Характеристика интегразы пенообразующего вируса и оценка возможности ее использования для направленной интеграции ДНК

Княжанская, Екатерина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика интегразы пенообразующего вируса и оценка возможности ее использования для направленной интеграции ДНК
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика интегразы пенообразующего вируса и оценка возможности ее использования для направленной интеграции ДНК"

005000904

На правах рукописи

Книжанскал Екатерина Сергеевна

Характеристика интегразы пенообразуннцего вируса и оценка возможности ее использования для направленной интеграции ДНК

03.01.03 - молекулярная биология

1 7 НОЯ 2011

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2011

492189890251

Работа выполнена в отделе химии нуклеиновых кислот НИИ физико-химической биологии имени Л.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В.

Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Готтнх Марина Борисовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Карпов Вадим Львович

доктор химических наук

Тншков Владимир Иванович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии паук

Институт молекулярной генетики

Защита состоится 9 декабря 2011 года в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, аудитория 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 8 ноября 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Генная терапия различных заболеваний является одним из наиболее перспективных путей развития современной медицины и биотехнологии. Большинство одобренных генно-терапевтических протоколов основа но на использовании вирусных векторов для доставки "лечебных генов". Перспективно использование ретровирусных векторов, способных встраивать вносимую ДНК в клеточный геном. Встраивание ДНК осуществляется вирусным ферментом интегразой (ИН), которая сиквенс-специфично взаимодействует с вирусной ДНК, но не проявляет сиквенсных предпочтений при связывании клеточной ДНК. В ходе интеграции ИН взаимодействует с рядом клеточных белков, формируя прединтеграционный комплекс (ПИК), белки которого приводят интеграцию в определенные области генома. Так, показано, что ВИЧ-1 склонен интегрироваться в транскрибируемые гены, а вирус лейкемии мышей (MLV) - в участки старта транскрипции. Эти особенности интеграции ретровирусов несут в себе опасность инсерционного мутагенеза: «выключения» генов или активации онкогенов. И действительно, отмечены случаи возникновения онкологических заболеваний у пациентов, которые подвергались генной терапии с использованием ретровирусных векторов. Таким образом, очевидно, что необходима разработка методики, обеспечивающей направленность интеграции таких векторов в безопасные участки генома. Также актуален вопрос, какой именно ретровирус выбрать в качестве основы для создания генно-терапевтических векторов. Основным приемом при разработке систем направленной интеграции является присоединение к ИН белкового домена, обладающего сайт-специфической ДНК-связывающей активностью. Однако до сих пор не было предложено ни одной системы, способной направлять интеграцию ДНК в безопасный сайт в человеческом геноме.

Перспективными векторами для генной терапии считаются спумаретровирусы (СВ). Представители этого подсемейства способны заражать человека, не вызывая патологического эффекта. Векторы на основе СВ размножаются в большом наборе клеточных культур, и, в частности, эффективно вводятся в гематопоэтические линии. Известно, что СВ векторы не демонстрируют опасных предпочтений в интеграции, свойственных для векторов на основе MLV и ВИЧ-1. Тем не менее, ИН СВ еще не использовалась для разработки систем направленной интеграции. Самым хорошо исследованным представителем подсемейства СВ является вирус PFV (prototype foamy virus), в силу чего именно этот вирус целесообразно использовать для первой попытки разработать систему направленной интеграции на основе СВ.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка системы для направленной интеграции ДНК на основе гибрида ИН PFV и белка, способного

специфично связываться с безопасным участком в геноме человека. В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:

1) охарактеризовать ДНК-связывающую и каталитическую активности ИН PFV;

2) провести дизайн и конструирование нового белка, способного направить интеграцию в безопасный участок в геноме человека;

3) создать систему направленной интеграции на основе гибрида ИН PFV и сконструированного белка и оценить способность этой системы направлять интеграцию в сайт узнавания этого белка в плазмидной ДНК in vitro.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе впервые изучена роль металла-кофактора в процессе интеграции короткого ДНК-субстрата ИН PFV в плазмидный вектор и показано, что в присутствии Mg2+ значительно увеличивается выход продукта согласованной интеграции. Изучено влияние модификации ДНК-субстрата ИН PFV на эффективность реакции З'-процессинга и выявлены нуклеотиды, с которыми сближены остатки лизина каталитического домена ИН PFV. Исследовано влияние коротких одноцепочечных олигонуклеотидов на активность ИН PFV в реакции З'-процессинга, и показано, что для них характерен двухсайтовый механизм связывания, обеспечивающий концентрационно-зависимую активацию, а затем ингибирование ИН.

Впервые предложено направлять интеграцию в участок длиной 18 п.о. в гене лейциновой тРНК. Синтезирован de novo ген белка tRL18, состоящего из шести доменов «цинковые пальцы» и способного специфически связывать выбранный участок. Выделен белок tRL18, сконструирован набор гибридных белков на основе tRL18 и интеграз PFV и ВИЧ-1, проведена характеристика этих белков. Исследована способность гибридных белков направлять интеграцию ДНК в плазмидный вектор, содержащий сайт узнавания tRL18, in vitro и показано, что гибридные белки на основе ИН PFV обеспечивают иной профиль интеграции, чем ИН дикого типа: снижение частоты интеграции в сайт узнавания tRL18 и повышение частоты интеграции в участки, непосредственно прилегающие к сайту.

Систему направленной интеграции, сконструированную и опробованную в данной работе, можно рассматривать как основу для создания генно-терапевтических векторов на основе PFV.

Публикации н апробация работы. По материалам работы опубликовано 4 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах. Результаты работы были доложены на следующих конференциях: международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006», секция «Биология» (Москва, 12-15 апреля 2006 г.); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008 г.); 14lh International Conference "Microbial enzymes in biotechnology and medicine" (Казань, 2009 г.); VIII111 European symposium of Protein society (Цюрих, Швейцария, 14-18 июня 2009 г.); the EMBO Meeting 2010 (Барселона, Испания, 47 сентября 2010 г.); 1st International Interdisciplinary Conference "Modern problems in systemic

regulation of physiological functions" (Сафага, Египет, 10-21 декабря 2010 г.); the EMBO Meeting 2011 (Вена, Австрия, 10-13 сентября 2011 г.).

Структура » объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 37 рисунками и 9 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 230 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

На сегодняшний день достаточно много известно об особенностях строения ИН PFV и об ее взаимодействии с ДНК. Существуют данные рентгено-структурного анализа ее комплекса с ДНК (Hare S. et а!., 2010). Однако на момент начала нашей работы эта ИН, также как и сам вирус PFV, были изучены сравнительно мало. В этой связи мы в первую очередь исследовали особенности каталитической активности ИН PFV и ее взаимодействия с ДНК-субстратом. Полученные данные сравнивались с данными о функционировании наиболее изученной ретровирусной ИН - ИН ВИЧ-1. Большинство из описанных в литературе систем направленной интеграции использовали ИН ВИЧ-1, включая и самую успешную из таких систем (Гаи IV. et al, 2006, Su К. et at., 2009). Мы решили использовать обе эти ИН для конструирования системы направленной интеграции. Таблица 1. Нуклеогидиые последовательности ДНК-субстратов ИН PFV и ИН ВНЧ-1

Субстрат Нуклеотидная последовательность дуплекса Название олнгонуклеотида

U5pfv 3'-TATGTTTTAAGGTACTGTTA-5' 5'-ATACAAAATTCCATGACAAT-3' (ШАФ)

(U5B'")

U5piv-2 3'-TATGTTTTAAGGTACTGTTA-5' 5' -ATACAAAATTCCATGACA—-3' (U5A',Sv)

(и5В-2"р)

U5pfvFL 3'—TATGTTTTAAGGTACTGTTA-5' 5' -FL-ATAC AAAATTCC ATG AC AAT-3' (U5Arp)

(U5BpAFL)

U5pfv27 3 •-TTAGTTATATGTTTTAAGGTACTGTTA-5' 5'-AATCAATATACAAAATTCCATGACAAT-3' (U5A27'1")

(U5B2 7pjv)

U5hiv 3' -CAC ACCTTTTAG AG АТС GTCA-5' 5'-GTGTGGAAAATCTCTAGCAGT-3' (U5A"")

(U5Bh'v)

U5lliv-2 3 '-C AC AC CTTTTAG AG АТС GTCA-5' 5' -GTGTGG AAAATCTCTAG С A—3' (U5A""')

(U5B

Катализируемый ретровирусными ИН процесс встраивания вирусной ДНК в клеточный геном состоит из двух стадий. На первой из них, называемой З'-процессинг, ИН отщепляет динуклеотид с З'-концов каждой цепи вирусной ДНК (АТ в случае И'V, ОТ в случае ВИЧ-1). На втором этапе ИН катализирует нуклеофильную атаку З'-гидроксильных

групп процессированных цепей ДНК по межнуклеотидным фосфатам обеих цепей клеточной ДНК с образованием ковалентного продукта. Обе эти реакции можно воспроизвести in vitro с использованием очищенного препарата ИН и олигонуклеотидных дуплексов, имитирующих конец вирусной ДНК (Таблица 1, Нуклеотидные последовательности ДНК-субстратов ИН PFV и ИН ВИЧ-1). Известно, что свойства препарата ИН сильно зависят от метода выделения. В нашей работе обе ИН были выделены согласно методике (Leh Н. et а!., 2000) без детергентов и в присутствии ионов Mg2+ и Zn2\

1. Характеристика ИН РРУ

1.1. Исследование ДНК-связывающей активности ИН РРУ

Для определения сродства ИН РРУ к своему субстрату, дуплекс ШрГу в фиксированной концентрации (2 нМ) титровался возрастающими концентрациями ИН РРУ. Полученные комплексы анализировались методом торможения в геле в неденатурирующих условиях. В приближении исследуемой системы к теории простого лиганд-рецепторного взаимодействия по уравнению (1) было рассчитано кажущееся значение К^арр, которое соответствовало 15-20 нМ. Это значение близко к определенному ранее арр ИН ВИЧ-1 с субстратом Ш1"" (40 нМ, йергег Е. е/ а!., 2004). Наше значение для ИН РРУ ниже полученного другой исследовательской группой (£>е/е/г^ О. е/ а1, 2008) - 130 нМ, однако различия могут быть обусловлены разными методами определения К^ арр.

[РШ]0 + [/АЧ„ + К, '-ТаРШ], + [№]„ + к;1)' - 4 X [РШ], X [//^

2 (1) Нужно отметить, что метод торможения в ■ .,.. ■ .■.,- _ геле не позволяет выявить разницу в ДНК-

связывающей активности ретровирусной ИН к ее ДНК-субстрату и к некоторой случайной последовательности ДНК той же длины. Таким образом, полученное нами значение К^ арр является также и константой диссоциации комплекса между ИН РРУ и неспецифической последовательностью ДНК.

Мы также исследовали кинетику

[!N*DNA]-

0,25 ■

0,20-

3 0.15'

§ X 0,10'

0.05'

О.ОО-

10 15 20 ВРЕМЯ, мин

Рисунок 1. Кинетика связывания 2 нМ ДНК со 100 нМ ИН ВИЧ-1 (белые кружки) и ИИ РРУ (черные кружки) при 25°С, связывания ИН РРУ с ДНК, используя для этого исследованная методом поляризации „ ^

флуоресценции. субстрат, несущии флуоресцеин на 5 -конце В-

цепи Таблица 1). При добавлении препарата ИН РРУ к раствору

наблюдалось резкое увеличение анизотропии флуоресцентного сигнала. Зависимость

изменения анизотропии флуоресценции

в присутствии ИН РРУ от времени приведена на Рис.Рисунок 1. Кинетика связывания 2 нМ ДНК со 100 нМ ИН ВИЧ-1 (белые кружки) и ИН РРУ (черные кружки) при 25°С, исследованная методом поляризации флуоресценции.. Согласно

этим данным, полное связывание ДНК-субстрата достигается в течение трех минут, в то время как связывание ДНК-субстрата ИН ВИЧ-1 занимает 20 мин (Smolov М. et al., 2006). Таким образом, несмотря на то, что сродство к ДНК-субстрату у обоих ферментов примерно одинаково, ИН PFV значительно быстрее связывает свой ДНК-субстрат.

1.2. Исследование каталитической активности ИН PFV

Ретровирусные ИН являются металл-зависимыми ферментами; в качестве металла-кофактора in vivo выступают ионы Mg2+, in vitro им также может быть Мп'+. Известно, что ИН ВИЧ-1 проявляет большую специфичность при связывании ДНК-субстрата в присутствии Mg2+, однако замена иона металла не сказывается на каталитической активности ИН ВИЧ-1, выделенной без использования детергентов. Также известно, что ИН PFV, выделенная с детергентом, проявляет большую каталитическую активность в присутствии ионов Мп2+, нежели ионов Mgz+ (Pähl A. and Flügel R., 1993; Lee H. К. et al, 2005). Поскольку способ выделения ИН влияет на ее каталитическую активность, мы исследовали влияние кофактора на активность ИН PFV, выделенной без детергентов.

1.2.1. Активность ИН PFV в реакции З'-процессинга и гомологичного переноса

цепи

Реакцию З'-процессинга in vitro проводили, используя субстрат U5ph и принятые в литературе условия реакции. В ходе З'-процессинга ИН отщепляет динуклеотид AT с 3'-конца B-цепи. Эффективность этой реакции можно оценить по накоплению укороченного продукта на радиоавтографе (Рис. 2А). Мы показали, что в присутствии Мп2+ ИН PFV в 810 раз более активна, чем в присутствии Mg+ (Рис. 2А).

А Б

ИН PFV, HM MHPFV.HM HHPFV.HM ИН PfV, HM ■ ИН ____ '---1.ЦЦ--—-'--- I лрвцвсоф|е*д» -ИН ----— -ИН ________ j

20 нт 1внт

^ss i»?'

■ДМ«-AT

нглроцпсгмруемп« Ц/*пь

О- „

Мц" Мп"

Рисунок 2. Активность ИН РКУ' в реакции З'-процессинга (А) и гомологичного переноса цени (Б) в буфере, содержащем (левая часть радиоавтографов) и Мп: (правая часть радиоавтографов) при возрастающих концентрациях ИН (0-10-25-50-100-200-500 нМ для З'-процессинга и 0-10-50-100-500 нМ для переноса цепи).

Те же закономерности наблюдались и при проведении реакции переноса цепи (Рис. 2Б). В этой реакции ИН использует субстрат 115-2, в котором В-цепь укорочена на 2 нуклеотида и имитирует продукт З'-процессинга; при этом дуплекс 115-2 может использоваться ИН и как субстрат, и как мишень интеграции. Это так называемый гомологичный перенос цепи. Эффективность этой реакции можно оценить по накоплению продуктов с меньшей подвижностью, чем у исходного субстрата (Рис. 2Б).

При работе с ИН ВИЧ-1 обычно используют большой избыток фермента по отношению к субстрату (обычно > 30:1). Оптимальными являются 2-4 нМ концентрация

субстрата и 50-100 нМ концентрация фермента. Мы исследовали зависимость эффективности З'-процессинга от концентрации ИН PFV и определили, что максимальный выход продукта З'-процессинга достигается при 100-250 нМ ИН. Реакция проводилась в присутствии Мп2+, так как выход продукта в этом случае выше, что снижает ошибки при оценке данных. Далее, мы подобрали оптимальную концентрацию субстрата U5pfv, варьируя его концентрацию и оставив концентрацию ИН 100 нМ постоянной. Оптимальная концентрация субстрата составила 3-10 нМ; ее повышение не приводило к увеличению выхода продукта реакции. Таким образом, условия реакции З'-концевого процессинга для ИН ВИЧ-1 и PFV схожи. Значительное превышение концентрации фермента над субстратом объясняется тем, что каталитически активна олигомерная форма ИН (в З'-процессинге одного конца вирусной ДНК задействуется минимум 2 субъединицы ИН) и, в силу специфики выделения, не все молекулы ИН в растворе являются активными. Стоит отметить, что ранее в нашей лаборатории был показан так называемый однооборотный механизм каталитического процесса для ИН ВИЧ-1, при котором один каталитически активный мультимер ИН связывается с молекулой субстрата, катализирует отщепление динуклеотида и остается связанным с ДНК в силу высокого сродства к ней, а значит выводится из дальнейшего каталитического процесса (Smolov М. et al., 2006). Возможно, эта же модель может быть применима и для ИН PFV.

Мы также исследовали зависимость накопления продуктов З'-процессинга от времени и рассчитали стационарную скорость накопления продукта на линейной стадии роста Vi¡near=0,014 нмоль/мин. Сравнение полученной для ИН PFV величины Vijncar с аналогичной характеристикой для ИН ВИЧ-1, равной 0,011 нмоль/мин (Smolov М. et al., 2006), показывает, что оба фермента характеризуются очень низкой скоростью З'-процессинга.

1.2.2. Активность ИН PFVeреакции гетерологичного переноса цепи

Мы также сравнили активности ИН PFV и ИН ВИЧ-1 в реакции гетерологичного переноса цепи, т.е. интеграции ДНК-субстрата в плазмидную ДНК. В качестве субстрата использовались дуплексы U5-2, содержащие радиоактивную метку на 5'-конце процессированной цепи. В качестве мишени для интеграции использовали плазмиду pbr322 (Fermentas). В ходе этой реакции ИН может встраивать одну молекулу ДНК-субстрата в одну цепь плазмидной ДНК, этот процесс называется точечной интеграцией и приводит к образованию релаксированной формы плазмиды. Возможно также встраивание двух молекул ДНК-субстрата в разные цепи плазмидной ДНК, приводящее к образованию ее линейной формы. Этот процесс называется согласованной интеграцией и соответствует интеграции in vivo. Анализ продуктов реакции, содержащих радиоактивную метку, проводился в неденатурирующем агарозном геле.

Продукт-точечной интеграции (релаксированная форма плазмиды)

Продукт сотласо ванной интеграции [линейная форма плазмиды)

Mft^/liyGF

Рисунок 3. Анализ в недеиатурируещем агарозном геле продуктов интеграции в плазмнду pbr322. Гетерологичный перенос субстрата L'5-2",v, катализуемый ИН PFV в буфере, содержащем Мп' (А) н Mg2+ (Б). В. Гетерологичный перенос субстрата U5-2biv, катализуемый ИН ВИЧ-1 в буфере, содержащем Мп2+, в присутствии LEDGF. Все эксперименты проводились при возрастающих концентрациях ИН: 0-0,5-0,75-1-1,5 мкМ.

В буфере, содержащем Мп2+, гетерологичный перенос, катализуемый ИН PFV, происходит достаточно эффективно (Рис. ЗА), причем примерно 30% от общего продукта составляет продукт согласованной интеграции, соответствующий по подвижности линейной форме плазмиды. Интересно, что в присутствии ионов Mg2+, общая эффективность интеграции в плазмиду практически не отличалась от интеграции в присутствии Мп2+, однако распределение продуктов точечного и согласованного переноса изменилось: около 80% от общего продукта интеграции пришлось на согласованную интеграцию (Рис. ЗБ). В целом, наши результаты согласуются с результатами (Valkov Е. el al., 2009), однако, мы впервые показали влияние иона металла-кофактора на распределение продуктов гетерологичной интеграции ИН PFV.

В случае ИН ВИЧ-1, нам не удалось детектировать продуктов интеграции в плазмиду ни в присутствии Mg2+, ни Мп2+. Только добавление в реакционную смесь активатора ИН ВИЧ-1, белка LEDGF, позволило осуществить гетерологичный перенос субстрата U5-2h,v с преимущественным формированием релаксированной формы плазмиды (Рис. ЗВ). Транскрипционный фактор LEDGF/p75 является клеточным ко-фактором ИН ВИЧ-1. Известно, что in vitro ИН ВИЧ-1 в комплексе с LEDGF проявляет повышенную активность в реакции гомологичного переноса цепи. В то же время, недавно было показано (Kessl J. J. et al, 2011.), что пресформированный комплекс ИН/LEDGF не способен катализировать согласованную интеграцию. Авторы полагают, что причиной этого служит жесткая конформация комплекса ИН/LEDGF, не способная к перестройке, необходимой для успешного протекания согласованной интеграции, то есть для одновременного переноса двух молекул субстратной ДНК (в клетке - двух концов вирусной ДНК) в ДНК-мишень. В нашем эксперименте добавление LEDGF стимулировало активность ИН ВИЧ-1 в реакции гетерологичного переноса цепи, однако процент продукта согласованной интеграции был крайне низок.

Итак, мы показали, что в реакции З'-процессинга ИН РРУ слабо активна в буфере с но проявляет высокую активность в буфере, содержащем Мп2+. В то же время в реакции гетерологичного переноса субстрата Ш-2 в плазмидный вектор ИН РРУ активна как в буфере с Мп , так и с , а ИН ВИЧ-1 способна осуществить эту реакцию исключительно в присутствии ее природного клеточного ко-фактора ЬЕОСИ.

2. Изучение особенностей взаимодействия ИН РИУ с концевым участком Ш-субстрата

Как уже отмечалось, на момент начала нашей работы в литературе отсутствовали данные о структуре ИН РРУ и ее комплекса с субстратом. Считается, что все ретровирусные интегразы содержат в каталитическом центре консервативный 0,0,Е-мотив; для ИН ВИЧ-1 также показано наличие двух остатков лизина, взаимодействующих с концом вирусной ДНК. Мы решили выяснить, присутствуют ли в структуре ИН РРУ остатки лизина, также контактирующие с нуклеотидами в районе точки процессинга. Для этого мы использовали набор аналогов Ш-субстрата, в которых природные дезоксирибонуклеотиды были заменены на модифицированные нукпеотиды, содержащие в 2'-положении 2,3-пропандиольную группировку (Рис. 4Б). Эта группировка может быть окислена КаГО4 с образованием альдегидной группы, которая, в свою очередь, способна формировать основание Шиффа с аминогруппой остатков лизина в структуре белка. Последующее восстановление получающегося соединения КаВН3СК приводит к возникновению прочного ковалентного комплекса между аналогом Ш-субстрата и определенным остатком лизина в белке. Выходы полученных ковалентных комплексов можно оценить путем предварительного введения в аналог субстрата радиоактивной метки и анализа продуктов реакции электрофорезом по методу Лэммли. Такой подход к исследованию взаимодействий ИН РРУ с ДНК-субстратом был применен впервые.

А -а- ж. В

5' - А Т А С Л А А А Т Т С С А Т О А С А А Т - 3" 3' - Т А Т О Т Т Т Т А А О О Т А С Т О Т Т Л - 5'

Vм* °н

° ^ -... ° и 3"

ВХ В4 АЗ МИ

днке

комплексе с ИН ''

Своводная ДНК ^ «И* —

Рисунок 4. Изучение взаимодействия ИН РКУ с модифицированным аналогом субстрата 1)5. А. Положения модифицированных нуклеотидов в дуплексе и5рГ\ Б. Структура модифицированного нуклеотида. В. Ковалентные комплексы, образованные между модифицированными аналогами субстрата и5р У и ИН РРУ. 1 - субстрат В1, 2 - субстрат В4, 3 - субстрат АЗ, 4 - маркеры.

Проведенные нами эксперименты с модифицированными субстратами, содержащими модификации в 1 и 4 положениях процессируемой цепи (В1 и В4, соответственно) и 3 положении непроцессируемой цепи (АЗ) (Рис. 4А), показали успешное образование ковалентных комплексов для всех трех положений, причем выходы этих комплексов были достаточно высокими и сравнимыми по величине (В1 - 34%, В4 - 36%, АЗ - 28%) (Рис. 4В). Высокая эффективность образования ковалентных комплексов позволила нам предположить, что каждый из модифицированных нуклеотидов сближен с остатком лизина в активном центре ИН. Это предположение было позднее подтверждено данными рентгено-структурного анализа кристаллического комплекса ИН РРУ с ДНК субстратом (Наге & а!., 2010).

3. Влияние олигонуклеотидиых ингибиторов З'-процессинга на активность 1111 РРУ

Цикл работ нашей лаборатории, посвященных поиску ингибиторов ИН ВИЧ-1, выявил интересное влияние на активность этой ИН со стороны коротких одноцепочечных олигонуклеотидов (КОО, длина 10-21 нуклеотидов). Так, было показано, что КОО при низких концентрациях (1-100 нМ) способны стимулировать активность ИН ВИЧ-1 в реакции З'-процессинга, а при увеличении их концентрации наблюдается обратный эффект: ингибирование каталитической активности ИН (Рис. 5А). Также было отмечено, что присоединение молекулы эозина к З'-концу КОО (КОО-Э) усиливает обе эти активности и приводит к их проявлению при более низких концентрациях (Рис. 5Б). Было высказано предположение, что такая активность КОО и КОО-Э обусловлена наличием двух независимых сайтов в составе ИН ВИЧ-1, с каждым из которых эти соединения могут связываться. Эти сайты были названы сайтами ингибирования и активации согласно эффектам, к которым приводит связывание КОО. Сродство КОО к сайту активации выше, чем к сайту ингибирования, поэтому при низких концентрациях КОО связывается преимущественно в сайте активации, а при увеличении концентрации начинается связывание в сайте ингибирования. Присоединение к КОО молекулы эозина повышает аффиность КОО к обоим сайтам в структуре ИН ВИЧ-1.

Мы исследовали влияние КОО и КОО-Э на активность ИН РИУ в реакции З'-процессинга. Использовались КОО состава сатттттотот () ]-ДНК) и СОШиШСШи (11-РНК), а также соответствующие им конъюгаты с эозином - 11-ДНК-Э и 11-РНК-Э. Для этих соединений была показана наибольшая активность как в стимуляции, так и в ингибировании процессинга, катализируемого ИН ВИЧ-1, причем природа сахара (ДНК или РНК) не влияла на величину оказываемого эффекта.

В случае ИН РРУ для трех соединений из четырех исследованных (11-ДНК, 11-ДНК-Э, 11-РНК-Э) было показано наличие той же колоколообразной зависимости активности ИН от концентрации КОО, которая наблюдалась в случае ВИЧ-1 (Рис. 5В): при

низких концентрациях КОО происходила активация фермента, а при повышении концентрации - его ингибирование. Соединение 11-РНК было способно активировать ИН РРУ несколько хуже своего ДНК-аналога, но не проявило ингибирующей активности даже при 100 мкМ концентрации. Следовательно, природа сахара играет важную роль при связывании КОО с ИН РРУ, и РНК-подобная структура соединения 11-РНК значительно снижает сродство КОО в первую очередь к сайту ингибирования.

Присоединение эозина к обоим КОО усилило как активирующий, так и ингибирующий эффект, и, в частности, привело к появлению ингибирующего действия для соединения 11 -ОМ-Э. Для всех испытанных соединений активирующий эффект был сильнее, чем в случае ИН ВИЧ-1, а ингибирующий - слабее.

А Б В

<> иМ

4)0 пМ 10«) нМ SSIOOWllM

| М

2 SO ИМ ;i НЮ llM S250J1M

11-РМК 11-ДНК-Э Т1-РЦ1С'Э

Рисунок 5. Влияние коротких одиоцепочечных олигонуклеотидов и их конъюгатов с эозином на каталитическую активность ИН РКУ и ИН ВИЧ-1 в реакции З'-процессинга. А. Эффективность 3'-процессинга ИН ВИЧ-1 в присутствии 11-ДНК и 11-РНК. Б. Эффективность З'-процессинга ИН ВИЧ-1 в присутствии 11-ДНК-Э и 11-РНК-Э. В. Эффективность З'-процессинга ИН РРУ в присутствии 11-ДНК, 11-РНК, 11-ДНК-Э и 11-РНК-Э.

Наши результаты позволяют предположить, что каталитическая активность всех ретровирусных интеграз в реакции З'-процессинга может быть стимулирована под действием КОО. Влияния КОО на активность обеих интеграз в реакции гомологичного переноса процессированного субстрата Ш-2 нами обнаружено не было.

4. Создание системы направленной интеграции на основе ИН PFV и ИН ВИЧ-1 4.1. Выбор сайта для направленной интеграции в геноме человека

В качестве сайта для направленной интеграции в человеческом геноме мы выбрали участок длиной 18 п.о. в гене лейциновой тРНК (Рис. 6А), который назвали trg. Последовательность trg располагается с гене тРНК лейцина для антикодона TAG (хромосома 17) и в гене тРНК лейцина для антикодона AAG (хромосомы 14, 20, а также два локуса в хромосоме 5). Участок trg удовлетворяет следующим требованиям:

а) сайт trg уникален для генов лейциновой тРНК (согласно поиску в базе данных BLAST);

б) интеграция в него или вокруг него не затрагивает важные для жизнедеятельности клетки и человека участки, поскольку гены тРНК располагаются в геноме в виде тандемных копий и многократно повторены, а частота интеграционных событий не превышает 10-ти на клетку (часто имеет место одна интеграция);

в) сайт trg располагается в транскрипционно-активных областях генома, что обеспечит успешную транскрипцию трансгена.

Таким образом, интеграция в район выбранной нами последовательности не должна привести к нарушению белкового синтеза в клетке, и, в то же время, будет происходить вдали от протоонкогенов и в транскрипционно-активной области генома.

4.2. Дизайн белка, состоящего из доменов «цинковые пальцы» и способного связывать последовательность trg

Белки, имеющие структуру типа «цинковые пальцы», обладают высокой, сиквенс-специфической ДНК-связывающей активностью. Для связывания ДНК им не требуется а 12 3 4 5 5 димеризация. Один домен

5'-AGG TAG CGT GGC CGA GCG-31

з'-тсс АТС gca ccg gct cgc-5' «цинковый палец» имеет

длину около 30 а.к. и

Б 1 YKCPECGKSFSRSDDLVRHQRTHTGEKP-•> 6 GCG ' .,„,,.,,„,

2 YKCPECGKSFSQSGHLTEHQRTHTGEKP — 5 CGA СВЯЗЫВйет ОДИН триплет

3 ykcpecgksfsdpghlvrhqrthtgekp—^ 4 ggc днк. Хорошая изученность

4 YKCPECGKSFSSRRTCRAHQRTHTGEKP-»- 3 CGT

5 YKCPECGKSFSREDNLHTHQRTHTGEKP->■ 2 TAG принципов

6 YKCPECGKSFSRSDHLTNHQRTH -*■ 1 AGG

Рисунок 6. Структуры белка tRL18 и его сайта узнавания trg. А функционирования таких Последовательность trg. Б Аминокислотная белков позволила

последовательность белка tRL18, Красным цветом выделены

консервативные остатки 2-х Cys и 2-х His. Фиолетовым исследователям выявить выделен линкер, соединяющий 2 соседних «пальца». аминокислотную

Последовательность, участвующая в связывании нуклеотидного триплета, выделена зеленым.

последовательность доменов или модулей, распознающих разные триплеты. В связи с этим, в настоящее время доступны программы, способные предсказать аминокислотную последовательность белков «цинковые пальцы» для значительного процента последовательностей ДНК. Мы воспользовались одной из таких программ, Zinc Finger Tools (Mandell J.G. et al., 2006), для получения аминокислотной структуры белка, состоящего из 6 модулей и теоретически способного связывать последовательность trg (Рис. 6Б). Этот белок назвали tRLl8. Его длина составила 163 а.к. С помощью программы предсказания нуклеотидной последовательности по аминокислотной ресурса molbiol.ru (http: w ww.molbiol.ru. scripts О i i 9.h¡m!) была получена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего этот белок (ген trllS), после чего мы приступили к дизайну системы для синтеза этого гена de novo.

4.3. Синтез гена tri¡8

Прежде чем приступить к синтезу гена trlI8, мы оптимизировали его нуклеотидную структуру с учетом кодоновых предпочтений Е. coli, так как именно эту культуру планировалось использовать для последующего выделения белка tRL18. Затем мы приступили к дизайну олигонуклеотидов для синтеза гена. Было использовано две стратегии для сборки гена trll8.

4.3.1. Первый подход к синтезу гена trll8

Первый подход был основан на лигировании коротких олигонуклеотидных фрагментов гена trll8. Каждая из цепей гена была разбита на 15 фрагментов, длина которых составляла от 28 до 45 нуклеотидных звеньев, таким образом, чтобы каждый из фрагментов в одной цепи был комплементарен двум фрагментам в другой цепи. Необходимо отметить, что белок tRL18 содержит большое количество повторяющихся структурных модулей, обеспечивающих организацию «цинковых пальцев». Соответственно, последовательность гена также содержала большое число повторяющихся последовательностей, что могло затруднить правильную сборку олигонуклеотидов. Последовательность каждого из олигонуклеотидных фрагментов была оптимизирована таким образом, чтобы свести к минимуму образование внутримолекулярных дуплексов и шпилек, так как их возникновение могло нарушить синтез гена. Сначала мы проводили одновременное лигирование всех фрагментов с последующей амплификацией лигазной смеси с помощью праймеров, комплементарных концевым участкам гена trll8. Затем попытались собрать ген последовательным наращиванием фрагментов. Однако ни один из этих приемов не позволил нам получить продукт, соответствующий по подвижности целевому гену (около 500 п.о.). В связи с этим, нам пришлось изменить систему сбоки гена trll8 так, как это описано ниже.

4.3.2. Второй подход к синтезу гена trll8

Второй подход к сборке гена был основан на методе полимеразной достройки одноцепочечных участков с последующим лигированием разрывов в отдельных фрагментах. Сборка фрагментов в целый ген trl!8 проводилась методами молекулярного клонирования. В рамках этого подхода, нуклеотидная последовательность гена trll8 была изменена таким образом, чтобы двумя внутренними сайтами для эндонуклеаз рестрикции BsiWI ген был разбит на 3 примерно одинаковые по длине части: А, В и С (Рис. 7). Каждая из этих частей была в свою очередь составлена из 5 олигонуклеотидных фрагментов (длиной от 45 до 60 нуклеотидных остатков). Как и в предыдущем случае, между олигонуклеотидами разных цепей были значительные области перекрывания, между которыми находились одноцепочечные «бреши». Последовательность каждого из олигонуклеотидных фрагментов была еще раз оптимизирована таким образом, чтобы свести к минимуму образование внутримолекулярных дуплексов и шпилек. Пара праймеров Рг5'/РгА служила для амплификации фрагмента А, пара РгВ1/РгВ2 для

амплификации фрагмента В, а пара РгС/РгЗ' для амплификации фрагмента С. Праймер Рг5' содержал сайт для эндонуклеазы рестрикции Ше1, а праймер РгЗ' - для ВатН1, необходимые для проведения последующих генно-инженерных мероприятий. Сборка каждого фрагмента осуществлялась отдельно. Олигонуклеотиды смешивались в эквимолярных количествах для формирования дуплексов с разрывами. Далее проводилась полимеразная достройка разрывов фрагментом Кленова ехо-. Затем следовала реакция лигирования разрывов Т4-лигазой, после чего полученная лигазная смесь амплифицировалась с соответствующей парой праймеров.

Вмчп

I I

Участки, удлиняемые фрагментом Кленова

^ 1*1 1*4

Этап II

Этап III

Этап IV

1500 ►

500 * 300 V —

"""

АС - 348 п.о

1500 ► 500 ► ыа» 1 МаМ 1

1 1

две - 516 П.о

Рисунок 7. Схематическое изображение второго подхода к синтезу гена 1г118 путем полимеразной достройки и лигирования фрагментов А, В и С (Этап I), и последующей сборки этих фрагментов методами молекулярного клонирования (Этапы 1ЫУ).

Такой подход позволил получить амплифицированные фрагменты требуемой длины (около 170 п.о.). Однако анализ их нуклеотидной последовательности выявил значительное количество точечных замен и делеций во фрагментах В и С. возникших, вероятно, в результате полимеразной достройки. Сборка фрагмента А прошла успешно. Мы снова слегка изменили систему, использовав дополнительные олигонуклеотиды пЗ" и п5", комплементарные одноцепочечным участкам олигонуклеотидов п4 и п5' соответственно (Рис. 7). Их введение в систему позволило избежать возникновения мутаций при полимеразной достройке и привело к успешной сборке фрагментов В и С.

Все фрагменты были затем отдельно клонированы в вектор для клонирования продуктов ПЦР рЭпуе (С^а§еп) (Рис. 7). Далее, фрагмент С был клонирован в вектор рОпуе-А, с образованием вектора рБпуе-АС. В этот вектор клонировали фрагмент В с получением вектора рОпуе-АВС, кодирующего полную последовательность гена ?г118, правильность которой была подтверждена секвенированием.

4.4. Получение генетических конструкций для экспрессии белка ЛЫ8 и его гибридов с интегразами РРУ и ВИЧ-1

Наличие сайтов для эндонуклеаз рестрикции Ше1 и ВатН1 на концах гена №118 позволило осуществить его клонирование в вектор для прокариотической экспрессии белков рЕТ15Ь (Novagen) (Рис. 8), содержащий с 5'-конца полилинкера участок, кодирующий последовательность Н1з6 и позволяющий получать белки, содержащие Н156-tag на N-кoнцe. Ген №118 был амплифицирован с использованием пары праймеров Рг5' и альтернативным вариантом праймера РгЗ' - РгЗ'ЭТОР, вводящим СТОП-кодон на 3'-конец гена. ПЦР продукт был вначале клонирован в вектор рЭпуе, а затем перенесен в вектор рЕТ15Ь.

""Sn&l

pDrive ) —^ j pETlSb

»*"•* , Г" -

pET15b

HH ВИЧ-linker

ib ) ^ ( pDrive ] —> J pET15b

N ,»H ВИЧ V J

Рисунок 8. Схема конкурирования гибридных белков. Бордовыми стрелками отмечены этапы, проведенные через стадию ПЦР-амплификации.

У нас имелись конструкции для бактериальной экспрессии ИН PFV и ВИЧ-1 на базе того же вектора рЕТ15Ь, где гены ИН также располагались между сайтами рестрикции Ndel и BamHl (векторы рЕТ15Ь-ИН ,v и pET15b-HHpfv). На их базе мы получили конструкции для экспрессии гибридных белков tRL184fflhlv и tRL18-HHpfv (N-концевые гибриды). (Рис. 8). Конструкции были получены путем ПЦР амплификации гена tr!18 с использованием пар праймеров. вносящих на оба конца гена сайты Ndel. Эти праймеры были разработаны таким образом, чтобы между геном ИН и геном tri 18 располагался линкер из 6 аминокислот состава GSQSAG, вводившийся в конструкцию для уменьшения

взаимного влияния двух белков в гибриде. Полученные ПЦР-продукты были клонированы в векторы рЕТ15Ь-ИН " и рЕТ15Ь-ИНр|1 через промежуточный этап: клонирование в вектор рОпуе. Конструкции для экспрессии гибридов состава и ИНр1у-Ж1, ] 8

(С-концевые гибриды) были получены на базе конструкции рЕТ15ЬчКЫ8. Для этого гены ИН РРУ и ИН ВИЧ-1 были амплифицированы с использованием пары праймеров, также вносящих на оба конца гена сайты Ше1 и аминокислотный линкер между двумя белками. Клонирование продуктов ПЦР-амплификации в вектор рЕТ15Ь-ИиЛ8 позволило получить конструкции для экспрессии С-концевых гибридов. Правильность сборки всех конструкций была подтверждена анализом их нуклеотидной последовательности.

4.5. Характеристика белка и гибридных белков ииЛ8-ИН'"\ 1ЯЫ8-

ИНР'\ ИНыМЫЛ8 и ИНрГу-(Ш.18.

Выделение белка (ЯЫ8, а также всех гибридных белков проводилось аналогично выделению ИН РРУ и ИН ВИЧ-1. Их подвижность в геле по Лэммли соответствовала теоретически предсказанной. Введение белкового домена как на Ы-, так и на С-конец ИН ВИЧ-1 повысило уровень протеолитического гидролиза этого белка, что затруднило его выделение. Гибриды ИН РЕУ выделялись на уровне белка дикого типа (Рис. 9).

4.5.1. Изучение ДНК-связывающей активности белка ¡ЯП 8 и гибридных белков

/яьм-ин*", 1т18-И1Гр, ин""-ти8 « ииф-иш8

Структура нового белка {КЫ8 была исследована методом кругового дихроизма (КД) в присутствии ионов 2п1+, необходимых для формирования «цинковых пальцев». Спектры КД подтвердили, что структура, типичная для этого класса белков образуется только в

-г 2+

присутствии ионов/п .

Основным требованием,

предъявляемым к белку 011^18, является его способность сиквенс-

специфично связывать

последовательность trg, которая является его ДНК-субстратом.

Субстрат trg титровался

возрастающими концентрациями

Рисунок 9. Анализ препаратов белков в геле по Лэммли. 1 —

маркеры, 2 - ин вич-1, з - жь-ин"", 4 - ины,-жь, 5 - 1К1,18. и полученные комплексы были

.КЫ8, б - ин PFV.7-.RI.* 8 - ин"-«ь проанализированы методом

торможения в геле. Экспериментальные данные позволили нам рассчитать значение Ка арр для комплекса ®1Л8/<Г£, которое составило 30±9 нмоль (Таблица 2). Мы также исследовали взаимодействие белка 1ЯЫ8 со случайной последовательностью ДНК. В этом случае стабильных комплексов не было обнаружено вплоть до 1 мкМ концентрации 1КЫ8. Это позволяет сделать вывод о наличие специфических взаимодействий белка ИИЛв с последовательностью trg.

Таблица 2. Значения кажущихся констант диссоциации для комплексов последовательности с белком Н<Ы8, а также его гибридами с ИН [ТУ и ВИЧ-1.

Тип гибридного белка ИНы, ИНЫ,-тъ Ж1 ИН"" ИН1"*-

К„ а],р, НМ 30±9 25±6 30±8 25±7 20±6

Для успешного протекания направленной интеграции необходимо также учитывать способность полученных нами гибридных белков успешно связывать последовательность trg, так как присоединение к белку 1МЛ8 большого белкового домена (45 кДа для ИН РИУ и 32 кДа для ИН ВИЧ-1) могло сказаться на его правильной укладке. Мы провели оценку этой способности методом торможения в геле (Таблица 2). Все значения констант диссоциации оказались сравнимы между собой. Надо также отметить, что они .оказались близки со значениями констант диссоциации комплексов интеграз РБУ и ВИЧ-1 с неспецифическими последовательностями ДНК. Поскольку сродство белка 1ЯЫ8 к последовательности trg сравнимо со сродством обеих ИН к случайной последовательности ДНК, это могло снизить эффективность направленной интеграции полученными гибридами в последовательность и

4.5.2. Каталитическая активность гибридных белков на/8-и//''"'. ты8-ин"/г,

ин""-ты8 и ин^-мив

Критически важным фактором для успешного протекания экспериментов по направленной интеграции является способность полученных гибридных белков осуществлять реакцию З'-процессинга и, в особенности, переноса цепи. Эти активности наших гибридов были протестированы в стандартной системе, описанной выше, и полученные значения сравнивались со значениями для обеих ИН дикого типа (Таблица 3). Субстратами для З'-процессинга служили дуплексы 175, для гомологичного переноса цепи - дуплексы Ш-2. Оценка активности гибридных белков на основе ИН РРУ проводилась в присутствии Мп2+. Активность гибридов на основе ИН ВИЧ-1 измерялась в присутствии ионов обоих металлов, и были получены одинаковые результаты.

Активность М-концевых гибридов обеих ИН в реакции З'-процессинга снизилась приблизительно на 30% от активности исходных белков, а активность С-концевых гибридов - на 70%. Таким образом, влияние присоединенного белкового домена на активность обеих ИН в реакции З'-процессинга одинаково.

Таблица 3. Активность гибридных белков в реакциях З'-процессннга и переноса цени, оцененная относительно активности белков дикого типа, для которых она принята за 100%.

Тип гибридного белка PFV ВИЧ-1

tRL-HHp,v HHpfv-tRL tRL-HHhiv IlHh"-tRL

Относительная активность в реакции З'-процессннга 66% 35% 76% 30%

Относительная активность в реакции гомологичного переноса цепи 150% 200% 63% 31%

При анализе активности гибридов в реакции гомологичного переноса цепи выявились отличия. Активность обоих гибридов на основе ИН ВИЧ-1 была снижена, причем С-концевой гибрид был менее активен, чем N-концевой. В случае ИН PFV, добавление домена tRL18 стимулировало активность обоих гибридов на ее основе в реакции переноса цепи, причем активность С-концевого гибрида возросла вдвое.

Ранее неоднократно отмечалось, что добавление белковых доменов как на N- так и на С-конец ИН ВИЧ-1 не оказывает существенного влияния на ее каталитическую активность (Bushman F. D., 1994; Goulaouic Н. and Chow S., 1996; Tan W. et al., 2004). Здесь мы впервые показываем снижение каталитической активности ИН ВИЧ-1 при присоединении к ней белкового домена. Влияние присоединения белкового домена к ИН PFV было изучено впервые.

4.5.3. Активность гибридных белков при интеграции субстрата в плазмидный вектор

Анализ активности гибридов в гетерологичном переносе цепи мы проводили по методике, описанной в главе 1.2.3 для белков дикого типа (Рис. 3). Напомним, что для ИН PFV распределение продуктов гетерологичного переноса зависело от того, какой металл-кофактор использовался в реакции. В качестве мишени для интеграции использовалась плазмидаpbr322; субстратами служили дуплексы U5-2.

Активность гибридов ИН PFV в буфере с Мп2+ была сравнима с активностью ИН дикого типа, но наблюдались изменения в распределении продуктов точечной и согласованной интеграции (Рис. 10А1). Для самой ИН PFV продукт согласованной интеграции составлял 22% от общего продукта интеграции в плазмиду, для гибрида tRL18-HHprv - 70%, а для гибрида состава HHpfv-tRLl 8 - 45%.

В буфере, содержащем Mg2+, общая эффективность переноса субстрата U5-2ph в плазмиду pbr322 также совпадала с эффективностью реакции, катализируемой ферментом дикого типа (Рис. 10А2). Однако в этом случае распределение продуктов точечной и согласованной интеграции для разных белков было одинаковым. Во всех трех случаях продукт согласованной интеграции составлял около 75% от общего продукта интеграции.

Попытки провести перенос субстрата Ш-2Ь|1 в вектор рЬг322 гибридными белками на основе ИМ ВИЧ-1 в отсутствие ЬЕБОР не привели к положительному результату. В присутствие ЬЕОвИ в буфере с Мп'+ наблюдалась небольшая активность для С-концевого гибрида (ИН "-ПИЛЯ) (Рис. 10Б). Активности в реакции гетерологичного переноса цепи для К-концевого гибрида (Ж1Л8-ИН|т) детектировать не удалось. Напомним, что активность гибридов на основе ИН ВИЧ-1, и особенно М-концевого гибрида, в реакции гомологичного переноса цепи была снижена относительно фермента дикого типа. Эта же закономерность наблюдалась и в реакции гетерологичного переноса.

А1 А2 Б

ии пм ии-ии'1' ин!* ™ инрру гш-ин»* ин^-ии. им вич-1 ии-ин"" ин^-чи

П.О --------;----.......— ----1 ПЛ. -----------1-------- --ПЛ. -------1 -------- —■---"П

Р~ ' ' Т

500(1 "Ш - -л* Щ

1500 •

100^ Ц.

50(1 К» ЗОО •»

[ * Мп1*

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 111213 1415 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ю111213 1415

Рисунок 10. Катализ гибридами гетерологичного переноса цепи в плазмидный вектор рЬг322. А1-2. Интеграция, катализуемая гибридами на основе ИН 1'К\. А1 - интеграция в присутствии Мп* . А2 -интеграция в присутствии Дорожки 1 - ДНК-маркеры; 2,7,12 - реакционные смеси без ИН; 3-6 - интеграция ИН (ТУ; 8-11 - интеграция гибридом 4КЬ-ИНР"; 13-16 - интеграция гибридом ИН1"*-(ИЬ. Б. Интеграция, катализуемая гибридами на основе ИН ВИЧ-1 в присутствии Мп2+ и Т.Г.ОСтК. Дорожки 1,6,11 - реакционные смеси без ИН; 2-5 - интеграция ИН ВИЧ-1; 7-10 - интеграция гибридом 1КЬ-ИН "'; 12-15 - интеграция гибридом ИН^-ШЬ. Реакции проводились при возрастающих концентрациях ИН: 0-0,5-0,75-1-1,5 мкМ.

4.5.4. Влияние олигонуклеотида 11-ДНК на активность гибридных белков в реакции гетерологичного переноса цепи

Во всех наших экспериментах гетерологичный перенос был более эффективен в случае процессированного субстрата Ш-2, а не исходного дуплекса 115. Это может объясняться относительно низкой эффективностью З'-процессинга, в ходе которого ИН формирует свой субстрат для переноса цепи. В связи с тем, что одноцепочечные олигопуклеотиды при концентрациях до 1 мкМ стимулируют активность ИН РРУ в реакции З'-процессинга (раздел 3), мы предположили, что они также смогут стимулировать гетерологичный перенос субстрата 115. Мы сравнили эффективность интеграции субстрата Ш в присутствии 11-ДНК в вектор рЬг322 с эффективностью интеграции субстрата Ш-2 (Рис. 11). Как сама ИН РРУ, так и гибриды на ее основе осуществляли интеграцию более эффективно в присутствии 11-ДНК. Этот результат показывает, что КОО, стимулируя активность ИН в реакции З'-процессинга, способствует формированию большего количества каталитически-активного в переносе цепи комплекса ИН с процессированным субстратом Ш-2, чем образуется при простом добавлении ИН к дуплексу Ш-2.

Таким образом, нам удалось сконструировать набор гибридных белков для экспериментов по направленной интеграции на основе ретровирусных интеграз. Три из

полученных нами четырех гибридов были каталитически активны как в реакциях 3'-процессинга и гомологичного переноса цепи, так и в реакции гетерологичного переноса ДНК-субстрата в плазмиду. Детектировать активность гибрида состава tRL18-HHhlv в реакции гетерологичного переноса цепи нам не удалось. Ранее в работах по конструированию систем направленной интеграции на основе ИН ВИЧ-1 присоединение белкового домена на N-конец ИН не приводило к значительному снижению ее активности (Bushman F. D., 1994; Tan W. et ai, 2004). Однако подобный эффект может зависеть от природы домена и от взаимодействий, возникающих между двумя белками в составе гибрида. Известно, что N-концевой домен ИН ВИЧ-1 участвует в мультимеризации ИН, которая необходима для ее каталитической активности. Возможно, введение белка tRL18 на N-конец ИН ВИЧ-1 влияет на межсубъединичные взаимодействия в олигомерах ИН.

ИН PFV tRL-HHpt* MH^-tRL

ИМИ ШШШШ

1---——1

Рисунок 11. Катализ гетерологичного переноса цепи гибридами ИН РКУ в присутствии (дорожки 6-8, 13-15, 20-22) и отсутствии (дорожки 2-5, 9-12, 16-19) одноцепочечного олигонуклеотида 11-ДНК (1мкМ). Дорожки 2, 9,16 - в смеси отсутствовал препарат ИН; 3, 6, 10, 13, 17, 20 - 0,75 мкМ ИН; 4, 7, 11, 14, 18, 21 - 1 мкМ ИН; 5, 8, 12, 15, 19, 22 - 1,5 мкМ ИН. Использовалась 20 нМ концентрация субстратов Ш и 115-2.

4.6. Анализ распределения интеграции, катализируемой гибридными белками

4.6.1. Получение конструкциирЬг322"е

Для проведения экспериментов, призванных определить возможность использования полученных нами конструктов для направленной интеграции в геном, необходимо было создать систему, в которой последовательность trg располагается в некотором нуклеотидном окружении достаточно большой длины. Для этого последовательность была клонирована в вектор рЬг322 с получением векторарЬг322"е.

4.6.2. Оценка направленности интеграции, катализируемой гибридными белками

Как указано выше, гибрид ИНЫ1'4КЫ8 показал себя неактивным в реакции гетерологического переноса цепи. Тем не менее, эксперименты по определению направленности интеграции проводились с использованием всех полученных нами гибридных белков в связи с тем, что применяемый в этой работе метод ПЦР-анализа является более чувствительным, чем анализ продуктов интеграции путем миграции в агарозном геле.

12 3 4 5 6

Этап И

Рисунок 12. Схема эксперимента по оценке направленности интеграции. Этап I: гетерологичный перенос радиоактивно-меченного дуплекса U5-2 в плазмидный вектор pbr32?rg, Этап II: продукты реакции анализируются методом ПЦР с использованием пары праймеров U5b-2*/PP3 (интеграционный профиль в цепь А), пара праймеров U5b-2*/OP2 (интеграционный профиль в цепь К). Этап III: Анализ продуктов ПЦР в денатурирующем ПААГ. Дорожки 1-6: интеграция гибридами ИН PFV в присутствии Мп2+ (1-3) и Mg2+(4-6); дорожки 7-9: интеграция гибридами ИН ВИЧ-1 в присутствии Mnz+ и LEDGF. Дорожки 1, 4, 7 - интеграция белками дикого типа; 2, 5, 8 - интеграция N-копцевыми гибридами; 3, 6, 9 - интеграция С-концевыми гибридами. Стрелками отмечены «горячие точки» интеграции. Положение сайта trg отмечено слева от геля.

Эксперимент по оценке направленности интеграции состоял из трех этапов (Рис. 12). На первом этапе проводилась интеграция процессированного субстрата U5-2 (своего для каждой ИН) в вектор pbr322"s. Этот субстрат использовался для простоты постановки эксперимента. Интеграция, катализируемая ферментом дикого типа, служила в качестве контрольного эксперимента. На втором этапе (Рис. 12, этап II) проводился 11ЦР-анализ полученных реакционных смесей. Один праймер представлял собой процессированную цепь субстрата U5-2 (U5B-2), которая содержала радиоактивную метку. Второй праймер был комплементарен участку, располагающемуся на расстоянии 160 п.о. от сайта trg выше него по цепи (праймер РРЗ). ПЦР с использованием пары праймеров U5B-2*/PP3 служила для оценки распределения интеграции вблизи сайта trg в одну из цепей вектора pbr322"s (далее для удобства мы называем ее цепь А). Для того, чтобы оценить частоту интеграции в другую цепь (цепь Б), использовалась пара праймеров U5B-2*/OP2, где праймер ОР2 был комплементарен участку в цепи Б на расстоянии 180 п.о. от сайта trg. После проведения ПЦР продукты анализировались в сиквенсном ПААГ (Рис. 13, этап III). В качестве контроля подвижности на гель наносился продукт секвенирования с использованием либо радиоактивно меченного праймера РРЗ (если этот праймер использовался для аналитической ПЦР), либо с меченым праймером ОР2 (если в ПЦР использовался ОР2). В качестве матрицы для секвенирования служил вектор pbr322'rg. Благодаря совместной

миграции с продуктами секвенирования можно было точно обозначить район сайта ^ на радиоавтографе и выявить произошедшие изменения в распределении продуктов интеграции в районе этого сайта. На рис. 13 приведены результаты анализа продуктов интеграции в цепь А; при анализе продуктов интеграции в цепь Б наблюдались те же закономерности, но они были менее выражены.

Для начала рассмотрим результаты, полученные для гибридов на основе ИН РРУ (Рис. 12, 1-6). Мы анализировали продукты интеграции, проведенной как в буфере, содержащем Мц2+, так Мп2+, поскольку, как указывалось выше, сама ИН РРУ и ее гибриды активны в реакции гетерологического переноса при использовании обоих металлов-кофакторов, однако распределение между продуктами точечной и согласованной интеграции различается. ПЦР анализ продуктов интеграции в присутствии Мп2+ выявил слабые отличия в распределении сайтов интеграции между контрольным экспериментом (интеграция ИН РРУ дикого типа, дорожка I) и интеграцией обоими гибридами. Можно отметить падение интенсивности интеграции Ы-концевым гибридом ниже по цепи от сайта а также появление двух минорных «горячех» точек интеграции ниже целевого сайта (дорожка 2). Для С-концевого гибрида наблюдается одна «горячая» точка выше по цепи от сайта trg (дорожка 3). Анализ продуктов интеграции в буфере, содержащем Mg2+, показал увеличенную направленность интеграции для гибридных белков. Так, значительно снизилась интенсивность интеграции М-концевым гибридом вокруг сайта (дорожка 5). Это верно также и для С-концевого гибрида, однако в этом случае присутствуют и несколько «горячих» точек (дорожка 6). Диаграмма распределения частот интеграции в районе сайта построенная одновременно для гибрида и для белка дикого типа, позволяет оценить «горячие точки» интеграции для наиболее специфически интегрирующего гибрида ИНр|у-НИ, (Рис. 13). Видно, что точки интеграции для белка дикого типа равномерно распределены вдоль последовательности, в то время как частота интеграции гибридом падает в районе сайта írg, и возрастает в участках, непосредственно прилегающих к сайту. «Горячие точки» располагаются в позициях 6, 20, 46 и 52 выше по цепи от сайта trg, и в позициях 4, 12, 18 и 46 ниже по цепи от сайта (Рис. 13). Таким образом, гибрид состава показал определенную способность направлять интеграцию в районы, близкие

к сайту

Анализ интеграции в плазмиду, осуществленной ИН ВИЧ-1 и ее гибридами в присутствии белкового кофактора ЬЕБСР в буфере с Мп2+, показал снижение эффективности интеграции обоими гибридами в районе сайта а также общее изменение в распределении сайтов интеграции (дорожки 8, 9). Также можно выявить несколько «горячих точек» - 20-30 п.о. выше по цепи от сайта, 30 и 50 п.о. ниже по цепи.

бсолессбстеселкугл

Рисунок 13. Оценка частоты интеграции гибридом HHI""-(RL по сравнению с интеграцией, катализируемой IIII PFV дикого типа. Под графиком расположена нуклеотидная последовательность, окружающая сайт trg в векторе pbr32i's. Сайт trg выделен черной рамкой. Крупный шрифтом выделены нуклеотиды «горячих точек» интеграции.

Ранее в работе по конструированию гибридов на основе ИН вируса лейкоза птиц не наблюдалось отличий в направленности интеграции, катализируемой N- и С-концевым гибридом (Katz R. A. et al, 1996). В то же время, было показано, что С-концевой гибрид ИН ВИЧ-1 с 6-доменным белком «цинковые пальцы» Е2С, аналогичным белку tRL18, проявляет большую направленность интеграции, чем N-концевой (Tan W. et а!., 2004). В наших экспериментах гибриды на основе ИН ВИЧ-1 в целом проявляли низкую направленность интеграции, что затрудняет их сравнение. Однако направленность интеграции С-концевым гибридом на основе ИН PFV была выше, чем N-концевым, что согласуется с данными работы (Tan W. et al., 2004).

выводы

1. Получены характеристики ДНК-связывающей и каталитической активностей интегразы PFV: константа диссоциации комплекса ИН/субстрат, начальная скорость реакции З'-процессинга, скорость связывания интегразой своего субстрата.

2. Исследовано влияние металла-кофактора на распределение продуктов точечной и согласованной интеграции при гетерологичном переносе цепи интегразой PFV и впервые показано, что в присутствии ионов Mg2+ резко возрастает эффективность согласованной интеграции.

3. Впервые исследовано влияние коротких одноцепочечных олигонуклеотидов на активность ИН PFV в реакции З'-процессинга и гетерологичного переноса цепи. Для реакции З'-процессинга установлен двухсайтовый механизм связывания, обеспечивающий концентрационно-зависимую активацию, а затем ингибирование ИН. Также показано, что короткие одноцепочечные олигонуклеотиды повышают эффективность гетерологичного переноса цепи ИН PFV.

4. Сконструирована новая система для направленной интеграции ретровирусных векторов в безопасный участок в геноме человека, в качестве которого выбран участок в гене лейциновой тРНК. Сконструирован, выделен и охарактеризован синтетический белок, узнающий выбранный сайт интеграции.

5. Впервые показано, что интеграза PFV может быть использована для создания системы направленной интеграции. Получены гибриды интеграз PFV и ВИЧ-1 и нового синтетического белка. Эффективность системы направленной интеграции, основанной на использовании этих гибридных белков, проверена в экспериментах in vitro.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кпижаиская Е.С., Смолов МА., Кондрашина О.В., Гоггих М.Б. Сравнительное изучение каталитических характеристик интеграз пенообразующего вируса человека и ВИЧ-1// Acta Naturae. 2009. Т. 2, С. 84-87.

2. Agapkina J., Zatsepin Т., Knyazhanskaya Е., Mouscadet J.-F., Gottikh M. Structure-Activity Relationship Studies of HIV-1 Integrase Oligonucleotide Inhibitors// ACS Med. Cliem. Lett. 2011. V. 2. P. 532-537.

3. Korolev S., Knyazhanskaya E., Anisenko A., Tashlitskii V., Zatsepin T.S., Gottikh M., Agapkina J. Modulation of HIV-1 Integrase Activity by Single-Stranded Oligonucleotides and their Conjugates with Eosin//Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2011 V. 30. P. 651-666.

4. Княжанская E.C., Кондрашина O.B., Готгих М.Б. Подходы к направленной интеграции ДНК на основе транспозаз и ретровирусных интеграз// Мол. Биол.. 2011. Т. 45. С. 931-948.

5. Knyazhanskaya E.S., Smolov M.V., Gottikh М.В. Взаимодействие интеграз ВИЧ и ПВЧ с концевыми повторами своих ДНК субстратов// Сборник тезисов конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006». 12-15 апреля 2006 года. г. Москва. С. 115.

6. Княжанская Е.С., Смолов М.А., Готтих М.Б. Изучение особенностей действия интегразы HFV и сравнение их с аналогичными данными для интегразы ВИЧ// Сборник тезисов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 года. г. Новосибирск. С. 55.

7. Knyazhanskaya E.S., Smolov M.V., Kondrashina O.V., Gottikh М.В. Study of human foamy virus integrase and perspectives of its application for directed integration of retroviruses// Book of abstracts of the 14lh International Conference "Microbial enzymes in biotechnology and medicine". 2009. Kazan, Russia. P. 34-35.

8. Knyazhanskaya E.S., Smolov M.V., Kondrashina O.V., Gottikh M.B. The study of the specificity of action of HFV integrase and its comparison with HIV-1 integrase// Book of abstracts of the VIH,h European symposium of Protein society. 14-18 June 2009. Zurich, Switzerland. P. 134.

9. Knyazhanskaya E., Kondrashina O., Smolov M., Gottikh M. Designing chimeric proteins for directed DNA integration into human genome// Book of abstracts of the The EMBO Meeting. 4-7 September 2010. Barcelona, Spain. P. 110.

10. Knyazhanskaya E.S., Kondrashina O.V., Smolov M.V., Gottikh M.B. Directed DNA integration into human genome through the use of chimeric proteins// Book of abstracts of the Is1 International Interdisciplinary Conference "Modern problems in systemic regulation of physiological functions". 10-21 December 2010. Safaga, Egypt. P. 100.

11. Kondrashina O.V., Knyazhanskaya E.S., Smolov M.A., Gottikh M.B. The use of artificial "zinc-fmger"protein for directed DNA integration into safe position in the human genome// Book of abstracts of the 3rd EMBO Meeting. 10-13 September 2011. Vienna, Austria. P. 27.

Подписано в печать:

02.11.2011

Заказ Лг2 6191 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Княжанская, Екатерина Сергеевна

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Подходы к направленной интеграции ДНК на основе транспозаз и ретровирусных интеграз.

2.1.1 Системы направленной интеграции на основе ретровирусов.

2.1.1.1 Этапы интеграции ДНК ретровирусов.

2.1.1.2 Интеграционные предпочтения ретровирусов.

2.1.1.3 Походы к направленной интеграции на основе ретровирусных интеграз или их кофакторов.

2.1.1.3.1 Методы определения специфичности интеграции в модельной системе in vitro

2.1.1.3.2 Методы определения специфичности интеграции в клеточный геном

2.1.1.3.3 Гибриды на основе интеграз и природных ДНК-связывающих белков

2.1.1.3.4 Гибриды на основе синтетических белков «цинковые пальцы».

2.1.2 Системы направленной интеграции на основе транспозаз.

2.1.2.1 Интерплазмидный анализ.

2.1.2.2 Модификация транспозазы.

2.1.2.3 Модификация транспозона.

2.1.2.4 Модификация белка, связывающего транспозазу.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика интегразы пенообразующего вируса и оценка возможности ее использования для направленной интеграции ДНК"

Генная терапия различных заболеваний является одним из наиболее перспективных путей развития современной медицины и биоинженерии. Благодаря своей способности встраиваться в геном клетки-хозяина, ретровирусы представляют собой оптимальную базу для создания генно-инженерных векторов. Однако случайный характер интеграции представляет существенное препятствие для безопасного использования ретровирусных векторов, так как вирусный фермент, катализирующий интеграцию, - интеграза (ИН) не проявляет сиквенсных предпочтений при связывании геномной ДНК. Тем не менее, интеграция носит не совсем случайный характер. ИН взаимодействует с рядом клеточных белков, формируя прединтеграционный комплекс (ПИК), белки которого приводят интеграцию в определенные области генома. Так, показано, что ВИЧ-1 склонен интегрироваться в транскрибируемые гены, а вирус лейкемии мышей (MLV) - в участки старта транскрипции. Эти особенности интеграции ретровирусов несут в себе опасность инсерционного мутагенеза: «выключения» генов или активации протоонкогенов. В связи с этим, необходимо разрабатывать системы, предназначенные для направленной интеграции ретровирусной ДНК. Такие системы разрабатывались на основе интегразы ВИЧ-1, MLV, вируса лейкоза птиц. Основным приемом при разработке таких систем является присоединение к ИН белкового домена, обладающего сайт-специфической ДНК-связывающей активностью. Однако до сих пор не было предложено ни одной системы, разработанной для направления интеграции в определенный и безопасный сайт в человеческом геноме.

Представители подсемейства спумаретровирусов (СВ) способны заражать человека, не вызывая патологического эффекта. Векторы на основе СВ размножаются в большом наборе клеточных культур, и, в частности, эффективно вводятся в гематопоэтические линии. Известно, что СВ векторы не демонстрируют опасных предпочтений в интеграции, свойственных для векторов на основе MLV и ВИЧ-1. Тем не менее, ИН СВ еше не использовалась для разработки систем направленной интеграции на ее основе. Самым хорошо исследованным представителем этого подсемейства является вирус PFV (prototype foamy virus), в силу чего именно этот вирус следует использовать для первой попытки разработать систему направленной интеграции на основе СВ.

Целью данной работы является исследование каталитических свойств ИН PFV и особенностей ее взаимодействия с ДНК субстратом, а также разработка и конструирование системы для направленной интеграции ДНК на основе ИН PFV.

В работе решались следующие задачи:

1) Исследование особенностей каталитической активности ИН PFV;

2) Исследование взаимодействия ИН PFV с ДНК-субстратом

3) Дизайн системы направленной интеграции в безопасный участок в геноме человека;

4) Создание системы направленной интеграции на основе ИН PFV и ИН ВИЧ-1 и оценка способности этой системы направлять интеграцию в специфический участок плазмидной ДНК in vitro.

В настоящей работе впервые изучена роль металла кофактора в процессе интеграции короткого ДНК-субстрата ИН PFV в плазмидный вектор: показано, что в присутствии Mg2+ значительно увеличивается выход продукта согласованной интеграции. Также нами впервые изучено влияние 2'-пропандиольной модификации в первых положениях субстратного дуплекса ИН PFV на эффективность реакции З'-процессинга.

Мы исследовали влияние коротких одноцепочечных олигонуклеотидов (КОО) на активность ИН PFV в реакции З'-процессинга, и показали, что для них характерен двухсайтовый механизм действия, при котором КОО имеет сродство к двум сайтам в структуре белка: активации и ингибирования, причем сродство к сайту активации выше, чем к сайту ингибирования. Также показано, что присоединение молекулы эозина к КОО значительно увеличивает сродство к обоим сайтам.

Мы разработали новейшую систему направленной интеграции в безопасный участок человеческого генома. Мы синтезировали ген белка, состоящего из шести доменов «цинковые пальцы» и способного специфически распознавать и связывать 18-ти нуклеотидный участок в гене лейциновой тРНК. Нами был сконструирован набор гибридных белков на основе белка «цинковые пальцы» и интеграз PFV и ВИЧ-1. Была исследована способность этих гибридных белков направлять интеграцию аналога вирусной ДНК в плазмидный вектор in vitro, и было показано, что добавление к ИН PFV белкового домена со специфической ДНК-связывающей активностью меняет профиль интеграции в районе специфического сайта. Так, было показано снижение частоты интеграции в сам сайт и повышение частоты интеграции в участки, непосредственно прилегающие к сайту. Систему направленной интеграции, сконструированную и опробованную в данной работе, возможно впоследствии применить для создания генно-терапевтических векторов на основе вируса PFV.

Работа включает обзор литературы, состоящий из двух частей. Первая часть посвящена подходам к направленной интеграции на основе как ретровирусных интеграз, так и транспозаз. Второй подход рассматривает особенности строения и репликации спумаретровирусов.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Княжанская, Екатерина Сергеевна

5 ВЫВОДЫ

2. Исследовано влияние металла-кофактора на распределение продуктов точечной и согласованной интеграции при гетерологичном переносе цепи интегразой PFV и впервые показано, что в присутствии ионов Mg резко возрастает эффективность согласованной интеграции.

2.2.6 Заключение

Хотя спумавирусы известны уже достаточно давно [106], лишь сравнительно недавно началось активное изучение молекулярных механизмов их репликации, а также их взаимодействия с хозяйской клеткой и поиск факторов, определяющих основные пути развития спумавирусной инфекции. Случаи инфицирования человека этими вирусами редки, вирус не вызывает патогенных эффектов ни у человека, ни у природных хозяев. Что же делает БУ таким привлекательным объектом для исследователей? На то есть ряд причин.

Как уже показано целым рядом исследователей, спумавирусы являются перспективной и многообещающей базой для создания вирусных векторов на их основе [195, 196, 197]. Генная терапия открывает новые горизонты в классической медицине, в терапии онкозаболеваний, вирусных инфекций и генетических дефектов, в связи с чем удачная база для создания генно-терапевтических векторов не могла не остаться незамеченной исследователями.

По ряду особенностей своей репликации спумавирусы стоят на границе между ретровирусами и гепаднавирусами. Детальное изучение особенностей их строения и репликации может помочь лучше понять филогенетические связи между этими двумя вирусными семействами.

Спумавирусы коэволюционировали со своими естественными хозяевами в течение нескольких миллионов лет [200]. Существует мнение, что отсутствие патогенного эффекта при спумавирусной инфекции объясняется точной и тонкой подгонкой вируса к своему хозяину, которая обеспечивает успешное и длительное «сосуществование» в течение всей жизни организма-хозяина.

Наконец, ряд исследователей интегразы РБУ предлагали использовать этот белок как модель интегразы ВИЧ-1. Исследование интегразы ВИЧ-1 затруднено тем, что до сих пор не удалось получить пригодные для РСА кристаллы этого белка со своим ДНК-субстратом. Кристаллическая структура комплекса интегразы РБУ с ДНК-субстратом недавно была разрешена группой Черепанова [201]. Однако, возможность использования интегразы РБУ в качестве модельного белка для исследования интегразы ВИЧ находится под вопросом, в силу ряда значительных отличий в структуре и каталитических особенностях этих двух белков.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В связи с быстрым развитием такого направления биологии и медицины, как генная терапия, актуальной задачей является создание безопасных и эффективных векторов для переноса в клетки пациентов «терапевтических» генов. Особенно привлекательной основой для создания генно-терапевтических векторов считаются сложные ретровирусы (лентивирусы и спумавирусы). Это связано с их способностью интегрироваться в геном различных типов клеток, в том числе и неделящихся (в случае лентивирусов). Большинство созданных векторов основано на вирусах из семейства лентивирусов, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1), или гаммаретровирусов (MLV). Однако эти вирусы являются возбудителями чрезвычайно опасных болезней человека и животных, и даже специально подготовленные вирусные частицы не гарантируют безопасности их применения. Векторы на основе вирусов из подсемейства ретровирусов Spumavirinae могли бы быть столь же эффективными, но при этом безопасными. Так, известно, что пенообразующий вирус человека (prototype foamy virus, PFV) из этого подсемейства способен заражать клетки человека [119], однако при этом не выявлено патологий человека, ассоциированных с этим вирусом. В этой связи создание вектора на его основе представляется весьма перспективной задачей.

Мы уже говорили (раздел 2.1.1.2), что ретровирусная интеграция, катализируемая ферментом интегразой в комплексе с другими вирусными и клеточными белками, протекает неспецифически в любую последовательность генома, что может приводить к неопластической трансформации клетки. Поэтому создание систем для направленной интеграции необходимо для дальнейшего развития генной терапии.

Как указано в обзоре литературы, попытки осуществить направленную интеграцию с помощью гибридных белков на основе ретровирусной интегразы и сиквенс-специфичного ДНК-связывающего домена предпринимаются уже достаточно давно. Наиболее перспективными считаются системы на основе белков типа «цинковые пальцы» благодаря их высокой специфичности при узнавании ДНК, а также возможности создания новых белков с заданной специфичностью. Были созданы гибриды на основе ДНК-связывающего домена транскрипционного фактора Zif268, состоящего из 3 «цинковых пальцев» [57], и синтетического белка, содержащего 6 доменов «цинковый палец» Е2С [59]. Эти гибридные белки показывали способность направлять интеграцию в область сайта связывания «пальцев», однако полной специфичности достигнуто не было (разделы 2.1.1.3.3 и 2.1.1.3.4). Однако оба указанных домена не годятся для генно-терапевтических целей. Zif268 является транскрипционным фактором мыши, в то время как Е2С хоть и распознает сайт в человеческом геноме, однако сам этот сайт располагается в транскрипционно-активном участке и направленная интеграция в него не может считаться безопасной. Таким образом, необходимо создание нового синтетического домена «цинковые пальцы», имеющего уникальный сайт узнавания в человеческом геноме, который, к тому же, должен располагаться таким образом, чтобы интеграция в него или вокруг него была безопасной для клетки.

Структурный домен «цинковый палец» представляют собой последовательность из 30-ти аминокислотных остатков, свернутых в РРа-структуру, стабилизированную ионом цинка и гидрофобными взаимодействиями. Консенсусная аминокислотная последовательность «классического» «цинкового пальца» (тип СузгШвг) может быть представлена как (Туг/РЬе)-Х-Су8-Х2-5-Су8-Хз-(Туг/РЬе)-Х5-Ьеи-Х2-Ш8-Хз.5-Ш8, где X-любая аминокислота, а выделенные остатки цистеина и гистидина участвуют в связывании иона цинка. «Цинковые пальцы» именно этого типа входят в состав многих регуляторных белков. Обычно они содержат несколько «пальцев», которые образуют тандемные контакты вдоль двойной спирали ДНК. Каждый «цинковый палец» узнает нуклеотидный триплет в последовательности-мишени. Узнавание происходит за счет взаимодействия с гетероциклическими основаниями ДНК определенных аминокислот, находящихся в положениях -1, 2,3, 6 в а-спирали белка (Рисунок 7) [202].

Рисунок 7. Модель взаимодействия 2 «цинковых пальцев» с последовательностью ДНК. Аминокислотные остатки в положениях -1, 3, 6 Р2 узнают нуклеотиды 4, 5, 6 соответственно в одной из цепей ДНК (черные стрелки), а остаток в положении 2 контактирует с нуклеотидом, комлементарным к нуклеотиду, узнаваемому остатком 6 предыдущего пальца Р1 (серая стрелка) [203].

Принцип узнавания «цинковым пальцем» определенного нуклеотидного триплета может быть использован для конструирования белков с новой специфичностью. Кроме того, цинковые пальцы, в отличие от других ДНК-связывающих белков, работают в форме мономера и не требуют палиндромной последовательности-мишени. Такие особенности

Р1

1=2 цинковых пальцев потенциально позволяют создавать белки для узнавания любой последовательности ДНК.

Цинковые пальцы» могут быть использованы как ДНК-связывающий домен в гибридных белках с различными ферментами, взаимодействующими с ДНК. Были созданы гибриды на основе «цинковых пальцев» и метилтрансфераз [204], резольваз [205], нуклеаз [см. обзор 206] и ретровирусных интеграз [59, 61, 69] для направленной модификации ДНК. Во всех случаях наблюдалось предпочтение эффекторного белка к взаимодействию с ДНК в области связывания «цинкового пальца». Гибридный белок на основе 4-х «цинковых пальцев» и неспецифической эндонуклеазы рестрикции Fokl был использован как средство против врожденного комбинированного иммунодефицита (SCID), вызванного мутацией в гене у-цепи рецептора интерлейкина-2 (IL2Ry). Вносимый им двуцепочечный разрыв приводил к гомологической рекомбинации между хромосомной ДНК и нехромосомной ДНК-донором [ 207 ]. Кроме того, «цинковые пальцы» могут быть использованы и без дополнительного функционального домена для создания физического барьера при взаимодействии ДНК с РНК-полимеразой или для связывания с другими ДНК-связывающими белками (транскрипционные факторы) [203].

Сейчас, с развитием возможностей компьютерного моделирования и накопленного объема знаний о взаимодействии различных природных и синтетических цинковых пальцев со своими ДНК-мишенями, стало возможным создание «цинковых пальцев» с высокой аффинностью к различным ДНК-мишеням. Существует несколько способов поиска последовательности «цинковых пальцев», специфических к нужной последовательности ДНК. Один из них, самый простой и популярный, называется «модульная сборка» (modular assembly). В нем белки, состоящие из нескольких «пальцев» собираются из отдельных «пальцев» с известной специфичностью. Однако этот метод основан на предположении, что каждый «цинковый палец» взаимодействует с ДНК независимо, то есть в расчет не принимаются взаимодействия между «пальцами». Не так давно компания Zinc Finger Consortium (http://zincfingers.org/) создала базу данных охарактеризованных «цинковых пальцев», основываясь на экспериментальных данных, полученных разными группами исследователей. В основном с использованием этой базы были созданы компьютерные программы для предсказания аминокислотных последовательностей цинк-пальцевых доменов и поиска потенциальных участков узнавания в составе заданных ДНК:

• Zinc Finger Tools (http://www.scripps.edu/mb/barbas/zfdesign/zfdesignhome.php) [221];

• ZiFiT (http://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFiTA [202];

• ZiFDB (http://bindr.gdcb.iastate.edu/ZiFDB/) [208];

• http://cornpbio.cs.princeton.edu/zf/ [209].

Подход «модульной сборки» предполагает независимое взаимодействие с ДНК каждого индивидуального модуля («цинкового пальца»). Однако систематическое изучение большого числа сконструированных «цинковых пальцев» показало, что наибольший успех достигается, если последовательность-мишень состоит из триплетов GNN. Если в последовательности из 9 нуклеотидов не содержится ни одного такого триплета, то создание специфического белка из 3 «цинковых пальцев» невозможно [210]. Чтобы избежать этих проблем применяются другие методы поиска белков с новой специфичностью: последовательной селекции (sequential selection), двойной селекции (bipartite selection) и селекции, основанной на бактериальном подходе (bacterial-based selection). Преимущество этих методов - учёт взаимодействий между соседними «пальцами», но они сложны и занимают много времени. Недавно была создана компьютерная программа для селекции OPEN (Oligomerized Pool ENgineering) [211], позволяющая просто и быстро использовать методы селекции. Была показана активность «цинковых пальцев», полученных и тем, и другим способом.

Таким образом, возможность создавать белки «цинковые пальцы» для связывания с определенной, заранее выбранной последовательностью, делает их действительно уникальным инструментом как для фундаментальной науки, так и для генной терапии. Именно синтетический белок типа «цинковые пальцы» используется в качестве ДНК-связывающего домена при создании системы направленной интеграции ДНК.

На сегодняшний день достаточно много известно об особенностях строения ИН PFV и об ее взаимодействии с ДНК-субстратом. Существуют данные рентгено-структурного анализа ее комплекса с ДНК [201]. Однако на момент начала этой работы эта ИН, также как и сам вирус PFV, были изучены сравнительно мало. В этой связи мы исследовали особенности каталитической активности ИН PFV, а также некоторые особенности ее взаимодействия с ДНК-субстратом. Многие исследователи предлагали использовать ИН PFV как модельный белок для исследований ИН ВИЧ-1. В связи с этим, мы решили сравнить полученные нами данные об особенностях функционирования ИН PFV с накопленными данными об ИН ВИЧ-1. К тому же, многие из описанных в литературе систем направленной интеграции использовали ИН ВИЧ-1, включая и самую успешную из таких систем [68, 69]. Мы решили использовать обе эти ИН для конструирования системы направленной интеграции для того, чтобы иметь возможность непосредственного сравнения этих двух белков в нашей системе.

Руководствуясь всем выше обозначенным, нами были сформулированы следующие задачи нашей работы:

1. Исследование каталитических характеристик ИН PFV и особенностей ее взаимодейстия с ДНК субстратом, и сравнение полученных данных с аналогичными показателями для ИН ВИЧ-1.

2. Выбор последовательности-мишени для нового синтетического домена типа «цинковые пальцы» с тем, чтобы в случае получения активного белка, его можно было использовать для создания конструкций для направленной интеграции.

3. Определение аминокислотной последовательности белка, перевод её в нуклеотидную, синтез гена «цинковых пальцев».

4. Получение генетических конструкций, кодирующих гибридные белки на основе интеграз ВИЧ-1 и PFV и нового «цинк-пальцевого» домена.

5. Выделение всех сконструированных гибридных белков и самого домена «цинковые пальцы».

6. Проверка всех выделенных белков на активность в реакциях, катализируемых интегразами, и на способность связываться с последовательностью-мишенью.

7. Исследование направленности интеграции, катализируемой гибридными белками.

3.1 Характеристика каталитической активности ИН PFV

Ретровирусные интегразы осуществляют встраивание вирусной ДНК в клеточный геном. Этот процесс состоит из двух стадий. На первой из них, называемой З'-процессинг, ИН отщепляет динуклеотид с 3'-концов каждой цепи вирусной ДНК (AT в случае PFV, GT в случае ВИЧ-1). Этому динуклеотиду предшествует консервативный динуклеотид СА, общий для всех ретровирусов. На втором этапе ИН катализирует нуклеофильную атаку 3'-гидроксильных групп процессированных цепей ДНК по межнуклеотидным фосфатам обеих цепей клеточной ДНК с образованием ковалентного продукта. Обе эти реакции возможно воспроизвести in vitro с использованием очищенного препарата ИН и олигонуклеотидных дуплексов, имитирующих конец вирусной ДНК (Таблица 2).

Известно, что свойства препарата ИН зависят от метода его выделения. Учитывая склонность ретровирусных интеграз к аггрегации, их часто выделяют в присутствии детергентов. Для анализа каталитической активности ИН PFV in vitro мы использовали ИН, выделенную в мягких, близких к нативным условиях: без детергентов и в присутствии

Л i 'У I ионов Mg и Zn [212]. Выделение ИН ВИЧ-1 осуществлялось по аналогичной методике.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Княжанская, Екатерина Сергеевна, Москва

1. Young L.S., Searle P.F., Onion D., Mautner V. Viral gene therapy strategies: from basic science to clinical application. II J. Pathol., 2006, 208, 299-318.

2. Pluta K., Kacprzak M.M. Use of HIV as a gene transfer vector. // Acta Biochim Pol., 2009, 56, 531-595.3. www.wiley.co.uk/genmed/clinical/

3. Holmes-Son M.L., Appa R.S., Chow S.A. Molecular genetics and target site specificity of retroviral integration. // Adv. Genet., 2001, 43, 33-69.

4. Delauriere L., Chénais В., Hardivillier Y., Gauvry L., Casse N. Mariner transposons as genetic tools in vertebrate cells. // Genetica, 2009, 137, 9-17.

5. Izsvák Z., Chuah M.K., Vandendriessche Т., Ivies Z. Efficient stable gene transfer into human cells by the Sleeping Beauty transposon vectors. // Methods, 2009, 49, 287-297.

6. Hackett P.B., Largaespada D.A., Cooper L.J. A transposon and transposase system for human application. // Mol. Ther., 2010, 18, 674-683.

7. Ivies Z., Izsvák Z. Transposons for gene therapy! // Curr. Gene. Ther., 2006, 6, 593-607.

8. Engelman A., Cherepanov P. The lentiviral integrase binding protein LEDGF/p75 and HIV-1 replication. // PLoS Pathog., 2008, 4, el000046.

9. Brown P.O. Integration of retroviral DNA. // Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1990, 157, 1948.

10. Hindmarsh P., Leis J. Retroviral DNA integration. // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1999, 63, 836-843.

11. Агапкина Ю.Ю., Приказчикова Т.А., Смолов M.A., Готтих М.Б. Структура и функции интегразы ВИЧ-1. // Ven. Биол. Хим., 2005, 45, 87-122.

12. Спирин П.В., Вильгельм А.Э., Прасолов B.C. Лентивирусные векторы. // Молекуляр. биология, 2008, 42, 913-926 (рус), 814-825 (eng).

13. Pruss D., Bushamn F.D. and Wolffe A.P. Human immunodeficiency virus integrase directs integration to sites of severe DNA distortion within the nucleosome core. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91, 5913-5917.

14. Pruss D., Reeves R., Busman F.D. and Wolffe A.P. The influence of DNA and nucleosome structure on integration events directed by HIV-1 integrase. // J. Biol. Chem., 1994, 269, 2503125041.

15. Muller, H.-P., Varmus, H.E. DNA bending creates favored sites for retroviral integration: an explanation for preferred insertion sites in nucleosomes. // EMBOJ., 1994, 13, 4704-4714.

16. Pryciak, P.M. and Varmus H.E. Nucleosomes, DNA-binding proteins and DNA sequence modulate retroviral integration target site selection. // Cell, 1992, 69, 769-780.

17. Pryciak P.M., Sil A., Varmus H.E. Retroviral integration into minichromosomes in vitro. // EMBOJ., 1992, 11, 291-303.

18. Scherdin, U. Rhodes K., Breindl M. Transcriptionally Active Genome Regions Are Preferred Targets for Retrovirus Integration. II J. Virol., 1990, 64, 907-991.

19. Kitamura, Y., Lee Y.M., Coffin J.M. Nonrandom integration of retroviral DNA in vitro: effect of CpG methylation. // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1992, 89, 5532-5536.

20. Taganov K.D., Cuesta I., Daniel R., Cirillo L.A., Katz R.A., Zaret K.S., Skalka A.M. Integrase-specific enhancement and suppression of retroviral DNA integration by compacted chromatin structure in vitro. II J. Virol., 2004, 78, 5848-5855.

21. Rohdewohld H., Weiher H., Reik W., Jaenisch R., Breindl M. Retrovirus integration and chromatin structure: Moloney murine leukemia proviral integration sites map near DNasel-hypersensitive sites. // J. Virol., 1987, 61, 336-343.

22. Stevens, S.W., Griffith J.D. Sequence analysis of the human DNA flanking sites of human immunodeficiency virus type 1 integration. // J. Virol., 1996, 70, 6459-6462.

23. Schroeder A.R.W., Shinn P., Chen H., Berry C., Ecker J.R., Bushman F. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. // Cell, 2002, 110, 521-529.

24. Bushman F., Lewinski M., Ciuffi A., Barr S., Leipzig J., Hannenhalli S., Hoffmann C. Genome wide analysis of retroviral DNA integration. // Nature Rev. Microbiol., 2005, 3 , 848856.

25. Wu X., Li Y., Crise B., Burgess S.M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. // Science, 2003, 300, 1749-1751.

26. Felice B., Cattoglio C., Cittaro D., Testa A., Miccio A., Ferrari G., Luzi L., Recchia A., Mavilio F. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. // PLoS One, 2009, 4, e4571.

27. Barr S.D., Leipzig J., Shinn P., Ecker J.R., Bushman, F.D. Integration targeting by avian sarcoma leucosis virus and human immunodeficiency virus in the chicken genome. // J. Virol., 2005, 79, 12035-12044.

28. Mitchell R.S., Beitzel B.F., Schroder A.R., Shinn P., Chen H., Berry C.C., Ecker J.R., Bushman F.D. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. // PLoS Biol., 2004, 2, e234.

29. Crise B., Li Y., Yuan C., Morcock D.R., Whitby D., Munroe D.J., Arthur L.O., Wu X. Simian immunodeficiency virus integration preference is similar to that of human immunodeficiency virus type 1. II J. Virol., 2005, 79, 12199-12204.

30. Kang Y., Moressi C.J., Scheetz T.E., Xie L., Tran D.T., Casavant T.L., Ak P., Benham C.J., Davidson B.L., McCray P.B. Jr. Integration site choice of a feline immunodeficiency virus vector. II J. Virol., 2006, 80, 8820-8823.

31. Desfarges S., Ciuffi A. Retroviral integration site selection. // Viruses, 2010, 2, 111-130.

32. Studamire B., Goff S.P. Host proteins interacting with the Moloney murine leukemia virus integrase: multiple transcriptional regulators and chromatin binding factors. // Retrovirology, 2008, 5, 48.

33. Van Maele B., Debyzer Z. HIV-1 integration: an interplay between HIV-1 integrase, cellular and viral proteins. II AIDS Rev., 2005, 7, 26-43.

34. Van Maele B., Busschots K., Vandekerckhove L., Christ F., Debyzer Z. Cellular co-factors of HIV-1 integration. // Trends. Biochem. Sci., 2006, 31, 98-105.

35. Cherepanov P., Maertens G., Proost P., Devreese B., Van Beeumen J., Engelborghs Y., De Clercq E., Debyser Z. HIV-1 integrase forms stable tetramers and associates with LEDGF/p75 protein in human cells. II J. Biol. Chem., 2003, 278, 372-381.

36. Maertens G., Cherepanov P., Pluymers W., Busschots K., De Clercq E., Debyser Z., Engelborghs Y. LEDGF/p75 is essential for nuclear and chromosomal targeting of HIV-1 integrase in human cells. II J. Biol. Chem., 2003, 278, 33528-33539.

37. Ciuffi A., Llano M., Poeschla E., Hoffmann C., Leipzig J., Shinn P., Ecker J.R., Bushman F. A role for LEDGF/p75 in targeting HIV DNA integration. II Nat. Med., 2005, 11, 1287-1289.

38. Llano M., Saenz D.T., Meehan A., Wongthida P., Peretz M., Walker W.H., Teo W., Poeschla E.M. An essential role for LEDGF/p75 in HIV-1 integration. I I Science, 2006, 314, 461-464.

39. Marshall H.M., Ronen K., Berry C., Llano M., Sutherland H., Saenz D., Bickmore W., Poeschla E., Bushamn F.D. Role of PSIPl/LEDGF/p75 in lentiviral infectivity and integration targeting. // PLoS ONE, 2007, 2, el340.

40. Bushman F.D. Tethering human immunodeficiency virus 1 integrase to a DNA site directs integration to nearby sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91, 9233-9237.

41. Goulaouic H., Chow S.A. Directed integration of viral DNA mediated by fusion proteins consisting of human immunodeficiency virus type 1 integrase and Escherichia coli LexA protein. II J. Virol., 1996, 70, 37-46.

42. Katz R.A., Merkel G., Skalka A.M. Targeting of retroviral integrase by fusion to a heterologous DNA binding domain: in vitro activities and incorporation of a fusion protein into viral particles. // Virology, 1996, 217, 178-190.

43. Bushman F.D., Miller M.D. Tethering human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes to target DNA promotes integration at nearby sites. // J. Virol., 1997, 71, 458-464.

44. Peng W.-J., Chang C.-M., Lin T.-H. Target integration by a chimeric Spl zinc finger domainMoloney murine leukemia virus integrase in vivo. II J. Biomed. Sci., 2002, 9, 171-184.

45. Ciuffi A., Diamond T.L., Hwang Y., Marshall H.M., Bushman F.D. Modulating target site selection during human immunodeficiency virus DNA integration in vitro with an engineered tethering factor. II Hum. Gene Ther., 2006, 17, 960-967.

46. Lim K., Klimczak R., Yu J.H., Schaffer D.V. Specific insertions of zinc finger domains into Gag-Pol yield engineered retroviral vectors with selective integration properties. // PNAS, 2010, 107, 12475-12480.

47. Urnov F.D., Rebar E.J., Holmes M.C., Zhang H.S., Gregory P.D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. // Nat. Rev. Genet., 2010, 11, 636-646.

48. Klug A. The discovery of zinc fingers and their development for practical applications in gene regulation and genome manipulation. // Q. Rev. Biophys., 2010, 43, 1-21.

49. Sera T. Zinc-finger-based artificial transcription factors and their applications. // Adv. Drug. Deliv. Rev., 2009, 61, 513-526.

50. Segal D.J., Barbas C.F. 3rd. Custom DNA-binding proteins come of age: polydactyl zinc-finger proteins. // Curr. Opin. Biotechnol., 2001, 12, 632-637.

51. Beerli R.R., Barbas C.F. 3rd. Engineering polydactyl zinc-finger transcription factors. // Nat. Biotechnol., 2002, 20, 135-141.

52. Wu H., Yang W.P., Barbas C.F. 3rd. Building zinc fingers by selection: toward a therapeutic application. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1995, 92, 344-348.

53. Beerli R.R., Dreier B., Barbas C.F. 3rd. Positive and negative regulation of endogenous genes by designed transcription factors. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 9, 2000, 1495-1500.

54. Chow S.A. In vitro assays for activities of retroviral integrase. II Methods, 1997, 12, 306-317.

55. Bushman F.D., Fujiwara T., Craigie R. Retroviral DNA integration directed by HIV integration protein in vitro. // Science, 1990, 249, 1555-1558.

56. Holmes-Son M.L., Chow S.A. Integrase-lexA fusion proteins incorporated into human immunodeficiency virus type 1 that contains a catalytically inactive integrase gene are functional to mediate integration. II J. Virol., 2000, 74, 11548-11556.

57. Holmes-Son M.L., Chow S.A. Correct integration mediated by integrase-LexA fusion proteins incorporated into HIV-1. IIMol. Ther., 2002, 5, 360-370.

58. Purcell D.F., Martin M.A. Alternative splicing of human immunodeficiency virus type 1 mRNA modulates viral protein expression, replication and infectivity. // J. Virol., 1993, 6, 63656378.

59. Pabo C.O., Sauer R.T., Sturtevant J.M., Ptashne M. The lambda repressor contains two domains. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1979, 76, 1608-1612.

60. Little J.W. and Mount D.W. The SOS regulatory system of Escherichia coli. // Cell, 1982, 29, 11-22.

61. Schnarr M., Oertel-Buchheit P., Kazmaier M., Granger-Schnarr M. DNA binding properties of the Lex-A repressor. // Biochemie, 1991, 73, 423-431.

62. Pavletich N.P., Pabo C.O. Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 Á. II Science, 1991, 252, 809-817.

63. Mitchell P.J., Tjia R. Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence-specific DNA binding proteins. // Science, 1989, 245, 371-378.

64. Yu J.H., Schaffer D.V. High-throughput, library-based selection of a murine leukemia virus variant to infect nondividing cells. II J. Virol., 2006, 80, 8981-8988.

65. Busschots K., Vercammen J., Emiliani S., Benarous R., Engelborghs Y., Christ F., Debyser Z. The interaction of LEDGF/p75 with integrase is lentivirus-specific and promotes DNA binding. // J. Biol. Chem., 2005, 280, 17841-17847.

66. Nakanishi H., Higuchi Y., Kawakami S., Yamashita F., Hashida M. Development and therapeutic application of transposon-based vectors.// Yakugaku Zasshi, 2009, 129, 1433-1443.

67. Vigdal T.J., Kaufman C.D., Izsvak Z., Voytas D.F., Ivies Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tel /mariner transposable elements. II J. Mol. Biol., 2002, 323, 441-452.

68. Ivies Z., Hackett P.B., Plasterk R.H., Izsvak Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tcl-like transposon from fish, and its transposition in human cells. // Cell, 1997, 91, 501-510.

69. Plasterk R.H., Izsvak Z., and Ivies Z. Resident aliens: the Tcl/mariner superfamily of transposable elements. // Trends Genet., 1999, 15, 326-332.

70. Fraser M.J., Cary L., Boonvisudi K., Wang H.G. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. // Virology, 1995, 211, 397-407.

71. Walisko O., Schorn A., Rolfs F., Devaraj A., Miskey C., Izsvak Z., Ivies Z. Transcriptional activities of the Sleeping Beauty transposon and shielding its genetic cargo with insulators. // Mol. Ther., 2008, 16, 359-369.

72. Granger L., Martin E., Ségalat L. Mos as a tool for genome-wide insertional mutagenesis in Caenorhabditis elegans: results of a pilot study. // Nucl. Acids Res., 2004, 32, el 17.

73. Crénès G., Ivo D., Hérisson J., Dion S., Renault S., Bigot Y., Petit A. The bacterial Tn9 chloramphenicol resistance gene: an attractive DNA segment for Mosl mariner insertions. // Mol. Genet. Genomics, 2009, 281, 315-328.

74. Yusa K., Takeda J., Horie K. Enhancement of Sleeping Beauty transposition by CpG methylation: possible role of heterochromatin formation. // Mol. Cell. Biol., 2004, 24, 4004-4018.

75. Demattei M.V., Thomas X., Carnus E., Augé-Gouillou C., Renault S. Site-directed integration of transgenes: transposons revisited using DNA-binding-domain technologies. // Genetica, 2010, 138, 531-540.

76. Izsvak Z., Ivies Z. Sleeping beauty transposition: biology and application for molecular therapy. // Mol. Ther., 2004, 9, 147-156.

77. Wilson M.H., Kaminski J.M., George A.L. Jr. Functional zinc finger/sleeping beauty transposase chimeras exhibit attenuated overproduction inhibition. // FEBS Lett., 2005, 579, 6205-6209.

78. Yant S.R., Huang Y., Akache B., Kay M.A. Site-directed transposon integration in human cells. // Nucl. Acids Res., 2007, 35, e50.

79. Ivies Z., Katzer A., Stuwe E.E., Fielder D., Knespel S., Izsvak Z. Targeted Sleeping Beauty Transposition in Human Cells. II Mol. Ther., 2007, 15,1137-1144.

80. Maragathavally K.J., Kaminski J.M., Coates C.J. Chimeric Mosl and piggyBac transposases result in site-directed integration. IIFASEB J., 2006, 20: 1188-1195.

81. Wang N., Jiang C.Y., Jiang M.X., Zhang C.X., Cheng J.A. Using chimeric piggyBac transposase to achieve directed interplasmid transposition in silkworm Bombyx mori and fruit fly Drosophila cells. II J. Zhejiang Univ. Sci. B., 2010, 11, 728-734.

82. Feng X., Bednarz A.L., Colloms S.D. Precise targeted integration by a chimaeric transposase zinc-finger fusion protein. // Nucl. Acids Res., 2010, 38, 1204-1216.

83. Szabo M., Miiller F., Kiss J., Balduf C., Strahle U., Olasz F. Transposition and targeting of the prokaryotic mobile element IS30 in zebrafish. II FEBS Lett., 2003, 550, 46-50.

84. Izsvak Z., Khare D., Behlke J., Heinemann U., Plasterk R.H., Ivies Z. Involvement of a bifunctional, paired-like DNA-binding domain and a transpositional enhancer in Sleeping Beauty transposition. // J. Biol. Chem., 2002, 277, 34581-34588.

85. Linial M., Fan H., Hahn B., Lower R., Neil J., Quackenbusch S., Rethwilm A., Sonigo P., Stoye J., Tristem M. Retroviridae. B: Fauquet C. M., Mayo M. A., Maniloff J., Desselberger U., Ball L. A. (eds) // 2005, Virus taxonomy, Elsevier, San Diego.

86. Rethwilm A. Unexpected replication pathways of foamy viruses. // J. Acquir. Immune Deflc. Syndr. Hum. Retrovirol., 1993, 13, 248-253.

87. Delelis O., Jacqueline L.-C., SaYb A. Foamy viruses a world apart. // Curr. Op. Microb., 2004, 7, 400-406.

88. Meiering C.D., Linial M.L. Historical perspective of foamy virus epidemiology and infection. II Clin. Microbiol. Rev., 2001, 14, 165-176.

89. Achong B.G., Mansell P.W., Epstein M.A., Clifford P. An unusual virus in cultures from a human nasopharyngeal carcinoma. // J. Natl. Cancer. Inst., 1971, 46, 299-307.

90. Schweizer M., Neumann-Haefelin D. Phylogenetic analysis of primate foamy viruses by comparison of pol sequences. // Virology, 1995, 207, 577-582.

91. Moebes A., Enssle J., Bieniasz P.D., Heinkelein M., Lindemann D., Bock M., McClure M.O., Rethwilm A. Human foamy virus reverse transcription that occurs late in the viral replication cycle. II J. Virol., 1997, 71, 7305-7311.

92. Yu S.F., Sullivan M.D., Linial M.L. Evidence that the human foamy virus genome is DNA. HJ. Virol., 1999, 73, 1565-1572.

93. Schweizer M., Falcone V., Gaenge J., Turek R., Neumann-Haefelin D. Simian foamy virus isolated from an accidentally infected human individual. // J. Virol., 1997, 71, 4821-4824.

94. Jones-Engel L., Engel G.A., Schillaci M.A., Rompis A., Putra A., Suaryana K.G., Fuentes A., Beer B., Hicks S., White R., Wilson B., Allan J.S. Primate-to-primate retroviral transmission in Asia. II Emerg. Infect. Dis., 2005, 11, 1028-1035.

95. Hooks J.J., Gibbs C.J. Jr. The foamy viruses. // Bacteriol. Rev., 1975, 39, 169-185.

96. Mergia A., Leung N.J., Blackwell J. Cell tropism of the simian foamy virus type 1 (SFV-1). II J. Med. Primatol., 1996, 25, 2-7.

97. Falcone V., Schweizer M., Neumann-Haefelin D. Replication of primate foamy viruses in natural and experimental hosts. // Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2003, 277, 161-180.

98. Murray S.M., Picker L.J., Axthelm M.K., Linial M.L. Expanded tissue targets fpr foamy virus replication with simian immunodeficiency virus-induced immunosupression. // J. Virol., 2006, 80, 663-670.

99. Linial M.L. Foamy viruses are unconventional retroviruses. // J. Virol., 1999, 73, 17471755.

100. Cummins J.E. Jr., Boneva R.S., Switzer W.M., Christensen L.L., Sabdstrom P., Heneine W., Chapman L.E., Dezutti C.S. Mucosal and systemic antibody responses in human infected with simian foamy virus. // J. Virol., 2005, 79, 13186-13189.

101. Lecellier C.H., Dunoyer P., Arar K., Lehmann-Che J., Eyquem S., Himber C., Saib A., Voinnet O. A cellular microRNA mediates antiviral defence in human cells. // Science, 2005, 308, 557-560.

102. Cullen B.R. Role and mechanism of action of the APOBEC3 family of antiretroviral resistance factors. H J. Virol., 2006, 80, 1067-1076.

103. Sheehy A.M., Gaddis N.C., Choi J.D., Malim M.H. Isolation of a human gene that inhibits HIV-1 infection and is suppressed by the viral Vif protein. II Nature, 2002, 418, 646-650.

104. Esnault C., Heidmann O., Delebecque F., Dewannieux M., Ribet D., Hance A.J., Heidmann T., Schwartz O. APOBEC3G cytidine deaminase inhibits retrotransposition of endogenous retroviruses. II Nature, 2005, 433, 430-433.

105. Rosler C., Kock J., Kann M., Malim M.H., Blum H.E., Baumert T.F., von Weizsäcker F. APOBEC-mediated interference with hepadnavirus production. // Hepatology, 2005, 42, 301309.

106. Delebecque F., Suspene R., Calattini S., Casartelli N., Saib A., Froment A., Wain-Hobson S., Gessain A., Vartanian J.P., Schwartz O. Restriction of foamy viruses by APOBEC cytidine deaminases.// J. Virol., 2006, 80, 605-614.

107. Rüssel R.A., Wiegand H.L., Moore M.D., Schäfer A., McClure M.O., Cullen B.R. Foamy virus Bet proteins function as novel inhibitors of the APOBEC3 family of innate antiretroviral defence factors. II J. Virol., 2005, 79, 8724-8731.

108. Rethwilm A. The replication strategy of foamy viruses. // Curr. Top. Microbiol. Immunol.,2003, 277, 1-26.

109. Rethwilm A., Molecular biology of foamy viruses. // Med. Microbiol. Immunol., 2010, 199, 197-207.

110. Lochelt M., Muranyi W., Fliigel R.M. Human foamy virus genome possesses an internal, Bel-1-dependent and functional promoter. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993,90, 7317-7321.

111. Lochelt M., Yu S.F., Linial M.L., Fliigel R.M. The human foamy virus internal promoter is required for efficient gene expression and infectivity. // Viorology, 1995, 206, 601-610.

112. He F., Blair W.S., Fukushima J., Cullen B.R. The human foamy virusn Bel-1 transcription factor is a sequence specific DNA binding protein. // J. Virol., 1996, 70, 3902-3908.

113. Kang Y., Blair W.S., Fukushima J. Identification and functional characterization of a high affinity Bel-1 DNA binding site located in the human foamy virus internal promoter. // J. Virol., 1998, 72, 504-511.

114. Kang Y., Cullen B.R. Derivation and functional chatacterization of a consensus DNA binding sequence for the tas transcriptional activator of simian foamy virus type 1. // J. Virol., 1998, 72, 5502-5509.

115. LQchelt M. Foamy virus transactivation and gene expression. // Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2003, 277, 27-61.

116. Bannert H., Muranyi W., Ogryzko V.V., Nakatani Y., Flugel R.M. Coactivators p300 and PCAF physically and functionally interact with the foamy viral transactivator. // BMC Mol. Biol.,2004, 5, 16.

117. Bodem J., Krausslich H.G., Rethwilm A. Acetylation of the foamy virus transactivator Tas by PCAF augments promoter binding activity and virus transcription. // J. Gen. Virol., 2007, 88, 259-263.

118. Cullen B.R. Nuclear mRNA export: insights from virology. // Trends Biochem. Sci., 2003, 28, 419-424.

119. Bodem J., Schied Т., Gabriel R., Rammling M., Rethwilm A. Foamy virus nuclear RNA export is distinct from that of other retroviruses. // J. Virol., 2011, 85, 2333-2341.

120. Swanstrom R., Wills J.W. Synthesis, assembly and processing of viral proteins. B: Coffin J. M., Hughes S. H., Varmus H. E. (eds) Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, стр. 263-334.

121. Cartellieri M., Rudolph M., Herchenröeder О., Lindemann D., Rethwilm A. Determination of the relative amounts of Gag and Pol proteins in foamy virus particles. 2005 Retrovirology. 2:44.

122. Enssle J., Fischer N., Moebes A., Mauer В., Smola U., Rethwilm A. Carboxy-terminal cleavage of the human foamy virus Gag precursor molecule is an essential step in the viral life cycle.///. Virol., 1997, 71, 7312-7317.

123. Zemba M., Wilk Т., Rutten Т., Wagner A., Fügel R.M., Löchelt M. The carboxy-terminal p3Gag domain of the human foamy virus Gag precursor is required for efficient virus infectivity. // Virology, 1998, 247, 7-13.

124. Lehmann-Che J., Giron M.L., Delelis O., Löchelt M., Bittoun P., Tobaly-Tapiero J., de The H., Saib A. Protease-dependent uncoating of a complex retrovirus. // J. Virol., 2005, 79, 92449253.

125. Pfrepper K.I., Löchelt M., Rackwitz H.R., Schnölzer M., Heid H., Fügel R.M. Molecular characterization of proteolytic processing of the Gag proteins of human spumavirus. // J. Virol., 1999, 73, 7907-7911.

126. Fischer N., Heinkelein M., Lindemann D., Enssle J., Baum С., werder E., Zentgraf H., Müller J.G., Rethwilm A. Foamy virus particle formation. // J. Virol., 1998, 72, 1610-1615.

127. Pietschmann Т., Heinkelein M., Heldmann M., Zentgraf H., Rethwilm A., Lindemann D.F. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. // J. Virol., 1999, 73, 2613-2621.

128. Cartellieri M., Herchenroder O., Rudolph W., Heinkelein M., Lindemann D., Zentgraf H., Rethwilm A. N-terminal Gag-domain required for foamy virus particle assembly and export. // J. Virol., 1999, 79, 12464-12476.

129. Tobaly-Tapiero J., Bittoun P., Giron M.L., Neves M., Koken M., Saib A., de The H. Human foamy virus capsid formation requires an interaction domain in the N terminus of Gag. // J. Virol., 2001, 75, 4367-4375.

130. Freed E.O. Viral late domains. II J. Virol., 2002, 76, 4679-4687.

131. Schliephake, A.W., Rethwilm A. Nuclear localization of foamy virus Gag precursor protein. II J. Virol., 1994, 68, 4946-4954.

132. Jewell N.A., Mansky L.M. In the beginning: genome recognition, RNA encapsidation and the initiation of complex retrovirus assembly. II J. Gen. Virol., 2000, 81, 1889-1899.

133. Yu S.F., Edelmann K., Strong R.K., Moebes A., Rethwilm A., Linial M.L. The carboxyl terminus of the human foamy virus Gag protein contains separable nucleic acid binding and nuclear transport domains. // J. Virol., 1996, 70, 8255-8262.

134. Lee E.G., Linial M.L. The C terminus of foamy retrovirus Gag contains determinants for encapsidation of Pol protein into virions. II J. Virol., 2008, 82, 10803-10810.

135. Müllers E., Uhlig T., Stirnnagel K., Fiebig U., Zentgraf H., Lindemann D. Novel functions of prototype foamy virus gag glycine-arginine-rich boxes in reverse transcription and particle morphogenesis. II J. Virol., 2011, 85, 1452-1463.

136. Tobaly-Tapiero J., Bittoun P., Lehmann-Che J., Delelis O., Girón M.L., de The H., Saib A. Chromatin tethering of incoming foamy virus by the structural Gag protein. // Traffic, 2008, 9, 1717-1727.

137. Müllers E., Stirnnagel K., Kaulfuss S., Lindemann D. Prototype foamy virus Gag nuclear localization: a novel pathway among retroviruses. II J. Virol., 2011, 85, 9276-9285.

138. Yu S.F., Baldwin D.N., Gwynn S.R., Yendapalli S., Linial M.L. Human foamy virus replication: a pathway distinct from that of retroviruses and hepadnaviruses. // Science, 1996, 271, 1579-1582.

139. Jordan I., Enssle J., Güttler E., Mauer B., Rethwilm A. Expression of human foamy virus reverse transcriptase involves a spliced pol mRNA. // Virology, 1996, 224, 314-319.

140. Heinkelein M., Leurs C., Rammling M., Peters K., Hanenberg H., Rethwilm A. Pregenomic RNA is required for efficient incorporation of pol polyprotein into foamy virus capsids. // J. Virol., 2002, 76, 10069-10073.

141. Peters K., Wiktorowicz T., Heinkelein M., Rethwilm A. RNA and protein requirements for incorporation of the Pol protein into foamy virus particles. // J. Virol., 2005, 79, 7005-7013.

142. Pfrepper K.I., Rackwitz H.R., Schnolzer M., Heid H., Lochelt M., Flügel R.M. Molecular characterization of proteolytic processing of the Pol proteins of human foamy virus reveals novel features of the viral protease. II J. Virol., 1998, 72, 7648-7652.

143. Lee E.G., Roy J., Jackson D., Clark P., Boyer P.L., Hughes S.H., Linial M.L. Foamy retrovirus integrase contains a Pol dimerization domain required for protease activation. // J. Virol., 2011, 85, 1655-1661.

144. Imrich H., Heinkelein M., Herchenroder О., Rethwilm A. Primate foamy virus Pol proteins are imported into the nucleus. II J. Gen. Virol., 2000, 81, 2941-2947.

145. Ennsle J., Moebes A., Heinkelein M., Panhuysen M., Mauer В., Schweizer M., Neumann-Haefelin D., Rethwilm A. An active foamy virus integrase is required for virus replication. // J. Gen. Virol., 1999, 80, 1445-1452.

146. Juretzek Т., Holm Т., Gartner K., Kanzler S., Lindemann D., Herchenroder O., Picard-Maureau M., Rammling M., Heinkelein M., Rethwilm A. Foamy virus integration. // J. Virol., 2004, 78, 2472-2477.

147. Delelis O., Petit C., Leh H., Mbemba G., Mouscadet J.-F., Sonigo P. A novel function for spumaretrovirus integrase: an early requirement for integrase-mediated cleavage of 2-LTR circles. // Retrovirology, 2005, 2, 31.

148. Russell R.A., Critchley R., Vassaux G., McClure M.O. Human foamy virus integrase fails to catalyse the integration of a circular DNA molecule containing an LTR junction sequence. // Gen. Ther., 2002, 9, 1326-1332.

149. Pahl A., Flugel R.M. Endonucleolytic Cleavages and DNA-Joining Activities of the Integration Protein of Human Foamy Virus. // J. Virol., 1993, 67, 5426-5434.

150. Valkov E., Gupta S.S., Hare S., Helander A., Roversi P., McClure M., Cherepanov P. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. // Nucl. Acids Res., 2009, 37, 243-255.

151. Княжанская E.C., Смолов M.A., Кондрашина O.B., Готтих М.Б. Сравнительное изучение каталитических характеристик интеграз пенообразующего вируса человека и ВИЧ-1. II Acta Naturae, 2009, 2, 88-91.

152. Hunter E. Viral entry and receptors. // 1997 B: Coffin J.M., Hughes S.H., Varmus H.E., (eds)// Retroviruses, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Plainview, 71-119.

153. Lindemann D., Goepfert P.A. The foamy virus envelope glycoproteins. // Curr. Top. Microbiol. Immunol, 2003, 277, 111-129.

154. Lindemann D., Pietschmann T., Picard-Maureau M., Berg A., Heinkelein M., Thurow J., Knaus P., Zentgraf H., Rethwilm A. A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity. // J. Virol, 2001, 75, 5762-5771.

155. Duda A., Liiftenegger D., Pietschmann T., Lindemann D. Characterization of the prototype foamy virus envelope glycoprotein receptor-binding domain. // J. Virol, 2006, 80, 8158-8167.

156. Berg A., Pietschmann T., Rethwilm A., Lindemann D. Determinants of foamy virus envelope glycoprotein mediated resistance to superinfection. // Virology, 2003, 314, 243-252.

157. Liiftenegger D., Picard-Maureau M., Stanke N., Rethwilm A., Lindemann D. Analysis and function of pro to type foamy virus envelope N glycosylation. II J. Virol, 2005, 79, 7664-7672.

158. Trobridge G., Russel D.W. Cell cycle requirements for transduction by foamy virus vectors compared to those of oncovirus and lentivirus vectors. // J. Virol, 2004, 78, 2327-2335.

159. Nowrouzi A., Dittrich M., Klanke C., Heinkelein M., Rammling M., Dandekar T, von Kalle C., Rethwilm A. Genome-wide mapping of foamy virus vector integrations into a human cellline. // J. Gen. Virol., 2006, 87, 1339-1347.

160. Trobridge G.D., Miller D.G., Jacobs M.A., Allen J.M., Kiem H.P., Kaul R., Russel D.W. Foamy virus vector integration sites in normal human cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2006, 103,1498-1503.

161. Hare S., Gupta S.S., Valkov E., Engelman A., Cherepanov P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. II Nature, 2010, 11, 232-236.

162. Sander J.D., Zaback P., Joung J.K., Voytas D.F., Dobbs D. Zinc Finger Targeter (ZiFiT): an engineered zinc finger/target site design tool. // Nucl. Acids Res., 2007, 35, 599-605.

163. Papworth M., Kolasinska P., Minczuk M. Designer zinc-finger proteins and their applications. // Gene, 2006, 366, 27-38.

164. McNamara A.R., Hurd P.J., Smith A.E., Ford K.G. Characterisation of site-biased DNA methyltransferases: specificity, affinity and subsite relationships. // Nucl. Acids Res., 2002, 30, 3818-3830.

165. Akopian A., He J., Boocock M.R., Stark W.M. Chimeric recombinases with designed DNA sequence recognition. II Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2003, 100, 8688-8691.

166. Carroll D. Using nucleases to stimulate homologous recombination. // Methods Mol. Biol., 2004, 262, 195-207.

167. Urnov F.D., Miller J.C., Lee Y.L., Beausejour C.M., Rock J.M., Augustus S., Jamieson A.C., Porteus M.H., Gregory P.D., Holmes M.C. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. // Nature, 2005, 435, 646-651.

168. Fu F., Sander J.D., Maeder M., Thibodeau-Beganny S., Joung J.K., Dobbs D., Miller L., Voytas D.F. Zinc Finger Database (ZiFDB): a repository for information on C2H2 zinc fingers and engineered zinc-finger arrays. //Nucl. Acids Res., 2009, 37, 279-283.

169. Persikov A.V., Osada R., Singh M. Predicting DNA recognition by Cys2His2 zinc finger proteins. // Bioinformatics, 2009, 25, 22-29.

170. Smolov M., Gottikh M., Tashlitskii V., Korolev S., Demidyuk I., Brochon J.C., Mouscadet J.F., Deprez E. Kinetic study of the HIV-1 DNA 3'-end processing. // FEBSJ., 2006, 273, 11371151.

171. Lee H.S., Kang S.Y., Shin C.G. Characterization of the functional domains of human foamy virus integrase using chimeric integrases. // Mol. Cells., 2005, 19, 246-255.

172. Agapkina J., Smolov M., Barbe S., Zubin E., Zatsepin T., Deprez E., Le Bret M., Mouscadet J.-F., Gottikh M. Probing of HIV-1 integrase/DNA interactions using novel analogs of viral DNA.//J. Biol. Chem., 2006, 281, 11530-11540.

173. Wang T., Balakrishnan M., Jonsson C.B. Major and minor groove contacts in retroviral integrase-LTR interactions. // Biochemistry, 1999, 38, 3624-3632.

174. Chan P.P., Lowe T.M. GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence. II Nucl. Acids Res., 2009, 37(Database issue), D93-D97.

175. Mandell J.G., Barbas C.F. 3rd. Zinc Finger Tools: custom DNA-binding domains for transcription factors and nucleases. // Nucl. Acids Res., 2006, Jul 1, 34.

176. Pruett-Miller S.M., Connelly J.P., Maeder M.L., Joung J.K., Porteus M.H. Comparison of zinc finger nucleases for use in gene targeting in mammalian cells. // Mol. Ther., 2008, 16, 707717.

177. Dreier B., Segal D.J., Barbas C.F. 3rd. Insights into the molecular recognition of the 5'-GNN-3' family of DNA sequences by zinc finger domains. II J. Mol. Biol., 2000, 303, 489-502.

178. Blancafort P., Magnenat L., Barbas C.F. 3rd. Scanning the human genome with combinatorial transcription factor libraries. // Nat. Biotechnol., 2003, 21, 269-274.

179. Woody R.W. Circular dichroism. // 1995, Methods enzymol., 246, 34-71.

180. Negi S., Umeda Y., Masuyama S., Капо K., Sugiura Y. Novel zinc finger nuclease created by combining the Cys(2)His(2)- and His(4)-type zinc finger domains. // Bioorg. Med. Chem. Lett., 2009, 19, 2789-2791.

181. Chou C.C., Lou Y.C., Tang Т.К., Chen C. Structure and DNA binding characteristics of the three-Cys(2)His(2) domain of mouse testis zinc finger protein. // Proteins, 2010, 78, 2202-2212.

Информация о работе

Княжанская, Екатерина Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Характеристика интегразы пенообразующего вируса и оценка возможности ее использования для направленной интеграции ДНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы