Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Серологические свойства V3-петли GP 120 вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории бывшего СССР

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щелканов, Михаил Юрьевич, Москва

* / ]> / ' } ^ /Г*

л У , *>' "х У,% < ....."

г кУ <у с.-" .. ' ( " «У ■

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д.И. ИВАНОВСКОГО

Щелканов Михаил Юрьевич

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УЗ-ПЕТЛИ вР 120 ВАРИАНТОВ ВИЧ-1, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ БЫВШЕГО СССР

Специальность 03.00.03 — "Молекулярная биология" 03.00.28 — "Биоинформатика"

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: с.н.с. Э.В. Карамов с.н.с., к.б.н. Н.Г. Ярославцева

Москва — 1999

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген;

AT - антитело;

ББ - блокирующий буфер;

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека;

ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека первого типа;

ВИЧ-2 - вирус иммунодефицита человека второго типа;

Д.б.н. - доктор биологических наук;

Д.м.н. - доктор медицинских наук;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

Д.ф.-м.н. - доктор физико-математических наук;

Д.х.н. - доктор химических наук;

ИР - иммунореактивность;

ИФА - иммуноферментный анализ;

КББ - карбонат-бикарбонатный буферный раствор;

К.б.н. - кандидат биологических наук;

КНЦ - Кардиологический Научный Центр;

К.м.н. - кандидат медицинских наук;

К.ф.-м.н. - кандидат физико-математических наук;

К.х.н. - кандидат химических наук;

МАТ - моноклональные антитела;

МГК - метод главных компонент;

МЗ - Министерство Здравоохранения;

НИИ - научно-исследовательский институт;

НИИВ РАМН - НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН;

ОФД - орто-фенилендиамин;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РАМН - Российская Академия Медицинских Наук;

РАН - Российская Академия Наук;

РБ - Республика Беларусь;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

РФ - Российская Федерация;

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита;

СПИР - спектр иммунореактивности;

ФСБ - фосфатно-солевой буферный раствор;

ФСБТ - фосфатно-солевой буферный раствор с Твин-20;

ЗТС - тритиоцитидин, ламивудин;

AZT - азидотимидин, зидовудин, ретровир;

IS - индекс специфичности (от англ. - Index of Specificity);

SI - синцитиеобразующий;

SIV - вирус иммунодефицита обезьян;

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ..................................................................................... 1

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ЭПИДЕМИОЛОГИИ ВИЧ.

§1.1.1. ВИЧ как этиологический агент СПИДа ........................................ 4

§ 1.1.2. Морфология вириона ВИЧ ................................................................ 6

§1.1.3. Структура генома ВИЧ .................................................................... 7

§ 1.1.4. Классификация ВИЧ ...................................................................... 13

ГЛАВА 1.2. ИММУНОХИМИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К КЛАССИФИКАЦИИ ВИЧ.

§ 1.2.1. Молекулярные основы гуморального иммунитета ..................................................................16

§ 1.2.2. Общая схема реализации иммунохимических подходов к классификации

вирусов ................................................................................................................................................................................................26

§ 1.2.3. Экспериментальные методы оценки ИР ............................................................................................30

§ 1.2.4. Предварительная обработка экспериментальных данных ..................................................36

§ 1.2.5. Меры дистантности СПИР ..............................................................................................................................39

§ 1.2.6. Визуализация взаимных расположений СПИР в многомерном признаковом

пространстве ..................................................................................................................................................................................43

§ 1.2.7. Методы классификации СПИР ..................................................................................................................48

§ 1.2.8. Оценка качества классификации ..............................................................................................................53

§ 1.2.9. Анализ соответствий ............................................................................................................................................55

§ 1.2.10. Типирование ВИЧ-1 посредством иммунохимических методов ..............................58

ЧАСТЬ И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

§ II. 1. Сыворотки и ВИЧ-инфицированные пациенты ...................................... 68

§ II.2. Коммерческие тест-системы ............................................................ 68

§ II.3. Синтетические пептиды .................................................................... 68

§ II.4. Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) на основе синтетических

пептидов ............................................................................................... 73

§11.5. Конкурентный ИФА на основе синтетических пептидов .......................... 76

§ II.6. Обработка результатов ИФА ............................................................. 76

§ II.7. Выделение и секвенирование нуклеиновых кислот ................................ 77

§ II.8. Оборудование ................................................................................ 77

ЧАСТЬ III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА III. 1.СЕРОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ВАРИАНТОВ ВИЧ-1, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ БЫВШЕГО СССР ДО 1995 Г.. § III. 1.1. Серотипирование ВИЧ-позитивных сывороток с территории

Белоруссии ........................................................................................... 78

§ III. 1.2. Анализ соответствий между гено- и серотипом ................................. 102

§ III. 1.3. Влияние точечных аминокислотных замен на кросс-реактивность между

различными субтипами ВИЧ-1 ................................................................. 116

§ III.2.1. Серотипирование вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на юге/юго-востоке

Украины ............................................................................................. 124

§ III.2.2. Серотипирование вариантов ВИЧ-1 из светлогорского очага эпидемии в

Гомельской области Беларуси .................................................................. 132

§ III.2.3. Взаимосвязь между генотипом и серотипом для сывороток из Светлогорского

очага эпидемии ..................................................................................... 146

§ III.2.4. Серотипический профиль эпидемии ВИЧ-1 в Москве ......................... 155

§ III.2.5. Серотипирование вариантов ВИЧ-1, циркулирующих среди ВИЧ-1-инфицированных внутривенных наркоманов в Твери ..................................... 162

ГЛАВА III.4. НЕКОТОРЫЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ АНАЛИЗА МНОГОМЕРНЫХ ДАННЫХ, ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ СЕРОТИПИРОВАНИИ ВИЧ-1-ПОЗИТИВНЫХ СЫВОРОТОК В ИФА НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ.

§ III.4.1. Определение дистантности СПИР, минимизирующих экспериментальную погрешность ........................................................................................ 185

§ Ш.4.2. Применение метода главных компонент для анализа эффективности панелей эпитоп-имитирующих пептидов при серотипировании ВИЧ ........................... 190

ВЫВОДЫ ...................................................................................... 200

СПИСОК НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ .................. 201

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ..................................................... 205

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). В настоящее время, распространение ВИЧ имеет характер пандемии и охватывает все страны мира. По данным 1ЛМАШ8, к началу 1998 г. в мире насчитывалось 30.6 млн. ВИЧ-инфицированных, и 11.7 млн. человек умерли от СПИДа. В 1997 г. было выявлено 5.8 млн. новых случаев ВИЧ-инфекции, из которых 90 % приходятся на развивающиеся страны, включая Россию и другие государства на территории бывшего СССР.

Вплоть до 1995 г. на территории бывшего СССР наблюдался низкий уровень распространения ВИЧ-инфекции. Однако уже тогда специалисты отмечали высокое разнообразие вариантов ВИЧ, что свидетельствовало о наличии, во-первых, ранней стадии инфекции в этом регионе, а во-вторых, - наличии множественных независимых проникновений вируса. Последнее вселяло особые опасения, так как после распада СССР и падения «железного занавеса» на фоне резкого ухудшения социально-экономической обстановки, снижались возможности государства контролировать и корректировать эпидемиологические процессы. И действительно, в то время, как скорость увеличения количества ВИЧ-инфицированных в США и Западной Европе, начиная с 1995 г., снижается, на Украине (с лета 1995 г.), в Беларуси (с лета 1996 г.) и в России (с 1997 г.) - напротив - наблюдается взрывообразное разрастание эпидемии. Отличительной чертой последнего времени является стремительный рост числа новых случаев ВИЧ-инфекции среди внутривенных наркоманов бывшего СССР. Сказанное иллюстрируют приведенные ниже диаграммы. Учитывая прозрачность государственных границ; определенную социально-культурную общность народов, проживающих на территории бывшего СССР; активизацию деятельности наркомафии как внутри бывшего СССР, так и на сопредельных территориях вкупе с ослаблением государственных структур, можно прогнозировать сходную динамику эпидемиологического процесса во всем регионе. Поэтому исследования (включая данную работу), направленные на воссоздание молекулярного портрета эпидемии, чрезвычайно актуальны, так как позволяют предсказать направление развития эпидемического процесса, а также разработать подходы к созданию отечественных вакцин и экспертной оценке применимости их зарубежных аналогов.

Количество новых случаев ВИЧ-инфекции, выявляемых ежегодно в РФ, 1987-1997

1 500

- ■ 1000; "

500 I

Распределение числа случаев ВИЧ-инфекции в зависимости от пути заражения. РФ, 1987-1997

Ш7-ТЭ95

Переливание крови От мете р и ребенку Нозокомиальный Гетерос ексу ал ь н ы й Гомосексуальный

Внутривенное введение наркотиков

Другой/неизвестен

■ У

НВПМПНм

500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Количество

Щ^в* — 11М & 1;¥>С РМСтЬИ* С.,* ........Дп

ИтигМ Ж'! ^ НсЗГГ

Цель работы. Целью данной работы является, во-первых, изучение антигенного разнообразия ВИЧ-1 на популяционном и организменном уровне; во-вторых, установление взаимосвязи между структурой различных вариантов верхушечного эгштопа УЗ-петли 20 ВИЧ-1 и характером взаимодействия с ними ВИЧ-позитивных сывороток; в-третьих, адаптация методов многомерного анализа данных к результатам иммунохимических исследований.

Научная новизна работы. Показано, что среди внутривенных наркоманов на территории бывшего СССР циркулируют варианты ВИЧ-1 генотипа А серотипа А/С. Предложена модель функционирования верхушечного эпитопа УЗ-петли gpl20 в составе комплекса с антителами. Верифицирован ряд статистических методов -многомерное шкалирование, метод главных компонент и иерархический кластер-анализ - для их применения к иммунохимическим данным.

Научно-практическое значение работы. Так как в последние два-три года на территории бывшего СССР наибольший прирост новых случаев ВИЧ-инфекции имеет место среди внутривенных наркоманов, то исследование молекулярно-эпидемиологических характеристик вариантов ВИЧ, циркулирующих среди этой группы риска представляет несомненный практический интерес в контексте анализа подходов к разработке отечественных диагностических тест-систем на основе синтетических пептидов и анти-ВИЧ вакцин. Предложенная модель взаимодействия верхушечного эпитопа ВИЧ-1 с антителами позволяет предсказывать взаимосвязи между молекулярной структурой УЗ-имитирующих антигенов и их серологическими свойствами, что имеет ценность для разработки анти-ВИЧ вакцины и диагностических тест-систем.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 256 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц, 44 рисунков, и состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы» (часть I), «Материалы и методы» (часть II), «Собственные результаты» (часть III), «Выводы». Параграфы нумеруются в соответствие со следующим форматом: <Номер части (римская цифра)>.< Номер главы (арабская цифра) >.<Номер параграфа (арабская цифра)>. В каждом параграфе используется собственная нумерация формул: <Номер параграфах<Порядковый номер формулы>. Нумерация таблиц и рисунков - сквозное на протяжении каждой главы. Библиографический список включает 352 наименование.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1.1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ЭПИДЕМИОЛОГИИ ВИЧ.

§ 1.1.1. ВИЧ как этиологический агент СПИДа.

Первые случаи заболевания, названного впоследствии СПИДом (Синдром Приобретенного Иммунодефицита; в английском варианте - Acquired Immune Deficiency Syndrome - AIDS), были описаны в 1981 г. в США. У молодых мужчин-гомосексуалистов была выявлена саркома Капоши - редкая форма патологии, характерная лишь для лиц пожилого возраста. Некоторые из новых пациентов, к тому же, страдали тяжелой формой пневмонии, вызванной условно-патогенным микроорганизмом Pneumocystis carinii, не имея при этом в анамнезе диагноза врожденного или вторичного иммунодефицита [Gottlieb M.S., 1981; Masur Н., 1981]. Появление этого заболевания у многих молодых людей, ведущих сходный образ жизни, привело врачей и ученых к мысли, что СПИД развивается в результате действия на организм каких-либо факторов, связанных с гомосексуализмом. Однако дальнейшее развитие событий показало, что СПИД развивается не только у мужчин, имеющих гомосексуальные контакты, но и у женщин и детей. Появление СПИДа у таких групп населения, как внутривенные наркоманы, больные гемофилией, получающие массированны переливания крови и ее продуктов, проститутки, а также факты, когда у болевших СПИДом родителей рождался и заболевал СПИДом ребенок, дали основания полагать, что СПИД обуславливается неким инфекционным (вероятно, вирусным), агентом. Интенсивный поиск этиологического агента СПИДа привел к тому, что в 1983-1984 гг. в лаборатории Люка Монтанье (Франция) и - независимо -Роберта Галло (США) и Джея Леви (США) были изолированы ретровирусы человека, ассоциированные со СПИДом. Первоначальные названия этого вируса были: Lymphoadenopathy-Associated Virus (LAV; [Barre-Sinussi F., 1983]), Human T-Lymphotropic Virus type III (HTLV-III; [Gallo R.C., 1983]) и AIDS-Related Virus (ARV; [Levy J.A., 1984, 1993]). Проведенный позднее анализ нуклеотидпых последовательностей вирусов, изолированных тремя исследовательскими группами,

показал, что все они являются штаммами одного вируса. Имевшая место непродолжительная терминологическая дискуссия (см. подробности в [Gallo R.C., 1988] была прекращена в 1986 г. на II Международной Конференции по проблеме СПИДа, где было решено назвать возбудителя СПИДа его сегодняшним «именем» - вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).

В 1986 г. появилось сообщение [Clavel F., 1986] об изоляции от двух пациентов из Западной Африки нового ретровируса, ассоциированного со СПИДом: на основании клинических симптомов у обоих больных был диагностирован СПИД, однако тестирование их сывороток на антитела к ВИЧ-1 в иммуноферментном анализе дало отрицательный результат, а в иммуноблоте - сомнительный. Авторами было показано, что новый вирус родственен ВИЧ-1, и он был назван ВИЧ-2. В настоящее время большинство случаев ВИЧ-2-инфекции приходится на районы Западной Африки, однако они зафиксированы и в других странах. Так, например, первые случаи ВИЧ-2-инфекции в Советском Союзе были описаны Покровским с соавт. в 1988 г. [Покровский В.В., 1988] (а дифференциальные диагностикумы разработаны Карамовым Э.В. и Лукашовым В.В. [Карамов Э.В., 1992; ЛукашовВ.В., 1992]). Дискуссии о патогенности ВИЧ-2 закончились признанием того факта, что вирус второго, также, как и первого типа, в конечном счете, обуславливает развитие СПИДа у инфицированного [Clavel F., 1987].

В настоящее время выявлены следующие пути трансмиссии ВИЧ [Хаитов P.M., 1992; Новохатский A.C., 1992]:

О половые (включая гомосексуальные) контакты;

О гемотрансфуция, переливание форменных элементов крови и пересасадка органов;

О вертикальный, т.е. от инфицированной матери - ребенку. В соответствие с этим, выделяют следующие группы риска ВИЧ:

♦ лица, ведущие беспорядочную половую жизнь (прежде всего, проститутки и наркоманы);

♦ наркоманы, вводящие наркотики внутривенно;

♦ лица, получающие множественные переливания крови или ее продуктов.

Справедливости ради, следует отметить, что предпринимаемые меры, как то:

ужесточение правил, регламентирующих проверку донорской крови, и изучение новых серотипов ВИЧ, контроль за обязательной стерилизацией медицинских инструментов

и широкое распространение их одноразовых аналогов (включая их бесплатное распространение среди представителей групп риска), привели к тому, что процент лиц, инфицированных при переливании крови и ее препаратов, имеет постоянную тенденцию к снижению [Новохатский A.C., 1992].

Проблема СПИД сегодня в той или иной степени затрагивает все страны мира. Широкому распространению СПИДа способствует сам характер этого заболевания с длительным (годы) инкубационным периодом, во время которого возможна передача вируса от инфицированного (часто и не подозревающего об этом) -здоровому человеку. Диагностировать ВИЧ-инфекцию на этой стадии, в подавляющем большинстве случаев, можно лишь с помощью лабораторных методов. Кроме того, следует отметить, что ВИЧ поражает наиболее активную часть населения репродуктивного возраста, создающую экономический фундамент любого государства. На фоне отсутствия эффективной терапии, становится понятно, почему ВИЧ-инфекция стоит как бы особняком в ряду других инфекционных заболеваний, привлекая к себе внимание не только специалистов в области биологии и медицины, но также специалистов в области права и государственных деятелей. К сожалению, пандемия СПИДа продолжает расширяться, и в немалой степени этому способствует тот факт, что направленные против нее меры не всегда адекватны создаваемой ею угрозе.

§ 1.1.2. Морфология вириона ВИЧ.

Электронно-микроскопические исследования показывают, что вирионы ВИЧ имеют форму округлых частиц д�