В процессе поиска мы выделили бактериофаг, получивший название Сб. Он не растет на клетках мутантных по генам dcrA и/или dcrB, но растет на клетках BtuB". С6 - вирулентный бактериофаг, образующий ясные бляшки среднего размера с узким ореолом. Для того чтобы охарактеризовать фаг С6 по морфологии мы сделали его электронную микрофотографию(Рис.1\/-3).

ж * ■ yf#

Рис.ЬЛЗ. Электронная микрофотография фаговой частицы Сб. Размер масштабного отрезка 45 нм.

Головка фаговой частицы икосаэдрическая с диаметром 45 нм (для сравнения головка фага С1- 55 нм). Хвост, размером приблизительно 160 нм в длинну (для С1- 150 нм) и 10 нм в диаметре, на фотографиях имеет различные конфигурации. Из этого мы заключили, что он достаточно

гибкий. Мы не обнаружили свидетельств сократимости хвоста, наличия базальной пластины и других дополнительных структурных частей. По всем признакам фаг С6, подобно фагу С1, можно отнести по классификации Н. Ackermann в отряд - Caudovirales, род - Siphoviridae, вид - "Т1-подобные" вирусы (Maniloff, J., and Ackermann, H.-W. 1998). В таблице IV приведены сравнительные характеристики фаговых частиц рода "Siphoviridae" (Лихачева и др. 1990).

Таблица IV-1. Размеры некоторых фаговых частиц рода "Siphoviridae"

Фаг Размер фаговых частиц, нм.

Диаметр головки Длина хвостового отростка

BF23 68 170

Т5 65 200

X 54 150

С1 55 150

С6 45 160

Мы определили, что латентный период развития фага С6 при инфицировании клеток \V3350 составляет 25мин, а средний выход - 90 частиц из зараженной бактериальной клетки при выращивании бактерий с

хорошей аэрацией на богатой среде LB при 37°С.

Исследуя свойства бактериофагов С1 и С6 мы обнаружили не специфическую для фагов Е. coli способность осуществлять общую трансдукцию бактериальных генов

Способность бактериофагов к общей трансдукции. Фаги, осуществляющие трансдукцию хозяйских генов, являются важным фактором горизонтального переноса генов в бактериях, участвуя в их эволюционном развитии. Интерес к горизонтальному переносу генов в природе стимулируется также дискуссией о риске связанном с применением генетически модифицированных микроорганизмов. В последнее время участились попытки оценить вклад различных механизмов переноса генов. Наибольшее влад в горизонтальный перенос генов вносят конъюгативные плазмиды, меньшее влияние оказывает трансформация, т.е. проникновение внутрь клетки свободно плавающей в среде ДНК. Хотя наибольший вклад в горизонтальный перенос генов вносят конъюгативные плазмиды, фаги могут внести ощутимое влияние на данный процесс. В работе Schicklmaier, Р. (1994) показано, что, по крайней мере, 95% природных штаммов Salmonella enterrica имеют профаги и около 60% из них осуществляют общую трансдукцию. Для клеток Escherichia coli хорошо изученных

трансдуцирующих фагов не так много. Из них только два осуществляют общую трансдукцию - это PI, широкого круга хозяев, и мутантный фаг Т4.

На фоне вышеизложенного нам интересно было исследовать бактериофаги С1 и С6 на их способность к общей (неспецифической) трансдукции. Для этого мы использовали способ, предложенный для поиска трансдуцирующих фагов в Salmonella enterrica. Фаг, обладающий способностью к общей трансдукции, с определенной частотой запаковывает фрагменты хромосомы, содержащие рибосомальные гены. Выделяя ДНК запакованную в фаговых частицах и амплифицируя её соответствующими праймерами, залипающими в области рибосомальных генов клетки, можно определить наличие или отсутствие данных фрагментов в запакованных частицах. При наличии соответствующих контролей и присутствии нужного фрагмента в амплификате можно с большой долей уверенности утверждать, что данный фаг обладает способностью к общей трансдукции. В качестве отрицательного контроля брался фаг X, в качестве положительного фаг PI. Праймеры для амплификации рибосомальных фрагментов были 8f-5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и 1492r-5 '-GGTTACCTTGTTACGАСТТ-3'. Результаты наших исследований показали наличие рибосомальных фрагментов в фаговых частицах как СI так и Сб.

Для подтверждения возможности фагов С1 и С6 осуществлять общую трансдукцию, мы подобрали штаммы с маркирванными транспозоном ТпЮ генами в различных частях хромосомы клетки Е. coli (В 7119 и В 2416) (см. табл.Ш-1 в «МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ»), Данные штаммы служили в качестве доноров, в качестве реципиента использовали штамм N99. Лизаты фагов С1 и С6 на донорных штаммах получали по методу Миллера применительно к фагу PI без добавок ионов Са2+ (см. «Материалы и методы»). Процесс трансдукции также проводили по Миллеру без добавок ионов Са2+ с различными разведениями фаголизатов. Селекцию проводили на среде, содержащей тетрациклин. Колонии выросшие на селективной среде после трансдукции проверяли на наличие фенотипа, соответствующего мутациям переносимых генов. Частота трансдукции фагами С1 и С6 составляет порядка 10'7 на инфицированную клетку. Таким образом данное свойство фагов С1 и С6 - это редкое свойство для фагов Е. coli, которое интересно само по себе и возможно для использования в генетических исследованиях

И так мы определились с инструментом для поиска новых функциональных связей белков DcrA и DcrB - это новый бактериофаг Сб. Поскольку развитие С6 не зависит от продукта гена BtuB, мы провели поиск компонента внешней мембраны, который служит для него рецептором.

Идентификация рецептора для Сб. Для определения белка-рецептора, ответственного за адсорбцию бактериофага С6, мы использовали два подхода. В первом подходе, мы проверили чувствительность к С6 известных Е. coli мутантов, дефектных по белкам внешней мембраны, которые служат рецепторами для адсорбции различных бактериофагов Е. coli. Во втором, мы изолировали бактериальные мутанты, устойчивые к бактериофагу С6 и проверили их чувствительность к фагам, для которых известны рецепторы в Е. coli.

Результаты первого подхода показали (табл. IV-2), что бактериофаг С6 использует для адсорбции только рецептор FhuA. Проверенные мутанты Е. coli, в которых отсутствуют такие рецепторы как: LamB (CR.63), Tsx (АВ2849), OmpC (В-7321), OmpF (В-3718), и BtuB (В6619) - были чувствительны к С6 и только С600, несущий мутацию в FhuA был устойчив к Сб.

Реализуя второй подход, было отобрано 100 независимых мутантов Е. coli, устойчивых к бактериофагу С6 (W3350C6R1, ... - W3350C6R100). Они были проверены на устойчивость к бактериофагам Т5, Т1,ф80 (рецептор FhuA), X (рецептор LamB), Т6 (рецептор Tsx), 434 (рецептор OmpC), Tula (рецептор OmpF), TuII* (рецептор OmpA), и BF23, С1 (рецептор BtuB). Результаты эксперимента показали (табл .IV-2), что почти две трети мутантов, устойчивых к С6 были также устойчивы к Т5, Т1 и ф80 (группа I), а оставшаяся треть проверенных мутантов была устойчива только к бактериофагу С1 (группа II).

Таблица IV-2. Устойчивость спонтанных мутантов W3350C6R к фагам, для

Бактериофаги Устойчивость спонтанных

(рецептор) мутантов

I группа II группа

Т5(FhuA) + -

Т1(FhuA) + -

ф80 (FhuA) + -

X (LamB) - -

Т6 (Tsx) - -

Tula (OmpF) - -

TuII* (OmpA) - -

BF23 (BtuB) - -

CI (BtuB) - +

434 (OmpC) - -

M_j_1l

устойчивые;"-" - чувствительные.

Разумно предположить, что первая группа мутантов дефектна по рецептору БИцА, а вторая группа - по ОсгА или ЭсгВ белкам.

Это предположение было подтверждено результатами

комплементационного анализа при помощи плазмид с клонированными генами pFhuA (pUC19::fhuA), pDcrA(pRK404::dcrA) или pDcrB(pUC19::dcrB) соответственно (см. "Материалы и методы"). В качестве контроля в этих опытах использовался штамм С600, как FhuA", штаммы W3350dcrA60::CAT и W3350dcrB20::RSM, как DcrA" и DcrB". Плазмида pFhuA комплементировала все C6R мутции из 1 группы, в то время как C6R мутции из 2 группы комплементировались pDcrA, или pDcrB. В контроле плазмиды pDcrA, pDcrB и pFhuA комплементировали мутации в штаммах W3350dcrA60::CAT, W3350dcrB20::RSM и С600, соответственно.

Полученные данные показывают, что белки DcrA и DcrB в двух процессах, а именно инфекции фагов Cl и С6, действуют совместно, и составляют новую систему внутренней мембраны, которая наряду с «Топ», «Toi» и «Pel» -системами, может функционально связываться с различными х.

белками внешней мембраны (BtuB и FhuA).

На какой стадии в процессе инфекции фагов участвуют белки DcrA и DcrB? Исходя из местоположения белков DcrA и DcrB в клетке, нам было важно определить, на какой стадии процесса инфицирования фагами работает данная система. Возможны три вартанта:1) они участвуют непосредственно в процессе взаимодействия рецепторного белка с хвостом фага и влияют на прочность их связывания (Рис.1У-4(А)); 2) они принимают участие в процессах внутреннего развития фага (Рис.1У-4(В)); 3) возможно их участие в процессе инъекции ДНК фагов (Рис.1У-4(С)). ч-

Т ■ .'Ч

А)"" ^

Рис. 1У-4. Стадии процесса инфекции фагов, в которых могут участвовать белки ОсгА и ОсгВ. А. Влияние на обратимость или необратимость взаимодействия фага с его рецептором на поверхности клетки. В. Влияние на внутреннее развитие фага. С. Влияние на инъекцию ДНК фага.

Влияние DcrA и DcrB на внутреннее развитие бактериофагов. Для

того чтобы определить влияние продуктов генов dcrA и dcrB на внутреннее развитие бактериофагов, мы провели трансфекцию ДНК фагов Cl и С6 в соответствующие мутанТные (150 - 250 БОЕ/мкг Cl ДНК и 230 - 270 БОЕ/мкг С6 ДНК) и родительский штамм W3350 (270 БОЕ/мкг Cl ДНК и 320 БОЕ/мкг С6 ДНК). Эти результаты показывают, что гены dcrA и dcrB существенны только на ранних стадиях развития бактериофага, поскольку, их повреждение не оказывает влияния на эффективность развития фагов внутри клетки после проникновения в нее фаговой ДНК.

Можно ожидать, что белки, один из которых функционирует во внутренней мембране (DcrA), а другой в периплазме (DcrB), или служат сигналом для необратимой адсорбции или участвуют в процессе проникновения ДНК фага через мембраны. Например, Pel белок, который встроен во внутреннюю мембрану, необходим для проникновения ДНК фага лямбда в бактериальную клетку. (Williams., et al. 1986).

Анализ процесса адсорбции фагов Cl и Сб. Проверяя влияние DcrA и DcrB на взаимодействие фагов с рецепторами BtuB и FhuA, мы измеряли эффективность адсорбции бактериофагов Cl и С6 на мутантных клетках (Табл.1У-3) и мембранных фракциях данных клеток (Табл.ГУ-4), как описано в "Материалах и методах".

Табл.1У-3. Адсорбция Cl и С6 на штаммах Е. coli W3350 и фагоустойчивых мутантах._

Фаги Исходное количество частиц фага в суспензии (БОЕ/мл) Количество неадсорбированного фага, оставшегося в суспензии после 10 мин адсорбции (БОЕ/мл).*

W3350 В6817 (W3350 dcrA-) В6884 (W3350 dcrB-) В6887 (W3350 fliuA-) В6619 Сbtuß-)

Cl 2500 750 600 500 750 2450

С6 2600 1170 520 530 2500 1040

- определены средние значения по результатам трех экспериментов с отклонением не больше 10 %.

Как видно из полученных данных клетки, мутантные по dcrA и dcrB генам, адсорбируют фаги С1 и С6 даже более эффективно, чем это делают клетки штамма дикого типа W3350. В тоже время, мутанты по btuB или fhuA, соответственно, были явно дефектны по адсорбции (Табл.1 V-3). В условиях нашего эксперимента, никакой активный бактериофаг не отделялся от клеток после адсорбции С1 или С6 ни в dcr+, ни в der-

бактериях. То есть бактериофаги С1 и С6 образуют довольно устойчивую связь с бактериальной поверхностью и на нее не влияют der мутации.

Подобные результаты были получены при измерении эффективности инактивации С1 и С6 на мембранных фракциях клеток (Табл.1У-4). Для стандартизации концентрации мембранных фракций различных штаммов мы измерили эффективность инактивации бактериофагов Т4 и BF23 на тех же мембранных фракциях.

Табл.1У-4. Инактивация С1 и С6 бактериофагов на мембраных фракциях клеток.

Фаги Исходное количество частиц фага в суспензии (БОЕ/мл) Количество не адсорбированного фага, оставшегося в суспензии после 10 мин адсорбции (БОЕ/мл).*

W3350 W3350 dcrA60::CAT

Т4 3 х 106 1.8 х 106 1.8 х 106

BF23 3 х 106 1.5 х 105 1.5 х 105

С1 3 х 106 3.6 х 105 6.0 х 104

С 6 3 х 10б 1.8 х 106 1.7 х 106

определены средние значения по результатам трех экспериментов с отклонением не больше 10 %.

Наши результаты показывают, что dcrA и dcrB мутации не затрагивают процессов, происходящих на первой стадии инфицирования клеток бактериофагами, т.е. не участвуют во взаимодействии с рецепторами. Дополнительное доказательство того, что взаимодействие С1 и С6 бактериофагов с поверхностью клеток мутантных по dcrA и dcrB генам необратимо, был получено при высеве соответствующих мутантов, отмытых от фага после адсорбции, на чувствительный к бактериофагу бактериальный газон, как описано в "Материалах и методах". Этот эксперимент показал, что эффективность образования негативных колоний меньше чем 10"6 на адсорбированный бактериофаг.

Влияние ЭсгА и ОсгВ на инъекцию фаговых геномов внутрь клетки. Исходя из данных приведенных выше, путем исключения, мы сделали заключение, что ОсгАВ-система влияет на процесс инъекции ДНК фагов внутрь клетки, т.е. участвуют в формирования сигнала о начале инъекции или в создании поры во внутренней мембране бактерии

Для визуализации процесса взаимодействия бактериофагов С1 и С6 с клетками дикого типа и мутантами по генам с!сгА и с!сгВ, мы сделали электронные микрофотографии. На электронных фотографиях фаговые частицы с головкой, заполненной ДНК, выглядят темными, пустые головки частиц выглядят светлыми. Анализ полученных микрофотографий показал, что головки фаговых частиц адсорбированных на клетках дикого типа пустые, т.е. происходит инъекция генома фага С1(С6) внутрь клетки (Рис.1\/-5(а)). В тоже время инъекции геномов бактериофагов С1(С6) в клетки с мутациями в генах с!сгА и с!сгВ не наблюдается, головки фаговых частиц заполнены ДНК фага (Рис.1\/-5(б, в).

в)

Рис. IV-5. Электронная микрофотография демонстрирующая процесс инъекии геномов фагов С1(С6) внутрь клетки хозяина, а) Клетки дикого типа (W3350). б) Клетки с мутацией dcrA гена (W3350dcrA'). в) Клетки с мутацией dcrB гена (W3350dcrB').

Анализ чувствительности бактерий к SDS при адсорбции бактериофагов С1 и Сб. Не влияя непосредственно на эффективность взаимодействия бактериофагов с рецепторными белками, белки Dcra и DcrB могут участвовать в процессе формирования открытого канала во внешней мембране клетки при адсорбции фагов на её поверхности. Простой способ проверить это предположение - определить чувствительность бактерий к детергентам, типа SDS, после фаговой атаки на клетки. Хорошо известно, что внешняя мембрана Е. coli проявляет значительную устойчивость к различным детергентам, таким как SDS. Однако при нарушении целостности внешнемембренного барьера SDS получает доступ к цитоплазматической мембране и разрушает её, приводя к лизису бактерии. Это происходит, например, в клетках со специфическими делециями гена fhuA, а также после добавления бактериофага Т5 к бактериям. И в первом и во втором случае происходит образование открытого канала во внешней мембране, и клетки становятся чувствительными к SDS. Измеряя оптическую плотность клеточной суспензии в присутствии бактериофага С1 или С6 и SDS, мы получили следующие результаты (Pmc.IV-6).

Изменения оптической плотности клеточной суспензии в присутствии бактериофага С1 или С6 и SDS были проведены при 20°С, при множественности бактериофага 50 (см. "Материалы и методы"). В этих условиях, связывание бактериофага с рецептором происходит в течение 2 мин. На Рис.1У-6а показано, что добавление 1% SDS после С1 или С6 приводит уже через 4 минуты к уменьшению в OD600 почти в 3 раза для С6 и в 7 раз для С1. Добавление к клеткам суспензии бактериофага (данные не i

показанны) или только SDS не вызывает такого уменьшения. Эти результаты показывают, что SDS получает доступ к цитоплазматической мембране после взаимодействия бактериофага с рецептором.

Результаты, представленные на Рис.1У-6Ь, демонстрируют • чувствительность мутантных по гену dcrA клеток к SDS. Из графика видно, что адсорбция фага С1 повышает чувствительность dcrA' клеток к SDS, как и клеток дикого типа. В противоположность этому, фаг С6 почти не « увеличивает чувствительность dcrA* клеток к SDS.

Инактивация гена dcrB (Рис.1У-6с) приводит к другому результату. Фаг С6 практически совсем не изменяет чувствительности клеток, а С1 оказывает слабое влияние на чувствительность. Данные результаты показывают, что белки DcrA и DcrB, очевидно, могут принимать участие в открытии диффузионных каналов через внешнюю мембрану после адсорбции бактериофага или оказывать влияние на их формирование (а) W3350 (b) W3350 dcrA60::CAT

Д4 0,31

тп

(с) W3350 dcrB20:\RSM

0,35

SDS

SDS + C1 -A- SDS + C6

o-l-,-,-,-.--.-.-,-1-,

0123456789 10 11

1Ш1

Рис. IV-6. Влияние адсорбции бактериофагов C1 и C6 на чувствительность бактериальных штаммов к SDS. Графики изменение оптической плотности OD600 клеток Е. coli от времени для следующих штаммов: а) W3350, Ь) W335OderА60::СAT, с) W3350 dcrB20::RSM после адсорбции бактериофага. Бактериофаги С1 и С6 (множественность инфекции около 50) были добавлены в момент времени 0 мин , а SDS (1 % конечная концентрация) был добавлен 2 минутами позже. Величины являются средними по результатам трех экспериментов.

Вектор прямой селекции, основанный на свойствах взаимодействия фага с клеткой хозяина. Предпосылки для конструирования новых векторов. Постоянно растущее количество биотехнологических процессов, в которых генетически модифицированные микроорганизмы могут, как загрязнять окружающую среду, так и нейтрализовать токсичные вещества после техногенных аварий требует применять новые подходы к конструированию векторов. Такие векторы должны удовлетворять определенным критериям. Наиболее важные из них это: 1) стабильное поддержание генно-инженерных конструкций; 2) уровень экспрессии гетерологичных генов, который не ухудшает селективного состояния бактерии, в особенности при конкуренции с природными микроорганизмами; 3) отсутствие генов определяющих устойчивость к антибиотикам, 4) возможность прямой селекции рекомбинантных плазмид. Учитывая спрос и исходя из наших данных полученных в работе, а именно: низкая частота спонтанных мутаций, ведущих к устойчивости к фагам С1 и С6 и высокая устойчивость клеток с мутациями в генах dcrA и dcrB к суперинфекции фагами, мы предложили новую стратегию конструирования векторов прямой селекции с

последующей возможностью интеграции клонированных генов в хромосому клетки. Ключевым звеном этой стратегии является методология использования фагов, как инструмента для контр - селекции.

Принципы, лежащие в основе новой системы прямого отбора рекомбинантных плазмид с возможностью последующей интеграции клонированного фрагмента в хромосому. Экспрессия клонированного на векторе pUC19 гена dcrB (pDcrB) в мутантной по этому гену бактерии Е. coli вызывает гибель клетки-хозяина при высеве на твердый агар, содержащий фаги С1 и Сб. Вставка в указанный ген на плазмиде чужеродной ДНК приводит к синтезу дефектного пептида, не способного участвовать в процессе инфекции. В результате клетки, содержащие такие конструкции, выживают на фаговом газоне. Таким образом, в пуле трансформированных клеток будут обнаруживаться только колонии, содержащие плазмиды со вставками клонируемой ДНК. В то время как клетки, в которые попал не расщепленный рестриктазой вектор pdcrB, благодаря восстановлению гена dcrB в результате лигирования, неполной рестрикции и т.д., приводящие обычно к появлению "фона", будут погибать (рис.1У-7а).

Рис.IV-7 а) Схема клонирования в вектор прямого отбора и способ отбора рекомбинантных плазмид. б) Схема интеграции клонированного на новом векторе фрагмента ДНК в ген dcrB хромосомы Е. coli.

Avain

ГснХ

5> m Avant

<l'iB в \ромосоме

Мы также разработали и описали систему получения стабильных вставок чужеродных генов в хромосому Е. coli, не использующую гены антибиотикоустойчивости в качестве маркеров. Клонированные на вектор прямой селекции pdcrB гены легко переносятся в хромосому бактерии, замещая дикий аллель dcrB при гесА зависимой рекомбинации. Отбор интегрантов проводится при высеве содержащих рекомбинантную плазмиду бактерий на фаговый газон С1и Сб. При этом выживают только клетки, в которых дикий аллель dcrB на хромосоме замещается на инактивированный аллель, содержащий вставку в виде клонированного фрагмента. В данной системе отпадает необходимость использования генов антибиотикоустойчивости (в качестве селективного маркера) рядом или внутри клонированного гена. Образуются стабильные вставки в ген dcrB, несущественный для роста бактерии (рис.1У-5б).

Примеры клонирования фрагментов ДНК, содержащих геи tetA (придает клетке устойчивость к тетрациклину) и участка генома фага 173 (придает клетке устойчивость к некоторым лямбдоидным фагам). Фрагмент ДНК размером 2,9 т.п.о., содержащий ген tetA, был перенесен из вектора mini-Mu/ux(Tc-r) (Engebrecht J, Simon M, Silverman M. 1985), обработанного эндонуклеазой Avaiii, на вектор pDcrB, обработанный тем же ферментом (Phc.IV-8). Сайт узнавания эндонуклеазы Avaiii лежит внутри гена dcrB, поэтому в рекомбинантных плазмидах клонированные фрагменты ДНК должны разделять этот ген на две части, приводя к отсутствию его экспрессии. После лигирования лигазную смесь трансформировали в клетки dcrB", а затем высевали на селективные среды:

LB с ампицилином и тетрациклином (контроль количества трансформантов с касетой tetA); - LB с ампицилином и фагами С1 и С6 (опыт).

Количество колоний выросших на чашке с тетрациклином и чашке с фагами было примерно одинаково. При пересеве 100 колоний с чашки, содержащей фаги, на среду с тетрациклином все колонии оказались устойчивыми к антибиотику. Полученная рекомбинантная плазмида получила название pDcrB-Tc.

Фрагмент ДНК размером 2 т.п.о., содержащий участок хромосомы фага 173 с генами, придающими клетке gprB фенотип (устойчивость к заражению фагом 173), был перенесен в Avaiii сайт вектора pDcrB (Phc.IV-8). После лигирования лигазную смесь трансформировали в клетки dcrB", а затем высевали на селективную среду- LB с ампицилином и фагами С1 и Сб. Из выросших колоний 10 были использованы для выделения плазмид и проверены на наличие вставки гетерологичной ДНК в ген dcrB. Также они были исследованы на приобретение клетками gprB фенотипа. Все 10

Колонии Ар-г, Тс-г

/ Лигирование

^ V трансформация

^ в ¿сгВ-штамм / * Ар-гС1(С6).гТс-г

^ Пересев уг

на Тс '

^ >(С0) Ар-г С1 (С6)-г П

У ) Лигирование Колонии Проверка

N. трансформация Ар-г, С1(С6)-г на наличие __р. Ар-гС1(С6)-г$рг+г

Ч в <1сгВ-штамм В фенотипа -------

->■ -►

|бргВ |

ч\\

Лр-г С1(Сб)-г Ёрг-

Рис.1У-8.Схема клонирования фрагментов ДНК, содержащих ген 1е1А и участка генома фага 173

плазмид имели вставки ДНК в ген ёсгВ, а клетки несли устойчивость к фагу 173 (§ргВ фенотип). Полученная рекомбинантная плазмида получила название рОсгВ-§рг.

Интеграция в хромосому фрагментов ДНК, содержащих ген 1е1А и участок хромосомы фага 173. Плазмиду рБсгВ-Тс трансформировали в штамм .1С7623 (гесВС бЬсВС генотип) и высеяли на селективную среду, содержащую ампицилин для поддержания плазмиды (РисЛУ-9). При отсутствии селективного давления этот штамм не поддерживает плазмиду с Со1Е репликоном (в том числе рс1сгВ-Тс) и выщепляет её с высокой частотой. Отдельную колонию выращивали на среде без ампицилина и затем высевали на фаговый газон С1 и С6 в количестве 107-108. Выросшие клетки пересевали на селективные среды:

- ЬВ с ампицилином (контроль выщепления плазмиды);

- ЬВ с тетрациклином (опыт).

10 колоний с фенотипом Ар5Тс'СГС6г были подвергнуты исследованию на присутствие вставки кассеты 1е1А в ген с1сгВ с помощью ПЦР (прямой праймер СТТССССАССАССОССАСАТ, обратный праймер ААСОСАОСССААТААСАТ) и трансдукции. Все 10 колоний содержали 1е1А, интегрированный в ёсгВ ген хромосомы.

Плазмиду рОсгВ^рг трансформировали в штамм 1С7623 и высеяли на селективную среду, содержащую ампицилин для поддержания плазмиды (Рис.1У-9). Отдельную колонию выращивали на среде без ампицилина и затем высевали клетки в титре 107-108 на фаговый газон С1 и Сб.

А)

Б)

Трансформация в recBC sbcBC

^^^О ifiop

Инкубирование. Высев на без антиот. газон с С1 и Сб

трансформантов

Проверка

выросших колонии на Лр-r, Тс-г ^

Трансдукция I по Тс V

Проверка на наличие вставки в ген dcrB. ПЦР, М стойчивостъ к фагам С1 и Сб

СМюр Тс-г '

Трансформация в recBC sbcBC ^Отбор

w трансформантов

Проверка выросших

Инкубирование. Высев на колоний на

без антиотиков. газон с С1 и Сб Ap-s, gpr фенотипг

Phc.IV-9. Схема интеграции клонированных фрагментов ДНК, содержащих ген tetA и участка генома фага 173, в хромосому Е. coli.

15 из выросших колоний пересеяли на селективные среды:

- LB с ампицилином (контроль выщепления плазмиды);

- LB (опыт).

Все 15 колоний были чувствительны к ампицилину и имели gpr фенотип. ПЦР анализ хромосомы Е. coli подтвердил наличие вставки блока генов фага 173 в хромосомальный ген dcrB.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

образует ясные бляшки среднего размера с узким ореолом и по морфотипу относится к группе Т1-подобных фагов. Мы определили, что бактериофаг С6 использует для адсорбции внешний мембранный рецептор РЬиА. Это означает, что продукты генов с!сгА и скгВ могут контролировать развитие бактериофага, распознающего не только внешнемембранный белок ВШВ (в случае бактериофага С1), но также и бактериофага, способного распознавать белок внешней мембраны РЬиА (в случае бактериофага С6). Это означает, что систему БсгАВ можно тоже отнести к полифункциональным, т.е. в процессе действия она может функционально связываться с разными белками внешней мембраны.

В тоже время наши результаты добавили ещё один новый компонет в систему РЬиА-зависимого транспорта макромолекул. Показано, что белок внешней мембраны РЬиА в процессах транспорта функционально может быть связан не только с "Топ" системой, но и с ещё одной новой системой "БсгАВ" (Рис.V-10).

Рис.У-10. Схема, демонстрирующая функциональные связи белка БЬиА в процессе транспорта макромолекул.

Изучая механизм действия системы DcrAB в процессе инфицирования фагов, мы определили, что dcrA и dcrB мутации не оказывают влияния на эффективность развития фагов внутри клетки после проникновения в нее фаговой ДНК, так как при трансфекции ДНК фага С1(С6) происходит нормальный выход фаговых частиц. Данные мутации не затрагивают и первую стадию процесса инфекции бактериофага - взаимодействие с рецепторами, так как бактериофаги С1 и С6 образуют довольно устойчивую связь с бактериальной поверхностью, которую не изменяют мутации der.

Таким образом, можно предположить, что белки, один из которых функционирует во внутренней мембране (DcrA), а другой в периплазме (DcrB), участвуют в процессе проникновения ДНК фага через мембраны.

Внешняя мембрана Е. coli проявляет большую устойчивость к различным детергентам, таким как SDS. Однако SDS получает доступ к внутренней мембране и разрушает её, если нарушена проницаемость внешнемембранного барьера. Так, фаг Т5, при взаимодействии с FhuA, открывает канал в наружной мембране, и после добавления бактериофага к бактериям клетки становятся чувствительными к SDS. Поэтому изучая влияние белков DcrA и DcrB на проницаемость внешней мембраны бактерии в процессе адсорбции фагов С1 и С6, мы определили устойчивость клеток к SDS после взаимодействия с фагами. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что DcrA и DcrB белки участвуют в открытии диффузионного канала через внешнюю мембрану после адсорбции бактериофага или в его формировании.

Остается неясным, взаимодействуют ли продукты dcrA и dcrB генов непосредственно с внешнемембранными рецепторами FhuA и BtuB. Если система DcrAB для С1 и С6 играет роль подобную Pel для инфекции бактериофага лямбда, то такое взаимодействие, не обязательно, потому что попытки продемонстрировать такое взаимодействие для Pel оказались неудачными (Scandella, D., and Arber, W. 1974). В тоже время показано, что ТопВ непосредственно взаимодействует как с рецепторами, так и с молекулами, в переносе которых он участвует.

Исследуя свойства бактериофагов С1 и С6 мы обнаружили не специфическую для фагов Е. coli способность осуществлять общую трансдукцию бактериальных генов, а следовательно участвовать во всеобщем природном процессе переноса генов, по крайней мере, внутри некоторых штаммов Escherichia coli и их эволюции.

На основании данных, полученных в работе о взаимоотношении бактериофаг-клетка хозяин, нами предложена новая стратегия конструирования векторов позитивной селекции и интегративных векторов, в которых отсутствуют гены антибиотикоустойчивости. Ключевым звеном этой стратегии является методология использования фагов, как инструмента для контр-селекции. Сконструированная в работе плазмида pDcrB - это удобный вектор для основных задач клонирования фрагментов ДНК и интеграции их в хромосому. Предложенный принцип использования фагов для контр-селекции может лечь в основу создания нового поколения многоцелевых векторов.

ВЫВОДЫ.

1. Из сточных вод выделен и охарактеризован новый бактериофаг, названный С6, для адсорбции которого необходимы продукты генов dcrA и dcrB;

2. Идентифицирован белок внешней мембраны, являющийся рецептором для С6 - это FhuA, широко используемый фагами и колицинами;

3. Показано, что для инфекции фагов Cl и С6 необходимы продукты генов dcrA и dcrB одновременно. Эти результаты свидетельствуют, что DcrA и DcrB работают в комплексе. Комплекс DcrAB охарактеризован как новая транспортная система Е. coli, которая, подобно Ton, Toi, Pel системам, может взаимодействовать с различными рецепторными белками в процессе транспорта разных макромолекул;

4. Показано, что белки DcrA и DcrB не влияют на стабильность связывания фагов Cl и С6 с рецепторами, а участвуют в процессе инъекции ДНК.

5. Показано, что при адсорбции фагов Cl и С6 наблюдается DcrAB зависимое увеличение чувствительности клеток к детергентам. Это свидетельствует об участие DcrA и DcrB в открытие или формирование канала во внешней мембране клетки в процессе взаимодействия клетки хозяина с бактериофагом;

6. Показана способность фагов Cl и С6 осуществлять общую трансдукцию, т.е. неспецифический перенос генов от штамма к штамму, что может найти применение в генетических исследованиях. Данное свойство является редким свойством для бактериофагов Е. coli

7. Предложен новый метод прямого отбора при клонировании фрагментов ДНК и интеграции их в хромосому;

8. Сконструирован и применен в исследовательских целях новый вектор прямой селекции для клонирования фрагментов ДНК.

Основное содержаниедиссертации нашло отражение в следующих печатных работах:

1. Valéry V. Samsonov, Victor V. Samsonov, Sergey P. Sineoky "DcrA and dcrB Escherichia coli genes can control DNA injection by phages specific for BtuB and FhuA receptors."// Research in Microbiology 2002 Dec; 153(10):639-46

2. N.A. Likhacheva, Victor V. Samsonov, Valeri V. Samsonov, and S.P. Sineoky. 1996. Genetic control of the resistance to phage CI of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 178: 5309-5315.

¡ i

Р 13 9 5 9

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Самсонов, Валерий Васильевич

I. ВВЕДЕНИЕ.

1. Актуальность темы.

2. Цель и задачи исследования.

3. Новизна результатов.

4. Научно-практическая значимость работы и практическое использование полученных результатов.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Компоненты оболочки бактерий, как рецепторы фагов и колицинов.

1.1. Модель клеточной стенки Е. coli.

1.2. Внешнемембранные рецепторы Escherichia coli.11'

1.2.1. Основные пориновые белки.

1.2.2. ЛПС - основной компонент внешней мембраны.

1.2.3. Энтеробактериальный антиген и капсульные полисахариды.

1.2.4. Белки, участвующие в специфическом транспорте.

1.3. Муреиновый слой.

1.4. Сайты адгезии.

1.5. Цитоплазматическая мембрана.

1.5.1. Липидные компоненты.

1.5.2. Белковые компоненты.

1.6. Периплазма.

2. Транспорт в бактериях.

2.1 Белки внешней мембраны, участвующие в транспорте веществ.

2.2 Белки внутренней мембраны, участвующие в транспорте веществ.

3. Проникновение ДНК внутрь клеток.

3.1 Трансформация.

3.1.1. Грам-положительные бактерии: бациллы, пневмококки и стрептококки.

3.1.2. Грам-отрицательные бактерии:гемофильные бактерии и

• гонококки.

3.1.3. Искусственные способы введения ДНК в бактериальную клетку.

3.2. Транспорт фаговой ДНК через мембрану.

3.2.1. Адсорбция.

3.2.2. Проникновение через мембрану.

3.2.2.1. Бактериофаг Т4.

3.2.2.2. Бактериофаг Т7.

3.2.2.3. Бактериофаги Т5 и BF23.

3.2.2.4. Бактериофаг Т1.

3.2.2.5. Бактериофаг X.

3.2.2.6. Бактериофаг N4.

3.2.2.7. Бактериофаг UC1.

3.2.2.8. Фаги с разными рецепторами.

3.2.2.9. Бактериофаг fl.

3.2.3. Контактные сайты.

3.2.4. Проникновение через пептидогликан.

3.2.5. Электрохимический протоновый градиент - движущая сила транспорта ДНК.

3.2.6. Таксономия вирусов бактерий.

4. Транспорт колицинов в бактерии.

5. Некоторые полифункциональные системы мембраны Е. coli.

5.1. Внешнемембранный белок FhuA.

5.2. Внешнемембранный белок BtuB.

5.3. Ton система.

5.4. Tol система.

5.5. Pel система.

6. Бактериофаг С1 и гены, контролирующие его адсорбцию.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Бактерии, фаги и плазмиды.

2. Среды и реактивы.

3. Поиск фагов, процесс инфекции которых зависит от белков DcrA или DcrB.

4. Генетические методы.

5. Методы работы с ДНК.

6. Клонирование fhuA гена Е. coli К12.

7. Комплементационный анализ.

8. Анализ адсорбции С1 и С6 фагов.

9. Получение мембранных фракций клеток Е. coli.

10. Тест на чувствительность к SDS.

11. Измерение необратимости адсорбции фагов.

12. Электронная микроскопия.

13. Выход фага.

14. Анализ инактивации бактериофага.

15. ПЦР амплификация рибосомальных фрагментов.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Выделение бактериофагов, зависящих от продуктов dcrA и dcrB генов, но не от btuB.

2. Бактериофаг С6.

3. Способность бактериофагов к общей трансдукции.

4. Идентификация рецептора для С6.

5. На какой стадии в процессе инфекции фагов участвуют белки

DcrA и DcrB?.

5.1. Влияние DcrA и DcrB на внутреннее развитие бактериофагов.

5.2. Анализ процесса адсорбции фагов С1 и С6.

5.3 Влияние DcrA и DcrB на инъекцию фаговых геномов внутрь клетки.

6. Анализ чувствительности бактерий к SDS при адсорбции бактериофагов С1 и С6.

7. Вектор прямой селекции, основанный на свойствах взаимодействия фага с клеткой хозяина.

7.1 Принципы, лежащие в основе новой системы прямого отбора рекомбинантных плазмид с возможностью последующей интеграции клонированного фрагмента в хромосому.

7.2 Примеры клонирования фрагментов ДНК, содержащих ген tetA (придает клетке устойчивость к тетрациклину) и участка генома фага 173 (придает клетке устойчивость к некоторым лямбдоидным фагам).

7.3. Интеграция в хромосому фрагментов ДНК, содержащих ген tetA и участок хромосомы фага 173.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новая DcrA-DerB зависимая система транспорта ДНК бактериофагов в Escherichia coli K-12"

1. Актуальность темы.

Механизмы транспорта различных веществ внешней среды через оболочку бактерий, таких как сахара, аминокислоты, комплексы железа, витамины, антибиотики, нуклеиновые кислоты интересуют ученых с давних пор. И этот интерес не ослабевает, подогреваясь интересом создания искуственных мембран. Именно поэтому в последние годы предпринимаются значительные усилия по изучению функций, синтеза, химического состава структурных компонентов оболочки грамотрицательных бактерий, особенно, Escherichia coli и Salmonella typhy murium.

Одним из способов, позволяющим находить минорные, несущественные в лабораторных условиях белки мембран, является изучение бактериальных мутантов, дефектных по адсорбции соответствующих фагов и транспорту бактериоцинов. В тоже время, чтобы увеличить возможности фаготерапевтических методов лечения необходимо:

1) исследование механизмов бактериальной устойчивости, свойственных данному виду бактерий, и относительная частота возникновения спонтанных мутаций, приводящих к даному виду устойчивости ;

2) исследование способности фагов преодолевать разные типы устойчивости (расширение коллекций, отбор мутантов и т.п.);

3) осуществление поиска новых фагов, использующих разные рецепторы для адсорбции (В.Н. Крылов. 2001).

- в биологии, для более полного понимания процессов транспортировки макромолекул через оболочку бактерий и механизмов взаимодействия систем хозяин-паразит; в биотехнологии, для получения фагоустойчивых штаммов - продуцентов;

- в эпидемиологии, для фаготипирования и таксономии; в медицине, для развития методов фаготерапии;

- в генной инженерии, для конструирования новых векторов.

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Самсонов, Валерий Васильевич

VI. ВЫВОДЫ.

2. Идентифицирован белок внешней мембраны, являющийся рецептором для Сб - это FhuA, широко используемый фагами и колицинами;

3. Показано, что для инфекции фагов С1 и Сб необходимы продукты генов dcrA и dcrB одновременно. Эти результаты свидетельствуют, что DcrA и DcrB работают в комплексе. Комплекс DcrA В охарактеризован как новая транспортная система Е. coli, которая, подобно Ton, Tol, Pel системам, может взаимодействовать с различными рецепторными белками в процессе транспорта разных макромолекул;

4. Показано, что белки DcrA и DcrB не влияют на стабильность связывания фагов С1 и Сб с рецепторами, а участвуют в процессе инъекции ДНК.

5. Показано, что при адсорбции фагов С1 и Сб наблюдается DcrAB зависимое увеличение чувствительности клеток к детергентам. Это свидетельствует об участие DcrA и DcrB в открытие или формирование канала во внешней мембране клетки в процессе взаимодействия клетки хозяина с бактериофагом;

6. Показана способность фагов С1 и Сб осуществлять общую трансдукцию, т.е. неспецифический перенос генов от штамма к штамму, что может найти применение в генетических исследованиях. Данное свойство является редким свойством для бактериофагов Е. coli

7. Предложен новый метод прямого отбора при клонировании фрагментов ДНК и интеграции их в хромосому;

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Ранее нами были охарактеризованы гены Е. coli, существенные для адсорбции бактериофага С1: ген dcrA(sdaC), который располагается во внутренней мембране клетки, и ген dcrB, впервые описанный нами ген, продукт которого располагается в периплазме и, возможно, заякорен в цитоплазматическую мембрану. В настоящей работе мы попытались ответить на вопрос: связаны ли данные белки функционально только с BtuB или могут иметь связи и с другими рецепторными белками подобно полифункциональным системам TonBExbBD, ToIAQR или Pel (смотри обзор)? Для этого мы осуществили поиск новых фагов, использующих продукты генов dcrA и dcrB для своего развития. Направленное выделение интересующих нас фагов было проведено при помощи нового метода отбора фагов из негативных колоний (НК), образованных на смешанном газоне пермиссивных для искомых фагов (W3350) и изогенных, но непермиссивных клеток (W3350dcrAB). Во время поиска обнаружен бактериофаг, получивший название С6, который не растет на клетках мутантных по генам dcrA и/или dcrB, но растет на клетках BtuB". Фаг С6 образует ясные бляшки среднего размера с узким ореолом и по морфотипу относится к группе Т1-подобных фагов. Мы определили, что бактериофаг С6 использует для адсорбции внешний мембранный рецептор FhuA. Это означает, что продукты генов dcrA и dcrB могут контролировать развитие бактериофага, распознающего не только внешнемембранный белок BtuB (в случае бактериофага С1), но также и бактериофага, способного распознавать белок внешней мембраны FhuA (в случае бактериофага С6). Это означает, что систему DcrAB можно тоже отнести к полифункциональным, т.е. в процессе действия она может функционально связываться с разными белками внешней мембраны.

В тоже время наши результаты добавили ещё один новый компонет в систему FhuA-зависимого транспорта макромолекул. Показано, что белок внешней мембраны FhuA в процессах транспорта функционально может быть связан не только с "Топ" системой, но и с ещё одной новой системой "DcrAB" (Рис.V-10).

Pnc.V-10. Схема, демонстрирующая функциональные связи белка FhuA в процессе транспорта макромолекул. мы определили, что dcrA и dcrB мутации не оказывают влияния на эффективность развития фагов внутри клетки после проникновения в нее фаговой ДНК, так как при трансфекции ДНК фага С1 (С6) происходит нормальный выход фаговых частиц. Данные мутации не затрагивают и первую стадию процесса инфекции бактериофага - взаимодействие с рецепторами, так как бактериофаги С1 и С6 образуют довольно устойчивую связь с бактериальной поверхностью, которую не изменяют мутации dcr. Таким образом, можно предположить, что белки, один из которых функционирует во внутренней мембране (DcrA), а другой в периплазме (DcrB), участвуют в процессе проникновения ДНК фага через мембраны.

Остается неясным, взаимодействуют ли продукты dcrA и dcrB генов непосредственно с внешнемембранными рецепторами FhuA и BtuB. Если система DcrAB для С1 и С6 играет роль подобную Pel для инфекции бактериофага лямбда, то такое взаимодействие, не обязательно, потому что попытки продемонстрировать такое взаимодействие для Pel оказались неудачными (Scandella, D., and Arber, W. 1974). В тоже время показано, что TonB непосредственно взаимодействует как с рецепторами, так и с молекулами, в переносе которых он участвует.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Самсонов, Валерий Васильевич, Москва

1. Albritton W., Setlow /., Thomas M. et al. 1984 Heterospecific transformation in the genus Haemophilus. Mol. Gen. Genet. 193:358-363

2. Ames, G., and C. Higgins.1983. The organization, mechanism of action, and evolution of periplasmic transport systems. Trends Biochem. Sci. 8: 97-100

3. Anderson. J.J., Wilson. J.M. and Oxender. D. L. 1979 Defective transport and other phenotypes of a periplasmic 'leaky' mutant of Escherichia coli K-I2. J. Bacteriol. 140:351-358

4. Anderson, E.S., and A.H. Rogers. 1963. Slime polysaccharides of the Enterobacteriaceae. Nature (London) 198: 714-715.

5. Armstrong, J., R. N. Pcrham, and J. E. Walker. 1981. Domain structure of bacteriophage fd adsorption protein. FEBS Lett. 135:167-172;

6. Armstrong, J., J. A. Hewitt, and R. N. Perham. 1983. Chemical modification of the coat protein in hacteriophage-fd and orientation of the virion during assembly and disassemly. EMBO J. 2:1641-1646;

7. Barany F., Kahn M., Smith H. 1983 Directional transport and integration of donor DNA in Haemophilus influenzae transformation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 80:72747278

8. BASSFORD, P. J., JR., and KADNER, R. J. 1977. Genetic analysis of components involved in vitamin B12 uptake in Escherichia coli. J. Bacteriol. 132:796-805

9. Bayer, M.E. 1979. The fusion sites between outer membrane and cytoplasmic membrane of bacteria: their role in membrane assembly and virus infection, p. 167-202. In M. Inouye (ed.) Bacterial outer membranes. John Wiley & Sons, Ins., New York.

10. Bayer, M.E. 1991. Zones of membrane adhesion in the cryofixed envelope of Escherichia coli. J. Struct. Biol. 107:268-280

11. Beck, K., and B. Zink. 1981. Nueteotide sequence anil genome organisation of filamentous bacteriophages f! iinti id. Gene 16:35-58.

12. Beckendorf, S. К. 1973 Structure of the distal half of the bacteriophage T4 tail fiber. J Mol Biol. Jan;73:37-53.

13. Benedetti, H., L. Letellier, R. Lloubes, V. Geli, D. Baty, and C. Lazdunski. 1992 Study of the import mechanisms of colicins through protein engineering and K+ efflux kinetics. NATO Adv. Study Inst. Ser. H65:215-223

14. Benedetti, H., M. Frenette, D. Baty, M. Knibiehler, F. Pattus, and C. Lazdunski. 1991 Individual domains of colicins confer specificity in colicin uptake, in pore-properties and in immunity requirements. J. Mol. Biol. 217:429-439

15. BenzR. 1985. Porin from bacterial and mitochondrial outer membranes. Crit. Rev. Biochem. 19:145-190

16. Benzinger R. 1978 Transfection of Enterobacteriaceae and its applications. Microbiological Reviews, 42:194-236

17. Bernadac, A., Gavioli, M., Lazzaroni, J-C., Raina, S., and Lloubes, R. 1998 Escherichia coli tol-pal mutants form outer membrane vesicles. J Bacteriology. 180:4872-4878

18. Birge, E. A. 1981. Bacterial and bacteriophage genetics. Springer Verlag. New York

19. Bonhivers, M., Ghasi, A., Boulanger, P., and Letellier, L. 1996 FhuA, a transporter of the Escherichia coli outer membrane, is converted into a channcl upon binding of bacteriophage T5. EMBO J 15: 1850-1856

20. Boulanger, P., Ie Maire, M., Bonhivers, M., Dubois, S., Desmadril, M and Letellier, L. 1996. Purification and structural and functional characterization of FhuA, a transporter of the E. coli outer membrane, Biochemistry, 35:14216-14224

21. Boulanger, P. and Letellier, L. 1992. Ion channels are likely to be involved in the two steps of phage T5 DNA penetration into E. coli cell. J. Biol. Chem. 267:3168-3172

22. Bouveret. E. Derouiche. R. Rigal, A. Lloubes. R. Lazdunski. C. and Benedetti. H. 1995 Peptidoglycan-associated lipoprotein-TolB interaction. J. Biol. Chem. 270: 11071-11077

23. Bouveret. E., Rigal. A., Lazdunski. C. and Benedetti. H. 1998 Distinct regions of the colicin A translocation domain are involved in the interaction with TolA and TolB proteins upon import into Escherichia coli. Mol. Microbiol. 27: 143-157

24. Bradbeer С., Woodrow M. L., and Khalifah L. I. 1976 Transport of vitamin B)2 in E. coli: common receptor system for vitamin B12 and bacteriophage BF23 on the outer membrane of the cell envelope. J Bacterid 125: 1032-1039

25. Braun. V. and Herrman. C. 1993 Evolutionary relationship of uptake systems for biopolymers in Escherichia coli: cross-complementation between the TonB-ExbB-ExbD and the TolA-TolQ-TolR proteins. Mol. Microbiol. 8: 261-268

26. Braun, V., Frenz, S., Hantke, K., and Schaller, K. 1980 Penetration of colicin M into cells of Escherichia coli. J. Bacteriol. 142:162-168

27. Braun, V., Gunter, K., and Hantke, K. 1991 Transport of iron across the outer membrane. Biol Metals. 4:14-22

28. Braun, V. 1995 Energy-coupled transport and signal transduction through the Gram-negative outer membrane via TonB-ExbB-ExbD-dependent receptors proteins. FEMS Microbiol. Rev. 16:295-307.

29. Buxton R.S. 1971. Genetic analysis of Escherichia coli К 12 mutants resistant to bacteriophage BF23 and the E group colicins. Molec. gen. Genet. 113: 154-156

30. Cadieux N., and Kadner R. J. 1999 Site-directed disulfide bonding reveals an interaction site between energy- coupling protein TonB and BtuB, the outer membrane cobalamin transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19: 10673-10678

31. Caro, L. G., and M. Schnos. 1966. The attachment of the male-specific bacteriophage fl to sensitive strains of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56:126-132;

32. Ceglowski P. Kawezynski M., Dohrzanski W. 1981 Role of Streptococcus sanguis (strain Wicky) cell surface-located deoxyribonucleic acid-binding factor in transformation of a homologous strain. J. Bacteriol. 146:1-10

33. Chang S., Cohen S 1979 High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts bv plasmid DNA. Mol. Gen. Genet. 168:111-115

34. Charpac M. Dedonder R. 1965 Production d'un "facteum competence" soluble par Bacillus subtilis Marburg inc 168. Compt. rend. Acad. Sci. 260:5638-5641;

35. Clavel, Т., Germon, P., Vianney, A., Portalier, R. and Lazaroni, J. C. 1998 TolB protein of Escherichia coli K-12 interacts with the outer membrane peptidoglycan-associated proteins Pal, Lpp and OmpA. Mol. Microbiol. 29:359-367

36. Click. E.M. and Webster. R.E. 1998 The ToIQRA proteins are required for membrane insertion of the major capsid protein of the filamentous phage fl during infection. J. Bacteriol. 180: 1723-1728;

37. Deich R. Hoyer H. 1982 Generation and release of DNA-binding vesicles by Haemophilus influenzae during induction and loss of competence. J. Bacteriol. 152:855864

38. Demchick, P. and Koch, A. L. 1996 The permeability of the cell wall fabric of Escherichia coli and Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 178:768-773

39. Derouiche. R. Gavioli. M. Benedetti. H. Prilipof, A. Lazdunski. C. and Lloubes. R. 1996 TolA central domain interacts with Escherichia coli porins. EMBO J. 15. 6408-6415;

40. Di Masi, D. R., White, J. C., schnaitman, C. A., and Bradbeer, C. 1973. Transport of vitamin В12 in Escherichia co/zVCommon receptor sites for vitamin BI2 and the E colicins on the outer membrane of the cell envelope. J. Bacteriol. 115: 506-513;

41. Dinh, Т., I. Paulsen, and M. Saier. 1994 A family of extracytoplasmic protein that allow transport of large molecules across the outer membrane of gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 176:3825-3831;

42. Dityatkin S.I., Lisovskaya K.T. Panzhava N.N., Iliashenko B.N. 1972 Frozen-thwawed bacteria as recipients of isolated coliphage DNA. Bioch. Bioph. Acta. 251:319323.

43. Doulanger, P., and Letellier, L. 1988 Characterization of ion channels involved in the penetration of phage T4 DNA into Escherichia coli. L. Biol. Chemistry. 263:97679775

44. Dreisekelman, B. 1994. Translocation of DNA across bacterial membranes. Microbiol. /tev.58:293-316;

45. Elliott, J., and Arber, W. 1978 E. co//K-12 pel mutants, which block phage A. DNA injection, coincide with pts, which determines a component of a sugar transport system. Molec. Gen. Genet. 161:1-8.

46. Engebrecht J, Simon M, Silverman M. 1985 Measuring gene expression with light. Science 227: 1345-7

47. Eppens. E.F., Nouwen. N. and Tommassen. J. 1997 Folding of a bacterial outer membrane protein during passage through the periplasm. EMBO J. 16. 4295-4301

48. Fani R., Mastromei G. Polsinelli M. Venema G. 1984 Isolation and characterization of Bacillus subtilis mutants altered in competence. J. Bacteriol. 157:152157

49. Fox M.S., Hotchkiss R.D. 1960 Fate of transforming deoxyribonucleate following fixation by transformable bacteria. Nature. V. 187.10: 1002-1004

50. Fralick JA, Diedrich PL, Casev-VVood S. 1990 Isolation of an Lc-spccific Escherichia coli bacteriophage. J Bacteriol. 172:1660-2

51. Garcia, L. R., and Molineux, I. J. 1995 Rate of translocation of bacteriophage T7 DNA across the membranes of Escherichia coli. J. Bacteriol. 177:4066-4076

52. Germon. P. Clavel. Т. Vianney. A. Portalier. R. and Lazzaroni. J.C. 1998 Mutational analysis of the Escherichia coli K-I2 Tol A N-terminal region and characterization of its TolQ-interacting domain by genetic suppression. J. Bacteriol. 180: 6433 6439;

53. Goldberg, E. B. 1980 in Virus Receptors (Randall, L., and Philipson, L., eds) pp.115-141, Chapman and Hall, London

54. Goodgal S. Mitchell M. 1984 Uptake of heterologous DNA by Haemuphilus influenzae. J. Bacteriol. 157:785-788

55. Grant, W.D., T.W. Sutherland, and J.F. Wilkinson. 1969. Exopolysaccharide colanic acid its occurrence in the Enterobacteriaceae. J. Bacteriol. 100: 1187-1193.

56. Grant, R., T.-C. Lin, W. Konigsberg, and R. E. Webster. 1981. Structure of the filamentous bacteriophage fl. J. Biol. Chem. 256:539-546

57. Grinius, L.1980. Nucleic acid transport driven by ion gradient across cell membranes. FEBS Lett. 113: 1-10

58. Gudmundsdottir A., Bell P. E., Lundrigan M. D., Bradbeer C., and Kadner R. J. 1989 Point mutation in a conserved region (TonB box) of E. coli outer membrane protein BtuB affect vitamin Bn transport. 171: 6526-6533

59. Guthrie G., Sinsheimer R 1960 Infection of protoplasts by subviral particles of bacteriophage OX 174. J. Mol. Biol. 2:297-305

60. Hahn.J., Inamine G.-S., Kozlov Y., Dubnau D. 1994 Characterization of comE, a late competence operon of Bacillus subtilis required for the binding and uptake of transforming DNA. Mol. Microbiol. 10:99-111.

61. Hancock R.E. 1987. Role of porins in outer membrane permeability. J. Bacteriol. 169: 929-933

62. Hancock, R. E. W., and Braun, V. 1976 Nature of the energy requirement for the irreversible adsorption of bacteriophages Tl and <j>80 to Escherichia coli. J. Bacteriol. 125:409-415

63. Hantke, K., and Braun, V. 1978 Functional interaction of the tonA/tonB receptor system in Escherichia coli. J Bacteriol.135: 190-197.

64. Havarstein L.S., Coomaraswamy G. Morrison D.A. 1995 An unmodified heptadecapeptide pheromone induces competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 92:11140-11144

65. Heller К. J. 1984 Identification of the phage gene for host receptor specificity by analyzing hibrid phages of T5 and BF23. Virology, 139:11-21

66. Heller, K., and Braun, V. 1979. Accelerated adsorption of bacteriophage T5 to Eshcerichia co.'i F, rezulting from reversible tail fiber-lipopolysaccharide binding. J. Bactcriol. 139: 32-38;

67. Heller, K., and Braun, V. 1982. Polymannose 0 antigens of Escherichia coli, the binding sites for the reversible adsorption of bacteriophage T5+ via the L-shaped tail fibers. J. Virol. 41: 222-227.

68. Holster M., de Waele D., Depicer A. et al. 1978 Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens. Mol. Gen. Genet. 163:181-188

69. Jacobson, A. 1972. Role of F pili in the penetration of bacteriophage fi. J. Virol. 10:835-843

70. Jussum K. Jussum К 1970 Specific uptake of homologous DNA accompanying transformation in Neisseria meningitidis. Acta pathol. et microbiol. Scand. Section B. 78:140-148

71. KADNER, R. J., HELLER, K., COULTON, J. W., and BRAUN, V. 1980. Genetic control of hydroxamate-mediated iron uptake in Escherichia coli. J. Bacteriol. 143:256-264

72. Kadner, R.J. 1990 Vitamin Bu transport in Escherichia coli: energy cuopling between membranes. Mol Microbiol 4:2027-2033

73. Kahn M., Concino M., Gromcova R., Goodgal S. 1979 DNA binding activity of vesicles produced by competence deficient mutants of Haemuphilus. Bioch. Bioph. Res. Corn. 87:764-772

74. Karlsson. M. Hannavy. K. and Higgins, C.F. 1993 A sequence-specific function for the N-terminal signal-like sequence of the TonB protein. Mol. Microbiol. 8. 379-388

75. Kiino, D. R., and Rothman-Denes, L. B. 1989 Genetic analysis of bacteriophage N4 adsorption. J. Bacteriol. 171:4595-4602

76. Killmann, H., Videnov, G., Jung, G., Schwarz, H., and Braun, V. 1995 Identification of receptor binding sites by competitive peptide mapping: phages Tl, 'Г5, and D80 and colicin M bind to the gating loop of fhuA. J Bacteriol 177: 694-698

77. Killmann, H., Benz, R., and Braun, V. 1993 Conversion of the FhuA transport protein into a diffusion channel through the outer membrane of Escherichia coli. EMBO J 12:3007-3016;

78. Killmann, H., Benz, R., and Braun, V. 1996 Properties of the FhuA channel in the Escherichia coli outer membrane after deletion of FhuA portions within and outside the predicted gating loop. J Bacteroil 178: 6913-6920;

79. Kleeman,W., and H.M.McConnel.1974. Lateralphase separations in Escherichia coli membranes. Biochem. Biophys. Acta 345: 220-230.

80. Krebber, C., S. Spada, D. Desplancq, A. Krebber, L. Ge, and A. Pluckthun. 1997. Selectively-infective phage (SIP): a mechanistic dissection of a novel in vivo selection for protein-ligand interactions. J. Mol. Biol. 268:607-618

81. Ma, D., D. Cook, J. Hearst, and H. Nikaido.1994 Efflux pumps and drug resistance in Gram-negative bacteria. Trends Microbiol. 2:489-493.

82. Magnuson R. Solomon J., Grossman A.D. 1994 Biochemical and genetic characterization of a competence pheromone from Вас. subtilis. Cell. 77:207-216

83. Mandel M., Higa A. 1970 Calcium depcndens bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol. 53:159-166

84. Maniatis, Т., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y

85. Maniloff, J., and Ackermann, H.-W. 1998 Taxonomy of bacterial viruses: establishment of tailed virus genera and the order Caudovirales. Arch Virol. 143:20512063

86. Manning P.A., Reeves P. 1976. Outer membrane of Escherichia coli К12: tsx mutants (resistent to bacteriophage T6 and colicin K) lack an outer membrane protein. Biochem. bioph. Res. Commun. 71:466-471.

87. Marwin, D. A. 1998. Filamentous phage structure, infection and assembly. Curr. Opin. Struct. Biol. 8:150-158;

88. Matsuyama, S. Tajima, T. and Tokuda, H.1997 A novel membrane lipoprotein, LolB (HemM) involved in the LolA (p20)-dependent localizationof lipoproteins to the outer membrane of Escherichia coli. EMBO J. 16: 6947-6955.

89. Mayer, H., and G. Schmidt. 1979. Chemistry and biology of the enterobacterial common antigen (ECA). Curr. Top. Microbiol. 85: 99-153.

90. Mejean V., Claverys J.-P. 1988. Polarity of DNA entry in transformation of Streptococcus pneumoniae. Mol. Gen Genet. V. 213. 3: 444-448.

91. Mende, J., and Braun, V. 1990 Import-defective colicin В derivatives mutatedin the TonB box. Mol Microbiol 4:1523-1533

92. Miller, J.H. 1972 Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y

93. Moffatt, B. A., and Studier, F. W. 1988 Entry of bacteriophage T7 DNA into the cell and escape from host restriction. J. Bacteriol. 170:2095-2105

94. Mondigler, M., Vogele, R.T., Heller, K.J. 1995 Overproduced and purified receptor binding protein pb5 of bacteriophage T5 binds to the T5 receptor protein FhuA. FEMS Microbiol Lett. 130: 293-300

95. Montag, D., Hashemolhosseini, S., and Henning, U. 1990 Receptor-recognizing area of protein 37 of phage T4, Tula andTuIb. J. Mol. Biol. 216:327-334

96. Morona R. Klose M. Henning V. 1984. Esherichia coli K-12 outer membrane protein (OmpA) as a bacteriophage receptor: analysis of mutant genes expressing altered proteins. J. Bacteriol. 159: 570-578

97. Morona, R., and Henning, U. 1984 Host range mutants of bacteriophage 0x2 can use two different outer membrane proteins of Escherichia coli K-12 as reseptors. J. Bacteriology. 159:579-582.

98. Morrison D., Baker M. 1979. Competence for genetic transformation in Pneumococcus depends on synthesis of a small set of proteins. Nature. V. 282.5735: 215-217;

99. Murialdo, H., Siminovitch, L. 1972 The morphogenesis of bacteriophage lambda. IV. Identification of gene products and control of the expression of the morphogenetic information. Virology. 48:785-823

100. Nelson, F. К., S. M. Friedman, and G. P. Smith. 1981. Filamentous phage DNA cloning vectors: a noninfective mutant with a nonpolar deletion in gene III. Virology 108:338-350

101. Nester E., Stocker B. 1963. Biosynthetic latency in early stages of deoxyribonucleic acid transformation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. V. 86. 4: 785-796;

102. Nimmich W., G. Schmidt and U. Krallmann-Wenzel. 1991. Two different Escherichia coli capsular polysaccharide depolymerases each associated with one of the coliphage ФК5 and ФК20. FEMS Microbiology Letters. 82: 137-142.

103. Nina Nilsson, Ann-Christin Malmborg, and Carl A. K. Borrebaeck 2000 The Phage Infection Process: a Functional Role for the Distal Linker Region of Bacteriophage Protein 3 J. Virol. 74:4229-4235

104. Oishi M., Cosloy S. 1972 The genetic and biochemical basis of the transformability of Escherichia coli K12. Bioch. Bioph. Res. Com. 49:1568-1572.

105. Oishi M., Irbe R. 1977 Circular chromosomes and genetic transformation in Escherichia coli. Modem trends bacterial transformation and transfection. Amsterdam, P.121-134

106. Overath, P., and J. Wright. 1983. Lactose permease: a carrier on the move. Trends Biochem. Sci. 8:404-408.

107. Pakula R. 1965 Factor regulating competence in transformation of Streptococcus. J. Bacteriol. 90:1320-1324

108. Palmen, R., Driessen, A.J. and Hellingwerf, K.J. 1994, Bioenergetic aspects of the translocation of macromolecules across bacterial membranes;Biochem. Biophys. Acta, 1183:417-451;

109. Parkinson, J.S. 1993. Signal transduction schemes of bacteria. Cell. 73: 857-871.

110. Piechowska M., Soltyk A., Shugar D. 1975. Fate of heterologous deoxyribonucleic acid in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. V. 122.2: 610-622.

111. Pilsl, H. Braun, V. 1998 The Ton system can functionally replace the TolB protein in the uptake of mutated colicin U. FEMS Microbiology Letters. 164:363-367

112. Postle, К. 1990 TonB and the Gram-negative dilemma. Mol Microbiol. 4:2019-2025

113. Postle, K. 1990. Aerobic regulation of the Escherichia coli tonB gene by changes in iron availability and the fur locus. J. Bacteriol, 172:2287-2293

114. Prehm, P., Jann, В., Jann, K., Schmidt, G., and Stirm, S. 1976 On a bacteriophage T3 and T4 receptor region within the cell wall lipopolysaccharide of Escherichia coli B. J. Mol. Biol. 101:277-281

115. Prozorov A.A. Bashkirov V.I. Lacomova N.M. Surikov N.N. 1982 Study of the phenomenon of marker resque in plasmid transformation of intact cells, protoplasts and different rec-mutants of Bacillus subtilis. Mol. Gen. Genet. 185:363-364

116. Pugsley, A.P. 1984 The ins and outs of colicins. Part I. Production and translocation across membranes. Microbiol.Sci. 1:168-175; Part II. Lethal action, immunity and ecological implications. Microbiol. Sci. 1:203-205

117. Raina R., Ravin A. 1980. Switches in macromolecular synthesis during induction of competence for transformation of Streptococcus sanguis. Proc. Natl Acad. Sci. USA. V. 77.10: 6062-6068

118. Rasched, L, and E. Oberer. 1986. Ff coliphages: structural and functional relationships. Microbiol. Rev. 50:401-427

119. Reynolds, P. R., Mottur, G. P., and Bradbeer, C. 1980 Trasport of vitamin B12 in Escherichia coli. J Biol Chem. 255:4313-4319

120. Riechman. L. and Holliger. P. 1997 The C-terminal domain of TolA is the coreceptor for filamentous phage infection of E. coli. Cell 90: 351-360

121. Sabet, S.F., and Schnaitman, C.A. 1973 Purification and properties of the colicin E3 receptor of Escherichia coli. J Biol Chem 248: 1797-1806.

122. Scandella, D., and Arber, W. 1974 An Escherichia coli mutant which inhibits the injection of phage ЮЫА. Virology 58:504-513;

123. Scandella, D., and Arber, W. 1976 Phage X DNA injection into Escherichia coli pel mutants is restored by mutations in phage V or H. Virology 69: 206-215

124. Schicklmaier, P., and H. Schmieger. 1994. Frequency of genralized transducing phages in natural isolates of the Salmonella typhimurium complex. Appl. Environ. Microbiol. 61:1637-1640.

125. Schmidt, M.A., and K. Jann.1982. Phospholipid substitution of capsular (K) polysaccharide antigens from Escherichia coli causing extraintestinal infections. FEMS Micribiol. Lett. 14: 69-74.

126. Schoffler, H., and Braun, V. 1989 Transportacross the outer membrane of Escherichia coli K-12 via the FhuA receptor is regulated by the TonB protein of the cytoplasmic membrane. Mol Gen Genet 217: 378-383

127. Schramm, E., Mende, J., Braun, V., and Kamp, R.M. 1987 Nucleotide sequence of the colicin В activity gene cba: consensus pentapeptide among TonB-dependent colicins and receptors. J Bacteriol 169: 3350-3357

128. Schweizer M., Hindennach I., Garten W., Henning U. 1978. Major proteins of Escherichia coli outer cell envelope membrane. Interaction of protein II* with lipopolysaccharide. Europ. J. Biochem. 1978. 82: 211-217

129. Singh R.N. 1972 Number of deoxyribonucleic acid uptake sites in competent cells of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. V. 110.1: 226-272,

130. Sisco K. Smith H. 1979 Sequence-specific DNA uptake in Haemophilus transformation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 36:764-772;

131. Skare, J., B. Ahmer, C. Seachord, R. Darveau, and K. Postle. 1993 Energy transduction between membranes. TonB, a cytoplasmic membrane protein, can be chemically cross-linked in vitro to the outer membrane receptor FepA. J. Biol. Chem. 268:16302-16308.

132. Skurray R.A., Hancock R.E., Reeves P. 1974. Con- mutants: class of mutants in Escherichia coli K-12 lacking a major cell wall protein and defective in conjugation and adsorption of a bacteriophage. J. Bacteriol. 119: 726-735

133. Smilowitz, H. 1974. Bacteriophage fl infection: fate sif the parental major coat protein. J. Virol. 13:94-99

134. Smith H.O., Tomb J.-F. Dougherty B.A. Fleischman R.D, et a I. 1995 Frequency and distribution of DNA uptake signal sequences in the Haemophilus influenzae genome. Science. 269:538-540

135. Smith H., de Vos W., Bron S. 1983 Transformation in Bacillus subtilis: properties of DNA- binding- deficient mutants.! Bacteriol. V. 153.1: 12-20.;

136. Smith H., Wiersma K., Venema G., Bron S. 1984. Transformation in Bacillus subtilis: a 75000 dalton protein complex is involved in binding and entry of donor DNA. J. Bacteriol. V. 157.3: 733-738

137. Snyder, С. E. 1984 Bacteriophage T5 gene A2 protein alters the outer membrane of E. coli. J. Bacteriol. 160:1191-1195

138. Sparling Ph. 1966 Genetic transformation of Neisseria gonorrhoeae to streptomycin resistance J. Bacteriol. 92:1364-1371

139. Stein D.C. 1991 Transformation of Neisseria gonorrhoeae: physical requirements of the transforming DNA. Can. J. Microbiol. 37:345-349

140. Stengele, I., P. Bross, X. Garces, J. Giray, and I. Rasched. 1990. Dissection of functional domains in phage fd adsorption protein. J. Mol. Biol. 212:143-149

141. Stintzi, A., Barnes, C., Xu, J., and Raymond, K.N. 2000 Microbial iron transport via a siderophore shuttle: a membrane ion transport paradigm. PNAS. 97: 10691-10696.

142. Taketo A., Hayashi A. Kuno S. 1972 Sensitivity of Escherichia coli to viral nucleic acid. 4. Transfection of phage DNA to mutant thermosensitive in wall synthesis. J. Biochem. 71:513-518.

143. Thanabalu, T. Koronakis, F. Hughes, C. and Koronakis, V. 1998 Substrate-induced assembly of a contiguous channel for protein export from E. coli reversible bridging of an in-ner-membrane translocase to an outer-membrane exit pore. EMBO J. 17. 6487-6496;

144. Tomacz A. 1965 Control of the competent .state in Pneumococcus by a hormonelike cell product: an example for a new type of regulatorymechanism in bacteria. Nature. 208:155-159

145. Tomacz A. Mosser I. 1966 On the nature of the pneumococcal activator substance. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 55:58-66

146. Tomasz A. 1968. Biological consequences of the replacement of choline by ethanolamine in the cell wall of Pneumococcus: chain formation, loss of transformability, and loss of autolysis. Proc. Natl Acad. Sci. USA.V. 59.1: 86-93.

147. Vagner V., Claverys J.-P., Ehrlich S., Mejean V. 1990. Direction of DNA entry in competent cells of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. V. 4.12: 1785-1788

148. Van de Pol I., Veldhuisen G., Cohen I. 1961 Phage transformation: a new criterium for the biological activity of bacteriophage DNA. Bioch. Bioph. Acta. 48:417418

149. Van der Ley,P., P. deGraaff, J.Tomassen .1986, Shielding of Escherichia coli outer membrane proteins as receptors for bacteriophages and colicins by o-antigenic chains of lipopolysaccharide. J. Bacteriol. 168: 449-451.

150. Vosman В., Kuiken G., Venema G. 1988. Transformation in Bacillus subtilis: involvement of the 17-kilodaIton DNA-entry nucleease and the competence- specific 18-kilodalton protein. J. Bacteriol. V. 170. 8: 3703-3710

151. Wackernagel W. 1973 Genetic transformation in E. coli: the inhibitory role of the recBC DNAse. Bioch. Bioph. Res. Com. 51:306-311.

152. Webster, R.E. 1991 The tol gene products and the import of macromolecules into Escherichia coli. Mol. Microbiol. 5: 1005-1011

153. Whitfield. C. and Valvano. M.A. 1993 Biosynthesis and expression of cell-surface polysaccharides in gram-negative bacteria. Adv. Microb. Physiol. 35: 135- 246

154. Williams, N., Fox, D. K., Shea, C., and Roseman. S. 1986 Pel, the protein that permits X DNA penetration of Escherichia coli, is encoded by a gene in ptsM and is required for mannose utilizatoin by the phosphotransferase system. PNAS USA. 83:89348938

155. Wilson, G.G., Young, K.K.Y., Edlin, G.J., and Konigsberg, W. 1979 High frequency, generalized transduction by bacteriophage T4. Nature. 280: 80-82

156. Winans, S. C., S. J. Elledge, J. H. Krueger, and G. C. Walker. 1985. Site-directed insertion and deletion mutagenesis with cloned fragments in Escherichia coli. J. Bacteriol. 161:1219-1221

157. Young F., Tipper D., Strominger J. 1964. Autolysis of cell walls of Bacillus subtilis. Mechanism and possible relationship to competence. J. Biol. Chem. V 239. 4: 3600-3602.;

158. Zgurskaya, U.I. and Nikaido, H. 1999 AcrA is a highly asymmetric protein capable of spanning the periplasm. J. Mol. Biol. 285: 409 420

159. Zusheng, L., Clarke, J. and Beveridge, T. J. 1998 Gram-negative bacteria produce membrane vesicles which are capable of killing other bacteria. J. Bacteriol. 180:54785483

160. Крылов B.H. 2001. Фаготерапия с точки зрения генетики бактериофага: надежды, перспективы, проблемы безопасности, ограничения. Генетика, т.37, №7, с 869-887

161. Лихачева Н.А., Е.А. Хренова, С.П. Синеокий. 1990 Генетический контроль резистентности Escherichia coli К12 к фагу С1. «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология». 12: 12-15

162. Парийская А. А., Пухова Е. С. 1967 О "факторе компетентности" у Bacillus suutilis. Микробиология. 36:456-463.

163. Прозоров А.А. 1965. Влияние яичного лизоцима на проницаемость клеток Bacillus subtilis для трансформирующей ДНК. Доклю АН СССР. Т. 160. 2: 472-474

164. Прозоров А.А. 1987 Дифференцировка клеток и её регуляция при генетической трансформации у бактерий. Микробиология. 66:5-13.; 4.

165. Прозоров А.А. 1998 Поглощение ДНК бактериальной клеткой: естественный процесс и лабораторные приемы. Генетика. 34:581-592.

166. Прозоров А.А. 1988 Трансформация у бактерий. М.: Наука. 255с.; Хмель. И. А. 1999 Микроцины- пептидные антибиотики энтеробактерий: генетический контроль синтеза, структура, механизм действия. ГЕНЕТИКА. 35:516

Информация о работе

Самсонов, Валерий Васильевич
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.05

Диссертация

Новая DcrA-DerB зависимая система транспорта ДНК бактериофагов в Escherichia coli K-12 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы