Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и изучение препаратов, активных в отношении вируса иммунодефицита человека, на модели изопятов ВИЧ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калнина, Людмила Борисовна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ ИМЕНИ Д. И. ИВАНОВСКОГО

КАЛНИНА ЛЮДМИЛА БОРИСОВНА

ПОИСКИ ИЗУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ, АКТИВНЫХ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА, НА

МОДЕЛИ ИЗОЛЯТОВ ВИЧ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность — 03.00.06 — вирусология

Научный руководитель доктор медицинских наук Д.Н.Носик

МОСКВА - 1999 г

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение 3

Часть 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

Глава 1. Проблема СПИДа и распространение вируса

иммунодефицита человека 7

Глава 2. Источники инфекции и пути передачи СПИДа 8

Глава 3. Структура и особенности вируса

иммунодефицита человека 9

Глава 4. Патогенез ВИЧ —инфекции 14

4.1. Нормальный иммунитет 14

4.2. Иммунитет при ВИЧ —инфекции 15

4.3. Другие потенциальные механизмы 17

Глава 5 Проблема профилактики и терапии ВИЧ —

инфекции 19 5.1 .Профилактика ВИЧ —инфекции и меры

безопасности 19

5.2. Клиника ВИЧ — инфекции 21

5.3. Терапия ВИЧ — инфекции и СПИДа 23

5.4. Возможные перспективы создания новых препаратов для химиотерапии и профилактики СПИДа. 33

Часть 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35

Глава 1. Материалы и методы 35

Глава 2. Выделение изолятов ВИЧ 44

2.1. Исследование действия различных факторов клеточного роста на жизнеспособность лимфоцитов. 44

2.2. Исследование влияния антиинтерферо— новых антител и низкомолекулярных соединений на эффективность выделения ВИЧ 45

2.3. Исследование эффективности выделения

ВИЧ в зависимости от стадии ВИЧ —инфекции 46

Глава 3. Изучение свойств изолятов ВИЧ 46

3.1. Анализ динамики накопления антигенов

ВИЧ в культурах лимфоцитов периферической крови 47

3.2. Исследование тропности изолятов ВИЧ к

клеточным линиям. 48

3.3. Изучение характера цитопатического

действия изолятов ВИЧ 53

3.3.1. Исследование цитопатического эффекта

в культурах лимфоцитов периферической крови 53

3.3.2. Изучение характера цитопатогенных

эффектов изолятов ВИЧ в культурах клеток 53

3.4. Исследование инфекционной активности

изолятов ВИЧ 55

3.5. Морфологический анализ культур клеток,

инфицированных ВИЧ 55

3.6. Анализ субтипов изолятов ВИЧ 56

3.7. Изменение свойств изолятов ВИЧ в

динамике инфекции 57

3.8. Характеристика выделенной популяции

вирусов 58

Глава 4. Изучение чувствительности изолятов ВИЧ

к препаратам различных классов 59

4.2. Исследование активности дезинфектантов 60

4.3.Ингибиторы АДФ — рибозилирования как

противовирусные средства. 63

Глава 5. Изучение противовирусной активности

лекарственных средств, полученных на основе

металлокомплексов с природной ДНК. 65

5.1. Исследование противовирусных свойств

металлокомплексов с ДНК. 65

5.1.1. Анализ противовирусных свойств

металлокомплексов с ДНК и солей металлов. 65

5.1.2. Анализ противовирусных свойств

металлокомплекса АВК 68

5.1.3. Анализ противовирусных свойств

препарата АВК в отношении различных штаммов

ВИЧ-1 69

5.2. Исследование анти—ВИЧ активности

клеточного фактора, индуцируемого АВК. 69

5.2.1. Индукция выработки клетками клеточного

фактора(ов) 69

5.2.1.1. Исследование этапов (схемы) наработки

клеточного фактора(ов) 70

5.2.1.2. Исследование кратности использования культур клеток при индукции клеточного фактора(ов) 73

5.2.2. Исследование противовирусной активности клеточного фактора(ов) в отношении ВИЧ 73

5.2.2.1. Исследование защитного действия АУР, полученного на разных типах клеток человека 73

5.2.2.2. Исследование вирулицидного действия активности клеточного фактора(ов) в отношении ВИЧ 73

5.2.2.3. Исследование (схемы) появления противовирусной резистентности в клетках 73

5.2.2.4. Исследование противовирусного действия различных концентраций клеточного фактора(ов) 73

5.2.2.5. Исследование свойств клеточного фактора(ов) 74

5.2.2.5.1 Исследование активности интерферона 74

5.2.2.5.2. Исследование свойств клеточного фактора(ов) с помощью ферментативного анализа 74

5.2.2.5.3. Исследование противовирусных свойств фактора(ов), оказавшихся в различных фракциях культуральной жидкости в результате высаливания

ее сульфатом аммония 74

5.2.2.5.4. Исследование свойств клеточного фактора(ов) с помощью анализа на мембранных

фильтрах 77

5.2.2.6. Исследование синтеза мРНК различных

цитокинов в клетках, подвергшихся действию АВК 77

ОБСУЖДЕНИЕ. РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 79

ВЫВОДЫ 93

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

94

Введение.

Актуальность проблемы

Проблема СПИДа является одной из актуальнейших проблем, стоящих перед медициной и человечеством на пороге XXI века. Впервые синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД, AIDS) описан у гомосексуалистов в США в 1981 году. Два года спустя L.Montagnier и соавторы идентифицировали возбудитель СПИДа — ретровирус человека, первоначально названный LAV (Lymphoadenopathy— associated virus). Сейчас он известен как вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ—1)(47, 108, 109, 136).

С тех пор десятки миллионов человек стали жертвами этого заболевания, которое быстро приобрело характер пандемии и поставило перед человечеством вопрос о дальнейшем выживании. Количество ВИЧ — инфицированных людей к 2000 году, по данным ВОЗ, превысит 40 миллионов человек (26). Эти цифры, однако, достаточно приблизительно отражают реальную картину пандемии СПИДа в мире, так как во многих странах нет никакой возможности регистрировать всех заболевших и

инфицированных.

Начиная с 1985 года в СССР стали обнаруживать иностранных граждан, инфицированных вирусом

иммунодефицита человека, а в апреле 1987 года был выявлен первый в Советском Союзе больной СПИДом (29). За прошедшие годы число зараженных существенно возросло , и в настоящее время около 40000 жителей России живут с вирусом ВИЧ. С появлением ВИЧ — инфицированных лиц и больных СПИДом возникла необходимость выделения и изучения штаммов ВИЧ, циркулирующих на территории страны. Получение и исследование изолятов вирусов требуется как для решения фундаментальных, так и прикладных задач.

Вопрос о лечении СПИДа стоит также весьма остро. Из всех широкомасштабно испытанных к настоящему времени лечебных препаратов эффективным у больных оказался практически только азидотимидин (АЗТ) и несколько других аналогов нуклеозидов. Однако АЗТ очень токсичен, и время его применения ограничено несколькими месяцами.

Применение ингибиторов протеаз дало новую надежду на успех в лечении СПИДа, однако, совершенно очевидно, что эти препараты в ближайшие годы будут совершенно недоступны подавляющему большинству населения планеты из — за своей цены. Поэтому актуален поиск новых противовирусных средств, эффективных в отношении различных изолятов ВИЧ, менее

токсичных и с альтернативным механизмом действия. Требует своего изучения также проблема сочетанного применения различных противовирусных препаратов, что позволило бы обеспечить комплексное воздействие на различные этапы репродукции ВИЧ и снизить общую токсичность препаратов.

Настоящая работа выполнена в плане научно — исследовательских разработок Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН и является частью заданий, выполненных в рамках государственной научно —технической программы "Борьба с наиболее распространенными болезнями" по проблеме СПИД( темы N 16, 116, 365).

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования был поиск и изучение препаратов, активных в отношении вирусов иммунодефицита человека, на модели изолятов ВИЧ, выделенных на территории Российской Федерации.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

провести выделение изолятов вируса иммунодефицита человека от ВИЧ—инфицированных лиц и больных СПИДом;

исследовать биологические свойства выделенных изолятов ВИЧ;

изучить вирулицидную и противовирусную активность ряда препаратов в отношении изолятов ВИЧ.

Научная новизна работы

При выполнении настоящей работы был получен ряд новых данных, имеющих как теоретическое, так и практическое значение.

Проведено массовое выделение отечественных изолятов ВИЧ от ВИЧ—инфицированных лиц и больных СПИДом из различных регионов Российской Федерации и СССР.

Показана выраженная гетерогенность изолятов ВИЧ, циркулирующих на территории страны. Обнаружено, что для изолятов ВИЧ характерны индивидуальные биологические особенности, а также генетическое разнообразие.

При выделении изолятов ВИЧ от одного и того же пациента в динамике инфекционного процесса обнаружена закономерность возрастания инфекционной активности вирусов при повторной изоляции.

Показано, что устойчивость клеток к воздействию ВИЧ повышается при обработке их специфическими ингибиторами АДФ — рибозилирования.

Впервые показано, что отечественный иммуномодулятор АВК обладает выраженным противовирусным действием в отношении вируса иммунодефицита человека.

Впервые обнаружена способность металлокомплекса с ДНК индуцировать биосинтез в клетках цитокина, обладающего анти — ВИЧ активностью.

Практическая ценность работы

По материалам диссертационной работы получено авторское свидетельство на изобретение:

Калнина Л.Б., Клещинова Е.А., Корнеева М.Н., Носик Д.Н. и др. Штамм вируса иммунодефицита человека ВИЧ— 1иВ17г используемый для приготовления диагностических препаратов // Авторское свидетельство N 1768637. Приоритет от 04.12.1990 г.

Подготовлены: "Каталог перевиваемых клеточных линий, чувствительных к инфицированию вирусами иммунодефицита человека." (Д.Н.Носик, М.Н.Корнеева, А.А.Кущ, Л.В.Урываев, Б.В.Гущин, Р.В.Свирска, И.А.Киселева, Н.В.Кузнецова, ЛА.Глухова, Л.Б.Калнина, Е.В.Зорин, В.М.Стаханова, Л.Л.Фадеева, С.М.Клименко). Утвержден Ученым Советом Института вирусологии им. Д.И.Ивановского 20.11.1989.

"Методические рекомендации по выделению вирусов иммунодефицита человека от ВИЧ—инфицированных лиц и больных СПИД." (Д.Н.Носик, Л.Б.Калнина, А.Ю.Злобин, Н.В.Кузнецова, И.А.Киселева, М.С.Петрова, Е.А.Гущина, В.В.Покровский, Е.А.Клещинова, М.С.Бочкова). Утверждены Ученым Советом Института вирусологии им. Д.И.Ивановского 17.06.1991, апробированы и используются в Институте микробиологии им. А.Кирхенштейна АН Латвии, в Республиканском Центре особоопасных вирусных инфекций Грузии.

Показано, что дезинфектанты Велтолен, Клорклин, Соларсепт, Бромосепт обладают вирулицидным эффетом в отношении вируса иммунодефицита человека и могут быть использованы для дезинфекционных целей в медицинской практике.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Проведено массовое выделение (223) отечественных изолятов ВИЧ и сформирована коллекция штаммов, которая может быть использована для проведения исследований по изучению природы ВИЧ и поиску анти — ВИЧ препаратов.

2. Установлено, что на территории страны циркулирует гетерогенная популяция ВИЧ, различающаяся по своим биологическим и генетическим свойствам. С прогрессированием болезни в большинстве случаев увеличивается инфекционная активность вируса.

3. Показано, что иммуномодулятор (металлокомплекс с природной ДНК) АВК обладает выраженным противовирусным действием в отношении ВИЧ.

4. Обнаружена способность металлокомплекса АВК индуцировать в клетках человека биосинтез цитокина, обладающего анти—ВИЧ активностью.

Апробация работы

Основные экспериментальные материалы и положения диссертации были доложены и обсуждены на I международном симпозиуме "СПИД" (Берлин, 1988), на V,VI,VII международной конференции "Проблемы СПИДа" (Монреаль, 1989; Сан-Франциско, 1990; Флоренция, 1991, Амстердам, 1992), на советско — австралийском симпозиуме по проблемам "Профилактики и лечения СПИДа" (Москва, 1990), на ЬХП сессии общего собрания Академии медицинских наук СССР (Москва, 1991), Юбилейной научно — практической конференции, посвященной 70 —ю Института Пастера (С.Петербург, 1993), на 3-й Международной конференции по проблемам СПИДа стран Юго —Восточной Азии и Тихоокеанского региона (Чиангмай, 1995), XIV Международном симпозиуме по медицинской химии (Маастрихт, 1996), Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство", (Москва, 1997).

Диссертация апробирована 27 апреля 1999 г. на заседании Экспертного Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ при Институте вирусологии им.ДИ.Ивановского РАМН.

Публикация результатов исследования

Основные положения диссертации отражены в 20 научных работах и авторском свидетельстве на изобретение.

Работа выполнена в плане исследований Института вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН (директор Института — академик РАМН Д.К.Львов) на базе лаборатории вирусов иммунодефицита. Некоторые разделы исследований были выполнены в соавторстве с сотрудниками Института вирусологии проф.Н.Н.Носиком, М.Н.Корнеевой, И.А.Киселевой,

Н.В.Кузнецовой,проф. Л.В.Урываевым, проф. А.А.Кущ, А.Ф.Бобковым, Л.А.Глуховойг Е.А.Гущиной, Б.В.Гущиным, которым выражаю глубокую благодарность. Отдельные фрагменты работы выполнены совместно с сотрудниками Российского Центра СПИДа (руководитель проф.В.В.Покровский), М.С.Бочковой, А.Кравченко; Военно — медицинской Академии (С.Петербург) И.И. Красильниковым, Медицинского Университета Иватэ (Япония) проф.Ш.Сато, которым выражаю искреннюю признательность.

Часть 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Проблема СПИДа и распространение вируса иммунодефицита человека

По данным Объединенной программы ООН по ВИЧ/СПИДу (ЮНЭЙДС), каждую минуту 5 человек в возрасте между 10 и 24 годами заражаются ВИЧ. Это впечатляющие цифры. По приблизительным подсчетам, более 30 миллионов человек в мире живут с вирусом иммунодефицита. В 2020 году в результате распространения ВИЧ будет более 40 миллионов сирот в возрасте до 15 лет в 23 странах. Большинство этих детей осиротеют из —за потери родителей, умерших от СПИДа (26).

Первые сведения о СПИДе поступили из США в начале 80—х годов, и вскоре стало ясно, что это одна из актуальнейших проблем всего человечества конца 20 века (22, 27, 54, 158, 159). Десятки миллионов человек уже стали жертвами этого заболевания. Процесс быстро приобрел характер пандемии и поставил перед человечеством вопрос о дальнейшем выживании.

До середины 90—х годов казалось, что эпидемия ВИЧ обошла стороной большинство стран Восточной Европы. Проведение массовых анализов крови среди населения из групп риска показывали крайне низкий уровень распространения ВИЧ — инфекции влоть до 1994 года. В Западной Европе на тот момент количество случаев заболевания превышало эти показатели в 15 раз, а в африканских странах, расположенных к югу от пустыни Сахара, количество людей, живущих с вирусом ВИЧ, было в 400 раз выше.

За последние несколько лет в бывших странах социализма Восточной Европы и Центральной Азии количество инфицированных возросло почти в 6 раз. Последние данные по региону свидетельствуют о том, что около 190 ООО детей и взрослых живут с вирусом ВИЧ, что является показателем значительно возросшего уровня распространения инфекции по сравнению с концом 1997 года (26).

Первый ВИЧ—инфицированный гражданин СССР был выявлен весной 1988 г.(29) К началу 1994г. было зарегистрировано 717 ВИЧ—инфицированных лиц. Затем количество зараженных стало заметно увеличиваться. Уже за 8 мес. 1997 года в СНГ было зарегистрировано 8985 ВИЧ—инфицированных, за весь 1996 год — 1500, а за предыдущие 9 лет — 1062 человека. В настоящее время более 40 000 жителей России живут с вирусом ВИЧ. Сложившаяся модель эпидемической ситуации изменилась в результате резкого увеличения количества лиц, практикующих инъекционное употребление наркотиков. Четверо из пяти вновь заразившихся ВИЧ в России являются наркоманами.

Глава 2. Источники инфекции и пути передачи СПИДа.

Источником инфекции являются вирусоносители или больные СПИДом. Наиболее высоки концентрации ВИЧ в сыворотке крови и тканевых жидкостях инфицированных людей, затем — в сперме, влагалищном выделяемом, слюне, слезах, грудном молоке, цереброспинальной жидкости. Пока нет подтверждений инфицирования СПИДом бытовым путем или через кровососущих насекомых. ВИЧ может быть внесен в организм с зараженной кровью или с препаратами, содержащими ее компоненты, при использовании загрязненного кровью инструментария (халатность медперсонала или использование общих нестерильных шприцов наркоманами). Передается СПИД и от матери к ребенку трансплацентарно и через родовые пути.

Определены три основные пути передачи ВИЧ — инфекции:

а) парентеральный, б) при сексуальном контакте — влагалищном или анальном, в) перинатально от матери ребенку во время беременности или родов.

ВИЧ более агрессивен при рН 7 — 8. Имеет тенденцию накапливаться в гнойно — воспалительных очагах половых органов, что является обычным осложнением СПИДа (9, 90). У детей СПИД протекает более злокачественно, что связано с незрелостью их иммунной системы, а также, возможно, с наличием в эпидермисе детей повышенного числа дендритных макрофагов — клеток Лангерганса (КЛ). КЛ, возможно, обеспечивают перемещение ВИЧ

непосредственно от одной КЛ к другой по отросткам и межклеточным контактам. У пожилых людей количество КЛ резко снижено и