Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Определение и изучение препаратов - ингибитора вируса иммунодефицита человека

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Определение и изучение препаратов - ингибитора вируса иммунодефицита человека"

12,1 12 9 2

LIÎCTEFGTEO здравоохранения российской ©ЕДЕРАПИИ

^учеочкзсшедовлтедшшй институт молекулярной

биологии, НПО "ВЕКТОР1'

lia правах рухсошхсп

плясшша ОЛЬГА йЖКСАНПРОВЙД

-л

шше.шв -

г^шощ^шп ЧШОШПА

Со.СО.СЗ» - вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук в фор:*э научного доклада

Колыюео - 1323

РеЗота выполнена ъ лаборатории культивирования п диагностики ретроварусов Всесоюзного научно-ьссладовательсггаго института молекулярной сиологаи НПО "Контор"

Каучццй руководитель ; Кандидат -оаогогачзка^ паук

Д.Г.Пскрозссаз:

oixciiôk:ïi : Лектор isüsksckiix наук, нрс&ассор Канада? мздацпвксЕХ ñay¡:, доцент

¿.K.ErcTpozoj

Вздутая организация: Институт Енрусолота: ;л. Д.II. Ивановсиого P&S

;азг?а дзхгзртещз! состоите.

- ГМ''дг/ж&Л- ISS2 г - 9

zo'j не cacóÁ^Ks: c^vs U 053.03.01 to

Вс-с-сосзкох; : кзэткгухо

cr,Cv"or;-; па C3GIÖ5, се;;,,,

г-.-.:. п. Kozhhv:.:;,

С цзгена г. сLz:.cс:. с.;:о:т

Дпоосрхедж разослана г

-с:

УчйпаЗ еекротар;,

/7 .■ // uí пayi:' ///', Гусч:

СКЦЦйЯЙЗГООЕЕЗЫЗГО соззтс

/7//

Рот'^екАЯ

GilbiirtO IЬКД ^цдн ХАРАКТЕРЙСЗЖА РАБОТЫ

актуальность__отоблемп^ В связи с появлением ?.

распространением СПИД начался активный поиск препаратов, ооладаших выраженным анта-ВИЧ действием, среда лекарственных средств, ннгибирущая активность которых была ранее установлена в отношении других вирусов, и разраОотка новых противовирусных препаратов, способных воздействовать на ВИЧ и приостанавливать пли предотвращать развитие инфекции. Так, была . выявлена анти-ВИЧ активность сурамина (Mltsuya H., et .al.,. 1984), азидотнмидина (Mltsuya H., et al.,1985), p- глицирризиновой кислоты (Ito H.,1988), рибавирина (Williams I.G., 1939), аурпнтрзсарбововой кислоты (Balzarlnl J., et al.,1989) и многих других препаратов.

В настоящее время проводятся эксперименты с более чегл 80 —субстанция!,и-потенцкальЕШ.и лекарственными средствам для лечения СЩД. Наиболее эффективные антн-ВКЧ прзпарзта откосятся к группе нуклеотидных аналогов, являющихся инп-биторкш вирусного фэриента-обраткой транскриптазы. Один иг si - ззютпэдгш! (AZT >- стал первым и пока единственным гр?пгргтсм, пзге^п:^ применение в медицинской практике для лечонпя авд, дакздтХ рзальнуо возможность продления иизш; 5эл1-епх <ЯЩ. Солгдач высокой эффективностью ннтябированря ВИЧ.

тен не кэнве, шлзэт ряд недостатков, сгргнттчлзгп^с^ ого применение б хггапкческой практике: се 7or.ciTi6H (Rlcnnan D.B., et al., 1937), обладает низкой з^эг.ггтасстьгз кнгЕбцрованяя репродукция ВИЧ в макрофагах (С'гссэ S.I'., et al., 1559), не способен препятствовать гибеж ллетск, датгдьЕоз щттошз азвдотжви>;ша приводи-." к

-г -

появлению ÀZT-устойчишх штаимов ВИЧ (Marz J.L., 1989.. Larder В.A., et al., 1989, Lanier В.A. andKenpSJ)., 1989). Поэтому актуальгаш представляется поиск новых ингибиторов размножения ВИЧ. И в этом плане особый интерес представляют препараты с механизмом действия, не связанным с ингибированием обратной транскриптазы вируса, что, вероятно, позволит дополнить действие AZT. Исследователи в поиске эффективных химиотерапевтических агентов против ВИЧ используют разнообразные стратегии, основанные на разных мишенях в решшкативноМ цикле вируса, с которыми могут взаимодействовать анти-БИЧ агенты. В добавок к обратной транскриптазе, являющейся мненью для 2',3'-дидазаксащуклеозидных аналогов, различные другие имени могут служить местами для химиотерапевтиче ской атаки: адсорбция вирусной частице на клеточной мембране, раздевание вирусного капсида, интеграция провирусной ДНК в каеточшй геном, процессинг шрусшх белков-предшественников, сборка ж внсвобожданиа (почкование ) потомства вирусных частиц. Поиск швах эффективных ингибиторов размножения ВИЧ, девствуnpEc на ря-тоят этапах его —яивнш>т цикла, остается актуальвш на сегодняшний дань.

Так к&к все ипш-дннн« ваве хювотерадавтичаские подходы нящнмнан ва подавление вируса на одном или более этапах его гртжя репаикации, шльзя отдать, чтобы хоть один из таких агентов "шгаад" da вирус из резервуаров •'маярофвхса/моаошЕГоа). Ддя достижения этой цели, которая актуальна два ямимиштии провирусной ДВЕ из персистентно -я кг[м i ц и i <оиян.и»а хдетяя. лить применены более эффективные

агенты, тгетэ как ^rjmneir-ипяыд однгонуквеотиды» ковалэнтно

связывающиеся с нуклеиновой кислотой, - разрезающие реагенты. Только такие вмешательства, которые достигают цели элиминирования вирусных последовательностей ДНК из клеток хозяина-, можно предположить, завершат действительный курс лечения болезни. В нескольких лабораториях мира в течение ряда лет ведутся интенсивные исследования в области создания нового поколения эффективных лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфекции на основе антисмысловых олигонуклеотидов. К настоящему времени в литературе описано ингибирование размножения ВИЧ в культуре клеток олигонуклеотидами, комплементарными различным функциональным участкам РНК вируса (гатеспИс еХ а1., 1986; МагзШшга ег а1., 1987, 1989; А^га*а1 еХ а1., 1988, 1989; 2а1а-еХ а1., 1988; Неппе1зеп ег а1., 1990). Тем не менее поиск новых более эффективных в отношении ВИЧ антисмысловых олигонуклеотидов и разработка на их основе лекарственных средств остается актуальным.

■Важно отметить, что высоко эффективных средств для лечения СПИД еще нет и в целом в настоящее время не существует такого подхода к созданию лекарственных препаратов для лечения СПИД, который мог бы претендовать на монополию. Эффективная терапия этого заболевания может стать результатом системного комплексного подхода, когда в зависимости от стадии или формы проявления болезни будут использоваться лекарственные средства различной природа с разными механизмами действия, их различные комбинации.

Принимая это во внимание мы в своей работе проводили поиск новых перспективных для лечения СЩЦ анти-ВИЧ агентов среди уже известных ингибиторов ВИЧ-инфекции (р-глицирризиновая кислота)

путем получения их различных химических производных, среда химических препаратов, для которых показана противовирусная активность в отношении других вирусов (энциклан), среди препаратов нового поколения - антисшсловых олигонуклеотидов; оценивали возможность совместного применения с AZT некоторых из них.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы был поиск анти-ВЙЧ активных препаратов и изучение анти-ВИЧ действия наиболее перспективных из них. Работа связана с решением задач, поставленных в рамках Государственной программа по борьбе со СПИЦ.

На первом этапэ исследования была подобрана система вирус-клетка, адекватная для разрешения, поставленной задач:-!, и разработан комплекс методов по оценке уровня ингибирования ВИЧ в клетках. В качестве эталонных были использованы известные препараты, обладающие анти-ВИЧ активностью - AZT, гепарин, ауринтрикарбоновая кислота (АТК). Среди клеточных культур, шрмиссивных для ВИЧ, наше внимание привлекли нэ только Т-хелперы (МТ-4, СШ, НЭ),■но и макрофагальные линии (ü-937). Использование клеток-макрофагов для тестирования противовирусных препаратов дает возможность провести более полную оценку препаратов и выявить те из них, которые могут дополнить действие AZT.

На втором этапе работы проводили скрининг различных химических соединений таких как компоненты экстракта корня солодки (Glycyrrhiza radix): р-глицирризиновая кислота, ■Злавоноиды; химические производные (З-глицирризиновой кислоты

иззличные амиды и гликопепшш); изоборниловые эфирк

(энциклан), антисмысловые олигонуклеотиды и их производные.

На третьем этапе исследования определяли количественные характеристики (П)50, СЮ50, 15) для наиболее перспективных, из изученных анти-ВИЧ препаратов.

По ходу выполнения работы была" рассмотрена возможность использования для ингибирования ВИЧ-инфекции разных комбинаций изученных препаратов с Агт.

Научная__новизна., В процессе скрининга препаратов,

относящихся к различным классам химических соединений, выявлены новые ингибиторы репродукции ВИЧ:

а) производные р-глицирризиновой кислоты, эффективно ингибирувдие размножение ВИЧ-1 как в культуре Т-лимфоцитов, так и в моноцитарной клеточной системе:

1. ниглизин (пента-о-никотинат р-глицирризиновой кислоты),

2. амид р-глицирризиновсй кислоты с 6-аминоурацилом,

3. амид р-глицирризиновой кислоты с 6-амино-2-тио-урацилом,

4. гликопептид р-глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром 1-гистидина,

5. гликопептид р-глицирри5иновой кислоты с дибутиловым эфиром Ь-глутаминовой кислоты,

6. гликопептид р-глицирризиновой кислоты с диметиловым эфиром Ь-аспарагиновой кислоты,

7. гликопептид р-глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром глицил-Ь-валина;

б) впервые была установлена способность изоборнилового эфира 2,Э-димз тил-3 а,4,9,9а-те трагвдрофуро-[2,3-Ь] - хиноксалин - 3 -карбоновой кислоты (энциклана), относящегося к новому классу химических соединений, эффективно ингибировать репродукцию кег

- 6 -

ВИЧ-I так и ВИЧ-2 в культуре клеток;

в) впервые показана высокая противовирусная активность (IS 100-500) и специфичность анти-ВИЧ действия олигонуклеотидов последовательности pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA (FM-20), комплементарной области начала трансляции открытой рамки считывания на (+) цепи ДНК ВИЧ-I, и последовательности pTGCCTGGAGCTGCTTGATGC (МР-20), комплементарной олигонуклеотиду РМ-20.

г) На примере уже известных антисмысловых олигонуклеотидов -ингибиторов ВИЧ-I и новых олигонуклеотидов РМ-20 и МР-20 показано, что введение в 5*-положение олигонуклеотидов химических модификаций (алифатических аминов, остатков холестерина) приводит к существенному повышению эффективности ингибирования ими репродукции ВИЧ и обеспечению значительной степени защиты Т-хелперов от цитопатического действия вируса.

д) Установлено, что глицирам-лекарственный препарат на основе p-глицирризиновой кислоты- не является антагонистом AZT.

Теоретическая и практическая ценность. Во всем мире под эгидой ВОЗ осуществляется комплексная программа борьбы со СПИД, включающая поиск лекарственных средств, способных хотя бы приостановить течение этой смертельной в большинстве случаев болезни. Бесспорно, что в этой связи выявление новых ингибиторов размножения ВИЧ (ниглизин, амида, и гликопептиды p-глицирризиновой кислоты, энциклан, олигонуклеотиды РМ-20 и МР-20, а также их производные, несущие на 5'-конце гидрофобные группировки) имеет как теоретическое, так и практическое значение.

Результаты работы по изучению совместного действия

препаратов p-глицирризиновой кислоты с азидотимидином позволили сделать вывод о возможности такого применения, что может оказаться полезным при комплексной терапии СПИД.

Определены количественные характеристики для ряда олигонуклеотидов и показана более высокая анти-ВИЧ активность новых олигонуклеотидов FM-20 и МР-20 по сравнению с уже известными, а введение химических модификаций позволило существенно повысить их эффективность за счет повышения их стабильности и увеличения проницаемости клеточных мембран для таких препаратов и обеспечить высокую степень защиты клеток от цитопатического действия вируса, что, вероятно, может быть использовано при создании доступных для практического применения эффективных препаратов для лечения заболевания С1ВД.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Химия природных и низкомолекулярных биорегуляторов" (Ереван, 1990), IX Всесоюзном симпозиуме "Целенаправленное изыскание лекарственных средств" (Юрмала, I991)»Международной конференции "International conference on molecular biology aspects ot diagnostics and therapy or AIDS" (Новосибирск, Академгородок, 1991), IV Всесоюзном симпозиуме ^Изучение и использование солодки в СССР" (Алма-Ата, 1991), I Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992).

Наличие анти-ВИЧ активности найденных нами новых препаратов (ниглизин, энциклан, олигонуклеотяд РМ-20) было подтверждено экспериментально в Кембриджском университете, в Национальном институте биологических стандартов и контроля, в Центре по сотрудничеству при Медицинском Исследовательском Совете (Лондон).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ.

содержание работы скрининг и изучение препаратов - ингибиторов вируса ишшюдбфи1щтд человека

Поск препаратов, обладающих анти-ВИЧ активностью, является, на наш взгляд, одним из наиболее перспективных направлений исследований и проводится в ряде ведущих лабораторий мира.

в нашей лаборатории работы по скринингу анти-ВИЧ препаратов начаты в 1989 году.

Для оценки противовирусной активности исследуемых препаратов' из клеточных культур МТ-4, СЕМ, Н-9, пермиссивных для ВИЧ, мы выбрали культуру перевиваетих лимфоидных клеток МТ-4, оказавшуюся наиболее чувствительной к ВИЧ и удобной в работе, так как позволяет получать стабильные и воспроизводимые результаты. Кроме того, эта клеточная линия получила широкое распространение в мире для оценки противовирусной активности ингибиторов репликации ВИЧ, что дает возможность сравнивать полученные результаты с исследованиями других лабораторий. Среди клеточных культур, пермиссивных для ВИЧ, наше внимание привлекли не только Т-хелперы, но и моноциты/макрофаги, играющие вансную роль в патогенезе СПИД за счет способности некашшвать вирус и передавать его Т4-лимфоцитам. В своей работе мы использовали хронически инфицированную ВИЧ-1 линию перевиваемых моноцитов челозека и-937 ' (депонирована в

Государственной коллекции вирусов Л 4005). Хроническая инфекция, протекающая в этой культуре, более адекватно отражает картину инфекции на уровне организма, чем модель острой литической инфекции при применении линий клеток МТ-4, CEW, Н-9. Использование моноцитов/макрофагов для тестирования противовирусных препаратов дает возможность провести полную оценку препаратов и выявить те из них, которые могут дополнить действие AZT.

Необходимо отметить, что используемые методы тестирования препаратов с анти-ВИЧ активностью могут в значительной мере влиять или даже изменять результаты теста, делая таким образом сравнительные исследования и оценку эффективности исследуемых препаратов затруднительными. Поэтому при выборе комплекса методов по оценке уровня ингибирования ВИЧ в клетках мы остановились на тех из них, которые позволяют получить наиболее полную информацию об особенностях действия ингибиторов размножения ВИЧ и используются большинством исследователей для таких целей (Ни J.M. and Hsiung G.D., 1989): Г) определение степени защиты инфицированных ВИЧ клеток от гибели путем определения их кизнеспособности .методом окрашивания клеток трипановым синим (оценка ингибирования Епрус-индуцированного цитопатического действия);

2) определение активности уникальной вирусной обратной транскриптазы (измерение специализированных функций и вирусных продуктов);

3) определение уровня накопления вирусных белков (суммарных и р24) иммуноферментшм методом (измерение вирусных продуктов).

Определение количества вируспродуцируицих клеток методам!-

непрямой иммунофлюоресценции и электронной микроскопии требует большего количества тестируемого материала, что, к сожалению, не всегда приемлимо, например, при скрининге антисмысловых олигонуклеотидов в силу их высокой стоимости, поэтому эти методы мы использовали лишь в случае необходимости.

В работе использовали штаммы ВИЧ-1/ЭВК (ГКВ 4005) и ВИЧ-2/rod, полученные от доктора Э.В. Карамова (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, г. Москва), а также штамм ВИЧ-1 * 1 (ГКВ 4046), выделенный в нашей лаборатории из мононуклеарных клеток периферический крови ВИЧ-инфицированного пациента. На начальном этапе работы нами были созданы рабочие банки этих штаммов вирусов, а также рабочие банки выбранных для скрининга анти-ВИЧ препаратов культур клеток МТ-4 и хронически инфицированных ВИЧ-I U-93T, что позволило проводить тестирование противовирусных прпапатов в одинаковых условиях.

Инфицирование клеток МТ-4 разными штаммами ВИЧ проводили путем добавления вируса к клеточной суспензии с концентрацией

с

2x10 клеток/мл. Множественность заражения - 0,2-0,5. Адсорбцию, вируса проводили в течение одного часа при температуре 37 °С. Инфицированные клетки разводили средой для культивирования до

с

концентрации 5x10 клеток/мл и вносили растворы исследуемых препаратов в клеточную суспензию. В качестве эталонных препаратов использовали известные анти-ВИЧ агенты с разными механизмами действия: AZT - 2',3'-дидвзоксинуклеозидный аналог, механизм действия которого связан с ингибированием вирусной обратной транскриптазы и терминированием синтеза вирусной ДНК ( Hirsch M.S., 1988, HercLewiJn P. and De Clercq E., 1990), ауринтрикарбоновую кислоту (ATK), ингибирупций эффект которой

обусловлен блокированием взаимодействия CD4 рецептора с вирусным gp120 (Balzarlnl J., et al., 1989), гепарин сульфатированный полисахарид, препятствующий адсорбции вируса на клеточной мембране (Toshlyukl N.and Hlroo Н., 1988, De Clercq E., 1988) и p-глицирризиновуга кислоту (ГК), относящуюся к группе природных соединений, выделенных из растительных источников, механизм антивирусного действия которой до настоящего времени остается неустановленым, но для которой показано непосредственное блокирование связывания ВИЧ с клеткой (Ito et al., 1988) (табл. I). Контрольные и инфицированные ВИЧ клетки (с анти-ВИЧ препаратом и . без него) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10-15% фетальной сыворотки (сыворотку предварительно прогревали при 56°С, I час), 300 мкг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл канамицина или 60 мкг/мл линкомицина в 96-луночных культуральных планшетах фирмы "Costar"'при температуре 37 °С во влажной атмосфере 5% COg.

Ингибирущий эффект препаратов оценивали на 4-5 сутки культивирования измерением активности вирус-специфического фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы, как описано ранее Lee et al. (1987) (за активность обратной транскриптазы принимали

о

включение радиоактивной метки [Н ]-КТ в системе poly (А): ollgo (di) in vitro в импульсах на 1 мл культуральной жидкости), вирусного антигена иммуноферментным методом (Жданов и др., 1988), количества вирусного белка р24, а также определяли долю жизнеспособных клеток методом исключения трилановым синим. По такой схеме проводилось тестирование всех исследуемых препаратов.

- 12 -

Ингибирование репликации ВИЧ-I в культурах клеток

Таблица I

Кон-___МТ-4______'_________ГКВ 4005_______

Препараты цент- Ингибирование, % Ингибирование, %___

рация активности накопления активности накопления

обратной вирусного обратной вирусного

мкг/мл транскрип- антигена транскрип- антигена

тазы тазы

АЯИДГРГДЫИ ЦЦЫ 10 98,1 94,2 57,4 55,7

Гепарин 50 98,8 96,3 47,0 Н/Д

АТК 20 91,2 н/д 11,8 6,7

10 85,3 Н/1 11,7 3,4

р-гк 1000 99,3 97,2 0 Н/Д

— щ _ 500 98,3 97,0 10,0 Н/д

р-ГК - р-глицирризиновая кислота АТК - ауринтрикарбоновая кислота

В таблице приведены средние значения 3-6 экспериментов.

Скрининг в изучение анза-ЕЕЧ дсйстпгл препаратов 1^шш^-гл«щИррИз5шовоа кислоты.

В 1987-88 гг. работами группы японских исследователей установлено, что ГК - соединение, присутствующее в водном экстракте корня солодки (Glycyrrhiza radix) эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ в культуре клеток (Ito et al., 1987). Показано также, что введение ГК в высоких дозах (800-1600 мг/день) больным СПИДом вызывает у них увеличение

содержания Т4 лимфоцитов и снижение количества вирусного антигена.

Механизм антивирусного действия ГК до настоящего времени зстается неустановленым. Предполагается, что одним из факторов йожет служить блокирование ГК протеинкиназы (Но ег а!.. I988).фосфорилирование которой молекулы Т4 рецептора необходимо йля связывания вируса с Т4 рецептором (Пе1йз ег а1., 1988). Остановлено также, что ГК непосредственно препятствует связыванию ВИЧ с клеткой (1Г.о ег а1., 1988).

Задачей нашей работы было сравнительное изучение анти-ВИЧ ¡ктивности различных производных р-глицирризиновой кислотк ;р-ГК) с целью выявления наиболее активных препаратов.

р-глицирризиновая кислота (а), ее производные получены в [нстатуте органической химии, г. Уфа:

На первом этапе исследования была проведена проверка нти-ВИЧ активности оффицинального препарата - глиштрама 1Шд-соль-р-ГК). Из рисунка I видно, что глицирам эффективно ащищает клетки МТ-4 от вирусной инфекции в концентрациях, ревышапцих 100 мкг/мл. Также был изучен противовирусный эффект лицирама с использованием различных штаммов ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

СИ 1 2 Нз

Рис Л Анти-ВИЧ активность глиодраиа.

1 - неинфицированные клетки МТ-4; 2 - содержание вирусного антигена; 3 - инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-4. По оси абсцисс

концентрация (мкг/мл); по оси -ординат (слева) кизнеспособность клеток {% от контроля); по оси ординат (справа) - уровень вирусного антигена {% от контроля).

Препарат применяли в концентрациях, использованных б ра-ре опубликованных работах - 500 - 1000 мкг/мл. Полученные результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о выраженном ингибирущеы эффекте глицирама на репродукцию исследованных штаммов ВИЧ в культуре клеток МТ-4.

Интибнроваше репродукции разных птенцов ИИ в культуре клеток МТ-4

Таблица 2

Наименование Кон- ГКВ 4005 ГКВ 404G ВИЧ-2/rod

препарата цент- ------------ ---------- ------------

рация Кол-во Инги- Кол-во Инге- Кол-во Ингк-препа- нееых Сиро- гсквых биро- кивых бирс-рата клеток вгние клеток ванне клеток ванне (Ag/ml % нако- % нако- % накопления пленяя пления вирус- вирус- вирусного ного ного АГ, % АГ, % КГ, %

1Ш4-с0ль-Р-ГК 1000 61,9 95,9 65,9 94,3 75,1 - " - 500 86,7 95,3 67,8 94,0 88,9

Контроль (ин-фзцибованше клетки) Контроль (не-хшфицировашые

кл9тки)

- 50., О

- 81,5

О 42,8

О

19,1 8" ,5

79,7 42,5

В таблице приведены средние данные-3-6 вкспэриыенои

Основной характеристикой противовирусной активности химиопрепаратов слугит хишгатерапевтический индекс (индекс селективвости-ЗБ)-отношение концентрации препарата, вызывающей 50£ снижение ннзнеспособности клеток (С050) к концентрации, на 50% ингибирувдей репродукцию ВИЧ (Ю50). В таблице 3 приведены результаты экспериментов по определению химиотерапввтического индекса для некоторых солей ГК. Кроме того, использовали для

сравнения AZT, механизм действия которого связан с ингибированием вирусной обратной транскриптазы и терминированием синтеза вирусной ДНК и ауринтрикарбоновую кислоту (АТК), ингибирувдий эффект которой обусловлен блокированием взаимодействия CD4 рецептора с вирусным gp120. Как видно из таблицы 3, индекс селективности различен для разных солей ГК. Установлено, что ГК и еЭ производные эффективно ингибируют репродукцию ВИЧ-1, причем значение IS для глицирама превышает 50, что указывает на ' перспективность использования этого препарата для лечения ВИЧ-инфекции.

Подавление продукции ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 и цитотокснческий эффект р-глициррязиновой кислоты я её canea

Таблица 3

Наименование т50» CD50, . is

препарата

по активности обратной транскриптазы ВИЧ по вирусному антигену цМ

Й-ГК 170 231 756 4,45

] К-2Ы-соль-0-ГК 178 103 >1193 >6,70

1Ш4-соль-р-ГК 48 <48 2542 53,0

АТК 10 - >1180 >118

AZT 0,0025 0,001 3,5 1400

Одним из основных недостатков Агт является его малая эффективность блокирования репродукции ВИЧ в клетках моноцитов/макрофагов. Вероятно, причиной этого служит низкая активность системы фосфорилирования Агт в макрофагальных-клетках, необходимой для включения препарата в процесс синтеза гровлрусной ДНК. Исходя из этого, было исследовано

противовирусное действие некоторых производных ГК на хронически инфицированной ВИЧ-1 культуре клеток моноцитов (рис.2). Установлено, что при использовании этой модели противовирусное действие некоторых производных превышает эффект AZT - Na-соль ГК Енгкбирует репродукцию ВИЧ-1 более чем на 8Q15, б то время как эффект AZT нэ превышает 50% даке в максимально • высокой концентрации 35 мкй. Таким образом, в отличие от AZI, препараты ПС в значительной степени эффективно подавляют репродукцию ВИЧ как в культурах Т-хелперов, так и в моноцитарных клетках.

В дополнительных экспериментах было проведено изучение ингнбнрующего эффзкта глицирама в сравнении с AZT к 'АТК г зависимости от времени добавления препарата к инфицированным клеткам (табл.4). Для АТК ID50 практически не меняется при добавлении препарата на стадии адсорбции или после адсорбции, что указывает на блокирование этил препаратом зтапа связывания вируса с клеткой.

Лптн-ЕлЧ активность препаратов на различных этапах

равидсеегая шруса

____________Тзблица_4

Соединение Время воздействия препарата на инфицированные ВИЧ—1 клетки, ч С* 1 Z 3 ___ 96 IDjrq, ЦЫ dl1

Глицираы !—! i-1 4E С

AZT г-Н !-i n G,C025

АТК i—I ■ j-:-,, - I 5,2 10,0

О* - препарат внесен в культуру клеток МТ-4 одновременно с

ЩЩ.-а ЕИ-Ь

Рве.2 Днти-ВИЧ активность солей р-глицирризшювой кислоты г культуре клеток.

а -• жизнеспособные ' клетки; Ь - активность обратной транскрштщзы.

1 - контроль клеток без препарата; 2 - клетки с А1Т (10 мкг/мл); 3 - клетки с р-ГК (I мг/мл); 4 - клетки с ■Ша-сольв-р-ГК (I мг/мл); 5 - клетки с Ша-солью-р-ГК (0,5 мг/мл); б - клетки с 1К-2И-солью-р-ГК (I мг/мл); 7 - клетки с 1К-2Ь1-С0ЛЫ>-р-ГК (0,5 мг/мл). По оси абсцисс - препараты в различных концентрациях; по оси ординат (слева) - количество жизнеспособных клеток (млн. клеток/мл); по оси ординат (справа) - активность обратной транскриптазы (Ж от контроля).

- 19 -

Б случае AZT • различия в П>50 достигаю? 2 порядков. Вероятно, ингибирующий эффект AZT при добавлении его на стадии адсорбции и госледувдей смывке клеток обусловлен проникновением за это время препарата в клетки или остаточным!*, количествами, неудаленными при отмывке клеток.

Глицирам в этом случае занимает промежуточное положение -при добавлении этого препарата после этапа адсорбции 1В_0 снижается в 6 раз. Это позволяет предположить, что механизм действия х'лицирама отличается от АТК и связан не только с блокированием связывания ВИЧ с клетками-мишенями, но г. обусловлен другими механизмами. Это косвенно подтверждается данными работы Ito et al. (1988), показавши»,и, что ГК непосредственно блокирует связывание вируса с клеткой в очень высокой концентрации -1,2 Ш глицирризина при инкубации б течение 1 часа только на 25-30% сникают связывание вируса с клзткэлл Г.ГГ-4, в то Бремя как IDgg составляет 0,1 - 0,3 i.í.í. Е связи с ЭТ1Ш следуёт' отметить, что ранее описано противовирусное действие ГК в близких концентрациях (0,5-2,4 fiíJ, ID50 - 0,71мМ) в отношении представителя семейства герпеснирусов - Еируса ветрянки-опоясывакцего лишая (Baba К. and. Shlgeta S., 1987). Ингибирукций эффект ГК в этом случае авторы связывают с ранней стадией вирусной репликации проникновением или раздеванием вируса.

Обнаружив, что разные соли ГК имеют различную эффективность пнгибирования репродукции ВИЧ в клетках МТ-4, а сама ГК не эффективна как ингибитор репликации ВИЧ при хронической инфекции, мы попытались исследовать на анти-ВИЧ активность другие производные ГК, полученные путем химических

модификаций р-глицирризиновой кислоты. В Институте органической химии г. Уфа ранее был разработан препарат ниглизин (пента-О-никотинат р-глицирризиновой кислоты) как противовоспалительное средство. Ш исследовали на анти-ВИЧ активность ниглизин, а также вновь синтезированные, на описанные в литературе, амиды и гликопептиды р-глицирризиновой кислоты. Результаты экспериментов приведены в табл.5,6,7. Анга-ВйЧ активность ниглизиза

__________________Таблица 5____

Наймено- Кон- 0-937 МТ-4 МТ-4 ваыие цент- (ВИЧ-1/ЭВК) (ГКВ 4005) (ВИЧ-2/ГОй) препа- рация--------;--------

рата препа- - Ингиби- йнгябиро— Ингибиро- Ингибиро-

рата рова- Банив на- вание на- вание на-

ниэ НТ, копления копления копления

% вирусного вирусного вирусного

АГ, % АГ, % АГ, %

Ниглизин 1000 66,4+3,2 60,1*4,9 96,6±0,4 91,8±1,1

500 65,9±1,9 61,8+6,6 96,7±0,4 86,8±8,1

з-гк 1000 н/э н/э ЭЭ,3±2,8 н/о

— п — 500 н/э н/э 98,3±5,1 Н/О

Агт. 10 57,4+2,1 55,7±0,4 96,4±0,9 80,1+3,3

н/э - нет эффекта н/о - не определяли

Анти-ВИЧ активность производных р-глицирразишвой кислоты в культуре клаток ИТ-4

_________;_____Таблица 6

Наименование Ю50, цМ ^ 13 препарата

Р-ГК 170 . 231 4,45

ГК + Ь-гистидин 66 380 5,83

ГК ^ Азр(ОМе)., 133 422 3,17

Ниглизин " 26 1479 56,88

— л, 1 -

Влияние производных р-глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток

Таблица 7

Наименование препарата

Кон- Количество цент- живых кле-рация ток, % препарата, мкг/мл

Ингибишвание.

активности вирусной обратной тран-скриптазы

накопления

вирусного

антигена

Азидотимидин 10 . 6,00+2,00 ' 98,08±0,11 94,17+0,32

¡з-гк 1000 11,40+7,60 99,30±0,Ю -

— " — 500 18,20±9,00 98,30±0,20 98,30±0,82

_ и ___ 250 - 96,90±0,20 93,90±0,86

100 26,00+12,10 89,90±5,9С 57,70±0,92

ГК+Ь-ЧЛиОВ^ —. и -. 500 250 12,44±5,53 13,82+4,55 99,35±0,19 99,50±0Д2 98,82+0,11 98,54±0,08

ГК+Ь-Азр(0Ме)2 1000 42,28±Ю,38 95,60±0,77 -

— * — 500 62,91±5,00 97,27+2,68 97,08±0,06

— ** — 250 72,53±0,21 95,31±3,49 95,88л),19

ГК+Ъ-гистидин 1000 8,91±2,94 99,60±0,06 93,44±0,21

_ « — 500 8,23+1,17 99,38+0,28 98,21+0,06

ГК+6-аминоурацил 1000 58,92+3,90 99,30±0,17 94,56±0,15

500 .69,93+2,33 98,18+0,29 88,34±0,25

ГК+6-амино-2-Б-

урацил 1000 25,11+1,39 99,10±0,28 95,26+0, зг.

_ п 500 47,52±9,84 85,66±7,18 53,35±1.04

ГК+И-у-Ь-Уа! (ОМе) 1000 9,83+5,48 98,93+0,10 -

500 11,94±2,17 98,83+0,07 98,21±0,05

— « _ 250 20,17±5,П 98,89+0,07 98,08+0,07

_ _ 100 22,96+11,33 98,06±0,23 -

Конроль (неин-фивдрованные клетки МТ-4) 38', 49+3,68

Контроль (инфицированные ВИЧ клетки МТ-4) 35,49+2,35 0 0

- 22 -

Как показали эксперименты, все исследованные производные ГК обладают анти-ВИЧ активностью. Ниглизин эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-I и ВИЧ-2.В культуре клеток МТ-4 и более эффективен по сравнению с AZT в культуре хронически инфицированных клеток (табл.5). Среди изученных производных ГК он имеет самый высокий индекс селективности -56,88 (табл.6). ГК + Gly-L-Val(ОМе) высоко эффективен даже в концентрации 100 мкг/мл, а ГК + Азр(0Ме)2, ГК + 6-аминоурацил в исследованных концентрациях предохраняют клетки от гибели вследствии инфекции (табл.7). Таким образом, наши эксперименты показали перспективность дальнейшего поиска эффективных ингибиторов репликации ВИЧ в группе производных р-глицирризиновой кислоты.

Изучение анти-ВИЧ активности сложных зфиров изоборнеола.

Нами была изучена анти-ВИЧ активность мембраноактивного препарата - энциклана, обладающего противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа А,В,С, клещевого энцефалита. Энциклан был синтезирован в Уральском Политехническом Институте, г. Екатеринбуг. В параллельных экспериментах было установлено, что. энциклан в концентрациях до. 40 мкМ, добавленный к очищенному препарату ВИЧ, не влияет на активность обратной транскриптазы. Это показывает, что анти-ВИЧ эффект энциклана не связан с блокированием обратной транскриптазы и отличается от механизма действия AZT.

Поскольку энциклан представляет собой соединение, состоящее из гидрофобного остатка изоборнилового эфира ацетоуксусной кислоты и гидрофильного (гетероциклического)

остатка, были предприняты попытки определить анти-В}!-активность кавдого из .компонентов энциклана, -а также изоборнеола, являщегося компонентом пихтового масла к служащего исходным сырьем для получения изоборнилового эфира ацетоуксусной кислоты ( Рис.3).

Gta I знцикл

ан

.Ьч

ГО

ir

I

ЕКС

II N -МетилхиноксвлиниЙ йодид

С

II

HoC-0-GHE-C-O-

НоС^ ^СНо

ИвСч, ^СНо •^¿fc?

tf сн0

IV Изобошеол

III Изоборниловый эфкр

ацетоуксусной кислоты .

Рис. 3 Структурные формулы исследованных химических соединений.

В таблице 8 приведены полученные результаты по определений количественных характеристик ингибирования активности обратной транифиптазы ВИЧ-I этими соединениями. Установлено, что изоборниловый эфир ацетоуксусной кислоты обладает выраженным ингибируппим эффектом на репродукции ВИЧ, сравнимым с эффектом энциклана (П>50 - 0,1 цМ, IS - 130). Следует подчеркнуть, что в отличие от этого, подавление размножения ВИЧ изоборнеолом не

превышает 50% даае в концентрации 5 мкг/мл. Гидрофильный фрагмент энциклана также обладает незначительным анти-ВИЧ эффектом (IS - 2,4). Таким образом, полученные данные позволяют сделать предположение о том, что активным началом энциклана служит изоборниловый эфир. Тем не менее, при сравнении значений IDgQ - концентраций препаратов, вызывающих 90% ингибируюший эффект, выявляются отчетливые различия между энцикланом и изоборниловым эфиром ацетоуксусной кислоты (Табл. 8). В связи с этим необходимо отметить, что введение химических модификаций может определять проявление анти-ВИЧ активности ряда соединений - так, АТК относится к наиболее активным анти-ВИЧ препаратам (IS - 118, IDgQ - 10 мкМ), в то время как аурин не оказывает влияния.на размножение ВИЧ (Baizarini J., et al., 1989).

Анти-ВИЧ активность энциклана и исходных компонентов для . его синтеза

Таблица 8

Исследуемое ^50' IB90. С%0' IS

соединение, (IM ЦМ (IM

т 0,16 1,6 21,5 136,7

II 15,93 21,68 38,94 2,4

III 0,365 33,58 47,45 130,0

IV >65 ' >65 >130

Кроме того, нами была изучена анти-ВИЧ-2 активность энциклана. Было показано, что энциклан эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-2 в концентрациях, превышающих 0,5 мкг/мл. При определении количественных характеристик ингибирования накопления вирусного антигена оказалось, ' что энциклан более,

чем па порядок эффективнее в отношении ВИЧ-1 (1В50=0,053 к 13=405,7) по сравнению с ВИЧ-2 (1Б50=2,0Э Е 15=10,29).

Таим образом, приведенные нами результаты показывают открытие принципиально нового класса химических соединений, обладающих выраженной анти-ВИЧ активностью и высокой селективность!) - кзоборниловые зфиры. Перспективным, на наш взгляд, представляется поиск и изучение анти-ВИЧ эффекта других препаратов этого ряда, что, вероятно, позволит получить данные о-механизме их действия.

Изучонзз енгн-Е-14 активности шткядгслоЕЫХ олЕГонукластздсв.

' Исследования, выполненные в последние года, свидетельству!)-! о чрезвычайной перспективности антпсмысловых олигонуклеотидов как потенциальных противовирусных препаратов нового поколения, направленных на определенные уникальны? последовательности вирусных нуклеиновых кислот и не оказывающих побочного действия на нормальные, клетки. В настоящее время исследования в области конструирования противовирусных производных олигонуклеотидов направлены б основном Е£ разработку препаратов для терапии СПИД, в связи с: исключительной актуальностью создания средств лечения этого заболевания. К настоящему времени в литературе списано ингибирование размножения ВИЧ-1 в культуре клеток олигонуклеотпдаии, комплементарными, различным функциональным участкам (+)цепи РНК вируса. Однако (-)цепь вкусной РНК также монет кодировать белки. В этой связи представлялось интересным сравнить эффективность подавления размножения ВИЧ-1 в культуре

клеток олигонуклеотидами, комплементарными (+) и (-) цепям РНК вируса.

В качестве антисмысловых олигонуклеотидов были выбраны олигонуклеотиды, комплементарные донорному сайту сплайсинга (нуклеотиды 278-299 (Ratner et al., 1985), структура олигонуклеотида pTGGCGTACTCACCAGTCGCCGC -ДСС-22 И ПОЛИ(А) последовательности мРНК (ртттТТТТТТТТТТТТТ - ПА-16), ранее показавше высокую анти-ВИЧ активность (Agrawal et al., ■ 1989), олигонуклеотид pCTCCGCTTCT (REV-10), комплементарный началу гена rev (рис.4). В кзчестве олигонуклеотида, комплементарного (-)цепи РНК, наш была выбрана последовательность pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA (РМ-20), комплементарная области начала трансляции предсказанной Роджером Миллером в 1988 году открытой рамки считывания на (+) цепи ДНК ВИЧ-I (нуклеотиды 7516-7535) . Кроме того, была исследована анти-ВИЧ активность олигонуклеотида pCGTAGTTCGTCGAGGTCCGT (МР-20) комплементарного РМ-20 (рис.4). В качестве контрольного олигонуклеотида использовали олигонуклеотид структуры pOTGAAACCCGAGAACATCAT (Гоз), комплементарный началу мРНК гена c-fos мыши.

Олигонуклеотиды были синтезированы в Новосибирском Институте биоорганической химии СО РАН гомогенным фосфотриэфирным методом, как описано Абрамовой с соавторами, 1990. Препараты, использовавшиеся в экспериментах, были гомогенны по данным электрофореза (чистота не менее 95%). Структура олигонуклеотидов подтверждалась результатами секвэнирования по методу Максама-Гилберта.

Полученные экспериментальные данные (табл.9) показывают высокую противовирусную активность олигонуклеотида РМ-20,

tat

gag

rev

pi7 р24

р15

vif

MR

prot

pol

endl □ трг

рСТООГ.ТГСЬЛКУ-Ю

tat

env CT120 lCT4t

net

LTR

V-

pTGCCrrcCÀGCTGCTrCATGC=MP-20

УП8

pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA=FM-20

Рис.4 Cxeua локчдиягщи« :i¡?. raice ВИЧ-I использованных олигонуцлеотидов.

'значительно превышающую эффект олигонуклеотидов, использованных ранее в других лабораториях Учитывая данные о неспецифическом действии антисмысловых олигонуклеотидов на размножение ВИЧ (Мозег, Бегуап, 1987; Ро7з1с, Бегтап, 1989), нами для изучения специфичности анти-ВИЧ эффекта были использованы различные штаммы ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Специфичность действия исследованных олигонуклеотидов подтверждается результатами экспериментов с ВИЧ-2: препараты, обладающие выраженным ингибиторным эффектом для ВЙЧ-1, оказывают меньшее действие на .'репродукцию ВИЧ-2 (табл.9). При анализе структуры вирусных генов ВИЧ-2 было установлено, что гомология препаратов ДСС-22 и РМ-20 с соотввствукщьи нуклеотидными последовательностями в ВИЧ-2 составляет менее 30%. Что касается олигонуклвотида ПД-16, то его противовирусная активность также значительно ниже для ВИЧ-2. Эти данные позволяют предположить, что эффект этого олигонуклвотида связан не только с его взаимодействием с поли А последовательностями тРНК, как предполагалось ранее (А§гаша1, 1988). Пря анализа первичной структуры ВИЧ-1 было установлено, что в области гена епт "(5740-5753, 7702-7717) локализованы кластера пода А, отсутствующие в геноме ВИЧ-2. Это дает возможность предположить, что анти-ВИЧ активность этого олягояувлвотйда связана в большей степени с блокированием этапа трансляция шРНК епу за счет его взаимодействия с тРНК.

Высокая анти-ВИЧ активность антисмысловых олигонуклеотидов показана в ряде работ. Более высокую эффективность о*шгонуклеотида МР-20 по сравнению с олигонуклеотидамп, списанными в этих работах, можно, вероятно, объяснить удачным выбором структуры мишени.

ИЕГЗбнрованиэ репродукции различных станмоз БИЧ антиснысловыш олигонуклеотидаш

Таблица 3

Наишновайие Концентрация, Ингибирование, %

препарата |лМ ГКВ 4005 ГКВ 4046 ВИЧ-2/гой

ИТ АГ нт нг АГ

сССАТСААССАССТССАСССА 5 98 97 95 39 64

(РМ-20 ) ч 37 94 97 ' - -

ОТС-СССТАСТСАССАаТТОСССС 10 94 - - 39 _

(ДСО-22) 5 68 - - 40 -

13 19 - 2 -

рТТТТТТТТТТТТТТТТ 10 63 83 - 40 -

(ПА-16) I 6 8 - . 22 -

рТТСАААССССАСААСАТОАТ 10 50 - - - -

(Гоа) т 24 13 - - -

лгт о, ,35 97 95 97 " • 98 99

без препарата - 0 0 0 0 0

В таблице приведены средние данные 3-6 экспериментов

Высокая эффективность смыслового олигонуклеотида РМ-20 может быть объяснена его эффективным действием на нескольких этапах развития-вируса: 1) блокирует инициацию трансляции за счет взаимодействия с тРНК гена тпе, описанного Миллером, если он - функционирующий ген. Эффективность этого процесса может быть особенно высока, поскольку участок, комплементарный этому олигонуклеотиду, соответствует сайту инициации трансляции ш?НК гэна тпе и локализуется а выпетленном районе вторичной ;структуры,тРЕК (Предсказание вторичной структуры РНК . было

выполнено с помощью программы "PCFOLD" (ZuKer, Stiegler, 198:; Jacobson et al., 1984). 2) Олигонуклеотид ингиоируе? транскрипцию с геномной ДНК . mPHK . env; 3) За счет егс взаимодействия с (-)цепью ДНК возможно блокирование синтеза (+)цепи ДНК вируса. 4) Олигонуклеотид может ингиоировать процесс репликации вирусной (геномной) FHK на этапе ее синтеза с ДНК матрицы.

Олигонуклеотид РМ-20 оказывает также выраженный ингибирупций эффект на репродукцию выделенного от инфицированного человека штамма ВИЧ-1 * 1 (ГКВ 4046). Компьютерный анализ этого района 47 различных штаммов ВИЧ-1 показал, что участок, к которому комплементарен олигонуклеотид РМ-20, является консервативным для всех, известных штаммов ВИЧ-1 (не более 1-2 замен).

Контрольный олигонуклеотид los,.хотя и в меньшей степени, также оказывал ингибирунцее -действие на размножение вируса, однако абсолютно не . защищал клетки от гибели. Но так как контрольный олигонуклеотид не -имеет совершенных участков связывания с РНК ВИЧ-1, объяснение его -противовирусной активности взаимодействием с генетическим / материалом -вирусе представляется.маловероятным. Анализ.опубликованных данных по действию олигонуклеотидов и их .аналогов на репродукцию ВИЧ-1 приводит к заключению, что, . по-видимому, ^имеется несколько механизмов подавления вирусной инфекции, олигонуклеотидами, и в ряде случаев ведущим из.них оказывается механизм, не связанный с образованием совершенных комплементарных комплексов. Так, отмечена относительно высокая противовирусная активность гомоолигонукЛеотидов (Agrawal et al., 1988), а в случае

- зг -

фосфотиоатных аналогов гомоолигонуклеотид (олигоцитидилат) оказался самым активным (А5гаиа1 ег а1., 1988; Магзикига ег а!., 1987). В таблице 10 приведены результаты экспериментов по определению количественных характеристик ингибирования репродукции- ВИЧ-1 для некоторых антисмысловых олигонуклеотидов. Для сравнения.использовали.один из наиболее эффективных для лечения ВИЧ-инфекции препаратов - азидотимидин. Как видно из таблицы 10 индекс селективности существенно отличается для разных антисмысловых олигонуклеотидов. Наибольшим 1Б характеризуются олигонуклеотиды РМ-20 и комплементарный ему МРГ20 - 13 до 500.

Эффективность анти-БИЧ действия антисмысловых

олигонуклеотидов

' ■ Таблица Ю

Ингибитор 1В50' С%0'

цЫ ДО

рССАТСААССАССТССАСССД 0,5 >50 >100

(РМ-20)

рССТАСТТССТССАССТСССТ. 0,1. >50 >500

(МР-20)

рТОСССТАСТСАССАСТССССОС 4,7 >50 >10,6

(ДСС-22)

рТТТТТТТТТТТТТТТТ 8,0 >50 >6,3

(ПА—16)

АЙТ 0,0025 3,5 1400

Таким-образом, результаты экспериментов с использованием модели, инфицированных ВИЧ клеток позволили найти перспективные алигонуклвотиды с высоким значением 15, уступающим только препаратам группы А2Т.

- 32- - у

Но, как известно, обычные олигонуклеотиды плохо проникают в клетку и подвержены деградации под действием клеточных куклеаз, что ограничивает их. использование для лечения СПИД. В настоящее время интенсивно ведутся работы по конструированию аналогов слигонуклеотидов с измененным рибозсфосфатшм остовом (фосфонаты и фосфоротиоаты), которые легко.проникают в клетки и устойчивы по отношению г. гидролизущим нуклеиновые кислоты ферментам (Аегата1 8. ех а1., 1988, 1989; Магаикига П. а1., 1939). Недостатками таких .производных как потенциальных терапевтических препаратов являются их более высокая, по сравнению с обычными олигонуклеотидамк, стоимость и отсутствие на сегодняшний день методов получения их в виде чистых стере¿изомерных продуктов, что приводит к току, что получаемые препараты содержат лишь неболылое количество активных компонент, образующих прочные комплементарные комплексы. В связи с этим большое значение • имеет создание противовирусных производных на основе обычных олигонуклеоткдов, синтез которых является более доступным, путем совершенствования структуры олигонуклэотидов.' Поэтому мы изучали возможность увеличения ингнбирующой активности исследованных наг,® 'олитонуклестидов путем введения в 5!-положение молекулы химических модификаций, облегчающих попадание олигонуклеотидов в клетку. Нашими коллегами из Института биоорганической химии были синтезированы производные олигонуклеотидов, несущие на 5*-конце алифатические остатки различной длины либо остаток холестерина. Алифатические остатки длиной 18, 16 и 15 атомов углерода присоединяли к 5'-концу олигонуклеотидов через фосфамидную связь либо напрямую, либо используя в качестве спейсера аминоуксусную

кислоту и пропилендиамин (соответственно а.Ь.с на рис.5). Остаток холестерина (й) присоединяли, используя в качестзе спейсера аминоуксусную кислоту. Полученные соединения были

ч

охарактеризованы с помощью обращеннофазовой хроматографий и электрофореза в полиакриламидном геле.

а

Ь с

d

НдС СНд

Рис.5 Структура алифатических остатков« остатка холестерина.

Как и ожидалось, присоединение гидрофобных остатков зущественно увеличивает связывание олигонуклеотидов с клетками (табл.П).(В таблице приведены значения связывания для элигонуклеотида только до 30 минут, так как при более длительной инкубации происходит полная деградация »модифицированного олигонуклеотида. В то же время до 50% элигонуклеотидов с модифицированными 5'-концами существуют в

-МЫСНЯ)А7СНЯ

о

-НН-СНя-С-СН (СНа)15сна

а

-ЮЬ(СНЯ) -НН-С-(СНя) СНа

а 14

а _

» j Í J ^ /

клетке и в среде в не деградированном виде - данные не

приведены).

Связывание производныхолигонукяеотидов с клетками МТ-4

Таблице II

Производные олигонукле- СТЕДОЕ Связывание с клетками (¡6)

(РЕ)»* 5 мин. 0.2 30 мин. 0.1 90 мин. 0.1 6 ч. 18 ч.

а-(рТ)1е 0.3 0.4 0.6 1.1 -

0.2 0.3 0.3 0.6 -

с-(рТ)1в 0.3 О.б 1.5 . 3.7 -

<мрт)ав - 5.7 9.4 14.9 19.0

Интересно отметить, что прямой корреляции мевду длиной алифатической цепи и связыванием -производных, с клетками нет. По-видимому, существенным для связывания является природа спейсерной группы мевду -гидрофобной группировкой и олигонуклеотидом. Так, соединение с, имевдее 15 атомов углерода в алифатической цепи, связывается с клетками в 3 - 4 раза лучше, чем соединения а и Ь, имехдае большее количество атомов углерода в алифатической цепи. Возможно, что на лучшее связывание с клетками соединения а оказывает влияние сходство амидной связи с пептидной.

Полученные экспериментальные данные по ингибированию размножения ВИЧ-1 в культуре клеток (табл.12) показывают высокую противовирусную активность производных олигонуклеотидов, значительно . превышающую аффект ^модифицированных олигонуклеотидов. Следует отметить, что

Янгибирование репродукции ВИЧ-1 производными олягонуклаотидов в культуре клеток МТ-4

Таблица 12

Кон

Янгибирование, %

Олиго-нукле-отид цен тра ция |1М 0 а ь с

И1 М2 МЗ М4 М1 М2 МЗ ы М1 М2 МЗ М4 М1 М2 МЗ М4 М1 М2 МЗ|М4)

МР-20 5 34 62 31 29 0 95 87 86 0 29 га 21 89 аг 70 7й 62 91 87 661

2.5 б 41 15 16 12 53 24 31 12 32 24 12 14 41 17 25 90 91 89 831

0.5 32 43 34 21 0 41 7 15 19 33 0 4 0 гз 0 13 16 46 0 33

РМ-20 5 0 47 го 19 0 70 50 59 0 44 21 13 51 59 29 45 0 93 86 88

2.5 0 52 13 13 0 43 0 12 0 36 20 5 12 68 0 27 63 90 88 87

1 0.5 0 57 29 9 0 27 0 5 0 30 13 3 0 23 0 0 76 63 43 57 (

ПД-16 5 0 59 24 41 29 га 7 9 АЗ 34 7 11 70 60 21 36 81 88 86 81 |

2.5 0 59 7 23 15 30 15 б 13 39 27 г 39 33 С 0 63 86 79 77«

0.5 0 52 0 11, 0 9 15 2 22 5 17 0 за 13 0 0 0 17 1Г., 01

108 5 0 94 73 67 0 — 58 б 0 '15 0 13 0 17 — — 0 27 24 01

г.5 0 50 гз 16 0 28 0 — 0 18 0 10 0 25 — — 0 13 12 г"

0.5 0 19 0 5 0 0 0 — 0 1 1 — 3 0 21 — — 0 13 1 6 0|

КВ7-10 5 0 23 0 6 56 62 34 30 0 81 0 а 62 85 66 67 28 91 85 79 |

2.5 0 17 — 5 0 28 19 1 1 0 17 0 0 •о 36 0 6 59 90 83 79|

„ 0.5 0 7 0 2 0 0 0 О 0 9 0 — 0 11 0 0 0 7 0 0|

М1-М4 - параметры, по которым оценивалась противовирусная активность производных олигонуклеотидов (М1 - увеличение жизнеспособности клеток; М2 - подавление активности обратной транскриптазы; МЗ - уменьшение суммарного вирусного антигена; М4 - уменьшение антигена р24). Использовались производные следующих олигонуклеотидов: МР-20 - рТСССТССАССТССТТСАТиб; РМ-20 - рССАТСААССАССТССАСССА; РОБ - рТТСААДССССАСААСАТСАТ; ЙЕ7-Ю - рСТССССТТСТ; СХЗозначение производных а,Ь,с,<1 - как на рис.5; о - шмодифицированный олигонуклеотид.

абсолютные значения ингиоирования размножения вируса могут отличаться в разных сериях экспериментов/ что может оыть связано с нуклеазной активность сыворотки и/или неконтролируемыми изменениями в состоянии клеток и вируса. Однако внутри одной серии экспериментов отклонение выбранных параметров от средних не превышает 5 - 10%. Представленные в табл. 12 значения представляют собой среднее из трех повторов в одной серии экспериментов. В качестве параметров, по которым следили за ингибированием размножения вируса, мы выбрали I) увеличение жизнеспособности клеток (так, если для незараженных клеток жизнеспособность составила 90 ~ 5%, а для зараженных -25 ± 3%, то увеличение жизнеспособности клеток измеряли как

х-35

у = - * 100,

90-35

где х - жизнеспособность клеток при данной концентрации производного олигонуклеотида; 2) подавление активности обратной транскриптазы; 3) уменьшение . суммарного вирусного антигена; уменьшение.антигена р24. Как видно из таблицы 12,' результаты этих измерений для производных олигонуклеотидов достаточно хорошо согласуются между собой.

^модифицированные олигонуклеотида оказывают влияние главным образом на активность обратной транскриптазы, причем это действие примерно одинаково для контрольного и опытных олигонуклеотидов. В то же время подавление суммарного антигена и антигена р24 составляет лишь 5 - 30%%, а небольшое увеличение жизнеспособности; происходит лишь в случае олигонуклеотида МР-20. Немодифи i дарованный олигонуклеотид длиной 10 (EEV-10) практически не влияет на все четыре показателя (табл.12).

- 37 -

Противовирусная активность производных

контрольного олигонуклеотвда значительно нижа, чем у

_ \

немодифицированного (таблЛ2). Во всех остальных случаях

противовирусная активность производных антисмысловых

олигонуклеотидов коррелирует с их способностью связываться с

метками (табл.II и табл.12). Крайний случай этой

закономерности проявляется на примере олигонуклеотвда RE7-10 -

зротивовирусную активность проявляют только холестериновые

1роизводныэ этого короткого олигонуклеотвда и лишь при

«шцентрациа 2,5 - 5 мкМ. Наилучшей противовирусной

активностью, так та как я в случае немодкфицированнкх

)лигонуклеотидов, обладают производные олигонуклеотидов ИЛ-20 л

JP-20.

Как следует • из табл.12, наибольшее противовирусное ¡ействие оказывают производные холестерина. Эти данные !оотв0*гствуют исследованиям Letalnger (1989) по увеличению сротивовирусной активности холестериновых производных нтисМыслоеых олигонуклеотидов,' однако в этих работах :спользовались другие способы пришивки остатка холестерина к лигонуклеотиду. Увеличение аяти-ВИЧ активности также роисходило при пришивке остатка холестерина к фосфоротиатному налогу гомоолигонуклвотида йСЮ Stein (1991). В настоящей аботе противовирусный эффект производных контрольного лигонуклеотида POS-га минимален (табл.12), что расходится 'о энными об увеличении сиквенс-неспецифического действия эсфоротиатных производных олигонуклеотидов (Stein,1991).

Результаты проведенной работы по изучению анти-ВИЧ эффекта адрофобных производных олигонуклеотидов показали высокую

избирательность выбранных препаратов. Отсутствие токсического эффекта и низкие концентрации, при которых работают холестериновые производные позволяет отнести эти препараты к переспективным анти-ВИЧ соединениям.

Изучение анти-ВЙЧ действия различных препаратов в комбинации с AZI

Существенной характеристикой препаратов с анти-ВИЧ активностью слукит возможность их использования совместно с AZI. Следует отметить, что AZT и его аналоги являются основой апти-ВИЧ терапии, как препараты с высокими - индексами селективности - до 2000. Среди других групп препаратов значения IS. как правило, не превышают 100, за исключением TIB0 производных (Pauwels et al., 1990). Учитывая это, мы считали необходимым также оценивать исследуемые препараты на возможность их совместного использования с AZI. Более того, этот подход может быть перспективен для разработки комплексной терашш СПИД, особенно с использованием комбинации препаратов с различными механизмами действия, которые могут дополнять друг друга, воздействуя на разные этапы репродукции ВИЧ.

Результаты экспериментов с использованием модели хронически инфицированных ВИЧ-I моноцитов человека покезали, что несмотря на неэффективность ГК.в этой культуре клеток, в комбинации с AZT ГК ингибирует размножение вируса в ней на 89,6% (табл.13). На модели первично инфицированных ВЙЧ-1 клеток МТ-4 мы экспериментально показали, что глицирам (препарат на основе ГК) не является антагонистом AZT, так как комбинационный индекс FIC для смеси Д£Т;глицирам = 1:10000, определенный

- 39 -

согласно (Allen et al.» 1989) и рассчитываемый по формуле:

IDcq А в смеси П)^а В в смеси П)50 А + И50 В

завен 1,55. Таким образом, по этому параметру ГК также мокно зтнести к перспективным анти-ВИЧ препаратам.

Сочетанное действие препаратов с различным механизмом действия на репродукция ВНЧ-1 п хронически инфицированной культуре клеток

Таблщз 13

рэпарат Концентрация препарата, Ингибипованиэ

мкг/мл * обратной

транскриптазы вируса, %

Z1 10 5Í,7±T,7

К - I0C0 Н/э

ZT+ГК. 10+1000 89,6+1,4

авдклан 20 ' 12,4±4,2

гт+энциклан 10+20 87,3±0,7

Результаты экспериментов с использованием модели гонически инфицированных ВИЧ-1 . моноцитов человека »демонстрировали низкую эффективность эндаклана (табл.13), (нако, в комбинации с AZT энциклан ингибирует репродукцию [руса на 86*. Этот факт дает возможность предположить наличие нергетического анти-ВИЧ действия этих соединений. Результаты i изучению ингибирутоего действия комбинаций энциклана с AZT в

инфицированных ВИЧ-1 клетках ЫТ-4 так ке свидетельствуют о перспективности использования таких комбинаций' (табл.14).

Что касается ауринтрикарбоновой кислоты, то в комбинации с А2Т или с глицирамом ее эффективность в отношении ВИЧ несколько возрастает (табл.14). При определении комбинационного индекса в смэск Агт:АТК=1:200 оказалось, что он равен 1,53 и, следовательно, эти препараты не являются антагонистами.

Кнгибнрование репродукции ВИЧ-1 в культуре клеток КП-4 комбинациями наиболее аффективных препаратов с

' Таблица 14

Препараты и" 'ИХ комбинации Концентрация, Ингибирование активности обратной транскршггазы, %

Ш 0.01 26.9±0.9

_ К — 0.05 92.0+1.3

Знцпшшн 0.06 46.1+0.5

ЭНЦ2КЛ2В + кЪЧ 0.06 + 0.01 93.5+0.2

Знцнклан + дгТ 0.06 + 0.05 96.4+0.3

АТК 5.0 84.6+0.Т

АТК+ лгт 5.0 + 0.01 91.6+0.3

кТК+ А2Т 5.0 + 0.05 93.8±0.2

Глнцараы 50.0 69.4±0.8

Глицирам + МК 50.0 + 5.0. 95.5±0.3

Глицираи + АйТ 50.0 + 0.01 99.1+0.2

\

- 41 -

шводы

1. Изучена анти-ВИЧ активность р-глицирризиновой кислоты и различных ее производных. Показана анти-ВИЧ активность гликопептидов и амидов р-глицирризиновой кислоты, ниглизина (пента-о-никотинат p-глицирризиновой кислоты). Показано, что производные р-глицирризиновой кислоты эффективно ингибируют репродукцию ВИЧ-I в хронически инфицированной ВИЧ-I культуре клеток моноцитов человека.

2. Установлена способность нового класса химических соединений - изоборниловые эфиры (энциклан) - ингибировать репродукцию как ВИЧ-I-, так и ВИЧ-2 в культуре клеток - (IS - 406 и 10. соответственно).

3. Показана высокая противовирусная активность и специфичность анти-ВИЧ-I действия олигонуклеотидов FM-20 pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA, комплементарного области. начала трансляции открытой рамки считывания (+) цепи ДНК ВИЧ-I, и MF-2Q - pTGCCTGGAGCTGCTTGATGC, комплементарного олигонуклеотиду РМ-20, (IDgg - 0,5 мкМ и 0,1 мкМ,-соответственно).

4. На примере уже известных антисмысловых .. олигонуклеотидов -ингибиторов ВИЧ-I и новых олигонуклеотидов FM-20 и MP-2G показано, что присоединение к 5'-концевым фосфатам олигонуклеотидов алифатических аминов или остатков холестерина, приводит к существенному повышению эффективности ингибирования ими репродукции ВИЧ■ и обеспечивает в значительной степени защиту Т-хелперов от цитопатического действия вируса.

5. Изучена анти-ВИЧ эффективность комбинаций AZT с препарата™ с другими механизмами действия с использованием хронически инфицированных ВИЧ-I моноцитов человека и Т-хелперов.

Установлено, что энцнклан, глицпрам и ауринтрикарбоновая

кислота не являются антагонистами AZT.

РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЩЕ РАБОТАХ:

1. Абрамова Т.В., Блинов В.М., Власов В.В., Горн В.В., Зарытова В.Ф., Иванова Е.Ы., Коневец Д.А., Плясунова О.А?, Покровский А.Г., Сандахчиев Л.С., Свинарчук Ф.П., Старостин Б.П., Чаплыгина С.Р. Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека .в культуре клеток производными антисмысловых олигонуклеотидов // Докл. АН СССР. 1990. Т.312. Л 5. С. 1259-1262.

2. Abramova T.V., Bllnov V.E., Vlassov V.V., Gorn V.V., Zarytova V.F., Ivanova Е.Ы., Konevets Б.А., Plyasunova O.A., Pokrovsky A.G. Anti-HIV actlvlty o! tfae antlsense ollgonucleotlcles bearing lipophllic.snd alfcylatlng groups at the 5'- termlnus // Hucleosid.es & Hucleotldes. 1991. V. 10(1-3). P. 419-422.

3. Мамаевв O.A., Плясукова. O.A., Проняева Т.Р., Покровский А.Г., Ткачев В.К., Карамов Э.В., Руднева И.А. Особенности длительного непрерывного культивирования линии клеток, хронически инфицированной вирусом иммунодефицита человека I типа //Вопросы вирусологии. 1991. -JS 6. С. 447-450.

4. Плясунова O.A., Егоричева И.Н., Федюк Н.В., Покровский А.Г., Балтина Л.А., Муринов Ю.И., Толстиков Г.А. Изучение анти-ВИЧ активности ß-глицирризиновой кислоты //Вопросы вирусологии. 1992. й о. С. 25-38.

5. Покровский А.Г., Плясунова O.A., Сандахчиев Л.С., Киселев O.K., Чупахин 0._Н., Чарушин В.Н., Понизовский М.Г., Дубур

- 43 -

Г.Я., Бисениекс Э.А. Анти-ВИЧ активность слокных эфяроз изоборнеола // Докл. РАН. 1992. (з печати)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ ЗАЩИЩЕНЫ АВТОРСКИМИ СБИДЕТЕЛЬСТВМЯ:

6. Покровский А.Г., ПлясуноЕа O.A., Толстиков Г.А., Балтина I.A., Муринов Ю.И. Ингибитор размножения вируса иммунодефицита человека // Заявка на A.c. СССР в 489792/14-124380, положительное решение от 09.03.91.

7. БалтинаЛ.А., Покровский А.Г., Плясунова O.A., Толстиков Г.А. Амид ß-глицирризиновой кислоты с 6-амино-2-тио-урацидом, проявляший антй-СПИД активность // Заявка на A.c. СССР .'5 4916058/04, положительное решение от 10.01.92.

3. Балтина Л.А., Покровский А.Г., Плясунова O.A., Толстиков Г.А. Амид ß-глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром Ъ-гистидина, проявляющий янти-СПИД активность // Заявка на A.c. СССР № 4915764/04, положительное решение от 03.01.92.

3. Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Покровский' А.Г., Плясунова O.A., Сандахчиев'Л.С. Гликопестид ß-глицирризиновой кислоты с дибутиловым эфиром L-глутаминовой кислоты, проявляющий анти-ОВД активность // Заявка на A.c. СССР £ 4916056/04, полозштельное решение от 03.01.92.

'.О. Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Покровский А.Г., Плясунова O.A., Муринов Ю.И., Сандахчиев Л.С- Амид ß-глицирризиновой кислоты с 6-аминоурацшюм, проязляядай анти-СШЩ активность // Заявка на A.c. СССР Я 4916055/04, положительное решение от С3.01.Э2.

I. Налгана Л.А.,Покровский А.Г., Плясунова O.A., Толстиков

- 44 -

Г.А. Гликопептвд р-глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром глицил-Ь-валина, проявляющий анти-СЩД активность // Заявка на A.c. СССР X 4915763/04, положительное решение от 03.01.92.

12. Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Покровский А.Г., Плясуновв O.A., Муринов Ю.И. Гликопептид р-глицирризиновой кислоты с диметиловым эфиром Ь-аспарагиновой кислоты, проявляющий анти-СПИД активность // Заявка на A.c. СССР * 4915765/04, положительное решение от 03.01.92.

13. Покровский а.Г., Плясунова O.A., Блинов в.м., Киселев О.И., Петрова Г.М., Чупахин О.Н., Чарушин в.К., Понизовский М.Г., ДуОур Г.я., Бисениекс э.а., Улдрикис я.Р. Применение изоборнилового эфира 2,9-диметил - За,4,9,9а тетрагидрофуро - L2,3-bl - хиноксалин- 3-карбоновой кислоты (энциклана) как ингибитора размножения вируса иммунодефицита человека (вич)// Заявка на A.c. СССР * 4903830/14, положительное решение от.22.06.92.

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ:

14. PokrovsKy A.G,,Elyasunova 0.,Yastrebova 0..Chaplygina S.Comparlson оГ varlaus drugs eriect on HIV reproduction on primary and chronlcalli Iniected cell llnes. - Abstracts ol .tue Slxth. international .conlerence on AIDS, San Francisco. USA. 1990 (20-24 June).P.112.

15. Балтина Л.А., Зиновьева С.А., Сахаутдинова Г.М., Покровский А.Г., Плясунова O.A., Толстиков Г. А. Гликопептиды глицирризиновой кислоты - новый класс иммуномодуляторов и

анти-ВИЧ агентов. -Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Химия природных низкомолекулярных биорегуляторов", Ереван.1990 (29 октября-I ноября).С.84.

16. PokrovsRy A.G., Plyasunova О.А., Bllnov V.M., Abramova T.V.,. Svinarchuk P.P., Vlassov V.V. Specificity of anti-HIV action of antisense oligonucleotides on different HIV strains. - Abstracts of the International Conference on Nucleic Acid Therapeutics, Florida. USA. 1991 (13-17 January). J.80.

17. Пдясунова O.A., Покровский А.Г., Блинов B.M., Власов В.В., Сшаарчук Ф.П., Абрамова Т.В., Горн В.В., Коневец Д.А. Изучение специфичности анти-ВИЧ действия антисмысловых олйгонуклеотидов на разные штаммы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). -Тезисы докладов IX Всесоюзного симпозиума по целенаправленному изысканию лекарственных средств, Рига.' 1991 (22-24 января).С.3.

18. Покровский А.Г., Плясукова О.А., Русаков И.А., Балтина Л. А., Муринов . Ю.И., Толстяков Г.А. Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в культуре клеток продуктами экстракции корня солодки и производными р-глицирризиновой кислоты. -Тезисы докладов IX Всесоюзного симпозиума по целенаправленному изысканию лекарственных средств, Рига. 1991 (22-24 января).0.54.

19. Pokrovsky A.G., Plyasunova О.А., Sandahchlev L.S. Perspectives for therapy of HIV Infection by drugs with different mechanisms of action. - Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of

- 46 -

diagnostics and. therapy or AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.11.

20. Abramova T, Bllnov V., Vlassov V., Corn V., Zarytova V., Ivanova E., Konevets D., Plyasunova 0., Pokrovsky A., Sandahchlev L4, Svlnarchuk P., Starostln V., Chapllglna S.Speciriclty of HIV inhibition by modiried ¿ntlsense olygonucleotides.- Abstracts or the International Conrerence on molecular biology aspects or diagnostics and therapy or AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).?.8.

21. Plyasunova O.A., Pokrovsky A.G., Rusakov I.A., Baltlna L.A., Murlnov Y.I., Tolstlkov G.A. Inhibition or human lmmunodericlency virus (HIV) reproduction in cell cultures by glycyrrhlslc acid. - Abstracts or the International Conrerence on molecular biology aspects or diagnostics and therapy or AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.15.

22. Ponlzovsky M., Petrova G., Charushln V., Dubur G., ChupakhinO., Pokrovsky A., Kiselev 0., Plyasunova 0., Egorlcheva I. New heterocyclic compounds with antl-HIV activity. - Abstracts or the International Conrerence on molecular biology aspects or diagnostics and therapy or AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.5.

23. Vlassov V., Konevets D., Plyasunova 0., Pokrovsky A., Svlnarchuk F. Hydrolysable ollgocleoxynucleotld.es derivatives as anti-HIV agents. - Abstracts or the International Conrerence on molecular biology aspects of

diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.25.

24. Tolstlkov G.A., Baltlna L.A., Ryzhova S.A., Murinov Yu. I., Pokrovsky A.G., Plyasunova O.A., Sandahchlev L.S. Development of new antl-HIV agents based on glycyrrhizlc acid. - Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy 'of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.14.

25. Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Покровский А.Г., ПлясуноЕа 0.А. Разработка новых средств для борьбы с ВИЧ-инфекцией на основе глицирризиновой кислота. -Материалы IV Всесоюзного симпозиума "Изучение и использование солодки в СССР", Алма-Ата. 1991 (3-5 октября).0.160-161.

26. Plyasunova 0.A., Pokrovsky A.G., Rusakov I.A., Baltlna L.A., Murinov Yu.I., Tolstlkov G.A. Inhibition of HIV reproduction In cell cultures by glycyrrhizlc acid.-Abstracts of the VIII International Conference on AIDS/III STD World Congress, Amsterdam'. 1992 (July).

27. Pokrovsky A.G., Plyasunova O.A., Bllnov V.M., Abramova T.V., Svlnarchuk F.P., Vlassov V.V. Antl-HIV action of antisense and sense ollgodeoxynucleotldes and Its derivatives. - Abstracts of the VIH International Conference on AIDS/ITI STD World Congress, Amsterdam. 1992 (July).

28. Svlnarchuk P.P., Konevetz D.A., Vlassov V.V., Pokrovsky A.G., Plyasunova O.A. Antl-HIV action of antisense and "sense oligodeoxynucleotide derivatives. - Abstracts of the

- 48 -

International Conference on Antlserise Oligonucleotides and Rlbonucleases H, Arcachon. 1992 (27 september-2 october).

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с сотрудниками ВНИИ МБ НПО "Вектор": Покровским

A.Г., Чаплыгиной С.Р., Егоричевой И.Н., Федюк Н.В., Власкиной

B.В., Мамаевой.О.А., Блиновым В.М.; НИБХ РАН: Власовым В.В., Свинарчуком Ф.П., Коневцом Д.А., Абрамовой Т.В., Горном В.В.; Института органической химии Башкирского научного центра РАН: Толстиковым Г.А., Балтикой Л.А., Муриновым Ю И., Русаковым И.А.; Уральского политехнического института: Чупахиным О.Н., Чарушиным В.Н., Понизовским М.Г.; Института гриппа: Киселевым О.И. Своим ближайшим коллегам и соавторам проведенных исследований автор приносит искреннюю благодарность.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Абрамова Т.-В., Комарова Н.И., Мундус Д.А., Перебоева О.С. Эффективный синтез препаративных количеств 5'-фосфорилиро-ванных олигодезоксирибонуклеотидов // Изв. Сиб. отд-ния АН СССР. Сер.хим.наук. 1990. Вып.Б. С. 45-51. Жданов В.М., Карамов Э.В., Аракелов С.А'., Руднева И.А., Кетиладзе Е.С., Стаханова В.М.,'Малышев H.A., Алексеева И.Л. Иммуноферментный-метод индикации антигена и антител к вирусу иммунодефицита человека и его использование для

серологического обследования различных групп населения

\

■ // Вопр. вирусол. 1988. 33. С. 294-293.

^rawal S., Good.ch.ild J., Clvelra M.P., Thornton A.H., Sarin P.S. and Zamecnik P.G. Oligodeoxynucleoslde phosphoraniida:^ and phosphorothioates as inhibitors oi human Irnmunoaei l-clency virus // Proc. Natl. Acad. Scl. USA. 1988. 7.35.

?. 7079-7083.

jrawal S., Goodchlld J., Glveira M., Sarin P.S., Zamecnik P.C. Phosphoroamldate, phosphorothioate, and methilphosphonate analogs or ollgodeoxynucleotide: Inhibitors oi human immunodeficiency virus //.Nucleosides & Nucleotides. 1988. V.8. P. 819-323.

Sravial S., Ikeuchi T., Sun D., Sarin P.S., Konopka A., Malzel J. and Zamecnik P.G. Inhibition of human Immunodeficiency virus In early infected and chronically Infected cells by antlsense ollgodeoxynucleotides and their phosphorothloate analogues •// Proc. Natl. Acad. Scl. USA. 1989. 7.86. P.7790-7794.

Jen 1.3., Teepe A.G., Kehoe M.J., Holland G.S., Mc Namara D.J. and Cook P.D. Antiviral and cytotoxicity evaluation of 3-nltro-3-deazauridlne // Antiviral Res. 1989. Y.12.

P.259-268.

iba M. and Shlgeta S. Antiviral activity of glycyrrnlzln against varicella-zoster virus in vizro // Antiviral Res. 1987. V.7. ?. 99-1C7. -

.laarinl J., Naesen3 L-, Herdewi^n P., Rosenberg I., Holy A., rauvvels R., Eaba M., Johns D.G., De Glercq E. 'darKed in vivo antlretrovlrus activity of 9-(2-phosphonylmethoxyethyljadenine, a selective anti-human immunodeficiency virus agent //

- 50 -

Proc. Natl. Acad. Scl. USA. 1989. V.86. P. 332-336.

Crowe S.M., McGrath M.S., Elbeik T., Klrlhara J. and Mills J Comparative assessment oi antiretroviral In hums monocyte-macrophages and lymphoid cell lines acutely an chronically Infected with the human immunodeficiency vlru // J. Med. Virol. 1989. V.29. P. 176-180.

De Clercq E. Chemotherapeutic approach of AIDS // Verh. K Acad. Geneeskd. Belg. 1988. V.50. P. 166-216.

Fields A.P., Bednarik P.P., Hess A., May W.S. Huma: Immunodeficiency virus induces phosphorylation, of its cel. surface receptor // Nature (London). 1988. V.333. P. 278-28I

Herdewi^n P. and De Clercq E. Dideoxynucleoside analogues a: inhibitors of HIV replication // In: Design Antl-AIDS Drug; . edited by E. De Clercq. Pharmacochemistry library. ELSEVIER Amsterdam - Oxford - New York - Tokyo. 1990. V.14. P 14-1-174.

Hirsch M.S. Azldothymldine //J. Inf. Dls. 1988. V.157. P 427-431..

Hu J.M. and Hslung G.D. Evaluation of new antiviral agents: I In vitro perspectives // Antiviral Res. 1989. V.11. P 217-232.

Ito M., Nakashima H., Pauwels R., De Clercq E., Shlgeta S. an( Yamamoto N. Inhibitory effect of glycyrrhizln on the ii vitro lnfectlvlty and cytopathic activity of the humai immunodeficiency vl-us [HIV (HTLV-III/LAV)) // Antiviral Re; 1987. V.7. P. 127-137.

Ito M.,-Sato A., Hirabayashl K., Tanabe F., Shlgeta S., Bab;

M., De Clercq E., Nakashlma H. and Yamamoto N. Mechanism of Inhibitory effect of glycyrrhlzln on replication of -human immunodeficiency virus (HIV) // Antiviral Res. 1988. V.1Q. P. 289-298.

Jacobson A.B., Good L., Simonettl J:, Zuker M. Some simple computational methods to improve the folding of large RNA3 // Nucl. Acids Res. 1984. V.12. P. 45-52. .arderB.A., Darby G. and Rlchman D.D. HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy // Science. 1989. V.243. P. 1731-1734. ,arder B.A. and Kemp S.D. Multiple mutations in HIV-1 reverse transcriptase confer high-level resistance to zidovudine (AZT) // Science. 1989. V.246. P. 1155-1158. ,ee M.H., Sano K., Morales F.E. and Imagawa D. Sensitive reverse transcriptase assay to detect and quantltate human immunodeficiency virus // J. Clin. Microbiol. 1987. V.25. P. 1717-1721.

etsinger R., Zhang G., Sun, D., Ilceuchi T., Sarin P. Cholesteryl-conjugated oligonucleotides.: Synthesis, properties, and activity as Inhibitors of human Immunodeficiency virus In cell culture // Proc. Natl. Acad. Scl. USA. 1989. V.85. P. 6553-6556. arx J.I. Drug-resistant strains of AIDS virus found //

Science. 1989. V.243. P. 1551-1552. atsukura M., Shinozuka K., Zon G., Mitsuya H., Reltz M., Cochen J., Broder S. Phosphorothioate analogs of ' oligonucleotides: Inhibitors of replication and cytopathlc

effects of human Immunodeficiency virus // Proc. Natl. Acad Sei. USA. 198T. V.84. P. 7706-7710.

Matsukura M.', Zon G., Shinozuka K., Robert-Guron M., Shimad T., Stein C.A., MltsuzaH., Wong-Staal P., Cohen J.S. an Broder S. Regulation of viral expression on HIV (huma immunodeficiency virus) in vitro by an antlsensi phosphorothioate oligodeoxynucleotide against rev (art/tra in chronically infected cells // Proc. Natl. Acad. Sei.USA 1989. V.86. P. 424-4-424-8.

*

Miller R.H. Human immunodeficiency virus may encode a nove! protein on the genomic DNA plus strand // Science. 1988 V.238.P. 1420-1422.

Mitsuya H., Popovlc M., Yarchoan R., Matsushita S., Gallo R.C and Broder S. Suramin protection of T cells In vltrt against inactivity and cytopathic effect of HTLV-Ii: // Science. 1984. V.226. P. 172-174.

Mitsuya H., Wetohold K.J., .Purman P.A., St. Clair K.M. Nuslnoff Lehrman S., Gallo R.C., Bolognesl D., Barry D.W. and Broder S. 3'-azldo-3 *-deoxythymidine (BW A509U): Ai antiviral agent that inhibits the lnfectivity and cytopathl« effect of human T-lymphotroplc virus type III, lymphadenopathy-assoclated virus In vitro // Proc. Natl, Acad. Sei. USA. 1985. V.82. P. 7096-7100.

Moser H.E. and Dervan P.B. Sequence-specific cleavage of doublt helical DNA by trifle helix formation // Science. 1987, V.238. P. 645-650.

Pauwels R., Andrles K., Desmyter J., Kukla M.J., Heykarrts J..

De Glercq E. and Janssen P.A.J. Potent and selective Inhibitor of HIV-1 replication in vitro by a novel aeries of tetrahydro-lmldazo [4,5,1-JK] [1,4]-bensodiazepln-2(1H)- one and -thlone (TIBO) derivatives // In: Design Antl-AILS Drugs edited by S. De Clercq. Pharmacochemistry " library. ELSEVIER ' - Amsterdam - Oxford - Hev; York - Tokyo. 15=0. V.U. P. 103-122. auwels R., Andries K.t Desmyter J., Schol3 D., Kukla M.J., Breslln H.J., Raeymaeckers A., Gelder J.V., Woestenborghs R., Heykants J., Schelleke'ns K., Janssen P.A.C., Da Clercq E. & Jassen P.A.J. Potent and selective Inhibitor of HIV-1 replication in vitro by a novel series of TIEO derivatives // Nature.. 1990. V.343. P. 470-4-74. 3V3ic T.J., Dervan P.B. Triple helix formation, by oligonucleotides on ENA extended to the physiological pH range //"J. An- Chem. Soc. 1939 . 7.111. P. 3059-3051. atner L., Haseltine W., Patarca R., Llvali K.J., Starcich B., Josephs S.P., Doran E.R., Rafalskl J.A., Whltehorn E.A., Baumeister K., Ivanoff I., Petteway S.R., Pearson M.L.. Lautenberger J.A., Papas T.S., Ghrayeb J., Chang N.T., Gallo R.C., Wong-Staal P. Complete nucleotide sequence of the AIDS virus, HTIV-III // Nature. 1985. V.313. P. 277-284. ;nnelsen K., Leserman L., Matthes E., Schroder H.C. and Müller «7.E.G. Inhibition of expression oi Human Immunodeficiency Virus - 1 in vitro by antibody-targeted liposomes containing antlsense RNA to the env region // ■}. Biol. Chem. i99G. 7.265. ?. 16337-16342.

Rlchman D.D., Plschl M.A., Grleco M.H., Gottlieb M.S., Volberdlng P.A.. Laskln 0.1., Leedom J.M., Grooptnan J.E., Mildvan D., Hlrsch M.S., Jackson G.G., Durack D.T., Nuslnoff-Lehrman S. and the AZT Collaborative Working Group The toxicity azidothymldine In the treatment of patients with AIDS and AIDS-related complex. A .double-blind placebo-controlled trial // N. Engi. J. Med. 1987. V.317. P. 192-197.

Stein C.A.. Pal R., DeVlco A.I., Hoke G., Mumbauer S., Klnstler 0., Sarngadharan M.G., letslnger R.L. Mode oi action oi 5'-linked cholesteryl phosphorothloate ollgodeoxynucleotldea In Inhibiting syncytia formation and Infection by HIV-1 and HIV-2 in vitro // Biochemistry. 1991. V.30. P. 2439-2444.

Toshlyukl N. and Hlroo H. Heparin inhibits infectivlty of human Immunodeficiency virus in vitro // Jap. J. Cancer Res. Gann. 1988. V.79. P. 9-1V.

Williams I.G. Antl-HIV drugs // Med. Int. (Gr. Brit.) 1988. v. 57. P. 2364-2366.

Zala J.A.. Rossi J.J., Murakawa G.J., Spallone P.A., Stephens L.A.. Kaplan B.E., Erltza R.,-Wallace NR.B. & Cantln E.M. Inhibition of human Immunodeficiency virus by using an ollgonucleoslde methylphosphonate targeted to the tat-3 gene /7 J. Virol. 1988. V.62. P. 3914-3917.

Zamecnlk P., Goodchlld J., Taguchl Y., Sarin P. Inhibition of replication and expression of human T-cell lymphotroplc virus type III In cultured cells by exogenous synthetic oligonucleotides complementary to viral UNA // Proc. Natl.

- 55 -

Acad. Sçl. USA. 1986. V.83. P. 4143-4146. ,uker M., Stlegler P. Optimal computer.folding of large RNAs sequences using thermodynamics and auxiliary Information // Nucl. Acids Res. 1981. V.9. P. 133-148.