Механизмы взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК и иммуноглобулинами ВИЧ-инфицированных больных

Баранова, Светлана Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК и иммуноглобулинами ВИЧ-инфицированных больных
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизмы взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК и иммуноглобулинами ВИЧ-инфицированных больных"

На правах рукописи

БАРАНОВА СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА

МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 С ДНК И ИММУНОГЛОБУЛИНАМИ ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ БОЛЬНЫХ

03.00.04 - биохимия \ V

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2009

1 О ШОУ 2009

003473573

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной

медицины СО РАН и Новосибирском государственном университете

Научные руководители:

д.х.н., профессор Невинский Георгий Александрович д.б.н., доцент Бунева Валентина Николаевна

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор Малыгин Эрнст Георгиевич к.б.н., доцент Ходырева Светлана Николаевна

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится «/У » шещ 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан » лсй4 2009 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Взаимодействие белков с нуклеиновыми кислотами лежит в основе многих жизненно важных процессов организма. Интерес к ДНК-зависимым ферментам актуален еще и потому, что многие из них являются мишенями для большого числа антивирусных, антибактериальных и антираковых препаратов.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) входит в семейство ретровирусов и является возбудителем одного из самых опасных заболеваний современного общества - синдрома приобретенного иммунодефицита. Одним из направлений химиотерапии ВИЧ-инфекции является использование ингибиторов ключевых ферментов жизненного цикла ВИЧ - интегразы (ИН), обратной транскриптазы (ОТ) и протеазы.

Несмотря на то, что многие аспекты функционирования одного из ключевых ферментов вируса - интегразы достаточно хорошо изучены, механизмы обеспечения специфичности при узнавании и расщеплении вирусной ДНК остаются невыясненными. Более того, актуальность данного исследования с практической точки зрения заключается в том, что понимание механизмов узнавания может помочь разработать подходы к созданию специфических ингибиторов ВИЧ.

Кроме того, при ВИЧ-инфекции длительная персистенция вируса приводит к постоянной активации клеток иммунной системы. На первом зтапе после заражения организма человека вирусом иммунный ответ направлен на белки ВИЧ, к которым относятся и ферменты - обратная транскриптаза и интеграза. Антитела (АТ) против этих ферментов могут обладать протеазной активностью. Учитывая это, представляется чрезвычайно важным детальное исследование каталитических свойств АТ против фермента вируса - интегразы ВИЧ-1.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в анализе закономерностей взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК и иммуноглобулинами ВИЧ-инфицированных больных. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

• изучение на количественном уровне характера специфических и неспецифических взаимодействий ИН ВИЧ-1 с ДНК с помощью метода последовательного усложнения структуры ДНК-лиганда. Оценка относительного вклада различных специфических и неспецифических взаимодействий ИН с ДНК в обеспечение специфичности действия фермента;

• определение зависимости олигомерного состояния и активности интегразы от длины и структуры специфических и неспецифических олигонуклеотидов: Установление механизма образования олигомерной каталитически активной формы фермента;

проведение исследования протеолитической активности у иммуноглобулинов классов IgG и IgM из крови ВИЧ-инфицированных больных, гидролизующих ИН:

- проверить выполнимость критериев отнесения каталитической активности антител крови ВИЧ-инфицированных больных непосредственно к иммуноглобулинам;

- изучить ферментативные свойства исследуемых абзимов (рН- и металл-зависимость, субстратная специфичность, кинетические параметры реакции гидролиза);

- определить сайт, по которому происходит расщепление интегразы иммуноглобулинами.

Научная новизна и практическая ценность работы. Работа является первым, проведенным на количественном уровне, систематическим исследованием механизма узнавания ДНК интегразой ВИЧ-1. Впервые проведен детальный термодинамический анализ закономерностей взаимодействия ИН с неспецифическими и специфическими ДНК. Определены значения К& (AG°), характеризующие эффективность комплексообразования ИН с олигонуклеотидами (ON) различной структуры и длины. Установлено влияние специфических ON на активность и олигомеризацию фермента. Впервые показано, что антитела крови ВИЧ-инфицированных больных гидролизуют ИН ВИЧ-1. Полученные данные являются чрезвычайно важными для понимания механизмов взаимодействия интегразы с ДНК, а анализ гидролизующей активности AT может найти применение в разработке новых методов лечения ВИЧ-инфекции.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Результаты работы были представлены на международной конференции: "Chemical & Biological Problems of Proteomics", 2005, Novosibirsk, Russia и научно практической конференции «Новые материалы и методы для медицины», Новосибирск, 2008.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 140 страницах, содержит 45 рисунков и 12 таблиц. Библиография включает 216 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Взаимодействие интегразы ВИЧ-1 с различными олигонуклеотидами

Анализ относительного вклада нуклеотидных звеньев (и их структурных элементов) специфической (сп-) последовательности,

соответствующей тупым концам вирусной ДНК, и неспецифической (несп-) в эффективность взаимодействия фермента с вирусной ДНК проводили методом последовательного усложнения структуры лиганда (ПУСЛ). (Ж являются конкурентными ингибиторами ИН по отношению к «стандартному» субстрату реакции З'-процессинга - 21-мерному ОИ, соответствующему тупым концам вирусной ДНК (дцОТ-СЖл). Это позволило использовать метод ингибиторного анализа для определения эффективности взаимодействия ИН с различными (Ж

Минимальным лигандом ИН является ортофосфат. Сродство лигандов постепенно увеличивается при переходе от Р; к ёЫМР и более длинным с!(рЫ)п. На рис. 1 представлены зависимости от длины (п) <3(рМ)„.

Все зависимости для несп- оц<1(рМ)п были двухфазными.

Переход от сГГМР, с!СМР, ёАМР к соответствующим им (1(рН)2 приводит к повышению сродства в 2,5, 50 и 60 раз соответственно. Для ИН обнаружено два отдельных участка, соответствующих повышению сродства: п=0-2 и п=4-21 соответственно; регион п=2-4 имеет переходный характер. Изменение сродства (Ж на каждом из участков описывается геометрической прогрессией: АГа[(1(р1Ч)п] = ЛаКРЭД'П^Г» где / - фактор увеличения сродства при удлинении (Ж на одно звено, вычисляемый из наклона /о^-кривых. Монотонное возрастание значений logK¿ (п>4) отражает взаимодействие между ИН и каждой последующей нуклеотидной единицей гомо-сЗ(р^„; угол наклона кривых для различных с!(рМ)п соответствует значениям /=1,27-3,0 (К,, = Ку = 1// = 0,79-0,33 М)._ Из данных рис. 1, А видно, что основной вклад в сродство ИН к гомо-с1(рЫ)п вносит первое звено с 3'-конца, вклад звеньев со 2-го по 4-е несколько меньше, а звенья с1(рМ)„ с 5 по 21 взаимодействуют с ферментом еще с более низкой и примерно одинаковой эффективностью.

Когда фермент взаимодействует с основанием, сродство для гомо-с1(рЫ)п обычно возрастает с повышением относительной гидрофобности оснований: С<Т<С<А {Невинский Г.А., 2004). Для ИН сродство к несп-<1(рС)п ё(рТ)„, и с!(рА)п не соответствует относительной гидрофобности оснований. Так, сродство ИН к с1(рС)21 и с1(рА)21 - (Ж с минимальной и максимальной относительной гидрофобность оснований, сопоставимо, а сродство к с1(рТ)21 значительно ниже (рис. 1 ,А).

Для оценки возможного вклада углеводных остатков в сродство ДНК проведено сравнение сродства ИН к рибо- (г(Ж) и дезоксирибоСЖ. Зависимости значений от п для всех г(рМ)„, где N = С, и и А, были сопоставимыми с таковой для <1(рТ)п (рис. 1, Б). Следовательно, ИН взаимодействует в основном с сахарофосфатным остовом (Ж и в первую очередь с межнуклеозидными фосфатными группами.

Для оценки вклада сахарофосфатного остова в формирование

Рис. 1. Зависимость значений -^Ка для оц- и дцс1(рМ)п от их длины (п). (А) оцОМ; (Б) pибo-ON и некоторые дезоксирибо-ОЫ, включая апуриновые олигомеры; (В) оц- и дцОК для ортофосфата п = 0. Приведены

усредненные значения 2-3-х независимых экспериментов. Ошибка определения величин не превышала 20%.

контактов между ИН и с1(рН)„ использованы две серии аналогов: (1) олигомеры, в которых основание заменено на атом водорода (<1[(рК)п(рТ)]), и (2) аналоги с!(рМ)п, этилированные по межнуклеозидным фосфатным группам. Сродство аналогов, лишенных оснований, было близким к таковому для г(р]^)п, но немного ниже, чем для с)(рТ)п (рис. 1, Б). Этилированные производные «3(рТ)п, демонстрировали более низкое сродство. Эти данные показывают, что ИН контактирует в основном с сахарофосфатным остовом гОИ и с1(рТ)„, и основной вклад вносят электростатические взаимодействия с фосфатными группами.

Для оценки вклада второй цепи ДНК был проведен анализ взаимодействия ИН с несп- дуплексами <1(рТ)п*с1(рА)п. Сродство этих дуплексов возрастало с увеличением их длины, достигая максимального значения при п ~ 12-14, и очень слабо увеличивалось при п = 14-21 (рис. 1, В). Переход от ё(рТ)ю*с1(рА)|о к г(ри)ют(рА)ю приводил к понижению сродства примерно в 30 раз, в то время как для рибо- и дезоксирибодуплексов, г(ри)ю'с1(рА)|0 и г(рА)ш,с1(рТ)1о, изменения в сродстве были значительно меньше. Данные свидетельствуют о том, что

ИН взаимодействует с обеими цепями ДНК-субстрата, но вклад в сродство второй цепи значительно ниже, чем первой.

1.1. Взаимодействие интегразы ВИЧ-1 со специфической ДНК Добавление сп-СЖ. в реакционную смесь в низкой концентрации приводит к заметной активации ИН. Уровень активации возрастает с увеличением длины СЖ от 5 до 21 звена в случае СГ-лигандов (рис. 2, столбцы 2-6). Аналогичная зависимость от длины наблюдалась для СА-олигонуклеотидов, соответствующих специфической последовательности ДНК вируса после отщепления концевых СТ. Эти ОИ еще лучше активировали ИН (рис. 2, столбцы 7-12). Активация ИН сп- дцОЫ была

Рис. 2. Возрастание активности интегразы в реакции З'-процессинга с увеличением длины

активатора. «+» - ИН после предынкубации с различными (Ж или МпС12; «-» - ИН после предынкубации в отсутствие лигандов.

заметно выше, чем для оцОИ той же длины (рис. 2, сравнение столбцов 3 и 15, 5 и 16). Эффект активации для 014, содержащих последовательность, соответствующую нерасщепляемой цепи, был заметно ниже (рис. 2, столбцы 13-14). Таким образом, активация ИН осложняет оценку сродства сп-ОЫ к ферменту методом ингибиторного анализа. Активация фермента происходит также и в присутствии ионов Мп2+ (рис. 2, столбец 17). Было показано, что интеграза, предварительно активированная Мп2+, СЖ не активировалась, а сп-ОЫ демонстрировали конкурентный тип ингибирования по отношению к стандартному субстрату. Поэтому анализ ингибирования ИН проводили после предварительной активации фермента ионами Мп2+.

Переход от <}ТМР, сЮМР или с!СМР к соответствующим (1(рЫ)2 приводит к возрастанию сродства субстрата к ИН. Вклад 3'-концевых ОТ в ОТ-ОЫ2| в его сродство к ИН значительно выше по сравнению с другими нуклеотидами. Максимальный вклад специфических взаимодействий в общее сродство ИН к сп-ДНК может быть в среднем оценен как Кл=33 мМ. Данные свидетельствуют в пользу того, что вклад

Мб-¡15-|14. 5.11-£12' 811 ■ «И-

2 9-«■

76543 2 1-

□ 'МпО,

^ *фСТСТАеСАСТ)М(рИ>«

2 *

* сЧдАССАТСТСТМААССТСТС)

ИЗШгСТСеЛАААТСТСТАОСА)

13 + Й(РАТСТСТАОСА)

* ^рСТАйСА)

• «р71рСА| * И[рСА)

—• (1!рЗТЗТС,СААААТС1СТАССАаТ)

_ * йрСТСТАССАСТ}

. ^рСТАСЗСАСТ) * а(рА(ЗСАСТ)

100 150 200 250 300 350

Относительная активность, 'Л

второй цепи ДНК в ее сродство к ферменту существенно меньше, чем первой, хотя ИН взаимодействует с обеими цепями ДНК-субстрата.

1.2. Термодинамическая модель взаимодействия ИН ВИЧ-1 со специфической ДНК

Показано, что ИН имеет самое высокое сродство к 21- и 19-звенным СЖ, соответствующим концевой последовательности процессируемой цепи до и после отщепления СТ. Это свидетельствует о том, что ИН имеет отдельные специфические сайты для узнавания З'-концевых вТ и СА. Скорее всего, после удаления ОТ в ходе реакции З'-концевого процессинга происходит перестройка активного центра ИН, в результате которой происходит формирование сильных контактов с новым 3'-концевым СА-динуклеотидом специфической последовательности.

Относительный вклад вТ в сродство ОТ-ОЫ21 к ИН был оценен как ~ -5,4 ккал/моль или 0,13 мкМ (рис 3, А). Относительный вклад основания и сахарного остатка <1ТМР составили - ~ 0,051 М я -1,8 ккал/моль) и 0,45 М (ДС° « -0,5 ккал/моль) соответственно. Так как сродство ёСМР и сЮМР почти не отличается от такового для дезоксирибозофосфата, эти нуклеотиды, скорее всего, взаимодействуют неспецифически за счет сахарофосфатного остатка с сайтом ИН, узнающим 3'-концевое Т-звено. Относительный вклад рв-звена в сродство динуклеотида ¿(рвТ) к ИН был найден как А^рв) « 0,17 М (АС° я -1,1 ккал/моль). Относительный вклад третьего и четвертого нуклеотидов (А и С) специфической последовательности САСТ сопоставим и характеризуется значениями Кй ~ 0,41-0,43 М (АС0 « -0,51 до -0,54 ккал/моль). Каждое из следующих 17 нуклеотидных звеньев от 3'- к 5'- концу специфической последовательности повышает сродство примерно в 1,57 раз {КА « 0,64 М, ДС° » -0,27 ккал/моль). Суммарный вклад этих 17 звеньев был оценен как Ай° ~ -4,6 ккал/моль. Все специфические и/или неспецифические контакты ИН с сахаро-фосфатным остовом или основаниями нерасщепляемой цепи вместе с комплементарными взаимодействиями между цепями, повышают сродство ИН к дуплексу по сравнению с оцОТ-ОН2 примерно в 8 раз, что соответствует ДА= -1,25 ккал/моль. Такое относительно небольшое повышение сродства может быть результатом формирования слабых контактов ИН со второй цепью дцДНК, а также образования очень слабых контактов между цепями.

Таким образом, высокое сродство к несп- и сп-ДНК обеспечивается большим числом аддитивных неспецифических взаимодействий интегразы со всеми нуклеотидными звеньями ДНК, покрываемыми

ферментом, а специфические взаимодействия примерно только на порядок.

повышают сродство

К,(рОрТ) а 0.13 мкМ ЛС ■ - 5,4 ккал/моль

Вел контакты ИН с растопляемо»« цепыо ДНК обеспечивают величии" а гг' приблизительно равную -11,1

1*4,-1.10"М).

Каждый иэ 17 ну кое увеличивает сродство • 1.57 рва К. - О.в« М,

(Д С* " -«.27 ккал/моль); • целом АС- -4.в ккал/моль

К.(рТ) • 0.77 мкМ (л в* 4.3 ккал/моль)

К.(Т основами*) ш $1 мМ (Л С " -1,в ккал/моль) К.(рЯ)»0.45М (Л С " -0.5 ккал/моль) К.(Р!| « 33 мкМ <Д О* » -2,0 ккал/моль)

КсЦрй) - 0.17 М ДО'« -1.1 ккал/моль

КЛрА) Я К,(рС) а 0,41-0,43 М (Д в* ■ «0,91 до -0,54 ккал/моль)

СрТрОрТрСрОрАрАрАрАрТрСрТрСрТрАрО рСрА СрАрСрАрСрСрТрТрТрТрАрОрАрСрАрТрС рв р*т1рСрА

а всех на специфических и специфических контактов нвгидрали зуемой цепи комллвмактврными взвимсадеистеичми между цепями увеличивает сродство фермента к дуплексу примерно в в раз (Л ЛС" на - 1.25 ккал/моль).

Рис. 3. Термодинамическая модель взаимодействия интегразы со специфической последовательностью ДНК, содержащей ОТ-динуклеотид. Приведены значения АС, характеризующие различные контакты между ферментом и нуклеотидными звеньями цепей ДНК.

Данные, полученные для ИН, подтверждают сделанный ранее вывод о том, что основой специфичности ферментов являются стадии взаимной адаптации структуры фермента и ДНК и непосредственно катализа, но не образования первичного комплекса фермента со сп-ДНК {Невинский Г.А., 2004).

2. Влияние олигонуклеотидов на олигомерное состояние интегразы

Анализ взаимодействия ИН с ДНК методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) проводили с использованием различных сп- и несп- оц- и дцОЫ. Полученные данные по рентгеновскому рассеянию представлены в координатах Гинье (рис. 4, кривая 1), и они свидетельствуют в пользу того, что раствор содержит частицы белка одинакового размера. Анализ рентгенограммы образца белка показал, что исходная ИН находится в мономерной форме с радиусом инерции 16,8±0,5А. Компьютерная обработка данных МУРР выполнялась совместно с Тузиковым Ф.В. ((Зштег А., е/. а1, 1981).

Далее был проведен анализ данных МУРР, полученных для различных С»). На рис. 4 приведена кривая 2, соответствующая сп-с!(рССАОТ), которая свидетельствует о присутствии в растворе только

одного типа рассеивающих частиц. Аналогичные результаты получены для всех использованных (Ж Различные наклоны кривых 1 и 2 соответствуют разным размерам рассеивающих частиц. После инкубации ИН со сп-(Ж образуются олигомерные формы белка, на это указывает резкое увеличение наклона начального участка кривой рентгенограммы

Рис. 4. Рентгенограмма МУРР в координатах Гинье. Представлена логарифмическая зависимость интенсивности рентгеновских лучей /и1(Ь) от угла преломления И2. ИН инкубирована в отсутствие или в присутствии с1(рОСАСТ).

Кроме того, кривая состоит из фрагментов с различными наклонами, что свидетельствует о формировании нескольких новых частиц разных размеров после образования комплексов фермента с СЖ. На основании данных о 0,005 о,о1 о,о15 МУРР была проведена оценка числа Иг(А"2) мономеров ИН в составе его олигомерных форм. Например, для ИН (34,7 мМ, 100%) и сп-с!(рОСАСТ) (133,3 мМ) (рис. 4) были найдены различные формы ИН, связанные с одной или несколькими молекулами лиганда (Б): 82,78% мономерных форм (Е+ЕБ), 2,5% димерных форм (Е25+Е282) и 8,37% тетрамерных форм (Е48+Е482+Е48з+Е484).

При анализе образования различных олигомеров и их комплексов учитывались все возможные пути их формирования, включая взаимодействие между двумя молекулами свободного фермента при образовании димера (Е+Е = Е2), различных тримерных форм Е38, Е382 и Е383, а также разные пути формирования димерных и тетрамерных форм ИН, связанных с разным количеством молекул лиганда. Для определения кинетической схемы, по которой образуются олигомерные формы ИН, по нескольким альтернативным механизмам были рассчитаны значения Кй комплекса фермента с ОЫ. Рассчитанные значения К&, соответствующие различным кинетическим схемам, на несколько порядков отличались от экспериментальных величин. Процесс олигомеризации лучше всего описывался двумя кинетическими схемами (рис. 5, А и Б).

Взаимодействие ИН со сп-(Ж и формирование олигомерных форм фермента очень хорошо описывается кинетической схемой А, хотя в

МУРР (рис. 4, кривая 3).

-с 1"7

6,5 6 5,5 5 4,5 4

3. ИН + ¿(рССАСГ)

случае несп- лигандов нельзя исключить оба пути формирования комплексов. А

к,181 МЕв| МЕ48,1

Е - ЕЭ 1 Ь Е 2 - , £4^4

к., I к., 11

" к,[Б] к,[Е] кДЕ^Э]

Е — ■ *- ЕБ —.........." Е,Б --------------" Е.Б.

к, к, к.,

Рис. 5. Кинетические схемы, описывающие взаимодействие ИН с олигонуклеотидами. Модели 1 (А) и 2 (Б) - это два возможных кинетических пути формирования различных нуклеопротеиновых комплексов. Е - мономер ИН; Е2 - димер ИН; Е4 - тетрамер фермента; Б - ОК.

2.1. Анализ оптимальной кинетической схемы олигомеризации ИН На основании данных МУРР можно вычислить размер любых образующихся частиц и концентрации различных компонентов смеси. Графики зависимости рентгенограмм МУРР от концентрации различных (Ж, построенные по кинетической схеме А, позволяют не только рассчитать значение Ка для первого шага взаимодействия ИН с субстратом, но также количественно описать все шаги взаимодействия фермента с СМ (табл. 1).

- Шаг Е + в —> ЕБ, Аа(1) = к\1кл. Мономер ИН (Е) проявляет очень высокое сродство к длинным сп-СМ (по сравнению с короткими ОЫ) и особенно к дцСТ-(Ж21 (А'а(1)=2,2 нМ).

- Шаг ЕБ+Е—>Е28, А<|(2). Взаимодействие мономера ЕБ с Е характеризуется значением найденным для всех длинных сп- оц- и дц(Ж Однако, сродство несп-с1(рА)5, с](рТ)21'с1(рА)21 или короткого сп-сКрССАСГ) примерно на один порядок выше, чем для длинных сп-СЖ Это может указывать на различные изменения в структуре мономера ИН после его комплексообразования с разными (Ж.

- Шаг Е8+Е8—>Е282, Сродство Е друг к другу настолько низкое, что они не взаимодействуют друг с другом с образованием димеров. Сродство ЕБ-форм фермента друг к другу сопоставимо со сродством ЕБ-комплексов для сп- и несп-ОЫ.

- Шаг Е282+Е282—»Е^, /^(4). Для сп-ОИ этот шаг характеризуется очень высокими значениями которые показывают, что формирование Е484 из димеров Е282 является исключительно неэффективным процессом. В то время как для несп-ОЫ обнаружено значительно более высокое сродство Е282 форм друг к другу. Можно предположить, что

формирование Е484 из Е282 происходит более эффективно при взаимодействии ИН с несп-, чем со сп-ДНК-лигандами.

Таблица 1. Характеристики компонентов реакционной смеси, содержащей ИН и ouGT-ON21

Начальные

концентрации, мкМ Равновесные концентрации, мкМ

Ео So Е S ES E2S e2s2 E4S4

67,4 31,3 33,1 0,007 23,1 3,0 2,57 0,0148

63,8 73,0 0,05 9,26 44,1 0,009 9,41 0,198

58,4 134,0 0,006 75,6 41,3 0,001 8,24 0,152

50,1 229,5 0,002 179,4 36,7 0,0003 6,51 0,095

Радиус 16,8±0,5 14,0±0,3 18,5±0,3 19,3±0,2 33,8±0,9 61,0±0,4

инерции, Á

Значения Kj, мкМ Ка(1) 0,01±0,01 Kd(2) 253,6±4,0 Kd(3) 206,0±4,0 К<,(4) 447,0±65,0 ВД 0,0087±0,0004

- Шаг E2S+S—>E2S2, K¿(5). На этом шаге сродство, Á'd(5), форм E2S к cn-ON значительно выше такового для несп-ON. Сродство Е к сп- оц- и flnGT-ON21 (E+S—>ES) сопоставимо или ниже, чем формы E2S (SE-E+S—»SE-ES) к этим же ON. Это может свидетельствовать о возможных изменениях конформации мономера ИН после его комплексообразования с ES формой (ES+E—>ES-E—>ES-E , где Е и Е* - фермент в различных конформациях). Эти результаты были получены в модельных условиях, исключающих формирование Е2-формы. В то же время в клетке формирование форм Е2 является преимущественным процессом, и формирование комплекса E2S (E2+S—>E2S) может привести к значительным изменениям структурных характеристик второй субъединицы димера после того, как произойдет комплексообразование димера Е2 с одной молекулой ON.

Полученные результаты показывают, что и сп-, и несп-ON после комплексообразования с мономерами ИН стимулируют формирование олигомерных форм, которые отличаются сродством как к ON, так и друг к другу.

2.2. Радиус инерции и количество олигомерных форм интегразы

Радиусы инерции мономера ИН в комплексе с различными ON варьируют в диапазоне 16,8-18,7Á, a Rg мономера Е, свободного от ON, равен 16,8 Á. Поскольку комплексообразование мономера с ON слабо изменяет величину Rg, можно предположить, что конформация белка при взаимодействии с ON меняется незначительно. При переходе от ES к комплексам E2S, E2S2 и E4S4, содержащим различные ON, значения Rg

повышаются, но эти величины для комплексов с несп- лигандами заметно выше, чем для комплексов со сп-ОМ.

Для димеров, содержащих одну молекулу лиганда, величина 118 уменьшается от 25,2 до 17,1 А с увеличением длины сп-ОМ По-видимому, образующийся димер ИН может принимать более компактную форму за счет образования дополнительных контактов с каждым из звеньев более длинных сп-ОМ. Обратная зависимость наблюдалась для димеров, содержащих две молекулы лиганда - Я8 увеличивался от 26,5 до 36,5 А. Исключение составлял комплекс димера ИН с (1(рОСАОТ). Для него величина радиуса инерции оказалась равной 45,7 А, по-видимому, короткий сп- пентануклеотид связывается с интегразой в большей степени как несп-ОМ, хотя и является слабым активатором ИН (рис. 2).

Несп-ОМ взаимодействовали с мономером Е с большим повышением величины (Д11е=8,7-9,7%), чем сп-ОМ (Д118=0,6-1,2%). В результате комплексообразования Е2Б со второй молекулой ОМ (Е28+5—>Е2Б2) повышались значения на 75-81%. Димерные формы Е2Б2 для несп-ОМ характеризовались величинами Я8 на 82% большими. Эти данные демонстрируют, что при взаимодействии ИН с несп-ОМ могут образоваться димерные формы белка, которые представляют собой менее компактные, вероятно, более длинные элипсоподобные структуры.

В случае тетрамерных форм ИН в комплексе со сп- оц- и дцОМ значения совпадали и были равны 56,8 А. Следует полагать, что после образования тетрамера Е484 эти сп-ОМ формируют близкие по размеру и структуре комплексы, которые более компактны, чем в случае несп-ДНК-лигандов.

Образование олигомерных форм ИН зависит от длины и структуры лиганда. Их относительное количество повышается с концентрацией, длиной и зависит от структуры ОМ. При добавлении сп-ОМ, содержащего СГ-динуклеотид в насыщающей концентрации, количество димеров, содержащих в своем составе две молекулы ОМ, а также тетрамеров уменьшается. Аналогичные результаты были получены и при добавлении сп- дуплексов ОМ. Тетрамеры ИН тестируются только при высокой концентрации лиганда. Количество димеров, содержащих одну или две молекулы сп- дуплексов, растет при низкой концентрации лигандов, а при ее повышении уменьшается. Это может свидетельствовать о том, что механизм образования Е282 димерной формы осуществляется путем присоединения еще одной молекулы лиганда к форме Е2Б (рис. 5, А).

Известно, что ИН в растворе находится в динамическом равновесии между различными каталитически неактивными олигомерными формами. В использованных условиях ИН находится в мономерной форме (рис. 4, кривая 1), а образование олигомерных и каталитически

активных форм фермента происходит только после добавления cn-ON. Относительное количество димерных и тетрамерных форм коррелирует с данными по активации фермента. На основании полученных результатов можно заключить, что предынкубация ИН со cn-ON в условиях, не препятствующих ON-зависимому формированию каталитически активных олигомеров, приводит, главным образом, к образованию димерных форм E2S2. Эти формы фермента, скорее всего, и катализируют реакцию З'-процессинга.

Иная картина наблюдалась для несп-ON: количество комплекса E2S2 было очень низким, в то время как тетрамеры детектировались в более высокой концентрации. Так как влияние сп- и несп-ON на процесс ассоциации мономеров и димеров ИН сильно отличается, скорее всего, мономеры в составе тетрамера ИН отличаются конформацией и взаимным расположением.

2.3. Гипотетическая схема взаимодействия ИН с ON

Предынкубация ИН со сп- и несп-ДНК ведет к образованию различных олигомерных форм фермента, которые характеризуются разными величинами Rg. И только олигомеры, образованные под действием cn-ON, катализируют реакцию З'-процессинга.

В условиях проводимого исследования методом МУРР, ИН находилась в мономерной форме. В клетке фермент может находиться в различных олигомерных формах. Кроме того, взаимодействия мономеров и димеров фермента с вирусной ДНК, содержащей два длинных концевых повтора (ДКП), может отличаться от взаимодействия этих форм с двумя cn-ON. Это приводит к другому пути процесса комплексообразования. Формирование Е-ДКП-ДНК-ДКП-Е в клетке происходит более эффективно, чем образование комплекса ДКП-Е-Е-ДКП.

Теграмер ИН j | '

первого тапа I" 1 гш г* —

И Рис. 6.1 ипотетическая схема взаимодеиствия

мономер ин yi* I " интегразы со сп-и несп-олигонуклеотидами.

\ к.,»«™*.«» Тем не менее, этот комплекс может

активный w

моделировать природным, который участвует в образовании тетрамерной формы фермента, не способной катализировать З'-процессинг. Этот димер фермента в комплексе с двумя \ молекулами cn-ON, являющийся

аналогом комплекса фермента с

первого Ti

Начальный мономер ИН

Димер ИН т»т0амер ИН

первого в "

Дчмер№1 етооого типа ♦

тетрамер второго

вирусной ДНК, был назван комплексом первого типа (рис. 6).

Взаимодействия ИН с несп-ОЫ приводит к формированию димера другого типа (Ж-Е-Е-СЖ с большим значением и другим сродством мономеров фермента друг к другу в составе димера. Эти димеры фермента второго типа более эффективно формируют олигомер Е484, но он каталитически неактивен (рис. 6). На основании литературных данных и результатов данной работы можно заключить, что димеры первого типа катализируют реакцию З'-процессинга, но не реакцию интеграции. Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что только тетрамеры, состоящие из димеров первого и второго типа, могут катализировать все реакции согласованного процесса встраивания вирусной ДНК в ДНК клетки хозяина (рис. 6).

3. Гидролиз ИН иммуноглобулинами крови ВИЧ-инфицированных больных

Антитела (АТ) крови ВИЧ-инфицированных больных были выделены согласно разработанной в лаборатории ферментов репарации методике и любезно предоставлены Харитоновой М.А. (ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета).

Электрофоретический анализ препаратов 1§С и 1цМ, выделенных из крови ВИЧ-инфицированных больных, показал их электрофоретическую гомогенность (рис.7).

Рис. 7. Анализ гомогенности препаратов с помощью БОЗ-гель-электрофореза в градиентном 4,5-18 % ПААГ. Окраска геля AgNOз: 1 - белковые маркеры молекулярной массы; 2 - препарат ^М после обработки 10 мМ ДТТ; 3 - препарат ^О.

После всех стадий очистки АТ-ВИЧ обладали протеолитической активностью. При тестировании 54 очищенных препаратов АТ активность в реакции гидролиза интегразы выявлена в 39 препаратах (72%).

3.1. Доказательство наличия у АТ крови ВИЧ-инфицированных больных протеазной активности

В настоящее время для однозначного отнесения каталитической активности непосредственно абзимам существует ряд жестких критериев, некоторые из которых были проверены: 1) показана электрофоретическая гомогенность ^ (окраска белков серебром) (рис. 7); 2) гель-фильтрация АТ в условиях "рН шока" не приводила к потере каталитической

КДа 1 ; з 150-* Э7-*

67-» « * 43-* 30-+ -28-» :Л

активности АТ; 3) наблюдалась полная адсорбция активности анти-Ъ-^ сефарозой и элюция ^ с сорбента буфером с низким значением рН.

Один из самых жестких критериев принадлежности каталитической активности непосредственно АТ основан на анализе ферментативной активности белка после ЗОБ-электрофореза (рис. 8). Поскольку ЭБЭ разрушает практически все нековалентные комплексы, выполнение этого критерия практически однозначно свидетельствует о принадлежности

активности непосредственно АТ, а не каким-либо примесям.

* 70

1 SO I 50

I 40

10 12 14 16 1S 20 Номер фракции

[НЕ

Рис. 8. А - Анализ каталитической активности ^О после ЭОЗ-электрофореза в ПААГ. Продольная дорожка геля была разрезана на фрагменты 2-3 мм (см. £). Элюаты, соответствующие этим фрагментам, были использованы для определения степени гидролиза ИН % относительно контроля. Контроль - инкубация ИН в отсутствие АТ при 35 °С. Б - Данные электрофоретического анализа Окраска геля Соота^е С-250.

3.2. Анализ сродства иммуноглобулинов к ИН и их субстратная специфичность

Природные абзимы являются поликлональными АТ, представляющими собой набор моноклональных АТ, которые можно разделить по сродству к субстрату на отдельные субфракции при хроматографии на аффинных сорбентах. Данные аффинной хроматографии одного из препаратов (эквимолярная смесь АТ от трех ВИЧ-инфицированных больных) на ИН-сефарозе (рис. 9) свидетельствовали о том, что 15±3% имеет повышенное сродство к иммобилизованной интегразе.

В то же время, обе фракции АТ, взаимодействующая и не взаимодействующая с иммобилизованным субстратом, проявляли ИН-гидролизующую активность (рис. 9).

^ Рис. 9. Профиль аффинной хроматографии

5 препарата IgG на ИН-сефарозе. (-) -

8. оптическая плотность при 280 нм. (-•-) -

« £ степень гидролиза ИН Ig относительно

| контроля. Контроль - инкубация ИН в

| отсутствие АТ при 35 °С.

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 2fi Z

Номер фракции

Исследование субстратной специфичности препаратов АТ (после хроматографии на ИН-сефарозе), имеющих сродство к интегразе, показало, что они гидролизуют только ИН (рис. 10).

О} »5 ?

Рис. 10. БОБ-электрофоретический анализ продуктов гидролиза различных белковых субстратов 1§0-абзимами в градиентном 4,515% ПААГ. «-» в отсутствие АТ, «+» в присутствии АТ. Окраска геля AgNOз.

3.3. Определение типа протеолитической активности

Для определения типа протеолитической активности абзимов, в работе использованы специфические ингибиторы протеаз. Существенное подавление активности АТ было отмечено при использовании йодацетамида (рис. 11). В данной работе впервые обнаружены абзимы тиолового типа. Большая часть препаратов также ингибируется с помощью ЭДТА на 13-98 %, такое эффективное ингибирование (> 50 %) абзимов также обнаружено впервые.

Рис. 11. БВБ-электрофоретический анализ продуктов гидролиза интегразы ^М-абзимами до и после обработки ингибиторами протеаз в 12% ПААГ. К -контроль ИН: «-» в отсутствие АТ, «+» в присутствии АТ.

Низкоэффективная наработка АТ с сериновым типом активности (отсутствие существенного влияния АЕВБР) также является исключительной особенностью АТ против интегразы. Активность пяти из 19 препаратов АТ эффективно (36-88%) подавлялась ингибитором кислых протеаз (пепстатин А), что также является нетипичным явлением.

Таким образом, впервые показано, что суммарный пул АТ сыворотки крови ВИЧ-инфицированных больных, содержит абзимы нескольких типов: тиоловые и металлопротеазы, и в меньшем количестве сериновые и кислые протеазы. Следует отметить, что активность АТ эффективно подавляется несколькими специфическими ингибиторами. Например,

ингибируется на 95, 94 и 68% йодацетамидом, ЭДТА и лейпептина соответственно. Нельзя исключить, что основной пул АТ - это металлопротеазы, которые для хелатирования иона металла используют преимущественно БН-группы цистеина и карбоксильные группы кислых аминокислот. Однако в этом случае набор аминокислотных остатков, используемых абзимами для хелатирования ионов металлов, может существенно отличаться, поскольку эффективность ингибирования заметно варьирует от препарата к препарату.

3.4. Влияние ионов двухвалентных металлов на каталитическую активность АТ и определение рН-онтимума

Оценку эффекторного действия солей двухвалентных металлов проводили по их влиянию на степень гидролиза интегразы. Для всех исследованных 1§С] активирующий эффект убывал в последовательности: Мп2+>Си2+>М§2+.

Исследование рН-зависимости ИН-гидролизующей активности трех препаратов 1§в крови ВИЧ-инфицированных больных с различными уровнями относительной активности показало, что все препараты катализируют гидролиз ИН в широком диапазоне рН от 3,5 до 11, демонстрируя несколько различных оптимумов. Все препараты эффективно катализируют реакцию при рН 6,8-7,6. Полученные данные свидетельствуют о разной степени выраженности гетерогенности пула фракций ^в-ВИЧ, способных гидролизовать ИН.

3.5. Кинетические характеристики реакции гидролиза ИН

АТ-зависимый гидролиз ИН соответствовал кинетическим закономерностям Михаэлиса-Ментен. Наименьшие значения Км в реакции гидролиза ИН были сопоставимы со значениями констант Михаэлиса, найденными, для АТ-зависимого гидролиза других белков. Величины Км для суммарных препаратов АТ и обладающих наибольшим сродством к интегразе, были одного порядка. Необходимо отметить, что для суммарных фракций 1§С и фракций, элюированных с ИН-сефарозы, Км были практически одинаковыми, но скорость реакции гидролиза очищенных препаратов была выше на 1-2 порядка.

Значения ¿са, для гидролиза ИН в реакциях, катализируемых фракциями АТ, разделенных хроматографией на ИН-сефарозе, примерно в 10-100 раз выше значения таковой для суммарных препаратов АТ. На данный момент нет методик, которые позволяют эффективно разделить абзимы от каталитически неактивных АТ. Кинетические параметры были рассчитаны при использовании суммарной концентрации и поэтому активность АТ в реакции гидролиза ИН может быть выше.

3.5. Анализ продуктов гидролиза ИН антителами ВИЧ-инфицированных больных

Исследование продуктов гидролиза интегразы методом масс-спектрометрии (МАЬОЬТОГ) проводили, совместно с Герасимовой Ю.В (ЛИМБ ИХБФМ СО РАН). Было выявлено, что гидролиз может проходить двумя путями, первый путь: расщепление по одному сайту с

По первому пути расщепления:

¡п1: \/а1-РИе-Пе-Н|'з-Азп-РИе-1_уз-Агд-1_уз-С1у-С1у-11е-С!у-С1у-Туг-5ег-А1а-С!у-С!и-Агд-11е {УРШ^ШКСбЮСУЗАСЕт (180-200), Мг=2307 Да)

по второму пути расщепления:

¡п2:11е-С1п~Ш^у5-С1и^еи-С1п-1у5-в1п-11е-ТЬг-1уз-11е-С1п-Азп-РИе-Агд-\/а1-Туг-Туг-Агд (ЮТКЕЮКОИКЮЫРВУУУК (208-228), Мг=2698 Да) ¡пЗ: Не-С1п-А8р-А5п-8ег-А5р-Ие-1_у5-Уа1-\/а1-Рго-Агд-Агд-1.уз-А1а-1_у5-11е-11е-Агд-Азр-Туг (ШЫ501К\Л/РР^КАК11В0У (251-271), Мг=2528 Да)

Рис. 12. Пептиды, содержащие сайты гидролиза интегразы иммуноглобулинами, найденные обработкой данных масс-спектрометрии.

образованием двух продуктов с молекулярной массой 21 и 11 кДа (пептиды с 3 по 191 и 193 по 288 аминокислотной последовательности ИН). Второй путь - с двумя сайтами гидролиза в центральном и С-концевых доменах, при этом образуется один продукт с молекулярной массой 24 кДа (2-118 АК) и два продукта с Мг 3 и 5 кДа. Продукт с мол. массой 8 кДа не обнаруживается в реакционной смеси, поэтому предположили, что АТ далее расщепляют его на пептиды 5 кДа (219-261 АК) и 3 кДа (262-287 АК). Анализ полученных данных позволил установить пептиды со специфической последовательностью ИН, содержащие сайты гидролиза (рис. 12).

ВЫВОДЫ

полную реакцию интеграции, является тетрамерным комплексом со специфическими и неспецифическими ДНК; описан путь образования каталитического тетрамера, обеспечивающий специфичность действия ИН.

2. Впервые проведен детальный термодинамический и кинетический анализ закономерностей взаимодействия интегразы ВИЧ со специфическими и неспецифическими ДНК. Показано, что ИН ВИЧ-1 взаимодействует преимущественно с сахарофосфатным остовом одной из цепей любой ДНК более эффективно, чем со второй. Эффективность взаимодействия зависит от последовательности, длины и гибкости ДНК и примерно на порядок выше для специфической по сравнению с неспецифической ДНК. Высокая специфичность действия фермента обеспечивается не стадией коплексообразования, а взаимной конформационной адаптацией ИН и ДНК, которая обуславливает возрастание скорости реакции в случае специфической ДНК примерно на 7-8 порядков. Оценен относительный вклад различных звеньев ДНК в ее сродство к ферменту; взаимодействие интегразы со специфической и неспецифическими ДНК описано с помощью термодинамических моделей.

3. Впервые показано, что поликлональные и 1§М крови ВИЧ-инфицированных больных содержат небольшую фракцию антител, которые, в отличие от классических протеаз, с высокой эффективностью гидролизуют только интегразу ВИЧ, но не другие белки. Доказано, что протеолитическая активность иммуноглобулинов крови ВИЧ-инфицированных больных является их собственным свойством. Впервые показано, что суммарный пул антител может содержать в различном соотношении абзимы с активными центрами, подобными тиоловым, сериновым и металлопротеазам. Показано, что каталитические свойства антител и классических протеаз человека (сродство к субстратам, металл- и рН-зависимость, субстратная специфичность) существенно различаются. Установлено, что иммуноглобулины ВИЧ-инфицированных больных гидролизуют интегразу в центральном и С-концевом доменах белковой молекулы.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

1. Bugreev D.V., Baranova S.. Zakharova O.D., Parissi V., Desjobert C., Sottofattori E., Balbo A., Litvak S., Tarrago-Litvak L., Nevinsky G.A. Dynamic, thermodynamic, and kinetic basis for recognition and transformation of DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase // Biochemistry. -2003. -V. 42. -P. 92359247.

2. Baranova S.. Tuzikov F.V., Zakharova O.D., Tuzikova N.A. Calmels C., Litvak S., Tarrago-Litvak L., Parissi V., Nevinsky G.A. Small-angle X-ray characterization of the nucleoprotein complexes resulting from DNA-induced oligomerization of H1V-1 integrase //Nucleic Acids Res. -2007. -V. 35. -P. 975-987.

3. Баранова C.B.. Бунева B.H., Невинский Г.А. Гидролиз интегразы вируса иммунодефицита человека каталитическими антителами против вирусной интегразы // Вестник НГУ. Серия: Биология и клиническая медицина. -2007. -Т. 5.-С. 74-81.

4. Lesbats P., Metifiot P., Calmels С., Baranova S.. Nevinsky G.A., Andreola M.L., Parissi V. In vitro initial attachment of HIV-1 integrase to viral ends: control of the DNA specific interaction by the oligomerization state // Nucleic Acids Res. -2008. -V. 36.-P. 7043-7058.

Подписано в печать 13.05.2009г. Формат бумаги 60x84/16. Офсетная печать. Объем 1,1 п. л. Тираж 100 экз. Заказ №211 Редакционно-издательский центр НГУ. 630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Баранова, Светлана Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ИНТЕГРАЗА ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА.

1.1 Вирус иммунодефицита человека.

1.1.1 Общая характеристика ВИЧ.

1.1.2 Цикл репликации ретровируса ВИЧ.

1.2 Интеграза ВИЧ-1.

1.2.1 Строение и каталитические свойства ИН ВИЧ-1.

1.2.1.1 Строение каталитического домена.

1.2.1.2 Строение N-концевого домена.

1.2.1.3 Строение С-концевого домена.

1.2.1.4 Строение мутантных белков, содержащих два домена интегразы.

1.2.1.5 Структура полного фермента.

1.2.2 Взаимодействие интегразы ВИЧ-1 с олигонуклеотидами и ДНК.

1.2.2.1 Взаимодействие интегразы с ДНК.

1.2.2.1.1 Домены интегразы, отвечающие за связывание ДНК.

1.2.2.1.2 Взаимодействие интегразы с вирусной ДНК.

1.2.2.1.3 Взаимодействие интегразы с клеточной ДНК.

1.2.2.2 Взаимодействие ИН ВИЧ-1 с олигонуклеотидами.

1.2.3 Олигомеризация ИН ВИЧ-1.

1.2.3.1 Роль олигомерного состояния ИН во взаимодействии с ДНК.

1.2.4 Реакция интеграции вирусной ДНК.

1.3 Подходы к изучению механизмов узнавания ДНК ДНК-зависимыми ферментами.

1.3.1 Типы взаимодействий при узнавании ДНК различными белками и ферментами.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1 Реактивы и материалы.

2.2 Методы.

2.2.1 Элекгрофоретический анализ белков.

2.2.2 Окраска ПААГ нитратом серебра.

2 2 3 Опоеделение концентрации белков.

2.2.4 Концентрирование препаратов белка.

2.2.5 Отжиг комплементарных цепей олигонуклеотидов.

2.2.6 Получение меченого субстрата.

2.2.7 Получение Р32-меченых олигонуклеотидов с помощью Т4-полинуклеотидкиназы

2.2.8 Анализ влияния различных олигонуклеотидов на реакцию З'-процессинга.

2.2.9 Подготовка препаратов ИН для измерения методом МУРР.

2.2.10 Измерение спектров малоуглового рентгеновского рассеяния.

2.2.11 Определение олигомерных форм ИН электрофорезом в ПААГ.

2.2.12 Разделение иммуноглобулинов из крови ВИЧ-инфицированных больных.

2.2.13 Иммобилизация белка на BrCN-сефарозу.

2.2.14 Аффинная хроматография AT на ИН-сефарозе.

2.2.15 «Кислотный шок» препаратов антител.

2.2.16 Хроматография на колонке с иммобилизованными AT против легких цепей IgG человека.

2.2.17 Определение протеолитической активности антител.

2.2.18 Определение субстратной специфичности иммуноглобулинов.

2.2.19 Влияние ионов двухвалентных металлов на каталитическую активность антител

2.2.20 Определение типа протеолитической активности иммуноглобулинов с помощью ингибиторного анализа.

2.2.21 Определение оптимального значения рН реакции гидролиза интегразы.

2.2.22 Определение кинетических параметров реакции гидролиза субстрата антителами

2.2.23 Тестирование ИН-гидролизующей активности AT после электрофореза.

2.2.24 Модификация продуктов гидролиза ИН ВИЧ-антителами.

2.2.25 Метод MALDI-TOF.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Взаимодействие интегразы с различными олигонуклеотидами.

3.1.1 Взаимодействие ИН со «стандартным» субстратом.

3.1.2 Взаимодействие фермента с различными олигонуклеотидами.

3.1.2.1 Взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с неспецифическими одноцепочечными олигонуклеотидами.

3.1.2.2 Сродство ИН к неспецифическим ДНК-дуплексам.

3.1.2.3 Активация ИН специфическими олигонуклеотидами.

3.1.2.4 Сродство ИН к специфическим олигонуклеотидам.

3.1.2.5 Сродство ИН к специфическим ДНК дуплексам.

3.1.2.6 Термодинамическая модель взаимодействия ИН ВИЧ-1 со специфической последовательностью ДНК.

3 2 Влияние нуклеотидов на олигомерное состояние интегразы

3.2.1 Подбор условий проведения экспериментов методом МУРР.

3.2.3 Анализ взаимодействия ИН ВИЧ-1 с ДНК методом МУРР.

3.2.4 Кинетическая схема олигомеризации ИН.

3.2.5 Анализ кинетической схемы олигомеризации ИН.

3.2.6 Расчет радиуса инерции олигомерных форм ИН-ON.

3.2.7 Определение количества олигомерных форм ИН.

3.2.8 Гипотетическая схема взаимодействия интегразы со специфическими и неспецифическими ON.

3.3 Иммуноглобулины крови ВИЧ-инфицированных больных.

3.3.1 Выделение иммуноглобулинов класса G и М из крови ВИЧ-инфицированных больных.

3.3.2 Доказательства принадлежности каталитической активности непосредственно иммуноглобулинам.

3.3.3 Анализ сродства AT к интегразе и их субстратная специфичность.

3.3.4 Определение типа протеолитической активности AT.

3.3.5 Влияние ионов двухвалентных металлов на каталитическую активность AT.

3.3.6 Определение рН-оптимума гидролиза ИН антителами.

3.3.7 Определение кинетических параметров реакции гидролиза интегразы иммуноглобулинами.

3.3.8 Анализ продуктов гидролиза интегразы иммуноглобулинами классов G и М.

3.3.8.1 Определение продуктов гидролиза ИН электрофорезом в ПААГ.

3.3.8.2 Анализ продуктов гидролиза методом масс-спектрометрии.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК и иммуноглобулинами ВИЧ-инфицированных больных"

Взаимодействие белков с нуклеиновыми кислотами лежит в основе многих жизненно важных процессов живых организмов. Изучение механизма узнавания ДНК ферментами, а также механизма функционирования последних, позволяет проводить исследование таких важнейших процессов, как окислительный стресс, старение, патогенез, канцерогенез, генетический контроль, поддержание стабильности клеточного генома, его организации и эволюции. Интерес к ДНК-зависимым ферментам актуален еще и потому, что многие из них являются мишенями для большого числа антивирусных, антибактериальных и антираковых препаратов.

Вирус иммунодефицита человека входит в семейство ретровирусов и является возбудителем одного из самых опасных заболеваний современного общества - синдрома приобретенного иммунодефицита. Одним из направлений химиотерапии ВИЧ-инфекции является использование ингибиторов ключевых ферментов жизненного цикла ВИЧ -интегразы, обратной транскриптазы и протеазы.

Обратная транскриптаза катализирует реакцию синтеза одноцепочечной вирусной ДНК по матрице РНК. Затем с помощью этого же фермента достраивается вторая цепь ДНК. Интеграза ВИЧ осуществляет процесс встраивания двухцепочечной ДНК вируса в геном клетки хозяина, что вызывает хроническую инфекцию организма. Протеаза ВИЧ необходима для разделения длинной белковой цепочки на составные части в процессе репликации вируса.

Несмотря на то, что многие аспекты функционирования одного из ключевых ферментов вируса - интегразы достаточно хорошо изучены, все известные исследования в большинстве своем носят качественный характер, а многие количественные аспекты механизма узнавания и расщепления вирусной ДНК остаются невыясненными. Более того, с практической точки зрения такое изучение важно для поиска специфических ингибиторов интегразы.

Цель настоящей работы заключалась в анализе закономерностей взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК и иммуноглобулинами ВИЧ-инфицированных больных. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. изучение на количественном уровне характер специфических и неспецифических взаимодействий ИН ВИЧ-1 с ДНК с помощью метода последовательного усложнения структуры ДНК-лиганда. Оценка относительного вклада различных специфических и неспецифических взаимодействий ИН с ДНК в обеспечение специфичности действия фермента;

2. определение зависимости олигомерного состояния и активности интегразы от длины и структуры специфических и неспецифических олигонуклеотидов. Установление механизма образования олигомерной каталитически активной формы гЬрпмрнтя

3. проведение исследования протеолитической активности у иммуноглобулинов классов IgG и IgM из крови ВИЧ-инфицированных больных, гидролизующих ИН:

- определить сайт, по которому происходит расщепление интегразы иммуноглобулинами.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Интеграза вируса иммунодефицита человека

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Баранова, Светлана Владимировна

выводы

1. Впервые показано, что специфические олигонуклеотиды, соответствующие 3'-концевой последовательности расщепляемой цепи вирусной ДНК, активируют интегразу (ИН) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Методом малоуглового рентгеновского рассеяния показано, что под действием олигонуклеотидов образуются димерные и тетрамерные формы. Сделано предположение, что активная форма ИН, катализирующая полную реакцию интеграции, является тетрамерным комплексом со специфическими и неспецифическими ДНК; описан путь образования каталитического тетрамера, обеспечивающий специфичность действия ИН.

3. Впервые показано, что поликлональные IgG и IgM крови ВИЧ-инфицированных больных содержат небольшую фракцию антител, которые, в отличие от классических протеаз, с высокой эффективностью гидролизуют только интегразу ВИЧ, но не другие белки. Доказано, что протеолитическая активность иммуноглобулинов крови ВИЧ-инфицированных больных является их собственным свойством. Впервые показано, что суммарный пул антител может содержать в различном соотношении абзимы с активными центрами, подобными тиоловым, сериновым и металлопротеазам. Показано, что каталитические свойства антител и классических протеаз человека (сродство к субстратам, металл- и рН-зависимость, субстратная специфичность) существенно различаются. Установлено, что иммуноглобулины ВИЧ-инфицированных больных гидролизуют интегразу в центральном и С-концевом доменах белковой молекулы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Баранова, Светлана Владимировна, Новосибирск

1. Varmus H. Retroviruses // Science. 1988. V. 240. P. 1427-1428;

2. Лоуи Д.Р. Трансформация и онкогенез: ретровирусы // Вирусология. М. «Мир». 1989. Т.1.С. 433-474;

3. Rabson А.В., Martin М.А. Molecular organization of AIDS retrovirus // Cell. 1985. V. 40. P. 447—480;

4. Katz R., Skalka A. The retroviral enzymes //Annu.Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 133173;

5. Litvak S., Sarih-Cottin L., Foumier M., Andreola M., Tarrago-Litvak L. Priming of HIV replication by tRNA: role of RT // Trends. Biochem. Sci. 1994. V. 19. P. 114-118;

6. Brown P.O., Bowerman H.E., Varmus H.E., Bishop J.M. Retroviral integration: structure of the intial covalent product and its precursor, and a role for the viral integrase protein // Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 1989. V. 86. P. 2525-2529;

7. Fujivara Т., Mizunchi K. Retroviral DNA integration: structure of the integration intermediate//Cell. 1988. V. 55. P. 497-504;

8. Hazuda D.J., Wolfe A.L., Hastings J.C., Robbins H.L., Graham P.L., La Femina R.L., Emini E.A. Viral long terminal repeat binding characteristics of the HIV-1 integrase // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 3999-4004;

9. Sardana V.V., Schlabach A.J., Graham P., Bush B.L., Condra J.H., Culberson J.C., Gotlib L., Graham D.J., Kohl N.F., La Femina R.L., Schneider C.L., Wolanski B.S., Wollgang

10. J.M., Emini Е.А. HIV-1 protease inhibitors: evaluation of resistance engendered by amino acid substitutions in the enzyme's substrate binding site // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 2004-2010;

11. Hansen M.S.T., Carteau S., Hoffmann C„ Li L., Bushman F. Retroviral cDNA integration: mechanism, applications and inhibition // Genet Eng. 1998. V. 20. P. 41-61;

12. Grandgenett D.P., Vora A.C., Schiff R.D. A 32,000-dalton nucleic acid-binding protein from avian retravirus cores possesses DNA endonuclease activity // Virology. 1978. V. 89. P. 119-32;

13. Dyda F., Hickman В., Jenkins T.M., Engelman A., Craigie R., Davies D.R. Crystal structure of the catalytic domain of HIV-1 integrase: similarity to other polynucleotidyl transferases//Science. 1994. V. 266. P. 1981-1986;

14. Ariyoshi M., Vassylyev D.G., Iwasaki H., Nakamura H., Shinagawa H., Morikawa K. Atomic structure of the RuvC resolvase: a holliday junction-specific endonuclease from E. coli // Cell. 1994. V. 78. P. 1063-1072;

15. Rice P.A., Baker T.A. Comparative architecture of transposase and integrase complexes//Nat. Struct. Biol. 2001. V. 8. P. 302-307;

16. Haren L., Ton-Hoang В., Chandler M. Integrating DNA: Transposases and Retroviral lntegrases//Annu. Rev. Microbiol. 1999. V. 53. P. 245-281;

17. Engelman A., Craigie R. Efficient magnesium-dependent human immunodeficiency virus type 1 integrase activity // J. Virol. 1995. V. 69. P. 5908-5911;

18. Агапкина Ю.Ю., Приказчикова T.A., Смолов M.A., Готтих М.Б. Структура и функции интегразы ВИЧ-1 // Успехи биологической химии. 2005. Т. 45. С. 87 -122;

19. Wang C.Y., Yang C.F., Lai М.С., Lee Y.H., Lin Т.Н. Molecular dynamics simulation of a leucine zipper motif predicted for the integrase of human immunodeficiency virus type I // Biopolymers. 1994. V. 34. P. 1027-1036;

20. Vink С . Groeneqer A A., Plasterk R. Identification of the catalytic and DNA-binding1.Oregion of the human immunodeficiency virus type 1 integrase protein // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 1419-1425;

21. Polard P., Chandler M. Bacterial transposases and retroviral integrase // Mol. Microbiol. 1995. V. 15. P. 13-23;

22. Plasterk R.H.A. The HIV integrase catalytic core // Struct. Biol. 1995. V. 2. P. 87-90;

23. Lee S.P., Xiao J., Knutson J.R., Lewis M.S., Han M.K. Zn2+ promotes the self-association of human immunodeficiency virus type-1 integrase in vitro II Biochemistry. 1997. V. 36. P. 173-180;

24. Sluis-Cremer N. Tachedjian G. Modulation of the oligomeric structures of HIV-1 retroviral enzymes by synthetic peptides and small molecules // Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 5103-5111;

25. Engelman A., Craigie R. Identification of conserved amino acid residues critical for human immunodeficiency virus type 1 integrase function in vitro И J. Virol. 1992. V. 66. P. 6361-6369;

26. Bujacz G., Alexandratos J., Qing Z.-L., Clement-Mella C., Wlodawer A. The catalytic domain of human immunodeficiency virus integrase: ordered active site in the F185H mutant II FEBS Lett. 1996. V. 398. P. 175-178;

27. Leavitt A.D., Shiue L., Varmus H.E. Site-directed mutagenesis of HIV-1 integrase demonstrates effects on integrase functions in vitro II J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 21132119;

28. Yang W., Steitz T.A. Recombining the structure of HIV-1 integrase, RuvC and RNase H // Structure. 1995. V. 3. P. 131-134;

29. Goldgur Y., Dyda F., Hickman A.B., Jenkins T.M., Craigie R., Davies D.R. Three new structures of the core domain of HIV-1 integrase: an active site that binds magnesium // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1998. V. 95. P. 9150-9154;

30. Lovell S., Goryshin I.Y., Reznikoff W.R., Rayment I. Two-metal active site binding of a Tn5 transposase synaptic complex// Nature Struct. Biol. 2002. V. 9. P. 278-281;

31. Mizuuchi K. Polynucleotidyl transfer reaction in site-specific DNA recombination // Genes Cells. 1997. V. 2. P. 1-12;

32. Mizuuchi K. Polynucleotidyl transfer reaction in transpositional DNA recombination // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 21273-21276;

33. Wang J.-Y., Ling H, Yang W., Craigie R. Structure of a two-domain fragment of HIV-1 integrase: implications for domain organization in the intact protein IIEMBO J. 2001. V. 20. P. 7333-7343;

34. Zheng R., Jenkins T.M., Craigie R. Zinc folds the N-terminal domain of HIV-1 integrase, promotes multimerization, and enhances catalytic activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 13659-13664;

35. Vincent K.A., Ellison V., Chow S.A., Brown P.O. Characterization of human immunodeficiency virus type 1 integrase expressed in Escherichia со//' and analysis of variants with amino-terminal mutations // J. Virol. 1993. V. 67. P. 425-437;

36. Turner B.G., Summers M.F. Structural biology of HIV//J. Mol. Biol. 1999. V. 285. P.1.32;

37. Cai M., Zheng R., Caffrey M., Graigie R., Clore G.M., Granenborn A.M. Solution structure of the N-terminal zinc binding domain of HIV-1 integrase // Nature Struct. Biol. 1997. V. 4. P. 567-577;

38. Woerner A.M., Marcus-Sekura C.J. Characterization of a DNA binding domain in the C-terminus of HIV-1 integrase by deletion mutagenesis // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21. P. 3507-3511;

39. Katzman M., Sudol M. Mapping viral DNA specificity to the central region of integrase by using functional human immunodeficiency vims type 1/visna virus chimeric proteins // J. Virol. 1998. V. 72. P. 1744-1753;

40. Puras Lutzke R.A., Vink C., Plasterk R. Characterization of the minimal DNA-binding domain of the HIV integrase protein // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 4125-4131;

41. Lodi P.J., Ernst J.A., Kuszewski J., Hickman A.B., Engelman A., Craigie R. Clore G.M., Gronenborn A.M. Solution structure of the DNA-binding domain of HIV-1 integrase // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 9826-9833;

42. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот // М. «Мир».1987.

43. Luca L.D., Pedretti A., Vistoli G., Barreca M.L., Villa L., Monforte P., Chimirria A. Analysis of the full-length integrase-DNA complex by a modified approach for DNA docking // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 310. P. 1083-1088;

44. Podtelezhnikov A.A., Gao K., Bushman F.D., McCammon J.A. Modeling HIV-1 integrase complexes based on their hydrodynamic properties // Biopolymers. 2003. V. 68. P. 110-120;

45. Karki R.G., Tang Y., Burke T.R., Nicklaus M.C. Model of full-length HIV-1 integrase complexed with viral DNA as template for anti-HIV drug design // J. Comput.-Aided Mol. Design. 2004. V.18. P. 739-760;

46. Wijitkosoom A., Tonmunphean S., Truong T.N., Hannongbua S. Structural and dynamical properties of a full-length HIV-1 integrase: molecular dynamics simulations // J. Biomol. Struct. Dyn. 2006. V. 23. P. 613-24;

47. Mazumder A., Neamati N. Pilon A.A., Sunder S., Pommier Y. Chemical trapping of ternary complexes of HIV-1 integrase, Me2+ and DNA substrates // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 27330-27338;

48. LaFemina R.L., Callahan P.L., Cordingley M.G. Substrate specifity of recombinant human immunodeficiency virus integrase protein // J. Virol. 1991. V. 65. P. 5624-5630;

49. Khan E., Mack J.P.G., Katz R.A., Kulkosky J., Skalka A.M. Retroviral integrase domains: DNA binding and the recognition of LTR sequences // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 851-860;

50. Engelman A., Hickman A.B., Craigie R. The core and carboxyl-terminal domains of the integrase protein of human immunodeficiency virus type 1 each contribute to nonspecific DNA binding // J. Virol. 1994. V. 68. P. 5911-5917;

51. Gerton J.L., Brown P.O. The core domain of HIV-1 integrase recognizes key features of its DNA substrates // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 25809-25815;

52. Schauer M., Billich A. The N-terminal region of HIV-1 integrase is required for integration activity, but not for DNA binding // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. V. 185. P. 874-880;

53. Woerner A.M., Klutch M., Levin J.G., Marcus-Sekura C.J. Localization of DNA binding activity of HIV-1 integrase to the C-terminal half of the protein // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1992. V. 8. P. 297-304;

54. Shibagaki Y., Holmes M.L., Appa R.S., Chow S.A. Characterization of feline immunodeficiency virus integrase and analysis of functional domains //Virology. 1997. V. 230. P. 1-10;

55. Sherman P.A., Dickson M.L., Fyfe J.A. Human immunodeficiency virus type 1 integrase protein: DNA sequence requirements for cleaving and joining reaction // J. Virol. 1992 V 66 P 3593-3601:

56. Vink С., van Gent D.C., Elgersma Y., Plasterk R.H. Human immunodeficiency virus integrase protein requires a subterminal position of its viral DNA recognition sequence for efficient cleavage // J. Virol. 1991. V. 65. P. 4636-4644;

57. Mazumder A., Pommier Y. Processing of deoxyuridine mismatches and abasic sites by human immunodeficiency virus type-1 integrase // Nucleic Acids. Res. 1995. V. 23. P. 28652871;

58. Scottoline B.P., Chow S., Ellison V., Brown P.O. Disruption of the terminal base pairs of retroviral DNA during integration // Genes & Development. 1997. V. 11. P. 371-382;

59. Bushman F.D., Craigie R. Integration of human immunodeficiency virus DNA: adduct interference analysis of required DNA sites // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 34583462;

60. Bushman F.D., Craigie R. Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. P. 1339-1343;

61. Sherman P., Fyfe J.A. Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1990. V. 87. P. 5119-5123;

62. Katzman M., Sudol M. Influence of subterminal viral DNA nucleotides on differential susceptibility to cleavage by human immunodeficiency virus type 1 and visna virus integrases // J. Virol. 1996. V. 70. P. 9069-9073;

63. Wang Т., Balakrishnan M., Jonsson C.B. Major and minor groove contacts in retroviral integrase LTR interactions // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 3624-3632;

64. Esposito D., Craigie R. Sequense specifity of viral end DNA binding by HIV-1 integrase reveals critical regions for protein DNA interactions // EMBO J. 1998. V. 17. P. 58325843:

65. Jenkins T.M., Esposito D., Engelman A., Craigie R. Critical contacts between HIV-1 integrase and viral DNA identified by structure-based analysis and photo-crosslinking // EMBO J. 1997. V. 16. P. 6849-6859;

66. Shih C.-C., Stoye J.S., Coffin J.M. Highly preferred targets for retrovirus integration // Cell. 1988. V. 53. P. 531-537;

67. Withers-Ward E.S., Kitamura Y., Barnes J.P., Coffins J.M. Distribution of targets for avian retrovirus DNA integration in vivo // Genes Dev. 1994. V. 8. P. 1473-1487;

68. Famet C.M., Wang В., Lipford J.R., Bushman F.D. Differential inhibition of HIV-1 preintegration complexes and purified integrase protein by small molecules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 9742-9747;

69. Miller M.D., Bor Y.-C., Bushman F. Target DNA capture by HIV-1 integration complexes//Curr. Biol. 1995. V. 5. P. 1047-1055;

70. Kitamura Y., Lee Y.M.H., Coffin J.M. Nonrandom integration of retroviral DNA in vitro: Effect of CpG methylation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 5532-5536;

71. Pryciak P.M., Varmus H.E. Nucleosomes, DNA-binding proteins, and DNA sequences modulate retroviral integration target site selection // Cell. 1992. V. 69. P. 769-780;

72. Fitzgerald M.L., Grandgenett D.P. Retroviral integration: in vitro host site selection by avian integrase//J. Virol. 1994. V. 68. P. 4314-4321;

73. Hong Т., Murphy E., Groarke J., Drlica K. Human immunodeficiency virus type 1 DNA integration: Fine structure target analysis using synthetic oligonucleotides // J. Virol. 1993. V. 67. P. 1127-1131;

74. Pmss D., Reeves R., Bushman F.D., Wolffe A.P. The influence of DNA and nucleosome structure on integration events directed by HIV integrase // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 25031-25041;

75. Craigie R. Hotspots and warm spots: integration specifity of retroelements//Trends Genet. 1992. V. 8. P. 187-190;

76. Katz R.A., Gravuer K., Skalka A.M. A preferred target DNA structure for retroviral integrase in vitro И J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 24190-24195;

77. Kalpana G.V., Marmon S., Wang W., Crabtree G.R., Goff S.P. Binding and stimulation of HIV-1 integrase by a human homolog of yeast transcription factor SNF5 // Science. 1994. V. 266. P. 2002-2006;

78. Yoshinaga Т., Kimura-Ohtani Y., Fujiwara T. Detection and characterization of a functional complex of human immunodeficiency virus type 1 integrase and its DNA substrate by1.U

79. UV cross-linking // J. Virol. 1994. V. 68. P. 5690-5697;

80. Miller M.D., Farnet C.M., Bushman F.D. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition // J. Virol. 1997. V. 71. P. 5382-5390;

81. Vink C., Lutzke R.A., Plasterck R.H. Formation of a stable complex between the human immunodeficiency virus integrase protein and viral DNA // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 4103-4110;

82. Vora A.C, Grandgenett D.P. Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration // J. Virol.1995. V. 69. P. 7483-7488;

83. Bouziane M., Cherny D.I., Mouscadet J.-F., Auclair C. Alternate strand DNA triple helix-mediated inhibition of HIV-1 U5 long terminal repeat integration in vitro II J. Biol. Chem.1996. V. 271. P. 10359-10364;

84. Brodin P., Pinskaya M., Volkov E., Romanova E., Leh H., Auclair C., Mouscadet J.-F., Gottikh M. Branched oligonucleotide-intercalator conjugate forming a parallel stranded structure inhibits HIV-1 integrase // FEBS Lett. 1999. V. 460. P. 270-274;

85. Mazumder A., Neamati N., Ojwang J.O., Sunder S., Rando R.F., Pommier Y. Inhibition of the human immunodeficiency virus type 1 integrase by guanosine quartet structures // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 13762-13771;

86. Пинская М.Д., Бродин П., Романов Е.А., Волков Е.М., Мускадет Ж.-Ф., Готтих М.Б. Ингибирование интеграции ДНК вируса иммунодефицита человека модифицированными олигонуклеотидами // Молекуляр. биология. 2000. Т. 34. С. 10391045;

87. Rando R.F., Ojwang J., Elbaggari A., Reyes G., Tinder R., McGrath M.S., Hogan M.E. Suppression of human immunodeficiency virus type 1 activity in vitro by oligonucleotides which form intramolecular tetrads//J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 1754-1760;

88. Bishop J.S., Guy-Caffey J.K., Ojwang J.O., Smith S.R., Hogan M.E., Cossum P.A., Rando R.F., Chaudhary N. Intramolecular G-quartet motifs confer nuclease resistance to a potent anti-HIV oligonucleotide // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 5698-5703;

89. Агапкина Ю.Ю., Ташлицкий B.H., Депрез E., Брокон Ж.-С., Шугалий А.В., Маускадет Ж.-Ф., Готтих М.Б. Изучение взаимодействий гетероциклических оснований ДНК ВИЧ-1 с вирусной интегразой // Молекуляр. биология. 2004. Т. 38. С. 848-857;

90. Petit С., Schwartz О., Mammano F. Oligomerization within virions and subcellular localization of human immunodeficiency virus type 1 integrase // J. Virology. 1999. P. 50795088

91. Esposito D., Craigie R. HIV integrase structure and function //Adv. Virus Res. 1999. V. 52. P. 319-333;

92. Cherepanov P., Maertens G., Proost P., Devreese В., Van Beeumen J., Engelborgh Y., De Clercq E., Debyser Z. HIV-1 integrase forms stable tetramers and associates with LEDGF/p75 protein in human cells // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 372-381;

93. Deprez E., Tauc P., Leh H., Mouscadet J.-F., Auclair C., Brochon J.-C. Oligomeric state of the HIV-1 integrase as measured by time-resolved fluorescence anisotropy // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 9275-9284;

94. Faure A., Calmels C., Desjobert C., Castroviejo M., Caumont-Sarcos A., Tarrago-Litvak L., Litvak S.-, Parissi V. HIV-1 integrase crosslinked oligomers are active in vitro II Nucleic Acids. Res. 2005. V. 33. P. 977-986;

95. Vercammen J., Maertens G., Gerard M., De Clercq E., Debyser Z., Engelborghs Y. DNA-induced polymerization of HIV-1 integrase analyzed with fluorescence fluctuation spectroscopy // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 38045-38052;

96. Kulkosky J., Skalka M. Molecular mechanism of retroviral DNA integration // Pharmac. Ther. 1994. V. 61. P. 185-203;

97. Ellison V., Brown P.O. A stable complex between integrase and viral DNA ends mediates human immunodeficiency virus integration in vitro II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 7316-7320;

98. Asante-Appiah E., Seeholzer S.H., Skalka A.M. Structural determinants of metal-induced conformational changes in HIV-1 integrase // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 3507835087;

99. Gao K., Butler S.L., Bushman F. Human immunodeficiency virus type 1 integrase: arrangement of protein domains in active cDNA complexes // EMBO J. 2001. V. 20. P. 35653576;

100. Li M., Craigie R. Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 29334-29339;

101. Li M., Mizuuchi M., Burke T.R., Craigie R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates // EMBO J. 2006. V. 25. P. 1295-1304;

102. Chen A., Weber I.T., Harrison R.W., Leis J. Identification of amino acids in HIV-1 and avian sarcoma virus integrase subsites required for specific recognition of the long terminal repeat ends //J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 4173-4182;

103. Wielens J., Crosby I.Т., Chalmers D.K. A three-dimensional model of the human immunodeficiency virus type 1 integration complex // J. Comput. Aided Mol. Des. 2005. V. 19. P. 301-317;

104. Parissi V., Calmels C., De Soultrait V.R., Caumont A., Fournier M., Chaignepain S., Litvak S. Functional interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase with human and yeast HSP60 // J. Virol. 2001. V. 75. P. 11344-11353;

105. Невинский Г.А. Ропь спабых специфических и неспецифических взаимодействий в узнавании и превращении ферментами протяженных ДНК // Мопекуляр. биология. 2004. Т. 38. С. 756-785;

106. Невинский Г.А. Важная роль слабых взаимодействий при узнавании ферментами протяженных -молекул ДНК и РНК // Молекуляр. биология. 1995. Т. 29. С. 1637;

107. Nevinsky G.A., Veniaminova A.G., Levina A.S., Podust V.N., Lavrik O.I., Holler E. Structure-function analysis of mononucleotides and short oligonucleotides in the priming of enzymatic DNA synthesis // Biochmistry. 1990. V. 29. P. 1200-1207;

108. Лаврик О.И., Невинский Г.А. Белок-нуклеиновые взаимодействия в реакциях полимеризации, катализируемых ДНК-полимеразами про- и эукариот // Биохимия. 1989. Т. 54. С. 757-764;

109. Лаврик О.И., Невинский Г.А. Аффинная модификация ферментов: проблемы и перспективы // Итоги науки и техники. Сер. Биоорган, химия. 1987. Т. 13. М. ВИНИТИ. С. 3-172;

110. Knorre D.G., Lavrik O.I., Nevinsky G.A. Protein-nucleic acid interaction in reactions catalyzed with DNA polymerases // Biochimie. 1988. V. 70. P. 655-661;

111. Knorre D.G., Godovikova T.I., Nevinsky G.A. Evolutionary biochemistry and related areas of physicochemical biology // Bach institute of biochemistry and ANCO. 1995. P. 297320;

112. Ищенко А.А., Булычев Н.В., Максакова Г.А., Джонсон Ф., Невинский Г.А. Взаимодействие 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы из Escherichia coli с одноцепочечными дезоксиолигонуклеотидами и их комплексами // Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. С. 549558;

113. Белоглазова Н.Г., Лохова И.А., Максакова Г.А., Цветков И.В., Невинский Г.А. Апурин/апиримидиновая эндонуклеаза из плаценты человека. Узнавание ферментом апуринизированной ДНК// Молекуляр. биология. 1996. Т. 30. С. 220-230;

114. Колочева Т.И., Демидов С.А., Максакова Г.А., Невинский Г.А. Взаимодействие эндонуклеазы EcoRI с короткими специфическими и неспецифическими олигонуклеотидами // Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. С. 865-872;

115. Bugreev D.V., Vasyutina E.L., Kolocheva T.I., Buneva V.N., Andoh Т., Nevinsky G.A. Interaction of human DNA topoisomerase I with specific sequence oligodeoxynucleotides // Biochimie. 1998. V. 80. P. 303-308;

116. Bugreeva I.P., Bugreev D.V., Nevinsky G.A. Formation of nucleoprotein RecA filament on single-stranded DNA. Analysis by stepwise increase in ligand complexity // FEBS J. 2005. V. 272. P. 2734-2745;

117. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Nucleic Acids // New York. "CRC Press". 1975. V. 1. P. 589;

118. Горн В.В., Зарытова В.Ф., Потемкин Г.А., Средин Ю.Г., ПолищукА.С. Синтез 5'-фосфорилированных олигодезоксирибонуклеотидов фосфотриэфирным твердофазным методом в ручном и автоматическом вариантах // Биоорган, химия. 1986. Т. 12. С. 10541062;

119. Мудраковская А.В., Ямковой В.И. РНК-лигаза бактериофага Т4. VIII. Твердофазный ферментативный синтез олигорибонуклеотидов // Биоорган, химия. 1991. Т. 17. С. 819-822;

120. Koziolkiewicz М., Wilk A. Oligodeoxyn'bonucleotide phosphotriesters // Methods Mol. Biol. 1993. V. 20. P. 207-224;

121. Eritja R., Walker P.A., Randall S.K., Goodman M.F., Kaplan B.E. Synthesis of oligonucleotides containing the abasic site model compound 1,4-anhydro-2-deoxy-D-ribitol // Nucleosides & Nucleotides. 1987. V. 6. P. 803-814;

122. Nevinsky G.A., Kit Y., Semenov D.V., Khlimankov D., Buneva V.N. Secretory immunoglobulin A from human milk catalyzes milk protein phosphorylation // Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. V. 75. P. 77-91;

123. Kanyshkova T.G., Babina S.E., Semenov D.V., Isaeva N., Vlassov A.V., Neustroev K.N., Kul'minskaya A.A., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Multiple enzymic activities of human milk lactofemn // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 3353-3361;

124. Невинский Г.А., Канышкова Т.Г., Бунева B.H., Природные каталитические антитела (абзимы) в норме и при патологии // Биохимия. 2000. Т.65. С. 1473-1487;

125. Андриевская О.А. РНК-гидролизующие антитела из сыворотки крови больных системной красной волчанкой. Диссертация на соискание уч. степени канд. хим. наук. 1998. Новосибирск;

126. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4//Nature. 1970. V. 227. P. 680-685;

127. Merril C.R., Goldman D., van Keuren M.L. Gel protein stains: silver stain // Methods Enzymol. 1984. V. 104. P. 441-447;

128. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) // М. "Наука". 1981. С. 90-94;

129. Фримелль Г. Иммунологические методы // М. «Медицина». 1987;

130. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика // М. «Мир».1991;

131. Каггап P., Lindahl Т. Enzymatic excision of free hypoxanthine from polydeoxynucleotides and DNA containing deoxyinosine monophosphate residues // J. Biol. Chem 1978 V. 253. P. 5877-5879;

132. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование//М. «Мир». 1984. С. 132.

133. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов II М. «Мир». 1980. С. 109-210;

134. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики // М. «Мир». 1979;

135. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты // М. «Мир». 1982. С. 1120;

136. Zhang X., Shi L„ Shu S., Wang Y.f Zhao K., Xu N., Liu S., Roepstorff P. An improved method of sample preparation on anchorchip targets for MALDI-MS and MS/MS and its application in the liver proteome project // Proteomics. 2007. V. 7. P. 2340-2349;

137. Кирпота O.O., Жарков Д.О., Бунева B.H., Невинский Г.А. Взаимодействие 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека с одно- и двухцепочечными ДНК И Молекуляр. биология. 2006. Т. 40. С. 1055-1063;

138. Бугреев Д.В., Бунева В.Н., Синицина О.И., Невинский Г.А. Механизм узнавания суперскрученной ДНК эукариотическими топоизомеразами первого типа I. Взаимодействие ферментов с неспецифическими олигонуклеотидами // Биоорган, химия. 2003. Т.29. С. 163-174;

139. Breslauer K.J., Frank R., Blocker H., Marky L.A. Predicting DNA duplex stability from the base sequence// Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1986. V. 83. P. 3746-3750;

140. Asante-Appiah E., Skalka A.M. A metal-induced conformational change and activation in HIV-1 integrase // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 16196-16205;

141. Yi J., Asante-Appiah E., Skalka A.M. Divalent cations stimulate preferential recognition of viral DNA end by HIV-1 integrase // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 8458-8468;

142. Susk D., Oefner C. Structure of DNase I at 2,0 A resolution suggests a mechanism for binding to and cutting DNA // Nature. 1986. V. 321. P. 620-625.

143. Bera S., Vora A.C., Chiu R., Heyduk Т., Grandgenett D.P. Synaptic complex formation of two retrovirus DNA attachment sites by integrase: a fluorescnce energy transfer study// Biochemistry. 2005. V. 44. P. 15106-15114;

144. Свергун Д.И., Фейгин Jl.А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние // М. «Наука». 1986. С. 280;

145. Tuzikov F.V., Zinoviev V.V., Vavilin V.I., Malygin E.G. Small-angle X-ray scattering study of enzyme-substrate interaction in solution // Studia Biophisica. 1988. V. 125. P. 169-172;

146. Tuzikov F.V., Zinoviev V.V., Vavilin V.I., Malygin E.G. Application of the small-angle X-ray scattering technique for the study of the two-step equilibrium enzyme-substrate interactions// Biopolymers. 1996. V. 38. P. 131-139;

147. Tuzikov F.V., Tuzikova N.A., Galimov R.V., Panin L.E., Nevinsky G.A. General model to describe the structure and dynamic balance between different human serum lipoproteins and its practical application // Med. Sci. Monit. 2002. V. 8. P. 79-88;

148. Gill P.E., Murray W., Wrighe M.H. Practical optimization //Academic Press. London. New York. Toronto. Sydney. San Francisco. 1981;

149. Невинский Г.А., Семенов Д.В., Бунева B.H. Каталитически активные антитела (абзимы), индуцированные химически стабильными аналогами переходных состояний (обзор) // Биохимия. 2000. Т. 65. С. 1459-1472;

150. Невинский Г.А., Канышкова Т.Г., Семенов Д.В., Бунева В.Н. Каталитически активные антитела и их возможная биологическая функция // Докл. РАМН. 2001. Т. 2. С. 38-45;

151. Nevinsky G.A., Favorova О.О., Buneva B.N. Catalytic antibodies: New characters in the protein repertoire in protein-protein interactions // A molecular cloning manual (Golemis E., ed.). New York. Cold Spring Harbor Lab. Press. 2002. P. 523-534;

152. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Human catalytic RNA- and DNA-hydrolyzing antibodies //J. Immunol. Methods. 2002. V. 269. P. 235-249;

153. Nevinsky G.A., Buneva, V.N. Catalytic antibodies in healthy humans and patients with autoimmune and viral pathologies // J. Cell. Mol. Med. 2003. V.7. P. 265-276;

154. Nevinsky G.A., Buneva V.N. Natural catalytic antibodies-abzymes // Catalytic antibodies. (Keinan E., ed.). VCH-Wiley press. 2005. Germany. P. 503-567;

155. Фаучи Э., Лэйн К., Внутренние болезни по Тинсли Р. Харрисону, гл. 308 // «Практика». 2002;

156. Одинцова Е.С., Харитонова М.А., Барановский А.Г., Сизякина Л.П., Бунева В.Н., Невинский Г.А. Протеолитическая активность IgG антител из крови больныхсиндромом приобретенного иммунодефицита человека // Биохимия. 2006. Т. 71. С. 320332;

157. Одинцова Е.С., Харитонова М.А., Барановский А.Г., Сизякина Л.П., Бунева В.Н., Невинский Г.А. ДНК-гидролизующие IgG антитела из крови больных синдромом приобретенного иммунодефицита человека // Молекуляр. биология. 2006. Т. 40. С. 857864;

158. Buneva V.N., Kanyshkova T.G., Vlassov A.V., Semenov D.V., Khlimankov D„ Breusova L.R., Nevinsky G.A. Catalytic DNA- and RNA-hydro!yzing antibodies from milk of healthy human mothers //Appl. Biochem. Biotechnol. 1998. V. 75. P. 63-76;

159. Андриевская O.A., Бунева B.H., Забара В.Г., Наумов В.А., Ямковой В.И., Невинский Г.А. Иммуноглобулины класса М из сыворотки крови больных системной красной волчанкой эффективно расщепляют РНК // Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. С. 908-915;

160. Shuster A.M., Gololobov G.V., Kvashuk O.A., Bogomolova A.E., Smirnov I.V., Gabibov A.G. DNA hydrolyzing autoantibodies//Science. 1992. V. 256. P. 665-667;

161. Gabibov A.G., Gololobov G.V., Makarevich O.I., Schourov D.V., Chemova E.A., Yadav R.P. DNA-hydrolyzing autoantibodies //Appl. Biochem. Biotechn. 1994. V. 47. P. 293302;

162. Белки и пептиды. Под. ред. Иванова В.В., Липкина В.М. // М.: "Наука". 1995. Т. 1. С. 145-182;

163. Szentivanyi A. The beta-adrenergic theory of the atopic abnormality in bronhial asthma // J. Allergy. 1968. V. 42. P. 203-232;

164. Boushey H.A., Holtzman M.J., Shelter J.R., Nadel J.A. Bronhial hyperreactivity // Am. Rev. Respir. Dis. 1980. V. 121. P. 389-423;

165. Paul S., Erian P., Said S.!. Autoantibody to vasoactive intestinal peptide in human circulation // Biochem. Biophis. Res. Commun. 1985. V. 130. P. 479-485;

166. Paul S., Mei S., Mody В., Eklund S.H., Beach C.M., Massey R.J., Hamel F. Cleavage of vasoactive intestinal peptide at multiple sites by autoantibodies // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 16128-16134;

167. Paul S., Voile D.J., Beach C.M., Johnson D.R., Powell M.J., Massey R.J. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody // Science. 1989. V. 244. P. 1158-1162;

168. Odintsova E.S., Buneva V.N., Nevinsky G.A. Casein-hydrolyzing activity of slgA antibodies from human milk // J. Mol. Recognit. 2005. V. 18. P. 413-421;

169. SavePev A.N., Kanyshkova T.G., Kulminskaya A.A., Buneva V.N., Eneyskaya E.V., Filatov M.V., Nevinsky G.A., Neustroev K.N. Amylolytic activity of IgG and slgA immunoglobulins from human milk // Clin. Chim. Acta. 2001. V. 314. P. 141-152;

170. Andrievskaia O.A., Buneva V.N., Zabara V.G., Naumov V.A., lamkovoi V.I., Nevinskii G.A. Catalytic heterogeneity of polyclonal RNA-hydrolyzing IgM from sera of patients with lupus erythematosus // Med. Sci. Monit. 2000. V. 6. P. 460-^470;

171. Bangale Y., Karle S., Planque S., Zhou Y.-X., Taguchi H., Nishiyama YM Li L., Kalaga R., Paul S. Phase autoantibodies in Fas-defective mice and patients with autoimmune disease 11FASEB J. 2003. V. 17. P. 628-635;

172. Li L., Paul S., Tyutyulkova S., Kazatchkine M.D., Kaveri S. Catalytic activity of anti-thyroglobulin antibodies // J. Immunology. 1995. V. 154. P. 3328-3332;

173. Catalytic antibodies. Edited by Keinan E. // Weinleim Wiley-VCH Vertag GmbH&Co. 2005. P. 1-586;

174. Paul S., Li L., Kalaga R„ Wilkins-Stevens P., Stevens F.J., Solomon A. Natural catalytic antibodies: peptide-hydrolyzing activities of Bence Jones proteins and VL fragment // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 15257-15261;

175. Bizub-Bender D., Kulkosky J., Skalka A.-M. Monoclonal antibodies against HIV type 1 integrase: clues to molecular structure //AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1994. V. 10. P. 11051115;

176. Yi J., Arthur J.W., Dunbrack R.L.Jr., Skalka A.-M. An inhibitory monoclonal antibody binds at the turn of the helix-turn-helix motif in the N-terminal domain of HIV-1 integrase // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 38739-38748;

Информация о работе

Баранова, Светлана Владимировна
кандидата химических наук
Новосибирск, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Механизмы взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК и иммуноглобулинами ВИЧ-инфицированных больных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы