Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и оптимизация свойств новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе компьютерного прогноза

ВАК РФ 03.01.09, Математическая биология, биоинформатика

Автореферат диссертации по теме "Поиск и оптимизация свойств новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе компьютерного прогноза"

На правах рукописи

Дружиловский Дмитрий Сергеевич

ПОИСК И ОПТИМИЗАЦИЯ СВОЙСТВ НОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 НА ОСНОВЕ КОМПЬЮТЕРНОГО ПРОГНОЗА

03.01.09 - Математическая биология, биоинформатика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени у А (]|(Т 2013

кандидата биологических наук

Москва-2013 г.

005535598

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук (ФГБУ "ИБМХ" РАМН)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

Поройков Владимир Васильевич

Официальные оппоненты: Ефремов Роман Гербертович,

доктор физико-математических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, заместитель директора по науке

Кабанкин Анатолий Сергеевич,

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук, главный научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта Российской академии наук

Защита состоится 14 ноября 2013 г. в 13— часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при ФГБУ "ИБМХ" РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, 10, стр. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "ИБМХ" РАМН Автореферат диссертации разослан «11» октября 2013 г.

//" - /

Ученый секретарь диссертационного совета, ///'■) /"-' -•/

1-

кандидат химических наук / /у Карпова Е.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. С момента регистрации первых случаев заболевания в 1981 году (Siegal F.P et al., 1981), к настоящему времени СПИД рассматривается в качестве одной из самых опасных пандемий. В 1986 г. начались клинические испытания первых антиретровирусных препаратов. Результатом проведенных исследований стало применение в клинике HAART - высокоактивной антиретровирусной терапии (Vella S. et al., 2000). Несмотря на принимаемые профилактические меры, число людей, инфицированных ВИЧ, растет ежегодно во всем мире на 2,6 млн. человек (De Cock К. М., et al., 2011). По данным Объединенной программы ООН по СПИД (UNAIDS) (http://www.unaids.org), приведенным в ежегодном «Докладе о развитии эпидемии СПИД», всего к концу 2012 г. 34,3 млн. человек в мире были ВИЧ-инфицированными. В России на конец 2012 г. официально зарегистрировано свыше 650 тысяч больных ВИЧ-1, а согласно существующим оценкам, количество инфицированных может составлять от 860 тысяч до 1,4 миллиона человек.

Используемые в настоящее время лекарственные препараты для терапии ВИЧ/СПИД обладают значительными недостатками: существенные побочные эффекты, высокая стоимость лечения, возникновение резистентности (Thompson М. A. et al., 2012). В связи с этим, актуальной проблемой является поиск и создание новых высокоэффективных лекарственных препаратов, направленных на подавление вирусной активности в организме. Одним из наиболее актуальных направлений считается разработка ингибиторов интегразы ВИЧ-1 (Karmon S.L., 2013).

Интеграза ВИЧ-1 является одним из трех ферментов, необходимых для реализации жизненного цикла вируса. В ходе взаимодействия с клетками человека, интеграза (ИН) ВИЧ-1 катализирует две реакции - З'-процессинг и реакцию переноса цепи. На стадии 3'-процессинга интеграза ВИЧ-1 отщепляет ди- и тринуклеотиды с 3'-концов вирусной ДНК, заменяя их на ОН группы, а на стадии переноса цепи интеграза встраивает вирусную ДНК в хромосомную ДНК (Сага A. et al., 1995/ Отсутствие близких гомологов интегразы ВИЧ-1 в организме человека позволяет рассматривать ингибиторы интегразы ВИЧ-1 в качестве перспективных антиретровирусных веществ. Впервые информация об ингибиторах интегразы ВИЧ-1 была опубликована в 1992 году. Первый ингибитор интегразы ВИЧ-1, Ралтегравир, был разрешен к медицинскому применению только в конце 2007 года, второй, Элвитегравир - в 2009 г. Уже через год применения Ралтегравира и Элвитегравира в клинике были отмечены первые случаи возникновения резистентности к препарату

(Daar E.S., 2008, Zolopa A.R. et al.,2010), что указывает на необходимость поиска новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

В последние 20 лет в поиске и оптимизации новых физиологически активных веществ широко применяются методы компьютерного конструирования лекарств, основанные на информации о структуре белка-мишени и/или о структуре и активности известных лигандов (Ваггеса M.L. et al., 2009, Ferro S. et al., 2010). В случае интегразы (ИН) ВИЧ-1 применение методов, основанных на структуре белка-мишени, затруднено, поскольку пространственная структура полноразмерной ИН до сих пор не установлена. Построено несколько теоретических моделей, на основе которых предпринимаются попытки моделирования фермент-лигандного взаимодействия (Ваггеса M.L. et al., 2009; Sun X. H. et al., 2012, и др.). В ряде работ с использованием компьютерных методов найден ряд соединений, ингибирующих интегразу ВИЧ-1. В частности, на основе данных об известных ингибиторах интегразы были построены модели фармакофоров и с их использованием осуществлен виртуальный скрининг новых ингибиторов ИН среди коммерчески доступных образцов химических соединений (Liao С. and Nicklaus M., 2010, Bak A. et al., 2012). Поскольку для разработки лекарственного препарата, наряду со специфической активностью, необходимо обеспечить наличие адекватных фармакокинетических и фармакодинамических свойств новых соединений, компьютерное прогнозирование этих характеристик является дополнительным критерием для отбора перспективных веществ (Moss D. M. et al., 2013).

Исходя из вышесказанного, целью нашей работы явилась разработка и апробация подхода к поиску и оптимизации in silico свойств базовых структур новых соединений, ингибирующих интегразу ВИЧ-1.

Для достижения данной цели было необходимо решить следующие задачи.

1. Формирование репрезентативной обучающей выборки по известным ингибиторам интегразы ВИЧ-1, протестированным в сопоставимых условиях эксперимента, и проведение процедуры обучения программы PASS.

2. Прогнозирование активности для коммерчески доступных химических соединений, отбор веществ-кандидатов (hits) и тестирование их активности in vitro.

3. Компьютерная оценка вкладов структурных элементов ингибиторов интегразы ВИЧ-1 в проявление активности и экспериментальная валидация выявленных закономерностей.

4. Сравнительная оценка фармакодинамических и фармакокинетических характеристик новых активных соединений и известных из литературы ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

Научная новизна. Впервые сформирована репрезентативная обучающая выборка по ингибиторам интегразы ВИЧ-1, протестированных в сопоставимых условиях эксперимента, на основе которой реализована компьютерная программа для отбора in silico новых активных соединений. С использованием разработанного нами компьютерного подхода выявлены оригинальные ингибиторы интегразы из класса бензофуроксанов и бензофуразанов, активность которых была подтверждена в эксперименте. Анализ взаимосвязей «структура-активность» известных из литературы и найденных в нашей работе ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволил установить структурные элементы, ответственные за проявление активности, на основе чего проведен компьютерный дизайн новых более активных соединений.

Научно-практическая значимость. Продемонстрирована эффективность применения разработанного нами метода компьютерного прогнозирования ингибирования интегразы ВИЧ-1 для отбора новых активных соединений. Выявлены новые ингибиторы интегразы ВИЧ-1 из класса бензофуроксанов и бензофуразанов, лучшие из которых проявляют активность на уровне значений ICso~0,5 мкМ. Расчетная оценка фармакодинамических и фармакокинетических характеристик выявленных в работе активных веществ указывает на их преимущества по сравнению с известными в настоящее время ингибиторами интегразы ВИЧ-1, что позволяет рассматривать их в качестве базовых структур новых анти-ВИЧ препаратов.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов МНТЦ №3197 и Министерства образования и науки РФ (трехстороннее соглашение № 8274).

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на российских и международных симпозиумах и конференциях: 3rd International Symposium "Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources", Shanghai (China), 2005; III Международный симпозиум «Компьютерное обеспечение химических исследований», Ярославль, 2006; IV Московской международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2007; XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2007; 4th International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine", Moscow-Nizhny Novgorod-Moscow, 2008; 4rd International Symposium «Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources», Moscow (Russia), 2007; XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2009.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ в российских и международных научных изданиях, в том числе 4 статьи в рецензируемых

научных журналах, входящих в список ВАК, и 10 публикаций в сборниках научных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, описание результатов и обсуждения, заключение, выводы, список литературы, включающий 186 наименований (7 - отечественных, 179 - зарубежных) и 3 приложения. Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста и содержит 21 рисунок и 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Поскольку в литературе отсутствует информация о 3D структуре полноразмерного фрагмента, для выявления in silico новых ингибиторов ИН мы применили подход, основанный на структуре известных лигандов (Ligand-Based Drug Design). В этом случае необходимо создание обучающей выборки, содержащей информацию о структуре и активности известных ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

На основе анализа обширных литературных источников (European Patent и United States Patent and Trademark Office; поисковая система Google; электронные базы данных NIAID и ChemIDplus) нами была составлена обучающая выборка, включающая в себя 218 наиболее активных соединений (1С5о<10 мкМ), принадлежащих к различным химическим классам. Основные критерии отбора веществ при составлении обучающей выборки: изучение ингибирования З'-процессинга и/или реакции переноса цепи; фермент, выделенный из «дикого» (wild) вида ВИЧ-1; проведение преинкубации с целью формирования прединтеграционного комплекса; использование в качестве кофактора ионов Mg2+.

Для прогноза ингибирования интегразы ВИЧ-1 и оценки общего фармакологического профиля изучаемых веществ была использована компьютерная программа PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) [Filimonov D.A and Poroikov V.V., 2008], а для оценки параметров, характеризующих ADME (адсорбция, распределение, метаболизм, и выделение) свойства - компьютерная программа QikProp (http://www.schrodinger.com). Компьютерная программа PASS (версия 12.10.22) позволяет предсказывать 6400 видов биологической активности, включая фармакологические эффекты, биохимические механизмы действия, побочные эффекты и специфическую токсичность по структурной формуле органического соединения. Данная версия программы прогнозирует 513 побочных и токсических эффектов. Прогноз основан на анализе взаимосвязей «структура-активность» для обучающей выборки, содержащей более

313000 известных биологически активных веществ, принадлежащих к различным химическим классам. Средняя точность прогноза - около 95% (скользящий контроль с исключением по одному). В качестве оценочных параметров в программе PASS рассчитываются величины Ра и Pi, характеризующие вероятности наличия и отсутствия рассматриваемой активности, соответственно. Более подробно алгоритм PASS описан в публикациях (Филимонов Д.А. и Поройков В.В., 2006; Filimonov D. and Poroikov V., 2008) и на веб-сайте (www.way2drug.com/passonline).

При подготовке обучающей выборки в качестве системы управления базами данных (СУБД) была использована ISIS/Base (http://accelrys.com). ISIS/Base позволяет хранить, обновлять и обрабатывать информацию о химических веществах, включая данные о структурной формуле, биологической активности, т.д. Данные о структуре и биологической активности экспортировались в файлы формата SDF, которые мы использовали для обучения программы PASS. С целью оптимизации структуры и свойств новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1, применялись как исходная обучающая выборка PASS, так и составленная нами специализированная выборка для прогноза ингибирования интегразы ВИЧ-1.

В программе PASS реализована возможность оценки вклада отдельных фрагментов молекулы в анализируемую активность. Расчетные оценки визуализируются в виде различной окраски атомов: зеленая - положительный вклад в активность; красная -отрицательный вклад в активность; синяя или серая - нейтральный вклад в активность:

Рис. 1. Окраска вкладов фрагментов в общую активность соединения.

С учетом вкладов различных фрагментов в активность/токсичность можно осуществлять дизайн новых производных, потенциально обладающих более высокой активностью, более низкой токсичностью и т.п.

Для анализа результатов прогноза мы использовали компьютерную программу РЬагтаЕхрей (Рого1коу V. е1 а!., 2005), с помощью которой можно отбирать соединения, имеющие с высокой вероятностью требуемые профили биологической активности.

Выявленные 22 соединения из классов бензофуроксанов и бензофуразанов (выборка I), проявившие активность в отношении хотя бы одной реакции с 1С50<ЮО мкМ, были синтезированы в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН (ФГБУН ИОХ

РАН, проф. Шевелев С.А. с сотр.) и протестированы на ингибирование интегразы ВИЧ-1 in vitro в Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова (ИФХБ МГУ, проф. Готтих М.Б. с сотр.). Для сопоставления расчетных фармакодинамических и фармакокинетических характеристик этих веществ с другими исследуемыми в настоящее время ингибиторами интегразы нами была составлена выборка, содержащая 599 соединений из 17 химических классов, имеющих значения ICso<l 00 мкМ (выборка II1).

Для оценки фармакокинетических параметров анализируемых молекул была использована программа QikProp, которая обеспечивает расчет физико-химических дескрипторов, параметров «drug-Iikeness», и оценку ADME. Описание дескрипторов, оцениваемых программой QikProp, и рекомендованный для перспективных лекарственно-подобных соединений диапазон значений приведены в таблице 1 диссертационной работы.

Для поиска веществ, согласно прогнозу обладающих требуемыми свойствами, мы использовали базы данных коммерчески доступных образцов химических соединений ChemBridge (www.chembridge.com), AsInEx (www.asinex.com), InterBio Screen (www.ibscreen.com), ChemBlock (www.chemblock.com), и библиотеку из -10000 потенциально синтезируемых молекул, предоставленную проф. С.А. Шевелевым с сотр. (ФГБУН ИОХ РАН, Москва).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Подготовка обучающей выборки

В ходе анализа литературных источников мы выявили, что исследователи проводят измерение значения ICso для ингибирования интегразы ВИЧ-1 в экспериментах in vitro при различных условиях, что обуславливает существенные различия получаемых в экспериментах количественных данных. Например, для препарата Ралтегравир значения IC50 варьировали от 1 до 70 нМ. Чтобы минимизировать влияние различий в условиях эксперимента на прогностическую способность метода, при составлении обучающей выборки мы отбирали соединения, тестирование которых удовлетворяло критериям, описанным в разделе «Материалы и методы». Составленная нами выборка содержала информацию о 218 тщательно отобранных химических соединениях из 11 химических классов, из которых 35 ингибируют З'-процессинг и 28 ингибируют перенос цепи (21

' Не все соединения из выборки II удовлетворяли приведенным выше четырем критериям отбора.

соединение ингибировало обе реакции). Остальные соединения, протестированные в сопоставимых экспериментальных условиях, были неактивными.

Обучение PASS и валидация компьютерного прогноза

Мы провели обучение компьютерной программы PASS на основе составленной нами выборки. По результатам скользящего контроля с исключением по одному средняя ошибка прогноза составляет около 19%, варьируя от 12% (ингибирование З'-процессинга) до 26,5% (ингибирование реакции переноса цепи).

Прогнозирование активности с помощью данной программы для двух разрешенных к медицинскому применению ингибиторов интегразы ВИЧ-1 Ралтегравир (Isentress) и Элвитегравир (Stribild) дает результаты, хорошо соответствующие установленным экспериментальным данным (Табл. I)2.

Таблица 1

Сравнение результатов прогноза и эксперимента для допущенных к клиническому применению ингибиторов интегразы ВИЧ-1

Препарат Прогноз PASS (Ра) Экспериментальные значения (ICso, мкМ)

З'-процессинг Перенос цепи З'-процессинг Перенос цепи

Ралтегравир 0,504 0,948 1 0,007

Элвитегравир - 0,894 - 0,013

Таким образом, полученная в результате обучения специализированная версия программы PASS может быть использована для поиска новых активных молекул путем виртуального скрининга.

Виртуальный скрининг и отбор новых потенциальных ингибиторов интегразы

ВИЧ-1

Мы выполнили прогноз ингибирования интегразы ВИЧ-1 для 2,4 млн органических соединений, коммерчески доступных от различных поставщиков (см. раздел «Материалы и методы»). Критерии отбора соединений для тестирования: (1) прогнозируемые значения Ра>0,5 хотя бы для одной из реакций ингибирования интегразы (З'-процессинга или переноса цепи); (2) принадлежность отбираемых веществ к химическим классам, для которых ингибирование интегразы ВИЧ-1 ранее не было известно. На основе этих

2 В программе PASS при прогнозировании активности для соединений, включенных в обучающую выборку, соответствующая этим соединениям информация удаляется из базы знаний, что обеспечивает более объективную оценку.

критериев для экспериментального тестирования было отобрано 29 веществ из 12 химических классов.

Тестирование иигибирования интегразы ВИЧ-1 соединениями, отобранными на основе виртуального скрининга.

Из 29 соединений, отобранных для экспериментального тестирования, активность проявили 8 веществ, принадлежащих к 6 химическим классам. Поскольку при случайном скрининге число выявляемых активных соединений составляет менее 1% (Затаеп W., 1997), за счет компьютерного прогноза этот показатель был повышен более чем в 10 раз. В таблице 2 приведено сравнение результатов прогноза с полученными экспериментальными данными для наиболее активных веществ, которыми оказались производные бензофуроксанов и бензофуразанов.

Таблица 2

Сравнение результатов прогноза и эксперимента для наиболее активных

ингибиторов интегразы ВИЧ-1, выявленных на основе компьютерного прогноза

Структурные формулы (раскраска атомов отражает вклады отдельных фрагментов молекулы в активность) Прогноз (ингибирование 3'-процессинга) Эксперимент 1С50 (мкМ) (НИИФХБ)

З'-процессинг Перенос цепи З'- процессинг Перенос цепи З'- процессинг Перенос цепи

& & - 0,596 - 50

f Ч О/ .Л; /н » '.»г • *. •, 14 1 «г** - 0,936 - 70

ft 0,815 0,935 100 100

Как видно из таблицы 2, между значениями Ра и IC50 исследованных соединений нет четкой корреляции, поскольку в PASS значения вероятности Ра отражают меру принадлежности веществ к классу «активных», а не величину (выраженность) активности. Как видно из окраски фрагментов отобранных молекул, наибольшие вклады в искомую активность вносят как циклические компоненты соединений, так и различные заместители.

Поскольку Ралтегравир и Элвитегравир являются наиболее активными ингибиторами интегразы ВИЧ, было целесообразно проанализировать, какие фрагменты этих соединений вносят наибольший положительный вклад в активность. Эта информация может быть использована для конструирования и последующего синтеза новых, потенциально более активных, производных бензофуроксанов и бензофуразанов.

ОПТИМИЗАЦИЯ АИТИ-ВИЧ АКТИВНОСТИ БЕНЗОФУРОКСАНОВ И БЕНЗОФУРАЗАНОВ

Определение и анализ фрагментов молекул, вносящих наибольший вклад в ингибирование интегразы

Анализ окраски атомов в структурах Ралтегравира и Элвитегравира показывает, что наибольший вклад в активность вносят следующие заместители: метильная, гидроксильная и карбоксильная группы, а также галогены С1 и Р (Рис. 2).

С учетом специфики выделенных в ходе нашего анализа фрагментов и их расположения в структурах Ралтегравира и Элвитегравира, были сконструированы новые производные бензофуроксанов и бензофуразанов. При этом также учитывались вклады в активность отдельных структурных фрагментов выявленных нами на предыдущей стадии работы ингибиторов интегразы ВИЧ-1 из классов бензофуроксанов и бензофуразанов. Некоторые из сконструированных нами соединений были синтезированы в ФГБУН ИОХ РАН и их активность была протестирована в ИФХБ МГУ. Полностью результаты тестирования биологической активности полученных соединений приведены в таблице 7 диссертационной работы; некоторые примеры приведены ниже в таблице 3.

Как видно из табл. 3, присутствие метальной группы в положении 5 или 7 и нитрогруппы в положении 4 исследуемых соединений приводит к повышению ингибирующей активности (Табл. 3, соед. 1 и 2; соответствующие фрагменты окрашены в

Ралтегравир

Элвитегравир

Рис. 2. Окраска фрагментов молекул Ралтегравира и Элвитегравира.

насыщенный зеленый цвет). Напротив, отсутствие этих заместителей в структуре приводит к исчезновению активности (Табл. 3, соед. 3).

Таблица 3

Сравнение результатов прогноза и эксперимента для ряда новых производных беизофуроксанов и бензофуразанов

ГО Структурные формулы (окраска атомов отражает вклады отдельных фрагментов молекулы в активность) Пропюз (ингибирование З'-процессинга) Эксперимент 1С5о (мкМ) (НИИ ФХБ)

З'-процессинг Перенос цепи 3'-проц. Перенос цепи 3'- проц. Перенос цепи

1 ВцВ 0,536 0,604 2 3

2 0,897 0,548 0,5 0,4

3 0,627 - >1000 >1000

4 - 0,560 >1000 800

5 0,803 0,657 0,4 1

6 0,909 0,917 1 7

7 0,761 0,945 80 50

8 0,889 0,791 20 50

9 0,645 0,592 3 3

10 I 1 0,528 0,636 20 15

11 ■¿к 0,961 0,935 6 2

12 т „ М-*" 0,873 0,753 0,5 5

Введение метильиого заместителя в 5-е положение также приводит к исчезновению активности (Табл. 3, соед. 4).

Учитывая сильное влияние нитрогруппы, было изучено влияние заместителя в положении 5 на активность 4-нитробензофуроксана. Наличие метального остатка в этом положении приводит к повышению ингибирующей активности (Табл. 3, соед. 5).

Наличие двух метальных заместителей в положениях 5 и 7, наоборот, приводит к незначительному снижению значений IC50 {Табл. 3, соед. 6).

Далее была осуществлена попытка улучшить результаты путем добавления в 7-е положение других электродонорных заместителей (Табл. 3, соед. 7), учитывая высокий вклад в активность 4-нитро-бензафукроксанов метильной группы. Добавление алкильной цепи с функциональными группами содержащими на конце фрагменты предположительно дающие высокий вклад в активность, полученных на основе анализа, найденных при скрининге соединений, не приводит к повышению активности.

Производное 4-нитро-бензофуроксана, содержащее электроноакцепторный заместитель - хлор - в положении 7, оказалось более активным ингибитором, чем исходный 4-нитро-бензофуроксан (Табл. 3, соед. 8), но уступало 7-метил-4-нитро-бензофуроксану.

Метальные производные 4-нитро-бензофуразанов (Табл. 3, соед. 1 и 9). оказались в 3-6 раз менее активны, чем аналогичные у бензофуроксанов.

В случае соединения, содержащего в положении 7 сильный электроноакцепторный заместитель (Табл. 3, соед. 10) прогноз согласуется с экспериментом только для реакции переноса цепи.

Введение второй нитрогруппы в соединение, содержащее электроноакцепторный бромметильный заместитель (Табл. 3, соед. 11), приводит к повышению активности, как в отношении ингибирования реакции З'-процессинга, так и реакции переноса цепи.

Было исследовано ингибирование интегразы ВИЧ-1 6-нитро-бензофуразаном (Табл. 3, соед. 12), в ходе которого также было найдено повышение биологической активности.

Таким образом, на примере конструирования новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1 из классов бензофуроксанов и бензофуразанов мы показали, что использование информации о вкладах отдельных фрагментов в биологическую активность, рассчитываемых подготовленной нами специализированной версией программы PASS, позволяет получать более активные новые производные.

Прогноз побочных эффектов и токсичности. С целью сопоставления свойств найденных в ходе нашего исследования новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1 с известными в литературе соединениями, мы предсказали возможные побочные/токсические эффекты для наиболее активных веществ (Таблице 1 Приложения диссертационной работы). Некоторые результаты предсказаний (Табл. 3, соед. 2, 5, 7 и 12) с использованием стандартной версии программы PASS (см. раздел «Материалы и методы») представлены в таблице 4.

Таблица 4

Прогноз спектров токсичности/побочных эффектов для ряда бензофуроксанов и

бензофуразанов

№ Ра Активность

2 - -

0,706 Hypotension

0,679 Bone marrow suppression

5 0,625 Stroke

0,610 Myocardial ischemia

0,572 Cardiogenic shock

0,552 Pseudoporphyria

7 - -

0,816 Toxic, vascular

0,679 Carcinogenic, rat, male

0,661 Carcinogenic, rat

0,632 QT interval prolongation

12 0,571 Carcinogenic, rat, female, mammary gland

0,603 Hypotension

0,588 Allergic dermatitis

0,583 Cyanosis

0,570 Ototoxicity

0,568 Hematotoxic

Аналогичный прогноз был нами выполнен для Ралтегравира и Элвитегравира. Из 25 предсказанных (при пороговом значении Ра>0,5) побочных/токсических эффектов для Ралтегравира, все (приступы паранойи, гиперкинезия, атаксия, риск развития гепатита, расстройство пищеварения, бессонница, чувство тревоги, головокружение, тромбоцитопения, абдоминальные боли, сенсорные расстройства, общее недомогание, экзантема, рвота, дискинезия, дерматиты, головная боль, аллергическая реакция, боль, тошнота, нефротоксичность, нарушение сна, гематотоксичность, желудочно-кишечная токсичность, гепатотоксичность) соответствуют данным, полученным в экспериментальных и клинических исследованиях. В свою очередь для Элвитегравира было предсказано (при пороге Ра>0,5) 10 побочных/токсических эффектов, 9 из них (аллергический контактный дерматит, фотоаллергический дерматит, некроз печени, колики, почечные колики, почечная недостаточность, интерстициальный нефрит, нефрит, гемолитическая анемия) соответствуют клиническим данным (Lee F.J., Carr А., 2012).

Как можно видеть из представленных в таблице 4 данных, для соединений 2 и 7 в предсказанных спектрах биологической активности отсутствуют какие-либо побочные/токсические эффекты. Для соединений 5 и 12 возможны проявления некоторых нежелательных эффектов, однако количество предсказанных побочных/токсических

зффсктов у соединений классов бензофуразанов и бензофуразанов существенно меньше, чем у Ралтетравира. 11рн этом нельзя исключил», что побочныс/токсическис >ффскты могут проявляться при более высоких концентрациях, чем ингибированис интегразы ВИЧ-1, поскольку прогноз PASS ласт качественные оценки вероятности наличия активности.

Сравнение фармико.ин ических профилен орш ина.тьных н н тсс i ni.it 111 ■iHicnaivnbi интибнторов mncinaibi Как упоминалось в разделе «Материалы и методы», для сравнения прогнозируемых фармакологических профилей ингибиторов ВИЧ-1 были использованы две выборки I и II.

Оценки фармакологических профилей веществ обеих выборок были получены с использованием программы PASS 12.10.22. На рис. 3 приведены распределения соединений по числу прогнозируемых с вероятностью Ра>50% видов активности для обеих выборок. Для всшсств из выборки 1 среднее число прогнозируемых с вероятностью Ра>50% видов биологической активности составляет 74. минимальное число -II, максимальное - 228. среднеквадратичное отклонение - S7. Для всшсств из выборки II среднее число проттюзируемых с вероятностью Ра>50% видов биологической активности составляет 94. минимальное число - 0. максимальное - 72S, среднеквадратичное отклонение - 116.

о.»

045

I 0.4

03» 0.1 0.25

I "

8 0.15 0.1 oos о

Рис. 3. Доля соединений, попадающих в определенный интерват значений по количеству прогнозируемых с вероятностью Ра>50% видов биоло!ической активности. Светлые столбики - выборка I; темные - выборка II.

Выборка опубликованных в литературе ингибиторов интегразы ВИЧ-1 незначительно отличается от выборки оригинальных соединений в интервале 10 - 250 прогнозируемых видов активности (рис. 3). Вместе с тем. как показывает анализ прогнозируемых спектров биологической активности, для 23 соединений из выборки II с вероятностью Ра>50% прогнозируется 234 видов активности, то сеть они уступают по селективности соединениям выборки I. С другой стороны, в выборке И присутствуют 12 соединений, для которых с вероятностью Ра>50% прогнозируется менее 10 видов

активности, что говорит об их более высокой селективности, чем изучаемые нами оригинальные соединения (выборка I). Из выборки I мы отобрали 4 соединения, имеющих значения 1С5о<10 мкМ, которые являются наиболее перспективными для дальнейших исследований. Для этих соединений количество видов биологической активности, прогнозируемых с вероятностью Ра>50%, лежит в интервале от 14 до 228, что не отличается существенно от картины, наблюдаемой для всей выборки II. В то же время при пороге Ра>50% PASS 12.06.22 прогнозирует возможное наличие побочных/токсических эффектов для 591 из 599 веществ из выборки II (99%).

Как показал проведенный нами с помощью программы PharmaExpert анализ, для выборки II в прогнозируемых спектрах наиболее типичными являются следующие виды биологической активности: Acrocylindropepsin inhibitor, Chymosin inhibitor, Phospholipid-translocating ATPase inhibitor, Na+-transporting two-sector ATPase inhibitor, Sentrin-specific protease 8 inhibitor, Saccharopepsin inhibitor, PLIN2 expression enhancer, L-glutamate oxidase inhibitor, Sentrin-specific protease 6 inhibitor. Сравнение с видами биологической активности, полученными для выборки I, показало, что сходных активностей при пороге Ра>0,5 не обнаруживается. Такое отличие фармакологических профилей оригинальных соединений от известных из литературы ингибиторов интегразы ВИЧ-1 является дополнительным свидетельством существенной новизны веществ изучаемого нами химического класса.

Спавненне фармакокинетнческих свойств оригинальных и известных из литературы ингибиторов ннтегразы. Для валидации результатов прогноза ADME характеристик программы нами проведена оценка результатов прогноза для Ралтегравира и Элвитегравира. Как видно из представленных в таблице 5 данных, все расчетные параметры, за исключением QPlogHERG для Ралтегравира и CIQPlogS для Элвитегравира, соответствуют рекомендованный диапазону значений. В случае Ралтегравира выход из рекомендованного диапазона значений (<-5) наблюдается только для расчетной величины IC50 при блокаде HERG К+ каналов. Это соответствует известным литературным данным, в соответствии с которыми Ралтегравир в высоких концентрациях является блокатором HERG К+ каналов, что может привести к удлинению QT интервала и, следовательно, к сердечной недостаточности. Низкое значение CIQPlogS, прогнозируемое для Элвитегравира, указывает на низкую растворимость соединения в воде, которая, как отмечено в ряде публикаций составляет менее 0,3 мг/мл. Несмотря на это, высокая активность этих препаратов в отношении ингибирования интегразы ВИЧ-1 и в целом удовлетворительные расчетные ADME характеристики являются достаточным основанием

для их использования в качестве препаратов сравнения при изучении новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1, тем более, что это препараты, разрешенные к применению в клинике.

Как показал анализ параметров, рассчитанных с использованием программы С^кРгор для соединений выборки II, только 24 из 599 соединений соответствуют рекомендованному диапазону значений для всех 18 параметров, остальные же соединения хотя бы по одному параметру выходят за рамки этого диапазона.

Аналогичный расчет был нами выполнен для выборки I. Анализ расчетных характеристик показал, что для 18 из 22 соединений параметры (31кРгор соответствуют рекомендованному диапазону значений.

В таблице 5 приведены примеры прогнозируемых параметров (ЗИсРгор для 4 активных бензофуроксанов и бензофуразанов.

Таблица 5.

Оценки АБМЕ характеристик для новых соединений и препаратов сравнения

Характеристика* 2 7 11 12 Ралтегравир Элвитегравир

Б1а15 0 1 2 2 0 0

О« 0 -2 -2 -2 -2 -2

шо1 М\У 285.317 195.134 319.028 305.264 444,421 447,89

ёопогПВ 0 0 0 0 1 1

ассрШВ 6,7 4 5 41036 9,5 5,95

(ЗРро1ге 28.974 16.811 18.922 27.116 42,328 41,551

(ЗР^оМ 1.219 -0.159 -0.332 -0.273 2,445 4,764

(ЗР^Б -1.733 -0.766 -1.009 -0.964 4,577 -5,928

СК^Р^Б -2.729 -1.901 -4.068 -2.976 -5,442 -6,904

0Р1оеНЕКО -4.114 -3.302 -3.109 -4.795 -5,5 -3,426

ОРРСасо 1538.37 155.055 30.821 73.806 132,856 63,561

-0.037 -1.002 -1.553 -1.573 -1,823 -1,351

(ЗРРМОСК 1249.26 65.972 26.618 29.58 101,004 113,987

МйаЬ 2 2 3 1 3 4

01>1с^К[15а -0.785 -0.848 -0.921 -1.142 -0,104 0,435

РегсеШ Нитап Ога1 АЬэ. 91.127 65.222 51.648 58.785 66,307 87,113

ЬМеОАЧуе 0 0 0 0 1 0

ЯикОПЬтее 0 0 0 0 0 1

*Расшифровка параметров, рассчитываемых программой С^кРгор, приведена в разделе «Материалы и методы» диссертационной работы.

Расчет АЭМЕ характеристик программой С^кРгор показал, что по всем 18 параметрам соединения 2, 7, 11 и 12 соответствуют рекомендованному диапазону АОМЕ характеристик.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе исследована возможность использования компьютерных методов для поиска и оптимизации новых ингибиторов реакций осуществляемых интегразой ВИЧ-1. Показано, что применение разработанной нами версии PASS, обученной на основе информации из специализированной обучающей выборки, позволяет путем виртуального скрининга выявлять новые активные производные, принадлежащие к новым (по отношению к известным ингибиторам интегразы) химическим классам, среди коммерчески доступных образцов химических соединений.

Из 2,4 млн веществ, представленных в коммерчески доступных библиотеках, на основе компьютерного прогноза выявлено 3 новых ингибитора интегразы ВИЧ-1, относящихся к классам бензофуроксанов и бензофуразанов (IC50 на уровне микромолярных концентраций).

На основе анализа фрагментов молекул, вносящих положительный либо отрицательный вклад в активность исследованных соединений, нами сконструировано 27 новых структур, которые были синтезированы и протестированы; 4 вещества ингибировали интегразу ВИЧ-1 с IC50 <10 мкМ (два вещества имели значения IC50 <1 мкМ).

Сравнение оценок вероятных побочных/токсических эффектов для найденных нами веществ и препаратов Ралтегравир и Элвитегравир показало, что, согласно прогнозу, новые ингибиторы интегразы ВИЧ-1 не уступают разрешенным к медицинскому применению антиретровирусным веществам.

Общие фармакологические профили, рассчитанных для найденных нами веществ с помощью компьютерной программы PASS, в среднем не существенно отличались от аналогичных профилей активности для опубликованных в литературе ингибиторов интегразы. Вместе с тем, согласно прогнозу, для отдельных известных ранее ингибиторов интегразы селективность была выше, что указывает на необходимость дальнейшей оптимизации структуры и свойств ингибиторов интегразы ВИЧ-1 из классов бензофуроксанов и бензофуразанов.

Необходимо отметить, что, для соединений изучаемого нами химического класса отсутствие побочных/токсических эффектов прогнозируется с использованием программы PASS для 23% веществ, а для ранее известных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 - для 1%, соответственно. Аналогично, ADME параметры, рассчитанные с помощью программы QikProp, соответствовали рекомендованным значениям для 81% наших соединений и лишь для 4% ранее известных ингибиторов интегразы ВИЧ-1. Эти оценки указывают на более высокую перспективность найденных нами оригинальных веществ по сравнению с известными из литературы ингибиторами интегразы ВИЧ-1.

выводы

1. Сформированная нами репрезентативная обучающая выборка по известным ингибиторам интегразы ВИЧ-1, протестированным в сопоставимых условиях эксперимента, позволила получить специализированную версию программы PASS, прогнозирующую с разумной точностью новые соединения ингибирующие интегразу ВИЧ-1.

2. С помощью компьютерного прогноза на основе анализа коммерчески доступных баз данных выявлены новые ингибиторы интегразы ВИЧ-1 из новых (по отношению к известным ингибиторам ИН) химических классов, активность которых подтверждена в экспериментах in vitro.

3. На основе компьютерной оценки вкладов структурных элементов сконструированы новые ингибиторы интегразы ВИЧ-1; их синтез и биологическое тестирование показали, что четыре вещества обладают более высокой активностью, чем найденные путем виртуального скрининга в коммерчески доступных базах данных.

4. Сравнение расчетных фармакодинамических и фармакокинетических характеристик выявленных новых активных соединений и известных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 указывает на перспективность дальнейших исследований в выявленных нами классах веществ.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Geronikaki A., Druzhilovsky D., Zakharov A., Poroikov V. Computer-aided prediction for medicinal chemistry via the Internet. // SAR and QSAR Environ. Res. 2008. Vol. 19. No. 1-2. P. 27-38.

2. Поройков B.B., Филимонов Д.А., Глориозова T.A., Лагунин А.А., Дружиловский Д.С., Степанчикова А.В. Компьютерное предсказание биологической активности химических веществ: Виртуальная хемогеномика. // Вестник ВОГиС. 2009. Том 13. № 1. С. 137-143.

3. Дружиловский Д.С., Филимонов Д.А., Лиао Ч., Пич М., Никлаус М., Поройков В.В. Компьютерный поиск и оптимизация новых ингибиторов интегразы вируса иммунодефицита человека. // Биомедицинская химия. 2009. Том 55. № 5. С. 544-557.

4. Королев С.П., Кондрашина О.В., Дружиловский Д.С., Старосотников A.M., Дутов М.Д., Бастраков М.А., Далингер И.Л., Филимонов Д.А., Шевелев С.А., Поройков В.В., Агапкина Ю.Ю., Готтих М.Б. Структурно-функциональный анализ 1,2,5-бензоксадиазолов и их п-оксидов в качестве ингибиторов интегразы ВИЧ-1. // Acta Naturae. 2013. Том 5. № 1 (16). С. 75-85.

5. Poroikov V., Rudik A., Druzhilovsky D., Lagunin A., Filimonov D. Computer-Aided Prediction of Biological Activity Spectra for Creating New Effective and Safe Medicines. // Abstr . 3rd Internat. Symp. "Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2005)". 2005. Shanghai (China). P. 24.

6. Дружиловский Д.С., Филимонов Д.А., Лагунин A.A., Глориозова Т.А., Поройков В.В. Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1. // Материалы III Международного симпозиума «Компьютерное обеспечение химических исследований». 2006. Ярославль. С. 14.

7. Druzhilovskiy D.S., Filimonov D.A., Lagunin А.А., Gloriozova T.A., Poroikov V.V. Computer-Assisted Prediction Of Cytotoxicity For Hiv-1 Integrase Inhibitors. // Abstr. 4rd Internat. Symp. «Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2007)». 2007. Moscow (Russia). P. 175.

8. Geronikaki A., Druzhilovsky D., Zakharov A., Poroikov V. Prediction Of Biological Activity Via Internet. Medicinal Chemist's Point Of View. // Abstr. 4rd Internat. Symp. «Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2007)». 2007. Moscow (Russia). P. 21.

9. Поройков В.В., Дружиловский Д.С., Филимонов Д.А., Шевелев С.А., Готтих М.Б., Никлаус М.К.. Поиск и оптимизация новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1. // Материалы XIV Рос. нац. конгресса «Человек и лекарство». 2007. Москва. С. 311.

10. Дружиловский Д.С., Филимонов Д.А., Лагунин А.А., Глориозова Т.А., Поройков В.В. Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1. // Материалы IY Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 2007. Москва. С. 402.

11.Poroikov V.V., Filimonov D.A., Gloriozova Т.А., Lagunin A.A., Druzhilovsky D.S., Zakharov A.V., Stepanchikova A.V. Computer - aided prediction of biological activity spectra for substances: virtual chemogenomics. // Abstr. 6-th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. 2008. Novosibirsk (Russia). P. 197.

12. Poroikov V., Druzhilovsky D., Shevelev S., Gottikh M., Nicklaus M.. Computer - aided discovery of new hiv-1 inhibitors. // Abstr. 4-th International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine". 2008. Moscow-Nizhny Novgorod-Moscow. P. 69.

13. Дружиловский Д.С., Готтих М.Б., Шевелев C.A., Филимонов Д.А., Лагунин А.А., Захаров А.В., Поройков В.В. Поиск новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе компьютерного прогноза. // Материалы XVI Рос. нац. конгресса «Человек и лекарство». 2009. Москва. С. 534.

14. Poroikov V., Druzhilovsky D., Zakharov A., Lagunin A., Filimonov D. Computational Tools And Databases For Toxicology And Pharmacology: Is There Real Integration Via The Internet? // Abstr. Fifth Internet. Symp. on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2009), 2009. Istanbul (Turkey). P. 34.

Подписано в печать 09.10.2013г. Формат А5 Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 1071 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дружиловский, Дмитрий Сергеевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ В.Н.ОРЕХОВИЧА» РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК (ФГБУ «ИБМХ» РАМН)

04201363541

На правах рукописи

Дружиловский Дмитрий Сергеевич

ПОИСК И ОПТИМИЗАЦИЯ СВОЙСТВ НОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 НА ОСНОВЕ КОМПЬЮТЕРНОГО ПРОГНОЗА

03.01.09 - Математическая биология, биоинформатика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Поройков Владимир Васильевич

Москва-2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

3D - 3-х мерное представление данных З'Р - реакция З'-процессинга БФКС - бензофуроксаны БФЗ - бензофуразаны

ВААРТ - высокоактивная антиретровирусная терапия ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека 1 типа; ИП - ингибиторы протеазы ИН - интеграза ВИЧ-1

кД - внесистемная атомная единица массы (х103)

НИОТ (NRTI) - нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной

транскриптазы

ННИОТ (NNRTI) - ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы

ПК - мультимерный прединтеграционный комплекс

ПТМ - посттрансляционные модификации

СПИД - Синдром приобретенного иммунодефицита

СУБД - система управления базами данных

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

ADME - адсорбция, распределение, метаболизм, экскреция BAF (ПАФ) - противоавтоинтеграционный фактор FDA - Food and Drug Administration HLA — главный комплекс гистосовместимости HMGA1 - high-mobility group protein A1

IC50 - концентрация ингибитора, подавляющая активность фермента на 50 % LTR - long terminal repeat

PASS - Prediction of Activity Spectra for Substances

QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) - метод количественного анализа связей структура-активность ST - реакция переноса цепи WT - дикий тип

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................10

1.1. Структура и морфология вируса иммунодефицита человека..........10

1.2. Жизненный цикл ВИЧ-1......................................................................13

1.2.1. Связывание с рецепторами и ко-рецепторами иммунных клеток 15

1.2.2. Проникновение вируса внутрь клетки..........................................17

1.2.3. Обратная транскрипция и вирусная репликация..........................17

1.2.4. Регуляция вирусной репликации....................................................18

1.2.5. Инкапсулирование и формирование зрелой вирусной частицы 19

1.3. Антиретровирусные препараты..........................................................20

1.3.1. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 (НИОТ)........................................................................................................20

1.3.2. Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 (ННИОТ).....................................................................22

1.3.3. Ингибиторы протеазы ВИЧ-1........................................................22

1.3.4. Ингибиторы слияния ВИЧ-1..........................................................23

1.3.5. Антагонисты ко-рецепторов..........................................................23

1.3.6. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1......................................................24

1.3.7. Второе поколение ингибиторов интегразы ВИЧ-1......................34

1.3.8. Посттрасляционные модификации интегразы ВИЧ-1 как мишень для новых антиретровирусных препаратов..................................34

1.3.9. Мутантные формы вируса ВИЧ и комбинированная терапия ВИЧ-1............................................................................................................36

1.4. Методы виртуального скрининга для поиска новых активных соединений....................................................................................................38

1.5. Применение методов (Q)SAR и молекулярного моделирования

для анализа ингибирования интегразы ВИЧ-1..........................................43

1.6. Стратегия компьютерного конструирования лекарств (Computer-Aided Drug Design, CADD)..........................................................................45

1.7. Компьютерные методы прогноза ADMET свойств интегразы

ВИЧ-1............................................................................................................46

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................52

2.1. Объекты исследования..........................................................................52

2.2. Базы данных и выборки химических соединений............................52

2.3. Программное обеспечение, использованное в исследованиях .... 54

2.4. Экспериментальная оценка активности соединений........................62

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ............................................64

3.1. Подготовка обучающей выборки........................................................64

3.2. Обучение PASS и валидация компьютерного прогноза....................69

3.3. Виртуальный скрининг и отбор новых потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1..................................................................71

3.4. Тестирование ингибирования интегразы ВИЧ-1 соединениями, отобранными на основе виртуального скрининга....................................72

3.5. Оптимизация анти-вич активности бензофуроксанов и бензофуразанов............................................................................................80

3.5.1. Определение и анализ фрагментов молекул, вносящих наибольший вклад в ингибирование интегразы........................................80

3.5.2. Прогноз побочных эффектов и токсичности................................89

3.5.3. Сравнение фармакологических профилей оригинальных и известных из литературы ингибиторов интегразы..................................92

3.5.4. Сравнение фармакокинетических характеристик оригинальных и известных из литературы ингибиторов интегразы ... 94

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................97

ВЫВОДЫ......................................................................................................99

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..............................................100

ПРИЛОЖЕНИЕ..........................................................................................120

Таблица 1. Прогноз спектров токсичности/побочных эффектов

для исследуемых БФКС и БФЗ........................................................120

Таблица 2. Сравнение оценок ADME характеристик для 22-х

изучаемых соединений БФКС и БФЗ..............................................125

Таблица 3. Оценки ADME характеристик для выборки II............127

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. С момента регистрации первых случаев заболевания в 1981 году [1], к настоящему времени СПИД рассматривается в качестве одной из самых опасных пандемий. В 1986 г. начались клинические испытания первых антиретровирусных препаратов. Результатом проведенных исследований стало применение в клинике HAART - высокоактивной антиретровирусной терапии [2]. Несмотря на принимаемые профилактические меры, число людей, инфицированных ВИЧ, растет ежегодно во всем мире на 2,6 млн. человек [3]. По данным Объединенной программы ООН по СПИД (UNAIDS) [4], приведенным в ежегодном «Докладе о развитии эпидемии СПИД», всего к концу 2012 г. 34,3 млн. человек в мире были ВИЧ-инфицированными. В России на конец 2012 г. официально зарегистрировано свыше 650 тысяч больных ВИЧ-1, а согласно существующим оценкам, количество инфицированных может составлять от 860 тысяч до 1,4 миллиона человек.

Используемые в настоящее время лекарственные препараты для терапии ВИЧ/СПИД обладают значительными недостатками: существенные побочные эффекты, высокая стоимость лечения, возникновение резистентности [5]. В связи с этим, актуальной проблемой является поиск и создание новых высокоэффективных лекарственных препаратов, направленных на подавление вирусной активности в организме. Одним из наиболее актуальных направлений считается разработка ингибиторов интегразы ВИЧ-1 [6].

Интеграза ВИЧ-1 является одним из трех ферментов, необходимых для реализации жизненного цикла вируса. В ходе взаимодействия с клетками человека, интеграза (ИН) ВИЧ-1 катализирует две реакции - З'-процессинг и реакцию переноса цепи. На стадии 3'-процессинга интеграза ВИЧ-1 отщепляет ди- и тринуклеотиды с 3'-концов вирусной ДНК, заменяя их на -ОН группы, в то время как на стадии реакции переноса цепи интеграза

встраивает вирусную ДНК в хромосомную ДНК [7]. Отсутствие гомологов интегразы ВИЧ-1 в организме человека позволяет рассматривать ингибиторы интегразы ВИЧ-1 в качестве перспективных антиретровирусных веществ. Первая информация о ингибиторах интегразы ВИЧ-1 была опубликована в 1992 году [8]. Первый ингибитор интегразы ВИЧ-1, Ралтегравир, был разрешен к медицинскому применению только в конце 2007 года. Уже через год применения Ралтегравира в клинике были отмечены первые случаи возникновения резистентности к препарату [9], что указывает на необходимость поиска новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

В последние 20 лет в поиске и оптимизации новых физиологически активных веществ широко применяются методы компьютерного конструирования лекарств, основанные на информации о структуре белка-мишени и/или о структуре и активности известных лигандов [10,11]. В случае интегразы ВИЧ-1 применение методов, основанных на структуре белка-мишени, затруднено, поскольку пространственная структура полноразмерного белка до сих пор не установлена. Построено несколько теоретических моделей, на основе которых предпринимаются попытки моделирования фермент-лигандного взаимодействия [12, 13]. В ряде работ с использованием компьютерных методов найден ряд соединений, ингибирующих интегразу ВИЧ-1. В частности, на основе данных об известных ингибиторах интегразы были построены модели фармакофоров и с их использованием осуществлен виртуальный скрининг новых ингибиторов ИН среди коммерчески доступных образцов химических соединений [14, 15]. Поскольку для разработки лекарственного препарата, наряду со специфической активностью, необходимо обеспечить наличие адекватных фармакокинетических и фармакодинамических свойств новых соединений, компьютерное прогнозирование этих характеристик является дополнительным критерием для отбора перспективных веществ [16].

Исходя из вышесказанного, целью нашей работы явилась разработка и апробация подхода к поиску и оптимизации in silico свойств базовых структур новых соединений, ингибирующих интегразу ВИЧ-1.

Для достижения данной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Формирование репрезентативной обучающей выборки по известным ингибиторам интегразы ВИЧ-1, протестированным в сопоставимых условиях эксперимента, и проведение процедуры обучения программы PASS.

2. Прогнозирование активности для коммерчески доступных химических соединений, отбор веществ-кандидатов (hits) и тестирование их активности in vitro.

3. Компьютерная оценка вкладов структурных элементов ингибиторов интегразы ВИЧ-1 в проявление активности и экспериментальная валидация выявленных закономерностей.

4. Сравнительная оценка фармакодинамических и фармакокинетических характеристик новых активных соединений и известных из литературы ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

Научная новизна. Впервые сформирована репрезентативная обучающая выборка по ингибиторам интегразы ВИЧ-1, протестированных в сопоставимых условиях эксперимента, на основе которой реализована компьютерная программа для отбора in silico новых активных соединений. С использованием разработанного нами компьютерного подхода выявлены оригинальные ингибиторы интегразы из класса бензофуроксанов и бензофуразанов, активность которых была подтверждена в эксперименте in vitro. Анализ взаимосвязей «структура-активность» известных из литературы и найденных в нашей работе ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволил установить структурные элементы, ответственные за проявление активности,

на основе чего проведен компьютерный дизайн новых более активных соединений.

Научно-практическая значимость. Продемонстрирована

эффективность применения разработанного нами метода компьютерного прогнозирования ингибирования интегразы ВИЧ-1 для отбора новых активных соединений. Выявлены новые ингибиторы интегразы ВИЧ-1 из класса бензофуроксанов и бензофуразанов, лучшие из которых проявляют активность на уровне значений 1С50~0,5 мкМ. Расчетная оценка фармакодинамических и фармакокйнетических характеристик выявленных в работе активных веществ указывает на их преимущества по сравнению с известными в настоящее время ингибиторами интегразы ВИЧ-1, что позволяет рассматривать их в качестве базовых структур новых анти-ВИЧ препаратов.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов МНТЦ № 3197 и Министерства образования и науки РФ (трехстороннее соглашение № 8274).

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на российских и международных симпозиумах и конференциях: 3rd International Symposium "Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources", Shanghai (China), 2005; III Международный симпозиум «Компьютерное обеспечение химических исследований», Ярославль, 2006; IV Московской международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2007; XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2007; 4rd International Symposium «Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources», Moscow (Russia), 2007; 4th International Conference "Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine", Moscow-Nizhny Novgorod-Moscow, 2008;

XVI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2009.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ в российских и международных научных изданиях, в том числе 4 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК, и 10 публикаций в сборниках научных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит: введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, описание результатов и обсуждения, заключение, выводы, список литературы, включающий 186 наименований (7 - отечественных, 179 - зарубежных) и 3 приложения. Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста и содержит 21 рисунок и 8 таблиц.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура и морфология вируса иммунодефицита человека

ВИЧ относится к семейству ретровирусов, подсемейству лентивирусов. Лентивирусы вызывают хронические инфекции с длинным латентным периодом, персистирующей репродукцией вируса и поражением ЦНС. Возбудители типичных лентивирусных инфекций — вирус висны, вызывающий заболевание у овец, вирус иммунодефицита обезьян и вирус кошачьего иммунодефицита.

Зрелые вирионы вируса иммунодефицита человека имеют сферическую форму, их размеры не превышают 100-120 нм в диаметре. Снаружи вирус окружен липидной мембраной, в которую встроены 72 гликопротеиновых комплекса. Каждый из этих комплексов образован тремя молекулами поверхностного гликопротеина (gpl20) и тремя молекулами гликопротеина, пронизывающего мембрану (gp41). Связь между gpl20 и gp41 довольно слабая, и поверхностный гликопротеин может спонтанно отсоединяться от вируса. Поэтому gpl20 обнаруживается в сыворотке крови [17], а также в лимфоидной ткани ВИЧ-инфицированных пациентов [18]. При отпочковывании ВИЧ-1 от клетки ее мембранные белки, в том числе HLA классов I и II, и молекулы адгезии, в частности ICAM-1 (Inter-Cellular Adhesion Molecule 1), встраиваются в липидную мембрану вируса. Изнутри к липопротеиновой оболочке прилегает матриксный белок р17. Сердцевину вируса (капсид) составляет капсидный белок р24, который окружает белково-нуклеиновый комплекс: две молекулы вирусной РНК, связанные с протеином р7 и обратной транскриптазой рбб. Вирус содержит все необходимые для репликации ферменты: обратную транскриптазу, интегразу р32 и протеазу pi 1 [19].

Репродукция большинства ретровирусов определяется тремя генами: gag, pol и env (рис. 1). Название генов произошло от кодируемых ими белков:

gag — «groupantigen» (капсидный белок), pol — «polymerase» (полимераза), env — «envelope» (белки внешней оболочки) [20]. Классическая схема генома ретровирусов записывается как 5' LTR-gag-pol-env-LTR 3'. Оба конца генома содержат длинные концевые повторы LTR [21], которые обеспечивают интеграцию в клеточный геном и вирусных белков не кодируют. Гены gag и env кодируют белки капсида и внешней оболочки, ген pol — обратную транскриптазу и другие ферменты. Среди 9000 пар нуклеотидов генома ВИЧ содержится еще шесть генов — vif, vpu, vpr, tat, rev и nef. Ранее гены nef, vif, vpr и vpu называли дополнительными, поскольку репликация in vitro возможна и без их участия. В последние годы функция этих генов и кодируемых ими белков была уточнена. Установлено, что продукты генов nef, tat и rev синтезируются в ранней фазе репликации ВИЧ.

\ р32 интегроза

pi 1 p6i протеаад обратная

транс «риггтаза

Рис. 1. Геном ВИЧ-1.

Регуляторные белки tat и rev накапливаются в ядре и связываются с определенными участками вирусной РНК: первый - с трансактивируемым регуляторным элементом (TAR) в области длинных концевых повторов, второй — с rev-чувствительным регуляторным элементом (RRE) в области гена env. Белок tat активирует транскрипцию промоторной области длинных

концевых повторов и необходим для репликации вируса почти во всех культурах клеток. Для функционирования белка tat необходимо присутствие клеточного кофактора — циклина Т1 [22]. Белки tat и rev стимулируют транскрипцию провирусной ДНК в РНК, элонгацию РНК, транспорт РНК из ядра в цитоплазму и необходимы для трансляции. Белок rev обеспечивает также транспорт компонентов вируса из ядра и переключение синтеза регуляторных белков на синтез структурных белков.

Другой вид вируса иммунодефицита человека - ВИЧ-2, является менее патогенным и передается с меньшей вероятностью, чем ВИЧ-1. Отмечено, что люди, инфицированные ВИЧ-2, обладают также слабым иммунитетом и к ВИЧ-1 [23]. Проведенные детальные исследования