Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ-активности препаратов на клеточных и тканевых моделях

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ-активности препаратов на клеточных и тканевых моделях"

На правах рукописи

КиселёваЯна Юрьевна

РАЗРАБОТКА НОВЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ОЦЕНКИ АНТИ-ВИЧ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ НА КЛЕТОЧНЫХ И ТКАНЕВЫХ МОДЕЛЯХ

03.00. Об - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Кольцово - 2005

Работа выполнена в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗСР РФ.

Научные руководители:

кандидат биологических наук, доцент Плясунова О.А. доктор биологических наук, профессор Марголис Л.Б.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Евстропов А.Н. кандидат медицинских наук Беланов Е.Ф.

Ведущая организация:

ГНЦ Институт иммунологии МЗСР РФ, Москва

Защита состоится 2 сентября 2005 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗСР РФ по адресу: Кольцово Новосибирской области, 630559; тел. (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗСР РФ.

Автореферат разослан 28 июля 2005 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД, AIDS) - это первое ретровирусное заболевание, которое быстро распространилось по всему миру, приобретя характер пандемии. Несмотря на то, что более 20 лет научные ресурсы всего мира направлены на борьбу с этим заболеванием и, начиная с 1996 года, благодаря применению высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ), заболеваемость СПИДом значительно сократилась, число ВИЧ-инфицированных продолжает расти. В 2004 году общее число людей, являющихся носителями ВИЧ, возросло и составило 39,4 миллиона человек [UNAIDS/WHO, 2004]. Надежда врачей на то, что с помощью ВААРТ удастся излечить ВИЧ-инфицированных больных, столкнулась с уникальными патогенетическими особенностями ВИЧ-инфекции, не позволяющими ни иммунной системе, ни применяемым в настоящее время анти-ВИЧ препаратам обеспечить полную элиминацию вируса из организма. [Finzi, 1999; Hamer, 2004; McMichael, 2001; Ramratnam, 2000;]. ВИЧ характеризуется высокой генетической и антигенной изменчивостью. [Chen, 2004; Frenkel, 2004; Mayers, 1996; Pfflay, 2001; Pillay, 2000; Richman, 1996].

ВИЧ поражает самую сердцевину иммунной системы - CD4+ T-лимфоциты, постепенно на протяжении многих лет уничтожая иммунокомпетентные клетки.

Неспособность обратной транскриптазы ВИЧ контролировать стабильность генома, на фоне высокой скорости репликации вируса в условиях применения специфической противовирусной терапии приводит формированию мутантных штаммов со сниженной чувствительностью к анти-ВИЧ препаратам [Kellam, 1992; Larder, 1989; Larder, 1991; Ross, 2001; Schmit, 1996; Tisdale, 1993]. X4 и R5 штаммы ВИЧ-1 используют различные ко-рецепторы для проникновения в клетки и поражают различные субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов [Bleul, 1997, Ostrowski, 1998]. Поэтому необходим поиск лекарств, которые будут эффективны против штаммов различной тропности. Ключевые патофизиологические процессы ВИЧ-инфекции происходят в лимфоидной ткани [Fauci, 1996; Haase, 1996; Pantaleo, 1993], что требует разработки специальных подходов для тестирования препаратов на лимфоидной ткани ex vivo.

По последним оценкам, ВИЧ интегрируется в геном и существует в виде стабильной латентной формы провируса в покоящихся CD4+ T-лимфоцитах памяти в течение периода сравнимого с человеческой жизнью [Siliciano, 2004]. В такой форме вирус не чувствителен к ВААРТ и может быть активирован при активации Т-клеток памяти в ответ на специфический патоген [Belmonte, 2003; Chun, 1997; Hamer, 2004].

Сложные особенности патогенеза ВИЧ-инфекции требуют создания новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ активности препаратов.

Цель и задачи исследования. Целью нашего исследования была разработка новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ активности препаратов in vitro, в том числе на лимфоидной ткани в соответствии с современными представлениями о патогенезе и терапии ВИЧ-инфекции.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить коллекцию мутантов ВИЧ-1, резистентных к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы.

2. Изучить фенотипические и генотипические свойства, полученных мутантов.

3. Исследовать перекрестную устойчивость мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы в культуре клеток МТ-4.

4. Оценить подавление AZT-устойчивых мутантов ВИЧ-1 и штаммов с различной тропностью к ко-рецепторам новыми мембранотропными соединениями в культуре клеток МТ-4 и первичной культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека.

5. Исследовать активность НзИОТ и других перспективных антиретровирусных препаратов против штаммов с различной тропностью к ко-рецепторам в культуре лимфоидной ткани человека.

6. Разработать экспериментальную систему для оценки анти-ВИЧ активности постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации.

Научная новизна.

Впервые получен мутант ВИЧ-1, устойчивый к фосфонату d4T.

Впервые проведено сравнительное исследование развития устойчивости к нуклеозидным аналогам и их фосфонатным производным.

Впервые показано, что резистентность к нуклеозидным аналогам развивается гораздо быстрее и достигает более высокого уровня, чем к их фосфонатным производным.

Впервые показано, что phd4T с высокой эффективностью подавляет репликацию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T.

Впервые проведено исследование анти-ВИЧ активности новых мембранотропных соединений - анионной поликарбоксилатной матрицы и ее производных, модифицированных адамантаном и норборненом.

Впервые показано эффективное ингибирование комплексными адамантан- и нонборнен- содержащими мембранотропными соединениями репродукции Х4 штаммов LAI.04 и ВИЧ-IevKj а также AZT-устойчивых вариантов в культуре клеток человека МТ-4.

Впервые показана возможность использования культуры лимфоидной ткани миндалин человека для оценки анти-ВИЧ активности противоретровирусных препаратов.

Впервые проведено тестирование новых препаратов -микробицида, ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы UC781 и неконкурентного ингибитора обратной транскриптазы ниглизина в первичной культуре лимфоидной ткани миндалин человека. Показано, что эти препараты эффективно подавляют репликацию R5 и Х4 штаммов ВИЧ-1, при этом R5 вирус более чувствителен к UC781, чем Х4 вирус.

Впервые разработана экспериментальная система для исследования препаратов, действующих на постинтеграционные стадии вирусной репликации в лимфоидной ткани человека. Практическая значимость работы.

Созданная коллекция мутантных вариантов ВИЧ-1, обладающих повышенной устойчивостью к ряду нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (AZT, H-phAZT, ddl, d4T, phd4T) может быть использована для оценки эффективности новых препаратов против резистентных мутантов.

Использование в качестве экспериментальной модели культуры лимфоидной ткани миндалин человека позволит тестировать перспективные соединения в условиях, приближенных к in vivo.

Разработанная тест-система позволит оценивать препараты, направленные на блокирование постинтеграционных стадий вирусной репликации.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Резистентность к нуклеозидным аналогам развивается гораздо быстрее и в большей степени, чем к их фосфонатным производным.

2. Фосфонатное производное d4T с высокой эффективностью подавляет репродукцию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T.

3. Комплексные адамантан- и нонборнен- содержащие

соединения эффективно ингибируют репродукцию штаммов LAI.04 (СХСЯ4-тропный вариант) и ВИЧ-Ievk, а также AZT-устойчивых вариантов ВИЧ в культуре клеток человека МТ-4.

4. Культура лимфоидной ткани миндалин человека является адекватной системой для оценки анти-ВИЧ активности перспективных противоретровирусных препаратов.

5. Препараты UC781 и ниглизин эффективно подавляют репликацию R5 и Х4 штаммов ВИЧ-1 в культуре лимфоидной ткани миндалин человека.

6. Разработана тест-система, перспективная для оценки препаратов, направленных на блокирование постинтеграционных стадий вирусной репликации.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на конференции молодых ученых (Вектор, Кольцово, 2001); 8 и 9 международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, Россия, 2000, 2001); IX International conference "New informational technology in medicine and ecology" (Гурзуф, Украина, 2001); XII International congress of virology (Paris, France, 2002), XV International round table "Nucleosides, nucleotides and nucleic acids" (Leuvev, Belgium, 2002), I Международном Симпозиуме "Стресс и экстремальные состояния" и Сателлитном Симпозиуме "Новые технологии в медицине и биологии третьего тысячелетия". (Кара-Даг, Украина, 2002); 2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment, (Paris, France, 2003), симпозиуме "Интегративная медицина" (Кара-Даг, Украина, 2003); международной конференции "Microbicides 2004" (Лондон, Великобритания, 2004); международном симпозиуме "Keystone symposia on HIV Pathogenesis" (Банф, Канада, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 6 статей в отечественных и зарубежных журналах, 11 тезизов на международных конференциях.

Структура и объём работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 17 таблиц и 29 рисунков и состоит из 6-ти разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, а также списка сокращений и списка цитируемой литературы, включающего 343 ссылки.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение мутантов ВИЧ-1, резистентных к НзИОТ.

Изучение их фенотипических и генотипических свойств

В этой главе описана проведенная нами селекция in vitro вариантов ВИЧ-1, резистентных к известным нуклеозидным аналогам - эффективным ингибиторам обратной транскриптазы вируса - AZT, H-phAZT (фосфонатное производное AZT), d4T, phd4T (фосфонатное производное d4T) и ddl.

Селекцию in vitro резистентных вариантов ВИЧ-1 проводили на высокочувствительной к ВИЧ перевиваемой культуре клеток Т-лимфоцитов человека МТ-4. В качестве исходного штамма был взят

ВИЧ-1еук (ГКВ 4005, Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского). Использовали начальные концентрации препаратов, ингибирующие вирус примерно на 30%. Репликацию ВИЧ-1 оценивали по изменению жизнеспособности клеток методом окрашивания трипановым синим, и по накоплению вирусного белка р24 методом ИФА. Каждый новый пассаж вируса и увеличение концентрации препарата проводили после восстановления эффективной репликации вируса.

В результате проведенной селекции нами создана коллекция мутантов ВИЧ-1, обладающих повышенной устойчивостью к препаратам давления (таб.1). Показано, что в гене обратной транскриптазы эти вирусы содержат ряд мутаций, часть из которых являются классическими резистентными мутациями, а часть -впервые описаны в настоящей работе (таб.2).

Таблица 1.

Количественные характеристики ингибирования резистентных мутантов

Мутант 1С50, цМ 1С90, цМ 18 Кратность резистентности

ЕУКМ2Т16 9,0 >37,5 17

ЕУК/АгТ20 4,5 >37,5 33 80

ЕУК/АгТ21 6,4 31,8 24 114

ЕУКУА7Т22 4,5 >37,5 33 80

ЕУК/Н-рИАгИб 1,8 >262,3 642 7,8 '

<; г") уд, л,

■. .11 'Л- ' V

ЕУКШ8 122,8 1 355,6 1 13 1 10

Таблица 2.

Анализ нуклеотидных и аминокислотных замен

Мутант Мутации

EVK/AZT16 D67V/A, F214L

EVK/H-phAZT16 K219Q, Ь214Р

EVK/d4T10 P52R/L, N54D/G

EVK/phd4T10 K49N, I50M, P52R, N54S

Сравнение мутантов ВИЧ-1, резистентных к НЗИОТ - AZT, d4T с их фосфонатными производными выявило, что при одинаковых сроках пассирования кратность резистентности (КР), а также частота клонов с заменами значительно выше в случае мутантов, селектированных под давлением AZT и d4T, чем их фосфонатных производных. Эти факты, взятые вместе, дают основания утверждать, что резистентность к нуклеозидным аналогам развивается гораздо

быстрее, чем к их фосфонатным производным, и достигает более высокого уровня.

2. Исследование перекрестной устойчивости мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы в культуре клеток МТ-4

Созданную коллекцию резистентных мутантов ВИЧ-1еук использовали для сравнения эффективности различных НзИОТ в отношении НзИОТ-устойчивых мутантов ВИЧ-1еук и "дикого" типа вируса, с целью выявления перекрестной резистентности мутантов.

Таблица 3.

Перекрестная устойчивость мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы в культуре клеток МТ-4

Вирус

АгТ-устойчивый мутант

(ЕУК/АгТ1б, КР=160)

Н-рИАгТ-устойчивый мутант

(ЕУК/Н-рЬАгТ16, КР=8)

с14Т-устойчивый мутант (ЕУКЖПО, КР=70) р1к14Т-устойчивый мутант (ЕУК/р1к14Т10,КР=15) сШ-устойчивый мутант

(еуклш, кр=ю)

<7 в

500 1

400

300

200

100

Р<0,05

325 ±87

Р<0,05

I-

87±24

дгт-устончивые мутанты

I

н-рьлгт

Рисунок 1. Кросс-резистентность ЛСТ-устойчивых мутантов и субклонов к Ы-рЪЛСТ и ё4Т (средние показатели кратности резистентности •

Перекрестная уст,«-.и.ость ошибка среднего , п—5).

AZT-устойчивые мутанты характеризуются (рис.1, таб.3) высокой степенью перекрестной устойчивости к Ы-рЪЛСТ, КР от 79 до 600 (в

среднем КР=325Б87), и умеренной перекрестной устойчивостью к d4T, ^ от 4 до 23 (в среднем КР= 12П4). Выявлена положительная корреляция между устойчивостью к А2Т и перекрестной устойчивостью к H-phAZT (г = 0,7, Р<0,05). А также - положительная корреляция между устойчивостью к AZT и перекрестной устойчивостью к d4T (г = 0,89, Р<0,05). Показано, что AZT-устойчивый мутант EVK/AZT16 с высокой эффективностью подавляется фосфонатом d4T (таб.3). Фосфазид-устойчивый мутант EVK/H-phAZT16 продемонстрировал очень низкую кросс-резистентность к AZT (таб. 3).

сМТ-устойчивый мутант (EVK/d4T10) был исследован на наличие перекрестной устойчивости к AZT, H-phAZT, ddl и phd4T. Активность препаратов AZT, H-phAZT и ddl против резистентного мутанта оказалась незначительно снижена (КР = 1,68, 1,60 и 1,27, соответственно) по сравнению с их активностью в отношении исходного штамма. Более того, эффективность phd4T против EVK/d4T10 оказалась в 1,5 раза выше, чем против дикого штамма, и в 100 раз выше, чем активность самого селективного препарата d4T (таб. 3).

р!к14Т-устойчивый мутант (Г.УК/р1к14Т10). Активность Л/Т в отношении -устойчивого мутанта снижена незначительно (в 3

раза) по сравнению с активностью азидотимидина в отношении исходного штамма (таб. 3). Эффект d4T против EVK/phd4T10 снижен в 11 раз, то есть примерно равен активности против мутанта самого препарата давления - phd4T (^=14,8).

ddl-устойчивый мутант (EVK/ddI8). Анализ перекрестной устойчивости мутанта EVK/ddI8 к AZT и H-phAZT выявил высокую эффективность препаратов (таб.3), в 5 раз превосходящую их эффективность против исходного штамма (ГС50 = 0,011 цМ, КР=0,2 и ГС50 = 0,052 цМ, КР=0,2, соответственно).

3. Подавление различных штаммов ВИЧ-1 новыми мембрано-тропными соединениями в культуре клеток МТ-4 и первичной культуре мононуклеарных клеток периферической крови

AZT-устойчивые мутанты, описанные в главе 1, и исходный штамм были использованы для тестирования антивирусной

активности нового класса ингибиторов, препятствующих проникновению вируса в клетку, на модели острой инфекции в культуре лимфобластоидных клеток человека МТ-4. Кроме того, мы оценили эффективность новых препаратов в отношении штаммов ВИЧ-1 с различной тропностью к ко-рецепторам CCR5, CXCR4 в культуре стимулированных мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров.

Новые мембранотропные соединения разработаны в НИФ Здоровья, Москва, Россия. Л8470 - исходная анионная поликарбоксилатная матрица. Комплексные соединения - анионная поликарбоксилатная матрица, модифицированная через спейсерную группу трициклическими производными адамантана - Л8337, и бициклическими производными норборнена с экзо-изомерной (Л8504) и эндо-изомерной (Л8530) конфигурацией присоединения.

Исследование цитотоксического действия соединений Л8470, Лб337, Лб504, Лб530 на первичной и перевиваемой культуре клеток показало, что препараты в концентрациях 10, 100, 200 и 1000 мкг/мл не снижают жизнеспособности клеток (по сравнению с контрольной культурой) и не ухудшают их пролиферативных свойств (табл.4.). Это позволяет исключить прямое цитотоксическое воздействие тестируемых соединений в используемых концентрациях на зараженные и незаряженные клетки.

Тестирование анти-ВИЧ активности адамантан- и норборнен-модифицированных мембранотропных соединений на СХСЯ4-тропных штаммах ВИЧ-1еук и ЬЛ1.04 в культуре клеток МТ-4 выявило эффективное ингибирование вирусной репродукции в диапазоне концентраций 1-3,2 мкг/мл (1С50). В то время как ингибирование исходной поликарбоксилатной матрицей штамма ВИЧ-1еук оказалось в 10 раз слабее, а ЬЛ1.04, по крайней мере, в 200 раз слабее (табл. 4.).

Таблица 4.

Анти-ВИЧ активность мембранотропных соединений Л8470, Л8337 и Л8504 в отношении Х4 штаммов в культуре клеток МТ-4

*Препараты вносили одновременно с вирусом н/д - нет данных

Соединение Аз530 с эндо-изомерной конфигурацией присоединения норборнена оказалось менее эффективно, чем экзо-изомер.

Кроме того, было показано, что АСТ-устойчивый вариант с КР=80 был на порядок более чувствительным к исследуемым соединениям, чем исходный ВИЧ-1еук и АСТ-устойчивый вариант с низкой КР=5 (таб.5).

Таблица 5.

Анти-ВИЧ-1 активность мембранотропных препаратов А8337, А8504, А8530 в отношении АСТ-устойчивых вариантов и исходного штамма

ВИЧ-1 еук в культуре клеток МТ-4

Шифр препарата Штамм ВИЧ-1ЕУК АСТ-устойчивый вариант (КР=5) А2Т-устойчивый вариант (КР=80)

1С50, мкг/мл 1С90, мкг/мл 1С50, мкг/мл 1С90, мкг/мл 1С50, мкг/мл 1С90, мкг/мл

Аб337 3,2 8,8 3,2 9,0 0,4 3,4

Ав504 3,2 10,0 3,4 10,0 0,4 2,7

Ав530 7,0 >10,0 20,0 80,0 н/д 5,8

Эффективность мембранотропных препаратов при оценке в культуре первичных МКПК человека, была менее выражена, чем в культуре клеток МТ-4.. Важно отметить, что в первичной культуре МКПК анионная матрица, модифицированная бициклическими производными норборнена -А8.504 - была избирательно эффективна при подавлении штамма Х41_аю4 (таб.6). Этот факт может быть объяснен избирательным молекулярным взаимодействием препаратов с различными поверхностными белковыми структурами вирусов, участвующих во взаимодействии с ко-рецепторами мембраны клеток-мишеней.

Таблица 6.

Анти-ВИЧ активность мембранотропных соединений А8470, Аб337, Аб504 в отношении Я5 (8Б162) и Х4 (ЬА1.04) штаммов ВИЧ-1

на первичной культуре МКПК человека

Шифр Я5 вариант ВИЧ-1 Х4 вариант ВИЧ-1

препарата (8Р162) (ЬА1.04)

1С50, мкг/мл 1С90, 1С50, 1С90,

мкг/мл мкг/мл мкг/мл

Аэ470 130 (>200) >200 >200(>200) -

АБ337 31(>100) 91 26(40) 88 (>100)

АБ504 >100 (>100) - 36(59) 80 (>100)

В скобках приведены данные, полученные при добавлении исследуемых препаратов только во время адсорбции вируса.

Таким образом, эксперименты по изучению анти-ВИЧ активности мембранотропных соединений показали, что, несмотря на то, что исходная полианионная матрица и монокомпонентные низкомолекулярные соединения как адамантана, так и норборнена (по данным литературы) заметно не подавляют репродукцию штаммов ВИЧ-1, их коньюгаты с поликарбоксилатным носителем весьма эффективны против СХСR4-тропных штаммов ВИЧ-1, в перевиваемой культуре клеток МТ-4. Эффективность этих препаратов в первичной культуре МКПК человека, инфицированных штаммами ВИЧ-1 с различной тропностью к ко-рецепторам CCR5, CXCR4, менее выражена. Крайне важно отметить, что оба комплексных соединения, содержащих адамантановые или норборненовые фармакофоры, обладали более выраженным противовирусным действием в отношении высоко-резистентного к AZT мутанта ВИЧ-1. Последнее, безусловно, является важным для перспективного развития данного класса анти-ВИЧ препаратов и указывает на их возможное включение в ряд эффективных препаратов для комплексной антиретровирусной терапии.

4. Исследование анти-ВИЧ активности НИОТ и новых перспективных антиретровирусных препаратов в культуре лимфоидной ткани человека

В предыдущих главах мы оценивали анти-ВИЧ активность в перевиваемой культуре Т-лимфоцитов человека и культуре стимулированных МКПК периферической крови здоровых доноров. Однако основные патофизиологические процессы при ВИЧ-инфекции происходят в лимфоидной ткани, содержащей 98% лимфоцитов организма человека. Культура первичной лимфоидной ткани миндалин человека, ex vivo эффективно поддерживающая высокий уровень репликации ВИЧ в отсутствии экзогенной стимуляции, была разработана в 1995 году и успешно применялась для изучения патогенеза острой фазы ВИЧ-инфекции. В настоящей работе данная модель была использована для оценки активности таких соединений как классические нуклеозидные ингибиторы ОТ - AZT и ddl, и фосфонатного производного AZT - H-phAZT, а также двух новых соединений: UC781- класс ННИОТ, I стадия клинических испытаний) и препарата, запатентованного в нашей лаборатории, - ниглизина (Пента-О-никотинат глицирризиновой кислоты). Последний эффективно ингибирует рекомбинантную ОТ ВИЧ-1 по неконкурентному типу [Плясунова, 2004]. В качестве мишеней были использованы вирусы с различной тропностью к ко-рецепторам -

X4lai 04 и R5sF162-

Для приготовления первичной культуры небные миндалины, удаленные в ходе стандартной тонзиллэктомии измельчали с помощью скальпеля до размера 2-3 мм. Полученные фрагменты

помещали на поверхность пористой коллагеновой губки, по 9 блоков на каждую, и культивировали в 3 мл полной ростовой среды. Репликацию оценивали по накоплению белка р24 в культуральной среде на 3, 6, 9 и 12 день культивирования. Для каждого препарата эксперименты были выполнены, по крайней мере, на тканях от трех разных доноров.

Все исследованные препараты продемонстрировали четкий дозозависимый эффект ингибирования ВИЧ-1 на протяжении всего культивирования в первичной лимфоидной ткани миндалин человека.

Рисунок 2. Чувствительность штаммов Х4[,дю4 и Я5зр162 к АСТ и Н-рЪАСТ в культуре первичной лимфоидной ткани миндалин человека.

А2Т показал высокую активность в отношении Х4 и Я5 вирусов (рис.2.), количественные характеристики ингибирования составили 1С50ьа104=0,0027цИ 1С50зр162=0,0092цМ. 90%-интибирующая концентрация для обоих штаммов была одинаковой и равной А£Т. Для сравнения мы оценили количественные характеристики ингибирования ЬА1.04 и БР162 в культуре стимулированных МКПК в присутствии АТТ, 1С50ЬА104 = 0,0017цМ, 1С90ьаю4 = 0,1 цМ и

Ы-рЪАСТ по активности уступал А2Т примерно на порядок. Н-рЪАСТ был одинаково эффективен против обоих штаммов

(IC50lai о4=0,042цМ, IC50Sfi62=0,049hM). Для сравнения мы оценили количественные характеристики ингибирования LAI.04 и SF162 в культуре стимулированных МКПК в присутствии H-phAZT: IC50LAI04 = 0,01цМ, IC90LAio4= и IC50Sfi62= 0,02цМ, IC90sf,62= 0,09ЦМ.

Таким образом, активность AZT была примерно на порядок выше активности H-phAZT, что соответствует данным, полученным в культуре клеток МТ-4. При этом как в случае AZT, так и в случае Н-phAZT, не выявлено значительных отличий в чувствительности между исследуемыми штаммами с различной тропностью к ко-рецепторам.

В то же время эффективность ddl в отношении вируса Х4 была в 40 раз выше, чем в отношении вируса R5 (рис.3). Это согласуется с данными in vivo, в которых, показано, что диданозин значительно более активен против Х4 вариантов ВИЧ-1, чем против R5 вариантов.

Рисунок 3. Чувствительность штаммов X4LAI.04 и R5SF162 к ddl в культуре первичной лимфоидной

ткани человека.

миндалин

Это

основания

данную

пригодной

дает считать модель для

адекватной оценки анти-ВИЧ активности препаратов. Поэтому далее мы исследовали анти-ВИЧ активность двух новых перспективных соединений. Одно из них - пента-О-никотинат глицирризиновой кислоты - ниглизин. В культуре первичной лимфоидной ткани ниглизин эффективно подавлял вируспродукцию штаммов ВИЧ-1 Х4 и R5. При этом количественные характеристики анти-ВИЧ активности ниглизина очень близки к данным, полученным на модели острой инфекции в культуре клеток МТ-4 в отношении Х4 штамма ВИЧ-1еук (табл.7). Таблица 7.

Сравнительная оценка анти-ВИЧ активности ниглизина_

Ниглизин

Культура первичной лимфоидной ткани

Х4уио4

R5sf162

Культура клеток МТ-4

x4evk

EVK/AZT22 (КР=80)

IC50, цМ

22,0

13,0

9,64

0,134

Эффективность ниглизина против AZT-устойчивого мутанта (КР=80) на 2 порядка превысила его активность против исходного штамма ВИЧ-Ievk- Эти данные демонстрируют перспективность ниглизина в качестве эффективного анти-ВИЧ препарата.

Далее в культуре лимфоидной ткани миндалин человека мы исследовали антивирусную активность ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы, кандидата в микробициды - препарата UC781 (Biosyn, Huntington Valley, PA), который необратимо ингибирует обратную транскриптазу. UC781 с высокой эффективностью подавлял репликацию вирусов Х4 и R5 в лимфоидной ткани при различных способах добавления препарата (табл.8).

Таблица 8.

Количественные характеристики ингибирования при различных способах добавления UC781

Способ добавления UC781 R5 s f162 Х4 lai04

IC50, цМ IC90, цМ IC50, цМ IC90, цМ

На протяжении всего культивирования* <0,01 0,08 0,01 0,09

2ч преинкубация** 0,25 1,1 0,38 8

Мы провели оценку эффекта долговременной защиты ткани препаратом иС781. 2ч преинкубация ткани с иС781 и последующее ее заражение спустя 0, 24, и даже 48 ч приводила к подавлению репликации ВИЧ-1. иС781 в концентрациях ЮцМ и 1цМ подавлял репликацию вируса Я5 от 92 до 100%. В случае Х4х,аю4 только ЮцМ-концентрация иС781 обеспечивала подобный эффект. Таким образом, защита от вируса Я5 была более эффективна, чем от вируса Х4 (рис.4).

Рисунок 4. Оценка "эффекта памяти" иС781 в культуре первичной ткани миндалин человека при (■) ЮцМ иС781 и (■) 1цМ иС781 (пояснение в тексте).

Таким образом, в данной главе, на примере ингибиторов обратной транскриптазы, мы показали, что культура первичной лимфоидной ткани миндалин человека является адекватной моделью для оценки анти-ВИЧ активности препаратов. Используя данную модель, мы обнаружили, что UC781 предотвращает заражение даже спустя 48 ч после его нанесения на ткань.

5. Разработка экспериментальной системы для оценки

постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации

Различные ингибиторы ВИЧ-инфекции, активность которых мы оценивали в предыдущих главах, направлены на подавление афферентных стадий вирусного цикла при продуктивной инфекции ВИЧ-1. Между тем, одно из главных препятствий борьбы с ВИЧ-инфекцией - это наличие в клетках организма латентного провируса, то есть многолетнего резервуара инфекции в лимфоидной ткани, позволяющего ВИЧ персистировать в организме, несмотря на длительное применение В A APT [Blankson, 2002; Chun, 1997; Finzi, 1999; Ramratnam, 2000; Siliciano, 2004]. Поэтому необходима разработка препаратов, направленных на постинтеграционные стадии вирусного цикла, что позволит предотвратить возможность репликации вируса в латентно инфицированных клетках, его распространение и заражение новых клеток. В связи с этим, важной задачей представляется разработка системы, которая позволит исследовать подобные препараты, причем в ткани, которая in vivo является резервуаром латентно инфицированных клеток.

Для этой цели мы разработали систему, состоящую из первичной культуры лимфоидной ткани миндалин человека, зараженной доксициклин-зависимой конструкцией ВИЧ-1 - HIV-rtTA. Она обладает способностью проникать в клетки-мишени, транскрибироваться и интегрироваться как латентный провирус; и только при добавлении доксициклина происходит запуск продуктивной инфекции.

Сначала мы показали, что вирус HIV-rtTA реплицируется в лимфоидной ткани только при наличии доксициклина в среде. Далее мы исследовали возможность активации репликации HIV-rtTA при отсроченном добавлении доксициклина (спустя 6 дней после заражения). Как в контроле (доксициклин присутствовал в течение всего периода культивирования), так и в опыте (доксициклин был добавлен с 6 по 15 день культивирования) увеличение концентрации белка р24, обнаруживалось на 6-й день после добавления доксициклина (рис.3.23). На 9-й день после добавления доксициклина накопление р24 в контроле составило 7,9 5,5 нг/мл (9-й день культивирования), а в опыте 10,7 О 5,7 нг/мл (15-й день культивирования) (Р=0,74, Поскольку кинетика вирусной

репликации после добавления доксициклина в опыте и контроле была сходной, следовательно, вирусная репликация, по-видимому, была действительно следствием наличия провируса в латентно-инфицированных клетках, а не следствием de novo инфекции.

В целях проверки возможности использования этой системы для оценки постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации мы исследовали ампренавир. Это классический ингибитор вирусной протеазы. Мы инокулировали ткань в отсутствии доксициклина, вирус при этом интегрировался, но не реплицировался. На 5 день добавили ампренавир, а затем на 6 день активировали репликацию латентного провируса доксициклином. Это привело к дозозависимому ингибированию HIV-rtTA.

Рисунок 5. Дозозависимое ингибирование репликации вирусной конструкции HIV-rtTA в опыте с отсроченным добавлением доксициклина в культуре первичной лимфоидной ткани

миндалин человека, ex vivo (n=3).

Таким образом, на примере ампренавира мы показали, что данная экспериментальная система может быть применена для оценки анти-ВИЧ активности соединений, направленных на блокирование постинтеграционных стадий вирусной репликации.

Для более фундаментальной оценки этой системы мы исследовали влияние латентной и продуктивной вирусной инфекции на гибель CD4+ Т-лимфоцитов в лимфоидной ткани ex vivo.

В результате продуктивной репликации HIV-rtTA в присутствии доксициклина в лимфоидной ткани происходит снижение содержания CD4+ Т-лимфоцитов (измеренное по соотношению CD3*CD87 С03+С08*) на 64±5% (Р<0,001, п=10) в сравнении с неинфицированным контролем на 12 день культивирования (рис.6.). Напротив, при отсутствии доксициклина в культуральной жидкости и, соответственно, в отсутствие репликации, соотношение CD3+CD87 CD3+CD8+ составляет 104±5% (Р=0,21, п=6) по сравнению с контролем (рис.7). Однако в данном случае количество вирусных частиц и время их взаимодействия с клетками ткани ограничены размером инокулума и временем, в течение которого вирусные частицы обладают инфекционностью при 37°С.

10----------------------

о H'Wfl I mill I'll

0 001 0 01 01 1 10 [Ампренавир], цМ С 50=0,03 цМ С90=0,4цМ

Напротив, при продуктивной инфекции на протяжении всего периода культивирования вирусные частицы постоянно продуцируются и заражают все новые клетки. Следовательно, на данном этапе мы не можем сделать вывод об отсутствии влияния латентной инфекции на снижение содержания С044Т- лимфоцитов.

Для адекватного ответа на интересующий нас вопрос мы создали экспериментальное условие, при котором в отсутствии доксициклина заражение осуществлялось несколько раз (13 раз) на протяжении всего периода культивирования, так чтобы воссоздать уже известную нам кинетику продуктивной репликации ШУ-йТА. В результате мы получили искусственную кинетику накопления р24, которая даже несколько выше, чем кинетика ШУ-йТА в присутствии доксициклина (рис.6). Оценка соотношения СВЗ+С087 С03+С08+ показала, что и в присутствии сходного количества вируса оно равно 92 ±5% (Р=0,08, п=8) и статистически не отличается от контроля

(рис.7).

Рисунок 6. Множественное заражение ИТУ-йТА ткани миндалин человека. Блоки ткани миндалин каждого донора были разделены на три фракции, одну из которых заражали один раз и культивировали без доксициклина. Другую - заражали один раз и культивировали в присутствии доксициклина. Третью -культивировали без доксициклина, но заражали 13 раз на протяжении культивирования, каждые 3 дня увеличивая число инокуляций вируса (п=6-9).

Рисунок 7. Уровень С04+ Т-лимфоцитов в культуре первичной лимфоидной ткани при различных способах заражения И1У-йТА в сравнении с неинфицированным контролем -продуктивная инфекция (одиночное заражение + доксициклин), непродуктивная инфекция: ([]) - одиночное и (■;) множественное заражение и культивирование без доксициклина. Оценка проведена на 12 день после инфекции (п=6-9).

Нами разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать препараты, направленные на постинтеграционные стадии вирусной репликации, в частности на блокирование провируса, сборку вирусной частицы и отпочковывание. На модели лимфоидной ткани ex vivo, показано, что только продуктивная инфекция CD4+ T-лимфоцитов приводит к их массовой гибели, в то время как при непродуктивной инфекции незараженные и латентно зараженные CD4+ Т-лимфоциты не погибают.

ВЫВОДЫ

1. Создана коллекция мутантных вариантов ВИЧ-1, обладающих повышенной устойчивостью к ряду нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы - AZT, d4T, ddl, H-phAZT, phd4T. Показано, что все отобранные мутанты эффективно реплицируются в чувствительных клетках и проявляют цитопатические свойства. В гене pol наряду с классическими резистентными мутациями впервые выявлены и описаны новые мутации.

2. Впервые установлено, что резистентность ВИЧ-1 к нуклеозидным аналогам развивается значительно быстрее и в большей степени, чем к их фосфонатным производным (KPazt=160,8 и крц-phazt = 7,8; КРЛТ--70 и KPphd4T=14,8). Впервые показано, что phd4T с высокой эффективностью подавляет репликацию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T, a H-phAZT - резистентных к d4T и ddl.

3. Установлено, что AZT-резистентные мутанты обладают высокой перекрестной устойчивостью к H-phAZT и умеренной - к d4T; -резистентный мутант - умеренной устойчивостью к d4T и незначительной - к AZT. Для d4T- и ddl- устойчивых мутантов кросс-резистентность не выявлена. Впервые показано, что H-phAZT- устойчивый мутант обладает низкой перекрестной устойчивостью к AZT.

4. Сравнительное исследование анти-ВИЧ активности новых мембранотропных соединений в культуре клеток МТ-4 выявило высокую эффективность ингибирования репликации штаммов Х4, а также AZT-устойчивых мутантов комплексными мембранотропными соединениями, модифицированными адамантаном и норборненом, по сравнению с исходной анионной поликарбоксилатной матрицей. Показано, что бициклическое производное норборнена As504 избирательно эффективно против штамма X4laj 04 в первичной культуре МКПК.

5. Впервые показано, что препараты AZT, H-phAZT, ddl высоко активны против Х4 и R5 вирусов в культуре лимфоидной

ткани ex vivo. В этой системе эффективность ddl в против Х4 вируса в 40 раз выше, чем против R5 вируса.

6. Впервые ex vivo в культуре лимфоидной ткани показано, что ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы UC781 эффективно ингибирует репликацию ВИЧ-1. R5 ВИЧ-1 вирус более чувствителен к UC781, чем Х4 ВИЧ-1. Краткой преинкубации ткани с UC781 достаточно для предотвращения репликации ВИЧ-1 в течение, по крайней мере, 12 дней.

7. Разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать препараты, ингибирующие постинтеграционные стадии вирусной репликации. В данной экспериментальной системе было показано, что продуктивная инфекция CD4+ T-лимфоцитов приводит к их массовой гибели, в то время как латентно зараженные и незараженные CD4+ Т-лимфоциты не погибают.

Работа выполнена при поддержке грантов МНТЦ-1244 и 2175р.

Результаты работы опубликованы в следующих материалах: Статьи:

1. Покровский А.Г., Плясунова О.А., Киселева Я.Ю., Гашникова Н.М., Федюк Н.В. Сравнительное исследование возникновения резистентности ВИЧ-1 к AZT и Н-фосфонату AZT в культуре клеток// ДАН 2002. - 384. - N2. - С. 259-262.

2. Gashnikova N., Plyasunova О., Kiseleva Y.. Fedyuk N., Pokrovsky A. In Vitro Study of Resistance-Associated Genotypic Mutations to Nucleoside Analogs Journal Article Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids.- 2003. - Vol. 22. - N.5-8. - P. 991-4.

3. Плясунова ОА., Ильина Т.В., Киселева Я.Ю., Федюк Н.В., Балтина Л.А., Толстиков ГА., Покровский А.Г. Анти-ВИЧ активность пента-О-никотината глицирризиновой кислоты // Вестник РАМН.- 2004.- №11 .-С.42-46.

4. Kiseiveva Y., Ito Y., Lima R.G., Grivel JC, Das A.T., Berkhout В., Margolis L.B. Depletion of CD4 T lymphocytes in human lymphoid tissue infected ex vivo with doxycycline-dependent HIV-l//Virology.-2004.-Vol. - 328. - N1.P.-1-6.

5. Ito Y, Grivel JC, Chen S, Kiselveva Y. Reichelderfer P, Margolis L. CXCR4-tropic HIV-1 suppresses replication of CCR5-tropic HIV-1 in human lymphoid tissue by selective induction of CC-chemokines. J Infect Dis. 2004.-189(3).- P.506-514.

6. Киселева Я.Ю., Перминова Н.Г., Плясунова О.А., Тимофеев Д.И., Сербии А.В., Касьян Л.И., Егоров Ю.А, Гребиник Т.С., Тимофеев И.В. Противовирусная активность мембранотропных соединений,

модифицированных адамантановыми и норборненовыми фармакофорами в отношении различных штаммов ВИЧ-1 // Молекулярная генетика, эпидемиология и вирусология. 2005.-N.2.- с. 33-36.

Тезисы:

7. Плясунова ОА, Киселева Я.Ю.. Федюк Н.В., Покровский А.Г. Получение резистентных к d4T мутантов ВИЧ-1 и изучение их биологических свойств // Материалы 8-ой международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы". Санкт-Петербург, 19-24 мая 2000 г. - Русский журнал "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы"-2000.-Т.4.-№ 1.-С.75.

8. Плясунова О.А., Киселева Я.Ю., Федюк Н.В. Получение резистентных к нуклеозидным аналогам мутантов ВИЧ-1 и изучение их биологических свойств// Материалы 9-ой международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы". Санкт-Петербург, 27 мая - 1 июня 2001г. - Русский журнал "ВИЧ/СПИД и родственные проблемы"-2001.-Т.5.-№ 1.-С.15.

9. Plyasunova OA, Kiseleva Ya. Yu., Biological features of in vitro obtained DDI-resistant HIV-1 mutants// IX international conference "New informational technology in medicine and ecology". Gurzuf, Ukraine, 1-10 June 2001 r. - Materials of conference. - P. 155.

10. Plyasunova OA, Kiseleva Ya.Yu., Gashnikova N.M., Fedyuk N.V., Pokrovsky A.G. Comparison study of appearance of HIV-1 resistance to nucleoside analogues in cell culture // Abstracts of The World of Microbes, Xllth International Congress of Virology, Paris, France, 27 Juny -1 August 2002. - Vol.781. - P.264.

11. Плясунова О.А., Киселева Я.Ю.. Тимофеев Д.И., Сербии А.В., Тимофеев И В., Перминова Н.Г. Новые мембранотропные ингибиторы ВИЧ на основе модифицированной производными адамантана и норборнана поликарбоксилатной матрицы // Труды I Международного Симпозиума "Стресс и экстремальные состояния", Сателлитный Симпозиум "Новые технологии в медицине и биологии третьего тысячелетия". Кара-Даг,Украина. -5-14 июня.-2002 г.-С. 110-111.

12. Gashnikova N.M., Plyasunova OA, Kiseleva Y.U.. Fedyuk N.V. In vitro study of resistance-associated genotypic mutations to nucleoside analogs// XV International round table "Nucleosides, nucleotides and nucleic acids". - Leuvev, Belgium. - 2002. -10-14 September.

13. Kiselyeva Ya.Yu. Plyasunova OA, Perminova N.G., Serbin A.V., Timofeyev D.I., Timofeyev I.V. The adamantan- and norbornane-modified compounds activity in respect of different HIV-1 strains //Symposium "Integrative medicine" and the 2-d International

Symposium "Stress and Extreme Conditions" Kara-Dag. - Feodosia, Ukraine. - June 8-19. - 2003. - P.80-81.

14. Grivel JC, Ito Y., Fitzgerald W., Chen S., Kiselyeva Y., Margolis L. HIV-1 pathogenesis and viral in infected human lymphoid tissue// 2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment, Paris, France 13-16 July, 2003, P.309.

15. Kiselveva Ya.. Watts P., Margolis L., Shattock R. UC781 protects ex vivo lymphoid tissue from HIV-1 infection //Microbicides 2004. -London, UK. - 28-31 March. - 2004. - P.71.

16. Timofeyev I., Serbin A., Timofeyev D., Plyasunova O., Karpyshev N., Varaksin N, Ryabicheva T., Nekludov V., Kiseleva Y, Perminova N. Design of anti-HIV microbicides with inclusion of pharmacophore modifiers and pseudo-ligands. // Microbicides 2004. - London, UK. -28-31 March.- 2004.-P.92.

17. Kiselveva Ya.. Ito Y., Lima R., Grivel JC, Das A.T., Berkhout B., Margolis L.B. Depletion of CD4 T lymphocytes in human lymphoid tissue infected ex vivo with doxycycline-dependent HIV-1//HIV Pathogenesis, Keystone Symposia, Banff, Canada. - Apr 9 - 15. -2005.

Подписано к печати "26" июля 2005г. Тираж 100 экз. Заказ № 1515. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

i ^«лаЛк'*1 J

\

■ч.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Киселева, Яна Юрьевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Патогенез ВИЧ-инфекциии в лимфоидной ткани

1.2. Препараты, используемые для лечения ВИЧ-инфекции

1.3. Развитие устойчивости к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Результаты

3.1. Получение мутантов ВИЧ-1, резистентных к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы. Изучение их фенотипических и генотипических свойств

3.2. Исследование перекрестной устойчивости мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы в культуре клеток

3.3. Подавление различных штаммов ВИЧ-1 новыми мембранотропными соединениями в культуре клеток МТ-4 и первичной культуре мононуклеарных клеток периферической крови

3.4. Исследование анти-ВИЧ активности НзИОТ и других перспективных антиретровирусных препаратов в культуре лимфоидной ткани человека

3.5. Разработка экспериментальной системы для оценки постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации

Глава 4. Обсуждение

Выводы

Список используемых сокращений

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ-активности препаратов на клеточных и тканевых моделях"

Актуальность исследования

Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД, AIDS) - это первое ретровирусное заболевание, которое быстро распространилось по всему миру, приобретя характер пандемии. Впервые СПИД описан у гомосексуалистов в США в 1981 году [144, 186, 236]. Два года спустя в лабораториях L.Montagnier [12] и R.Gallo [90] был идентифицирован возбудитель СПИДа - ретровирус человека, первоначально названный, соответственно, LAV (Lymphoadenopathy-associated virus) и HTLV-III. Сейчас он известен как вирус иммунодефицита человека I типа (ВИЧ-1). Несмотря на то, что более 20 лет научные ресурсы всего мира направлены на борьбу с этим заболеванием и, начиная с 1996 года, благодаря применению высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ), заболеваемость СПИДом значительно сократилась, число ВИЧ-инфицированных продолжает расти. В 2004 году общее число людей, являющихся носителями ВИЧ, возросло и достигло самого высокого уровня в истории: по оценкам экспертов 39,4 миллиона (35,9^44,3 миллиона) человек живут с этим вирусом. Эта цифра включает 4,9 (4,3-6,4) миллиона человек, инфицированных ВИЧ в 2004 году. За прошедший год глобальная эпидемия СПИДа унесла жизни 3,5 миллиона человек [299].

Надежда врачей на то, что с помощью ВААРТ удастся излечить ВИЧ-инфицированных больных, столкнулась с уникальными патогенетическими особенностями ВИЧ-инфекции, не позволяющими ни иммунной системе, ни применяемым в настоящее время анти-ВИЧ препаратам обеспечить полную элиминацию вируса из организма.

ВИЧ поражает самую сердцевину иммунной системы — CD4+ Т-лимфоциты, постепенно на протяжении многих лет уничтожая иммунокомпетентные клетки.

ВИЧ характеризуется высокой генетической и антигенной изменчивостью. Изоляты ВИЧ, полученные от одного и того же больного, но из разных отделов организма, а также выделенные на разных стадиях заболевания, отличаются по нуклеотидным последовательностям и антигенным свойствам. Кроме того, различные субтипы ВИЧ превалируют в различных географических областях. Все это осложняет создание вакцин против СПИДа и иммунотерапию.

Неспособность обратной транскриптазы ВИЧ контролировать стабильность генома, высокая скорость репликации вируса в условиях применения специфической противовирусной терапии приводит к отбору и неизбежному накоплению мутантных штаммов со сниженной чувствительностью к анти-ВИЧ препаратам.

Хотя все стадии жизненного цикла ВИЧ-1 являются потенциальными мишенями для антиретровирусной терапии, сейчас в клинической практике используют только три класса соединений: ингибиторы проникновения, ингибиторы обратной транскриптазы и ингибиторы протеазы. Причем, ко всем применяемым в настоящее время препаратам обнаружены резистентные мутанты ВИЧ-1. Поэтому очень важно, чтобы новые препараты были активны не только против 'диких' штаммов, но и против резистентных штаммов ВИЧ-1. Этого можно добиться путем создания препаратов, действующих на 'новые' мишени вирусного цикла, либо, если препарат направлен на 'старые' мишени, необходимым этапом должно быть тестирование его активности против резистентных мутантов ВИЧ-1.

Поскольку одной из задач нашей лаборатории является поиск новых перспективных антиретровирусных препаратов, мы были заинтересованы, в частности, в получении мутантов ВИЧ-1, резистентных к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы, изучении их фенотипических и генотипических свойств и исследовании перекрестной устойчивости мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы.

Важной особенностью ВИЧ-инфекции является наличие штаммов ВИЧ-1, использующих различные ко-рецепторы - CXCR4 и CCR5 - для проникновения в клетки (штаммы Х4 и R5, соответственно) и поражающих различные субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов [17, 219]. Поэтому необходим поиск лекарств, которые будут эффективны против штаммов ВИЧ-1 различной тропности.

Ключевые патофизиологические процессы ВИЧ-инфекции происходят в лимфоидной ткани [74, 118, 225], что требует разработки специальных подходов для тестирования препаратов на лимфоидной ткани ex vivo. В настоящее время для тестирования анти-ВИЧ препаратов используются либо лимфобластоидные и моноцитарные перевиваемые культуры клеток человека, либо первичные культуры стимулированных мопонуклеарных (МКПК), лимфоцитарных или моноцитарных клеток периферической крови здоровых доноров, пермиссивных для репликации ВИЧ-1. Но у данных систем есть недостатки, которые ограничивают их применение. В частности, метаболизм природных пуклеотидов, как в перевиваемых культурах Т-лимфоцитов человека, так и в стимулированных мононуклеарных клетках периферической крови усилен [85, 97, 200]. По-видимому, это связано с тем, что в данных системах нарушены природные взаимодействия, которые существуют между иммуннокомпетентными клетками и их окружением in vivo. Например, стимуляция МКПК фитогемагглютинином значительно меняет экспрессию CCR5 и CXCR4 ко-рецепторов на поверхности лимфоцитов [17, 325]. Основой вышеперечисленных in vitro моделей являются изолированные клетки периферической крови человека. Между тем, хорошо известно, что на долю периферической крови приходится менее 2% всех лимфоцитов организма [315], и изменения в периферической крови при ВИЧ-инфекции являются лишь отражением ключевых патофизиологических процессов, происходящих в лимфоидной ткани, которая содержит подавляющее большинство - 98% лимфоцитов организма человека и является основной мишенью для ВИЧ. Поэтому использование культуры лимфоидной ткани человека, в которой сохранена архитектоника ткани, стромальное окружение иммунокомпетентных клеток, обеспечивющее взаимодействие между антигенами, хемокинами, факторами роста, лимфоцитами, макрофагами и дендритными клетками, позволило бы проводить более адекватное тестирование новых препаратов с целью оценки их перспективности.

Наиболее труднопреодолимым препятствием в борьбе с ВИЧ-инфекцией является наличие многолетнего латентного резервуара инфекции в лимфоидной ткани. По последним оценкам ВИЧ интегрируется в геном и существует в виде стабильной латентной формы провируса в покоящихся CD4+ Т-лимфоцитах памяти в течение периода сравнимого с человеческой жизнью [277]. В такой форме вирус не чувствителен к ВААРТ и может быть активирован при активации Т-клеток памяти в ответ на специфический патоген [13, 39, 119].

Таким образом, сложные особенности патогенеза ВИЧ-инфекции требуют создания новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ активности препаратов.

Цель и задачи исследования

Целью нашего исследования была разработка новых экспериментальных систем для оценки анти-ВИЧ активности препаратов in vitro, в том числе на лимфоидной ткани в соответствии с современными представлениями о патогенезе и терапии ВИЧ-инфекции.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить коллекцию мутантов ВИЧ-1, резистентных к пуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы.

2. Изучить фенотипические и генотипические свойства, полученных мутантов.

3. Исследовать перекрестную устойчивость мутантов ВИЧ-1 к различным нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы в культуре клеток МТ-4.

4. Оценить подавление AZT-устойчивых мутантов ВИЧ-1 и штаммов с различной тропностью к ко-рецепторам новыми мембранотропными соединениями в культуре клеток МТ-4 и первичной культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека.

5. Исследовать активность НзИОТ и других перспективных антиретровирусных препаратов против штаммов с различной тропностью к ко-рецепторам в культуре лимфоидной ткани человека.

6. Разработать экспериментальную систему для оценки анти-ВИЧ активности постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации.'

Научная новизна работы

Впервые получен мутант ВИЧ-1, устойчивый к фосфонату d4T.

Впервые проведено сравнительное исследование развития устойчивости к нуклеозидным аналогам и их фосфонатным производным.

Впервые показано, что резистентность к нуклеозидным аналогам развивается гораздо быстрее и достигает более высокого уровня, чем к их фосфонатным производным.

Впервые показано, что phd4T с высокой эффективностью подавляет репликацию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T.

Впервые проведено исследование анти-ВИЧ активности новых мембранотропных соединений - анионной поликарбоксилатной матрицы и ее производных, модифицированных адамантаном и норборненом.

Впервые показано эффективное ингибирование комплексными адамантан- и нонборнен- содержащими мембранотропными соединениями репродукции Х4 штаммов LAI.04 и ВИЧ-Ievk, а также AZT-устойчивых вариантов в культуре клеток человека МТ-4.

Впервые показана возможность использования культуры лимфоидной ткани миндалин человека для оценки анти-ВИЧ активности противоретровирусных препаратов.

Впервые проведено тестирование новых препаратов - микробицида, ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы UC781 и неконкурентного ингибитора обратной транскриптазы ниглизина в первичной культуре лимфоидной ткани миндалин человека. Показано, что эти препараты эффективно подавляют репликацию R5 и Х4 штаммов ВИЧ-1, при этом R5 вирус более чувствителен к UC781, чем Х4 вирус.

Впервые разработана экспериментальная система для исследования препаратов, действующих на постинтеграционные стадии вирусной репликации в лимфоидной ткани человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Резистентность к нуклеозидным аналогам развивается гораздо быстрее и в большей степени, чем к их фосфонатным производным.

2. Фосфонатное производное d4T с высокой эффективностью подавляет репродукцию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T.

3. Комплексные адамантан- и нонборнен- содержащие мембранотроппые соединения эффективно ингибируют репродукцию штаммов LAI.04 (CXCR-4-тропный вариант) и ВИЧ-Ievk, а также AZT-устойчивых вариантов ВИЧ в культуре клеток человека МТ-4.

4. Культура лимфоидной ткани миндалин человека является адекватной системой для оценки анти-ВИЧ активности перспективных противоретровирусных препаратов.

5. Препараты UC781 и ниглизин эффективно подавляют репликацию R5 и Х4 штаммов ВИЧ-1 в культуре лимфоидной ткани миндалин человека.

6. Разработана экспериментальная система, перспективная для оценки препаратов, направленных на блокирование постинтеграционных стадий вирусной репликации.

Практическая значимость работы

Созданная коллекция мутантных вариантов ВИЧ-1, обладающих повышенной устойчивостью к ряду нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы (AZT, Н-phAZT, ddl, d4T, phd4T) может быть использована для оценки эффективности новых препаратов против резистентных мутантов.

Использование в качестве экспериментальной модели культуры лимфоидной ткани миндалин человека позволит тестировать перспективные соединения в условиях, приближенных к in vivo.

Разработанная экспериментальная система позволит оценивать препараты, направленные на блокирование постинтеграционных стадий вирусной репликации. Апробация работы

Результаты работы были доложены на конференции молодых ученых (Вектор, Кольцово, 2001); 8 и 9 международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы" (Санкт-Петербург, Россия, 2000, 2001); IX International conference "New informational technology in medicine and ecology" (Гурзуф, Украина, 2001); XII International congress of virology (Paris, France, 2002), XV International round table "Nucleosides, nucleotides and nucleic acids" (Leuvev, Belgium, 2002), I Международном Симпозиуме "Стресс и экстремальные состояния" и Сателлитном Симпозиуме "Новые технологии в медицине и биологии третьего тысячелетия". (Кара-Даг, Украина, 2002); 2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment, (Paris, France, 2003), симпозиуме "Интегративная медицина" (Кара-Даг, Украина, 2003); международной конференции "Microbicides 2004" (Лондон, Великобритания, 2004); международном симпозиуме "Keystone symposia on HIV Pathogenesis" (Банф, Канада, 2005).

Публикации

По материалам диссертации имеется 17 печатных работ, в том числе 6 статей в отечественных и зарубежных журналах, 11 тезизов на международных конференциях.

Личный вклад соискателя заключается в проведении основной части экспериментов - по селекции и изучению фенотипических свойств AZT-, H-phAZT-, ddl-резистентных мутантов, в исследовании анти-ВИЧ активности мембранотропных соединений в культуре клеток МТ-4 и первичной культуре мононуклеарных клеток периферической крови, в изучении анти-ВИЧ активности НзИОТ и других перспективных антиретровирусных препаратов в культуре лимфоидной ткани человека, и в разработке экспериментальной системы для оценки постинтеграционных ингибиторов вирусной репликации.

Результаты по селекции AZT-, H-phAZT-, ddl-, d4T- и phd4T- резистентных мутантов, получены в соавторстве и при непосредственной помощи О.А. Плясуновой. Результаты по анализу нуклеотидных и аминокислотных замен в гене pol получены сотрудником нашей лаборатории Н.М Гашниковой.

Автор благодарит О.А. Плясунову, П.М. Кузину и С.А. Сафонову за обучение методам безопасной работы с инфекционным материалом, освоение вирусологических и культуральных методов и неоценимую помощь при проведении экспериментов. Н.М Гашникову за сотрудничество по анализу нуклеотидных и аминокислотных замен в гене pol. А.Г. Покровского за научное консультирование.

Автор благодарит сотрудников Лаборатории Клеточной и Молекулярной Биофизики (NICHD, USA) - J.-Ch. Grivel, Y. Ito за приобретенные навыки работы с первичной культурой миндалин человека, а также помощь в освоении методов флуоцитометрии и ПЦР в реальном времени.

Автор благодарит Н.Г.Перминову, И.В.Тимофеева и А.В.Сербина за любезно предоставленную возможность исследования новых мембранотропных соединений и за научное консультирование.

Автор благодарит Dr. R. Shattock за любезно предоставленный препарат UC781.

Автор благодарит Dr. B.Berkhout и A.T.Das за любезно предоставленную возможность работы с досксициклин-зависимой вирусной конструкцией HIV-rtRT и за научное консультирование.

За научное руководство работой автор выражает особую благодарность О.А. Плясуновой и Л.Б. Марголису.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Киселева, Яна Юрьевна

выводы

1. Создана коллекция мутантных вариантов ВИЧ-1, обладающих повышенной устойчивостью к ряду нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы - AZT, d4T, ddl, H-phAZT, phd4T. Показано, что все отобранные мутанты эффективно реплицируются в чувствительных клетках и проявляют цитопатические свойства. В гене pol наряду с классическими резистентными мутациями впервые выявлены и описаны новые мутации.

2. Впервые установлено, что резистентность ВИЧ-1 к нуклеозидным аналогам развивается значительно быстрее и в большей степени, чем к их фосфонатным производным (KPazt=160,8 и КРн-рилгт = 7,8; KPd4T=70 и KPphd4t-14,8). Впервые показано, что phd4T с высокой эффективностью подавляет репликацию мутантов ВИЧ-1, резистентных к AZT и d4T, a H-phAZT - резистентных к d4T и ddl.

3. Установлено, что AZT-резистентпые мутанты обладают высокой перекрестной устойчивостью к H-phAZT и умеренной - к d4T; р1^4Т-резистентный мутант -умеренной устойчивостью к d4T и незначительной - к AZT. Для d4T- и ddl-устойчивых мутантов кросс-резистентность не выявлена. Впервые показано, что II-pliAZT- устойчивый мутант обладает низкой перекрестной устойчивостью к AZT.

4. Сравнительное исследование анти-ВИЧ активности новых мембранотропных соединений в культуре клеток МТ-4 выявило высокую эффективность иигибирования репликации штаммов Х4, а также AZT-устойчивых мутантов комплексными мембранотроппыми соединениями, модифицированными адамантаном и норборненом, по сравнению с исходной анионной поликарбоксилатной матрицей. Показано, что бициклическое производное норборнеиа As504 избирательно эффективно против штамма X4lai 04 в первичной культуре МКПК.

5. Впервые показано, что препараты AZT, H-phAZT, ddl высоко активны против Х4 и R5 вирусов в культуре лимфоидной ткани ex vivo. В этой системе эффективность ddl в против Х4 вируса в 40 раз выше, чем против R5 вируса.

6. Впервые ex vivo в культуре лимфоидной ткани показано, что ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы UC781 эффективно ингибирует репликацию ВИЧ-1. R5 ВИЧ-1 вирус более чувствителен к UC781, чем Х4 ВИЧ-1. Краткой преинкубации ткани с UC781 достаточно для предотвращения репликации ВИЧ-1 в течение, по крайней мере, 12 дней.

7. Разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать препараты, ингибирующие постинтеграционные стадии вирусной репликации. В данной экспериментальной системе было показано, что продуктивная инфекция CD4+ Т-лимфоцитов приводит к их массовой гибели, в то время как латентно зараженные и незараженные CD4+ Т-лимфоциты не погибают.

Список используемых сокращений ВААРТ - высокоактивная антиретровирусная терапия ГК - глицирризииовая кислота

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный калониестимулирующий фактор

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КР — кратность резистентности

ИП — ингибиторы протеазы

МКПК - мононуклеарпые клетки периферической крови

НзИОТ - нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы

НтИОТ - нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы

ННИОТ - ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы

ОТ - обратная транскриптаза

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТАМ - тимидин-ассоциированные мутации

ФГА - фитогемагглютинин

ЦНС - центральная нервная система

AZT - 3'-azido-2',3'- dideoxythymidin

AZT-MP - 3'-azido-2',3'- dideoxythymidine-5' - monophosphate AZT-TP - 3'-azido-2',3'- dideoxythymidine-5' - triphosphate CD - cluster of differentiation

CC50 - цитотоксическая концентрация, на 50% снижающая жизнеспособность клеток dATP - 2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate ddA-TP - 2',3'-dideoxyadenosine 5' - triphosphate ddl - 2',3'-dideoxyinosine dNTP - deoxyribonucleotide triphosphate ddN - дидезоксинуклеозиды ddNTP - дидезоксинуклеозидтрифосфат d4T - 2',3'-didehydro-2',3'-dideoxythymidine- 5'-diphosphate d4T-DP - 2',3 '-didehydro-2',3 '-dideoxythymidine d4T-TP - 2,,3'-didehydro-2',3'-dideoxythymidine - 5' - triphosphate

IC50 - 50% ингибирующая концентрация

IC90 - 90% ингибирующая концентрация

FDA - Food and Drug Administration

MlP-la - macrophage inflammatory protein la

MIP-1J3 - macrophage inflammatory protein 1P

MNR - множественная резистентность к нуклеозидным аналогам

NSI - non-syncytium-inducing

R5 - штамм ВИЧ-1, тропный к ко-рецептору CCR5

RANTES - regulated on activation, normal T cell expressed and secreted

SI - syncytium-inducing

X4 -штамм ВИЧ-1, тропный к ко-рецептору CXCR4

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Киселева, Яна Юрьевна, Кольцово

1. Adkins J.C., Peters D.H., Faulds D., Zalcitabine. An update of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and clinical efficacy in the management of HIV infection // Drugs.- 1997.- 53(6).- P. 1054-1080.

2. Ahluwalia G.S., Gao W.Y., Mitsuya H., Johns D.G., 2',3'-Didehydro-3'-deoxythymidine: regulation of its metabolic activation by modulators of thymidine-5'-triphosphate biosynthesis //Mol Pharmacol.- 1996.- 50(1).- P. 160-165.

3. Armstrong J.A., Home R., Follicular dendritic cells and virus-like particles in AIDS-related lymphadenopathy // Lancet.- 1984,- 2(8399).- P. 370-372.

4. August E.M., Marongiu M.E., Lin T.S., Prusoff W.H., Initial studies on the cellular pharmacology of 3'-deoxythymidin-2'-ene (d4T): a potent and selective inhibitor of human immunodeficiency virus // Biochem Pharmacol.- 1988.- 37(23).- P. 4419-4422.

5. Back N.K., Nijhuis M., Keulen W., et al., Reduced replication of ЗТС-resistant HIV-1 variants in primary cells due to a processivity defect of the reverse transcriptase enzyme // Embo J.- 1996,- 15(15).- P. 4040-4049.

6. Balzarini J., Naesens L., Verbeken E., et al., Preclinical studies on thiocarboxanilide UC-781 as a virucidal agent//Aids.- 1998.- 12(10).-P. 1129-1138.

7. Barnard J., Borkow G., Parniak M.A., The thiocarboxanilide nonnucleoside UC781 is a tight-binding inhibitor of HIV-1 reverse transcriptase // Biochemistry.- 1997.- 36(25).- P. 7786-7792.

8. Barre-Sinoussi F., Chermann J.C., Rey F., et al., Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS) // Science.-1983.- 220(4599).-P. 868-871.

9. Belmonte L., Bare P., de Bracco M.M., Ruibal-Ares B.H., Reservoirs of HIV replication after successful combined antiretroviral treatment // Curr Med Chem.- 2003.- 10(4).- P. 303-312.

10. Berkhout В., Verhoef К., Marzio G., et al., Conditional virus replication as an approach to a safe live attenuated human immunodeficiency virus vaccine // J Neurovirol.- 2002.- 8 Suppl2.-P. 134-137.

11. Blankson J.N., Persaud D., Siliciano R.F., The challenge of viral reservoirs in HIV-1 infection // Annu Rev Med.- 2002,- 53,- P. 557-593.

12. Bleul C.C., Wu L., Hoxie J.A., et al., The HIV eoreceptors CXCR4 and CCR5 are differentially expressed and regulated on human T lymphocytes // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1997,- 94(5).- P. 1925-1930.

13. Borrow P., Lewicki H., Hahn B.H., et al., Vims-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection//J Virol.- 1994.- 68(9).- P. 6103-6110.

14. Boucher C.A., O'Sullivan E., Mulder J.W., et al., Ordered appearance of zidovudine resistance mutations during treatment of 18 human immunodeficiency virus-positive subjects // J Infect Dis.- 1992,- 165(1).- P. 105-110.

15. Boyer P.L., Sarafianos S.G., Arnold E., Hughes S.H., Selective excision of AZTMP by drug-resistant human immunodeficiency virus reverse transcriptase // J Virol.- 2001.-75(10).-P. 4832-4842.

16. Boyer P.L., Sarafianos S.G., Arnold E., Hughes S.H., The Ml 84V mutation reduces the selective excision of zidovudine 5'-monophosphate (AZTMP) by the reverse transcriptase of human immunodeficiency virus type 1 // J Virol.- 2002.- 76(7).- P. 3248-3256.

17. Boyer P.L., Sarafianos S.G., Arnold E., Hughes S.H., Nucleoside analog resistance caused by insertions in the fingers of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase involves ATP-mediated excision // J Virol.- 2002.- 76(18).- P. 9143-9151.

18. Bukrinsky M.I., Stanwick T.L., Dempsey M.P., Stevenson M., Quiescent T lymphocytes as an inducible virus reservoir in HIV-1 infection // Science.- 1991,- 254(5030).- P. 423427.

19. Burstein M.E., Serbin A.V., Khakhulina T.V., et al., Inhibition of HIV-1 replication by newly developed adamantane-containing polyanionic agents // Antiviral Res.- 1999.-41(3).-P. 135-144.

20. Carr A., Cooper D.A., Adverse effects of antiretroviral therapy // Lancet.- 2000.-356(9239).-P. 1423-1430.

21. Carr A., Workman C., Smith D.E., et al., Abacavir substitution for nucleoside analogs in patients with HIV lipoatrophy: a randomized trial // Jama.- 2002.- 288(2).- P. 207-215.33