Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение особенностей репродукции ВИЧ-1 в перевиваемых линиях моноцитов/макрофагов в Т-лимфоцитов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение особенностей репродукции ВИЧ-1 в перевиваемых линиях моноцитов/макрофагов в Т-лимфоцитов"

• » О им

2 о ИЮН 199*

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ, НПО "ВЕКТОР"

На правах рукописи

МАМАЕВА Ольга Александровна

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РЕПРОДУКЦИИ ВИЧ-1 В ПЕРЕВИВАЕМЫХ ЛИНИЯХ МОНОЦИТОВ/МАКРОФАГОВ И Т-ЛИМФОЦИТОВ

03.00.06. - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 1994

Работа выполена В Научно-исследовательском- институт молекулярной биологии НПО "Вектор".

Научный руководитель: кандидат биологических'наук Покровский А.Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Загребельный СЛ

кандидат медицинских наук Беланов Е.Ф.

Ведущая организация: Институт вируоологии им. Д.И. Ивановско1 РАМН, Москва.

Защита состоится 1994г. на заседаш

Специализированного совета К.098.08.01 при Научно-исследовЕ тельском институте молекулярной биологии НПО "Вектор" по адрес} 633159 Кольцово . Новосибирской области, в кofiфepeнц-зaJ Института.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеь Научно-исследовательского института молекулярной биологии НГ "Вектор".

Автореферат разослан " 1994г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук / Т.Н. Шубина

ч?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интерес исследователей к изучению вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в ■ большой степени определяется тем, что к настоящему времени в мирз насчитывается более 10 миллионов лиц, инфицированная БИЧ, из них приблизительно у 200 тысяч имеются выраженные клинические проявления СПИД (Horton R, 1993). По прогнозам ВОЗ на ближайшее десятилетие число серополохительных и больных СПИД будет продолжать расти во всех странах мира (Chin J. et al, 1991), поскольку до настоящего времени не существует достаточно эффективных средств лечения этогб заболевания. Вопрос о создании вакцины также остается весьма проблематичным (Osterhaus A. et al, 1992, Ward R.H.R, 1991).

Поиск эффективных лекарственных препаратов, создание вакцины, требуют фундаментального изучения ВИЧ: особенностей репродукции вируса на уровне клетки и организма, изучения механизмов взаимодействия вируса и клетки. Одним из подходов к решению этих задач может служить• изучение особенностей размножения ВИЧ в культурах как первично-, так и хронически инфицированных клеток. Результаты таких исследований имеют также существенное значение и для разработки эффективных способов получения значительных количеств вирусных белков, необходимых для создания диагностических тест-систем.

Другим, не менее важным направлением, является поиск новых лекарственных препаратов, обладающих анти-ВИЧ активностью. Особенностью ВИЧ-инфекции является то, что не существует адекватных моделей инфекции на лабораторных животных (Letvln N.L, 1992) и поэтому первичный скрининг и подробное изучение механизмов действия перспективных препаратов возможно только на

культурах клеток. Одной из наиболее распространенных моделей скрининга противовирусных препаратов является оценка -их ингибирующэго действия на острую литическую инфекцию в перевиваемых культурах Т-лимфоцитов человека - МТ-4 и Н-9. Применение только этой модели ВИЧ-инфекции не позволяет исследовать ингибирунцее действие препаратов на хроническую инфекцию, протекающую в клетках макрофагального ряда. Изучение особенностей репродукции ВИЧ-1 в перевиваемых линиях, моноцитов/макрофагов может быть полезным при создании дополнительных моделей для скрининга противовирусных препаратов, способных обеспечить более адекватную оценку эффективности их действия.

У®:Оь_и_за!дачи__исследования. Целью настоящей работы было

исследование особенностей репродукции ВИЧ-1 в перевиваемых линиях клеток моноцитов/макрофагов и Т-лимфоцитов, сравнительный анализ анти-ВИЧ активности азидотимидина и ряда его производных на различных моделях ВИЧ-инфицированных клеток.

Научная новизна и практическая ценность работы. Получена уникальная хронически инфицированная ВИЧ-1 линия перевиваемых моноцитов человека ГКВ 4005, продуцирующая инфекционные вирусные частицы в течение длительного непрерывного культивирования (230 пассажей более трех лет) без подсева неинфицированных клеток. Разработан способ культивирования ВИЧ-1, заключающийся в сокультивировании клеток хронически инфицированной ВИЧ-1 линии моноцитов ГКВ 4005 и перевиваемой линии Т4-лимфоцитов, позволяющий получать антиген с полным набором вирусспецифических белков. Изучена противовирусная активность 5'-фосфонатов азидотимидина и фтортимидина с различными типами остатков модифицированного фосфата в культуре клеток МТ-4, инфицированной

ВИЧ-I. Показано, что исследованные соединения обладают значительно более низкой токсичностью для кеинфицированных клеток, чем AZtf. Установлено, что наиболее выраженным ингибирующим действием обладает 5'-карбоксифосфонат AZT, не описанный ранее. Показано, что азвдотимидин, фтортимидпн и 5'-метилфосфонат азидотимидина не проявляют выраженного ингибирующего действия на репродукцию . ВИЧ-1 как в первичной культуре нестимулированных" моноцитов периферической крови здорового донора, инфицированной ВИЧ-1, так и в культурах клеток, хронически инфицированных ВИЧ-1.

Объем и структура диссертации. Диссерацня состоит из: введения, обзора литературы (глава I), материалов и методов (глава 2), результатов и' обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (148 ссылок). Работа изложена на 104 страницах машинописного текста, включает 9 рисунков и II таблиц.

Апробация работы.. Материалы диссертации докладывались на конференции "Проблемы биотехнологии- иммунобиологических и гемотрансфузионных препаратов" (Новосибирск, 1988 г.), 1-ом Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), международной конференции "AIDS, Cancer and Human retroviruses" (С-Петербург, 1992). По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Работы по получению хронически инфицированной ВИЧ-1 'линии клеток ГНВ 4005 проводились совместно с сотрудниками лаборатории Карамова Э.В., Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва. Производные азидотимидина синтезированы в лаборатории Краевского A.A., Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автор выражает глубокую признательность Покровскому А.Г.,

Плясуновой O.A., Куляндину С.А., Киселеву H.H., Казариновой Ф.С., Черных А.И., ФедакН.В., Сенькиной В.П., Кузиной П.М., Сафоновой С.А., Замятиной Т.К., Власкиной В.В., Сшфиной С.В.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

__Получение___хронически___инфицированной___ВИЧ-1__линии

5§1Е01^аешх_моноуитдв_Ч8ЛОвека^ Линия клеток ГКВ 4005 была получена путем инфицирования перевиваемых моноцитов человека (линия U-937) изолятом ВИЧ-I, выделенным от больного лжфо аде нона тие й (Карамов Э.В. и др, 1986), клонирования и выделения клона клеток, хронически инфицированных ВИЧ-1, продуцирующих этот вирус. Проведено субклонирование полученной линии клеток. При этом были отобраны субклоны с более высокой вируспродукцией.

2. Культивирование клеток и методы оценки вируспродукции.

Перевиваемые линии клеток культивировали на питательной среде HPMI-1640 с добавлением 10-15% сыворотки плода коров, 0,06% L-глутамша, 160 мкг/мл гентамицина, 60 мкг/мл линкомицина или 100 мкг/мл канамицина в стационарном (в матрасиках или многолуночных планшетах, для культивирования клеток) или рОллерно-суспензионном (при частоте вращения роллерных бутылей I оборот/мин) режимах при соотношении жидкой и газовой фаз 1:5 и температуре 36-37°С.

Посевная концентрация клеток составляла: для клеток линии ГКВ 4005 и U-937 - (0,7-0,8)хЮ6 клеток/мл, для клеток линий МТ-4, Jurkat tat, CCRF-ОШ - 0,5хЮ6 клеток/мл, для хронически инфицированных линий H-9/HIY-Ijjj, и CEM/HIV-IBRU - 0,ЗхЮ6 клеток/мл. Долю жизнеспособных клеток определяли, подсчитывая клетки в камере Горяева после окрашивания 0,4%-ным раствором

трипанового синего. В конце каздого пассажа (на 4-6 сутки культивирования) рассчитывали индекс пролиферации клеток, который определяли как частное от деления концентрации клеток в конце пассажа на посевную концентрацию клеток. Уровень вируспродукции оценивали по наличию в культуральной жидкости Еирусного антигена, выявляемого иммуноферментным методом.

Инфекционный вирус в образцах инактие&ровали добавлением твин-80 до конечной концентрации 0,1% с последующей инкубацией при температуре (6±2)°С не менее 24 часов. Готовили последовательные двукратные разведения исследуе-дого вируссодержащего материала и вносили в лунки 96-луночного планшета с иммобилизованными человеческими анти-ВИЧ-I IgG или моноклональными антителами к р-24. После проведения реакции измеряли оптическую плотность (ОП) при длине- волны 492 км с помощью прибора "Мультискан". Для ' качественной оценки результатов использовали значение титра. За татр принимали последнее разведение пробы, значение ОП которого не менее чем в два раза превышало значение ОП отрицательного контроля. Для количественной оценки накопления р24 строили график зависимости ОП от концентрации для стандартного антигена.

Кроме того, уровень вируспродукции оценивали по активности обратной транскриптазы. За активность обратной транскриптазы принимали включение радиоактивной метки в импульсах на 'I мл культуральной жидкости (Lee et al, 1987).

3.Оценка цитотоксичности и анти-ВИЧ активности соединений. Цитотоксичность исследуемых соединений оценивали на культуре клеток МТ-4. Соединений растворяли в растворе Хенкса и их соответствующие разведения вносили в лунки 96-луночных планшетов (по три на кавдое разведение) при рассеве клеток. Клетки

культивировали как описано выше в течение 4 суток. По- окончании инкубации подсчитывали долю жизнеспособных клеток. Строили дозозависимую кривую и- определяли концентрацию соединений, вызывающую гибель 50% клеток - СБ50.

Для оценки анти-ВИЧ активности соединений культуру клеток МТ-4 или первичную культуру моноцитов человека инфицировали ВИЧ-1 Чштамм ГКВ 4005) с множественностью заражения 0,2-0,5 инфекционных единиц на клетку. После адсорбции вируса в течение одного часа при 37°С инфицированные клетки рассеивали в 96-луночные планшеты и вносили растворы исследуемых соединений (по три лунки' на каждое разведение). В случае монослойной культуры моноцитов, клетки после адсорбции вируса триады отмывали раствором Хенкса, затем вносили в лунки ростовую среду и исследуемые соединения. Для оценки анти-ВИЧ активности соединений в культурах хронически инфицированных ВИЧ-1 клеток Н-9/Н1У-1щ, и СЕМ/НГ7-1ВНу, эти Алетки рассеивали в 96-луночные

с

планшеты с посевной концентрацией 0,3x10 клеток/мл и вносили растворы исследуемых соединений. Клетки культивировали также как описано вше.

Ингибирующий эффект соединений оценивали на четвертые сутки культивирования по подавлению накопления вирусного антигена, активности обратной • транскриптазы, защите клеток от цитопатогенного действия вируса по сравнонию с контролем (инфицированные клетки, не обработанные, противовирусными соединениями).

Для рассчета ингибирунцего эффекта на накопление вирусного антигена (иммуноферментный метод) строили график зависимости ОП конрольной пробы вируса (без добавления анти-ВИЧ препарата) от 1оз2х (где х - обратная величина разведения контрольного

образца). Затем по значению ОП исследуемой пробы (с анти-ВИЧ препаратом) на графике находили соответствующее ей значение х'. Процент ингибирования вычисляли по формуле:

= 100% - х 100% ,-где

а - обратная величина выбранного рабочего разведения исследуемой пробы;

х' - обратная величина разведения исследуемой пробы (Плясунова O.A. и др, 1992).

Степень защиты клеток от цитопатогенного действия ВИЧ-1 определяли по формуле:

% защиты =-х 100, где

К - Б

А - число жизнеспособных меток при данной концентрации исследуемого соединения; Б - число жизнеспособных клеток в контрольной инфицированной культуре (без внесения соединения); К - число жизнеспособных клеток в контрольной нэинфвдированной культуре.

.Рассчитывали количественные характеристики ингибирования репродукции ВИЧ-I: ID50 - концентрацию соединения, на 50% подавляющую продукцию вируса; IS - индекс селективности ~ отношение токсичной дозы соединений CD5Q к его эффективной дозе

ID50-

При статистической-обработке результатов вычисляли среднее значение не менее трех экспериментов и стандартное отклонение. 4ЛИзучение___культуральных___свойств___и___особенностей

репродукции хронически .инфицированной линии клеток ГКВ 4005.

Первый этап изучения полученной линии клеток посвящен исследованию ее культуральных свойств и особенностей

- а -

вируспродукции. В таблице I представлены данные -о динамике пролиферации клеток, уровне вируспродукции по данным ИФА в течение одного пассажа в условиях роллерно-суспензйонного культивирования. Полученные данные позволили выбрать оптимальный интервал пассирования культуры для роллерного культивирования -6 суток.

Таблица I

Динамика роллерно-суспензйонного культивирования линии клеток ГКВ-4005

Время, Доля жизнеспособ- Индекс обратного

сут. ных клеток, % пролиферации титра антигена.

ВИЧ-1 в ИФА

I 62,4 4 14,7 1,2 4 0,5 5,8 ± 0,6

2 50,8 4 6,3 1,2 4 0,3 6,4 ±0,7

3 57,4 4 4,9 1,6 4 0,4 5,8 ± 0,6

4 50,8 4 11,3 1,4 4 0,4 6,2 ± 0,6

5 56,8 4 11,9 1,8 4 0,4 6,6 ± 0,7

6 65,2 12,7 2,3 4 0,8 6,8 ± 0,6

7 65,0 4 9,3 2,2 4 0,3 6,4 ± 0,7

8 46,2 16,6 1,5 4 0,5 1,1

II 34,0 . 4 14,2 1,8 4 0,8 6,0 ± 0,9

13 17,6 4 11,0 1,7 4 0,6 6,4 ± 0,7

Было проведено сравнение двух способов культивирования клеток линии ГКВ 4005: стационарного (в матрасах) и роллерно-суспензйонного. Показано, что цри длительном культивировании в роллерно-суспензионном режиме не происходит изменений морфологии клеток, способности к пролиферации и вируспродукции по сравнению со стационарным культивированием этой линии клеток.

Опыт длительного (более 200 пассажей) культивирования клеток линии ГКВ 4005 в роллерно-суспензионном режиме показал,

что клетки сохраняют типичную для зтой линии ■ морфологию и способность к пролиферации и вируспродукции (табл. 2). Уровень вируспродукции, определяемый по активности обратной

с

транскриптазы, также стабилен и составляет (5,76 ± 0,43)хЮ имп.мин/мл. Доля инфицированных клеток, выявляемых методом непрямой кммунофлюоресценции в течение культивирования, изменялась' незначительно: от 20% до 40%.

Таблица 2

Роллерно-суспензионное культивирование клеток ГКВ 4005

Номер Индекс Доля logg обратного

пассажа пролиферациш жизнеспособных титра антигена

клеток, % ВИЧ-1 в ИФА

31-35 2,8 + 1,0 65,6 6,3 не мэнее 4,0

36-40 2,3 + 0,4 74,0 ■+ 1,3 не менее 4,0

40-46 2,0 + 0,4 68,9 + 16,9 5,3 ± 0,8

46-50 2,0 0,4 69,0 + 7,3 5,0 ± 0,9

51-56 2,1 ± 0,3 74,0 + 6,3 6,3 ± 0,9

56-60 2,2 ± 0,4 70,6 + 9,5 5,5 ± 0,9

61-65 2,1 + 0,4 68,0 4,2 5,6 ± 0,8

66-70 1,9 0,2 70,2 ± 5,2 5,6 ± 0,7

71-76 1,9 + 0,4 69,8 ± 4,8 . 5,6 ± 0,7

176-180 . 1,9 ± 0,8 66,7 15,2 6,5 4 1,6

186-190 1,9 + 0,6 66,0 + 10,4 6,8 4 0,6

226-230 1,7 Ч 0,8 74,5 + 10,5 6,8 4 1,1

Следует особенно подчеркнуть тот факт, что на протяжении такого длительного периода культивирования клетки сохраняют стабильную вируспродукции без подсева неинфицированных клеток.

Методом негативного контрастирования показано, что вирусные частицы, продуцируемые культурой ГКВ 4005, имеют размеры 90-100 нм и обладают морфологией, типичной для лентивирусов.

Методом иммуноблота в лизате клеток ГК& 4005 выявлено

наличие специфических белков щ>160, 8р120, рб4, р51/55, ®)41, р24, р17. Наличие в культуре клеток линии ГКВ 4005 вирусспецифической РНК- было подтверждено методом РНК-ДНК гибридизации.

Необходимо также отметить, что культура клеток ГКВ 4005

продуцирует инфекционный вирус. При титровании культуральной

жидкости на чувствительных к ВИЧ-1 клетках линии МТ-4

л ч

(перевиваемые Т-лимфоциты человека) показано наличие 10 -10 . инфекционных единиц в I мл. При длительном пассировании культуры инфекционность вируса не снижается.

Для создания банка линии ГКВ 4005 нами была изучена возможность }фиоковсервации этих клеток.

Замораживание клеток проводили по стандартной методике в среде КРМ1-1640, содержащей 30% сыворотки плода коровы, 10% глицерина. Однако, восстановление культуры клеток ГКВ 4005 после крииконсервации - процедура, сложная и требущая дорогостоящих добавок к питательным средам. Положительные результаты дает применение следующих добавок к стандартной питательной среде ЕРМ1-1640: сыворотка плода коровы - до 30%, Ъ-глутамин - 0,12%, меркаптоэтанол - 10~5 М, инсулин- 25 ед/мл. Однако, решающее значение имеет применение интерлейкина-2. Полученные Нами данные показывают, что применение питательной, среда с добавлением интерлейкина-2 позволяет восстановить культуру клеток к 7-8 пассажу.

Совокупность приведенных выше данных показывает, что наш получена хронически инфицированная ВИЧ-1 культура перевиваемых моноцитов человека, которая стабильно продуцирует инфекционный вирус в течение длительного непрерывного культивирования без подсева неинфицированных клеток. Линия клеток ГКВ .4005

депонирована в Государственной коллекции вирусов в институте вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН России под №4005 и защищена патентом-России.

Вероятно, стабильность полученной наш клеточной линии связана с особенностями ВИЧ-инфекции в моноцитарных клетках. В отличие от Т4-лимфоцитоа, в которых ВИЧ-инфекция протекает по логическому типу, в макрофагальных клетках' может происходить существенное накопление.вируса без литических изменений клеток (Levy J.А, 1988).

Наш результаты подтвервдаются данными Ushijima Н. et al, I991, которые также получили хронически инфицированный ВИЧ-1 клон клеток U-937, U-937/HIV-1, сохранявший способность к продукции инфекционного вируса при культивировании в течение 2 лет-.

Кроме того, Т. Folks et al (1986) получили стабильную хронически инфицированную линию клеток U1/HIV-1 (субклон U-937).

Линию клеток ГКВ .4005 можно рассматривать как одну из моделей, в определенной степени отражающую картину хронической инфекции, протекающей в организме и использовать ее для изучения закономерностей активации ВИЧ-инфекции. Так, эта линия клеток была использована для изучения активирующего воздействия на репродукцию ВИЧ-1 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-даоксина (Pokrovsky et al, .1991).

Мы предлагаем также использовать эту культуру в качестве дополнительной модели для изучения противовирусных препаратов. Так,' показано, что противовирусный эффект азидотимидина, и р-глицирризиновой кислоты значительно менее выражен на культуре клеток ГКВ 4005, чем на клетках МТ-4, инфицированных ВИЧ-1 (Pokrovsky et al, 1990).

5.Применение сывороток КРС и свиней, обработанных ПЭГом

Для культивирования линии клеток ГКВ 4005 применяется питательная среда ЙРМ1-1640 с добавлением 15% сыворотки плода коров. Исследована возможность частичной или полной замены этой сыворотки сыворотками КРС или свиней, обработанными полиэтиленглкколем (ПЭГом). Ь таблице 4 приведены данные, полученные при культивировании клеток линиии ГКВ 4005 в течение-

Таблица 4

Культивирование клеток линии ГКВ 4005 на среде НРМ1-1640 с добавлением сывороток, обработанных ПЭГом

Используемая Содер-

сыворотка

жание сыворотки в среде, %

Морфо- Индекс Доля Доля logg

логия пролв- жизне- ВПК, обратно-

клеток ферации способ- по го титра

клеток вдх дан- вирусно-

клеток, ным го анти-

% НИФ, гена в

% ИФА

сыворотка КРС, обработанная ПЭГом 15

Сыворотка КРС, обработанная 7,5 ПЭГом плюс сыворотка

"Тй^ Г

пич- .

ная 2,2+0;5 70,4±6,4 10-30 6,2±0,4

2,I±0,3 72,9*5.1 10-30 6,3*0,5

2,0±0,2 67,5+5,9 10-30 6,5*0,6

плода коровы фирмы "Flow"

Сыворотка свиней, обработанная ПЭГом

7,5

15

Сыворотка

свиней, 7,5

обработанная ПЭГом плюс сыворотка плода коровы фирмы "Plow" 7,5

Сыворотка плода коровы фирмы "Flow" 15

" - 2,2±0,2 74,5±3,1 10-30 6,8*0,5

2,1*0,3 72,1+6,2 10-30 6,1*0,7

8-14 пассажей на средах, содержащих экспериментальные сыворотки. Показано, что возможна частичная или полная замена сыворотки плода коровы сыворотками, обработанными ПЭГом. Морфология клеток, их пролиферация, уровень вируспродукции не изменяются. При электронно-микроскопическом исследовании клеток также не выявлено изменений по сравнению с контролем. Полученные данные позволяют рекомендовать к применению сыворотки КРС и свиней, обработанные ПЭГом в качестве значительно более дешевого и доступного заменителя сыворотки плода коровы, этот способ культивирования защищен патентом России.

6.Изучение динамики накопления антигенов ВИЧ-I штамма ГКВ 4005 в перевиваемых клеточных линиях.

. При изучении репродукции ВИЧ-I штамм ГКВ 4005 в перевиваемых линиях Т-хелперов показано, что наиболее чувствительной к инфицированию является линия клеток МТ-4, в которой к 5 суткам после инфицирования отмечено резкое возрастание уровня вирусных антигенов, выявляемых как по активности обратной транскриптазы (до 30.10®-имп.мин./мл), так и в ИФА, которое совпадает с падением доли жизнеспособных клеток.

При изучении динамики накопления р-24 антигена в культурах клеток Molt-4 и Jurlcat tat выявлено, что более чувствительной культурой является Jurkat tat. На пятые сутки после инфицирования достигается максимальное накопление р24-антигена -(2,33±0,38) мкг/мл, тогда как в культуре клеток Molt-4 максимальное количество антигена составляет лишь (0,76+0,02) мкг/мл. Необходимо также отметить, что, в. отличие от линий клеток МТ-4 и Molt-4, в процессе инфекции не происходит резкого уменьшения доли жизнеспособных клеток Jurkat tat.

Приведенные данные показывают, что наиболее чувствительными

к инфицированию ВИЧ-I штамм ГКВ 4005 являются клеточные линии МТ-4, Jurkat tat и Molt-4 и позволяют выбрать линию клеток МТ-4 как наиболее чувствительную и обеспечивающую более высокое накопление вирусспецифических белков.

7.Изучение особенностей вирусщюдукции при сокультивировании лимфоцитов человека линии МТ-4 и хронически инфицированной линии клеток ГКВ 4005.

Привлекательной идеей было изучение возможности сокультивйрования хронически инфицированной линии промоноцитов ГКВ 4005 и чувствительных к инфицированию клеток . МТ-4. Такая клеточная система, на наш взгляд, в определенной степени может отражать реальную картину инфекции в организме больного, когда хронически инфицированные клетки макрофагального ряда вызывают инфицирование чувствительной популяции Т-лимфоцитов.

На первом этапе этой работы исследована возможность сокультивирования клеточных линий МТ-4 и ГКВ 4005 при различном соотношении клеток. Данные, приведенные в табл.5, показывают, что сокультивирование клеток ГКВ 4005 и МТ-4 приводит к инфицированию последних и позволяет получить существенный прирост вирусных белков (выявляемых в ИФА и по активности обратной транскриптазы) по сравнению с вируспродукцией линии клеток ГКВ 4005. Необходимо отметить, что увеличение доли клеток МТ-4 в сокультивате вызывает рост продукции вирусспецифических белков.

Перспективность применения . таких "смешанных" клеточных культур подтверждается Murakami Т.- et al (1993), предложившими использовать для изучения анти-ВИЧ препаратов сокультивирование хронически инфицированной ВИЧ-I моноцитарной клеточной линии UI и CD4+ Т-лимфоцитов Molt-4. Авторы подчеркивают, что применение'

Таблица 5

Накопление белков ВИЧ-1 при сокультивировании клеток штаммов ГКВ JS40Q5 и МТ-4

Соотношение клеток

МТ-4/: ГКВ Ä4005

Активнооть обратной

транскриптазы (хЮб имп/мин)

logg обратного

титра суммарного антигена в ИФА

0,4 : I

I : I 2,3 : I . 9:1 ГКВ J64005 МТ-4- .

н/д 13,54+0,37 17,87+0,35 30,94+1,39 5,76+0,43 0,16+0,02

6,69+0,58 8,23+0,70 8,33+0,29 8,72+0,72 6,69+0,58 О

такой "смешанной" культуры -дает возможность получить более объективную оценку противовирусного действия препаратов. •

Для разработки схемы культивирования ВИЧ-1, позволяющей получать антиген ВИЧ-1 с полным набором вирусспецифических белков, была исследована возможность применения вируссодержащей жидкости, полученной при обогатительном пассаже (сокультивирование клеток МТ-4 и ГКВ 4005 в (соотношении 1:1), для инфицирования клеток МТ-4. Показано, что инфицирование клеточной линии МТ-4 вируссодержащей жидкостью. после обогатительного пассажа приводит к еще более существенному приросту как продукции вирусных белков, так и доли инфицированных клеток. При сокультивировании клеток ГКВ 4005 и МТ-4 в соотношении 1:1 на четвертые сутки культивирования ' выявляется 50-60% вируспродуцирующих клеток. Применение полученной культуральной вируссодержащей жидкости для

инфицирования клеток МТ-4 приводит к синхронизированной литической инфекции, при которой на 4-5 сутки культивирования инфицировано 80-95% клеток, и доля жизнеспособных клеток падает до 45-25%. Эта схема культивирования использовалась для наработки внруссодержащей жидкости с целью получения антигена ВИЧ-1, содержащего полный набор вирусспецифических белков и защищена патентом России.

8. Изучение____анта-ВИЧ____активности____5'-фбсфонатов

азидотимидина и фтортимидина.

Второй частью настоящего исследования бцло изучение анти-ВИЧ активности 5'-фосфонатов азидотимидина и фтортимидина с различными типами остатков модифицированного фосфата на разных клеточных линиях. Выбор препаратов определялся .тем, что среди множества классов соединений, обладающих анти-ВИЧ активностью, ввделяются аналоги нуклеозидов, избирательно ингибирующие обратную транскриптазу вируса - 3'-азидо-2',3'-дидезокситимидин (AZT), 2',3'- дидезоксицитидин (DDG), 2' ,3'-дидезоксиинозин (DDI) (Mltauya Н. et al, 1985, Mltsuya H. et al, 1986). Эти соединения в настоящее время официально разрешены к применению для лечения больных СПИД, а наиболее широко используется азидотимидин. Однако, при лечении AZT часто возникают побочные явления. Они связаны с индуцируемым AZT искажением внутриклеточного пула 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов. В последние годы было обнаружено, что 5'-фосфонаты нуклеозидов обладают выраженной анти-ВИЧ активностью и, кроме того, менее токсичны для клеток, чем исходные нуклеозиды (Бибилашвили Р.Ш. и др, 1988, Тарусова Н.Б. и др, 1987, Карамов Э.В. и др, 1990).

Была изучена анти-ВИЧ активность двух групп соединений: 5'-фосфонатов AZT с различными типами остатков

модафицированного фосфата:'

а а

II Thy

НО-Р-О—, „ , но

«о

Ü . 7h> u« У q_ Th> ¡i 7hу

.и« \ / наос \ / L

OH

•а "« Eifl

I II III

a также Б'-фосфонатов FLT:

а с

П Thy Й Thy Thy

ту? Рр

IV У PLT

При изучении цитотоксичности и противовирусной активности этих соединений в культура клеток МТ-4, инфицированной ВИЧ-1 выявлена их'отличительная особенность - они менее токсичны для неинфщированных клеток, чем AZT и FLT (табл. 6). 5'-фосфонаты AZT (соединешя I, II, III) с высокой эффективностью подавляют размножение ВИЧ-I в культуре клеток МТ-4. Индексы-селективности, определенные по накоплению в культуральной жидкости вирусного антигена и по • активности обратной транскриптазы для соединений I—III сравнимы с индексами селективности для AZT (табл.6).

Эта группа препаратов обеспечивает также эффективную защиту инфицированных клеток .от цитопатогенного действия вируса (рис.1). 5'-фосфонаты AZT в концентрациях выше 0,3 мкМ обеспечивают сохранение более 50% жизнеспособных клеток, тогда

Таблица 6

-Анти-ВИЧ активность 5'-фосфонатов азидотимидина и фтортимидина в культуре клеток МТ-4

Соеди " С%0 1Б

нение мкМ ПО вирусному антигену по активности обратной транс-криптазы по вирусному антигену по активности обратной транс-криптазы

1 >145 0,093+0,029 н/д >1559 н/д' .

II Х61 0,016+0,009 н/д 10063 н/д

III >174 0,12+0,03 0,054+0,015 >1450 >3222

IV 123 0,13+0,05 0,092±0,009 946 1337

V 160 0,15+0,04 0,13±0,03 1067 1231

ИЛ" 89 0,0029+0,0СЮ7 0,0084±0,0012 30690 10595

Агт 84 0,013+0,005 0,012+0,002 6462 7000

как АЙТ в этих. концентрациях токсичен для инфицировашшх клеток.

Среди исследованных 5'- фосфонатов АЙТ наиболее перспективным по изученным параметрам является 5'-карбоксифосфонат Агт (II) - его ивдекс селективности .(1Б) составил 10063 (табл.6). Это показывает целесообразность дальнейшего поиска наиболее активных ингибиторов репродукции ВИЧ в исследуемой группе соединений.

Изучение второй группы соединений - 5'-фосфонатов фтортимидина (соединения IV и V), показало, что они менее эффективно подавляют репликацию вируса, чем исходный фтортимидин (табл.6), но обеспечивают защиту инфицированных клеток от цитопатогенного действия вируса (рис.2). Б'-нитрилофосфонат И/Г (соединение V) и ИТ в концентрациях

Ингибирование репродукции ВИЧ-1 5'-фосфонатами AZT в культуре

клеток МТ-4

291 -1 СИ-з ED - в Ш -7 БЕЗ - г - 4 -»--в -«--в

I - неинфицированные клетки МТ-4;2 - инфицированные клетки МТ-4; 3 - инфицированные клетки, обработанные AZT; 4 содержание вирусного антигена в этих клетках; 5 инфицированные клетки, обработанные II; 6 - содержание вирусного антигена в этих клетках; 7 - инфицированные клетки, обработанные III; 8 - содержание вирусного антигена в этих клетках.

По оси абсцисс - концентрация соединений (мкМ); по оси ординат (слева) - жизнеспособность клеток (% от контроля); по оси ординат (справа) - уровень вирусного антигена (% от контроля).

выше 0,3 мкМ обеспечивают сохранение более 50% жизнеспособных клеток, тогда как Агт в этих концентрациях токсичен для инфицированных клеток.

Ингибирование репродукции ВИЧ-1 5'-фосфонатами И.Т в культуре клеток МТ-4

Ш -1 а -а Ш - о ШЗ . 7

ЕЛО -г —- 4 -*- - е -В- - о

I - неинфицированные клетки МТ-4; 2 - инфицированные клетки МТ-4; 3 - инфицированные клетки, обработанные АИТ; 4 -содержание вирусного антигена в этих клетках; 5 инфицированные клетки, обработанные V; 6 - содержание вирусного антигена в этих клетках; 7 -инфицированные клетки, обработанные ?ЬТ; 8 - содержание вирусного антигена в этих клетках.

По оси абецисс - концентрация соединений (мкМ); по ' оси ординат (слева) - жизнеспособность клеток (% от контроля); по оси ординат (справа) - уровень вирусного антигена \% от контроля).

В отличие от эффективного воздействия на репродукцию ВИЧ-1 в Т-лимфоцитах, не выявлено эффективного ингибирующего действия АЙТ, ЕЬТ и Б'-мвгапфосфэната АгТ (соединение I) в первичной культуре нестимулированиях моноцитов периферической крови здорового донора, инфицированной ВИЧ-1 (рис.3), не достигается 50% ингибирования накопления р--И4 антигена по сравнению с необработанными клетками.

Влияние Агт и его производных на накопление р24 антигена в первичной культура моноцитов периферической крови человека, инфицированной ВИЧ-1

■В-1 tm-2 Е23- з Ш-4

I - без внесения препаратов (контроль); 2 - обработанных AZT; 3 - обработанных FLT; 4 - обработанных I.

По оси абсцисс - концентрация соединений (мкМ); по оси ординат - накопление р24 антигена в- первичной культуре моноцитов (нг/мл).

При изучении анти-ВИЧ активности AZT, ELT и 5'-метилфосфоната AZT (соединение I)- . в хронически инфицированных ВИЧ-1 культурах клеток линий НЭ/НГМ^, и CEM/HIV-lg не выявлено эффективного ингибирущего действия этих соединений на репродукцию вируса.

Таким образом установлено, что анти-ВИЧ активность исследованных соединений различна в клетках разного происхождения. Полученные результаты подтверждают необходимость включения в традиционную схему для скрининга анти-ВИЧ препаратов линий клеток моноцитов/макрофагов и хронически инфицированных клеточных линий для более адекватной оценки ингибирующего действия препаратов.

ВЫВОДЫ

1.Получена уникальная хронически инфицированная линия перевиваемых моноцитов человека ГКВ-4005. Показано, что клетки ГКВ 4005 продуцируют инфекционные вирусные частицы в течение длительного непрерывного культивирования (более. 200 пассажей) без подсева неинфицированных клеток и применения цитокинов.

2.Разработан способ культивирования ВИЧ-1, заключающийся в сокультивировании хронически инфицированной ВИЧ-1 перевиваемой линии моноцитов (ГКВ 4005) и перевиваемой линии Т4-лимфоцитов МТ-4, позволяющий получать антиген с полным набором вирусспецифических белков.

3.Разработан способ культив1фования ВИЧ-1 на питательных средах, содержащих сыворотки КРС или свиней, обработанные ПЭГом.

4.Изучена противовирусная активность ряда 5'-фосфонатов азидотимидина с различными типами остатков модифицированного фосфата, а также 5'-фосфонатов фтортимидина в культуре клеток МТ-4, инфицированной ВИЧ-1. Показано, что все исследованные соединения обладают значительно более низкой токсичностью для неинфицированных клеток, чем азидотимидин. Установлено, что среди изученных 5'-фосфонатов AZT наиболее выраженным ингибирующим действием обладает 5'-карбоксифосфонат АКТ.

5. Показано, что азидотимицин, фтортимидин и 5'-метилфосфонат азидотимидина не' проявляют выраженного ингибиругацего действия на- репродукцию ВИЧ-I как в .первичной культуре нестимулированных моноцитов периферической крови здорового донора, инфицированной ВИЧ-I, так и в культурах клеток,'хронически инфицированных ВИЧ-1.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Покровский А.Г., Мамаева O.A., Плясунова O.A., Киселев H.H., Куляндин С.А. Способ получения антигена вируса иммунодефицита человека I типа // Патент РФ #1717631, выдан 15.12.92 г.

2.Руднева И.А., Карамов Э.В., Горчакова Т.А., Черных А.И., Мамаева O.A., Плясунова O.A., Покровский А.Г. Штамм перевиваемых моноцитов человека - продуцент вируса иммунодефицита человека I типа // Патент РФ Ш554370, выдан 19.03.93 г.

3. Андреева М.А., Мамаева O.A., Плясунова O.A. Способ культивирования штамма-продуцента вируса иммунодефицита человека I типа // Патент РФ № 1597388, выдан 26.02.93 Г.

4. Мамаева O.A., Плясунова O.A., Проняева Т.Р., Покровский А.Г., Ткачев В.К., Карамов Э.В., Руднева И.А. Особенности длительного непрерывного культивирования линии . клеток, хронически инфицированной вирусом иммунодефицита человека I типа // Вопр. вирусол.1991.- Ш.- С.447-450.

5. Мамаева O.A., Плясунова O.A., Проняева Т.Р., Горчакова Т.А., Руднева И.Н. Крупномасштабное культивирование линии-продуцентов ВИЧ-I для производства вирусного антигена -одного из компонентов тест-системы "Вектор" // Материалы

конференции "Проблемы биотехнологии иммунобиологических и гемотрансфузионных препаратов". Новосибирск, 1988, С.122-126.

6. Mainaeva O.A., Pokrovsky A.G., Kraevsky A.A. Inhibition of HIV reproduction In T-helper and monocyte cell cultures by analog of 3'-azido-2',3'-dldeoxynucleotlde // Abstracts of International conference of AIDS, cancer and human retroviruses. St.-Petersburg , 1992.P.62.

7. Мамаева O.A., Плясунова O.A., Покровский А.Г. Изучение культуральных свойств штамма ГНВ 4005 вируса иммунодефицита человека I типа // Материалы 1-го Съезда иммунологов России, Новосибирск 1992. С.289.

8. O.A. Мамаева, O.A. Плясунова, 1А.Г. Покровский, Н.Б. Дяткина, A.A. Арзуманов. .Изучение анти-ВИЧ активности 5'-фосфонатов азидотимидина и фтортимидина // Мол. биология 1994. Т.28. Ж. С.137-142.

Подписано к печати 5 мая 1994г. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Объем I п.л. Тираж 100. Заказ 14.

ИГД СО РАН