Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1"

На правах рукописи

Акимов Денис Владимирович

Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы

ВИЧ-1

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в ГУ НИИ биомедицинской РАМН

химии

им.

В.Н. Ореховича

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Поройков Владимир Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Иванов Алексей Сергеевич

доктор биологических наук Кабанкин Анатолий Сергеевич

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва

Защита диссертации состоится 9 февраля 2006 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: Москва, Погодинская ул., 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН

Автореферат разослан 29 января 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета кандидат биологических наук

Былинкина В.С.

Î006A

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Будучи впервые зарегистрирован в 1981 году, в настоящее время СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) входит в первую десятку наиболее опасных инфекционных заболеваний. Возбудитель СПИДа был идентифицирован в 1983 году, им оказался вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), относящийся к семейству ретровирусов (Змушко, Белозеров, 2000). В 1986 г. начались клинические испытания первого антиретровирусного препарата зидовудина, а кульминацией этого направления исследований стало создание комбинированной химиотерапии (Richman, 2001). Несмотря на все принимаемые меры, число людей, инфицированных ВИЧ, неуклонно растет во всем мире (JafFe, 2004). По данным Объединенной программы ООН по СПИДу (UNAIDS), приведенным в ежегодном «Докладе о развитии эпидемии СПИДа», всего в мире к концу 2004 г. было инфицировано 39,4 млн. человек, впервые заражено в 2004 г. - 4,9 млн. человек, умерло от СПИДа за этот же год - 3,1 млн. человек. В России на конец 2004 г. официально зарегистрировано свыше 300 тысяч инфицированных, а согласно оценочным подсчетам количество инфицированных может составлять от 860 тысяч до 1 миллиона человек.

Существующие лекарственные препараты для терапии СПИДа обладают значительными недостатками: 1) ко всем известным анти-ВИЧ препаратам возникает резистентность; 2) для них характерно наличие существенных побочных эффектов, обусловленных в том числе наличием в организме человека схожих макромолекул-мишеней; 3) зарегистрированные препараты имеют высокую стоимость.

В связи с этим актуальной проблемой является создание новых высокоэффективных лекарственных препаратов, направленных на подавление вирусной активности в организме. Одним из наиболее перспективных направлений считается в настоящее время поиск ингибиторов интегразы ВИЧ-1 (De Clercq, 2004; Pommier et al., 2005). Интеграза непосредственно участвует в репликационном цикле вируса, обеспечивая процессинг вирусной ДНК (реакция З'-процессинга), а также перенос и встраива шрусной

ДНК в хромосомы клетки-мишени (реакция переноса цепи). Так как у интегразы нет близкородственных белков в организме человека, можно ожидать, что отрицательное влияние ее ингибиторов на организм пациентов в ходе лечения будет гораздо меньшим.

Процесс создания нового лекарственного соединения включает несколько этапов: 1) выбор макромолекулы-мишени; 2) поиск нового вещества с требуемой фармакологической активностью; 3) испытание его в эксперименте, т.е. проведение фармакологических и токсикологических исследований; 4) оптимизация свойств найденных базовых структур; 5) получение разрешения уполномоченного органа (Фармакологический комитет Министерства здравоохранения и социального развития РФ) и проведение испытаний вещества в клинике; 6) получение разрешения на медицинское применение; 7) организация производства и маркетинг препарата. Выбор мишени и поиск базовых структур являются ключевыми этапами. В классическом варианте поиска проводится синтез многочисленных соединений-аналогов известного биологически активного вещества, проведение длительных и дорогостоящих испытаний. Использование методов компьютерного конструирования лекарств позволяет значительно сократить расходы и ускорить разработку новых препаратов за счет уменьшения числа "холостых" синтезов и испытаний (Иванов, Арчаков, 2000).

Учитывая значительный интерес к созданию новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1, представляется разумной попытка компьютерного поиска новых ингибиторов среди химических соединений из баз данных коммерчески доступных веществ. Можно надеяться, что компьютерный поиск потенциально активных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволит существенно повысить эффективность процесса разработки новых лекарственных препаратов за счет отсева веществ, для которых заведомо прогнозируется низкая вероятность наличия данной биологической активности, либо с высокой вероятностью прогнозируются побочные токсические эффекты.

Цель работы: поиск новых перспективных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 среди веществ из баз данных коммерчески доступных образцов химических соединений с применением компьютерного скрининга.

Задачи исследования

1. Создание обучающей выборки, включающей известные ингибиторы интегразы ВИЧ-1, для повышения точности компьютерного прогноза антиинтегразной активности. Обучение компьютерной программы PASS и оценка точности прогноза.

2. Определение элементов структуры в молекулах ингибиторов интегразы ВИЧ-1, положительно или отрицательно влияющих на проявление данной биологической активности.

3. Поиск и отбор наиболее перспективных потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 в БД коммерчески доступных образцов химических соединений.

4. Экспериментальное тестирование отобранных соединений на антиинтегразную активность и сопоставление полученных результатов с компьютерным прогнозом.

Положения, выносимые на защиту

1. Показана возможность поиска ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе прогноза их спектров биологической активности.

2. Определены особенности структуры ингибиторов интегразы ВИЧ-1, влияющие на проявление ими данной биологической активности.

3. Выявлено два новых соединения, ингибирующих интегразу ВИЧ-1 в экспериментах in vitro.

Научная новизна. Впервые создана база данных из 90 представителей ингибиторов интегразы ВИЧ-1, относящихся к классу ароматических производных дикетокарбоновых кислот. На этой выборке веществ проведено

обучение программы PASS, что позволило получить новый «инструмент» для прогнозирования данного вида биологической активности. Впервые показана возможность проведения компьютерного прогноза для химических соединений на определение ингибиторной активности в отношении интегразы ВИЧ-1. Предложена оригинальная модель псевдо-фармакофора, определяющая структурно-важные участки молекул для данного вида биологической активности. Показано, что среди доступных образцов химических соединений есть вещества, которые с определенной вероятностью могут обладать ингибиторной активностью в отношении интегразы ВИЧ-1. Выявлено два новых соединения, биологическое тестирование которых подтвердило, что они являются ингибиторами интегразы ВИЧ-1.

Научно-практическая значимость. Предложенный в настоящей работе подход к компьютерному поиску новых потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволил отобрать и исследовать восемь новых химических соединений, для двух из которых ингибиторная активность в отношении интегразы ВИЧ-1 подтверждена в биологических экспериментах на рекомбинантном ферменте. Проведенный анализ взаимосвязей «структура-активность» расширяет представления исследователей об ингибиторах интегразы и, дополняя базу знаний, облегчает последующие попытки рационального поиска ингибиторов интегразы ВИЧ-1. Предложенный нами метод поиска ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволяет существенно снизить временные и финансовые затраты при поиске новых базовых структур ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на следующих конференциях:

• VII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2000.

• VIII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2001.

• II Российская конференция молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 2001.

• 14th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationships, Bournemouth, UK, 2002.

• III Съезд биофизиков России, Воронеж, 2004.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественных и зарубежных научных изданиях. Из них 5 - статей и 6 -тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из 8 глав, содержащих введение, литературный обзор, описание объектов и методов исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список цитированной литературы, включающего 105 источников. Диссертационная работа изложена на 93 страницах машинописного текста и содержит 7 рисунков и 10 таблиц.

Материалы и методы исследования

Для поиска новых потенциальных ингибиторов интегразы использовалась программа PASS (Poroikov, Filimonov, 2005), которая на основе структурной формулы химического соединения предсказывает около 1000 видов биологической активности, включая фармакологические эффекты, механизмы действия и специфическую токсичность.

Для обучения программы PASS нами была подготовлена выборка из 90 ароматических производных дикетокарбоновых кислот - ингибиторов интегразы ВИЧ-1 (рис. 1), содержащая структурные формулы этих веществ, данные об их ингибиторной активности (значения 1С50 - концентрации, при которой происходит 50% ингибирование фермента), полученные из различных литературных источников.

Рис. 1. Интерфейс созданной нами базы данных по ингибиторам интегразы ВИЧ-1, относящихся к производным дикетокарбоновых кислот.

При создании базы данных по ингибиторам интегразы ВИЧ-1 была использована СУБД ISIS/Base (MDL, http://www.mdl.com/) - позволяющая хранить, обновлять и обрабатывать информацию о химических веществах, включая данные о структурной формуле, молекулярной массе, биологической активности, литературные ссылки и т.д. На основе созданной нами обучающей выборки проведено обучение компьютерной программы PASS. Ее валидация в режиме скользящего контроля с исключением по одному показала, что средняя точность прогноза составляет около 99%.

Поиск новых потенциальных ингибиторов интегразы проводили в базах данных коммерчески доступных образцов химических соединений ASINEX Gold Collection 2004 года (около 230000 соединений), ASINEX Platinum Collection 2004 года (около 150000 соединений) (http://www.asinex.com/) и IBS 2004 года (около 350000 соединений) (http://www.ibscreen.com/).

Тестирование ингибиторной активности в отношении интегразы ВИЧ-1 проводилось д.х.н. М.Б. Готтих с сотрудниками в Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ согласно стандартным методикам (Bischerour et al., 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Компьютерный поиск потенциальных ингибиторов интегразы

Из представленных на рис. 2 результатов прогноза антиинтегразной активности для веществ из коммерчески доступных баз данных образцов химических соединений (около 750 тысяч структур) очевидно, что число таких веществ сравнительно невелико. Как видно из рисунка, лишь для трех веществ ингибиторная активность в отношении интегразы ВИЧ-1 прогнозируется с вероятностью более 70%, и лишь для 12 веществ - с вероятностью более 30%. Из отобраных соединений 8 были найдены нами в базе данных IBS и 3 в базе данных AsInEx, однако они являлись дублями веществ из первой базы. Кроме того, было обнаружено одно соединение, входившее в состав обучающей выборки.

14 12 10 8

Z

6 4 2 0

Рис. 2. Количество потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1, прогнозируемых для веществ из коммерчески доступных баз данных. По оси абсцисс отложены пороговые значения вероятности прогнозируемой антиинтегразной активности Ра,%; по оси ординат - количество веществ в выборке (И), для которых данная активность прогнозируется с вероятностью, превосходящей пороговые значения.

Значение Ра (вероятность наличия данного вида биологической активности) может использоваться в качестве гибкого критерия, позволяющего отбирать большее или меньшее количество перспективных веществ для экспериментального тестирования. Для эффективного использования данные компьютерного прогноза должны рассматриваться специалистами (экспертами) с учетом поставленных задач. Так, например, если целью исследования является поиск базовых структур лекарств (lead compounds), обладающих существенной новизной (New Chemical Entity, NCE), целесообразно отбирать из массива доступных веществ не те структуры, для которых величина Ра близка к единице (они могут оказаться близкими аналогами опубликованных в литературе ингибиторов интегразы), а соединения с Ра<0.7. Риск получения отрицательного результата в эксперименте тем больше, чем меньше величина Ра, однако и новизна такой структуры (при подтверждении прогноза в эксперименте) будет более высокой. Наоборот, если поставлена цель поиска близких аналогов известных препаратов (так называемых "me-too-drugs"), то из массива имеющихся образцов следует отобрать вещества с наибольшими значениями Ра. В отличие от методов поиска «по сходству» химической структуры, на основе компьютерного прогноза PASS можно выявить вещества, которые существенно отличаются от классов соединений, составляющих обучающую выборку. Для такого рода веществ вероятность проявления искомой активности (Ра) может быть менее 50%.

Так как в результате компьютерного скрининга коммерчески доступных химических баз данных нами было найдено только 8 уникальных соединений с Ра>30%, то все они были отобраны для последующего экспериментального исследования в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, МГУ (Табл. 1).

В результате биологического тестирования 8 соединений, для двух из них было подтверждено наличие ингибирующей активности в отношении реакции

переноса цепи, причем ICjo составила 49 мкМ (рис. 3) и 75 мкМ соответственно (рис. 4).

Таблица 1

Структуры потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1, найденных в базе данных IBS

Структура Pa, Pi (прогноз ингибиторной активности) Экспериментально е значение IC50, мкМ

о «-J О н STOCK2S-36356 0.714/0.001 > 100

STOCK1S-04849 0.598/0.001 75

о" .JL-iJ 0 1 STOCK IS-10945 0.454 / 0.001 > 100

\ / =\ /° °\ yh^L}^5 F F О STOCK2S-05609 0.332 / 0.001 > 100

о-Ч STOCK 1S-05951 0.303 /0.001 49

Таблица 1 (продолжение)

"Л X 8ТОСК48-04306 0.576/0.001 > 100

8ТОСК48-79879 0.545/0.001 > 100

о 8ТОСК4Б-83532 0.356/0.001 > 100

8ТОСК18-05667 Контрольное соединение 0.849 / 0.000 25

• *

I *

II

1С ге зо « и «с 7С

яащммршщтинаяияор* I

Рис. 3. Результаты экспериментальной оценки ингибирования интегразы ВИЧ-1 веществом 8ТОСК18-05951.

СИ, о он

Рис. 4. Результаты экспериментальной оценки ингибирования интегразы ВИЧ-1 веществом STOCK1S-04849.

Следует заметить, что несмотря на то, что поиск проводился среди достаточно обширной (более 750 тысяч) выборки химических веществ, лишь для 8 соединений прогнозируемая вероятность ингибиторной активности в отношении интегразы ВИЧ-1 составила более 30%. Интеграза ВИЧ-1 -довольно трудный объект для исследования: структура полноразмерного фермента все еще не получена ввиду различной растворимости отдельных доменов, что сильно осложняет попытки поиска ингибиторов с использованием молекулярного докинга. Как фермент, интеграза не имеет аналогов в клетках млекопитающих, что с одной стороны делает ее привлекательной мишенью для создания новых препаратов из-за вероятного значительного снижения побочных эффектов таких лекарств, но с другой стороны ставит исследователей перед трудной задачей из-за невозможности привлечь опыт создания ингибиторов для аналогичного типа ферментов. Ароматические производные дикетокарбоновых кислот в свою очередь относятся к малораспространенному классу химических веществ, представленному в использованных базах данных весьма ограниченно.

Производные дикетокарбоновых кислот это обратимые конкурентные ингибиторы интегразы ВИЧ-1. Согласно современным представлениям (Pommier et al., 2005), дикетокарбоновые ингибиторы хелатируют ионы металлов в каталитическом сайте интегразы, нарушают взаимодействие

вирусной и хромосомальной ДНК и, таким образом, стабилизируют макромолекулярный комплекс "интеграза - вирусная ДНК" в 3'-процессированном состоянии. Вероятно, дикетокарбоновые ингибиторы интегразы ВИЧ-1 относятся к новому классу конкурентных ингибиторов, так называемым "ингибиторам интерфейса", т.е. ингибиторам межмолекулярного узнавания (Pommier et al., 2005). Таким образом, отобранные соединения, обладая новизной структуры расширяют подкласс дикетокарбоновых ингибиторов интегразы и могут быть использованы в дальнейшем при рациональном поиске новых ингибиторов интегразы.

Необходимо отметить, что в группу отобранных на основе компьютерного прогноза для биологического тестирования веществ было включено контрольное соединение, ингибиторная активность в отношении интегразы ВИЧ-1 которого была установлена ранее (Pais et al., 2002). Это вещество (STOCK 1S-05667) также было обнаружено в базе данных IBS и тестировалось вместе с остальными веществами. При этом его ингибиторная активность была сопоставима с данными, опубликованными в оригинальной работе (Pais et al., 2002).

Определение участков молекул-ингибиторов, влияющих на проявление активности.

Для того чтобы проанализировать данные по локализации элементов структуры молекул ингибиторов, вносящих положительный или отрицательный вклад в проявление данного вида биологической активности, мы использовали возможности компьютерной программы PASS по визуализации взаимосвязей «структура-активность». Нами были проанализированы структуры отобранных для создания обучающей выборки ингибиторов интегразы ВИЧ-1, а также структуры найденных с помощью компьютерного поиска потенциальных ингибиторов интегразы и определены такие фрагменты молекул.

В табл. 2 в качестве примера представлены структуры двух веществ (STOCK1S-05951 и STOCK 1S-04849), проявивших наибольшую активность при биологическом тестировании на ингибиторной активности в отношении интегразы ВИЧ-1, а также контрольного вещества (STOCK 1S-05667), для которого ингибиторная активность была известна из литературы. Светло-серым цветом обозначены структурные элементы, наличие которых существенно для проявления активности; серым - структурные элементы, которые слабо влияют на активность, черным - отрицательно влияющие на активность.

Из табл. 2 видно, что наибольший вклад в проявление ингибиторной активности в отношении интегразы ВИЧ-1 вносит кето-енольный фрагмент молекул, в то время как фенольному кольцу соответствует нейтральная или слабоположительная роль. Нитро-группа, замещающая водород в мета-положении бензольного кольца молекулы STOCK 1S-05951, вносит существенный отрицательный вклад в проявление ингибиторной активности. Метальные группы в орто-положениях молекулы STOCK 1S-04849 также снижают ингибиторный эффект вещества в отношении интегразы ВИЧ-1. Коррекция типа или положения данных заместителей возможно привела бы к усилению ингибиторных свойств молекул STOCK 1S-05951 и STOCK 1S-04849. В молекуле контрольного вещества STOCK 1S-05667 структурных элементов, вносящих отрицательный вклад в проявление антиинтегразной активности, нами не обнаружено, поэтому закономерно то, что для данного вещества экспериментальное значение 1С50 лучше, чем для STOCK 1S-05951 и STOCK 1S-04849.

Таблица 2

Идентификация фрагментов структуры, влияющих на проявление ингибиторной активности в отношении интегразы ВИЧ-1

Структура Идентификатор ICso) мкМ

О О 1| | V V W II 1 II С^ ^С О С 0Л0 STOCK 1S-05951 49

сн4 о О ^¿^ ^ Я ^ sX ^ ^ О О 0 О О II 1 II STOCK 1S-04849 75

О О V,^ w 11 1 я С^ ^С О с STOCK 1S-05667 25

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложенный в настоящей работе подход к компьютерному поиску новых потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволил отобрать среди сотен тысяч коммерчески доступных веществ и исследовать восемь новых у химических соединений, для двух из которых ингибиторная активность в

отношении интегразы ВИЧ-1 подтверждена в биологических экспериментах in V vitro. Проведенный анализ взаимосвязей «структура-активность» расширяет

представления исследователей об ингибиторах интегразы и создает базу для рационального поиска новых высокоактивных ингибиторов интегразы ВИЧ-1. Определение областей структуры, вносящих наибольший и наименьший вклады в проявление ингибиторной активности в отношении интегразы ВИЧ-1 позволило идентифицировать фрагменты молекул, вносящие значимый вклад в проявление данного вида биологической активности, которые согласуются с данными, полученными на основе трехмерного моделирования.

ВЫВОДЫ

1. Создана обучающая выборка, состоящая из 90 дикетокарбоновых ингибиторов интегразы ВИЧ-1, которая позволила получить наиболее полную информацию о взаимосвязи их структуры и активности. После обучения программы PASS точность компьютерного прогноза ингибиторной активности в отношении интегразы ВИЧ-1 составила более 99%.

2. Анализ взаимосвязи «структура-активность» дикетокарбоновых * ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволил определить структурные элементы,

вносящие положительный и отрицательный вклад в проявление данного вида биологической активности.

3. В результате виртуального скрининга более чем 750 тысяч коммерчески доступных образцов химических соединений отобрано 8 веществ, для которых проявление антиинтегразной активности наиболее вероятно.

4. В результате экспериментального тестирования отобранных соединений на ингибиторную активность выявлено 2 ранее не описанных в литературе ингибитора интегразы ВИЧ-1, относящихся к классу производных дикетокарбоновых кислот.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Poroikov V., Filimonov D., Akimov D. Can new actions be found for old pharmaceuticals through computer prediction of biological activity? // Newsletter of The QSAR and Modelling Society, 2000, No.l 1, pp. 19-22.

2. Шабельникова Е.И., Акимов Д.В., Поройков B.B. Применение компьютерной системы PASS для анализа спектра биологической активности лекарственных препаратов. // VII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2000, с.560.

3. Poroikov V., Akimov D., Shabelnikova E., and Filimonov D. Top 200 Medicines: Can New Actions Be Discovered Through Computer-Aided Prediction? // SAR & QSAR in Environmental Research, 2001, No. 12 (4), pp. 327-344.

4. Акимов Д.В., Поройков B.B., Филимонов Д.А., Никлаус М. Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы вируса иммунодефицита человека. // VTII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2001, с.537.

5. Акимов Д.В., Поройков В.В., Филимонов Д.А. Компьютерное прогнозирование новых видов активности для 200 наиболее популярных лекарств. // II Российская конференция молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 2001, с. 250.

6. Акимов Д.В., Филимонов Д.А., Поройков В.В. Ингибиторы интегразы -возможное будущее ВИЧ/СПИД терапии. // Химико-фармацевтический журнал, 2002, т. 36, сс. 3-7.

7. Akimov D., Filimonov D., Poroikov V. Computer-aider search for new HIV-1 integrase inhibitors // 14th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationships, September 8-13,2002, Bournemouth, UK, Poster #160.

8. Филимонов Д.А., Акимов Д.В., Поройков В.В. Метод самосогласованной регрессии для количественного анализа связи структуры и свойств химических соединений. // Химико-фармацевтический журнал, 2004, т. 38, сс. 24-24.

9. Акимов Д.В., Поройков В.В. Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы вируса иммунодефицита человека. // III Съезд биофизиков России, Воронеж 2004, с. 750.

Ю.Филимонов Д.А., Бородина Ю.В., Лагунин А.А., Акимов Д.В., Рудик А.В., Поройков В.В. Компьютерное прогнозирование биологической активности химических соединений. // III Съезд биофизиков России, Воронеж, 2004, с. 801.

П.Акимов Д.В., Филимонов Д.А., Приказчикова Т.А., Готтих М.Б., Поройков В.В. Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1. // Биомедицинская химия, 2005, т. 51, сс. 335-340.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность всему коллективу Лаборатории структурно-функционального конструирования лекарств ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Марку Никлаусу и Раджешри Карки (Лаборатория медицинской химии Национального института рака, США) за консультирование по широкому спектру вопросов, относительно ингибирования интегразы ВИЧ-1, компании InterBioScreen Ltd. и лично профессору Виктору Георгиевичу Карцеву за предоставленные образцы химических соединений, д.х.н. Марине Борисовне Готтих и ее сотрудникам за экспериментальное тестирование антиинтегразной активности

Для заметок

Для заметок

Заказ N° 2538 Подписано в печать 27.12.2005 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 0,75

im А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Акимов, Денис Владимирович

Список используемых сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Структура вируса иммунодефицита человека.

2.1.1. Морфология.

2.1.2. Репликационный цикл.

2.2. Интеграза ВИЧ-1.

2.3. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1.

2.3.1. Низкомолекулярные ингибиторы из природных источников.

2.3.2. Синтетические гидроксилированные ароматические соединения.

2.3.3. Природные пептиды.

2.3.4. Сульфаты, сульфонаты и нуклеотиды -ингибиторы интегразы ВИЧ-1.

2.3.5. Конкурентные необратимые ингибиторы интегразы.

2.3.6. Дикетокарбоновые кислоты и их производные.

2.3.7. Компьютерное конструирование ингибиторов интегразы.

3. Объекты и методы.

3.1. Объекты.

3.2. Методы.

3.2.1. Валидация точности прогноза.

3.2.2. Тестирование PASS на гетерогенной выборке химических соединений.

3.2.3. Применение PASS для поиска новых биологически активных соединений.

3.2.4. Методы экспериментального тестирования ингибиторов интегразы ВИЧ-1 in vitro.

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Создание обучающей выборки.

4.2. Обучение и валидация программы.

4.3. Компьютерный поиск потенциальных ингибиторов.

4.4. Тестирование отобранных веществ на антиинтегразную активность.

4.5. Определение роли отдельных структурых участков в проявлении ингибиторной активности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1"

Актуальность темы. С момента регистрации первых случаев заболевания в 1981 году [Gottlieb et al. 1981; Masur et al. 1981; Siegal et al. 1981], к настоящему времени СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) входит в первую десятку наиболее опасных инфекционных заболеваний. Возбудитель СПИДа был идентифицирован в 1983 году [Gallo et al. 1983; Gelmann et al. 1983; Barre-Sinoussi et al. 1983], им оказался вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), относящийся к семейству ретровирусов [Змушко, Белозеров, 2000] . К 1986 г. начались клинические испытания первого антиретровирусного препарата зидовудина, а кульминацией этого направления стало создание комбинированной химиотерапии [Vella, Palmisano, 2000; Richman, 2001]. Несмотря на все принимаемые профилактические меры, число людей, инфицированных ВИЧ, неуклонно растет во всем мире [Jaffe, 2004]. По данным Объединенной программы ООН по СПИДу (UNAIDS) [http://www.unaids.org/], приведенным в ежегодном «Докладе о развитии эпидемии СПИДа», всего в мире к концу 2004 г. было инфицировано 39,4 млн. человек, впервые заражено в 2004 г. - 4,9 млн. человек, умерло от СПИДа за этот же год - 3,1 млн. человек. В России на конец 2004 г. официально зарегистрировано свыше 300 тысяч инфицированных, а согласно оценочным подсчетам количество инфицированных может составлять от 8 60 тысяч до 1 миллиона человек.

Существующие лекарственные препараты для терапии СПИДа обладают значительными недостатками [Cohen, 2002; Sabin et al., 2005]: 1) ко всем известным анти-ВИЧ препаратам возникает резистентность; 2) для них характерно наличие существенных побочных эффектов, обусловленных в том числе наличием в организме человека схожих макромолекул-мишеней;

3) зарегистрированные препараты имеют высокую стоимость.

В связи с этим актуальной проблемой является создание новых высокоэффективных лекарственных препаратов, направленных на подавление вирусной активности в организме. Одним из наиболее перспективных направлений в настоящее время считается разработка ингибиторов интегразы ВИЧ-1 [De Clercq, 2004; Anthony, 2004; Pommier, et al. 2005]. Так как у интегразы нет родственных белков в организме человека, можно ожидать, что отрицательное влияние ее ингибиторов на пациентов в ходе лечения будет гораздо меньшим.

Процесс создания нового лекарственного препарата включает несколько этапов: 1) выбор макромолекулы-мишени; 2) поиск нового вещества с требуемой фармакологической активностью;

3) испытание его в эксперименте, то есть проведение фармакологических и токсикологических исследований;

4) оптимизация свойств найденных базовых структур; 5) получение разрешения уполномоченного органа (Фармакологический комитет Министерства здравоохранения и социального развития РФ) и проведение испытаний вещества в клинике; б) получение разрешения на медицинское применение; 7) организация производства и маркетинг препарата. Выбор мишени и поиск базовых структур являются ключевыми этапами. В классическом варианте поиска проводится синтез многочисленных соединений-аналогов известного биологически активного вещества, проведение длительных и дорогостоящих испытаний. При этом исследователь замкнут в кругу представлений о структуре нового лекарства как очередного представителя уже известной группы аналогов. Применение на первом этапе методов компьютерного анализа и прогноза позволяет преодолеть эти недостатки. Использование методов компьютерного конструирования лекарств позволяет резко сократить расходы и ускорить разработку новых препаратов за счет уменьшения числа "холостых" синтезов и испытаний [Иванов, Арчаков, 2000].

Учитывая значительный интерес к созданию новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1, представляется разумной попытка компьютерного поиска новых ингибиторов среди химических соединений из баз данных коммерчески доступных веществ. Можно надеяться, что компьютерный поиск потенциально активных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволит существенно повысить эффективность процесса разработки новых лекарственных препаратов за счет отсева веществ, для которых заведомо прогнозируется низкая вероятность наличия данной биологической активности, либо с высокой вероятностью прогнозируются токсические эффекты.

Целью данной работы является поиск перспективных структур новых лекарств, ингибирующих интегразу ВИЧ-1 на основе компьютерного скрининга веществ из баз данных доступных образцов химических соединений.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

• Создание обучающей выборки, включающей известные ингибиторы интегразы ВИЧ-1, для повышения точности компьютерного прогноза антиинтегразной активности. Обучение компьютерной программы PASS и оценка точности прогноза.

• Определение элементов структуры в молекулах ингибиторов интегразы ВИЧ-1, положительно или отрицательно влияющих на проявление данной биологической активности.

• Поиск и отбор наиболее перспективных потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 в БД коммерчески доступных образцов химических соединений.

• Экспериментальное тестирование отобранных соединений на антиинтегразную активность и сопоставление полученных результатов с компьютерным прогнозом.

Положения, выносимые на защиту:

1. Показана возможность поиска ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе прогноза их спектров биологической активности.

2. Определены особенности структуры ингибиторов интегразы ВИЧ-1, влияющие на проявление ими данной биологической активности.

3. Выявлено два новых соединения, ингибирующих интегразу ВИЧ-1 в экспериментах in vitro.

Научная новизна. Впервые создана база данных из 90 представителей ингибиторов интегразы ВИЧ-1, относящихся к классу ароматических производных дикетокарбоновых кислот. На этой выборке веществ проведено обучение программы PASS, что позволило получить новый «инструмент» для прогнозирования данного вида биологической активности. Впервые показана возможность проведения компьютерного прогноза для химических соединений на определение ингибиторной активности в отношении интегразы ВИЧ-1. Предложена оригинальная модель псевдо-фармакофора, определяющая структурно-важные участки молекул для данного вида биологической активности. Показано, что среди доступных образцов химических соединений есть вещества, которые с определенной вероятностью могут обладать ингибиторной активностью в отношении интегразы ВИЧ-1. Выявлено два новых соединения, биологическое тестирование которых подтвердило, что они являются ингибиторами интегразы ВИЧ-1.

Научно-практическая значимость. Предложенный в настоящей работе подход к компьютерному поиску новых потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволил отобрать и исследовать восемь новых химических соединений, для двух из которых ингибиторная активность в отношении интегразы ВИЧ-1 подтверждена в биологических экспериментах на рекомбинантном ферменте. Проведенный анализ взаимосвязей «структура-активность» расширяет представления исследователей об ингибиторах интегразы и, дополняя базу знаний, облегчает последующие попытки рационального поиска ингибиторов интегразы ВИЧ-1. Предложенный нами метод поиска ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволяет существенно снизить временные и финансовые затраты при поиске новых базовых структур ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на следующих конференциях:

• VII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2000.

• VIII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2001.

• II Российская конференция молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 2001.

• 14th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationships, Bournemouth, UK, 2002.

• III Съезд биофизиков России, Воронеж, 2004.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественных и зарубежных научных изданиях. Из них 5 - статей и 6 - тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из 8 глав, содержащих введение, литературный обзор, описание объектов и методов исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список цитированной литературы, включающего 105 источников. Диссертационная работа изложена на 93 страницах машинописного текста и содержит 7 рисунков и 10 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Акимов, Денис Владимирович

6. выводы

1. Создана обучающая выборка, состоящая из 90 дикетокарбоновых ингибиторов интегразы ВИЧ-1, которая позволила получить наиболее полную информацию о взаимосвязи их структуры и активности. После обучения программы PASS точность компьютерного прогноза ингибиторной активности в отношении интегразы ВИЧ-1 составила более 99%.

2. Анализ взаимосвязи «структура-активность» дикетокарбоновых ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволил определить структурные элементы, вносящие положительный и отрицательный вклад в проявление данного вида биологической активности.

3. В результате виртуального скрининга более чем 750 тысяч коммерчески доступных образцов химических соединений отобрано 8 новых веществ, для которых проявление антиинтегразной активности наиболее вероятно.

4. В результате экспериментального тестирования отобранных соединений на ингибиторную активность выявлено 2 ранее не описанных в литературе ингибитора интегразы ВИЧ-1, относящихся к классу производных дикетокарбоновых кислот.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Poroikov V., Filimonov D., Akimov D. Can new actions be found for old pharmaceuticals through computer prediction of biological activity? // Newsletter of The QSAR and Modelling Society, 2000, No.11, pp.19-22.

2. Шабельникова Е.И., Акимов Д.В., Поройков В. В. Применение компьютерной системы PASS для анализа спектра биологической активности лекарственных препаратов. // VII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2000, с.560.

3. Poroikov V., Akimov D., Shabelnikova E., and Filimonov D. Top 200 Medicines: Can New Actions Be Discovered Through Computer-Aided Prediction? // SAR & QSAR in Environmental Research, 2001, No. 12 (4), pp. 327-344.

4. Акимов Д.В., Поройков В.В., Филимонов Д.А., Никлаус М. Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы вируса иммунодефицита человека. // VIII Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 2001, с.537.

5. Акимов Д.В., Поройков В.В., Филимонов Д. А. Компьютерное прогнозирование новых видов активности для 200 наиболее популярных лекарств. // II Российская конференция молодых ученых "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 2001, с. 250.

6. Акимов Д.В., Филимонов Д.А., Поройков В.В. Ингибиторы интегразы - возможное будущее ВИЧ/СПИД терапии. // Химико-фармацевтический журнал, 2002, т. 36, сс. 3-7.

7. Akimov D., Filimonov D., Poroikov V. Computer-aider search for new HIV-1 integrase inhibitors // 14th European Symposium on Quantitative Structure-Activity Relationships, September 8-13, 2002, Bournemouth, UK, Poster #160.

8. Филимонов Д.А., Акимов Д.В., Поройков В.В. Метод самосогласованной регрессии для количественного анализа связи структуры и свойств химических соединений. // Химико-фармацевтический журнал, 2004, т. 38, сс. 24-24.

9. Акимов Д.В., Поройков В. В. Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы вируса иммунодефицита человека. // III Съезд биофизиков России, Воронеж 2004, с. 750.

10. Филимонов Д.А., Бородина Ю.В., Лагунин А.А., Акимов Д.В., Рудик А.В., Поройков В.В. Компьютерное прогнозирование биологической активности химических соединений. // III Съезд биофизиков России, Воронеж, 2004, с. 801.

11. Акимов Д.В., Филимонов Д.А., Приказчикова Т.А., Готтих М.Б., Поройков В. В. Компьютерный поиск новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1. // Биомедицинская химия, 2005, т. 51, с с. 335-340.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность всему коллективу Лаборатории структурно-функционального конструирования лекарств ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, доктору М. Никлаусу (Лаборатория медицинской химии Национального института рака, США) за консультирование по широкому спектру вопросов, касающихся ингибирования интегразы ВИЧ-1, д.х.н. М.Б. Готтих и сотрудникам ее лаборатории за экспериментальное тестирование выявленных нами соединений, компании InterBioScreen Ltd. и лично профессору Виктору Георгиевичу Карцеву за предоставленные образцы химических соединений.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предложенный в настоящей работе подход по компьютерному поиску новых потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 позволил отобрать среди сотен тысяч коммерчески доступных веществ и исследовать 8 новых химических соединений. Проверка показала, что для двух из них ингибиторная активность в отношении интегразы ВИЧ-1 подтверждена в биологических экспериментах на рекомбинантном ферменте. Сравнительно невысокие величины ингибиторной активности исследованных веществ возможно обусловлены наличием некоторых неблагоприятных заместителей, что особенно хорошо заметно для вещества STOCK1S-O5951. Последующий анализ активных соединений и оптимизация химической структуры за счет подбора благоприятных заместителей могут значительно улучшить ингибирующие свойства данных соединений. Проведенный нами анализ взаимосвязей «структура-активность» расширяет представления исследователей об ингибиторах интегразы и, дополняя базу знаний, может облегчить последующие попытки рационального поиска ингибиторов интегразы ВИЧ-1. Определение областей молекул, вносящих положительный и отрицательный вклад в проявление ингибиторной активности в отношении интегразы ВИЧ-1 дополняют данные, полученные на основе трехмерного моделирования, и создают основу для направленного синтеза новых высокоактивных веществ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Акимов, Денис Владимирович, Москва

1. Змушко Е.И., Белозеров Е.С. ВИЧ-инфекция. 2000, С.Петербург .

2. Иванов А.С., Арчаков А. И. Компьютер и Лекарства. Энциклопедия Современное Естествознание, 2000, Т. 8, стр. 182-192.

3. Abd-Elazem I.S., Chen H.S., Bates R.B., Huang R.C. Isolation of two highly potent and non-toxic inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) integrase from Salvia miltiorrhiza. // Antiviral. Res. 2002, 55: 91-106.

4. Ahn M.J., Kim C.Y., Lee J.S., Kim T.G., Kim S.H., Lee C.K., et al. Inhibition of HIV-1 integrase by galloyl glucoses from Terminalia chebula and flavonol glycoside gallates from Euphorbia pekinensis. // Planta. Med. 2002, 68: 457-9.

5. Anthony N.J. HIV-1 integrase: a target for new AIDS chemotherapeutics. // Curr. Top. Med. Chem. 2004, 4: 97990.

6. Bukrinsky M.I., Sharova N., Dempsey M.P., Stanwick T.L., Bukrinskaya A.G., Haggerty S., Stevenson M. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89: 6580-4.

7. Buolamwini J.K., Assefa H. CoMFA and CoMSIA 3D QSAR and Docking Studies on Conformationally-Restrained Cinnamoyl HIV-1 Integrase Inhibitors: Exploration of a Binding Mode at the Active Site. // J. Med. Chem. 2002, 45: 841-52.

8. Cai M., Zheng R., Caffrey M., Craigie R., Clore G.M., and Gronenborn A.M. Solution structure of the N-terminal zinc binding domain of HIV-1 integrase. // Nat. Struct. Biol. 1997, 4: 567-577.

9. Cherepanov P., Maertens G., Proost P., Devreese В., Van Beeumen J., Engelborghs Y., De Clercq E., Debyser Z. HIV-1 integrase forms stable tetramers and associates with LEDGF/p75 protein in human cells. // J. Biol. Chem. 2003, 278: 372-81.

10. Chow S.A. In vitro assays for activities of retroviral integrase. // Methods 1997, 12: 306-17.

11. Cohen J. Therapies: Confronting the limits of success. // Science 2002, 296: 2320-2324.

12. Dayam R., Neamati N. Small-molecule HIV-1 integrase inhibitors: the 2001-2002 update. // Curr. Pharm. Des. 2003, 9: 1789-802.

13. Dayam R., Sanchez Т., Clement 0., Shoemaker R., Sei S., Neamati N. Beta-diketo acid pharmacophore hypothesis. 1. Discovery of a novel class of HIV-1 integrase inhibitors. // J. Med. Chem. 2005, 48: 111-20.

14. De Clercq E. HIV-chemotherapy and -prophylaxis: new drugs, leads and approaches. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2004, 36(9): 1800-22.

15. Debyser Z., Cherepanov P., Pluymers W., De Clercq E. Assays for the evaluation of HIV-1 integrase inhibitors. // Methods. Mol. Biol. 2001, 160: 139-55.

16. Drake R.R., Neamati N., Hong H., Pilon A.A., Sunthankar P., Hume S.D., et al. Identification of a nucleotide binding site in HIV-1 integrase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 4170-5.

17. Dupont R., Jeanson L., Mouscadet J.F., Cotelle P. Synthesis and HIV-1 integrase inhibitory activities of catechol and bis- catechol derivatives. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11: 3175-8.

18. Este J.A., Cabrera C., Schols D., Cherepanov P., Gutierrez A., Witvrouw M., et al. Human immunodeficiency virus glycoprotein gpl20 as the primary target for the antiviral action of AR177 (Zintevir). // Mol. Pharmacol. 1998, 53: 340-5.

19. Farnet C.M., Bushman F.D. HIV-1 cDNA integration: requirement of HMG I (Y) protein for function of preintegration complexes in vitro. // Cell 1997, 88: 48392.

20. Filimonov D.A., Poroikov V.V., Borodina Y., Gloriozova T. Chemical similarity assessment trough multilevelneighborhoods of atoms: definition and comparison with the other descriptors. // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1999, 39, 666-670.

21. Gelmann E.P., Popovic M., Blayney D., Masur H., Sidhu G., Stahl R.E., Gallo R.C. Proviral DNA of a retrovirus, human T-cell leukemia virus, in two patients with AIDS. // Science 1983, 220: 862-5.

22. Goldgur Y., Craigie R., Cohen G.H., Fujiwara Т., Yoshinaga Т., Fujishita Т., et al. Structure of the HIV-1 integrase catalytic domain complexed with an inhibitor: a platform for antiviral drug design. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 13040-3.

23. Guenther S., Nair V. Binding modes of two novel dinucleotide inhibitors of HIV-1 integrase. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12: 2233-6.

24. Hazuda D.J., Felock P., Witmer M., Wolfe A., Stillmock K., Grobler J.A., et al. Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV- 1 replication in cells. // Science 2000, 287: 646-50.

25. Hazuda D.J., Hastings J.C., Wolfe A.L., Emini E.A. A novel assay for the DNA strand-transfer reaction of HIV-1 integrase. // Nucleic. Acids Res. 1994, 22: 1121-2.

26. Jaffe H. Public health. Whatever happened to the U.S. AIDS epidemic? // Science. 2004, 305: 1243-4.

27. Johnson A.A., Marchand C., Pommier Y. HIV-1 integrase inhibitors: a decade of research and two drugs in clinical trial. // Curr. Top. Med. Chem. 2004, 4: 1059-77.

28. Joseph R. Prous. The Year's Drug News, 1994, Prous Science.

29. Kalpana G.V., Marmon S., Wang W., Crabtree G.R., Goff S.P. Binding and stimulation of HIV-1 integrase by a human homolog of yeast transcription factor SNF5. // Science 1994, 266: 2002-6.

30. King P.J., Robinson W.E. Jr. Resistance to the anti-human immunodeficiency virus type 1 compound L-chicoric acid results from a single mutation at amino acid 140 of integrase. // J. Virol. 1998, 72: 8420-4.

31. Lagunin A., Stepanchikova A., Filimonov D., Poroikov V. PASS: prediction of activity spectra for biologically active substances. // Bioinformatics 2000, 16: 747-8.

32. Lubkowski J., Yang F., Alexandratos J., Wlodawer A., Zhao H., Burke T.R., Jr., et al. Structure of the catalytic domain of avian sarcoma virus integrase with a bound HIV-1integrase-targeted inhibitor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 4831-6.

33. Makhija M.T., Kulkarni V.M. Eigen value analysis of HIV-1 integrase inhibitors. // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2001, 41:1569-77.

34. Makhija M.T., Kulkarni V.M. QSAR of HIV-1 integrase inhibitors by genetic function approximation method. // Bioorg. Med. Chem. 2002, 10: 1483-97.

35. Marchand C., Zhang X., Pais G.C., Cowansage K,, Neamati N., Burke T.R. Jr, Pommier Y. Structural determinants for HIV-1 integrase inhibition by beta-diketo acids. // J. Biol. Chem. 2002, 277: 12596-603.

36. Mazumder A., Gazit A., Levitzki A., Nicklaus M., Yung J., Kohlhagen G., et al. Effects of tyrphostins, protein kinase inhibitors, on human immunodeficiency virus type 1 integrase. // Biochemistry 1995, 34: 15111-22.

37. Mazumder A., Neamati N., Sunder S., Owen J., Pommier Y. In "Methods in Cellular and Molecular Biology": Antiviral Evaluation. / Eds. Kinchington D., Schinazi R. The Humana Press, Inc.: Totowa, NJ, 1999, pp. 327-38.

38. Miller M.D., Farnet C.M., Bushman F.D. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. // J. Virol. 1997, 71: 5382-90.

39. Mustata G.I., Brigo A., Briggs J.M. HIV-1 integrase pharmacophore model derived from diverse classes of inhibitors. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14: 1447-54.

40. Neamati N. Patented small molecule inhibitors of HIV-1 integrase: a ten-year saga. // Expert. Opin. Ther. Pat. 2002, 12: 709-24.

41. Neamati N., Barchi Jr. J.J. New paradigms in drug design and discovery. // Curr. Top. Med. Chem. 2002, 2: 211-27.

42. Neamati N., Hong H., Sunder S., Milne G.W., Pommier Y. Potent inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 integrase: identification of a novel four-point pharmacophore and tetracyclines as novel inhibitors. // Mol. Pharmacol. 1997, 52: 1041-55.

43. Neamati N., Lin Z., Karki R.G., Orr A., Cowansage K., Strumberg D., et al. Metal-dependent inhibition of HIV-1 integrase. // J. Med. Chem. 2002, 45: 5661-70.

44. Pannecouque C., Pluymers W., Van Maele В., Tetz V., Cherepanov P., De Clercq E., Witvrouw M., Debyser Z. New class of HIV integrase inhibitors that block viral replication in cell culture. // Curr. Biol. 2002, 12: 116977 .

45. Parissi V., Calmels C., De Soultrait V.R., Caumont A., Fournier M., Chaignepain S., Litvak S. Functional interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase with human and yeast HSP60. // J. Virol. 2001, 75: 11344-53.

46. Perryman A.L., McCammon J.A. AutoDocking dinucleotides to the HIV-1 integrase core domain: Exploring possible binding sites for viral and genomic DNA. // J. Med. Chem. 2002, 45: 5624-7.

47. Pinskaya M., Romanova E., Volkov E., Deprez E., Leh H., Brochon J.C., Mouscadet J.F., Gottikh M. HIV-1 integrase complexes with DNA dissociate in the presence of short oligonucleotides conjugated to acridine. // Biochemistry. 2004, 43: 8735-43.

48. Pluymers W., Neamati N., Pannecouque C., Fikkert V., Marchand C., Burke T.R., Jr., et al. Viral entry as the primary target for the anti-HIV activity of chicoric acid and its tetra-acetyl esters. // Mol. Pharmacol. 2000, 58: 641-8.

49. Pluymers W., Pais G., Van Maele В., Pannecouque C., Fikkert V., Burke T.R., Jr., et al. Inhibition of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Integration by Diketo Derivatives. // Antimicrob. Agents. Chemother. 2002, 46: 3292-7.

50. Pommier Y., Johnson A.A., Marchand C. Integrase inhibitors to treat HIV/AIDS. // Nat. Rev. Drug. Discov. 2005, 4: 23648 .

51. Poroikov V., Akimov D., Shabelnikova E., Filimonov D. Top 200 medicines: can new actions be discovered through computer-aided prediction? // SAR QSAR Environ. Res. 2001, 12: 327-44.

52. Poroikov V., Filimonov D. PASS: Prediction of biological activity spectra for substances. In: "Predictive Toxicology". Marcel Dekker, 2004, 459-478.

53. Poroikov V.V., Filimonov D.A., Borodina Yu.V., Lagunin A.A., and Kos A. Robustness of biological activity spectra predicting by computer program PASS for noncongeneric sets of chemical compounds. // J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2000, 40, 1349-1355.

54. Reinke R.A., King P.J., Victoria J.G., McDougall B.R., Ma

55. G., Mao Y., et al. Dicaffeoyltartaric acid analogues inhibit human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) integrase and HIV-1 replication at nontoxic concentrations. // J. Med. Chem. 2002, 45: 3669-83.

56. Richman D.D. HIV chemotherapy. // Nature 2001, 410: 9951001.

57. Ridley C.P., Reddy M.V., Rocha G., Bushman F.D., Faulkner D.J. Total synthesis and evaluation of lamellarin alpha 20-Sulfate analogues. // Bioorg. Med. Chem. 2002, 10: 3285-90.

58. Rowley D.C., Hansen M.S.Т., Rhodes D., Sotriffer C.A., Ni

59. H.H., McCammon J.A., et al. Thalassiolins A-C: New marine-derived inhibitors of HIV cDNA integrase. // Bioorg. Med. Chem. 2002, 10: 3619-25.

60. Segura-Totten M., Wilson K.L. BAF: roles in chromatin, nuclear structure and retrovirus integration. // Trends. Cell. Biol. 2004, 14: 261-6.

61. Singh S.B., Zink D.L., Bills G.F., Pelaez F., Teran A., Collado J., et al. Discovery, structure and HIV-1 integrase inhibitory activities of integracins, novel dimeric alkyl aromatics from Cytonaema sp. // Tetrahedron. Lett. 2002, 43: 1617-20.

62. Stanwell C., Ye В., Yuspa S.H., Burke T.R., Jr. Cell protein cross-linking by erbstatin and related compounds. // Biochem. Pharmacol. 1996, 52: 475-80.

63. Stepanchikova A.V., Lagunin A.A., Filimonov D.A., Poroikov V.V. Prediction of biological activity spectra for substances: evaluation on the diverse sets of drug-like structures. // Curr. Med. Chem. 2003, 10: 225-33.

64. Taktakishvili M., Neamati N., Pommier Y., Nair V. Discovery of a nuclease-resistant, non-natural dinucleotide that inhibits HIV-1 integrase. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11: 1433-5.

65. Turner B.G., Summers M.F. Structural Biology of HIV. // J. Mol. Biol. 1999, 285, pp. 1-32.

66. USP Dictionary of USAN and International Drug Names, 1996, The United States Pharmacopeial Convention, Inc.

67. Vella S., Palmisano L. Antiretroviral therapy: state of the HAART. // Antiviral. Res. 2000, 45: 1-7.

68. Wai J.S., Egbertson M.S., Payne L.S., Fisher Т.Е., Embrey M.W., Tran L.O., Melamed J.Y., Langford H.M., Guare J.P. Jr., Zhuang L., Grey V.E., Vacca J.P., Holloway M.K.,

69. Naylor-Olsen A.M., Hazuda D.J., Felock P.J., Wolfe A.L., Stillmock K.A., Schleif W.A., Gabryelski L.J., Young S.D. 4-Aryl-2,4-dioxobutanoic acid inhibitors of HIV-1 integrase and viral replication in cells. // J. Med. Chem. 2000, 43: 4923-6.

70. Yoshinaga Т., Sato A., Fujishita Т., Fujiwara T. S-1360: in vitro activity of a new HIV-1 integrase inhibitor in clinical development. In: Abstracts of the 9th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infec-tions. Seattle, 2002: abstract 8.

71. Zhang C.F., Nakamura N., Tewtrakul S., Hattori M., Sun Q.S., Wang Z.T., et al. Sesquiterpenes and alkaloids from Lindera chunii and their inhibitory activities against HIV-1 integrase. // Chem. Pharm. Bull. 2002, 50: 1195-200.

72. Zhang X., Neamati N., Lee Y.K., Orr A., Brown R.D., Whitaker N., et al. Arylisothiocyanate-containing esters of caffeic acid designed as affinity ligands for HIV-1 integrase. // Bioorg. Med. Chem. 2001, 9: 1649-57.