Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление и изучение клеточных функций Escherichia coli, участвующих в генетическом контроле развития бактериофагов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Синеокий, Сергей Павлович, Москва

/

/

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ

MI "РООРГАНИЗМОВ

СИНЕОКИЙ Сергей Павлович

ВЫЯВЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ФУНКЦИЙ ESCHERICHIA COLI, УЧАСТВУЮЩИХ В ГЕНЕТИЧЕСКОМ КОНТРОЛЕ РАЗВИТИЯ БАКТЕРИОФАГОВ.

03.00.15 - генетика

С

еной степени •< наук

Москва - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................3

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ....................................................................................8

1. Белки клеточной стенки E.coli, участвующие в фаговой адсорбции и транспорте колицинов.......................................................................................8

1.1. Пориновые белки..................................................................................................9

1.2. Белки-рецепторы фагов и колицинов, участвующие в специфическом транспорте..........................................................................................................12

1.3. Транспорт колицинов.........................................................................................14

1.4. ТопВ иТо1А -зависимые транспортные системы и импорт макромолекул

в E.coli..................................................................................................................15

1.5. Участие белков ЕхЬВ и ExbD в ТопВ зависимом транспорте.........................16

1.6. Продукты генов tol и импорт макромолекул в Е. coli....................................17

1.7. Механизм транспорта макромолекул системой Tol.......................................19

1.8. Взаимозаменяемость белков TonB-ExbB-ExbD и TolA-TolQ-TolR..............19

1.9. Многостадийность фаговой инфекции............................................................20

2. Элементы системы адаптация клеток Escherichia coli к воздействиям окружающей среды ................................................................23

2.1. SOS система..................:............„.......................................................................23

2.2. Регуляция синтеза капсульного полисахарида................................................29

2.2.1. Основные элементы регуляции синтеза колановой кислот............................29

2.2.2. RcsC и RcsB как пара сенсор - эффектор.......................................................... 31

2.2.3. Протеаза Lon контролирует уровень RcsA.......................................................33

2.2.4. Стимуляция транскрипции генов cps зависит от взаимодействия RcsA

с RcsB....................................................................................................................34

2.2.5. Модель регуляции синтеза клеточной капсулы...............................................34

2.3. Переход в стационарную фазу как последняя стадия адаптивного

ответа...................................................................................................................36

2.3.1. RpoS -зависимые гены........................................................................................37

2.3.2. RpoS-зависимые гены могут быть элементами других регуляторных систем........................ .......................................................................................41

2.3.3. Регуляция гена RpoS...........................................................................................42

2.3.4. Как RpoS контролирует экспрессию генов......................................................47

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................49

1. Бактериальные штаммы, плазмиды и бактериофаги.......................................49

2. Питательные среды и реактивы.........................................................................60

3. Перенос мутации из плазмиды в хромосому....................................................61

4. Генетические методы конструирования штаммов...........................................61

5. Проверка утилизации витамина В12...................................................................62

6. Методы работы с ДНК........................................................................................62

7. Фракционирование компонентов оболочки клеток.......................................64

8. Анализ клеточных бел::ов...................................................................................64

9. Анализ адсорбции фага С1.................................................................................65

10. Комплементационный анализ мутантов по фаговой адсорбции....................65

11. Качественное и количественное определение эффективности

индукции профага ля. j'a....................................................................................65

12. Спот-тест и количественное определение эффективности индукции

профага А,.............................................................................................................67

13. Определение эффективности адсорбции фага лямбда.....................................67

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................................68

1. Изучение клеточного генетического контроля адсорбции бактериофага С1................................................................................................68

1.1. Выделение бактериофага С1 и получение мутантов Е, coli, дефектных

по адсорбции фага С1..........................................................................................68

1.2. Клонирование генов а^гА и dcrB.......................................................................68

1.3. Локализация генов der А и dcrB внутри клонированных фрагментов

ДНК и на физической карте E.coli.....................................................................69

1.4. Анализ нуклеотидной последовательности генов der А и dcrB......................72

1.5. Оперонная организация экспрессии гена dcrB.................................................73

1.6. Идентификация продукта гена dcrB..................................................................74

1.7. Локализация белка DcrB в мембранных фракциях..........................................75

1.8. Продукт гена dcrA не влияет на экспрессию dcrB...........................................76

1.9. Утилизация витамина В12 в мутантах dcrB и dcrA...........................................78

1.10. Плейотропные эффекты, вызванные инактивацией или увеличением

дозы гена dcrA в клетке.......................................................................................78

1.11. Построение модели адсорбции бактериофага С1.............................................79

1.12. Изучение участков бактериальной хромосомы на 63.1 и 77.8 минутах карты E.coli, прилегающих к генам dcrA и dcrB..............................................82

2. Изучение SOS-незавкшмых клеточных функций, контролирующих

индукцию лямбдоидных фагов.......................................................................86

2.1. Клонирование генов Escherichia coli, сверхэкспрессия которых

приводит к RecA- независимой индукции профага лямбда............................86

2.2. Избыток RcsA и DsrA в клетке приводит к RecA-незавиеимой

индукции профага лямбда..................................................................................88

2.3. Влияние сверхпродукции RcsA и DsrA на индукцию других лямбдоидных фагов.............................................................................................90

2.4. Количественное определение эффективности RecA-незавиеимой индукции профага лямбда..................................................................................91

2.5. Роль генов rcsA,rcsB и dsrA в RecA-незавиеимой индукции профага лямбда...................................................................................................................98

2.6. Эффективность RcsABC пути индукции профага лямбда при сверхпродукции cI-Я. репрессора...............................................................................100

2.7. Индукция профагов - естестенный ответ клетки на различные

стрессовые воздействия....................................................................................104

V. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ...............................................110

VI. ЛИТЕРАТУРА..................................................................................................112

I. ВВЕДЕНИЕ

На современном этапе развития бактериальной генетики выявление и изучение новых генетических функций E.coli остается одной из наиболее важных и интересных задач. По мере увеличения количества известных генов, данных об их роли в различных процессах, регуляции, вовлеченности в глобальные клеточные регуляторные сети - получение информации о каждом новом гене и новых функциях ранее обнаруженных генов представляет все более общий интерес, поскольку может рассматриваться во взаимосвязи с ранее накопленными сведениями. Определение первичной последовательности ДНК E.coli и рамок считывания, которые потенциально могут являться новыми бактериальными генами, дало новый импульс в этих исследованиях. Появилась возможность организации масштабных проектов направленного введения мутаций в потенциально новые гены с последующим анализом различных фенотипических изменений. В то же время, разработка новых методов направленного отбора мутантов, проявляющихся в различных фенотипических изменениях, по-прежднему, необходима для выявления генетического контроля многих клеточных функций.

Одним из общих подходов генетического изучения E.coli является выявление клеточных генов, влияющих на различные этапы развития бактериофагов. Эффективность этого подхода связана с тем, что развитие бактериофагов зависит от многих бактериальных генов, участвующих также в контроле различных клеточных процессов. Мутации в подобных генах, как правило, приводят к нарушению развития бактериофага, что и является, обычно, их наиболее легко тестирумым фенотипическим проявлением. Наибольшее количество работ, использующих этот подход для генетического изучения E.coli, посвящено выявлению генов необходимых для различных существенных этапов развития бактериофага лямбда.(R. Hendrix 1983). Эти работы позволили выявить десятки ранее неизвестных бактериальных генов

вовлеченных во многие фундаментальные клеточные процессы. В тоже время, дальнейшая эффективность использования этого подхода зависит от возможности вносить в него новые методологические элементы, расширяющие круг потенциально обнаруживаемых бактериальных генов.

Целью данной работы было выявление и изучение ранее неизвестных функций E.coli, контролирующих адсорбцию бактериофага С1 (ранее выделенного и описанного в лаборатории) и поиск SOS- независимого пути индукции профага лямбда.

Результатом изучения генетического контроля адсорбции вирулентного бактериофага С1 явилась идентификация трех бактериальных генов der А, der В и der С, мутации в которых нарушают процесс фаговой адсорбции. Показано, что ген der С идентичен известному гену ЫиВ, ответственному за адсорбцию фага BF23, транспорт витамина В12 и некоторых колицинов; ген der А идентичен гену sdaC, контролирующему гипотетический транспортер серина (Z.Chao et. al., 1994), а ген der В впервые идентфицирован в настоящей работе и совпадает с рамкой считывания ORF_o203 гипотетического белка, описанной Sofia et. al., 1994). Определена нуклеотидная последовательность участков хромосомы включающих гены der А и derB. Показана оперонная организация ORF_o221 и derb. Идентифицирован продукт гена derB - процессируемый белок с мол. весом 18 кДа. Определена локализация DcrB в периплазме и внутренней клеточной мембране. Обнаружена супрессия точковых мутаций в derB при введении в соответствующие штаммы гена derA/sdaC на многокопийной плазмиде. Показано, что клетки, несущие мультикопийную плазмиду с геном derA/sdaC, перестают нормально делиться и образуют филаменты на богатой среде при 42°С. Этим продемонстрирована возможность участия белка DcrA/SdaC в клеточном делении. Обнаружено также, что мутанты по гену der А в 3 раза устойчивее к ß-лактамным антибиотикам, чем исходный штамм, что свидетельствует о

возможном влиянии гена dcrA на функционирование пенициллин-связывающих белков. На основании полученных данных предложена модель адсорбции фага С1. При этом высказано предположение, что роль белков DcrA и Dcr В может заключаться в передаче сигнала, приводящего к конформационному изменению белка BtuB в результате чего меняется способность этого белка выполнять функцию рецептора фага С1. Таким образом может осуществляться регуляция эффективности адсорбции бактериофага в зависимости от состояния клетки.

Изучение фенотипических проявлений инсерционных мутаций, введенных в некоторые ранее не идентифицированные прилегающие к гену dcrB рамки считывания, позволило предположить участие соответствующих генов в транспортных клеточных процессах и клеточном делении. В частности, среди этих генов обнаружен ген, определяющий устойчивость клеток к марганцу.

В другой части работы при изучении на модели E.coli - бактериофаг лямбда клеточного генетического контроля стабильности поддержания лизогенного состояния обнаружен ранее неизвестный SOS - независимый путь индукции лямбдоидных профагов.

Взаимоотношения фага X и клеток Escherichia coli являются наиболее детально изученным модельным примером взаимодействия вируса с клеткой-хозяином. Умеренные бактериофаги способны развиваться двумя способами, а именно: лизировать чувствительные клетки или идти по лизогенному пути развития, при котором фаговый геном поддерживается в клетке в неактивном состоянии посредством репрессии его генов одним или несколькими репрессорами (Lamont et al., 1989; Roberts and Devoret, 1983).

Открытие, что облучение УФ светом лизогенных клеток приводит к индукции некоторых профагов (Lwoff, 1953; Lwoff et al., 1950), было крупным научным достижением, положившим начало изучению механизма индукции профага. С этого времени усилиями многих исследователей был установлен механизм УФ-индукции

профага и других воздействий на клетку, вызывающих повреждения ДНК, приводящих к появлению одноцепочечной ДНК (Gimble and Sauer, 1986; Little, 1991; Roberts and Devoret, 1983; Walker, 1984, 1996). Инициация SOS-ответа происходит при активации копротазной активности белка RecA после его взаимодействия с однонитевой ДНК. Активированный белок RecA, способствует автопротеолитическому расщеплению некоторых фаговых репрессоров, также как и расщеплению клеточного репрессора SOS генов - белка LexA. SOS система и SOS-индуцибельные умеренные фаги описаны для многих бактерий (Roberts and Devoret, 1983; Walker, 1996). Наблюдаемая спонтанная индукция лямбдоидных профагов (в отсутствие индуцирующих воздействий на клетку) связана, в основном, с фоновой активностью SOS функции, т.к. инактивация RecA гена приводит к значительному снижению уровня спонтанной индукции (Lamont et al., 1989; Roberts and Devoret, 1983).

Предполагается, что зависимость индукции лямбдоидных профагов от SOS-функции позволяет фагу спастись в тех случаях, когда клетке грозит гибель при возникновении повреждений в ДНК. В природе клетка может испытывать большое количество разнообразных стрессовых воздействий не приводящих к индукции SOS -функции. Можно допустить, что некоторые и этих воздействий также способны вызывать индукцию профагов, но при этом оказываются задействованы другие индуцибельные клеточные функции. Это косвенно подтверждается фактом наличия умеренных бактериофагов, которые не являются SOS-индуцибельными (при наличии спонтанной индукции). Хорошо известными примерами таких фагов Е. coli являются Mu и Р2.

В настоящей работе обнаружен SOS- независимый путь индукции профага X, контролируемый ранее идентифицированными генами г es А и dsrA, чьи продукты участвуют в позитивной регуляции синтеза капсульного полисахарида клетки -колановой кислоты (Gottesman, 1995; Gottesman and Stout, 1991; Gottesman et al., 1985;

Sledgjeski and Gottesman, 1995; Stout et al., 1991). RcsA вызьшает индукцию профага в экспоненциальной фазе клеточного роста и его действие зависит от наличия в клетке интактной аллели гена г es В. Ген rcsB также кодирует позитивный регулятор синтеза клеточной капсулы. По-видимому, механизмы активации синтеза капсульного полисахарида и индукции профага X имеют общие регуляторные стадии. DsrA, возможно, участвует в двух различающихся путях индукции профага X. В экспоненциально растущих клетках - DsrA может регулировать RcsABC- зависимый путь индукции. Эта регуляция, по-видимому, связана с обнаруженным ранее участием DsrA в активации транскрипции г es А. При входе клеток в стационарную стадию развития, DsrA может влиять на индукцию профага независимо от функционирования генов rcsA и rcsB.

На основании результатов, полученных в ходе работы, было предположено, что RcsA-зависимая индукция в экспоненциальной фазе идет через инактивацию репрессора С1, возможно, копротеазой альтернативной Ree А, в то время как DsrA-зависимая индукция при входе клеток в стационарную стадию развития, по-видимому, не связана со стимуляцией авторасщепления фагового репрессора CI.

В ходе работы получены новые результаты о клеточных транспортных системах и возможных механизмах регуляции развития вирулентных фагов на этапе адсорбции, а также о механизмах клеточной регуляции стабильности профагов при различных стрессовых воздействиях на клетку. Работа расширяет наши представления о многообразии взаимодействия фаговых и клеточных функций, регулируемости различных этапов развития вирулентных и умеренных бактериофагов клеточными генами, позволяющих рассматривать бактериофаги, фактически, как генетические элементы клетки способные осуществлять внутри- и межвидовой генетический обмен, эффективность которого регулируется клеткой и зависит от ее состояния.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Данный обзор литературы не претендует на полный анализ результатов исследований связанных с предметом диссертации, а именно, изучению генов E.coli, контролирующих процессы фаговой адсорбции и адоптации клеток к внешним воздействиям. Изучению этих вопросов посвящено огромное количество работ, основные результаты которых регулярно обобщаются в хорошо известных сборниках, в частности, Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology 1987, 1997. The Bacteriophage lambda. 1971, 1981. Целью нашего обзора является приведение основных сведений необходимых для понимания вопросов затрагиваемых в диссертации, а также анализ наиболее значимых работ выполненных в последние годы и не попавших в популярные обзоры.

1. Белки клеточной стенки Е. coli, участвующие в фаговой адсорбции и транспорте колицинов.

Клеточная оболочка грамотрицательных бактерий, таких как Escherichia coli, состоит из внутренней или цитоплазматической мембраны, пептидогликанового слоя и внешней мембраны. Между внутренней мембраной и пептидогликаном имеется пространство, называемое периплазмой, где содержится ряд ферментов гидролиза и "связывающие белки". С оболочкой связаны существенные клеточн�