Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, исследование каталитической активности и ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru с использованием олигонуклеотидного и LTR-содержащих субстратов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение, исследование каталитической активности и ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru с использованием олигонуклеотидного и LTR-содержащих субстратов"

На правахрукописи

Семенова Елена Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ, ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ИНГИБИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1^X1 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО И LTR-СОДЕРЖАЩИХ СУБСТРАТОВ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.

Научныйруководитель:

доктор медицинских наук, профессор Покровский А.Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Дегтярев С. X. кандидат химических наук Зиновьев В. В.

Ведущая .организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Защита состоится 14 мая 2004 года в 16.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ по адресу. Кольцово Новосибирской области, 630559 (тел. 3832-367428).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.

Автореферат разослан апреля 2004 г.

диссертационного совета

Учёный секретарь

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время подавление репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) основано на использовании препаратов блокирующих активность вирусных ферментов - обратной/ транскриптазы и протеазы. Основным недостатком этих препаратов является, достаточно высокая токсичность для человека из-за гомологии вирусной протеазы с эукариотическими протеазами и, соответственно, обратной транскриптазы с ДНК-полимеразами клетки. Наиболее! перспективной мишенью для анти-ВИЧ терапии считается третий вирусный фермент -интеграза, которая за счет катализа реакций З'-процессинга и встраивания осуществляет интеграцию провирусной ДНК в геном клетки-хозяина и отличается своей многофункциональностью от клеточных ферментов Однако, найденные к настоящему времени несколько групп ингибиторов интегразы ВИЧ-1 (производные дикетоновой кислоты, производные нуклеотидов, ароматические соединения с гидроксильными группами) также подавляют активность других ферментов, таких как обратная транскригггаза и протеаза ВИЧ-1, эукариотические ДНК-полимеразы, бактериальные рестриктазы Другим препятствием для внедрения в клиническую практику противовирусных препаратов на основе ингибиторов интегразы является низкая корреляция между экспериментальными данными, полученными с использованием рекомбинантного фермента т vitro и данными по ингибированию репликации ВИЧ-1 в культуре клеток Отличия результатов ингибиторного анализа возможны как из-за различий в нуклеотидной последовательности гена, кодирующего фермент из различных штаммов ВИЧ, так и из-за способов определения активности интегразы in vitro.

До настоящего времени основным способом определения активности интегразы ретровирусов in vitro является процедура, основанная на использовании рекомбинантной интегразы и различных радиоактивных двуцепочечных дуплексах длиной 18-36 нуклеотидов, гомологичных концам длинных концевых повторов (long terminal repeat - LTR), в качестве субстратов Ранее было показано, что активность рекомбинантной интегразы in vitro зависит от наличия обоих LTR-концов в активном центре и протяженности субстрата, что не выполняется в случае олигонуклеотидного дуплекса. Использование же полученных на сегодняшний день протяженных ДНК-дуплексов для тестирования ингибиторов интегразы затрудняется сложным многостадийным конструированием, а также невозможностью тестировать активность интегразы в обеих и

встраивания, без дополнительных модификаций субстратов применительно к каждой реакции.

Цель и задачи исследования; Целью данной работы являлось получение, исследование каталитической активности и ингибирование рекомбинатной интегразы ВИЧ-1 штамма Bru с использованием олигонуклеотидного и иШ-тодержащих субстратов.

В задачи работы входило:

- получить конструкцию для экспрессии в Eichenchia coh рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 на основе штамма Bru (ВЙЧ-1/Bru) Выделить рекомбинатную интегразу ВИЧ-1/Bru и определить основные кинетические параметры полученного фермента.

- провести поиск ингибиторов рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru в реакции 3*-процессинга in vitro среди соединений из химически-различных групп: ' тритерпеновых соединений (глицирризиновой кислоты, глицерретовой кислоты и ее производных, бетулоновой кислоты и ее производных), флавоноидов, кумаринов, синтетических алкалоидов, циклических сулъфонов, сесквитерпеновых лактонов, пространственно затрудненных фенольных соединений, производных полицикланов.

- сконструировать протяженные LTR-содержащие субстраты и разработать методы для определения активности рекомбинантной интегразы с их использованием в реакциях З'-процессинга и встраивания in vitro. Провести сравнительное исследование активности и ингибиторный анализ рекомбинатной интегразы ВИЧ-1/Bnr с использованием стандартного субстрата - олигонуклеотидного дуплекса, и сконструированных LTR-содержащих субстратов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе получена система определения активности рекомбинантной интегразы в реакциях З'-процессинга и встраивания. Система состоит из впервые полученной и охарактеризованной рекомбинатной интегразы ВИЧ-1 штамма Bra и впервые сконструированных LTR-содержащих субстратов длиной 636 п.н. и 1270 п.н. Данная система позволяет исследовать in vitro реакции, катализируемые интегразой ВИЧ, в условиях максимально приближенных к in vivo и с большей эффективностью осуществлять поиск ингибиторов интегразы ВИЧ-1 для их возможного дальнейшего применения в качестве препаратов для анти-ВИЧ терапии.

В результате „исследования, были найдены 2 'группы новых ингибиторов

интегразы ВИЧ-1 в реакции З'-процессинга: производные бетулоновой кислоты и производные фурил-замещенных полицикланов. Показано, что одним из механизмов анти-ВИЧ действия производных бетулоновой кислоты является ингибирование интегразы ВИЧ-1, что открывает перспективы использования в клинической практике этой группы соединений.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации

опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи, 4 тезиса докладов, а также получено положительное решение о выдаче патента Российской Федерации. Результаты диссертации используются для разработки в ГНЦ ВБ "Вектор" нового анти-ВИЧ препарата на основе дипептида бетулоновой кислоты (рис. 7, I-Зв), эффективно ингибирующего рекомбинатную интегразу ВИЧ-1/Bru в реакции З'-процессинга.

Материалы диссертации были представлены на следующих международных конференциях: "Human Proteome Organization (HUPO) 2nd Annual & ХГХ International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) World Congress (Монреаль, Канада, 2003), "2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment" (Париж, Франция, 2003), "The 6th international Engelhardt conference on molecular biology" (Санкт-Петербург -Москва, 2003), "28th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (FEBS)" (Стамбул, Турция, 2002).

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (посвященного структуре, механизмам функционирования и ингибирования ретровирусных интеграз), экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (180 ссылок), содержит 30 рисунков и 9 таблиц.

ОСНОВНОЕСОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Получение и характеризация рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru

Штамм Bru является одним из наиболее используемых для исследования репликации и ингибирования ВИЧ-1 в культуре клеток. Однако на сегодняшний день для исследований интеграции ВИЧ-1 in vitro используется в основном рекомбинантная интеграза, полученная путем переклонирования с высокопродуцентного молекулярного клона вируса

иммунодефицита - pNL4-3, в котором последовательность гена pol, кодирующего интегразу, гомологична ДНК штамма NY5. Данные кинетического анализа реакций, катализируемых рекомбинатной интегразой ВИЧ-1/рЖ4-3, модифицированной сайт-направленым мутагенезом, получены, как правило, качественно без вычисления основных каталитических характеристик фермента. Это затрудняет какую-либо систематизацию результатов по влиянию аминокислотных замен на функции фермента, полученных разными научными группами.

Получение рекомбинатной интегразы ВИЧ-1/Bru. Фрагмент кДНК ВИЧ-1, содержащий* нуклеотидную' последовательность, кодирующую интегразу, амплифицировали методом полимеразной цепной реакции двумя рарами праймеров. На основе анализа нуклеотидной последовательности штамма Bra ВИЧ-1 (GeneBank HIV Sequence Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, США) были выбраны пары специфических праймеров: Inl-fwd (5'- TTCAAGCACAACCAGATAAA -3') — Inl-rev (5' -ACCAATCTAGCATCCCCTAG -3') и In2-fwd (5'-

CCAGTGCATATGGCTGGAATCAGGAAGGTA-3') — In2-rev (5'-GGTCCTGGATCCTTATCATCCTGTCTACTTG-3').

12 3

Рисунок 1. Амплификация фрагмента гена pol ВИЧ-1 (штамм •V Вт), кодирующего ингегразу: 1 -маркеры (pET/Rsal), слева - их молекулярный вес в п.н.; 2 - первый этап ПЦР; 3 -второй этап ПЦР.

Рисунок 2. Схематическое изображение конструкции для экспрессии

рекомбинатной интегразы ВИЧ-1/Bru.

На первом этапе праймерами Inl-fwd и Inl-rev нарабатывали фрагмент, превышающий размер нуклеотидной последовательности, кодирующей интегразу, на 150 п. н. с обоих концов (рис. 1, дорожка 2). Второй этап ПЦР гнездовыми праймерами In2-fwd и In2-rev позволил получить необходимое количество фрагмента ДНК (рис. 1, дорожка 3), кодирующего интегразу, с заданными концевыми последовательностями для последующего клонирования гена в экспрессирующий вектор pET-15b ("Novagen", США) под контроль фагового Т7 промотора по сайтам Ndel - ВатШ. Полученная конструкция (рЕТ-15Ь-1п(Вги)В1) (рис., 2) позволяет нарабатывать белок в системе Eschenchia coh с дополнительной последовательностью аминокислот на N-конце - 6 остатков His, для возможности очистки на аффинном сорбенте.

По данным электрофоретического анализа суммарного белка клеточного лизата (рис. 3, дорожки 1, 2) после индукции в течение 3 ч экспрессии в клетках Ecoli BL21 (DE3) интеграза нарабатывается в количестве, значительно превышающем уровень экспрессии каждого из клеточных белков. Аффинной хроматографией на Ni-NTA агарозе при помощи линейного градиента элюции имидазолом достигалось выделение интегразы, гомогенной по данным Ds-Na-ПААГ-элекгрофореза (рис. 3, дорожки 5-6)

1 2 3 4 5 6

71.5

57.2 42,9

28.6

14.3

Рисунок 3. Электрофоретическое разделение в 12%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na: 1- суспензия клеток, содержащих рЕТ-15Ь-Ш(НГУ-1)ВгцВ1до индукции (разведение в 20 раз); 2- суспензия клеток после индукции (разведение .в 20 раз); 3 - белки-маркеры Dalton Mark Ш ("Fluka", США), слева - их молекулярная масса в кДа; 4-6- фракции ИН ВИЧ-1/Bru, элюируемые 100 - 500 мМ имидазола с Ni-NTA агарозы. Гель окрашен Кумасси R-250.

Измерение каталитических характеристик рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru в реакции 3*-процессинга. Исследование каталитической активности полученной рекомбинантной интегразы проводили, используя реакцию З'-процессинга. Субстрат на основе олигонуклеотидного дуплекса (21 п.н.), гомологичный Ш-концевой последовательности провирусной ДНК ВИЧ-1, конструировали гибридизацией двух олигонуклеотидов: 5'- GTGTGGAAAATCГСTAGCA - 3' и 5' - ACTGCTAGAGATTTTCCACAC - 3' с последующим достраиванием с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е.саН, используя [а-32P]dGTP и dTTP. Активность фермента определяли по отщеплению радиоактивномеченного продукта от олигонуклеотидного

дуплекса (рис. 4 а).

Рисунок 4. Измерение кинетических характеристик рекомбинатной интегразы ВИЧ-1/Вги в реакции З'-процессинга. а - накопление продукта реакции [а32р]ОрТ в зависимости от концентрации субстрата олигонуклеотидного дуплекса; б -график зависимости, начальных скоростей: накопления' продукта [а32р]0фТ от концентрации субстрата; в - линейная аппроксимация зависимости скорости реакции от концентрации субстрата.

Km для специфического дуплекса составила (3,7 ± 0,2) 10*10 М, к^т реакции 3-процессинга с использованием данного субстрата составила (1,2 ± 0,3) 10" 1/с, V^ (5,3 ±0,4) Ю- М/с (рис. 4 б, в).

Сравнение нуклеотидной последовательности рекомбинантной интегразы Вги ВИЧ-1 с интегразойpNL4-3. При сравнении нуклеотидной

последовательности интегразы pNL4-3 с последовательностью полученной нами рекомбинантной интегразы штамма Bra (рис. 5), были обнаружены нуклеотидные замены, приводящие к изменению аминокислотных остатков. Причем три из четырех замен происходят в функционально важных районах фермента: Glu(10)Asp в ННСС-фрагменте N-концевого домена, Val(113)He, Ile(151)Val в центральном домене в непосредственной близости от аминокислотных остатков, входящих в каталитический центр (Aspll6 и Glul52). Сравнение каталитической активности рекомбинатной интегразы ВИЧ-1/Вга с литературными данными по рекомбинантной интегразе ВИЧ-l/pNL4-3, позволило установить различия в сродстве к одному и тому же олигонуклеотидному субстрату. Установлено, что замены в положениях Glu(10)Asp, Val(113)He, Ile(151)Val и Val(244)Leu приводят к увеличению сродства к олигонуклеотидному дуплексу и.активации работы интегразы.

1 50 212 288

N-концевой домен Каталитический домен С-юнцевой домен

12 16 4043 64 116 162

H H сс D D Е

.10 113 151 241. ▼ • т- Т • ' Т IN^'DKAQEEH______,"PVKTVHTDN-...14'SQGVIESMN.____""DSRDPVWKGP

IN„U 'DKAQDEH._______~PVKT1HTDN____""SQGWESMN___"DSRDPLWKGP

Рисунок 5. Схема доменной структуры и отличия аминокислотной последовательности интегразы pNL4-3 и штамма Bru ВИЧ-1. Стрелками над аминокислотной последовательностью указаны позиции замен.

Взаимодействие рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru с

двухвалентными ионами металлов, каталитическая активность интегразы ВИЧ-1 зависит от присутствия кофакторов - ионов Мп2+ или Mg2*. Оптимум концентрации для проявления максимальной активности рекомбин,атной

интегразы ВИЧ-1/Bra в реакции З'-процессинга с использованием олигонуклеотидного субстрата составила для Mg*+ меньше на 2 мМ, чем для

Мп2+ (рис. 6). Следует отметить снижение

каталитической активности интегразы при дальнейшем увеличении концентрации Мп+.

Вероятно, уменьшение ферментативной активности в присутствии Мп2+ может быть результатом неспецифических взаимодействий ионов металла и фермента, а также выпадением белка в осадок.

2. Ингибирование реакции З'-процессинга, катализируемой рекомбинантной интегразой ВИЧ-1/Вги

Далее была определена ингибирующая активность различных соединений в отношении рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Вги в реакции З'-процессинга. Использовавшиеся в работе соединения были синтезированы в лаборатории лесохимии и биоактивных соединений Института Органической Химии СО РАН (г. Новосибирск) под руководством академика РАН, д.х.н. Толстикова Г. А. Исследованы следующие группы химических соединений: тритерпеновые соединения (глицирризиновая кислота, глицерретовая кислота и ее производные, бетулоновая кислота и ее производные), флавоноиды, кумарины, синтетические алкалоиды, циклические сульфоны, сесквитерпеновые лактоны, пространственно затрудненные фенольные соединения, производные полицикланов - всего 79 соединений.' В' результате скриннинга было показано, что производные тритерпенов (амид глицирретовой кислоты (рис. 7, 1-16), производные бетулоновой кислоты (рис. 7,1-Зб, 1-Зв, I-Зз, 1-Зи, I-Зф, 1-Зш, 1-3-1,1-3-1 в, 1-3-

9,1-3-11, 1-3-12))-и производные полицикланов (рис.г7, УШд, У111е, 1УШк) ингибируют интегразу ВИЧ-1/Вга в. реакции З'-процессинга.

Рисунок 7. Структура производных тритерпенов и полицикланов, эффективно подавляющих активность рекомбинатной интегразы ВИЧ-1/Бга в реакцииг З'-процессинга. Цифрами указана нумерация положения' атомов углерода в тритерпеновом остове по ШРАС.

На рис. 8 а приведены данные электрофоретического анализа накопления продуктов реакции З'-процессинга, катализируемой рекомбинатной интегразой ВИЧ-1/Вги, в зависимости от концентрации амида бетулоновой кислоты 1-Зб. На рис. 8 б представлены количественные данные эксперимента по ингибированию интегразы ВИЧ-1 данным производным для определения 150

(а) (6)

1 2 3 4 5 6 7

1С. В-361.М

Рисунок 8. Ингибирование реакции З'-процессинга, катализируемой интегразой ВИЧ-1, амидом бетулоновой кислоты (1-Зб): (а) -Электрофоретическое разделение продуктов реакции (20 % ПААГ, 7 М мочевина). 1- отсутствие интегразы; концентрация соединения 1-36: 2-0 М; 3 - 10-8 М; 4 - 10'7 М; 5 - КГ* М; 6 -10'5 М; 7 - 10-4 М; (б) - График зависимости относительной активности интегразы в реакции З'-процессинга от концентрации 1-Зб. Справа указано положение олигонуклеотидного дуплекса (21 п.н.) и процессированного динуклеотида ([а32р](ЗрТ).

Суммарные результаты по ингибиторному анализу группы тритерпенов приведены в табл. 1. Ранее было показано, что производные тритерпенов, и, в частности, исследуемые производные глицерретовой и бетулоновой кислот, блокируют ранние стадии вирусной репродукции - проникновение вирусных частиц в клетку. Между тем, полученные данные о способности модифицированных терпеноидов ингибироватъ размножение ВИЧ при добавлении их после этапа адсорбции вируса, предполагали множественный механизм действия терпеноидов. Наши данные (табл. 1) показывают, что одним из механизмов анти-ВИЧ действия исследуемых производных растительных тритерпенов является ингибирование интегразы ВИЧ.

При анализе химических структур производных бетулоновой кислоты

Таблица 1. Ингибиторный анализ наиболее активных производных тритерпенов и полицикланов в отношении рекомбинатной

интегразы ВИЧ-1 в реакции З'-процессинга in vitro. Представленны средние значения, полученные из 3-х независимых экспериментов.

Соединение IscM

1-16 3,7 ± 0,2 10°

1-36 4,2 ±0,3 10"'

1-Зв 1,7 ±0,1 10"'

1-Зз 5.2 ± 0,4 10°

1-Зи 9.0 ± ОД Ю*

1-Зф 1.0 ± 0,1 ю-*

1-Зш 5:0 ±0,5 Ю-" .

1-3-1 3.4 ± 0,3 10°

I-3-IB 8.2 ± ОД 10^

1-3-9 5.6 ± 0,4 10°

1-3-11 7.2 ±0,1 10""

1-3-12 2.6±0,3 КГ

УШд 6,5 ±0,4 10°

Ville 5,8 ± 0,5 10"°

VIIIk 1,3 ± 0,3 10°

и данных ингибиторного анализа, было установлено, что наиболее эффективно . ингибируют

рекомбинантную интегразу ВИЧ-1/Вги в реакции З'-процессинга производные, модифицированные по 17-му положению

тритерпенового остова радикалом, содержащим больше 7

метиленовых остатков и СОО* -концевую группу.

На рис. 9 а приведены данные электрофоретического анализа накопления продуктов реакции З'-процессинга в зависимости от концентрации фурил-замещенного производного УШе. На рис. 9 б представлены количественные

данные эксперимента по ингибированию интегразы ВИЧ-1 данным производным для определения I50- Суммарные результаты по ингибиторному анализу группы производных полицикланов приведены в табл. 1. Следует отметить, что все активные соединения из исследуемой группы производных полицикланов

относятся к группе

фурилзамещенных полицикланов.

С

и . О

Рисунок 9. Ингибирование реакции З'-процессинга, катализируемой шпетразойг ВИЧ-1, производным полицшсланов (УШе): (а) -Электрофорегаческое разделение продуктов реакции (20 % ПААГ, 7 М мочевина). 1- отсутствие интегразы; концентрация УШе: 2 - О М; 3 - 10"7 М; 4- Ю М; 5 - ИГ5 М; 6-10"4 М; 7-5' 10"* М; (б) - График зависимости относительной активности интегразы в реакции З'-процессинга от концентрации соединения УШе.

3. Получение и использование протяженных ДНК субстратов на основе ЦГО для измерения активности рекомбинантной интегразы

ВИЧ-1

Конструирование ЬТЯ-содержащих ДНК субстратов.

Конструирование субстратов основывалось на использовании в качестве матриц для полимеразной цепной-реакции кольцевых форм провирусной ДНК ВИЧ-1/Вга, образующихся во время репликативного цикла вируса. На первом этапе были выбраны олигонуклеотидные- праймеры - 81 (5'-ООООТОООЛОСАОСАТСТСО-З') и 82 (5'-ТСТТОССОТОСОСОСТТСЛО-З1), комплементарные консервативной Л области наибольшего сходства геномов различных штаммов вируса иммунодефицита человека 1-ого типа. Причем ориентированность праймеров выбрана таким образом, что амплифицируются только фрагмент комплиментарный кольцевым формам ДНК (рис. 10). Затем повторным амплифицированием парой гнездовых праймеров - п1 (5'- ЛСТООЛЛОвОСТЛАТТСЛСТСС-З1) и п2 (51-ЛСТОСТЛОЛОЛТТТТССЛСЛСТО-З'), непосредственно на концы ЬТЯ получают 2 ДНК продукта, которые содержат сайт — СА-динуклеотид на 3'-

ОН конце, для специфического узнавания интегразы и состоят из одного или двух параллельно ориентированных интактных LTR-последовательностей (рис. 10).

Рисунок 10. Схематическое изображение конструирования субстратов на основе LTR для измерения активности рекомбинантной интегразы ВИЧ-1.

Использование сконструированных субстратов для определения активности, рекомбинантной интегразы ВИЧ in vitro. Измерение

активности интегразы ВИЧ в реакции З'-процессинга с использованием LTR-содержащих субстратов (рис. 11) проводили по аналогии с использованием в качестве субстрата олигонуклеотидного дуплекса (рис. 4а). LTR-содержащие субстраты метили посредством фрагмента Кленова, что давало возможность получить ДНК у которой оказывался меченным только один нуклеотид с каждого З'-конца. Максимальная скорость реакции (Ущах) З'-процессинга, катализируемой рекомбинатной ИН ВИЧ-1/Вга, была выше в 9,5 раз в присутствии 2-LTR субстрата (5,0 ± 0.3 10*14 М/с), чем в случае олигонуклеотидного дуплекса (см. раздел 1).

Как видно из построенных нами графиков зависимости интегразы от концентрации ионов двухвалентных металлов отличия в профиле не значительны между использованием олигонуклеотидного дуплекса (рис. 6) и сконструированного нами 2-LTR субстрата (рис. 12). Однако стоит отметить отсутствие снижения активности интегразы при увеличении в среде концентрации Мп2+ более чем на 8 тМ. Тогда как для олигонуклеотидного субстрата было показано уменьшение ферментативной активности интегразы ВИЧ при увеличении концентрации в среде ионов Мп2+ (рис. 6), что, возможно, является результатом неспецифических взаимодействий ионов металла и фермента, а также выпадением белка в осадок. Исходя из наших результатов, при использовании длинного субстрата не происходит снижения активности интегразы при увеличении концентрации в среде ионов Мп2+, что, вероятно, свидетельствует о стабилизации комплекса интеграза-субстрат.

Для исследования реакции встраивания были разработаны две методики: в качестве ДНК мишени для встраивания использовали плазмидную ДНК (pUC19) и сам субстрат. Для исследования встраивания в плазмидную ДНК радиоактивную метку в LTR субстрат вводили посредством ник-трансляции, что давало равномерно меченую ДНК (рис. 13). После инкубации рекомбинантной интегразы с радиоактивно меченым субстратом и pUC19 при разделении продуктов реакции в 4 % полиакриламидном геле и радиоавтографии наблюдали появление высокомолекулярной радиактивномеченной плазмидной ДНК, содержащей различное количество молекул субстрата (рис. 13).

Предположительно, различные продукты реакции можно объяснить несколькими возможными вариантами встраивания: 1) согласованная

интеграция 1-L.TR субстрата в плазмидную ДНК; 2) одно-концевая встройка 1-ЦШ субстрата в плазмидную ДНК; 3) обе перечисленные выше возможности одновременно. Следует отметить отсутствие продуктов с молекулярным весом превышающим в 2 или более раз молекулярный вес 1-ЦШ субстрата, что являлось бы свидетельством о встройке 1-ЦШ субстрата самого в себя. Этот факт может быть объяснен преобладанием молярной концентрации плазмидной ДНК над ЦШ-субстратом более чем на 2 порядка, а также тем, что напряженная структура суперскрученной формы плазмиды стехиометрически создает наиболее благоприятные условия для встраивания субстрата.

При исследовании реакции встраивания, когда ЦШ-содержащий субстрат использовался в качестве, как мишени, так и субстрата, радиактивное мечение не требовалось. После инкубации- субстрата с рекомбинантной интегразой- и разделении- продуктов реакции в 4 % (нативные условия) полиакриламидном геле, происходила, дупликация субстрата (рис. 14). Отсутствие более высокомолекулярных копий продукта, говорит о том, что образуется преимущественно продукт 2 х 1-ЦШ субстрат. Превалирование продукта с.молекулярным весом, в два раза превышающим, вес 1-ЦШ субстрата предполагает возможность согласованной интеграции, при которой повторная встройка в один и тот же субстрат затрудняется стехиометрическими проблемами подхода второго комплекса фермент-субстрат к ДНК-мишени за ограниченное время реакции. Также, возможно, продукты реакции с более высокими молекулярными массами не визуализируются при окраске бромистым этидием, так как частота появления этих продуктов невысока по сравнению с 2 х

Наши данные показали, что 1-ЕГО. субстрат эффективно встраивается как в плазмидную ДНК, выступающую в качестве мишени, так и сам в себя. Также продукты реакции встраивания различаемы как в случае радиоактивного мечения субстрата, так и при окрашивании бромистым этидием. Более того, ингибирование встраивания. 1-ЦШ субстрата ауринтрикарбоновой кислотой- (АТК) (рис. 14, дорожка 1), охарактеризованного ранее ингибитора рекомбинантной интегразы ВИЧ-1, открывает возможности для скрининга потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ в реакции встраивания с использованием данного метода.

-ин

+ИН*

10'. 20'40* 1 час

•ж«*»/**'«*»*'''

«Б

Рисунок 11. Накопление продуктов реакции З'-процессинга,

катализируемой; рекомбинатной интегразой . ВИЧ-1/Вги с использованием радиоактивно

меченого 2-1ЛИ субстрата, в зависимости от времени. Продукты реакции анализировали в 20 % денатурирующем ПААГ с последующей радиоавтографией. Б-2-1ЛИ субстрат, Р - рСтрТ.

ин -

Продукты .

• риС19

1-1ЯЯ! субстрат

8 10 12

С, шМ

Рисунок 12. Зависимость скорости образования продуктов реакции З'-процессинга, катализируемой интегразой ВИЧ-1 с

использованием . 2-1ЛИ субстрата, от концентрации двухвалентных ионов металлов и Мп2+.

Рисунок 13. Анализ продуктов реакции встраивания радиоактивно меченого 1-ЬТЯ субстрата в р11С19. Электрофорез в 4 % ПААГ с последующей радиоавтографией.

| 400

Рисунок 14. Встраивание 1-L.TR ДНК субстрата в 1-1ЛТ1 ДНК субстрат. 4% ПААГ, окрашенный бромистым этидием. АТК -аурингрикарбоновая кислота, ИН - интеграза. Справа указаны длины маркеров в п.н.

Исследование ингибирующей активности ауринтрикарбоновой кислоты и производных тритерпенов в отношении интегразы ВИЧ с использованием LTR-содержащих субстратов. Мы провели

сравнительный ингибиторный анализ между LTR-содержащими субстратами и олигонуклеотидным субстратом (21 п.н.), используя производные тритерпенов (1-16, I-3-б, I-3-в) и ауринтрикарбоновую кислоту. В табл. 2 суммированы данные по ингибированию интегразы ВИЧ-1/Бгц производными тритерпенов и АТК с использованием олигонуклеотидного и LTR-содержащих субстратов, а также данные ингибиторного анализа репликации ВИЧ-1/Бгц данными соединениями в культуре клеток МТ-4 (Семенова, Плясунова и др., 2003). Вычисление коэффициентов корреляции (г) показало (табл.. 2), что при использовании LTR-содержащих субстратов происходит значительное увеличение коррелирования данных ингибиторного анализа реакции З'-процессинга in vitro и репликации ВИЧ-1/Bm в культуре клеток по сравнению с субстратом на основе олигонуклеотидного дуплекса.

Таблица 2. Сравнительный - ингибиторный' анализ производными тритерпенов в отношении рекомбинантной интегразы- ВИЧ-1/Вги в реакции З'-процессинга in vitro с использованием олигонуклеотдиного и LTR-содержащих субстратов.

Соединение Ингибирование реакции 3-проиессига, катализируемой интегразой ВИЧ-1 in vitro, IC„,M Ингибирование ВИЧ-1 репликации в культуре клеток (МТ-4) после адсорбции вируса, 1С»,М' (Семенова, Плясунова и др., 2003)

ДНК дуплекс (21 пл.) 1-LTR субстрат 2-LTR субстрат

АТК 6,3*0,410" 4,2 ±0,3 10"* 4,0 ±0,3 10"° 1,0 ±0,1 10°

1-Хб 3,7 ±-0,2 10"3 3.2 ± 0,2 10"* 1,6 ±0,2 10"" 2,9 ± 0,2 10""

1-3-6 4,2 ±0,3 10"' 1,2 ±0,3 10"* 4,1 ±0,4 10"° 2,8 ±0,2 Ю"6

I-3-в 1,7 ±0,1 10"' 7,0 ±0.1 10'7 3,0 ±0,3 10"' 0,4 ±0,1 10*

коэффициент корреляции (г) -0,02 0,85 0,69

Таким образом, сконструированные нами протяженные LTR-содержащие ДНК субстраты предоставляют возможность комплексно исследовать функциональную активность интегразы в реакциях З'-процессинга и З'-встраивания без каких-либо дополнительных модификаций субстрата и проводить поиск и изучение ингибиторов интегразы ВИЧ-1 in vitro в условиях максимально приближенных к in vivo.

Выводы

1. Впервые получена рекомбинантаая интеграза ВИЧ-1 штамма Вш. Определены кинетические параметры реакции З'-процессинга, катализируемой рекомбинантной интегразой ВИЧ-1/Вга, с использованием в качестве субстрата олигонуклеотидного дуплекса (21 п.н.), гомологичного и5-концевой последовательности LTR ВИЧ-1: Кш (3,7 ± 0,2) Ю"10 М, ккат (1,2 ± 0,3) 10"7 1/с, V™« (5,3 ± 0,4) ИГ" М/с.

2. Впервые показано, что амид глицирретовой кислоты, производные бетулоновой кислоты и производные фурил-замещенных полицикланов эффективно ингибируют реакцию З'-процессинга, катализируемую рекомбинантной интегразой ВИЧ-1/Вга. Впервые установлено, что, одним из механизмов анти-ВИЧ действия производных бетулоновой кислоты является ингибирование интегразы ВИЧ-1.

3. Установлено, что наиболее эффективно ингибируют рекомбинантную интегразу ВИЧ-1/Вга в реакции З'-процессинга производные бетулоновой кислоты, модифицированные по 17-му положению тритерпенового остова радикалом, содержащим больше 7 метиленовых остатков и СОО- концевую группу.

4. Разработана система определения активности рекомбинантной интегразы в реакциях З'-процессинга и встраивания с использованием впервые сконструированых LTR-содержащих субстратов длиной 636 п.н. (1-LTR субстрат) и 1270 п.н. (2-LTR субстрат). Показано увеличение максимальной скорости реакции З'-процессинга, катализируемой рекомбинантной ИН ВИЧ-1/Вга, с использованием 2-LTR субстрата по сравнению с олигонуклеотидным дуплексом длиной 21 п н.

5. Определены коэффициенты корреляции (г) между данными ингибиторного анализа, полученных в реакции З'-процессинга in vitro, катализируемой рекомбинантной интегразой ВИЧ-1/Вга, и в системе оценки репликации ВИЧ-1/Вга в культуре клеток МТ-4. Показано значительное преимущество поиска ингибиторов рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 с использованием LTR-содержащих субстратов (г = 0,85 для 1-LTR субстрата и г = 0,69 для 2-LTR субстрата) по сравнению с субстратом на основе олигонуклеотидного дуплекса (г = -0,02).

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Семенова Е.А.! Гашникова Н.М., Ильина Т.В., Проняева Т.Р. Покровский А. Г. Свойства рекомбинантной интегразы вируса иммунодефицита человека 1-го типа штамма Вш//Биохимия. 2003. Т.68. № 9. С. 1208-1215.

2. СеменоваЕ. А.. ПлясуноваО А., ПетренкоН.И., УзенковаКВ., ШулъцЭ.Э., Толстиков ГА., Покровский А.Г. Ингибирование активности рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 производными высших терпеноидов // Доклады Академии Наук. 2003. Т. 391. № 4. С. 556-558.

3. Положительное решение о выдаче патента Российской Федерации от 03.02.2004 по заявке № 2002126-506 (027994) от 03.10.2002: "Субстрат для определения активности интегразы вируса иммунодефецита человека". Авторы: Семенова Е. А.. Покровский А. Г.

4. SemenovaE.A.. Plyasunova О. A., Petrenko N. I, Petukhova V. Z, Shults E. E, Tolstikov G. A., PokrovskyA. G, Novel natural triterpene derivatives as specific inhibitors of HIV-1 integrase // Molecular and Cellular Proteomics. 2003. V. 2. N. 9. P. 745. / Тезисы конференции "Human Proteome Organization (HUPO) 2nd Annual & ХГХ International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) World Congress" Монреаль, Канада, 2003.

5. Semenova E. A.. Plyasunova O. A., Petrenko N. I., Petukhova V. Z., Shults E. E, Tolstikov G. A., Pokrovsky A. G. Inhibition of recombinant human immunodeficiency virus's integrase by natural triterpene derivatives // Antiviral Therapy. 2003. V. 8. N. 1. P. 263. / Тезисы конференции "2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment" Париж, Франция, 2003.

6. Semenova E. A.. Gashnikova N. M., PokrovskyA. G. Design of the LTR-based DNA substrate for recombinant HTV-l integrase // EJB: 2002. V. 269. P. 80. / Тезисы конференции "28th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (FEBS)" Стамбул, Турция, 2002.

7. Семенова Е. А., Гашникова Н. М, Ильина Т. В., Покровский А. Г. Анализ изменчивости интегразы различных штаммов вируса иммунодефицита человека 1-го типа // Материалы школы-конференции для молодых ученых. «Биология -наука XXI века», Пущино, 2002, С. 319-320.

Семенова Е. А.

Подписано в печать 30.03.2004 Формат 60x84 1/16 Заказ № 45 Бумага офсетная, 80 гр/м1

Печл. 1 Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

»-73 80

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семенова, Елена Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ретровирусная интеграция

1.1.1. Реакция интеграции в жизненном цикле ретровирусов

1.1.2. Структура ретровирусной интегразы

1.1.2.1. ННСС-домен интегразы ретровирусов

1.1.2.2. Каталитический домен интегразы ретровирусов

1.1.2.3. С-концевой домен интегразы ретровирусов

1.1.3. Мультимеризация ретровирусной интегразы

1.1.4. Механизм расщепления ДНК и реакции присоединения

1.1.5. Ферментативные свойства ретровирусной интегразы

1.1.6. Последовательности, узнаваемые ретровирусной интегразой

1.1.7. Проникновение преинтеграционного комплекса в клеточное 26 ядро

1.2. Методы измерения активности ретровирусной интегразы in 28 vitro

1.3. Ингибирование интегразы ВИЧ

1.3.1. Подходы к ингибированию репликации ВИЧ

1.3.2. Ингибиторы интегразы ВИЧ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43 2.1. Материалы

2.1.1. Соединения для тестирования ингибирующей активности в 43 отношении рекомбинантной интегразы ВИЧ

2.1.2. Буферы, используемые в работе

2.1.3. Олигодезоксирибонуклеотиды

2.2. Методы

2.2.1. Выделение ДНК ВИЧ

2.2.2. Полимеразная цепная реакция

2.2.3. Клонирование интегразы ВИЧ

2.2.4. Выделение и очистка рекомбинантной интегразы

2.2.5. Конструирование субстратов для определения активности 53 рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 in vitro

2.2.5.1. Конструирование олигонуклеотидного субстрата

2.2.5.2. Конструирование LTR-содержаших субстратов

2.2.6. Определение ферментативной активности интегразы

2.2.6.1. Определение ферментативной активности интегразы в 55 реакции З'-процессинга

2.2.6.1.1. Ингибитороный анализ реакции З'-процессинга, катализируемой рекомбинантной интегразой ВИЧ-1/Вш

2.2.6.2. Определение ферментативной активности интегразы в 56 реакции З'-встраивания

2.2.6.2.1. Определение ферментативной активности интегразы 56 в реакции З'-встраивания с использованием плазмидной ДНК (pUC19) в качестве ДНК мишени

2.2.6.2.2. Определение ферментативной активности интегразы 57 в реакции З'-встраивания с использованием LTR-содержащего субстрата в качестве ДНК мишени

2.2.7. Ингибиторный анализ репликации ВИЧ-1 в культуре 57 лимфоидных клеток МТ

2.2.8. Статистическая обработка результатов 58 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 59 3.1. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ 59 ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1/Вги

3.1.1. Получение рекомбинантной интегразы ВИЧ

3.1.2. Сравнение нуклеотидной последовательности 62 рекомбинантной интегразы Bru ВИЧ-1 с интегразой pNL4

3.1.3. Измерение каталитических характеристик рекомбинантной 63 интегразы ВИЧ-I/Bru в реакции З'-процессинга

3.1.4. Взаимодействие рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Вги с 64 двухвалентными ионами металлов

3.2. ИНГИБИРОВАНИЕ РЕАКЦИИ З'-ПРОЦЕССИНГА, 67 КАТАЛИЗИРУЕМОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ ИНТЕГРАЗОЙ ВИЧ-1/Вги

3.2.1. Ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 70 производными тритерпеновых соединений

3.2.2. Ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 75 производными полицикланов

3.3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОТЯЖЕННЫХ ДНК 78 СУБСТРАТОВ НА ОСНОВЕ LTR ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ АКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ

3.3.1. Конструирование LTR-содержащих ДНК субстратов

3.3.2. Использование сконструированных субстратов для 82 определения активности рекомбинантной интегразы ВИЧ in vitro

3.3.3. Анализ активности рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 с 87 использованием LTR-содержащих ДНК субстратов и олигонуклеотидного дуплекса в реакции З'-процессинга

3.3.3.1. Исследование влияния ионов Мп и Mg на 87 функциональную активность интегразы с использованием разных типов субстратов

3.3.3.2. Исследование ингибирующей активности 88 ауринтрикарбоновой кислоты и производных тритерпенов в отношении интегразы ВИЧ с использованием LTR-содержащих субстратов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение, исследование каталитической активности и ингибирование рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru с использованием олигонуклеотидного и LTR-содержащих субстратов"

Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) является болезнью иммунной системы, которая сопровождается развитием у больных глубокой иммунной недостаточности, проявляющейся в том, что безопасные для здорового человека микроорганизмы приобретают способность вызывать тяжелые инфекционные заболевания - оппортунистические инфекции. Причиной возникновения СПИДа является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), относящийся к семейству Ретровирусов (Fausi A. S., 1988; Freed Е.О., 2001; Wang W. К. et al, 2000). Актуальность и практическая значимость поиска новых противовирусных средств для анти-ВИЧ терапии особенно подчеркивается в настоящее время, когда в России, и, в частности, в Сибирском регионе, отмечается нарастание темпов распространения ВИЧ инфекции (по данным www.aids.ni). В настоящее время при лечении ВИЧ-инфекции используются ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы ВИЧ, основным недостатком которых является: 1) из-за гомологии вирусной протеазы с эукариотическими протеазами и, соответственно, обратной транскриптазы с ДНК-полимеразами клетки, препараты на основе этих ингибиторов являются токсичными для человека. (Katzenstein T.L., 2003; Johnson D., 2002); 2) антивирусная терапия осложняется возможностью появления мутантов вируса устойчивых к большинству используемых лекарственных препаратов, т.к. обратная транскриптаза ВИЧ характеризуется низкой точностью синтеза ДНК по сравнению с другими ДНК-полимеразами. Это определяет высокую частоту мутаций во время репликативного цикла вируса, что в свою очередь приводит к появлению лекарственно устойчивых форм вируса во время длительного лечения пациентов (Laurence J., 2004; Hirsch M.S. et al, 2003); 3) ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы ВИЧ блокируют лишь образование вновь синтезированных молекул провирусной ДНК и процессинга вновь синтезированных вирусных белков, соответственно, и не влияют на уже интегрированную в геном клетки-хозяина молекулу (молекулы) провирусной ДНК, которой будет достаточно для дальнейшей экспрессии вирусного РНК-генома и вирусных белков.

Наиболее перспективной мишенью для создания новых анти-ретровирусных препаратов считается третий вирусный фермент - интеграза, осуществляющая интеграцию провирусной ДНК в геном клетки-хозяина и отличающаяся своей мультифункциональностыо от клеточных ферментов (De Clercq Е., 2002; Thomas М. et al, 1997). Интеграция происходит в несколько стадий, в результате которых происходит встраивание вирусного генома в ДНК хозяйской клетки. Первоначально в реакции З'-процессинга линейная ДНК провируса, синтезированная в реакции обратной транкрипции, гидролизуется интегразой с каждого З'-ОН конца LTR (long terminal repeat - длинные концевые повторы) по консервативному СА-динуклеотиду, при этом удаляется GT-динуклеотид. Следующая стадия интеграции происходит в ядре и включает в себя образование интегразой одноцепочечных разрывов в хозяйской ДНК и лигирование с процессированными З'-ОН концами провирусной ДНК (Hindmarsh P. et al, 1999).

Предположительно, ингибиторами интегразы могут быть как конкурентные, так и неконкурентные ингибиторы, которые будут нарушать мультимеризацию интегразы, необходимую для функционирования фермента, механизм транспорта преинтеграционного комплекса в ядро, стадию процессинга и встраивания провирусной ДНК в геном клетки-хозяина. На сегодняшний день были найдены несколько групп соединений, обладающих способностью подавлять активность рекомбинатной интегразы in vitro и репликацию ВИЧ-1 в культуре клеток. Это выявленные в результате скрининга производные дикетоновой кислоты, производные нуклеотидов, ароматические соединения с гидроксильными группами и т.д. Однако детальные исследования показали, что подавление активности интегразы in vitro, в лучшем случае, лишь превосходит на 2-3 порядка по значениям константы ингибирования этими же соединениями других ферментов, таких как обратная транскриптаза и протеаза ВИЧ-1, эукариотические ДНК-полимеразы, бактериальные рестриктазы. Таким образом,учоиск новых групп соединений, проявляющих ингибиторную активность в отношении интегразы ВИЧ-1, особенно актуален.

Вторым препятствием для внедрения в клиническую практику противовирусных препаратов на основе ингибиторов интегразы является низкая корреляция между экспериментальными данными, полученными с использованием рекомбинантного фермента in vitro и данными по ингибированию репликации ВИЧ-1 в культуре. Отличия результатов ингибиторного анализа возможны как из-за различий в нуклеотидной последовательности гена, кодирующего фермент из различных штаммов вируса иммунодефицита (Katzman at al, 2001), так и из-за способов определения активности интегразы in vitro (Debyser Z. at al, 2002).

Штамм Bru является одним из наиболее используемых для исследования репликации и ингибирования ВИЧ-1 в культуре клеток (Lund at al, 1998). Однако для проведения исследований интеграции ВИЧ-1 in vitro используется преимущественно только один рекомбинантный фермент, полученный путем переклонирования с высокопродуцентного молекулярного клона вируса иммунодефицита pNL4-3 (Cherepanov P. at al, 1999; Engelman A. at al, 1995; Tsurutani N. at al, 2000). Данные кинетического анализа реакций, катализируемых рекомбинатной интегразой BH4-l/pNL4-3, модифицированной сайт-направленым мутагенезом, получены, как правило, качественно без вычисления основных каталитических характеристик фермента. Это затрудняет какую-либо систематизацию результатов по влиянию аминокислотных замен на функции фермента, полученных разными научными группами.

Активность ретровирусной интегразы существенно зависит от наличия обоих LTR-концов в активном центре и протяженности субстрата (Cherepanov P. et al, 1999; Aiyar A. et al, 1996), что не выполняется при использовании олигонуклеотидного дуплекса - стандартного субстрата для измерения активности интегразы in vitro. Как следствие, неадекватность результатов интеграции in vitro, полученных при помощи олигонуклеотид-содержащей системы оценки активности интегразы, событиям, происходящим in vivo, стимулировала проведение работ по конструированию протяженного субстрата для согласованной интеграции (Cherepanov P. ct al, 1999; Grandgenett et al, 1993; Katz et al, 1990).

Целью настоящей работы являлось получение, исследование каталитической активности и ингибирование рекомбинатной интегразы ВИЧ-1/Вги с использованием олигонуклеотидного и LTR-содержащих субстратов.

В задачи настоящего исследования входило: м получить конструкцию для экспрессии в Escherichia coli рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 на основе штамма Bru. Выделить рекомбинатную интегразу ВИЧ-1/Вги и определить основные кинетические параметры полученного фермента. провести поиск ингибиторов рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Вги в реакции З'-процессинга in vitro среди соединений из химически-различных групп - тритерпеновых соединений (глицирризиновая кислота, глицерретовая кислота и ее производные, бетулоновая кислота и ее производные), флавоноидов, кумаринов, синтетических алкалоидов, циклических сульфонов, сесквитерпеновых лактонов, пространственно затрудненных фенольных соединений, производных полицикланов. сконструировать протяженные LTR-содержащие субстраты и разработать методы для определения активности рекомбинантной интегразы с их использованием в реакциях З'-процессинга и встраивания in vitro. Провести сравнительное исследование активности и ингибиторный анализ рекомбинатной интегразы BIT4-1/Bru с использованием стандартного субстрата - олигонуклеотидного дуплекса, и сконструированных LTR-содержащих субстратов.

По материалам диссертации получено положительное решение о выдаче патента Российской Федерации, опубликовано 2 статьи и 4 тезиса докладов. Результаты работы были представлены на международных конференциях: "Human Proteome Organization (HUPO) 2nd Annual & XIX International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) World Congress (Монреаль, Канада, 2003), "2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment" (Париж, Франция, 2003), "The 6th international Engelhardt conference on molecular biology" (Санкт-Петербург - Москва, 2003), "28th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (FEBS)" (Стамбул, Турция, 2002).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Семенова, Елена Александровна

ВЫВОДЫ

1. Впервые получена рекомбинантная интеграза ВИЧ-1 штамма Bru. Определены кинетические параметры реакции З'-процессинга, катализируемой рекомбинантной интегразой ВИЧ-1/Вги, с использованием в качестве субстрата олигонуклеотидного дуплекса (21 п.н.), гомологичного и5-концевой последовательности LTR ВИЧ-1: Кт (3,7 ± 0,2) Ю"10 М, ккаТ (1,2 ± 0,3) 10'7 1/с, Vmax (5,3 ± 0,4) КГ15 М/с.

2. Впервые показано, что амид глицирретовой кислоты, производные бетулоновой кислоты и производные фурил-замещенных полицикланов эффективно ингибируют реакцию З'-процессинга, катализируемую рекомбинантной интегразой ВИЧ-1/Вш. Впервые установлено, что одним из механизмов анти-ВИЧ действия производных бетулоновой кислоты является ингибирование интегразы ВИЧ-1.

3. Установлено, что наиболее эффективно ингибируют рекомбинантную интегразу ВИЧ-1/Вш в реакции З'-процессинга производные бетулоновой кислоты, модифицированные по 17-му положению тритерпенового остова радикалом, содержащим больше 7 метиленовых остатков и СОО"- концевую группу.

4. Разработана система определения активности рекомбинантной интегразы в реакциях З'-процессинга и встраивания с использованием впервые сконструированых LTR-содержащих субстратов длиной 636 п.н. (1-LTR субстрат) и 1270 п.н. (2-LTR субстрат). Показано увеличение максимальной скорости реакции З'-процессинга, катализируемой рекомбинантной ИН ВИЧ-1/Bru, с использованием 2-LTR субстрата по сравнению с олигонуклеотидным дуплексом длиной 21 п.н.

5. Определены коэффициенты корреляции (г) между данными ингибиторного анализа, полученных в реакции З'-процессинга in vitro, катализируемой рекомбинантной интегразой ВИЧ-1/Вш, и в системе оценки репликации ВИЧ-1/Вш в культуре клеток МТ-4. Показано значительное преимущество поиска ингибиторов рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 с использованием LTR-содержащих субстратов (г = 0,85 для 1-LTR субстрата и г = 0,69 для 2-LTR субстрата) по сравнению с субстратом на основе олигонуклеотидного дуплекса (г = -0,02).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние несколько лет в исследованиях процесса интеграции ВИЧ-I достигнут значительный прогресс: с использованием олигонуклеотидного радиоактивно меченного ДНК субстрата, гомологичного U3 или U5 регионам LTR и рекомбинатного фермента in vitro были детально исследованы реакции, катализируемые интегразой: З'-процессинга, встраивания и дезинтеграции, последняя, впрочем, до сих пор не обнаружена in vivo (Craigie R. et al, 1990; Bushman F. et al, 1990; Katz R. A. et al, 1990; Sherman P. A. et al, 1990).

Остается, однако, ряд существенных вопросов, решение которых требует дальнейших исследований. Так, недостает сведений о функциональной активности интегразы в зависимости от нуклеотидной последовательности, гена кодирующего фермент разных изолятов ВИЧ-1. В исследованиях интеграции ВИЧ-1 in vitro на сегодняшний день задействована практически только рекомбинантная интеграза, полученная путем переклонирования с высокопродуцентного молекулярного клона вируса иммунодефицита pNL4-3 (Cherepanov et al, 1999; Engelman et al, 1995; Tsurutani et al, 2000). Кинетический анализ реакций, катализируемых рекомбинатной интегразой BH4-l/pNL4-3, подвергнутой сайт-направленому мутагенезу, проводится, как правило, качественно без вычисления основных каталитических характеристик фермента. Это затрудняет какую-либо систематизацию результатов по влиянию аминокислотных замен на функции фермента, полученных разными научными группами.

Не преодолено также основное препятствие для внедрения в клиническ\то практику противовирусных препаратов на основе ингибиторов интегразы, заключающееся в низкой корреляции между экспериментальными данными по ингибированию фермента, полученных в экспериментах на культуре ВИЧ-инфицированных клеток, и данными, полученными с использованием рекомбинантного фермента и стандартного олигонуклеотидного субстрата in vitro. Не смотря на то, что сайт специфического узнавания интегразы ретровирусов состоит из 4-х концевых нуклеотидов, было показано, что для формирования стабильного комплекса ВИЧ-1 интеграза-субстрат необходимо взаимодействие интегразы с 12 парами нуклеотидов U3 LTR-конца и 11 парами нуклеотидов U5 LTR-конца (Masuda Т. et al, 1998; Esposito D. et al, 1998). Также было показано, что согласованная интеграция требует наличия субстрата протяженной длины. Следовательно, эффективность интегразы в реакциях З'-процессинга и встраивания зависит от наличия обоих LTR-концов в активном центре и протяженности субстрата, что не выполняется при использовании олигонуклеотидного дуплекса. Как следствие, низкая корреляция результатов, полученных при помощи олигонуклеотид-содержащей системы оценки активности интегразы in vitro и в системе оценки репликации ВИЧ-1 в культуре клеток, стимулировала появление различных научных работ по конструированию протяженного субстрата для измерения активности ретровирусной интегразы in vitro (Cherepanov et al, 1999; Grandgenett et al, 1993; Katz et al, 1990). Однако использование полученных на сегодняшний день субстратов для тестирования ингибиторов интегразы затрудняется сложным многостадийным конструированием протяженных субстратов, а также невозможностью тестировать активность интегразы в обеих реакциях -З'-процессинга и встраивания in vitro, без дополнительных модификаций субстратов применительно к каждой реакции.

Настоящая работа была в значительной мере направлена на разрешение некоторых из перечисленных выше вопросов. В качестве объекта исследований была выбрана рекомбинантная интеграза ВИЧ-1 на основе штамма Bru, как наиболее широко используемого штамма для анализа потенциальных ингибиторов репликации ВИЧ-1 в культуре инфицированных клеток (Lund et al, 1998). Мы получили конструкцию хтя экспрессии интегразы ВИЧ-1/Bru в Escherichia call - рЕТ-15b-IN(Bru)B 1. Клонирование фрагмента ДНК, полученного из инфекционного материала - суммарной ДНК клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1/Bru, выполнено в плазмидный вектор рЕТ-15b ("Novagen", США), содержащий промотор фага Т7.

Сравнение каталитической активности рекомбинатной интегразы ВИЧ-1 /Вru с литературными данными по рекомбинантной интегразе BH4-l/pNL4-3, отличающейся аминокислотными заменами в функционально важных районах фермента, позволило установить различия в сродстве к олигонуклеотидному субстрату и во взаимодействии с ионами двухвалентных металлов, необходимых для функционирования фермента. Установлено, что замены в положениях GIu(10)Asp, Val(l 13)Ile, Ile(151)Val и Val(244)Leu приводят к увеличению сродства к олигонуклеотидному дуплексу и активации работы интегразы, в отличие от индуцированных сайт-направленным мутагенезом замен Val(113)Lys и 11е(151)А1а, приводящих к инактивации фермента. Показано влияние вводимых в участок замен на значение оптимальной концентрации ионов двухвалентных металлов (Мп2+ и Mg2b) для проявления максимальной активности фермента между рекомбинантной интегразой BH4-l/pNL4-3 и интегразой ВИЧ-1/Вги.

В результате скриннинга соединений различных химических групп впервые было показано, что производные бетулоновой кислоты и фурилзамещенных полицикланов являются эффективными ингибиторами интегразы ВИЧ-1/Вш в реакции З'-процессинга.

Используя сопоставление химических структур производных бетулоновой кислоты и данных ингибиторного анализа, было сделано предположение о важности структуры радикала в 17-м положении тритерпенового остова. Впервые было показано, что одним из механизмов противовирусного действия производных бетулоновой кислоты является ингибирование стадии интеграции. Сделано предположение, что впервые выявленная группа фурилзамещенных полицикланов является специфическими ингибиторами интегразы ВИЧ-1.

На основании данных о важности длины и наличия обоих концов LTR в субстрате для исследования активности ретровирусной интегразы были сконструированы 1-LTR субстрат длиной 636 п.н. и 2-LTR субстрат длиной 1270 п.н., содержащие один интактный или два ковалентно сшитых LTR, соответственно. Конструирование субстратов основывалось на использовании кольцевых форм провирусной ДНК ВИЧ-1, образующихся во время репликативного цикла вируса, в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции, что делает схему конструирования доступной для воспроизведения. Разработанные методы оценки активности интегразы в реакции З'-встраивания с использованием LTR-содержащих субстратов позволяют выявлять продукты реакции встраивания, как в случае радиоактивного мечения субстрата, так и при окрашивании бромистым этидием. Показанная возможность ингибирования реакции встраивания с использованием 1-LTR субстрата ауринтрикарбоновой кислотой открывает перспективы для скрининга потенциальных ингибиторов интегразы ВИЧ с использованием данного метода.

При исследовании каталитической активности интегразы ВИЧ-1/Вги в реакциях З'-процессинга и З'-встраивания in vitro с использованием олигонуклеотид- и LTR-содержащих субстратов удалось подтвердить важность U3 и U5 региона LTR ВИЧ-1 для эффективной согласованной интеграции. Отсутствие снижения активности интегразы при увеличении концентрации в среде ионов Мп2+ при использовании LTR-содержащих субстратов, вероятно, свидетельствует о стабилизации комплекса интеграза-субстрат, предшествующего согласованной интеграции.

Используя сравнительный анализ коррелирования данных ингибирования рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Вги в реакции З'-процессинга in vitro и репликации ВИЧ-1 в культуре клеток, было показано значительное преимущество поиска ингибиторов рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 с использованием LTR-содержащих субстратов по сравнению с олигонуклеотидным дуплексом.

96

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семенова, Елена Александровна, Кольцово

1. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика. М.:Фаир-пресс, 1999

2. Гашникова И. М., Плясунова О. А., Мамаева О. А., Федюк И. В., Покровский А. Г. Неинтегрированные кольцевые формы провирусной ДНК ВИЧ-1 в экспериментальной инфекции // Доклады Академии Наук. 2001. Т. 377. С. 116-118.

3. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М.: Мир, 1979.

4. Макареева Е. Н., Лозовская Е. Л., Татиколов А. С., Сапежинский И. И. Фотосенсибилизирующие свойства и антиоксидантная активность фурагина антимикробного препарата, производного нитрофурана // Биофизика. 1997. Т. 42. № 2. С. 472-479.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

6. Покровский А. Г., Плясунова О. А., Киселева Я.Ю., Гашникова Н. М., Федюк Н. В. Сравнительный анализ устойчивости ВИЧ-1 к AZT и AZT Н-фосфонату в культуре клеток // Доклады Академии Наук. 2002. Т. 384, С. 152-154.

7. Плясунова О. А., Егоричева И. Н., Федюк Н. В., Покровский А. Г., Балтина Л. А., Муринов Ю. И., Толстиков Г. А. Изучение анти-ВИЧ-активности |3-глицирризиновой кислоты // Вопросы вирусологии 1992. Т. 37. № 5-6. С. 235238.

8. Семенова Е.А., Гашникова Н.М., Ильина Т.В., Проняева Т.Р. Покровский А.Г. Свойства рекомбинантной интегразы вируса иммунодефицита человека 1-го типа штамма Вги // Биохимия. 2003 а. Т.68. № 9. С. 1208-1215.

9. Семенова Е.А., Плясунова О.А., Петренко Н.И., Узенкова Н.В., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А., Покровский А.Г. Ингибирование активности рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 производными высших терпеноидов // Доклады Академии Наук. 2003. Т. 391. № 4. С. 556-558.

10. Уэбб JI. Ингибиторы ферментов и метаболизма. М.: Мир, 1966.

11. Acel A., Udashkin В. Е., Wainberg М. A., Faust Е. A. Efficient gap repair catalyzed in vitro by an intrinsic DNA polymerase activity of human immunodeficiency virus type 1 integrase // J. Virol. 1998. V. 72 No. 3. P. 20622071.

12. Aiyar A., Hindmarsh P., Skalka A. M., Leis J. Concerted integration of linear retroviral DNA by the avian sarcoma virus integrase in vitro: dependence on both long terminal repeat termini // J. Virol. 1996. V. 70. P. 3571-3580.

13. Andrake M. D., Skalka A. M. Multimerization determinants reside in both the catalytic core and С terminus of avian sarcoma virus integrase // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 29299-29306

14. Asante-Appiah E., Skalka A. M. Molecular mechanisms in retrovirus DNA integration// Antiviral Res. 1997. V. 36. No. 3. P. 139-156.

15. Asante-Appiah E., Merkel G., Skalka A. M. Purification of untagged retroviral integrases by immobilized metal ion affinity chromatography // Protein Expression and Purification. 1998. V. 12. No. 1. P. 105-110.

16. Asante-Appiah E., Seeholzer S. H., Skalka A. M. Structural determinants of metal-induced conformational changes in HIV-1 integrase // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. No. 52. P. 35078-35087.

17. Baba M., Schols D., Pauwels R., Nakashima H. and De Clercq E. Sulfated polisaccharides as potent inhibitors of HIV-induced syncytium formation: a newstrategy tovverds AIDS chemotherapy // J. Acquired Iniinun. Defic. Syndr. 1990. V.3. P. 493-499.

18. Baekelandt V., Claeys A., Cherepanov P., De Clercq E., De Strooper В., Nuttin В., Debyser Z. DNA-Dependent protein kinase is not required for efficient lentivirus integration// Virol. 2000. V. 74. No. 23. P. 11278-11285.

19. Baumann H., Knapp S., Lundback Т., Ladenstein R., Hard T. Solution structure and DNA-binding properties of a thermostable protein from the archaeon Sulfolobus solfataricus//Nat. Struct. Biol. 1994. V. 1. P. 808-819.

20. Bissett D. L., Oelrich D. M., Hannon D. P. Evaluation of a topical iron chelator in animals and in human beings: short-term photoprotection by 2-furildioxime //

21. J Am Acad Dermatol. 1994. V. 31. No. 4. P. 572-578.

22. Bischerour J., Tauc P., Leh H., de Rocquigny H., Roques В., Mouscadet, J.F. The (52-96) C-terminal domain of Vpr stimulates HIV-1 IN-mediated homologous strand transfer of mini-viral DN A//Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 2694-2702.

23. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

24. Brown P. O., Bovverman В., Varmus H. E., Bishop J. M. Correct integration of retroviral DNA in vitro // Cell. 1987. V. 49. P. 347-356.

25. Bujacz G., Jaskolski M., Alexandratos J., Wlodawer A., Merkel G., Katz R. A., Skalka A. M. High-resolution structure of the catalytic domain of avian sarcoma virus integrase//J. Mol. Biol. 1995. V. 253. P. 333-346.

26. Bushman F. D., Fujivvara Т., Craigie R. Retroviral DNA integration directed by HIV integration protein in vitro// Science. 1990. V. 249. No. 4976. P. 1555-1558.

27. Bushman F. D., Engelman A., Palmer I., Wingfield P., Craigie R. Domains of the integrase protein of human immunodeficiency virus type 1 responsible for polynucleotidyl transfer and zinc binding // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 3428-3432.

28. Bushman F. D., Wang B. Rous sarcoma virus integrase protein: mapping functions for catalysis and substrate binding//J. Virol. 1994. V. 68. P. 2215-2223.

29. Cai M., Zheng R., Caffrey M., Craigie R., Clore G. M., Gronenborn A. M. Solution structure of the N-terminal zinc binding domain of HIV-1 integrase // Nat. Struct. Biol. 1997. V. 4. P. 567-577.

30. Cai M., Huang Y., CafTrey M., Zheng R., Craigie R., Clore G. M., Gronenborn A. M. Solution structure of the Hisl2Cys mutant of the N-terminal zinc binding domain of HIV-1 integrase complexed to cadmium // Protein Sci. 1998. V. 7. P. 2669-2674.

31. Cannon P. M., Byles E. D., Kingsman S. M., Kingsman A. J. Conserved sequences in the carboxyl terminus of integrase that are essential for human immunodeficiency vims type 1 replication//J. Virol. 1996. V. 70. P. 651-657.

32. Carson M. // J. Mol. Graph. 1987. V. 5. P. 103-106.

33. Champoux J. J. Strand breakage by the DNA untwisting enzyme results in covalent attachment of the enzyme to DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V.ф 74. P. 3800-3804.

34. Cherepanov P., Surratt D., Toelen J., Pluymers W., Griffith J., De Clercq E., Debyser Z. Activity of recombinant HIV-1 integrase on mini-HIV DNA // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 2202-2210.

35. Chow S.A. In vitro assays for activities of retroviral integrase // Methods. 1997. V. 12. P. 306-317.

36. Chow S. A., Vincent K. A., Ellison V., Brown P.O. Reversal of integration and DNA splicing mediated by integrase of human immunodeficiency virus // Science. 1992. V. 255. No. 5045. P. 723-726.

37. Colicelli J., Goff S. P. Mutants and pseudorevertants of Moloney murine leukemia vims with alterations at the integration site // Cell. 1985. V. 42. P. 573580.

38. Ф' 45. Craigie R., Fujiwara Т., Bushman F. The IN protein of Moloney murineleukemia vims processes the viral DNA ends and accomplishes their integration in vitro // Cell. 1990. V. 62. No. 4. P. 829-837.

39. Craigie R. Hotspots and warm spots: integration specificity of retroelements // Trends Genet. 1992. V. 8. No. 6. P. 187-190.

40. Craigie R. HIV integrase, a brief overview from chemistry to therapeutics // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. N. 26. P. 23213-23216.

41. Daniel R., Katz R.A., Skalka A.M. A role for DNA-PK in retroviral DNA integration // Science. 1999. V. 284. No. 5414. P. 644-647.

42. Debyser Z.„ Cherepanov P., Van Maele В., De Clercq E., Witvrouvv M. In search of authentic inhibitors of H1V-1 integration // Antivir. Chem. Chemother.2002. V. 13. No. 1. P. 1-15.

43. De Clercq E. Antiviral therapy for human immunodeficiency virus infections // Clinical Microbiology Reviews. 1995. V. 8. No. 12. P. 200-239.

44. De Clercq E. What can be expected from Non-nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors (NNRTIs) in the treatment of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infections? // Rev. Med. Virol. 1996. V. 6. P. 97-117.

45. De Clercq E. In search of a selective antiviral chemotherapy // Clin. Microbiol. Rev. 1997. V. 10. No. 4. P. 674-693.

46. De Clercq E. New developments in anti-HIV chemotherapy // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1587. No. 2-3. P. 258-275.

47. Drake R., Neamati N., Hong H., Pilon A. A., Sunthankar P., Hume S.D., Milne G.W.A., Pommier Y. Identification of a nucleotide binding site in HIV-1 integrase //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 4170-4175.

48. Drelich M., Wilhelm R., Mous J. Identification of amino acid residues critical for endonuclease and integration activities of HIV-1 IN protein in vitro // Virology. 1992. V. 188. P. 459-468.

49. Dyda F., Hickman А. В., Jenkins Т. M., Engelman A., Craigie R., Davies D. R. Crystal structure of the catalytic domain of HIV-1 integrase: similarity to other polynucleotidyl transferases// Science. 1994. V. 266. P. 1981-1986.

50. Eijkelenboom A. P., Lutzke R. A., Boelens R., Plasterk R. H., Kaptein R., Hard K. The DNA-binding domain of HIV-1 integrase has an SH3-like fold // Nat. Struct. Biol. 1995. V. 2. P. 807-810.

51. Engelman A., Bushman F. D., Craigie R. Identification of discrete functional domains of HIV-1 integrase and their organization within an active multimeric complex // EMBO J. 1993. V. 12. P. 3269-3275.

52. Engelman A., Hickman А. В., Craigie R. The core and carboxyl-terminal domains of the integrase protein of human immunodeficiency vims type 1 each contribute to nonspecific DNA binding // J. Virol. 1994. V. 68. P. 5911 -5917.

53. Engelman A., Englund G., Orenstein J. M., Martin M. A., Craigie R. Multiple effects of mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase on viral replication//J. Virol. 1995. V. 69. P. 2729-2736.

54. Esposito D., Craigie R. Sequence specificity of viral end DNA binding by HIV-1 integrase reveals critical regions for protein-DNA interaction // EMBO J. 1998. V. 17. P. 5832-5843.

55. Farnet C.M., Haseltine W.A. Circularization of human immunodeficiency vims type 1 DNA in vitro //J. Virol. 1991. V. 65. P. 6942-6952.

56. Farnet C.M., Haseltine W.A. Determination of viral proteins present in the human immunodeficiency vims type 1 preintegration complex//J. Virol. 1991. V. 65. P. 1910-1915.

57. Farnet С. M., Bushman F. D. HTV-1 cDNA integration: requirement of HMG I(Y) protein for function of preintegration complexes in vitro // Cell. 1997. V. 88. P. 483-492.

58. Fletcher Т. M., Soares M. A., McPhearson S., Hui H., Wiskerchen M., Muesing M. A., Shaw G. M., Leavitt A. D., Boeke J. D., Hahn В. H. Complementation of integrase function in HIV-1 virions // EMBO J. 1997. V. 16. P. 5123-5151.

59. Freed E.O. HIV-1 replication // Somat. Cell. Mol. Genet. 2001. V. 26. No. 1-6. P. 13-33.

60. Fujiwara Т., Mizuuchi K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate // Cell. 1988. V. 55. No. 4. P. 497-504.

61. Fujiwara Т., Craigie R. Integration of mini-retroviral DNA: a cell-free reaction for biochemical analysis of retroviral integration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 3065-3069.

62. Fumero E., Podzamczer D. New patterns of HIV-1 resistance during HAART // Clin Microbiol Infect. 2003. V. 9. No. 11. P. 1077-1084.

63. С 76. Gates С. A., Cox M. M. FLP recombinase is an enzyme // Proc Natl Acad Sci

64. USA. 1988. V. 85. No. 13. P. 4628-4632.

65. Gallay P., Swingler S., Song J., Bushman F., Trono D. HIV nuclear import is governed by the phosphotyrosine-mediated binding of matrix to the core domain of integrase//Cell. 1995. V. 83. P. 569-576.

66. Goldgur Y., Dyda F., Hickman А. В., Jenkins Т. M., Craigie R., Davies D. R. Three new structures of the core domain of HIV-1 integrase: an active site that binds magnesium // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 9150-9154.

67. Goodarzi G., Im G. J., Brackmann K., Grandgenett D. Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase // J. Virol. 1995. V. 69. P. 6090-6097.

68. Goulaouic H., Chow S. A. Directed integration of viral DNA mediated by fusion proteins consisting of human immunodeficiency virus type 1 integrase and Escherichia coli LexA protein //J. Virol. 1996. V. 70. No. 1. P. 37-46.

69. Grandgenett D.P., Inman R.B., Vora A.C., Fitzgerald M.L. Comparison of DNA binding and integration half-site selection by avian myeloblastosis vims integrase//J. Virol. 1993. V. 67. P. 2628-2636.

70. Hattori Т., Ikematsu S., Koito A., Matsushita S., Maeda Y., Hada M., Fujimaki M., Takatsuki K. Preliminary evidence for inhibitory effect of glycyrrhizin on HIV replication in patients with AIDS // Antiviral Res. 1989. V. 11. N. 5. P. 255-261.

71. Hindmarsh P., Leis J. Retroviral DNA integration // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V. 63. No. 4. P. 836-843.

72. Ito M., Sato A., Hirabayashi K., Tanabe F„ Shigeta S., Baba M., De Clercq E., Nakashima H., Yamamoto N. Mechanism of inhibitory effect of glycyrrhizin onreplication of human immunodeficiency virus (HIV)// Antiviral Res. 1988. V. 10. N. 6. P. 289-298.

73. Jenkins Т., Hickman А. В., Dyda F., Ghirlando R., Davies D. R., Craigie, R.

74. Catalytic domain of human immunodeficiency virus type 1 integrase: identification of a soluble mutant by systematic replacement of hydrophobic residues // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 6057-6061.

75. Jenkins Т. M., Engelman A., Ghirlando R., Craigie R. A soluble active mutant of HIV-1 integrase: involvement of both the core and carboxyl-terminal domains in multimerization // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 7712-7718.

76. Jing N. Marchand C., Liu J., Mitra R., Hogan M.E., Pommier Y., Mechanism of inhibition of HIV-1 integrase by G-tetra forming oligonucleotides // J. Biol. Chem. 2000a. V. 275. P. 21460-21467.

77. Jones K. S., Coleman J., Merkel G. W., Laue Т. M., Skalka A. M. Retroviral integrase functions as a multimer and can turn over catalytically // J. Biol. Chem.1992. V. 267. No. 23. P. 16037-16040.

78. Johnson D. Therapeutic management of HIV // Oral Dis. 2002. V. 8. No. 2. P. 17-20.

79. Joyce С. M., Steitz T. A. Function and structure relationships in DNA polymerases // Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 777-822.

80. Junghans R. P., Boone L. R., Skalka A. M. Products of reverse transcription in avian retrovirus analyzed by electron microscopy //J. Virol. 1982. V. 43. P. 544554.

81. Kalpana G. V., Marmon S., Wang W., Crabtree G. R., Goff S. P. Binding and stimulation of HIV-1 integrase by a human homolog of yeast transcription factor SNF5 // Science. 1994. V. 266. No. 5193. P. 2002-2006.

82. Kalpana G. V., Reicin A., Cheng G. S., Sorin M., Paik S., Goff S. P. Isolation and characterization of an oligomerization-negative mutant of HIV-1 integrase // Virology. 1999. P. 259. No. 2. P. 274-285.

83. Katz R. A., Merkel G., Kulkosky J., Leis J., Skalka A. M. The avian retroviral IN protein is both necessary and sufficient for integrative recombination in vitro // Cell. 1990. V. 63. No. 1. P. 87-95.

84. Katzenstein T. L. Molecular biological assessment methods and understanding the course of the HIV infection // APMIS Suppl. 2003. V. 114. P. 1-37.

85. Katzman M., Katz R. A., Skalka A. M., Leis J. The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration // J. Virol. 1989. V. 63. P. 5319-5327.

86. Katzman M., Sudol M. In vitro activities of purified visna vims integrase // J. Virol. 1994. V. 68. No. 6. P. 3558-3569.

87. Katzman M., Harper A. L., Sudol M., Skinner L. M., Eyster M. E. Activity of HIV-1 integrases recovered from subjects with varied rates of disease progression //J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2001. V. 28. P. 203-210.

88. Khan E., Mack J. P., Katz R. A., Kulkosky J., Skalka A. M. Retroviral integrase domains: DNA binding and the recognition of LTR sequences // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 851-860.

89. Kukolj G., Skalka A. M. Enhanced and coordinated processing of synapsed viral DNA ends by retroviral integrases in vitro // Genes Dev. 1995. 9. P. 25562567.

90. Kukolj G., Katz R. A., Skalka A. M. Characterization of the nuclear localization signal in the avian sarcoma virus integrase // Gene. 1998. V. 223. P.1. Я 157-163.

91. Laemmli U. K. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriofage T4 // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

92. Lapadat-Tapolsky M., De Rocquigny H., Van Gent D., Roques В., Plasterk R., Darlix J. L. Interactions between HIV-1 nucleocapsid protein and viral DNA may have important functions in the viral life cycle // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 831-839.

93. Laurence J. HIV therapeutics, continued: another HIV protease inhibitor * approved // AIDS Read. 2003. V. 13. No. 8. P. 355-356.

94. Leavitt A. D., Shiue L., Varmus H. E. Site-directed mutagenesis of HIV-1 integrase demonstrates differential effects on integrase functions in vitro // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 2113-2119.

95. Lee Y. M., Coffin J. M. Relationship of avian retrovirus DNA synthesis to integration in vitro//Mol. Cell. Biol. 1991. V. 11. P. 1419-1430.

96. Lee M. S., Craigie R. Protection of retroviral DNA from autointegration: involvement of a cellular factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 9823-9827.

97. Lee-Huang S., Huang P. L., Chen H. C., Huang P. L., Bourinbaiar A., Huang H. 1., Kung H. F. Anti-HIV and anti-tumor activities of recombinant MAP30 from bitter melon//Gene. 1995. V. 161. No. 2. P. 151-156.

98. Litvak S. Retroviral reverse transcriptase. Austin, Texas, USA: Molecular Biology Intelligence Unit, 1996.

99. Lobel L. I., Murphy J. E., Goff S. P. The palindromic LTR-LTR junction of Moloney murine leukemia virus is not an efficient substrate for proviral integration //J. Virol. 1989. V. 63. P. 2629-2637.

100. Lodi P. J., Ernst J. A., Kuszewski J., Hickman А. В., Engelman A., Craigie R., Clore G. M., Gronenborn A. M. Solution structure of the DNA binding domain of HIV-1 integrase//Biochemistry. 1995. V. 34. P. 9826-9833.

101. Lund O.S., Losman В., Schonning K., Bolmstedt A., Olofsson S., Hansen J. E. Inhibition of HIV type I infectivity by coexpression of a wild-type and a defective glycoprotein 120 // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1998. V. 14. P. 14451450.

102. Lutzke R. A., Vink C., Plasterk R. H. Characterization of the minimal DNA-binding domain of the HIV integrase protein // Nucleic. Acids Res. 1994. V. 22. P. 4125-4131.

103. Mitsuya H., Yarchoan R., Broder S. Molecular Target for AIDS therapy // Science. 1990. V. 249. P. 1533-1544.

104. Mumm S. R., Grandgenett D. P. Defining nucleic acid-binding properties of avian retrovirus integrase by deletion analysis // J. Virol. 1991. V. 65. P. 11601167.

105. Murphy J. E., Goff S. P. A mutation at one end of Moloney murine leukemia virus DNA blocks cleavage of both ends by the viral integrase in vivo // J. Virol. 1992. V. 66. P. 5092-5095.

106. Nandi J.S. Unintegrated viral DNA as a marker for human immunodeficiency virus 1 infection in vivo and in vitro // Acta Virol. 1999. V. 43. No. 6. P. 367-372.

107. Neamati N., Marchand C., Pommier Y. HIV-1 integrase inhibitors: past, present, and future//Adv. Pharmacol. 2000. V. 49. P. 147-165.

108. Petit C., Schwartz O., Mammano F. The karyophilic properties of human immunodeficiency virus type 1 integrase are not required for nuclear import of proviral DNA//J. Virol. 2000. V. 74. No. 15. P. 7119-7126.

109. Polard P., Chandler M. Bacterial transposases and retroviral integrases // Mol. Microbiol. 1995. V. 15. P. 13-23.

110. Pommier Y., Neamati N. Inhibitors of human immunodeficiency virus integrase // Adv. Virus Res. 1999. V. 52. P. 427-458.

111. Pommier Y., Marchand C., Neamati N. Retroviral integrase inhibitors year 2000: update and perspectives// Antiviral Res. 2000. V. 47. No. 3. P. 139-148.

112. Reines D., Conaway J. W., Conaway R. C. The RNA polymerase II general elongation factors// Biochem. Sci. 1996. V. 9. P. 351-355.

113. Rice P., Craigie R., Davies D. R. Retroviral integrases and their cousins // Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. V. 6. No. 1. P. 76-83.

114. Roe Т., Reynolds Т. C., Yu G., Brown P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis // EMBO J. 1993. V. 12. P. 2099-2108.

115. Roth M. J., Schwartzberg P. L., Goff S. P. Structure of the termini of DNA intermediates in the integration of retroviral DNA: dependence on IN function and terminal DNA sequence // Cell. 1989. V. 58. P. 47-54.

116. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

117. Sherman P. A, Fyfe J. A. Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity //

118. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. No. 13. P. 5119-5123.

119. Steitz T. A. A mechanism for all polymerases // Nature. 1998. V. 391. P. 231232.

120. Studier F. W., Rosenberg A. N., Dunn A. N., Dubendorff J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes // Methods Enzymol. 1990. V. 185. P. 60-69.

121. Tamalet C., Fantini J., Tourres C., Yahi N. Resistance of HIV-1 to multiple antiretroviral drugs in France: a 6-year survey (1997-2002) based on an analysis of over 7000 genotypes//AIDS. 2003. V. 17. No. 16. P. 2383-2388.

122. Tanaka Т., Kawase M., Tani S. Alpha-hydroxyketones as inhibitors of urease // Bioorg. Med. Chem. 2004. V. 12. No. 2. P. 501-505.

123. Tasara Т., Maga G., Hottiger M. O., Huscher U. HIV-1 reverse transcriptase and integrase enzymes physically interact and inhibit each other // FEBS Lett. 2001. V. 507. P. 39-44.

124. Thomas M., Brady L. HIV integrase: a target for AIDS therapeutics // Trends Biotechnol. 1997. V. 5. P. 167-172.

125. Vink C., Yeheskiely E., van der Marel G. A., van Boom J. H., Plasterk R. H. Site-specific hydrolysis and alcoholysis of human immunodeficiency vims DNA termini mediated by the viral integrase protein // Nucleic. Acids Res. 1991. V. 19. P. 6691-6698.

126. Vora A. C., McCord M., Fitzgerald M. L., Inman R. В., Grandgenett D. P. Efficient concerted integration of retrovirus-like DNA in vitro by avian myeloblastosis virus integrase // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 4454-4461.

127. Wain-Hobson S., Sonigo P., Danos O., Cole S., Alizon M. Nucleotide sequence of the AIDS virus, LAV // Cell. 1985. V. 40. P. 9-17.

128. Wang W., Cote J., Xue Y., Zhou S., Khavari P. A., Biggar S. R., Muchardt

129. C., Kalpana G. V., Goff S. P., Yaniv M., Workman J. L., Crabtree G. R. Purification and biochemical heterogeneity of the mammalian SWI-SNF complex //EMBOJ. 1996. V. 15. No. 19. P. 5370-5382.

130. Wang W. K., Chen M. Y., Chuang C. Y., Jeang К. Т., Huang L. M. it Molecular biology of human immunodeficiency virus type 1 // J. Microbiol.1.munol. Infect. 2000. V. 33. No. 3. P. 131-140.

131. Wang Y.X., Neamati N., Jacob J., Palmer I., Stahl S.J., Kaufman J.D., Huang P.L., Winslow H.E., Pommier Y., Wingfield P.T., Lee-Huang S., Bax A., Torchia

132. D.A. Solution structure of anti-HIV-1 and anti-tumor protein MAP30: structural insights into its multiple functions // Cell. 1999. V. 99. P. 433-442.

133. Wei P., Garber M. E., Fang S.-M., Fischer W. H., Jones K. A. A novel CDK9-associated C-type cyclin interacts directly with HIV-1 Tat and mediates its high-affinity, loop-specific binding to TAR RNA // Cell. 1998. V. 92. P. 451 -462.

134. Woerner A. M., Klutch M., Levin J. G., Marcus-Sekura C. J. Localization of DNA binding activity of HIV-1 integrase to the C-terminal half of the protein // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1992. V. 8. P. 297-304.

135. Yi J., Arthur J. W., Dunbrack R. L. Jr., Skalka A. M. An inhibitory monoclonal antibodv binds at the turn of the helix-turn-helix motif in the N-terminal domain of HIV-1 integrase // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. No. 49. P.38739-38748.

136. Yoder К. E., Bushman F. D. Repair of gaps in retroviral DNA integration intermediates // J. Virol. 2000. V. 74. No. 23. P. 11191 -111200.

137. Zennou V., Petit C., Guetard D., Nerhbass U., Montagnier L., Charneau P. HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap // Cell. 2000. V. 101. No. 2. P. 173-185.

138. Zimmermann G., Zhou D., Taussig R. Mutations uncover a role for two magnesium ions in the catalytic mechanism of adenylyl cyclase // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 19650-19655.

139. Zheng R., Jenkins Т. M., Craigie R. Zinc folds the N-terminal domain of HI V-I integrase, promotes multimerization, and enhances catalytic activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 13659-13664.

140. Zhou H., Rainey G.J., Wong S.K., Coffin J.M. Substrate sequence selection by retroviral integrase//J. Virol. 2001. V. 75. No. 3. P. 1359-1370.

141. Автор безмерно благодарит профессора, доктора медицинских наук, заведущего лабораторией ретровирусов Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор" Покровского А. Г. за научное руководство работой.

142. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 02-04-49122).