Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменчивость гена pol вариантов вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) подтипа А, циркулирующих в России

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменчивость гена pol вариантов вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) подтипа А, циркулирующих в России"

СУХАНОВА Анна Львовна

ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНА POL ВАРИАНТОВ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА (ВИЧ-1) ПОДТИПА А, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В РОССИИ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории вирусов лейкозов ГУ НИИ вирусологии имени Д. И. Ивановского РАМН и специализированной научно-исследовательской лаборатории эпидемиологии и профилактики СПИД ФГУН Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ доктор биологических наук, профессор

I Алексей Филиппович Бобков | доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН

Покровский Вадим Валентинович

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ доктор медицинских наук

Мацевич Геннадий Рувимович

доктор биологических наук, профессор Тарантул Вячеслав Залманович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии

имени Н Ф Гамалея РАМН

Защита диссертации состоится 22 мая 2006 г в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 001 020 01 в Институте вирусологии имени Д И Ивановского РАМН по адресу: Москва 123098, ул Гамалеи, 16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии имени Д И Ивановского РАМН

Автореферат разослан апреля 2006 г

Ученый секретарь Диссертационного совета Доктор медицинских наук

Н. П Косякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Угроза, которую представляет инфекция вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) здоровью человечества, выражена тремя аспектами- неизбежностью летального исхода заболевания, глобальным масштабом эпидемии и отсутствием средств специфической профилактики инфекции. По данным Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИД, в России на 10.04.2006 официально зарегистрировано 354031 случаев ВИЧ-инфекции; ежегодно увеличивается количество больных и умирающих от СПИДа (Покровский и соавт, 2005) Единственным известным на сегодняшний день средством, препятствующим прогрессии заболевания, является комбинированная антирегровирусная (АРВ) терапия, которая заключается в одновременном применении нескольких ингибиторов вирусных ферментов -протеазы и/или обратной транскриптазы (ОТ) Однако, основная проблема, осложняющая этиотропную терапию ВИЧ-инфекции, заключается в устойчивости, или резистентности, вируса к действию лекарственных средств Резистентные варианты вируса чаще всего возникают в популяции de novo как результат неоптимального подбора АРВ-препаратов или нарушения режима их приема, однако известны и случаи заражения устойчивыми штаммами ВИЧ-1 (Lukashov et al, 2000; Ammaranond et al, 2003) В условиях ограниченного доступа к лекарственным средствам, характерным для России в переходный период, вопрос о резистентности ВИЧ не только не перестает быть актуальным, но и приобретает особое значение Монотерапия или битерапия с использованием ингибиторов вирусных ферментов может приводить к более быстрому развитию устойчивых вариантов ВИЧ, которые, передаваясь как вертикально, так и горизонтально, способны вызывать новые случаи инфекции Очевидно, таким образом, что для широкомасштабного внедрения АРВ-терапии в стране необходима информация об уровне лекарственной устойчивости в популяции циркулирующих вариантов вируса, т е среди ВИЧ-инфицированных лиц, не употреблявших АРВ-препараты

Основным способом анализа лекарственной устойчивости ВИЧ-1 является генотипирование, или выявление мутаций в геноме вируса, ответственных за ее развитие Подавляющее большинство мутаций устойчивости ВИЧ-1 локализуется в области гена pol, кодирующей протеазу и первые 240 аминокислотных остатков (а о ) ОТ Выделяют два вида мутаций устойчивости ВИЧ-1 - первичные и вторичные Первичные мутации непосредственно вызывают снижение чувствитель i^i^i ^y^yg^ii ^АРВ

БИБЛИОТЕКА С.-Пе1грбург 03

препаратам, но при этом, как правило, ухудшают его репликативную способность. Вторичные мутации не влияют на уровень лекарственной устойчивости, но в большей или меньшей степени восстанавливают репликативную способность вируса, несущего первичные мутации (Qumones-Mateu and Arts, 2001) Если селекция первичных мутаций всегда является следствием воздействия лекарственных веществ и в большинстве случаев не зависит от генетического подтипа ВИЧ-1 (Kantor et al, 2005), то вторичные мутации могут появляться в геноме вируса спонтанно, а у некоторых подтипов ВИЧ-1 даже присутствовать постоянно как проявление генетического полиморфизма Поэтому частота их встречаемости среди ВИЧ-инфицированных лиц, не употреблявших АРВ-препараты, может бьггь очень высокой и, как правило, зависит от генетического подтипа ВИЧ-1

Необходимо отметить, что мутации устойчивости лучше всего изучены в геноме ВИЧ-1 генетического подтипа В, типичного для индустриально развитых стран Это связано с тем, что именно в этих государствах в наиболее полном объеме обеспечивается лечение и мониторинг его эффективности у лиц, инфицированных ВИЧ-1 Однако, на территории России, как и многих других стран-бывших советских республик, в настоящее время доминирует ВИЧ-1 подтипа А (Bobkov et al, 2004; Vazquez de Parga et al, 2005) В 1996 г этот вариант вируса, впоследствии названный IDU-A, проник в среду российских потребителей инъекционных наркотиков (ПИН), что вызвало быстрое распространение эпидемии по всей территории страны сначала в этой группе риска, а затем и среди половых партнеров ПИН К 2003 г вариант IDU-A, по некоторым оценкам, вызвал 94% случаев ВИЧ-инфекции в России (Bobkov et al., 2004) Несмотря на это, область гена pol у него к началу настоящей работы, т е к 2003 г, оставалась неисследованной Было опубликовано только восемь последовательностей гена pol IDU-A, но и они были выделены в Молдавии, Белоруссии, Украине (Pandrea et al, 2001; Liitsola et al., 2000; Masharsky et al, 2003) Вместе с тем, для правильной интерпретации результатов генотиттирования лекарственной устойчивости необходима максимально полная информация о генетической изменчивости вариантов ВИЧ, циркулирующих в стране.

Цель и задачи работы. Цель исследования состояла в определении степени изменчивости гена pol и распространенности мутаций лекарственной устойчивости у инфицированных вариантами ВИЧ-1 подтипа А лиц в России, не принимавших АРВ-препараты, для оптимизации мониторинга и совершенствования терапии ВИЧ-инфекции в России Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи'

1. Определить нуклеотидные последовательности областей гена pol, кодирующих протеазу и обратную транскриптазу, и частоту встречаемости значащих мутаций гена pol, у инфицированных вариантами ВИЧ-1 подтипа А лиц в России, не принимавших АРВ-препараты к моменту забора крови

2 Оценить потенциальное влияние выявленных мутаций в гене pol на лекарственную устойчивость ВИЧ-1 и эффективность АРВ-терапии

3 Провести филогенетический анализ и определить степень генетической изменчивости областей гена pol, кодирующих протеазу и обратную транскриптазу, у исследуемых вариантов ВИЧ-1 подтипа А.

4 Охарактеризовать возможность применения методов молекулярной гибридизации на биологических микрочипах и рестрикционного анализа для различения вариантов ВИЧ-1 подтипа А, несущих мутации гена pol.

5 Оценить способность вариантов ВИЧ-1 подтипа А, несущих мутации гена pol, к передаче от человека к человеку

6 Изучить закономерности изменения частоты встречаемости основных вариантов ВИЧ-1, несущих мутации гена pol, на протяжении эпидемии ВИЧ-инфекции в разных регионах России в период времени с 1996 по 2005 гг

Научная новизна и практическая ценность работы

1 Показано, что варианты ВИЧ-1 подтипа А, циркулирующие в России среди потребителей инъекционных наркотиков и их половых партнеров, потенциально чувствительны к действию ингибиторов протеазы и ОТ Эта информация позволяет избежать дорогостоящего тестирования лекарственной устойчивости ВИЧ-1 перед началом АРВ-терапии у пациентов из данных групп риска (если отсутствуют дополнительные указания на возможность инфицирования устойчивым штаммом ВИЧ-1 в конкретном случае)

2 Для вариантов ВИЧ-1 подтипа А, выделенных от не употреблявших АРВ-терапию людей, впервые показана высокая частота встречаемости мутаций гена pol, вызывающих аминокислотные замены V77—»I, Т93—>L в протеазе и А62—>V в ОТ и известных ранее для ВИЧ-1 подтипа В как вторичные мутации лекарственной устойчивости Информация о высокой распространенности этих мутаций в России свидетельствует о необходимости корректировать алгоритмы интерпретации результатов генотипирования лекарственной устойчивости ВИЧ, проводимого в нашей стране у лиц, принимающих АРВ-терапию.

3 Впервые показано, что ВИЧ-1 IDU-A филогенетически гетерогенен Это выражается в циркуляции (т е передаче от одних лиц другим) на территории России четырех вариантов этого вируса, различающихся наличием

или отсутствием мутаций V77—>1 в протеазе и/или А62—»V в ОТ К ним относятся три варианта, имеющие мутантные /?о/-генотиттьт Mutv77i/A62v, Mutv77i, MutA62v, и один, являющийся для них «родительским» штаммом дикого типа Обнаружена монофилетическая природа вариантов MutV77i/A62v и Mutw7i, распространенных в разных регионах России Ро/-генотип, таким образом, является эпидемиологическим маркером различных циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 подтипа А В настоящей работе предложено определять pol-генотип, наряду с практиковавшимся ранее определением генетического подтипа ВИЧ-1, в целях эпидемиологических расследований Для определения /»/-генотипа показана возможность использования, помимо определения нуклеотидных последовательностей, одного из двух методов- молекулярной гибридизации на биологических микрочипах или рестрикционного анализа

4 Показан низкий уровень изменчивости гена pol вариантов ВИЧ-1 IDU-А, а также обнаружены различия в характере генетической изменчивости области, кодирующей протеазу, и области, кодирующей ОТ Информация о низкой гетерогенности этих областей генома вариантов ВИЧ-1 подтипа А, доминирующих на территории России, позволяет осуществить разработку новых генотипических тестов, в том числе, гибридизационных, адаптированных для выявления мутаций лекарственной устойчивости в геноме ВИЧ-1 подтипа А, а также для совершенствования методов молекулярной диагностики ВИЧ-инфекции 27 нуклеотидных последовательностей области гена pol ВИЧ-1 подтипа А, кодирующей протеазу, депонированы в GenBank под номерами с AY618594 по AY618620 В целом, результаты работы могут служить научным обоснованием необходимости мониторинга лекарственной устойчивости ВИЧ-1 и способствовать внедрению средств такого мониторинга в клиническую практику

Апробация работы Результаты исследований представлены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и отдела общей вирусологии ГУ НИИ вирусологии имени Д И Ивановского РАМН (Москва, 2006, доклад), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004, доклад), Втором и Третьем Европейских семинарах «Лекарственная устойчивость ВИЧ от фундамешальной науки к клиническому значению» (Рим, Италия, 2004, и Афины, Греция, 2005, постеры), 15-ой Всемирной конференции по СПИД (Бангкок, Тайланд, 2004, доклад), 12-ом Международном семинаре по динамике и эволюции ВИЧ (Кливленд, США, 2005, постер), 10-ой Европейской конференции по СПИД (Дублин, Ирландия, 2005, постеры)

Публикации По теме диссертации опубликовано 18 научных работ Структура диссертации Диссертация изложена на¡2.9 страницах машинописного текста, содержит¡5 рисунков, /^таблиц и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы из //¿ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Объект и методы исследования

Исследовано 302 образца мононуклеарных лейкоцитов периферической крови, полученных в период с 1996 по 2005 г г от лиц, которые были зарегистрированы с диагнозом «ВИЧ-инфекция» на территории 17 регионов России На момент забора крови обследуемые лица никогда не принимали АРВ-препараты и находились на стадии Ш («латентной») ВИЧ-инфекции по Российской классификации ВИЧ-инфекции Покровского В И 2001 г Возраст их варьировал от 0,5 года до 65 лет, а в среднем составлял 24 года ± 8 лет (стандартное отклонение) Соотношение полов было 164 (мужчины): 134 (женщины) Основными факторами риска заражения ВИЧ-1 было потребление инъекционных наркотиков (45,3%), гетеросексуальные контакты (27,3%), в 25,8% случаев путь передачи остался неизвестным Образцы были собраны совместно с коллективом лаборатории вирусов лейкозов ГУ НИИ вирусологии имени Д И Ивановского РАМН благодаря участию сотрудников региональных центров, а также Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИДом Определение генетического подтипа ВИЧ-1 в образцах проводили ранее описанными методами сравнительной оценки электрофор етической подвижности гетеродуплексов по генам env (Del wart et al, 1993) и gag (Heyndrickx et al, 2000) Для изучения генетической изменчивости и частота встречаемости мутаций использовали выборку, которая не включала лиц, по результатам эпидемиологического расследования принадлежавших одним и тем же эпидемиологическим цепочкам (всего исследовано 256 таких лиц, инфицированных ВИЧ-1 подтипа А (п~253) или рекомбинантной формой вируса CRF03 AB (п=3)) Для изучения возможности передачи от человека к человеку основных вариантов ВИЧ-1, несущих мутации гена pol, дополнительно исследовали образцы, полученные от 46 лиц, которые были эпидемиологически связаны с пациентами из основной выборки и все инфицированы ВИЧ-1 подтипа А

Фрагменты гена pol амплифицировали гнездовым методом ПЦР и анализировали тремя методами' с помощью прямого автоматического определения нуклеотидных последовательностей (74 образца), молекулярной гибридизации на биологических микрочипах (150 образцов) и рестрикционного анализа (89 образца) При анализе одних и тех же панелей образцов разными методами противоречивых данных не выявлено

Определение нуклеотидных последовательностей проводили в трех «перекрывающихся» амплифицированиых фрагментах гена pol с координатами 2217-2596, 2484-3027 и 2931-3462 (координаты здесь и далее даны для ВИЧ-1 НХВ2, регистрационный номер в Gen Bank К03455) Работы по определению нуклеотидной последовательности ДНК проводили в сотрудничестве с Г А Шипулиным и А И Кругловой на базе ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспопгребнадзора; часть работ было проведено также на базе НИИ

молекулярной биологии имени В А Энгельгардга РАН В результате выравнивания, проводимого с помощью программы BioEdit 7 0 1, получали нуклеотидные последовательности области гена pol, кодирующей все 99 а о или, в некоторых случаях, с 4-го по 90-ый а о протеазы, и с 1-го по 246-ой а о или по 300-ый а.о ОТ Филогенетический анализ проводили с помощью программы Mega 2 1, статистическую обработку данных с помощью программ из пакета STAT1STTCA

Выявление точечных мутаций в гене pol ВИЧ-1, приводящих к заменам V77—>Т в протеазе и А62—>V в ОТ, проводили в амплифицированных фрагментах гена pol с координатами 2249-2564 и 2593-2923 соответственно Для этого использовали разработанные совместно с H И. Рудинским и В.М Михайловичем и изготовленные ООО «Биочип-ИМБ», Россия, биологические микрочипы HIV-Protease77Chip™ и HTV-RT62Chip™ Эксперименты по молекулярной гибридизации на микрочипах проводили на базе лаборатории биологических микрочипов НИИ молекулярной биологи имени В А Энгельгардта РАН при помощи сотрудников лаборатории Для выявления мутаций гена pol ВИЧ-1 подтипа А, приводящих к заменам V77—»I в протеазе и А62—»V в ОТ, методом рестрикционного анализа использовали эндонуклеазы Vspl ("Fermentas", Литва) или Psil («СибЭнзим», Россия) соответственно

2. Мутации лекарственной устойчивости в нукпеотидных последовательностях гена pol ВИЧ-1 подтипа А среди ВИЧ-1 -инфицированных лиц в России, не принимавших АРВ-препараты

Определены нуклеотидные последовательности области гена pol, кодирующей протеазу, (pro) у 74 образцов ВИЧ-1, принадлежащих, согласно предварительному анализу генов env и gag, генетическому подтипу А (п = 71 ) или рекомбинантной форме CRF03AB (п = 3) Из них для 46 образцов ВИЧ-1 подтипа А определены также нуклеотидные последовательности области гена pol, кодирующей как минимум первые 246 а о ОТ (Rt) В результате филогенетическиго анализа полученных нуклеотидных последовательностей гена pol установили, что все они действительно принадлежат генетическому подтипу А ВИЧ-1 Более того, они с высокой достоверностью образовывали общую ветвь на филогенетических деревьях с последовательностями варианта IDU-A, выявленными среди ПИН Украины (98UA0116), Белоруссии (97BL006) и Молдавии (97MD18) и опубликованными в GenBank ранее под номерами AF413987, AFI 93275 и AF400676 Этой же ветви принадлежали также все три последовательности pro рекомбинантных вариантов ВИЧ-1 CRF03 AB

Затем сравнили транслированные аминокислотные последовательности изучаемых вариантов ВИЧ-1 с консенсусом IDU-A, полученным путем выравнивания ранее опубликованных последовательностей 98UA0116, 97BL006 и 97MD18 При этом среди исследуемых образцов были обнаружены

две дефектных поледовательности протеазы н четыре дефектных последовательности ОТ Они содержали стоп-кодоны и были исключены из дальнейшего анализа, поскольку принадлежали заведомо нежизнеспособным вариантам вируса При анализе оставшихся транслированных последовательностей гена pol, в целом, отмечалась их высокая консервативность Так, в области протеазы значащие мутации встречались в 27 положениях из 99 (27,3%), но на каждую последовательность протеазы приходилась в среднем лишь 1,6 аминокислотная замена ± 1,1 (стандартное отклонение, размах от 0 до 5). Область ОТ характеризовалась еще большей консервативностью' среди первых 256 аминокислотных остатков этого фермента только в 46 положениях (18,0%) встречались замены. Каждая последовательность ОТ содержала от 0 до 8 аминокислотных замен, в среднем 3,9 ± 2,1.

Связь выявленных аминокислотных замен с лекарственной устойчивостью ВИЧ определяли с помощью базы данных лекарственной устойчивости ВИЧ Стэнфордского университета (http://hivdb Stanford edu). используя программы ViroLogic PhenoSense™ и HTVdb Program (Genotypic Resistance Interpretation Algorithm, Version 4 1 9 (02/24/06)) Прежде всего, необходимо отметить, что среди выявленных нами замен ни в протеазе, ни в ОТ не было первичных мутаций устойчивости, т е мутаций, снижающих чувствительность ВИЧ-1 к АРВ-препаратам. Ни одно из сочетаний выявленных мутаций не коррелировало с генотипами ранее анализированных клинических изолятов, обнаруживающих фенотипическую устойчивость к АРВ-препаратам, или генотипами ВИЧ-инфицированных больных, у которых АРВ-терапия была неэффективна Таким образом, проведенная интерпретация аминокислотных последовательностей показала, что исследуемые варианты ВИЧ-1 потенциально чувствительны ко всем известным ингибиторам протеазы и ОТ Полученные нами результаты согласуются с литературными данными о низкой распространенности первичных мутаций устойчивости среди не употребляющих АРВ-препараты ВИЧ-позитивных лиц в странах, где охват АРВ-терапией — по экономическим причинам или ввиду малого количества нуждающихся в ней - неширок (Soriano, 2004)

Несмотря на это, мы обнаружили некоторые вторичные мутации и другие аминокислотные замены в положениях, мутации в которых связаны с лекарственной устойчивостью у ВИЧ-1 подтипа В (Табл 1) Замены в 20-ом и 63-м положениях протеазы обнаруживались в единичных случаях, являясь, по-видимому, следствием типичного для этих участков полиморфизма

Таблица 1. Обнаруженные аминокислотные замены в положениях, мутации в

Название мутации Частота встречаемости в исследованных образцах Ранее

а о и его положение замена а о. опубликованная для подтипа А

в белке доля % частота**, %

«дикого типаз»*

Пооте аза

К20 — N 1/72 1,4 <1

М36 -»I 72/72 100,0 98,6

L63 1/72 1,4 9,3

->Т 1/72 1,4 2,6

V77 — I 41/72 56,9 3,1

193 — L 51/51 100,0 6,2

Обоат ная транскрипт аза

А62 — V 24/42 57,1 <1

V179 -»I 2/42 4,8 74,6

L210 S 1 /42 2,4 <1

*3а «дикий тип» условно принят а о., наблюдаемый в консенсусе последовательностей ВИЧ-1 подтипа В, полученных от нелеченных АРВ-препаратами лиц.

"Ранее опубликованные значения частоты встречаемости мутаций среди нелеченных АРВ-препаратами лиц, инфицированных ВИЧ-1 подтипа А, приведены из базы данных лекарственной устойчивости ВИЧ Стэнфордского университета fhttpV/hivdb Stanford.edul, по состоянию на 10 02 2004, и являются результатом анализа 225 последовательностей протеазы и 160 последовательностей ОТ Жирным шрифтом обозначены полученные значения частоты встречаемости, которые статистически значимо отличаются от опубликованных прежде (р<0,01 при использовании z-критерия)

Присутствие изолейцина в 36-м положении протеазы всех анализированных последовательностей также не противоречит ранее известным данным, согласно которым именно этот аминокислотный остаток в 36-м положении характерен для подтипа А, более того, — не только А, но и для других не-В подтипов (Kantor and Katzenstein, 2003; Cornelissen et al, 1997) Замена лейцина на серин в 210-ом положении ОТ обнаружена в единственном образце и является полиморфным вариантом этого положения ОТ, в котором может возникать мутация устойчивости L210—»W Сообщений о том, что сама замена L210—»S влияет на лекарственную устойчивость, не найдено В случае же мутации VI79—»I, проявляющей свойства вторичной мутации у ВИЧ-1 подтипа В, имеет место парадоксальная ситуация' частота встречаемости этой замены среди исследованных вирусов IDU-A (4,8%) оказалась значительно ниже, чем величина, характерная в целом для подтипа А (74,6%), в котором изолейцин принадлежит консенсусу 179-го положения ОТ

Существенное расхождение полученных значений частоты встречаемости с литературными данными наблюдали в трех случаях' для мутаций V77—»I и

193—>L в последовательности протеазы и А62—»V - в последовательности ОТ Замена 193—»L в протеазе обнаруживалась не только в 100% исследованных нами образцов, но и во всех последовательностях варианта IDU-A, выделенных в 1997 - 2001 тт на Украине, в Белоруссии, Молдавии, Испании, а также у его рекомбинантной формы CRF03 АВ, впервые обнаруженной в 1996 г в Калиниграде Скорее всего, эту замену содержал исходный вариант ВИЧ-1 подтипа А, проникший в популяцию ПИН в 1995 г и распространившийся вскоре по странам бывшего СССР

Особое внимание обращают на себя замены VII-Л в протеазе и А62—»V в ОТ, частота встречаемости которых резко превышает характерные для ВИЧ-1 подтипа А значения При этом замена V77—>1 в протеазе, из 10 последовательностей вируса IDU-A, опубликованных ранее, определялась только в одном случае - в последовательности LP27, выявленной у российского иммигранта в Испании в 2001 г (регистрационный номер в GenBank AF455622) Более того, мутация V77->I также отсутствовала во всех анализированных нами или другими исследователями образцах рекомбинантной формы CRF03AB, которая впервые была зарегистрирована в 1996 г среди ПИН Калининградской области Таким образом, можно предположить, что частота встречаемости замены V77—>1 среди вирусов TDU-A значительно возросла уже в ходе эпидемии ВИЧ-1 инфекции в России Интересно, что в подавляющем большинстве случаев эта мутация оказывалась сцепленной в геноме вируса с заменой А62-»V в ОТ' из всех 26 V77—»1-содержащих вариантов 19 (73,1%) содержали также и мутацию А62—>V Что касается последней, то прежде сообщений о ее высокой распространенности среди лиц, не принимавших АРВ-преттараты, не появлялось Она отсутствовала также во всех последовательностях варианта TDU-A, опубликованных ранее Это позволяет предположить, что замена А62—>V в ОТ, как и V77—4 в протеазе, возникла в геноме вируса IDU-A уже в ходе эпидемии ВИЧ-инфекции среди ПИН, возможно, на территории России

Кроме мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью ВИЧ-1 (Табл 1), нужно отметить ряд замен в сайтах полиморфизма, частота встречаемости которых среди анализируемых образцов IDU-A превышала значения, характерные для подтипа А (р<0,001 по z-кригерию) К числу этих замен относятся K14-»R в протеазе (76%), а также К11->Т (100%), V35-»I (62%), E36-*D (91%), Т39-К (81%), K102-Q (12%), A158->S (86%), K173^L (86%), Q174—»К (98%), V245—>M (88%), E248->D (100%), А272-*Р (100%) и К277—R (75%) в ОТ (в скобках указано полученное значение частоты встречаемости)

3. Филогенетический анализ четырех обнаруженных в России вариантов ВИЧ-1 подтипа А, различающихся по мутациям ОТ7->1 в протеазе и А62-Л/ в обратной транскриптазе

В результате анализа генетических данных, полученных на предыдущем ■этапе работы, обнаружено четыре варианта нуклеотидных последовательностей гена pol вируса TDU-A, доминирующего в России, которые различались наличием или отсутствием мутаций V77-»T в протеазе и/или А62—»V в ОТ Так, среди всех 42 последовательностей провирусной ДНК, включающих области pro и Rt, 11 не содержали ни одной из указанных мутаций («дикий тип», Wt), 19 содержали обе мутации (MutVm<Ai;2v), 7 и 5 содержали только V77—»1 (Mutv77i) или A62-»V (MutA62v) соответственно В связи с этим возникает вопрос, имеют ли выявленные нами мутантные варианты вируса общее происхождение, или все случаи возникновения мутаций происходили независимо друг от друга Как видно из представленных на Рис 1 данных, ветвь филогенетического дерева, образованная исследуемыми последовательностями гена pol варианта IDU-A, неоднородна В ней с высокой достоверностью выделяется два «дочерних» кластера' один, в который входят все пять последовательностей генотипа MutA62v, и другой, объединяющий все варианты генотипов Mutv77i/Afi2v и Mutv77i Интересно, что последние оказываются на одной ветви друг с другом, будучи выделены из разных регионов России, тогда как вирусы дикого типа из тех же регионов (Алтайского, Хабаровского краев, Москвы, Пермской и Свердловской областей) располагаются вне этого кластера, близко к корню общей ветви IDU-А Эта картина, по-видимому, говорит об общем происхождении всех V77—>1-содержащих вариантов IDU-A и последующем распространении их по территории России, которое происходило на фоне циркуляции вирусов дикого типа Вирусы генотипа MutA62v также оказались филогенетически родственны друг другу, что можно было предположить, принимая во внимание однородность их географического источника - Красноярский край Однако их ветвь не принадлежит кластеру Mutv77i/A62v, что указывает на отсутствие прямых родственных связей между ними и вариантами Mutv77i/AS2v

Одним из ответов на вопрос о происхождении генотипов Muivra и MutA62v может быть предположение об их рекомбинантной природе Согласно этому предположению, генотип Mutv77I/A62V> однажды возникнув и распространившись по регионам России, где циркулировал и его родительский дикий штамм IDU-A, рекомбинировал с ним, что привело к образованию

ГеНОТИПОВ MutvT7I И MutA62V

90

Г

rRU0119lrV*+ P— RU0115 lrk*+ RU11114 Krsk*+ RU11049 Noyab*-RU0159 Khab*+ t RU0157 Khat>*+ L RU0160 Khab*+ , RU876 Ekat*+ RU873 Ekat*+ IRU878 Ekat*+

- RU078 AT+

- RU1994 Alt*+

- RU068 Alt*+ RU11152 Pemf+

_r RU1697 Mosc*+ g^l RU1692 Mosc*+ RU1337 Tver*+ RU1260 TVer*+

- RU11167 Perm* RU1579 Mosc*

RU1259 Tver*

- RU872 Ekat* RU1435 Tver*+ RU11157 Pernf

HRU1593 Perm* ggt RU1595 Perm*

iRU0205 Krek+ RU0167 Krsk+ RU0170 Krsk+ RU0163 Krsk+ ^ - RU0206 Krsk+ CONSENSUS IDU-A

— RU874 Ekat

— RU11070 A*

— RU11098 Krsk L RU1683 Mosc

RU1953 Perm

— RU11187 Perm "— RU0158 Khab

RU0137 Krdar - RU11022 Rost — RU0133 Krdar -RU0130 Krdar

A1 KE 94 Q23 17 A1 SE 94 SE7253 -A2 CY 94 94CY017 41

— A2 CD 97 97CDKFE4 B FR 83 HXB2

B US 86 JRFL C BR 92 92BR025 C BW 96 96BW0502 G BE 96 ORCBL G Fl 93 HH8793 12 1 O BE 87 ANT70

Mut77l и Mut77l/62V

Mut62V

IDU-A

Рис. 1. Филогенетическиое дерево, построенное методом ближайших соседей в результате анализа слитных нукпеотидных последовательностей длиной 1014 пн, кодирующих протеазу и первые 246 а о ОТ ВИЧ-1 Цифры у основания ветвей филогенетического древа указывают частоту (%), с которой данные последовательности оказывались на одной ветви в 500 независимых построениях Обозначения рядом с названием последовательности указывают наличие в ней мутации У77->1 (*), наличие мутации А62-Л/ (+), или наличие обеих мутаций (*+)

Чтобы проверить это предположение, мы анализировали все нуклеотидные замены, по которым генотип Mutv77i/A62v отличался от генотипа Wt (р=0,006 по z-критерию), и эти же положения в последовательностях Mutvrn и Mut^v Как показано в Табл 2, подавляющее большинство последовательностей варианта Mutv77i/A62v, наряду с мутациями в кодонах 77 протеазы и 62 ОТ, содержали характеристические мутации в кодонах 31 и 78 протеазы и кодонах 29, 35, 66, 67, 149, 170 и 246 ОТ, из которых все были синонимичными, кроме мутации в 35-ом положении ОТ Все эти мутации отсутствовали в большинстве образцов ВИЧ-1 дикого типа При анализе последовательностей Mutvm и Mut^v обнаружено, что набор характеристических мутаций и в pro, ив/?/ был либо практически полностью сохранен (как в вариантах Mutv77i), либо отсутствовал (образцы MutA62v из Красноярска) Это противоречило предположению о рекомбинантной природе генотипов Mutvm и Mut\62v, поскольку согласно ему следовало ожидать сохранения характеристических мутаций только в той области гена pol, которая произошла от мутаятного варианта Mutv7WA62v, при одновременном отсутствии мутаций в участке, произошедшем от вируса дикого типа.

Таблица 2. Характеристические мутации в гене ро/ у вариантов ВИЧ-1 подтипа А в России

Кодоны, их положение и кодируемые а.о.

РоА генотип Исследуемые Протваза Обратная транскпиптаза

образцы* 31 77 78 29 35 62 66 67 149 170 246

т V-I G Е T-.I A-.V к D L Р L

Wt Консенсус АСА GTA GGA GAG АСА GCT AAG GAC СТТ ССС CTG

Muttf77WM2W Консенсус R A.. ..G . -А • Т. ■ Т. . .А

Mutv77! RU872.Ekat

RU1579.Mosc . . G

RU11157.Perm . . G А.. . -G ■ Т. . -А

RU1593. Perm

RU159S.Perm . .G

RU11ie7.Perm

RU1259.Tver

Milw RU0163.Krsk RU0167.Krsk RU0170.Krsk RU0206.Krsk RU0205.Krsk

*Дпя образцов генотипов \ЛЛ и М^ут/дегу представлены консенсусные последовательности, полученные с помощью выравнивания соответсвенно 11 и 19 анализированных нуклеотидных последовательностей ВИЧ-1 подтипа А. Для образцов генотипов ЫМддо и Ми^ приведен номер образца и, сокращенно, место проживания пациента. Жирным шрифтом вцделены несинонимичные мутации.

Сравнительный анализ наборов характеристических нуклеотидных замен у генотипов Mutvra и Mutw7i/A62v позволил предположить схему постепенного накопления мутаций геномом ВИЧ, согласно которой сначала образовался вариант Mutvrn, потом в нем возникла и закрепилась мутация А62—»V в ОТ, а вслед за ней - синонимичные мутации в 29-ом, 149-ом и 246-ом положениях ОТ. Отсутствие характеристических нуклеотидных замен в вирусах с генотипом Mut^v позволяет предполагать, что они возникли из вариантов дикого типа путем прямой мутации в 62-ом кодоне ОТ

Генетическая изменчивость в области pro, определенная по Kim ига, среди всех 42 образцов варьировала в пределах 0,00 - 5,05 (среднее значение 1,72 + 1,10 стандартное отклонение), а в области Rt была несколько выше, составив в среднем 2,01 ± 0,75 и варьируя от 0 до 4,06. При более детальном исследовании нуклеотидных последовательностей гена pol мы обнаружили, что мутанта ые варианты ВИЧ-1 IDU-A отличаются от своего «родительского» вируса Wt не только более высокой генетической гомогенностью (что согласуется с более поздним временем их возникновения), но и более низким уровнем изменчивости в области pro, по сравнению с областью Rt (Рис 2А). Это

А. Генетические дистанции

Б. Содержание синонимичных мутаций

В. Содержание несинонимичных мутаций

О pro pg Rt

Рис 2 Анализ генетической гетерогенности областей pro и Rt у вариантов ВИЧ-1 IDU-A четырех poí-генотипов. Внутригрупповые генетические дистанции (А) рассчитаны по двухпараметрическому методу Kimura; содержание синонимических (Б) и несинонимических (В) мутаций рассчитано методом Ne¡—Gojobori (с коррекцией Jukes—Cantor) Точками обозначены медианы значений, высотой прямоугольников - интерквартильный интервал, высотой линий - размах значений.

различие было полностью обусловлено более низкой частотой синонимичных мутаций в pro, чем в Rt, что, по-видимому, указывает на более высокую природную мутабельность области Rt (Рис 2Б) Тем не менее, давление негативного отбора на вирусную популяцию нивелирует данные различия, приводя к практически одинаковому уровню частоты несинонимичных мутаций в pro и Rt (Рис 2В). Интересно отметить, что мы не обнаружили тех же закономерностей при анализе последовательностей ВИЧ-1 IDU-A дикого типа' у них различия в характере изменчивости pro и Rt отсутствовали Можно предположить, что при относительно более долгой циркуляции вариантов ВИЧ-1 IDU-A дикого типа различия между pro и Rt в темпах изменчивости стираются за счет постепенного накопления мутаций (именно синонимических) областью pro В то же время, в геноме вариантов Mutv77i/A62v, Mutvm и MutA62v, которые являются эволюционно более «молодыми», чем Wt, и циркулируют менее долго, мы эти различия смогли обнаружить. С другой стороны, различие в характере генетической изменчивости областей pro и Rt у мутантных вариантов ВИЧ-1 IDU-A может объясняться другими причинами Выяснение их, а также клинического и общебиологического значения этого феномена, по-видимому, должно явиться предметом дополнительных исследований

4. Распространение вариантов ВИЧ-1 подтипа А, четырех pol-генотипов, в разных регионах России на протяжении 1996—2005 гг.

Для дальнейшего изучения циркуляции обнаруженных в России вариантов ВИЧ-1, различающихся по мутациям V77-+I в протеазе и/или A62-+V в ОТ, мы разработали методы, позволяющие различать четыре pol-генотипа вирусов IDU-A без определения их нуклеотидных последовательностей Эти методы были основаны на технологии молекулярной гибридизации на биологических микрочипах и рестрикционном анализе

На первом этапе, чтобы выяснить, действительно ли сохраняется генотип каждого из вариантов ВИЧ-1 подтипа А при передаче от человека к человеку, мы исследовали 17 групп эпидемиологически связанных друг с другом ВИЧ-инфицированных лиц Для этого, с помощью указанных методов (а в некоторых случаях и с помощью определения нуклеотидных последовательностей) дополнительно анализировали образцы провирусной ДНК, полученные от 46 инфицированных ВИЧ-1 подтипа А лиц с установленными эпидемиологическими связями В результате анализа обнаружено, что генотип вируса сохранялся во всех случаях передачи инфекции вне зависимости от пути заражения (примеры изученных эпидемиологических цепочек показаны на Рис

3) Интересно, что ни в одном из 20 исследованных случаев передачи от человека к человеку ВИЧ-1 IDU-A дикого типа мы не обнаружили спонтанного возникновения ни мутации V77—>Т в pro, ни мутации А62—»V в Rt Необходимо, однако, отметить, что детекцию этих мутаций мы проводили непосредственно в ПЦР-продуктах фрагментов гена pol, без стадии предварительного клонирования Поэтому выявить минорные варианты вируса, возникающие в организме человека, мы не могли Тем не менее, можно предположить, что, даже если они и существовали, мы не зарегистрировали признаков их доминирования в популяциях ВИЧ-1 каждого пациента Это говорит о том, что случай, который привел к селекции вариантов вируса с мутантньтми генотипами Mutv77i/A62v и Mutv77i был, по-видимому, редким тлением

~950~| 1 954 I—] 953

> >1

956*] I 952 |—[95Г

426>К42П)

423*

Г?

390 383

382

|1026| >(1024)

<ä ÜL

009 ^В 010

324

330 ^- 329

326

381 > (545"

□Wt HMutvTTi Ц Mutv77i/A62v □ MutAe2V

Рис. 3. Передача вариантов ВИЧ-1 IDU-A четырех pof-генотипов от человека к человеку Овалами обозначены женщины, прямоугольниками - мужчины Цифры - номера пациентов, фигуры без цифр - неисследованные нами лица Линии показывают эпидемиологические связи, стрелки - направление передачи инфекции, если оно установлено Сплошные тонкие линии - совместное употребление инъекционных наркотиков, сплошная толстая линия -переливание крови, пунктирные линии - гетеросексуальные контакты, стрелка с черным кружком - вертикальный путь передачи Звездочками обозначены образцы, охарактеризованные только относительно мутации V77I в pro (*). или только относительно мутации A62V в Rt (*").

На следующем этапе, чтобы подробно исследовать распространенность в России вариантов вируса, несущих мутации V77—»1, А62—>V или их сочетание, мы анализировали 253 образца провирусной ДНК ВИЧ-1 подтипа А, собранные на территории России в 1996 —2005 гг Во избежание искажений частоты встречаемости мутаций, в эту выборку мы не включили образцы, которые были получены от принадлежавших одним и тем же эпидемиологическим цепочкам лиц В результате комплексного использования методов определения нуклеотидных последовательностей, молекулярной гибридизации на биологических микрочипах и рестрикционного анализа, охарактеризовано 246 образцов относительно мутации V77—»1 и 186 — относительно мутации А62—>V Рассчитанные значения частоты встречаемости этих мутаций составили 60,2% (148/246) и 51,6% (96/186) соответственно При этом состояние обоих кодонов, по которым можно было сделать заключение о генотипе вируса, - 77-ого кодона в pro и 62-го в Rt - удалось определить в случае 179 образцов На Рис 4 представлены данные о распространенности четырех обнаруженных в настоящем исследовании ро/-генотипов среди вариантов ВИЧ-1 IDU-A, циркулирующих в 14 регионах России В целом по стране наибольшую частоту встречаемости (78/179, 43,6%) обнаружил генотип MutV77i/4f>2v Следующим по распространенности оказался дикий тип вируса (50/179, 27,9%), за которым располагались варианты, несущие лишь одну из мутаций MutV77i (34/179, 19,0%) и MutA62V (17/179, 9,5%) Представляет интерес географическое распределение вариантов вируса, обнаруживаемых в России в ходе эпидемии ВИЧ-инфекции (Рис 4)

В 1996-1997 г в южных регионах России (в Краснодарском крае, Саратовской и Ростовской областях), которые были охвачены эпидемией ВИЧ-1 инфекции в первую очередь, обнаружен только дикий тип ВИЧ-1 1DU-A Первым регионом, в котором были зарегистрированы мутантные генотипы, оказалась Тверская область, причем там практически одновременно, весной 1997 г, были выявлены случаи инфекции сразу двумя вирусами' Mutvni и Mutv77i/A62v, что, по-видимому, подтверждает их эволюционное родство Можно предположить, что в Тверской области они и образовались, или были занесены туда из неисследованных нами регионов Вслед за эпидемией в Тверской области, в 1998 г была зарегистрирована вспышка ВИЧ-инфекции среди ПИН в Московской области и Москве В ней мы обнаруживали и вирусы IDU-A дикого типа, занесенные туда раньше, и оба тверских варианта Возможно, распространение в столице инфекции вирусами, содержащими мутацчю V77—»1 в pro, определило эпидемиологическую ситуацию во всей стране Так, в 1999 г

ВСЕГО (179) Магаданская обл (5) Хабаровский край (4) Алтайский край (36) Ямало-ненецкий АО (1) Свердловская обл (9) Пермская обл. (51) Красноярский край (23) Иркутская обл (5) Тюменская обл. (4) Московская обл. (19) Тверская обл (5) Ростовская обл. (6) Саратовская обл (5) Краснодарский край (6)

Г " " Т........-......... ....... ........... ■

1 .................5.............................. ................

1 .................Г ■

2004 2001 2000 2000 2000 1999 1999 р 1999 р 1999 1998 1997 1997 1996 19%

0% 20% 40% 60% 80% 100%

[□Wt □ MutA62V □ MutV77l ■ MutV77l/A62V

Рис. 4. Распределение по регионам России четырех роАгенотипов ВИЧ-1 IDU-A, различающихся наличием/отсутствием мутаций V77I в pro и A62V в Rt Рядом с названием региона в скобках указано количество исследованных образцов Справа указан год начала эпидемии ВИЧ-инфекции в регионе (по Покровскому и соавт, 2005)

вспыхивают эпидемии ВИЧ-инфекции в Пермской, Тюменской, Иркутской областях и Красноярском крае Мы регистрируем появление варианта ВИЧ-1 с генотипом Ми1у77т/Аб2У везде, кроме Тюменской области, где обнаруживаются вирусы дикого типа, как и на юге Интересно, что на этом этапе появляются случаи инфекции вирусом М^д^гу, сначала - редкие - в Перми (даты их выявления здесь относятся к 1997-1998 гг), потом преобладающие - в Красноярском крае Однако, широкого распространения во всей стране они, по-видимому, не получили Вспышки, зарегистрированные в 2000 г и позже - в Екатеринбурге, в Алтайском крае и на Дальнем Востоке, характеризуются гетерогенностью популяции ВИЧ-1 подтипа А с тенденцией к доминированию мутантного варианта МгЛутл/Авгу

Необходимо отметить, что в ходе эпидемии ВИЧ-инфекции в России соотношение частоты встречаемости между ¿»/-генотипами ВИЧ-1 ГОИ-А

существенно меняется (Рис 5) Если среди случаев ВИЧ-инфекции, зарегистрированных до 1998 г, преобладали варианты дикого типа, то в последующие периоды времени все чаще выявляются вирусы генотипа Mutv77i/A62v - их распространенность возросла почти в два раза, - и генотипа Mutv77i, который стал встречаться более чем в три раза чаще Таким образом, по-видимому, развитие эпидемии ВИЧ-инфекции в России в период с 1996 по 2004 гг сопряжено с ростом частоты встречаемости вариантов, содержащих мутацию V77—»1 в pro, среди вновь выявляемых случаев инфекции ВИЧ-1 подтипа А

5. Обсуждение полученных данных о распространении мутантных вариантов ВИЧ-1 подтипа А в России

Полученные в результате настоящего исследования данные говорят о возникновении и нарастающей циркуляции в России вирусов IDU-A с мутантными /«/-генотипами Mutvrn и Mutv77i/A62v Это явление, по-видимому, повлияло на эпидемию ВИЧ-инфекции и в некоторых странах Ближнего Зарубежья, где отмечается повышение частоты встречаемости мутации V77—>Т в pro (Vazquez de Parga et al, 2005) и A62-VV в Rt среди ВИЧ-1 подтипа A (Carr et al, 2005) Обращает на себя внимание тот факт, что среди всех четырех генотипов наибольшее распространение получил вариант Mutv77i/A62v В связи с этим возникает вопрос, не вызвана ли такая селекция варианта Mutv77i, а затем и Mutv77i/A62v. какими-либо их преимуществами перед вирусом дикого типа, которые и способствовали быстрому распространению Mutv77i/A62v

Анализ эпидемиологической ситуации, сложившейся на начало 1997 г в России показывает, что эта «селекция» могла быть и не связана с возможными биологическими особенностями мутантного варианта вируса, а вызвана эпидемиологическими факторами. На 1 января 1997 г в России было зарегистрировано 2607 ВИЧ-инфицированных граждан, при этом 83,4% являлись ПИН Новая вспышка в Тверской области в начале 1997 г была одной из самых больших на территории России, наряду с Калининградским очагом, выявленным в тот же период, и очагами в Краснодарском крае и Ростовской области, выявленными ранее, в 1996 г. В связи с этим, проникновение варианта Mutv77i/A62v ВИЧ-1 из Твери в «еще не освоенные вирусом» в то время крупные индустриальные регионы России — в Москву и Московскую область, а затем на Урал, в Сибирь и на Дальний Восток — само по себе могло обусловить широкомасштабную эпидемию Эти территории характеризуются большим числом наркопотребителей, поэтому там было возможно одновременное

заражение одним вариантом вируса больших групп людей из-за использования нестерильного оборудования при приготовлении или употреблении наркотиков Тем не менее, интересно, что в ряде городов, как, например, Москва или Пермь, циркуляция V77—►Т-содержащих вариантов начиналась на фоне достаточно широкого распространения вируса дикого типа, но все-таки приводила к возрастанию частоты встречаемости мутантных вариантов Поэтому не исключено, что эти вирусы обладают определенными особенностями - повышенной репликативной активностью или другими биологическими свойствами, дающими им преимущества перед вариантами ВИЧ-1 дикого типа На популяционном уровне большое значение могут иметь и такие свойства вируса, как, например, его стабильность в окружающей среде или доза, обеспечивающая заражение при парентеральном пути передачи

В результате сопоставления полученных данных с базой данных эпитопов ВИЧ-1 Национальной лаборатории в Лос-Аламосе, Нью-Мехико, США, (http7/hiv-web.lanl gov) обнаружено, что ряд выявленных нами аминокислотных замен в продуктах гена pol находится в участках антигенных детерминант ВИЧ-1, распознаваемых цитотоксическими Т-лимфоцитами Так, например, область

всего 68

всего 56

всего 24

■ MutV77l/A62V

□ MutV77l

□ MutAB2V

; awt

1996-1998 1999-2001 2002-2004

Рис. 5. Изменение частоты встречаемости в России вариантов ВИЧ-1 Ю1)-А четырех ро1-генотипов с течением времени По оси X представлены периоды времени, в которые были зарегистрированы исследованные случаи ВИЧ-инфекции По оси У представлено количество исследованных случаев ВИЧ-инфекции с известными датами выявления.

мутации Vil-Л в протеазе принадлежит эпитопам VLVGPTPVNI (а о 75-84) и LVGPTPVNT (а о 76-84), представляемым молекулами гистосовместимости супертипа HLA-A2, а область мутации A62-*V в ОТ - HLA-A3-рестрицируемому эпитопу NTPVFATKK (а о 57-65) Кроме того, характеристическая для генотипа Mutv77i/A62v замена V35—>1 в ОТ тоже принадлежит эпитопам ALVEICTEM (а.о 33-41, HLA-A2) и ALVEICTEMEK (а о 33-43, HLA-A3). Хотя и неизвестно, обеспечивают ли выявленные мутации ускользание ВИЧ-1 от клеточного иммунного ответа, можно предполагать, что их первичная селекция была связана именно с этим Это предположение подкрепляется некоторыми данными, указывающими на значительную частоту встречаемости в России аллелей HLA-A2 и HLA-A3 (Зарецкая, 1983), хотя с этой точки зрения труднее объяснить широкомасштабное распространение мутантных вирусов среди жителей разных регионов России, вероятно, отличающихся друг от друга по генам комплекса гистосовместимости

Нельзя исключить также то, что изменения, которые, возможно, обеспечивают вирусу Mutv77i/A62v определенные биологические преимущества, сосредоточены в каких-то других областях его генома, например, регуляторных Согласно этому предположению, выявленные нами замены V77-»I, А62—>V и другие характеристические мутации могут просто являться генетическими маркерами этого варианта ВИЧ-1

Представляется важным рассмотреть, как выявленные нами особенности гена pol циркулирующих вариантов ВИЧ-1 могут сказаться на эффективности АРВ-терапии пациентов, инфицированных такими вирусами Причем к этим особенностям относятся не только мутации V77—>1 в протеазе и А62—»V в ОТ, закрепившиеся в геноме ВИЧ-1, по-видимому, в ходе эпидемии в России Помимо этих замен, подавляющее большинство вирусов подтипа А содержит в последовательностях протеазы вторичные мутации М36—»I и 193—»L, первая из которых характерна для всех вариантов этого генетического подтипа и многих вариантов других не-В подтипов (Kantor and Katzenstein, 2003; Corneiliscn et al, 1997) и поэтому не обсуждалась нами собственно как мутация, а вторая, по-видимому, принадлежала изначальному варианту ВИЧ-1 подтипа А, вызвавшему эпидемию среди ПИН стран Восточной Европы и бывшего СССР

Необходимо подчеркнуть, что все перечисленные мутации не обусловливают лекарственной устойчивости в отсутствие первичных мутаций (Qumones-Mateu and Arts, 2001) Однако в литературе накапливается все больше информации о том, что присутствие в геноме вируса вторичных мутаций до начала АРВ-терапии снижает эффективность терапии Так, по некоторым данным (Servais et al, 2001 ), к факторам, статистически достоверно вызывающим

ухудшение ответа на терапию, включающую ингибиторы протеазы, относится наличие пяти или более вторичных мутаций в протеазе ВИЧ-1 до начала лечения, или присутствие замены Т93—»L в протеазе также до начала лечения Это, очевидно, связано с тем, что, в условиях воздействия АРВ-препаратов, такие полиморфные вирусы легче накапливают первичные мутации устойчивости, причем не только к ингибиторам протеазы, но и к ингибиторам ОТ (Weber et al, 2003) Что касается замены A62-»V в ОТ, то аналогичных исследований не проводили, поскольку эта мутация не выявлялась ранее среди нелеченых ВИЧ-инфицированных лиц Она была описана как вторичная мутация, сопровождающая вместе с другими заменами в ОТ (V75—>1, F77—>L и Fl 16-»Y) появление первичной мутации устойчивости Q151—>М Известно, что комплекс из всех пяти мутаций, называемый Q151—»М-комплексом, вызывает множественную устойчивость ко всем нуклеозидным ингибиторам ОТ, кроме ламивудина и тенофовира (Iversen et al, 1996) В ходе терапии замена А 62—»V отбирается в последнюю очередь, что у пациентов сопровождается ростом вирусной нагрузки (Shirasaka et al., 1995) В исследованиях in vitro добавление мутации A62-»V в геном гибридного вируса, содержащего в ОТ остальные четыре мутации, обеспечивало получившемуся мутанту репликативное преимущество даже перед вирусом дикого типа как в присутствии, так и в отсутствие АРВ-препаратов (Kosalaraksa et al, 1999)

Справедливо, однако, будет отметить, что подавляющее большинство вышеперечисленных данных получено при исследовании вариантов ВИЧ-1 генетического подтипа В, и роль обнаруженных нами вторичных мутаций в окружении генетического контекста, свойственного подтипу А, требует дополнительного исследования Тем не менее, эти данные позволяют выдвинуть предположение, что распространенные в России вирусы, содержащие полиморфную протеазу и мутацию А62—»V в ОТ, во-первых, могут труднее поддаваться лечению, быстро вырабатывая лекарственную устойчивость, а во-вторых, и в отсутствие терапии (у нелеченых лиц) могут обладать повышенной репликативной способностью Последняя гипотеза, несмотря на отсутствие в литературе экспериментальных данных, могла бы стать одним из вариантов объяснения сложившейся в России уникальной ситуации, заключающейся в преимущественном распространении вируса с генотипом MutvT7i/Afi2v на фоне циркуляции других вариантов ВИЧ-1 Возможность же затруднений в проведении АРВ-терапии у пациентов, инфицированных такими вирусами, настоятельно диктует необходимость постоянного мониторинга эффективности проводимого лечения с помощью определения вирусной нагрузки и тестирования лекарственной устойчивости ВИЧ-1.

выводы

1 Анализ ВИЧ-специфических нуклеотидньтх последовательностей гена pol позволил установить, что в России среди лиц, инфицированных ВИЧ-1 подтипа А и не принимавших АРВ-препарты, не выявляются первичные мутации устойчивости, но с высокой частотой встречаются мутации, известные как вторичные мутации устойчивости у ВИЧ-1 подтипа В и выражающиеся в заменах М36—V77—»1,193—>L в протеазе и A62->V в обратной транскриптазе Частота встречаемости этих мутаций составила 100,0%, 56,9%, 100,0% и 57,1 % соответственно

2 С помощью интерпретации данных генотипирования показана потенциальная чувствительность циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 подтипа А к действию ингибиторов протеазы и обратной транскриггт азы

3 Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена pol позволил идентифицировать четыре варианта ВИЧ-1 подтипа А, циркулирующих в России Три из них имеют мутантные ро/-генотипы Mutv77i/Af.2v, Mutv77i, MutA62v, к отличительным особенностям которых относятся мутации V77—>1 в протеазе и/или А62—>V в обратной транскриптазе, и один является «родительским» штаммом дикого типа

4 Варианты мутантных pol- генотипов Mutv77I/A62V, Mutv77I и MutA62V характеризуются более низким уровнем вариабельности гена pol, чем варианты ВИЧ-1 дикого типа, что в большей степени проявляется в области, кодирующей протеазу (0,74, 0,37 и 0,00 против 1,88 соответственно), чем в области, кодирующей обратную транскриптазу (1,09,0,95,1,23 против 2,06 соответственно).

5 Ро/-генотип циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 подтипа А сохраняется при передаче в от человека к человеку, что позволяет определять его в целях эпидемиологических расследований в очагах ВИЧ-инфекции Для определения pol- генотипа ВИЧ-1 подтипа А показана адекватность применения методов молекулярной гибридизации на биологических микрочипах и рестрикционного анализа

6 Варианты ВИЧ-1 подтипа А ро/-генотипов Mutv77i/A62v и Mutvra возникли, по-видимому, из одного источника не позднее 1997 г и распространялись быстрее, чем другие варианты вируса, что в период с 1998 по 2004 гг сопровождалось ростом частоты их встречаемости в России и к 2005 г привело к преобладанию вариантов Mutv77i/A62v

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Суханова АЛ., Бобков А Ф. Генетическое тестирование лекарственной устойчивости при ВИЧ-инфекции проблемы и перспективы // Эпидемиология и инфекционные болезни -2004 №4 -С 54-58

2 Суханова AJL, Казеннова Е В, Рудинский Н.И., Михайлович В М, Грядунов Д.А, Будилов А В , Булавкина М А , Weber J N, Покровский В В, Бобков А Ф Генетическая изменчивость области, кодирующей протеазу, у изолятов ВИЧ-1 подтипа А и рекомбинаягов CRF03AB на территории СНГ: возникновение и быстрое распространение варианта с заменой V77I // Вопросы вирусологии - 2004. № 49(6) -С 4-9

3 Рудинский Н И., Михайлович В М, Донников М Ю , Лапа С А, Суханова AJL, Казеннова Е В, Бобков А Ф, Заседателев А С, Покровский В В, Мирзабеков А Д. Разработка биологических микрочипов для выявления мутаций устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам протеазы и результаты из применения // Вопросы вирусологии - 2004 №49(6).-С. 10-15

4 Roudinskii N1, Sukhanova A.L., Kazennova EV, Weber JN, Pokrovsky VV, Mikhailovich V.M., Bobkov A.F Diversity of Human Immunodeficiency Virus Type 1 subtype A and CRF03 AB protease in Eastern Europe Selection of the V771 variant and its rapid spread in injecting drug user populations // Journal of Virology. - 2004 - Vol 78(20) -P 11276-11287

5. Bobkov A F, Kazennova E V, Selimova L M, Khanina T A., Ryabov G S, Bobkova M.R., Sukhanova A.L., Kravchenko A V, Ladnaya N N, Weber J N, Pokrovsky V V Temporal trends in the HTV-1 epidemic in Russia' predominance of subtype A II The Journal of Medical Virology -2004 - Vol 74(2).-P. 191-196.

6 Суханова AJL, Рудинский H И, Богословская E В, Круглова А И, Баппсирова JIЮ, Цыганова Г М., Шипулин Г А, Казеннова Е В, Аликина Ю И, Зверев С.Я, Гришечкин А Е, Покровский В В , Бобкова М Р , Бобков А.Ф Полиморфизм области генома, кодирующей протеазу и обратную транскриптазу, вариантов ВИЧ-1 подтипа А, распространенных на территории СНГ//Молекулярная биология -2005 №39(6) -С. 1063-1071

7 Гришечкин А Е, Казеннова Е В , Суханова А. Л, Белых С И, Султанов Л В , Демьяненко Э Р, Плотникова О И, Ладная Н Н, Покровский В В, Бобков А Ф Молекулярно-эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции на территории Алтайского края // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии -2006. №1 -С 15-19

8. Sukhanova А, Roudinsky N., Kazennova Е, Mikhailovich V., Pokrovsky V., Bobkov A The IDU-A HTV-1 variant bearing the V77I substitution in protease is spreading rapidly within the territory of the Former Soviet Union // HIV Medicine - 2004 - Preprint from Vol 5 Abstracts of the 2nd European HTV Drug Resistance Workshop' From Basic Science to Clinical Implications. Rome, Italy 11-13 March, 2004 - P 4-5 - Abstract 7 PI 7

9 Sukhanova A.L , Pokrovsky V V, Kazennova E V, Bobkov A F, Weber J N, Roudinskii N I., Mikhailovich V.M Genetic diversity of HTV-1 subtype A and CRF03AB protease at the territory of the former Soviet Union emergency and rapid spread of the V77I variant The XV International AIDS Conference Bangkok, Thailand 11 -16 July, 2004 - Abstract book - Vol 1 -P 91 - Abstract MoOiClOll

10 Kazennova E V, Bobkov A F, Selimova L M, Khanina T A , Bobkova M R., Sukhanova A.L, Kravchenko A. V, Ladnay N N, Pokrovsky V V, Weber J N Temporal trends in the HTV-1 epidemic in Russia The XV International AIDS Conference. Bangkok, Thailand, 1116 July, 2004 - Abstract book - Vol 1 -P 104 - Abstract MoPeC3421

11 Roudinskii NI, Mikhailovich V M., Bobkov A F, Sukhanova A.L Noval microarray hybridisation technique for testing HTV protease inhibitors resistance The XV International AIDS Conference Bangkok, Thailand 11-16 July, 2004 - Abstract book -Vol 2 -P 37 -Abstract WePeB5694.

12 Sukhanova A.L., Bobkov A F, Roudinskii NI, Mikhailovich V M, Pokrovsky V V HIV-1 in Russia' study of the IDU-A pol variants The 3rd European HIV Drug Resistance Workshop From Basic Science to Clinical Implications Athens, Greece 30 March -1 April, 2005. - Abstract book - Abstract 12

13. Sukhanova A.L., Roudinskii N1, Mikhailovich V.M, Pokrovsky V.V, Bobkov AF Gradual accumulation of the V77I protease and A62V RT mutations by IDU-A HTV-1 isolates in the former USSR The 12th International Workshop on HIV Dynamics and Evolution Cleveland, Ohio, USA 23-26 April, 2005 - Abstract book. - P 53.-Abstract 50

14 Аликина Ю И, Суханова AJI., Зверев С Я, Казеннова Е В, Гибадулин Р Г, Бобкова М Р, Рудинский Н И, Покровский В В., Бобков А Ф Молекул ярно-эпидемнологический мониторинг ВИЧ-инфекции на территории Пермской области, 1996—2004 гг Всероссийская научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» Суздаль, Владимирская обл 19-22 мая, 2005 - Сборник тезисов

15 Sukhanova A. L., Bogoslovskaya Е V, Roudinskii NI, Shipulin G. А , Mikhailovich V М, Pokrovsky V V, Bobkov A F The IDU-A HIV-1 variants harbouring both V77I protease and A62V RT mutations are spreading rapidly within the territory of Russia The 3rd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment Rio de Janeiro, Brazil 24-27 July, 2005 -Abstract book -P 280 - Abstract WePe4 1C13

16 Roudinskii N, Sukhanova A., Markova О , Mikhailovich V, Zasedatelev A , Bobkov A F Oligonucleotide microarrays in epidemiological surveillance for HTV-1 strains in former USSR areas The 3rd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment. Rio de Janeiro, Brazil 24-27 July, 2005.-Abstract book -P 137. - Abstract MoPel5.2C10

17 Bogoslovskaya E V, Sukhanova A.L., Kruglova AI, Bobkova M R., Bashlarova L Yu, Tsyganova G M, Shipulin G A, Bobkov A F, Pokrovsky V V Genetic polymorphism of HTV-1 in Russia The lO"1 European AIDS Conference (EACS) Dublin, Ireland 17-20 November, 2005 - Abstract book -P 31 - Abstract PE3 1/2

18 Zverev S, Alikina Y, Sukhanova A., Kazennova E, Roudinsky N, Bobkova M, Pokrovsky V, Bobkov A F Simultaneous spread of four subtype A HTV-1 variants among IDUs in Perm region of Russia The ю" European AIDS Conference (EACS) Dublin, Ireland 17-20 November, 2005.-Abstract book.-P 131-132 - Abstract PE17 2/1

Автор выражает глубокую благодарность и признательность

I Алексею Филипповичу Бобкову I и Вадиму Валентиновичу Покровскому за научное руководство, идею настоящей работы, полученные знания, постоянную помощь и поддержку при планировании, проведении исследования и анализе полученных данных;

Марине Ридовне Бобковой и Елене Валерьевне Казеиновой за обучение основным профессиональным навыкам, участие, поддержку, терпение и помощь при написании диссертации, без которых она никогда бы не была завершена;

Людям, чьи данные и клинические образцы были исследованы в работе,

Сотрудникам федеральных и территориальных центров по профилактике и борьбе со СПИДом, принимавшим участие в сборе и передаче клинического материала и эпидемиологических данных, и лично Сергею Яковлевичу Звереву и Юлии Игоревне Алтейной;

Всему коллективу лаборатории вирусов лейкозов ГУ НИИ вирусологии имени Д И Ивановского РАМН за совместный труд по обработке и генотипированию исследованных образцов ВИЧ-1;

Владимиру Михайловичу Михайловичу, Никите Игоревичу Рудинскому и коллективу лаборатории биологических микрочипов НИИ молекулярной биологии имени В А Энгельгардта РАН за разработку, изготовление, предоставление микрочипов и помощь в проведении опытов по молекулярной гибридизации;

Герману Александровичу Шипулину, Анне Игоревне Кругловой, Елене Владимировне Богословской и коллективу научно-производственной лаборатории ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора за совместную работу по определению нуклеотидных последовательностей ВИЧ;

Владимиру Владимировичу Лукагаову, Людмиле Фроловне Лидеман и Алексею Геннадиевичу Прилипову за прочтение рукописи, уделенное ей внимание, критические замечания и неоценимую помощь в формулировке ключевых положений диссертации

№ - 9 6 0 4

Подписано в печать 10.04.2006 Формат 60x90/16 ОбьСм 1.00 пл. Тираж 100 экз. Заказ №19040608

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912X772801001

Адрес: 117292, г. Москва, ул. Дмитрия Ульянова, д. 8, кор. 2.

Тел. 125-22-73.

http://www.imiverpriirt.nl

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суханова, Анна Львовна

ВВЕДЕНИЕ (4) ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 18)

Глава 1. ФАКТОРЫ МИКРОЭВОЛЮЦИИ ВИЧ-1 IN VIVO (8)

1.1. Репликативный цикл ВИЧ-1 (8)

1.2. Механизмы генетической изменчивости ВИЧ-1 (9)

1.3. Скорость репликации ВИЧ-1, квазивиды, жизнеспособность (11)

1.4. Естественный отбор (13)

1.5. Антиретровирусная терапия как фактор отбора устойчивых вариантов ВИЧ-1 (14)

Глава 2. ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНА POL ВИЧ-1, НАПРАВЛЯЕМАЯ ФАКТОРАМИ ОТБОРА (16)

2.1. Структура и функция протеазы (17)

2.2. Ингибиторы протеазы (ИП) (19)

2.3. Механизмы разви тия устойчивости ВИЧ-1 к ИП (19)

2.4. Структура и функция обратной транскриптазы (24)

2.5. Нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ) (27)

2.6. Механизмы развития устойчивости ВИЧ-1 к НИОТ (28)

2.7. Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ) (32)

2.8. Механизмы развития устойчивости ВИЧ-1 к ННИОТ (32)

2.9. Влияние клеточного иммунного ответа на вариации генаpol ВИЧ-1 (34)

Глава 3. ЛЕКАРСТВЕННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ ВИЧ В КОНТЕКСТЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ВАРИАНТОВ ВИРУСА (38)

3.1. Происхождение и генетическое разнообразие ВИЧ-1 (39)

3.2. Полиморфизм гена pol в отсутствие антиретровирусных препаратов (40)

3.3. Влияние генетического полиморфизма ВИЧ-1 на разви тие лекарственной устойчивости (43)

3.4. Эпидемиология передающейся лекарственной устойчивости ВИЧ-1 (48)

Глава 4. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭПИДЕМИИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ В РОССИИ (52)

4.1. Развитие эпидемии ВИЧ-инфекции в России и странах Ближнего Зарубежья (52)

4.2. Генетическая характеристика варианта ВИЧ-1 IDU-A, доминирующего в России (55)

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (57)

Глава 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ (57)

1.1. Объект исследования (57)

1.2. Сбор клинико-эпидемиологических данных (58)

1.3. Получение «грубых» лизатов мононуклеарных клеток периферической крови (59)

1.4. Определение генетического подтипа ВИЧ-1 (59)

1.5. Амплификация фрагментов гена pol ВИЧ-1 (62)

1.6. Выявление мутаций V77I и A62V с помощью биологических микрочипов (64)

1.7. Выявление мутаций V77I и A62V с помощью рестрикционного анализа (66)

1.8. Электрофоретический анализ препаратов ДНК в агарозном геле (67)

1.9. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК (68)

1.10. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей (70)

1.11. Статистическая обработка данных (70)

Глава 2. МУТАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ В НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ ГЕНА POL ВИЧ-1 ПОДТИПА А СРЕДИ ВИЧ

ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ В РОССИИ. НЕ ПРИНИМАВШИХ АРВ-ПРЕПАРАТЫ (71)

2.1. Предварительная характеристика исследуемых образцов (71)

2.2. Построение консенсуса нуклеотдиных последовательностей генаpol ВИЧ-1 варианта IDU-A. опубликованных к началу настоящего исследования (72)

2.3. Доказательства принадлежности исследуемых нуклеотидных последовательностей гена pol подтипу А ВИЧ-] (73)

2.4. Анализ аминокислотных последовательностей протеазы и ОТ ВИЧ-1 IDU-A (76)

2.5. Частота встречаемости мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью ВИЧ-1 (77)

2.6. Анализ потенциального влияния мутаций в гене pol ВИЧ-1 1DU-A на эффективность антиретровируспой терапии (79)

Глава 3. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЧЕТЫРЕХ ОБНАРУЖЕННЫХ В РОССИИ ВАРИАНТОВ ВИЧ-1 IDU-A. РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ МУТАЦИЯМИ V77I В PRO И A62V В

RT (НО)

3.1. Характеристика исследуемых групп (80)

3.2. Филогенетические взаимоотношения между вирусами четырех обнаруженных генотипов IDU-A ВИЧ-1 (81)

3.3. Изменчивость гена pol обнаруженных вариантов 1DU-A ВИЧ-1 (84)

ГЛАВА 4. РАСПРОСТРАНЕНИЕ ВАРИАНТОВ ВИЧ-i ПОДТИПА А ЧЕТЫРЕХ POL-ГЕНОТИПОВ В РАЗНЫХ РЕГИОНАХ РОССИИ В ПЕРИОД С 1996 ПО 2005 ГГ (87)

4.1. Изучение возможности применения биологических микрочипов и рестрикционного анализа для выявления мутаций V771 в pro и A62V в Rt (87)

4.2. Передача вариантов ВИЧ-1 IDU-A, несущих мутации V77I и/или A62V, в эпидемиологических цепочках (90)

4.3. Частота встречаемости /?о/-генотипов Wt, Ми177шу, МШ771 и Mut^v ВИЧ-1 1DU-A в разных регионах России и ее изменение в ходе эпидемии в стране (90)

4.4. Частота встречаемости мутаций V771 в pro и A62V в Rl ВИЧ-1 1DU-A в регионах России (96)

9 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ (98)

I. Вопрос о передающейся лекарственной устойчивости ВИЧ-1 в России (98) И. Генетическая гетерогенность вариантов ВИЧ-1 IDU-A, циркулирующих в России (100) Ш. Обсуждение возможных причин преимущественного распространения в России варианта IDU-A с /w/-ген о типом Mut77[/s2v О 06)

V. Обсуждение данных о клиническом значении выявленных мутаций в гене pol (108) ВЫВОДЫ (111)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменчивость гена pol вариантов вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) подтипа А, циркулирующих в России"

Актуальность проблемы

Угроза, которую представляет инфекция вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) здоровью человечества, выражена тремя аспектами: неизбежностью летального исхода заболевания, глобальным масштабом эпидемии и отсутствием средств специфической профилактики инфекции. По данным Федерального научно-методического центра по профилактике и борьбе со СПИД, в России на 10.04.2006 официально зарегистрировано 354031 случаев ВИЧ-инфекции; ежегодно увеличивается количество больных и умирающих от СПИДа (Покровский и соавт., 2005). Единственным известным на сегодняшний день средством, препятствующим прогрессии заболевания, является комбинированная антиретровирусная (АРВ) терапия, которая заключается в одновременном применении нескольких ингибиторов вирусных ферментов — протеазы и/или обратной транскриптазы (ОТ). Однако, основная проблема, осложняющая этиотропную терапию ВИЧ-инфекции, заключается в развитии устойчивости, или резистентности, вируса к действию лекарственных средств. Резистентные варианты вируса чаще всего возникают в популяции de novo как результат неоптималыюго подбора АРВ-препаратов или нарушения режима их приема, однако известны и случаи заражения устойчивыми штаммами ВИЧ-1 (Lukashov et al., 2000; Ammaranond et al., 2003). В условиях ограниченного доступа к лекарственным средствам, характерным для России в переходный период, вопрос о резистентности ВИЧ не только не перестает быть актуальным, но и приобретает особое значение. Монотерапия или битерапия с использованием ингибиторов вирусных ферментов может приводить к более быстрому развитию устойчивых вариантов ВИЧ, которые, передаваясь как вертикально, так и горизонтально, способны вызывать новые случаи инфекции. Очевидно, таким образом, что для широкомасштабного внедрения АРВ-терапии в стране необходима информация об уровне лекарственной устойчивости в популяции циркулирующих вариантов вируса, т.е. среди ВИЧ-инфицированных лиц, не употреблявших АРВ-препараты.

Основным способом анализа лекарственной устойчивости ВИЧ-1 является генотипирование, или выявление мутаций в геноме вируса, ответственных за ее развитие. Подавляющее большинство мутаций устойчивости ВИЧ-1 локализуется в области гена pol, кодирующей протеазу и первые 240 аминокислотных остатков (а.о.) ОТ. Выделяют два вида мутаций устойчивости ВИЧ-1 - первичные и вторичные. Первичные мутации непосредственно вызывают снижение чувствительности вируса к АРВ-препаратам, но при этом, как правило, ухудшают его репликативную способность. Вторичные мутации не влияют на уровень лекарственной устойчивости, но в большей или меньшей степени восстанавливают репликативную способность вируса, несущего первичные мутации (Quinones-Mateu and Arts, 2001). Если селекция первичных мутаций всегда является следствием воздействия лекарственных веществ и в большинстве случаев не зависит от генетического подтипа ВИЧ-1 (Kantor et al., 2005), то вторичные мутации могут появляться в геноме вируса спонтанно, а у некоторых подтипов ВИЧ-1 даже присутствовать постоянно как проявление генетического полиморфизма. Поэтому частота их встречаемости среди ВИЧ-инфицированных лиц, не употреблявших АРВ-препараты, может быть очень высокой и, как правило, зависит от генетического подтипа ВИЧ-1.

Необходимо отметить, что мутации устойчивости лучше всего изучены в геноме ВИЧ-1 генетического подтипа В, типичного для индустриально развитых стран. Это связано с тем, что именно в этих государствах в наиболее полном объеме обеспечивается лечение и мониторинг его эффективности у лиц, инфицированных ВИЧ-1. Однако, на территории России, как и многих других стран-бывших советских республик, в настоящее время доминирует ВИЧ-1 подтипа A (Bobkov et al., 2004; Vazquez de Parga et al., 2005). В 1996 г. этот вариант вируса, впоследствии названный IDU-A, проник в среду российских потребителей инъекционных наркотиков (ПИН), что вызвало быстрое распространение эпидемии по всей территории страны - сначала в этой группе риска, а затем и среди половых партнеров ПИН. К 2003 г. вариант IDU-A, по некоторым оценкам, вызвал 94% случаев ВИЧ-инфекции в России (Bobkov et al., 2004). Несмотря на это, область гена pol у него к началу настоящей работы, т.е. к 2003 г., оставалась неисследованной. Было опубликовано только восемь последовательностей гена pol IDU-A, но и они были выделены в Молдавии, Белоруссии, Украине (Pandrea et al., 2001; Liitsola et al., 2000; Masharsky et al., 2003). Вместе с тем, для правильной интерпретации результатов генотипирования лекарственной устойчивости необходима максимально полная информация о генетической изменчивости вариантов ВИЧ, циркулирующих в стране.

Цель и задачи работы

Цель исследования состояла в определении степени изменчивости гена pol и распространенности мутаций лекарственной устойчивости у инфицированных вариантами ВИЧ-1 подтипа А лиц в России, не принимавших АРВ-препараты, для оптимизации мониторинга и совершенствования терапии ВИЧ-инфекции в России. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить нуклеотидные последовательности областей гена pol, кодирующих протеазу и обратную транскриптазу, и частоту встречаемости значащих мутаций гена pol, у инфицированных вариантами ВИЧ-1 подтипа А лиц в России, не принимавших АРВ-препараты к моменту забора крови.

2. Оценить потенциальное влияние выявленных мутаций в гене pol на лекарственную устойчивость ВИЧ-1 и эффективность АРВ-терапии.

3. Провести филогенетический анализ и определить степень генетической изменчивости областей гена pol, кодирующих протеазу и обратную транскриптазу, у исследуемых вариантов ВИЧ-1 подтипа А.

4. Охарактеризовать возможность применения методов молекулярной гибридизации на биологических микрочипах и рестрикционного анализа для различения вариантов ВИЧ-1 подтипа А, несущих мутации гена pol.

5. Оцепить способность вариантов ВИЧ-1 подтипа А, несущих мутации гена pol, к передаче от человека к человеку.

6. Изучить закономерности изменения частоты встречаемости основных вариантов ВИЧ-1, несущих мутации гена pol, на протяжении эпидемии ВИЧ-инфекции в разных регионах России в период времени с 1996 по 2005 гг.

Научная новизна и практическая ценность работы

1. Показано, что варианты ВИЧ-1 подтипа А, циркулирующие в России среди потребителей инъекционных наркотиков и их половых партнеров, потенциально чувствительны к действию ингибиторов протеазы и ОТ. Эта информация позволяет избежать дорогостоящего тестирования лекарственной устойчивости ВИЧ-1 перед началом АРВ-терапии у пациентов из данных групп риска (если отсутствуют дополнительные указания па возможность инфицирования устойчивым штаммом ВИЧ-1 в конкретном случае).

2. Для вариантов ВИЧ-1 подтипа А, выделенных от не употреблявших АРВ-терапию людей, впервые показана высокая частота встречаемости мутаций гена pol, вызывающих аминокислотные замены V77I, I93L в протеазе и A62V в ОТ и известных ранее для ВИЧ-1 подтипа В как вторичные мутации лекарственной устойчивости. Информация о высокой распространенности этих мутаций в России свидетельствует о необходимости корректировать алгоритмы интерпретации результатов генотипирования лекарственной устойчивости ВИЧ, проводимого в нашей стране у лиц, принимающих АРВ-терапию.

3. Впервые показано, что ВИЧ-1 IDU-A филогенетически гетерогенен. Это выражается в циркуляции (т. е. передаче от одних лиц другим) на территории России четырех вариантов этого вируса, различающихся наличием или отсутствием мутаций V77I в протеазе и/или A62V в ОТ. К ним относятся три варианта, имеющие мутантные /wZ-генотипы Mutv77i/A62v, Mutv77i> MutA62v, и один, являющийся для них «родительским» штаммом дикого типа. Обнаружена монофилетическая природа вариантов Mutv77i/A62v и Mutv77b распространенных в разных регионах России. Ро/-генотип, таким образом, является эпидемиологическим маркером различных циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 подтипа А. В настоящей работе предложено определять ро/-геиотип, наряду с практиковавшимся ранее определением генетического подтипа ВИЧ-1, в целях эпидемиологических расследований. Для определения pol-генотипа показана возможность использования, помимо определения нуклеотидных последовательностей, одного из двух методов: молекулярной гибридизации на биологических микрочипах или рестрикционного анализа.

4. Показан низкий уровень изменчивости гена pol вариантов ВИЧ-1 IDU-A, а также обнаружены различия в характере генетической изменчивости области, кодирующей протеазу, (pro) и области, кодирующей ОТ (Rt). Информация о низкой гетерогенности этих областей генома вариантов ВИЧ-1 подтипа А, доминирующих на территории России, позволяет осуществить разработку новых генотипических тестов, в том числе, гибридизационных, адаптированных для выявления мутаций лекарственной устойчивости в геноме ВИЧ-1 подтипа А, а также для совершенствования методов молекулярной диагностики ВИЧ-инфекции. 27 нуклеотидных последовательностей области гена pol ВИЧ-1 подтипа А, кодирующей протеазу, депонированы в GenBank под номерами с AY618594 по AY618620.

В целом, результаты работы могут служить научным обоснованием необходимости мониторинга лекарственной устойчивости ВИЧ-1 и способствовать внедрению средств такого мониторинга в клиническую практику.

Апробация работы

Результаты исследований представлены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и отдела общей вирусологии ГУ НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН (Москва, 2006, доклад), 5-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004, доклад), Втором и Третьем Европейских семинарах «Лекарственная устойчивость ВИЧ: от фундаментальной науки к клиническому значению» (Рим, Италия, 2004, и Афины, Греция, 2005, постеры), 15-ой Всемирной конференции по СПИД (Бангкок, Тайланд, 2004, доклад), 12-ом Международном семинаре по динамике и эволюции ВИЧ (Кливленд, США, 2005, постер), 10-ой Европейской конференции по СПИД (Дублин, Ирландия, 2005, постеры). По теме диссертации опубликовано 18 научных работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Суханова, Анна Львовна

выводы

1. Анализ ВИЧ-специфических нуклеотидных последовательностей гена pol позволил установить, что в России среди лиц, инфицированных ВИЧ-1 подтипа А и не принимавших АРВ-препарты, не выявляются первичные мутации устойчивости, но с высокой частотой встречаются мутации, известные как вторичные мутации устойчивости у ВИЧ-1 подтипа В и выражающиеся в заменах M36I, V77I, I93L в протеазе и A62V в обратной транскриптазе. Частота встречаемости этих мутаций составила 100,0%, 56,9%, 100,0% и 57,1% соответственно.

2. С помощью интерпретации данных гепотипировапия показана потенциальная чувствительность циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 подтипа А к действию ингибиторов протеазы и обратной транскриптазы.

3. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена pol позволил идентифицировать четыре варианта ВИЧ-1 подтипа А, циркулирующих в России. Три из них имеют мутантные ро/-генотипы MutV77i/A62v, MutV77i, MutA62v, к отличительным особенностям которых относятся мутации V77I в протеазе и/или A62V в обратной транскриптазе, и один является «родительским» штаммом дикого типа.

4. Варианты мутантных ро/-генотипов MutV77i/A62v, Mutv77i и MutA62v характеризуются более низким уровнем вариабельности гена pol, чем варианты ВИЧ-1 дикого типа, что в большей степени проявляется в области, кодирующей протеазу (0,74, 0,37 и 0,00 против 1,88 соответственно), чем в области, кодирующей обратную транскриптазу

1,09, 0,95, 1,23 против 2,06 соответственно).

5. Ро/-гепотип циркулирующих в России вариантов ВИЧ-1 подтипа А сохраняется при передаче в от человека к человеку, что позволяет определять его в целях эпидемиологических расследований в очагах ВИЧ-инфекции. Для определения pol-генотипа ВИЧ-1 подтипа А показана адекватность применения методов молекулярной гибридизации на биологических микрочипах и рестрикционного анализа.

6. Варианты ВИЧ-1 подтипа А ро/-генотипов Mutv77i/A62v и Mutv77i возникли, по-видимому, из одного источника не позднее 1997 г. и распространялись быстрее, чем другие варианты вируса, что в период с 1998 по 2004 гг. сопровождалось ростом частоты их встречаемости в России и к 2005 г. привело к преобладанию вариантов

Mutv77I/A62V

112

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суханова, Анна Львовна, Москва

1. Бобков А.Ф. Каченнова Е.В., Селимова Л.М. и др. Субтипы ВИЧ-1 в России // Журн. микробиол.- 1999. № 1. -С.43-45.

2. Бобков А.Ф. Каченнова Е.В., Селимова Л.М,, и др. Молекулярно-вирусологические особенности эпидемии ВИЧ-инфекции в России и других странах СНГ // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. -2003. № 12. — С. 83-85.

3. Бобков А.Ф., Покровский В.В., Селимова Л.М. и др. Генетическое разнообрачие вирусов иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) на территории России // ДАН. -1997.-Т.353.-С.822-824.

4. Бобкова М.Р. Лекарственная устойчивость ВИЧ и лабораторные методы ее определения (лекция) // Клиническая лабораторная диагностика. 2002, - №1. -C.2S-32.

5. Богословская Е.В., Шипулин Г.А., Башкирова Л.Ю. и др. Определение лекарственной устойчивости ВИЧ у пациентов, получавших противоретровирусную терапию // Эгшдемиол. и инфекц. бол. 2004 - № 4 - С. 38-42

6. Галегов '.А. Лекарственная устойчивость и ее значение в процессе лечения ВИЧ-инфекции // Consilium medicum. 2001,- Экстра выпуск, ВИЧ-инфекция. - С. 11-13.

7. Зарецкая Ю. М. Клиническая иммуногенетика. //- М., 1983. - С. 135-181.

8. Каченнова Е.В. Молекулярно-эпидемиологический аналич вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), циркулирующих в России, 1987-2003 г. Автореф. дис. . докт. биол. наук. М., 2005. 52 с.

9. Казеннова Е.В., Бобков А.Ф. Подтипы вируса иммунодефицита человека 1 типа: классификация, происхождение и распространение в Европе II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2003. №1. - С.90-96.

10. Казеннова Е.В. Бобков А.Ф., Селимова Л.М. и др. Анализ субтипов гена gag вариантов ВИЧ-1, выделенных в России, методом сравнительной оценки электрофоретической подвижности гетеродуплексов // Вопр. Вируеол. 2001. - Т.46. - С. 12-16.

11. Коровина Г.И., Фомин Ю.А., Додонов К.Н., Улюкин И.М. К вопросу молекулярно-генетического мониторинга антиретровирусной терапии ВИЧ-инфекции // Terra Medica Nova 2005. № 3. - интернет-издание.

12. Ладная Н.Н. Распространение различных субтипоь ВИЧ на территории Российской Федерации.: Автореф. дис. . канд. биол. наук. М., 2000. -24 с.

13. Ладная Н.Н., Покровский В.В. Бобков А.Ф. и др. Распространение субтипов ВИЧ-1 в России. Эпидемиология и инфекционные болезни (1998); 3: 19-23.

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.-М.: Мир, 1984.

15. Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В. и др. А.С. № 2175972 Бюл. Ичобр. 2001. №251819,2021,22,23