Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический полиморфизм области гена pol, кодирующей протеазу и интегразу ВИЧ-1 в популяциях вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетический полиморфизм области гена pol, кодирующей протеазу и интегразу ВИЧ-1 в популяциях вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации"

На правах рукописи

Гафарова Ирина Эриковна

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ОБЛАСТИ ГЕНА pol, КОДИРУЮЩЕЙ ПРОТЕАЗУ И ИНТЕГРАЗУ ВИЧ-1 В ПОПУЛЯЦИЯХ ВИРУСОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

0Ö4615624

03.01.03.-молекулярная биология

- 2 ДЕК 2010

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2010

004615624

Работа выполнена в ФГУ НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Доктор биологических наук, профессор

Гараев Мансур Мухамедович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

Доктор биологических наук, профессор

Тарантул Вячеслав Залманович

Доктор биологических наук

Казеннова Елена Валерьевна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

ФГУ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России

Защита состоится «/£_».

'<.сО 2010г. в.

/г

на заседании диссертационного Совета Д.001.20.01 при ФГУ НИИ вирусологии

им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России (адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан

«/¿Р » иел^и? 2ою г.

Ученый секретарь диссертационного Совета Доктор медицинских наук

Е. И. Бурцева

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.

ВИЧ-инфекция - остается одной из наиболее актуальных проблем, вставших перед человечеством в конце XX века. Количество новых случаев ВИЧ-инфекции, показатель зараженности населения, удельный вес женщин среди ВИЧ-инфицированных, общее число детей с ВИЧ-1, смертей от СПИДа (синдром приобретенного иммунодефицита) продолжает возрастать как в целом мире, так и на территории нашей страны.

Использование высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) способствует снижению прогрессии заболевания и супрессии вирусной репликации. Современная ВААРТ позволяет значительно увеличивать продолжительность и качество жизни ВИЧ-инфицированных пациентов. Однако, широкое использование антиретровирусных препаратов (АРП) приводит к развитию лекарственной устойчивости, что обусловлено высокой частотой появления спонтанных мутаций в геноме ВИЧ-1. Описанные мутации устойчивости вируса к лекарственным препаратам, применяемых в химиотерапии при ВИЧ-инфекции, расположены в области гена pol, которая является одной из самых консервативных в геноме ВИЧ-1 и обеспечивает вирусную репликацию и морфогенез.

Ген pol ВИЧ-1 кодирует три специфических фермента: обратную транскриптазу (ОТ), вирусную протеазу (ВП) и интегразу (ИН). Мутации, возникающие в процессе антиВИЧ-терапии, можно разделить на два типа. Первые сами являются причиной лекарственной устойчивости и считаются первичными, в то время как другие мутации являются вторичными, или компенсаторными. Компенсаторные мутации могут быть ассоциированы с резистентностью только в том случае, если они присутствуют в комбинации с первичными мутациями устойчивости.

В зависимости от принципа действия и мишени современные АРП делятся на несколько классов: ингибиторы ОТ (нуклеозидные - НИОТ, ненуклеозидные - ННИОТ), ингибиторы протеазы (ИП), ингибиторы интегразы

(ИИН) и ингибиторы слияния. Первыми успешно апробированными клиническими препаратами против ВИЧ-1 стали ингибиторы ОТ нуклеозидной природы (азидотимидин или AZT, одобренный в 1987 г.). Однако, как показала практика, использование одного класса ингибиторов оказалось неэффективным. По этой причине предпочтение стали отдавать комбинированным схемам терапии, в частности одновременному использованию ингибиторов ОТ и ИП. Комбинированная терапия значительно улучшает качество жизни пациентов за счет поддержания иммунной системы на уровне, препятствующем возникновению оппортунистических инфекций.

Ранее нами был проведен анализ генетического полиморфизма области гена pol, кодирующей ОТ ВИЧ-1 в когорте ВИЧ-инфицированных, имеющих в качестве источника заражения единственного пациента «О», а также проведена оценка уровня лекарственной устойчивости у пациентов, получающих химиотерапию ингибиторами обратной транскриптазы (Пазилин, 2007). В настоящей работе нами проведен анализ генетической изменчивости области гена pol ВИЧ-1, кодирующей ВП и ИН у пациентов, получающих химиотерапию, в том числе и ингибиторами протеазы (ИП). По литературным данным основные сведения об описанных мутациях устойчивости к ИП были получены на основе изучения различных резистентных вариантов ВИЧ-1 субтипа В, редко встречающегося на территории Российской Федерации (РФ). В отношении других субтипов ВИЧ-1 эти сведения носят отрывочный характер, поэтому нами была уточнена локализация мутаций лекарственной устойчивости в области гена pol, кодирующей ВП у вариантов вируса, циркулирующих на территории России.

В настоящее время на территории РФ предполагается широкое использование в лечении ВИЧ-инфекции ингибиторов ИН (ИИН). В связи с этим мы провели анализ генетического полиморфизма этого участка генома ВИЧ-1 и выявили наличие предсуществующих мутаций устойчивости к ИИН в нелеченых популяциях.

Подавляющее большинство ВИЧ-позитивных в России инфицированы вариантами вируса субтипа А (вспышка 1996 г.) и субтипа G (Ростово-Элистинская вспышка в 1989 г.). Настоящее исследование было проведено на двух группах пациентов. Первую группу составили пациенты внутрибольничной вспышки ВИЧ-инфекции в г. Ростов-на-Дону и г. Элисты (субтип G), вторую исследуемую группу составили пациенты Липецкой области (субтип А).

Исследование генетического полиморфизма, эволюции ВИЧ-1 и молекулярно-эпидемиологический мониторинг распространения ВИЧ-инфекции на территории РФ являются базисными для создания эффективных вакцин, диагностических тестов и новых лекарственных препаратов, способствует развитию новых подходов лечения ВИЧ-инфекции, в частности, использование ИИН.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования было изучение генетического полиморфизма области гена pol, кодирующей протеазу и интегразу ВИЧ-1. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить первичные нуклеотидные последовательности гена pol, кодирующие протеазу и интегразу ВИЧ-1 в популяциях вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации.

2. Провести анализ генетического полиморфизма области гена pol, кодирующей протеазу и интегразу ВИЧ-1: оценка уровня генетической изменчивости, характер и распределение мутаций.

3. Провести сравнение степени полимофизма гена интегразы ВИЧ-1 в популяциях вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации.

4. Провести анализ наличия мутаций устойчивости к ингибиторам протеазы и ингибиторам интегразы в исследуемых популяциях вирусов.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих протеазу и интегразу ВИЧ-1, от пациентов юга России (г. Ростов-на-Дону и г. Элиста) и Липецкой области.

2. Разработана система праймеров, позволяющая амплифицировать полноразмерные гены, кодирующие протеазу и интегразу ВИЧ-1.

3. Полученные нуклеотидные последовательности, кодирующие протеазу и интегразу ВИЧ-1, депонированы в GeneBank.

4. Мутации устойчивости в протеазе ВИЧ-1, обеспечивающие резистентность к ингибиторам протеазы, у вариантов вируса субтипа G не отличаются от мутаций, характерных для вариантов вируса субтипа В. Единственным исключением является замена I54V/L, которая возникает у вариантов вируса субтипа G при использовании нелфинавира (NFV), в отличие от вирусов субтипа В.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Область гена pol, кодирующая протеазу ВИЧ-1, имеет низкий уровень генетической изменчивости (2,9%). Замены, возникающие в протеазе ВИЧ-1, имеют синонимический характер.

2. Мутации, возникающие при терапии ингибиторами протеазы у вариантов вируса субтипа G, не отличаются от соответствующих замен, характерных для субтипа В.

3. Функционально значимые участки интегразы ВИЧ-1 (район «цинковые пальцы»; DDE-мотив; «шарнирная петля»; аминокислоты, формирующие гидрофобную поверхность) являются высоко консервативными.

4. В популяциях ВИЧ-инфицированных пациентов, которые не подвергались действию ингибиторов интегразы, присутствуют мутации, потенциально ассоциированные с резистентностью к этому классу препаратов.

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 124 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержит 22 таблицы и 20 рисунков. По результатам работы опубликованы 2 печатные работы.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва, 25 марта 2010 г.); на «Ш-ей Ежегодной конференции молодых ученых НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН» (Москва, 20 апреля 2010 г.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве основной модели для проведения данного исследования являлись следующие группы ВИЧ-инфицированных: 1) пациенты нозокомиальных очагов юга России; 2) пациенты Липецкой области.

Первая группа пациентов была образована в 1988-1989 годах за счет распространения ВИЧ-1 субтипа в среди детей, находившихся в больничных стационарах Северо-Кавказского региона, Калмыцкой ССР, Астраханской и Волгоградской областей. По данным эпидемиологического расследования эта когорта имела единственный общий источник инфицирования. Трансмиссия вируса в этой популяции осуществлялась за счет использования нестерильного медицинского инструментария при парентеральных процедурах. Пациент «О» для этой популяции - грудной ребенок, рожденный от ВИЧ - позитивных родителей. Отец инфицированного ребенка мог быть заражен в период с 1980 по 1981 год, когда он находился в Республике Конго. В результате на юге России было инфицировано более 250 человек, при этом основные очаги заболевания были расположены в больничных стационарах Ростова-на-Дону и Элисты (Покровский и др., 1990). Популяция вирусов нозокомиальных очагов юга России существует уже более 20 лет и является одной из наиболее "старых" популяций на территории РФ. Как известно, уровень генетического полиморфизма вирусных популяций увеличивается с течением времени их существования. В связи с этим анализ генетического полиморфизма таких популяций дает более полное представление о мутационном разнообразии.

Вторую группу составляли пациенты Липецкой области. По характеру эпидемического процесса Липецкая область находится в группе регионов с низким уровнем превалентности (от 1 до 50 на 100 тысяч населения). При этом основной вклад в увеличение численности ВИЧ-инфицированных на этой территории вносит, так называемый, «миграционный компонент», который формируется за счет временной миграции населения из регионов с высоким уровнем ВИЧ-инфекции на территорию Липецкой области (иммигранты, сезонные рабочие и др.) (Турбина и др., 2006).

Амплификацию участков, кодирующих ВП и ИН ВИЧ-1, проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология, Россия) в варианте «nested» ПЦР. Амплификацию гена ВП проводили, используя праймеры рО и р4, а гена ИН -р17 и р15. Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе (ABI Prism 3100, США). Для компьютерной обработки нуклеотидных последовательностей использовали пакет программ DNAstar v.3.12 (Lasergene, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Подбор праймеров для амплификации гена pol ВИЧ-1.

До недавнего времени в качестве мишеней для химиотерапии выступали два вирусных фермента - ОТ и ВП. С введением в медицинскую практику ИИН остро встает проблема мониторинга мутаций лекарственной устойчивости к этим соединениям. Использование ИИН является частью комбинированных схем терапии ВИЧ-инфекции, в которых наряду с ИИН будут использоваться и традиционные химиопрепараты - ингибиторы ВП и ОТ. Нами была разработана универсальная система праймеров, позволяющая проводить анализ лекарственной устойчивости на основе структурного анализа всей области pol ВИЧ-1. Подбор олигонуклетидных праймеров проводили с помощью программы PrimerSelect из пакета компьютерных программ DNAstar. Схема расположения праймеров приведена на рисунке 1. Согласно предложенной схеме для проведения структурного анализа области pol, осуществляют nested амплификацию 6 отдельных перекрывающихся участков этого гена с помощью набора из 17 праймеров. Анализ последовательностей ампликонов, за счет их перекрывания, позволяет получать полные последовательности кодирующей области pol генома ВИЧ-1.

La1

ama*

Ijz.

Uü Im L»

, I pal ¡S—.o ¿r^i.

j tri <4

ÍMÍ

ш tm

8аД I j_RT_I RNAase H [_Irrt^

a»? , !уг* mí íam

/'.i nj

«17. "Tl

—

Рис.1. Схема расположения праймеров для амплификации области pol ВИЧ.

2. Филогенетический анализ изолятов вируса Ростово-Элистинской популяции и вирусов, циркулирующих на территории Липецкой области.

Часть лабораторной тест-системы, которая позволяет проводить анализ лекарственной устойчивости на основе структурного анализа всей области pol ВИЧ-1, была использована нами для дальнейшей работы. С ее помощью был проведен анализ полиморфизма генов ВП и ИН от вариантов вируса, полученных от ВИЧ-позитивных пациентов юга России и Липецкой области.

В работе по изучению генетической изменчивости гена pol, кодирующего ВП, нами были использованы образцы крови, полученные от 61 ВИЧ -инфицированного пациента Ростово-Элистинской вспышки. В результате амплификации были получены фрагменты ДНК размером 580 и.о., содержащие всю кодирующую последовательность ВП. Полученные первичные нуклеотидные последовательности ВП были использованы для построения алаймента с последовательностями маркерных штаммов различных субтипов группы М ВИЧ-1, отобранных из баз данных Gene Bank и Лос Аламоса. В качестве маркерных штаммов, принадлежащих различным субтипам ВИЧ-1, было отобраны 20 последовательностей из базы данных Лос Аламоса (http://www.hiv-web.lanl.gov.): субтип А - AF286238, AF413987; AY829238;

AY500393; субтип В - А04321, М26727; субтип С - U46016; субтип D -AF457090, U88824; субтип F - AF075703, AJ249238; субтип G - U88826, AF061640, AF450098, AF061642; субтип Н - AF190127, AF005496; субтип J -AF082395, AF082394; субтип К - AJ249235, AJ249239. В качестве «outgroup» использовали последовательность изолята из Сенегала (Ac№AJ302646) «О» субтипа. Последовательности маркерных штаммов мы отбирали по следующим признакам: использовали последовательности только полноразмерных геномов вирусов, не являющихся рекомбинантными; все штаммы были изолированы от разных пациентов; отбираемые последовательности были изолированы из удаленных географических регионов.

Данный алайнмент был использован для построения дендрограммы методом CLUSTAL V (рис. 2). Все исследуемые варианты вируса распределились на две группы: семь образцов образовали общую ветвь с маркерными штаммами, относящимися к субтипу А и 54 - к субтипу G (рис.2). Чтобы убедиться, что исследуемые образцы действительно относятся к ВИЧ-1 субтипов G и А, мы провели генотипирование данных вариантов вирусов по генам gag и env. В результате амплификации и секвенирования были получены первичные нуклеотидные последовательности области генов gag (980 н.о.) и env (845 и.о.), которые мы использовали для построения алайментов и дендрограмм методом CLUSTAL V из пакета программ DNAstar v.3.12 (Lasergene, USA) (рис. 4 и рис. 5). В соответствии с представленными данными (рис. 4 и рис. 5) варианты вирусов ВП которых принадлежит субтипу G, имеют генотип gagG/envG, а варианты вирусов ВП которых принадлежит субтипу А -gagA/envA. В результате эпидемиологического расследования было установлено, что пациенты, у которых был выявлен ВИЧ-1 субтипа А являются мигрантами из Краснодарского края, Ингушетии и Кабардино-Балкарии. Основной путь передачи вируса - половой или наркотический. Средний возраст пациентов на момент забора материала составлял 36 лет. Следовательно пациенты, у которых выявлен ВИЧ-1 субтипа А не относятся к пациентам нозокомиальной вспышки.

НжЛпЬЬ ft!C»J

Рис.2. Дендрограмма области гена pol, кодирующей ВП ВИЧ-1 у вирусов, выделенных от пациентов Ростово-Элистинской вспышки, с маркерными вариантами вируса группы М.

Для оценки генетической изменчивости гена pol, кодирующего ИН, нами были использованы образцы крови от 41 ВИЧ-инфицированного пациента Ростово-Элистинской вспышки, а также образцы крови от 41 пациента Липецкой области, собранные за период с 2002-2007 гг. Полученные первичные нуклеотидные последовательности ИН были использованы для построения алаймента и дендрограммы (рис. 3), используя алгоритм CLUSTAL V. В качестве эталонных штаммов использовали 11 консенсусных последовательностей гена ИН ВИЧ-1 всех известных субтипов группы М: AI, А2, В, С, D, Fl, F2, G, Н, J, К. Эталонные последовательности были получены из базы данных Лос Аламоса, используя программу RIP 3.0 Explanation (www.hiv.lanl.gov).

Все исследуемые варианты вируса распределелись на три группы: 32 образца образовали общую ветвь с ИН, принадлежащей субтипу А, 9 образцов - субтипу В и 41 образец - субтипу G.

Чтобы убедиться, что исследуемые образцы относятся к ВИЧ-1 субтипа А и В, мы провели генотипирование данных вариантов вирусов по генам gag и env. Полученные первичные нуклеотидные последовательности мы использовали для построения алайментов и дендрограмм (рис.4 и рис. 5). На основе дендрограмм, представленных на рис.4 и рис.5 следует, что изоляты вирусов ИН которых приндлежит субтипу А имеют генотип gagA/envA, а изоляты вирусов ИН которых принадлежит субтипу В - gagB/envB. Структура генов gagA/envA имеет наиболее высокую гомологию с вариантами ВИЧ-1 из Узбекистана и Украины и относится к, так называемому, ВИЧ IDU-A (injecting drug users), который является доминирующим на многих территориях РФ.

В результате филогенетического анализа было установлено, что на юге России (гг. Ростов-на-Дону и Элиста) доминирует ВИЧ-1 субтипа G, на территории Липецкой области встречаются варианты вирусов с генотипами gagA/envA и gagB/envB, но преобладающим является gagA/envA.

Рис.3. Дендрограмма области гена pol, кодирующей ИН ВИЧ-1 у вирусов, выделенных от пациентов Ростово-Элистинской вспышки и от пациентов Липецкой области, с маркерными вариантами вируса группы М

« й 2 Я 15 ш

Рис.4 Дендрограмма области гена ет ВИЧ-1 у вирусов, выделенных от пациентов Ростово-Элистинской вспышки и пациентов Липецкой области, с маркерными вариантами вируса группы М

2i К 15 si S 0

Рис.5 Дендрограмма области гена gag ВИЧ-1 у вирусов, выделенных от пациентов Ростово-Элистинской вспышки и пациентов Липецкой области, с маркерными вариантами вируса группы М

3. Анализ генетической изменчивости области гена pol ВИЧ-1, кодирующей протеазу.

Для определения уровня изменчивости ВП ВИЧ-1 мы определили частоты мутаций в пределах этого фрагмента генома (табл. 1). Как следует из представленных данных, область гена pol, кодирующая протеазу, имеет невысокую общую частоту мутаций (0,029 или 2,9%) и является достаточно

консервативной. Количество значимых замен еще ниже и составляет 1,4%. Отношение незначимых к значимым заменам составляет 1,04.

Таблица 1.

Полиморфизм области гена ро1, кодирующей ВП ВИЧ-1.

Область генома Количество измененных нуклеотидов Частота мутаций Количество анализированных н.о.

Н 3 О ШЗ Н 3 О

ВП* 146 141 287 1,04 0,015 0,014 0,029 9801

ВП** 261 272 533 0,96 0,016 0,017 0,033 16008

Примечание: * - аначиз полиморфизма ВП проводили только на пагц/ентах, не получавших ингибиторы вирусной протеазы; ** - анализ полиморфизма ВП проводили на всех пациентах исследуемой популяции, включая и тех, кто получал ингибиторы вирусной протеазы; Н - незначимые замены; 3 - значимые замены; О - общее число замен; Н/3 - отношение незначимых замен к значимым.

Характер распределения полиморфных позиций по структуре гена, кодирующего ВП, представлен на рисунке б. Все полиморфные позиции затрагивают концы основных вторичных структур фермента. Первый пик полиморфизма приходится на аминокислотные остатки с 14 по 19, где происходит переход Ь - цепи (координаты 9-15) в с - цепь, оканчивающуюся консервативным триплетом БТв активного центра. Второй пик приходится на позиции 37-43, которая представляет собой петлю, залегающую между <1 -цепью (30-35 Ак) и а4 - цепь (43-49).

Следующие полиморфные позиции это 57 и 61 ак, которые расположены в области «клапана». Следует отметить, что замены в 57 позиции предсталяют собой синонимичные замены только одного типа К на Я.

Следующая полиморфная область- 69, 70 - район, принимающий участие в начале формирования с" - цепи (69-78). Наиболее вариабельные позиции были отмечены в кодонах, кодирующих 37-ю (51,3%); 57-ю (49%); 70-ю (38%); 89 -ю (21%) аминокислоту.

0

1 50 р

X

1 30 ж

'С

S 20

А'

О

Рис. 6

Характер аминокислотных замен приведен в таблице 2. Как следует из приведенных данных, основное количество аминокислотных замен носит синонимичный характер с сохранением заряда (замены типа К на Я) или гидрофобной аминокислоты на гидрофобную (Б на Ь). Что является дополнительным указанием на высокий уровень консерватизма этого участка генома ВИЧ-1.

Таблица 2.

Характер аминокислотных замен в гене ВП ВИЧ-1.

Пациенты Аминокислотные позиции

14 15 16 19 37 41 43 57 61 69 70 86 89 99

CON К I G L D К К R 0 К К G М F

0104 N

0107 N I

0110 К

0111 N

3033 Е К н

3034 Е К н R

3188 R К н L

3189 V

3190 R К н Е

3194 S К

3196 R Е R

3197 R Е R

2971 Е R К R

2973 Е R К R Е

Полиморфизм гена, кодирующего ВП ВИЧ-1,

Y

- - -- -- - -

Jn П п П п пП пР п

- -1 I 1 I II I II II Л I II I I А I I I II I I II I I I I I t II/

12 14 15 16 19 21 23 34 37 41 43' 57 59 60 «1 67 69 70 72 86 89 99

Позиграя: акинокислотн

. Распределение полиморфизма по гену ВП ВИЧ-1.

Таблица 2 (Продолжение).

Пациенты Аминокислотные позиции

14 15 16 19 37 41 43 57 61 69 70 86 89 99

CON К I G L D К К R 0 К К G М F

2975 N

2976 V К R

2977 0 N R Е

2979 Е N R К R

2981 0 N R Е

2984 I N

3017 R К L

3018 V к I L

3019 к R

3022 R т

3023 V к R Т

3024 R

3025

3026 к

3028 Е R Т

3030 Е R к н Е

3031 N

3311 Е к V

3317 р R V

3321 N L

3350 т V Е р R к R L L

3364 R к Н I

3368 V к

3326 N R

3327 N R

3325 N

3330 Е R к R

3331 N

3335 V к R т

3339 N

3355 Е R к R

3372 Е

3329 S V

3424 Е N R L

3021 N I

3336 V S R

3027 N

3394 N R I L

3395 N I L

3029 Е к L

Число д замен ] 8 9 5 27 9 6 26 8 4 20 1 11 9

3.1. Анализ мутаций устойчивости к ингибиторам протеазы, возникающих при химиотерапии ВИЧ-инфекции.

Из 54 исследованных пациентов Ростово-Элистинской вспышки ВИЧ-инфекции, 23 получали терапию ингибиторами протеазы (ИП) в течение 6-12 месяцев. Анализ мутаций к ИП в исследуемой группе пациентов представлен в

таблице 3. Из 23 анализируемых образцов, собранных в период 2005-2008, мутации устойчивости в протеазе ВИЧ-1 были обнаружены у 7 вариантов вируса (табл. 3).

У вариантов вирусов от 2 пациентов (№3327, №3317) были обнаружены первичные мутации устойчивости к №У, а у вариантов вирусов от пациентов №3394 и №3395 - к ЬРУ/г (табл.3). У 1 варианта вируса (от пациента №3022) были выявлены мутации, обеспечивающие небольшой уровень устойчивости к №У, а у варианта вируса от пациента №3329 - к ЬРУ/г (табл.3).

У варианта вируса от пациента №3311 были выявлены вторичные мутации устойчивости к АТУ, которые сами по себе не способны вызывать высокий уровень резистентности к данному препарату. Однако влияние этих мутаций на уровень устойчивости к АТУ и ряду других ИП резко возрастает при наличии мутации 150Ь.

Таким образом, как следует из таблицы 3, мутации поддерживающие устойчивость вариантов вируса к ИП у в субтипа ВИЧ-1 не отличаются от соответствующих для субтипа В.

Таблица 3.

Мутации устойчивости к ИП у пациентов.

Пациенты Позиции кодонов и кодируемые ими аминокислотные остатки

10 20 30 33 36 46 47 53 54 58 62 63 71 76 82 88 89 90

ССЖ* Ь К о ь м М I Р I 0 1 1 А Ь V N Ь ь

2971 I I - - I - - - - - - - - - I - М -

3021 I т - - I - - - - - - - V - I - I -

3022 I - - I - - - V - - р V - I - М м

3311 У 1 - I I I - - V - V р т - А - V м

3321 I I - - I - - - - Е - - - - I - м -

3327 - I N - I - - - - Е - - - - I О м м

3329 V 1 - ь - - - V - V - - - М - V м

3317 - I N I 1 I V Ь V - - - т - I Б V м

3350 I I - - 1 - - - - - - т - - I - - -

3394 V м - - I I - V Е V р - V м - I

3424 - I - - I - - - - - - а - - I - м -

3395 - м - V I 1 - - V Е - р - 1 V м - I -

Примечание: - в качестве консенсусной последовательности использовали последовательность В субтипа (НХВ2) ** «-» - обозначает, что аминокислотные остатки соответствуют консенсусному аминокислотному остатку.

4. Анализ генетической изменчивости области гена pol, кодирующей ннтегразу ВИЧ-1.

4.1. Анализ полиморфизма гена интегразы в популяции ВИЧ -инфицированных пациентов Ростово-Элистинской вспышки.

В структуре ИН различают три функциональных домена: N-концевой домен (1-50 а.о.), С-концевой домен (212-288 а.о.) и срединный домен (51-211 а.о.), который содержит активный центр фермента. Полиморфизм NTD, CCD и CTD доменов ИН ВИЧ-1 представлен в таблице 4.

Таблица 4.

Полиморфизм NTD, CCD и CTD доменов ИН ВИЧ-1 в популяции пациентов Ростово-Элистинской вспышки ВИЧ-инфекции.

Домен Частота мутаций

Н 3 О Н/3

NTD 0,0103 0,0149 0,0252 0,689

CCD 0,0109 0,0086 0,0195 1,26

CTD 0,0064 0,0055 0,0119 1,17

по всему гену ИН 0,0097 0,0109 0,0205 0,89

Примечание. Н - незначимые замены; 3 - значимые замены;

О - общее число замен; Н/3 - отношение незначимых замен к значимым.

Как следует из представленных данных, домен CTD интегразы ВИЧ-1 является консервативным (0,0119 или 1,19%), а самым вариабельным является домен NTD (0,0252 или 2,52%).

В доменной организации ИН выделяют несколько функционально значимых участков: район «цинковых пальцев», который участвует в специфическом взаимодействии с провирусной ДНК; DDE-мотив, образующий активный центр ИН; «шарнирную петлю» (образована двумя глицинами в положениях 140 и 149), которая участвует в формировании ферментативного центра; а также аминокислоты, формирующие гидрофобную поверхность (62Q, 63 L, 114Н, 115Т, 117N, 139F, 143Y, 147S, 148Q, 150V, 151V).

В структуре «цинковых пальцев» была отмечена единственная мутация Н12Р. Смысл и значение этой мутации не совсем ясен.

Аминокислотные остатки активного центра (Б64, Б116, Е152) отличаются высоким уровнем консерватизма.

В позициях «шарнирных» глицинов нами были отмечены замены С140К и С14(Ж. Такие мутации отмечены как полиморфные для других субтипов ВИЧ-1 в базе данных вепсВапк.

Анализ мутаций в позициях аминокислот, формирующих гидрофобную поверхность, позволил показать их высокий консерватизм - нами не было обнаружено ни одной мутации в этих позициях. Эти данные, очевидно, свидетельствуют о высокой силе давления стабилизирующего отбора на эти аминокислоты, в виду их высокой значимости в выполнении функций ИН.

4.2. Сравнение уровня генетического полиморфизма гена интегразы ВИЧ-1 в популяциях вирусов субтипов Айв, циркулирующих на территории Российской Федерации.

Для сравнения уровня изменчивости вариантов вируса субтипов А и О мы определили частоты мутаций в пределах этого фрагмента генома (табл. 5). В соответствии с представленными данными, для вариантов вируса субтипа А это значение составляло 0,0082, а для вариантов вируса субтипа в - 0,0205. Таким образом, популяция вирусов субтипа в является более изменчивой по сравнению с популяцией вирусов субтипа А, что соответствует времени существования этих популяций. Частота мутаций для каждого отдельного домена ИН также представлена в таблице 5. Домен СТО ИН ВИЧ-1 как для субтипа А, так и для вариантов вируса субтипа О является консервативным (частота мутаций для субтипа А 0,0046, для субтипа в - 0,0119). Наибольшей генетической изменчивостью обладает домен ШЮ интегразы ВИЧ-1 (частота мутаций для субтипа А 0,0135, для субтипа в - 0,0252).

Таблица 5.

Полиморфизм NTD, CCD и CTD доменов ИН в популяциях ВИЧ-1 субтипов А и G.

Домен ИН Частота мутаций

Субтип G Субтип А

Н 3 О Н/3 Н 3 О Н/3

NTD 0,0103 0,0149 0,0252 0,689 0,0079 0,0056 0,0135 1,4

CCD 0,0109 0,0086 0,0195 1,26 0,0065 0,0018 0,0083 3,6

CTD 0,0064 0,0055 0,0119 1,17 0,0035 0,0011 0,0046 3,1

по всему гену ИН 0,0097 0,0109 0,0205 0,89 0,0059 0,0023 0,0082 2,6

Примечание. Н - незначимые замены; 3 - значимые замены; О - общее число замен;

Н/3 - отношение незначимых замен к значимым.

Для оценки силы действия отбора мы определили отношение числа незначимых замен к значимым (табл. 5). У вариантов вируса субтипов А и G максимальное значение отношения незначимых к значимым мутациям было получено для домена CCD (3,6 и 1,26 соответственно). Эти данные свидетельствуют о том, что на CCD домен действуют силы стабилизирующего отбора.

Анализ распределения полиморфных позиций по структуре гена ИН ВИЧ-1 в исследуемых популяциях представлен на рисунке 7. Как следует из приведенных данных, полиморфные позиции были отмечены для следующих аминокислотных остатков ИН субтипа А: ЕЗ (16%), Ell (6,3%), S17 (13%), S24 (13%), 131 (13%), D41 (9,4%), L74 (13%), М154 (9,4%), Е157 (6,3%), Е167 (6,3%), Н171 (6,3%), 1218 (13%) (в скобках указан процент измененных аминокислотных остатков) (рис.7). Сопоставляя высокий уровень полиморфизма, как для субтипа А, так и для субтипа G, можно отметить ряд совпадающих позиций 11, 17, 24, 31, 74, 154, 157, 167, 171 и 218 (рис.7).

Распределение значимых мутаций по гену ИН ВИЧ-1 субтипов А и G

частота мутации

<ХИМ)

□ Субтт ■ Субпап

Рис.7. Распределение значимых мутаций по гену ИН ВИЧ-1 субтипов А и G.

Однако, шесть из полиморфных позиций для субтипа G - 14, 32, 122, 125, 135 и 163, являются консервативными для вариантов вируса субтипа А. С другой стороны, полиморфные позиции 3 и 41 для субтипа А - являлись консервативными для субтипа G (рис. 7). Вероятными причинами такого несоответствия могут быть либо различия в субтипах, либо различия во времени существования данных популяций. Аналогичные явления в изменении положения полиморфных позиций отмечали ранее при анализе области V3 петли gpl20 на разных этапах существования популяции вирусов субтипа G (Ромашкин П.А., 2003).

Анализ полиморфизма в функционально значимых аминокислотных остатках ИН ВИЧ-1 субтипа А показал, что данные участки ИН являются высоко консервативными. Нами была отмечена только одна мутация в позициях «шарнирных» глицинов G149E. Эти данные совпадают с ранее получеными данными для вариантов вируса субтипа G.

4.3. Анализ мутаций в кодонах, связанных с формированием устойчивости к ралтегравиру (RAL) и элвитегравиру (EVG).

Анализ полиморфизма кодонов, замены в которых способствуют возникновению резистентности, у пациентов исследуемых популяций вирусов приведены в таблицах 6 и 7.

Таблица 6.

Анализ полиморфизма в позициях кодонов, обеспечивающих мутации устойчивости к ингибиторам ИН в популяции вирусов субтипа А.

Пациенты Позиции кодонов и кодируемые ими

аминокислотные остатки

51 72 74 128 154 157 203

CON Н V L А М Е I

2671 _*> - М - - - -

3147 К - - Т I К -

3229 - I - - - К

2725 - - - - I - -

2252 - - - - I - -

2268 - - - - - - м

Примечание: *' «-» - обозначает, что аминокислотные остатки соответствуют консенсусному аминокислотному остатку; серым цветом выделены пациенты, которые содержат минорные мутации устойчивости к RAL или EVG.

Таблица 7.

Анализ полиморфизма в позициях кодонов, обеспечивающих мутации устойчивости к ингибиторам ИН в популяции вирусов субтипа О.

Пациенты Позиции кодонов и кодируемые ими аминокислотные остатки

74 92 138 140 153 154 157 163 165 232

CON L Е Е G S М Е G V D

2973 I -

3019 - К К - - I К R - N

3021 - - - - - - - А - -

3022 - - - - - - - А - -

3023 - - - К - I К - - -

3028 - - - - А - - Е - -

3034 I -

3188 - - - R - - - - - -

3190 М

3195 - - - - - - - Е - -

3196 - - - - - - к - - -

3272 - - - - А - - Е - -

3289 I -

3300 - - - R - - - R - -

Как следует из приведенных данных, полиморфизм этих кодонов наблюдали у 6 вариантов вируса от 32 исследованных пациентов популяции субтипа А, и у 14 вариантов вируса от 41 пациента - субтипа в.

Мутации Н51К, V72I, Е92К, S153A, Е157К и D232N (табл. 6, 7) имеют характер генетического полиморфизма и не связаны с устойчивостью к RAL и EVG (Miller, М„ 2005).

Мутация L74M (табл.6, 7) является дополнительной мутацией устойчивости к RAL (Hazuda D., 2007). Данная мутация способствует снижению чувствительности к RAL в комбинации с мутацией N155H (Miller, М„ 2005).

Замена А128Т (табл. 6) не является мутацией устойчивости к ИИН, хотя ее появление было отмечено in vitro при использовании EVG.

Мутация Е138К/А (табл. 7) является дополнительной мутацией устойчивости к RAL в комбинации с мутациями в позициях 140 и 148 (Hazuda, D., 2007). Замена Е138К в комбинации с мутациями T66I, Q146P, S147G имеет высокий индекс резистентности к EVG (Shimura К., 2008).

Мутация G140R или G140K (табл. 7) являются редкими мутациями полиморфизма в этой позиции.

Мутации Ml541 и I203M (табл.6, 7) обычно появляются у пациентов, принимающих RAL или EVG (Hazuda, D., 2007). Однако данные замены не изменяют уровня устойчивости к RAL и EVG (Malet I., 2008).

Замена G163R/K (табл. 7) является дополнительной мутацией устойчивости у пациентов, получавших RAL, в комбинации с мутациями в позиции N155H (Markowitz, 2006).

Таким образом, по крайней мере, у трех пациентов (3019, 3190 и 3300) (табл.7) Ростово-Элистинской вспышки ВИЧ-инфекции имеется вирус с минорными мутациями, обеспечивающими устойчивость к RAL и EVG. Следует отметить, что для вариантов вирусов от этих пациентов достаточно одной из мажорных мутаций для получения полного RAL и EVG -устойчивых фенотипов.

В популяции ВИЧ-инфицированных субтипа А, циркулирующих на территории Липецкой области, мы обнаружили только у одного варианта вируса (3%) минорную мутацию устойчивости к RAL (от пациента 2671)

(табл.6), в то время как аналогичные мутации в популяции субтипа G составляют около 7,3%. Эти данные необходимо учитывать при разработке схем химиотерапии ИИН пациентам из разных популяций.

Таким образом, в популяциях ВИЧ-инфицированных, которые не подвергались действию ИИН, обнаружены мутации, потенциально способствующие формированию резистентности к RAL и EVG.

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей области гена pol ВИЧ-1, кодирующей протеазу и интегразу в популяциях вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации.

2. Проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей области гена pol ВИЧ-1, кодирующей протеазу и интегразу от пациентов Ростово-Элистинской вспышки ВИЧ-инфекции и пациентов Липецкой области.

3. Установлено, что протеаза ВИЧ-1 имеет низкий уровень генетической изменчивости (2,9%). Замены, возникающие в протеазе ВИЧ-1, имеют синонимический характер.

4. Мутации устойчивости лротеазы ВИЧ-1, обеспечивающие резистентность к ингибиторам протеазы, у вариантов вируса субтипа G не отличаются от мутаций, характерных для вариантов вируса субтипа В. Единственным исключением является замена I54V/L, которая возникает у вариантов вируса субтипа G при использовании NFV, в отличие от вирусов субтипа В.

5. Установлено, что в структуре интегразы изученных вариантов ВИЧ-1 субтипов Айв, консервативным доменом является С-концевой домен (частота мутаций 0,46% и 1,1%), а вариабельным - 14-концевой домен (частота мутаций 1,35% и 2,5%).

6. В популяциях ВИЧ-инфицированных пациентов, которые не подвергались действию ингибиторов интегразы, обнаружены мутации (Ь74М, Е138К, 016311), ассоциированные с вторичной устойчивостью к ралтегравиру и элвитегравиру. В популяции вирусов субтипа А частота выявления этих мутаций составляло 3%, а в популяциях вирусов субтипа 0-7,3%.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Гафарова И.Э., Шидеева Ж.А., Санджиева Д.Б., Гараев М.М. Анализ полиморфизма гена интегразы в популяции ВИЧ - инфицированных из нозокомиальных очагов вспышки ВИЧ инфекции 1989 года на юге России

// Вопросы вирусологии. - 2010. - №1. - С. 16-22.

2. Гафарова И.Э., Турбина Г.И., Гараев М.М.

Изучение генетического полиморфизма гена интегразы в популяциях ВИЧ-1 субтипа А, циркулирующих на территории Российской Федерации. В печати // Вопросы вирусологии.

Заказ№ Зб-а/11/10 Подписано в печать 08.11.2010 Тираж 100экз. Усл. п.л. 1,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 1 www.cfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гафарова, Ирина Эриковна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Распространение ВИЧ-инфекции в мире

1.2. Молекулярная эпидемиология ВИЧ

1.3. Патогенез ВИЧ

1.4. Структура вирусной частицы ВИЧ

1.5. Организация генома ВИЧ

1.6. Жизненный цикл ВИЧ

1.7. Лекарственная устойчивость

1.8. Протеаза ВИЧ

1.8.1. Структурная организация протеазы ВИЧ

1.8.2. Ингибиторы протеазы ВИЧ

1.9. Интеграза ВИЧ

1.9.1. Структурная организация интегразы ВИЧ

1.9.2. Субъединичная организация интегразы ВИЧ

1.9.3. Механизмы ферментативных реакций интегразы ВИЧ

1.9.4. Структура каталитического центра интегразы ВИЧ

1.9.4.1. Оценка данных рентгеноструктурного анализа интегразы ВИЧ

1.9.4.2. Модель организации активного центра интегразы ВИЧ

1.9.5. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1 56 1.9.5.1. Мутации устойчивости интегразы к химиопрепаратам

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Пациенты

2.2. Забор крови и выделение лимфоцитов

2.3. Выделение тотальной ДНК

2.4. Выделение РНК

2.5. Проведение реакции обратной транскрипции

2.6. Проведение полимеразной цепной реакции

2.7. Электрофорез ДНК

2.8. Приготовление ДНК для секвенирования

2.9. Секвенирование ДНК

2.10. Построение алайментов и филогенетический анализ

2.11. Анализ генетического полиморфизма

2.12. Клонирование последовательностей области гена pol ВИЧ

2.12.1. Получение рекомбинантных плазмид

2.12.2. Трансформация плазмидной ДНК

2.12.3. Селекция плазмид

2.12.4. Выделение плазмидной ДНК

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Лабораторный метод определения мутаций устойчивости

3.2. Подбор праймеров для амплификации гена pol ВИЧ

3.3. Филогенетический анализ изолятов вируса Ростово-Элистинской популяции и вирусов, циркулирующих на территории

Липецкой области

3.4. Анализ генетической изменчивости области гена pol ВИЧ-1, кодирующей вирусную протеазу

3.4.1. Анализ полиморфизма области генаро/, кодирующей протеазу ВИЧ

3.5. Анализ мутаций устойчивости к ингибиторам протеазы, возникающие при химиотерапии ВИЧ-инфекции

3.6. Анализ генетической изменчивости области гена pol, кодирующей интегразу ВИЧ

3.6.1. Анализ полиморфизма гена интегразы в популяции ВИЧ-инфицированных пациентов Ростово-Элистинской вспышки

3.6.2. Сравнение уровня генетического полиморфизма гена интегразы ВИЧ-1 в популяциях вирусов субтипов А и G, циркулирующих на территории Российской Федерации

3.7. Анализ мутаций в кодонах, связанных с формированием устойчивости к ралтегравиру и элвитегравиру

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический полиморфизм области гена pol, кодирующей протеазу и интегразу ВИЧ-1 в популяциях вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации"

ВИЧ-инфекция - остается одной из наиболее актуальных проблем, вставших перед человечеством в конце XX века. Количество новых случаев. ВИЧ-инфекции, показатель зараженности населения, удельный вес женщин среди ВИЧ-инфицированных, общее число детей с ВИЧ-1, смертей от СПИДа (синдром приобретенного иммунодефицита) продолжает возрастать как в целом, мире, так и на территории нашей страны.

Использование высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ) способствует снижению прогрессии заболевания и: супрессии; вирусной репликации. Современная; ВААРТ позволяет значительно увеличивать продолжительность, и качество жизни ВИЧ-инфицированных пациентов. Однако, широкое использование антиретровирусных препаратов (АРГ1) приводит к развитию лекарственной устойчивости, что обусловлено высокой частотой^ появления: спонтанных мутаций; в геноме ВИЧ-1. Описанные мутации устойчивости вируса к лекарственным? препаратам; применяемых в химиотерапии при ВИЧ-инфекции, расположены- в области гена pol, которая: является одной из самых консервативных в геноме : ВИЧ-1 и обеспечивает вирусную репликацию и морфогенез.

Ген pol ВИЧ-1 кодирует три специфических фермента: обратную транскриптазу (ОТ), вирусную протеазу (ВП) и интегразу (ИИ). Мутации, возникающие в процессе антиВИЧ-терапии, можно- разделить на два типа. Первые сами являются причиной лекарственной; устойчивости и считаются первичными, в то время как- другие мутации являются- вторичными, или компенсаторными. Компенсаторные мутации могут быть ассоциированы с резистентностью только в том случае, если они присутствуют в комбинации с первичными мутациями устойчивости.

В зависимости от принципа, действия и мишени современные АРП делятся на несколько классов: ингибиторы ОТ (нуклеозидные - НИОТ, ненуклеозидные - ННИОТ), ингибиторы протеазы (ИП), ингибиторы интегразы (ИИН) и ингибиторы слияния. Первыми успешно апробированными клиническими препаратами против ВИЧ-1 стали ингибиторы ОТ нуклеозидной природы (азидотимидин или AZT, одобренный в 1987 г.). Однако, как показала практика, использование одного класса ингибиторов оказалось неэффективным. По этой причине предпочтение стали отдавать комбинированным схемам терапии, в частности одновременному использованию ингибиторов ОТ и ИП. Комбинированная терапия значительно улучшает качество жизни пациентов за счет поддержания иммунной системы на уровне, препятствующем возникновению оппортунистических инфекций.

Ранее нами был проведен анализ генетического полиморфизма области гена pol, кодирующей ОТ ВИЧ-1 в когорте ВИЧ-инфицированных, имеющих в качестве источника заражения^ единственного пациента «О», а также проведена оценка уровня лекарственной устойчивости у пациентов, получающих химиотерапию ингибиторами обратной транскриптазы (Пазилин, 2007). В настоящей работе нами проведен анализ генетической изменчивости области гена pol ВИЧ-1, кодирующей ВП и ИН у пациентов, получающих химиотерапию, в том числе и ингибиторами протеазы (ИП). По литературным данным основные сведения об описанных мутациях устойчивости к ИП были получены на основе изучения различных резистентных вариантов ВИЧ-1 субтипа В, редко встречающегося на территории Российской Федерации (РФ). В отношении других субтипов ВИЧ-1 эти сведения носят отрывочный характер, поэтому нами была уточнена локализация мутаций лекарственной устойчивости в области гена pol, кодирующей ВП у вариантов вируса, циркулирующих на территории России.

В настоящее время на территории РФ предполагается широкое использование в лечении ВИЧ-инфекции ингибиторов ИН (ИИН). В связи с этим мы провели анализ генетического полиморфизма этого участка генома

ВИЧ-1 и1 выяви л и наличие предсуществующих мутаций устойчивости к ИИН в нелеченых популяциях.

Подавляющее большинство ВИЧ-позитивных в России инфицированы вариантами вируса субтипа А (вспышка 1996 г.) и субтипа G (Ростово-Элистинская вспышка в 1989 г.). Настоящее исследование было проведено на двух группах пациентов. Первую группу составили пациенты внутрибольничной вспышки ВИЧ-инфекции в г. Ростов-на-Дону и г. Элисты (субтип G), вторую исследуемую группу составили пациенты Липецкой области (субтип А).

Исследование генетического полиморфизма, эволюции ВИЧ-1 и молекулярно-эпидемиологический мониторинг распространения ВИЧ-инфекции на территории РФ являются базисными для создания эффективных вакцин, диагностических тестов и новых лекарственных препаратов, способствует развитию новых подходов лечения ВИЧ-инфекции, в частности, использование ИИН.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящего исследования было изучение генетического, полиморфизма области гена pol, кодирующей протеазу и интегразу ВИЧ-1. Для достижения поставленной4 цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить первичные нуклеотидные последовательности- гена pol, кодирующие протеазу и интегразу ВИЧ-1 в популяциях вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации.

2. Провести анализ генетического полиморфизма области гена pol, кодирующей протеазу и интегразу ВИЧ-1: оценка уровня генетической изменчивости, характер и распределение мутаций.

3. Провести сравнение степени полимофизма гена интегразы ВИЧ-1 в популяциях вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации.

4. Провести анализ наличия мутаций устойчивости к ингибиторам протеазы и ингибиторам интегразы в исследуемых популяциях вирусов.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих протеазу и интегразу ВИЧ-1, от пациентов юга России (г. Ростов-на-Дону и г. Элиста) и Липецкой области.

2. Разработана система праймеров, позволяющая амплифицировать полноразмерные гены, кодирующие протеазу и интегразу ВИЧ-1.

3. Полученные нуклеотидные последовательности, кодирующие протеазу и интегразу ВИЧ-1, депонированы в ОепеВапк.

4. Мутации устойчивости в протеазе ВИЧ-1, обеспечивающие резистентность к ингибиторам протеазы, у вариантов вируса субтипа О не отличаются от мутаций, характерных для вариантов вируса субтипа-В. Единственным исключением является замена 154У/Ь, которая возникает у вариантов вируса' субтипа О при использовании нелфинавира (№"У), в отличие от вирусов субтипа В.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Область гена ро1, кодирующая протеазу ВИЧ-1, имеет низкий уровень генетической изменчивости (2,9%). Замены, возникающие в протеазе ВИЧ-1, имеют синонимический характер.

2. Мутации, возникающие при терапии ингибиторами протеазы у вариантов вируса субтипа О, не отличаются от. соответствующих замен, характерных для субтипа В.

3. Функционально значимые участки интегразы ВИЧ-1 (район «цинковые пальцы»; БОЕ-мотив; «шарнирная петля»; аминокислоты, формирующие гидрофобную поверхность) являются высоко консервативными.

4. В популяциях ВИЧ-инфицированных пациентов, которые не подвергались действию ингибиторов интегразы, присутствуют мутации, потенциально ассоциированные с резистентностью к этому классу препаратов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гафарова, Ирина Эриковна

выводы

1. Проведен анализ нуклеотидных последовательностей области гена pol ВИЧ-1, кодирующей протеазу и интегразу в популяциях вирусов, циркулирующих на территории Российской Федерации.

2. Проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей области гена pol ВИЧ-1, кодирующей протеазу и интегразу от пациентов Ростово-Элистинской вспышки ВИЧ-инфекции и пациентов Липецкой области.

3. Установлено, что протеаза ВИЧ-1 имеет низкий'уровень генетической изменчивости (2,9%). Замены, возникающие в протеазе ВИЧ-1, имеют синонимический характер.

4. Мутации устойчивости протеазы ВИЧ-1, обеспечивающие резистентность к ингибиторам протеазы, у вариантов вируса субтипа G не отличаются от мутаций, характерных для вариантов вируса субтипа В. Единственным исключением является замена I54V/L, которая возникает у вариантов вируса субтипа G при использовании NFV, в отличие от вирусов субтипа В.

5. Установлено, что в структуре интегразы изученных вариантов ВИЧ-1 субтипов А1 и G, консервативным доменом является С-концевой домен (частота мутаций 0,46% и 1,1%), а« вариабельным - N-концевой домен (частота мутаций 1,35% и 2,5%).

6. В популяциях ВИЧ-инфицированных пациентов, которые не подвергались действию ингибиторов интегразы, обнаружены мутации (L74M, Е138К, G163R), ассоциированные с вторичной устойчивостью к ралтегравиру и элвитегравиру. В популяции вирусов субтипа А частота выявления этих мутаций составляло 3%, а в популяциях вирусов субтипа G - 7,3%.

114

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гафарова, Ирина Эриковна, Москва

1. Жданов В.М. Эволюция вирусов. М. 1990. с. 320 323.

2. Пазилин A.C., Саухат С.Р. и др. Генетическая характеристика обратной транскриптазы субтипа G ВИЧ-1 //Вопросы вирусологии. -2007.-№1.-с. 17-23.

3. Покровский В.В., Ерамова И.Ю. и др. Внутрибольничная вспышка ВИЧ инфекции в Элисте 7/ Ж. Микробиол. Эпидемиол. Иммунол. -1990. — Т.4. с. 17-23;

4. Рафальский В .В. Клиническая; фармакология атазанавира. // Фарматека 2008, № 4, С. 1-8.

5. Северцев A.C. Направленность эволюции. М. 1990. с. 272.

6. Турбина Г.И., Соломенцева М:Л;, Кириллова Л.Д., Никитина Л./!,., Гараев М.М. Эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции на территории Липецкой области в период 1993-2005г.г.//Вопросы вирусологии.-2006.-№6.-С 19-22.

7. Шмальгаузен И:И. Теория эволюции. Факторы стабилизирующего отбора. М. 1968.

8. Barbara G. et al. Highly active antiretroviral therapy: current state of the art, new agents and their pharmacological interactions useful for improving therapeutic outcome. // Curr. Pharm. Des. 2005. V. - 11. P. 1805-1843.

9. Brown A., Precious H., Whitcomb J., Simon V., Daar E., D'Aquila R., Keiser et al. Abstract 424, 8th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Chicago, 111., 2001.

10. Bukrinsky M. A hard way to the nucleus. //Mol. Med. 2004. V - 10. P. 1-5.

11. Check E. Gene regulation: RNA to the rescue? //Nature 2000. V. - 425 (6953). P.10-12.

12. Chen, H. & Engelman, A. The barrier-to-auto- integration protein is a host factor for fflV type 1 integration. //Proc. Natl Acad. Sci. USA 1998. V. -95. P. 15270-15274.

13. Chen J. et al. Crystal structure of the HIV-1 integrase catalytic core and C-terminal domains: a model for viral DNA binding. //Proc Natl Acad Sci USA 2000. V. - 97. P.8233- 8238.

14. Cherepanov P., Maertens G., Proost P., Devreese B., Van Beeumen J., Engelborghs Y.et al. HIV-1 integrase forms stable tetramers and associates with LEDGF/p75 protein in human cells. //J. Biol. Chem. 2003. V. - 278. P. 372-381.

15. Cherepanov P. et al. Structural basis for the recognition between HIV-1 integrase and transcriptional coactivator p75. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA -2005. V. 102. P. 17308-17313.

16. Chiu T.K. and Davies D.R. Structure and function of HIV-1 integrase. // Curr. Top Med. Chem. 2004. V. - 4. P. 965-977.

17. Cohen J. Therapies. Confronting the limits of success. // Science 2002. V. - 296. P. 2320-2324.

18. Cohen J. Retrovirus meeting. Novel attacks on HIV move closer to reality. // Science. 2006. V. - 311. P. 943.

19. Colonno R, Rose R, McLaren C et al. Identification of 1501 as the signature atazanavir (atv)-resistance mutation in treatmentB-naive hiv-1 infected patients receiving atv-containing regimens. // J Infect Dis 2004. V. -189. P. -1802-1810.

20. Condra J., Holder D., Schleif W., Blahy O., Danovich R. et al. Genetic correlates of in vivo viral resistance to Indinavir, a human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitor. // J. of virology. -1996. V. 70.-P. 8270-8276.

21. Cowley S. The biology of HIV infection Leprosy Review, 2001, 7:212-220.

22. Dayam R. & Neamati N. Active site binding modes of the beta-diketoacids: a multi-active site approach in HIV-1 integrase inhibitor design. //Bioorg. Med. Chem. 2004. V. - 12. P. 6371-6381.

23. De Luca L. et al. Analysis of the full-length integrase-DNA complex by a modified approach for DNA docking. //Biochem Biophys Res Commun -2003. V. — 310. P.1083-1088.

24. De Luca L. et al. Molecular dynamics studies of the full-length integrase-DNA complex. //Biochem. Biophys Res. Commun. 2005. V. - 336. P.1010-1016.

25. Deprez E., Tauc P., Leh H., Mouscadet J., Auclair C. & Brochon J. Oligomeric states of the HIV-1 integrase as measured by time-resolved fluorescence anisotropy. //Biochemistry 2000. V. - 39. P. 9275-9284.

26. Domingo E. and Holland J. RNA virus mutations and fitness for survival. //Annual Review of Microbiology. 1997. V. - 51. P. 151-178.

27. Doyon L., Croteau G., Poulin F., Piloteand L., Lamarre D. Second locus involved in human immunodeficiency virus type 1 resistance to protease inhibitors.//J. Virol.-1996.-V. 70.-P. 3763-3769.

28. Dyda F., Hickman A. B¿, Jenkins T. M., Engelman A., Craigie R. Davies D. R. Crystal structure of the catalytic domain of HIV-1 integrase: similarity to other polynucleotidyl transferases. // Science 1994. V. - 266. P. 1981-1986.

29. Ellison V., Gerton J., Vincent K. & Brown P. An essentia! interaction between distinct do-mains of HIV-1 integrase mediates assembly of the active multimer. //J.Biol. Chem. 1995. V. - 270. P.3320-3326.

30. EricksomJ., Burt S. Structural mechanisms of HIV drug resistance. //Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1996. V. - 36. P. 545-571.

31. Farnet C. & Bushman F. HIV-1 cDNA integration: requirement of HMG I(Y) protein for function of preintegration complexes in vitro. // Cell. 1997. V. - 88. P. 483-492.

32. Faure A., Calméis C., Desjobert C., Castroviejo M., Caumont-Sarcos A., Tarrago- Litvak L. et al. HIV-1 integrase crosslinked oligomers are active in vitro. //Nucleic Acids Res. 2005. V. - 33; P.977-986.

33. Fletcher T., Soares M., McPhearson S., Hui H., Wiskerchen M., Muesing M. et al. Complementation of integrase function in HIV-1 virions. // O J. 1997. V.-16. P.5123-5138.

34. Friend J., Parkin. N., Lieglér T., Martin J., Deeks S. Isolated lopinavir resistance after virologic rebound of a ritonavir/lopinavir-based regimen. // AIDS 2004.- V. - 18. P. 1965-1970.

35. Fujishita T., Yoshinaga T. & Sato A. Preparation of aromatic heterocycle compounds having HIV integrase inhibiting activities. Int. Patent W02000039086 (The World Intellectual Property Organization), 2000.

36. Gao K., Butler S. & Bushman F. Human immunodeficiency virus type 1 integrase: arrangement of protein domains in active cDNA complexes. // EMBO J. 2001. V. - 20. P.3565-3576.

37. Goldgur Y., Dyda F., Hickman A., Jenkins T., Craigie R. & Davies D. Three new structures of the core domain of HIV-1 integrase: an active site that binds magnesium. //Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. V. - 95. P. 9150-9154.

38. Greenwald J., Le V., Butler S., Bushman F. & Choe S. The mobility of an HIV-1 integrase active site loop is correlated with catalytic activity. // Biochemistry 1999. V. - 38. P. 8892-8898.

39. Hazuda D., Felock P., Witmer M., Wolfe A., Stillmock K., Grobler J. et al. Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells. // Science 2000. V. - 287. P.646-650.

40. Hoffinann C., Kamps B. HIV Medicine 2006.

41. Jacks T., Power M.D., Masiarz F.R. et al., Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 gag-pol expression. // Nature 1988. - V.21. - P. 280- 287.

42. Jenkins T., Engelman A., Ghirlando R. & Craigie R. A soluble active mutant of HIV-1 integrase: involvement of both the core and carboxyl-terminal domains in multimerization. //J. Biol. Chem. 1996. V. - 271. P.7712-7718.

43. Johnson A. et al. HIV-1 integrase inhibitors: a decade of research and two drugs in clinical trial. // Curr. Top Med. Chem. 2004. V. - 4. P. 1059-1077.

44. Johnson M, Grinsztejn B, Rodriguez C et al. Atazanavir plus ritonavir or saquinavir, and lopinavir/ritonavir in patients experiencing multiple virological failures. //Aids 2005. - V.19. - P. 685-694.

45. Johnson V., Brun-Vezinet F., Clotet B. Update of the drug resistance mutations in hiv-1: Spring 2008. // Top HIV Med. 2008. - V. 16. - P. 6268.

46. Johnson V., Brun-Vezinet F., Clotet B. Update of the drug resistance mutations in hiv-1: December 2009. // Top HIV Med 2009. -V. 17. P. USUS.

47. Kagan R, Shenderovich M., Heseltine P., Ramnarayan K. Structural analysis of an HIV-1 protease I47A mutant resistant to the protease inhibitor lopinavir. // Protein Sci. -2005. V. 14. P. 1870-1878.

48. Kalpana G., Marmon S., Wang W., Crabtree G. & Goff S. Binding and stimulation of HIV-1 integrase by a human homolog of yeast transcription factor SNF5. // Science. 1994. V. - 266. P. 2002-2006.

49. Karki R. et al. Model of full-length HIV-1 integrase complexed with viral DNA as template for anti-HIV drug design. // J. Comput. Aided Mol. Des. -2004. V.-18. P. 739-760.

50. Keseru G. & Kolossvary I. Fully flexible low-mode docking: application to induced fit in HIV integrase. //J. Am. Chem. Soc. 2001. V. - 123. P. 12708-12709.

51. Kim R, Baxter JD. Protease inhibitor resistance update: Where are we now? AIDS Patient Care STDS 2008. V. - 22. P. 267-277.

52. Kuritzkes DR. Hiv resistance: Frequency, testing, mechanisms. //Top HIV Med 2007. V. — 15. P. 150-154.

53. Lee M. & Craigie R. Protection of retroviral DNA from autointegration: involvement of a cellular factor. //Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994. V. -91. P. 9823-9827.

54. Loeb D., Hutchison C., Edgell M., Farmerie W., Swanstrom R. Mutational analysis of human immunodeficiency virus type I protease suggests functional homology with aspartic proteinses. // J. Virol. -1989. V. 63. - P. 111-121.

55. Mansky L.M. Retrovirus mutation rates and their role in genetic variation. // J: Gen. Virol. 1998. - V.79. - P. 1337-1345.

56. Marcelin AG, Chazallon C, Gerard L et all External validation of atazanavir/ritonavir genotypic score in hiv-1 protease inhibitor-experienced patients. //J Acquir Immune Defic Syndr 2006: V. - 42. P. - 127-128:

57. Marchand C., Zhang X., Pais G., Cowansage K., Neamati N., Burke T. Structural determinants for HIV-1 integrase inhibition by beta-diketo acids. //J. Biol. Chem. 2002. V. - 277. P. 12596-12603.

58. Markowitz M, Mohri H, Mehandru S et al. Infection with multidrug resistant, dual- tropic hiv-1 and rapid progression to aids: A case report. Lancet-2005. 365. P. 1031-1038.

59. McColl D., Fransen S., Gupta S., Parkin N., Margot N., et al. Resistance analysis of a phase 2 study of the integrase inhibitor elvitegravir (GS-913 7). 11th European AIDS Conference, 2007, Madrid, Spain.

60. Miller M., Jaskolski M., Rao J., Leis J., Wlodawer A. Crystal structure of a retroviral protease proves relationship to aspartic protease family. // Nature —1989. -V. 337. P. 576-579.

61. Miller M., Farnet C. & Bushman,F. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. //J. Virol. 1997. V.-71. P. 5382-8390.

62. Naeger LK, Struble KA. Effect of baseline protease genotype and phenotype on hiv response to atazanavir/ritonavir in treatment-experienced patients. //AIDS 2006. V. -20. P. 847-853.

63. Nicholls A., Sharp K. & Honig B. Protein folding and association: insights from the interfacial and thermodynamic properties of hydrocarbons. // Proteins: Struct. Funct.Genet. 1991. V. - 11. P.281-296.

64. Nijhuis M., Schuurman R., de Jong D. Increased fitness of drug resistant hiv-1 protease as a result of acquisition of compensatory mutations during suboptimal therapy. //AIDS. 1999. - V. 13. - P. 2349-2359.

65. Nowotny M., Yang W. Stepwise analyses of metal ions in RNase H catalysis from substrate desta-bilization to product release. //EMBO J. -2006. V. — 25. P.1924-1933.

66. Ode H., Neya S., HataM., Sugiura W., Hoshino T. Computational simulations of HIV-1 Proteases -multi-drug resistance due to nonactive site mutation L90M. //J. Am. Chem. Soc. 2006, V.128 (24). - P. 7887-7895.

67. Oz Gleenberg I. et al. Peptides derived from the reverse transcriptase of human immunodeficiency virus type 1 as novel inhibitors of the viral integrase. //J. Biol. Chem. 2005. V. - 280. P.21987-21996.

68. Pechik I., Gustchina A., Andreeva N., Fedorov A. Possible role of some groups in the structure and function of HIV-1 protease as revealed by molecular modeling studies. FEBS Lett. -1989. -V.247. -P.l 18-122.

69. Perno CF, Moyle G, Tsoukas C et al. Overcoming resistance to existing therapies in hiv-infected patients: The role of new antiretroviral drugs. // J. Med. Virol 2008; V.80-P. 565-576.

70. Petit C., Schwartz O. & Mammano F. Oligomerization within virions and subcellular localization of human immunodeficiency virus type 1 integrase. //J. Virol. 1999. V. - 73. P.5079-5088.

71. Pommier Y. et al. Integrase inhibitors to treat HIV/AIDS. //Nat. Rev. Drug Discov. 2005. V. - 4. P. 236-248.

72. Pommier Y., Marchand C. Interfacial inhibitors of protein-nucleic acid interactions. //Curr. Med. Chem. Anticancer Agents 2005. V. - 5. P.421-429.

73. Rhee SY., Taylor J., Wadhera G. et al. Genotypic predictors of human immunodeficiency virus type 1 drug resistance. // Proc Natl Acad Sei. -2006. V. 103. P. 17355-17360.

74. Santos A., Abecasis A., Vandamme A., Camacho R., Soares M. Discordant genotypic interpretation and phenotypic role of protease mutations in HIV-1 subtypes B and G. et al. Abstract 2008:

75. Sato, M. et al. Novel HIV-1 integrase inhibitors derived from quinolone antibiotics. //J. Med. Chem; 2006. V. - 49. P. 1506-1508.

76. Savarino A. et al. In-silico docking of HIV-1 integrase inhibitors reveals a novel drug type acting on an enzyme/DNA reaction intermediate. // Retrovirology 2007. V. - 4. P. 21.

77. Sawaya M., Prasad R., Wilson S., Kraut J. & Pelletier H. Crystal structures of human DNA polymerase beta complexed with gapped and nicked DNA: evidence for an-induced fit mechanism. //Biochemistry 1997. V. - 36. P.11205-11215.

78. Schames J., Henchman R., Siegel J., Sotriffer C., Ni H.& McCarnmon J. Discovery of a novel binding trench in HIV integrase. // J. Med. Chem. -2004. V.-47. P. 1879- 1881.

79. Shafer R. et al. Genotypic Testing for Human Immunodeficiency Virus Type 1 Drug Resistance. // Clin Microbiol Rev. 2002: V. - 15. P. 247-277.

80. Shafer RW, Rhee SY, Pillay D et al. Hiv-1 protease and reverse transcriptase mutations for drug resistance surveillance. //AIDS 2007. V. -21. P. 215-230.

81. Sherman MP, Greene WC. Slipping'through the door: HIV entry into the nucleus. //Microbes and infection 2002. V. - 4. P.67-73.

82. Sonigo P., Alizon M., Staskus K. S. et al. Nucleotide sequence of the visna lentivirus: relationship to the AIDS virus. // Cell 1985. - V.42. - P. 369382.

83. SugiuraW., Matsuda Z., Yokomaku Y., Hertogs K., Larder B. et al. Interference between D30N and L90M in Selection and Development of

84. Protease Inhibitor-Resistant Human Immunodeficiency Virus Type 1. //Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2002, V. 46. - P. 708-715.

85. Turner D, Wainberg MA. Hiv transmission and primary drug resistance. //AIDS Rev 2006. V. - 8. P. 17-23.

86. Van Maele, B. et al. Cellular co-factors of HIV-1 integration. // Sci. -2006.- V.-31. P.-98-105.

87. Verschueren W., Dierynck I., Amssoms K., Hu., Boonants P., Pille G. et al. Design and optimization of tricyclic phtalimide analogues as novel inhibitors of HIV-1 integrase. //J. Med. Chem. 2005. V. - 48. P. 19301940.

88. Violot S., HongS., RakotobeD., Petit C., Gay B., Moreau K. et al. The human polycomb group EED protein interacts with the integrase of human immunodeficiency virus type 1. //J. Virol. — 2003. V. 77. P. 1250712522.

89. Wai J., Egbertson M., Payne L., Fisher T., Embrey M., Tran L. et al. 4-Aryl-2,4-dioxobutanoic acid inhibitors of HIV-1 integrase and viral replication in cells. //J. Med. Chem. 2000. V. - 43. P.4923-4926.

90. Wang J., Ling H., Yang W. & Craigie R. Structure of a two-domain fragment of HIV-1 inte-grase: implications for domain organization in the intact protein. //EMBO J. 2001. V. - 20. P. 7333-7343.

91. Wang L. et al. Constructing HIV-1 integrase tetramer and exploring influences of metal ions on forming integrase-DNA complex. // Biochem. Biophys Res. Commun. 2005. V. - 337. P. 313-319.

92. Wlodawer A., Vondrasek J. Inhibitors of HIV-1 protease: a major success of structure-assisted drug design. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. -1998. -V.27.-P. 249-284.

93. Yu F., Jones G., Hung M., Wagner A., MacArthur H., Liu X. et al. HIV-1 Integrase Preassembled on Donor DNA IS Refractory to Activity Stimulation by LEDGF/p75. //J. Mol. Biol. 2007. V. - 46. P.2899-2908.

94. Yung E., Sorin M., Pal A., Craig E., Morozov A., Delattre O. et al. Inhibition of HIV-1 virion production by a transdominant mutant of integrase interactor 1. //Nat. Med. 2001. V. - 7. P. 920-926.