Молекулярно-эпидемиологический мониторинг ВИЧ-инфекции на территории Ямало-Ненецкого автономного округа

Грезина, Лилия Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-эпидемиологический мониторинг ВИЧ-инфекции на территории Ямало-Ненецкого автономного округа
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-эпидемиологический мониторинг ВИЧ-инфекции на территории Ямало-Ненецкого автономного округа"

На правах рукописи

Грезина Лилия Анатольевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ НА ТЕРРИТОРИИ ЯМАЛО-НЕНЕЦКОГО АВТОНОМНОГО ОКРУГА

03.02.02 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2011

2 9 ГТМ 2011

4855059

Работа выполнена в клинико-диагностической лаборатории ГУЗ «Ямало-Ненецкий окружной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» (г. Ноябрьск) и в лаборатории вирусов лейкозов ФГУ «НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России.

Научные руководители:

кандидат медицинских наук доктор биологических наук

Людмила Юрьевна Волова; Марина Ридовна Бобкова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Георгий Артемьевич Галегов; доктор медицинских наук, профессор Анатолий Петрович Суслов.

Ведущая организация:

ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора.

Защита диссертации состоится '¡О2011 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 208.131.01 в ФГУ «НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России (адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского» МЗ и СР.

Автореферат разослан «» 1 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Елена Ивановна Бурцева.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На сегодняшний день в мире нет стран, в которых не обнаруживались бы случаи заражения ВИЧ-инфекцией. Таким образом, распространение ВИЧ-инфекции приобрело пандемический характер, поэтому актуальность проблемы ВИЧ-СПИДа в мире и России очевидна.

В России в 2010 году общее число ВИЧ-инфицированных, состоящих на диспансерном учете, составило 589581 человек, в том числе 5227 детей в возрасте до 15 лет. Ежегодно увеличивается как количество вновь выявленных случаев заражения (в 2010 году выявлено 58633 случая), так и количество смертей ВИЧ-инфицированных пациентов (в 2010 году умерло 10969 человек), что в целом заставляет рассматривать эпидемиологическую ситуацию по ВИЧ-инфекции как стабильно ухудшающуюся.

Для диагностики этой инфекции применяются самые передовые технологии лабораторного анализа, включая молекулярные методы. В 2005 году в рутинную лабораторную практику внедрен метод секвенирования гена pol ВИЧ-1 в целях слежения за возникновением мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ [MP № 5958-РХ от 07.08.2007 г.]. Однако, получив возможность использовать передовое оснащение и тест-систему зарубежного производства («ViroSeq HIV-1»), региональные клинические лаборатории столкнулись с прежде не виданными задачами, находящимися на грани клинической диагностики и науки. В частности, одна из проблем заключалась в том, что, в связи с тотальной распространенностью подтипа В ВИЧ-1 в странах Северной Америки и Западной Европы, весь зарубежный опыт опирался, в основном, на данные, полученные при изучении вируса иммунодефицита человека 1-го типа подтипа В, поэтому в качестве референтной нуклеотидной последовательности («дикого штамма») компьютерными программами (ViroSeq HIV-1, HIV db Program) была предложена последовательность известного штамма НХВ-2 (подтип В).

Однако многочисленными исследованиями было установлено, что на территории России, начиная с 1995 года, широко распространился вариант подтипа А ВИЧ-1 [Bobkov et al., 2004; Vazquez de Parga et al., 2005], который имеет ряд существенных особенностей в структуре практически всех областей генома [Суханова, 2005; Лаповок с соавт., 2009], при этом генетические дистанции между подтипами А и В ВИЧ-1 достигают 25% - 40% [Korber et al, 1998]. Мутации ЛУ, возникающие в составе ВИЧ-1 разных подтипов, также могут различаться, хотя эти различия выражены не столь существенно [Kantor et al., 2005]. Гораздо больше проблем возникает при анализе мутаций, уже возникших в геноме, поскольку характер феноти-пического проявления мутаций, а значит, и их интерпретация, в значительной степени зависит от генетического окружения. Это означает, что одни и те же мутации в составе геномов разных подтипов ВИЧ-1 могут фенотипически выражаться по-разному вплоть до того, что у определен-

ных генетических вариантов вируса эти мутации не будут вызывать лекарственной устойчивости. Ошибки в интерпретации мутаций, вызванные неадекватностью существующих алгоритмов, могут привести к массовой неэффективности лечения и, как следствие, распространению устойчивых штаммов вируса.

Таким образом, Россия оказалась в ситуации, когда при условии доминирования в стране варианта ВИЧ-1 подтипа А применяются зарубежные тест-системы, разработанные на основе анализа генома ВИЧ-1 подтипа В. Альтернативы этим системам на данный момент не существует, и освоение этих тест-систем в г. Ноябрьске, адаптацию их к условиям использования в региональной лаборатории и изучение способов анализа результатов гено-типирования пришлось начинать «с нуля». В ходе этой работы были проведены исследования, которые позволили анализировать наличие мутаций ЛУ не только у леченых пациентов с целью подбора оптимальной для них схемы терапии, но и у «наивных» пациентов, тем самым была заложена основа национальной базы данных о полиморфизме гена pol, генетического варианта ВИЧ-1, циркулирующего в России. Эти данные составили базу для характеристики генетической изменчивости вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в изученном регионе России - Ямало-Ненецком автономном округе.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы было изучение разнообразия вариантов ВИЧ-1 (по гену pol), циркулирующих в Ямало-Ненецком автономном округе, оценка распространенности и анализ мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ-1, характеризующихся различными значениями уровней значимости («score»), а также исследование возможности применения современных молекулярных методов в практике эпидемиологического анализа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести ретроспективный анализ эпидемии ВИЧ-инфекции на территории Ямало-Ненецкого АО (1995-2008 гг.).

2. Адаптировать существующее оборудование к выполнению анализа с применением тест-системы «Viroseq HIV-1».

3. Провести анализ нуклеотидных последовательностей областей гена pol, кодирующих протеазу и обратную транскриптазу, среди вариантов ВИЧ-1, распространенных в ЯНАО у «наивных» и леченых пациентов.

4. На основании анализа генома ВИЧ-1 охарактеризовать подтипы ВИЧ-1, выявленные на территории ЯНАО, и частоту встречаемости значимых мутаций гена pol у лиц, инфицированных разными вариантами вируса.

5. Оценить эффективность применения различных специализированных on-line программ для определения подтипа ВИЧ-1 по гену pol.

6. Оценить связь мутаций лекарственной устойчивости в составе подтипа А, характеризующихся разными уровнями значимости, с проявлениями лекарственной устойчивости ВИЧ-1.

7. Оценить способность вариантов ВИЧ-1, несущих мутации гена pol, к передаче от человека к человеку.

8. Исследовать возможность применения результатов сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена pol ВИЧ-1 в практике эпидемиологического расследования.

Положения, выносимые на защиту:

1. Установлен факт доминирования генетического подтипа А ВИЧ-1 в Ямало-Ненецком автономном округе.

2. Разработан подход к определению подтипа ВИЧ-1 на основе использования интернет-ресурсов с учетом особенностей молекулярно-эпиде-миологической ситуации в России; даны рекомендации по использованию наиболее надежных ресурсов.

3. Показано, что наряду со структурными генами ВИЧ-1 ген pol может быть использован в качестве мишени для анализа в ходе эпидемиологических расследований.

4. Установлено, что в составе генетического варианта ВИЧ-1 подтипа А, характерного для России, мутации «low score» не связаны с развитием лекарственной резистентности.

Научная новизна работы:

1. Показано быстрое распространение ВИЧ-инфекции среди коренных малочисленных народов Крайнего Севера (ненцы, ханты, ямальцы); темпы его в 3,3 раза превышают аналогичный показатель среди прочего населения, что представляет серьезную угрозу для существования этой этнической группы.

2. В результате проведенной работы впервые охарактеризованы (по гену pol) генетические варианты ВИЧ-1, циркулирующие в Ямало-Ненецком автономном округе в различные периоды эпидемии, при этом исследуемая выборка составила 8,8% всей изучаемой популяции, что свидетельствует о ее репрезентативности. Установлено, что на сегодняшний день на Ямале, как и во всей стране, доминирует ВИЧ-1 подтипа А (90,8%).

3. Опробован алгоритм определения подтипов ВИЧ-1 на основании анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена pol с применением on-line программ. Впервые продемонстрирована неэффективность программы HIVdb Program: Sequence Analysis для определения подтипа А, доминирующего в России.

4. Впервые показано, что наличие мутаций с уровнем значимости «major score» и «intermedia score» является свидетельством лекарственной резистентности независимо от подтипа ВИЧ-1. Наличие «low 5соге»-мута-ций в штаммах ВИЧ-1 подтипа А не связано с развитием лекарственной резистентности, в то время как у подтипа В «low 5соге»-мугации ассоциированы с таковой.

5. Для достоверного изучения эпидемиологии \/771-содержащих генотипов подтипа А ВИЧ-1 использованы данные уточненного ретроспективного эпиданамнеза. Существование устойчивого генотипа ВИЧ-1 с заменой V77I в протеазе (MutW7l) подтверждено наличием V77I у «наивных» пациентов; сохранением V77I при назначении либо отмене противовирусных препаратов; сохранением замены V77I при передаче вируса от человека к человеку различными путями.

6. Показана возможность применения результатов секвенирования гена pol ВИЧ-1 не только в клинической практике для определения резистентности, но и в процессе эпидемиологического анализа для осуществления молекулярно-эпидемиологических расследований очагов ВИЧ-инфекции.

Практическая значимость работы. В рамках данной работы предложены методы адаптации однокапиллярного секвенатора ABI prism-310 для проведения исследований в тест-системе «Viroseq». Опробован и внедрен алгоритм определения подтипов ВИЧ-1 на основании анализа нуклеотид-ных последовательностей фрагментов гена pol с применением on-line программ, что поможет практикующим врачам-лаборантам достоверно определять подтип исследуемых штаммов ВИЧ-1. Также показана доступность методов филогенетического анализа для проведения реальных эпидемиологических расследований.

В целом, результаты работы могут служить научным подтверждением необходимости проведения молекулярно-эпидемиологического мониторинга ВИЧ-инфекции на основании анализа нуклеотидной последовательности гена pol и возможности использования результатов секвенирования гена pol ВИЧ-1 не только в клинической практике, но и в процессе эпидемиологического анализа.

Апробация работы. Апробация работы состоялась 20 апреля 2011 на совместном заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ, Отдела молекулярной вирусологии и Отдела общей вирусологии ФГУ «НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского» МЗ и СР. Результаты исследований представлены в докладах на окружной научно-практической конференции «Актуальные вопросы противодействия эпидемии ВИЧ/СПИД в ЯНАО» (Ноябрьск, 2009 г.), научно-практической конферен-

ции «25 лет борьбы с ВИЧ-СПИД в России» (Суздаль, 2010 г.), на окружном семинаре «Актуальные вопросы ВИЧ-инфекции. Диспансеризация и лечение ВИЧ-инфицированных в ЯНАО» (Ноябрьск, 2011 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 7 статей - в реферируемых российских журналах, 3 статьи - в различных изданиях (сборниках специализированных конференций и бюллетеней).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, содержит 43 рисунка, 26 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы из 197 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект и методы исследования

В рамках настоящей работы методом генотипирования исследовано 175 образцов плазмы от 130 пациентов, которые были зарегистрированы с диагнозом «ВИЧ-инфекция» на территории Ямало-Ненецкого автономного округа. Таким образом, изученная выборка составила 8,8% от численности всех ВИЧ-инфицированных лиц, состоящих на диспансерном учете в ЯНАО. Образцы плазмы получены в период с 1995 по 2008 гг. Весь полученный клинический материал использовался с информированного согласия пациентов. Пациенты охарактеризованы клинически и эпидемиологически. Возраст пациентов на момент инфицирования варьировал от 0 месяцев до 54 лет и в среднем составил 25,1 года. Среди обследованных было 67 мужчин и 63 женщины. По этнической принадлежности пациенты распределились следующим образом: русских - 92, украинцев - 16, татар - 12, ненцев - 4, белорусов - 4, другие национальности - 2.

Из 130 пациентов 94 обследованы для выявления лекарственной устойчивости однократно (94 исследования), 36 пациентов обследованы 2-4 раза (81 исследование). Среди обследованных группу «наивных» (не получавших специфической лекарственной терапии) пациентов составили 80 человек (92 теста), группу «леченых» - 50 человек (83 теста).

Определение нуклеотидной последовательности гена ро/ВИЧ-1 проводили методом автоматического секвенирования в формате «Viroseq». Коммерческий тест «ViroSeq HIV-1» фирмы «Abbot» (США) позволяет определять нуклеотидную последовательность, полностью кодирующую протеазу ВИЧ-1 (кодоны 1-99), и две трети последовательности, кодирующей обратную транскриптазу (кодоны 1-335). Тест-система «ViroSeq HIV-1» обеспечивает все этапы лабораторной работы от выделения РНК до получения нуклеотидной последовательности исследуемого образца, поэтому вся работа проводилась в строгом соответствии с инструкцией «ViroSeq. Система для генотипирования ВИЧ-1 (версия 2)».

Для определения подтипа ВИЧ-1 использовали нуклеотидные последовательности фрагмента гена pol (1302 пары нуклеотидов) в формате «fasta», полученные с помощью системы генотипирования ВИЧ-1 «ViroSeq». Подтипы ВИЧ-1 определяли с использованием программ HIVdb Program: Sequence Analysis, REGA HIV-1 Subtyping Tool (версия 2), представленных на сайте Стенфордского университета (http://hivdb.stan-ford.edu), а также программ COMET HIV-1 (http://comet.retrovirotogy.lu/) и STAR (http://www. vgb. ucl.ac. uk/stam. shtml).

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей области гена pol проводили методом ближайших соседей с применением пакета программ MEGA 3.1.

Распространение ВИЧ-инфекции в ЯНАО в 1995-2008 гг.

Несмотря на географическую изолированность и труднодоступность, Ямало-Ненецкий автономный округ, как и многие другие регионы России, охвачен эпидемией ВИЧ-инфекции. В связи с этим составной частью проведенного исследования стал ретроспективный эпидемиологический анализ ситуации по ВИЧ-инфекции в ЯНАО с использованием количественных (распространенность, заболеваемость) и качественных (пути передачи, половая и возрастная структура) показателей, с момента регистрации первого случая в 1995 году. Это позволило выделить и охарактеризовать три периода в развитии эпидемического процесса ВИЧ-инфекции в ЯНАО (рис. 1, 2).

Рисунок 1. Многолетняя динамика заболеваемости ВИЧ-инфекцией в ЯНАО 1995-2008 гг.

Рисунок 2. Частота реализации парентерального (при внутривенном употреблении психоактивных веществ) и полового пути передачи ВИЧ в ЯНАО 1995-2008 гг.

Парентеральный путь

- За бол ееа емост ь на 100? нас

58.2

1995 !<»«>(> 1<>97 1998 1999 2000 ¿001 ¿002 2003 2004 2005 ¿006 2007 ¿008

Первый период (1995-1999 гг.) характеризовался низкой интенсивностью (показатель заболеваемости: 0,6-6,9), наличием спорадических очагов ВИЧ-инфекции и небольшим количеством инфицированных лиц. Второй период (2000-2002 гг.) был ознаменован проникновением ВИЧ-1 в среду ПИН и характеризовался резким подъемом заболеваемости (показатель заболеваемости: 35,4-58,2), высокой интенсивностью эпидемического процесса, формированием крупных очагов ВИЧ-инфекции и преобладанием парентерального пути передачи (до 93,2%), связанного с внутривенным употреблением психотропных веществ. Третий период (2003 - 2008 гг.) сопровождался снижением заболеваемости (показатель заболеваемости: 25,8-23,2) и интенсивности эпидемического процесса, значительным вовлечением в эпидемический процесс лиц женского пола, увеличением доли полового пути передачи до 38,3% против 6,65% в предыдущем периоде. Сформировавшийся в 2000-2002 гг. наркозависимый тип эпидемического процесса ВИЧ-инфекции начал меняться на смешанный. Расширились возрастные границы ВИЧ-инфекции. Роль вертикального пути передачи оставалась незначительной (0,3% от общего числа ВИЧ-инфицированных) благодаря активному применению мер профилактики заражения плода. В настоящее время в ЯНАО нет ни одного района, в котором не проживал бы носитель ВИЧ-инфекции.

Особенностью эпидемии ВИЧ-1 в Ямало-Ненецком автономном округе является проникновение возбудителя в относительно изолированные этнические группы малочисленных народов Крайнего Севера (ненцы, ханты, ямальцы), численность которых в 2010 году составляла 36000 человек. В 2005 году впервые среди коренного населения было зарегистрировано 8 случаев ВИЧ-инфекции, в 2006 году выявлено еще 2 случая, в 2007 г. - 4 случая, в 2008 г. - 6 случаев, в 2009 г. - 10 случаев, в 2010 г. - 12 случаев. Заражение в 35 случаях произошло половым путем, в 6 - наркотическим путем и в 1 - вертикальным путем. Таким дбразом, среди коренных малочисленных народов Крайнего Севера на сегодняшний день зарегистрировано 42 ВИЧ-инфицированных, среди которых 12 мужчин (в том числе один ребенок) и 30 женщин. Заболеваемость среди коренных малочисленных народов Крайнего Севера в 2010 году составила 94,3 на 100 тыс. коренного населения.

Изолированность данной этнической группы и преимущественное распространение ВИЧ-1 половым путем привели к более позднему возникновению эпидемии ВИЧ-инфекции в среде коренных малочисленных народов Крайнего Севера. Однако образ жизни и быта этих этнических групп (сезонная миграция внутри округа, раннее начало половой жизни, отсутствие навыков безопасного секса, массовый промискуитет) вызвали стремительное развитие эпидемии ВИЧ-инфекции в этой популяции. Темпы развития эпидемии в среде коренных малочисленных народов Крайнего Севе-

pa в 3,3 раза превышают аналогичный показатель среди прочего населения, что внушает серьезные опасения о возможности значительного урона для этого этноса в результате воздействия ВИЧ, В сложившейся ситуации особенно актуальным является проведение молекулярно-эпидемиологи-ческого мониторинга и всестороннее использование его результатов.

Адаптация секвенатора ABI prism-310 к тест-системе «Viroseq»

Для проведения автоматического секвенирования гена pol ВИЧ-1 в лаборатории г. Ноябрьска использовался однокапиллярный секвенатор модели ABI prism-310 (производства компании Applied Biosystems) в стандартной комплектации, который является пионером капиллярной технологии в секвенировании. Данная модель секвенатора оказалась очень чувствительной к повышенному фону терминаторов BigDye, так как, в отличие от более современных многокапиллярных секвенаторов, имеет низкий диапазон детектируемой амплитуды сигнала (до 8000 единиц). Для адаптации секвенатора ABI prism-310 к методике «ViroSeq HIV-1» были применены технологические приемы (очистка продуктов секвенирования с помощью колонок «CentriCep», последовательная очистка окна капилляра изопропа-нолом и дистиллированной водой, применение капилляра длиной 50 см и др.), позволившие получить сиквенс-продукт хорошего качества и обеспечившие полное покрытие полимеразного гена ВИЧ-1.

Благодаря примененным технологическим мерам адаптации секвенатора ABI prism-310 к тест-системе «ViroSeq HIV-1», успешно проведен анализ нуклеотидных последовательностей областей гена pol, кодирующих протеазу и обратную транскриптазу. Это сделало возможным получение информации о последовательности генома ВИЧ-1 и применение инструментов молекулярно-генетического мониторинга в повседневной лабораторной практике.

Определение подтипа генетических вариантов, циркулирующих на территории ЯНАО в различные периоды эпидемии

В ходе анализа гена pol ВИЧ-1 с целью поиска мутаций лекарственной устойчивости есть возможность параллельно с этим исследованием проводить определение подтипа/генетического варианта вируса с применением нескольких систем интерпретации on-line.

При определении подтипа с помощью референс-программы HIVdb Program: Sequence Analysis, представленной на сайте лабораторией Стен-фордского университета (http://hivdb.stanford.edu/pages/algs/HIVd0.html), анализируемая область гена pol подавляющего большинства вариантов генотипировапась как PR-A/RT-AE, PR-AE/RT-A или PR-AE/RT-AE. Этот

факт пришел в полное противоречие с ранее полученными данными о доминировании в России варианта подтипа А.

Таким образом, вопрос о действительной подтиповой принадлежности образцов с использованием этой референс-программы остался неясным, что вызвало необходимость дополнительного проведения филогенетического анализа.

Филогенетический анализ гена pol исследуемых образцов продемонстрировал наличие субкластера, объединяющего варианты ВИЧ-1 В-гено-типа из Genbank и два анализируемых образца с генотипом PR-B/RT-B (рис. 3). На минимальной филогенетической дистанции от него располагались 8 образцов с генотипом PR-A/RT-B, что совпадало с результатами HIVdb Program: Sequence Analysis. Однако остальные 118 образцов, в числе которых были выявленные рекомбинантные формы, образовывали общий субкластер с последовательностями А1 из Genbank, что означало их принадлежность к подтипу А. Лишь 2 образца (YAN-64-1364 и YAN-36-832) объединялись с вариантами CRF01_AE из Genbank, что указывало на истинную принадлежность ВИЧ-1 этих образцов к CRF01_AE рекомбинантной форме вируса.

Судя по расположению на филогенетическом дереве и равенству длин соответствующих ветвей, пациенты YAN-64-1364 и YAN-36-832 были эпидемиологически связаны между собой. Исходя из того, что в нашей стране штаммы CRF01_AE практически не встречаются, было высказано предположение, что инфицирование одного из пациентов произошло в какой-либо стране Юго-Восточной Азии, после чего он стал источником заражения для полового партнера. Это предположение полностью подтвердилось при ретроспективном сборе эпидемиологического анамнеза. Будучи в Таиланде, пациентка YAN-36-832 была инфицирована ВИЧ-1 в результате гетеросексуальных контактов с местными жителями и, вернувшись на родину, заразила своего полового партнера YAN-64-1364.

Ввиду того, что подавляющее большинство анализированных нуклео-тидных последовательностей по области PR с использованием референс-программы HIVdb Program: Sequence Analysis было отнесено к подтипу А, был дополнительно проведен филогенетический анализ фрагментов гена pol, кодирующих RT (рис. 4), так как именно эта область отличалась особенной гетерогенностью (RT-A- 58% (70 образцов), RT-AE - 42% (50 образцов)).

Результаты анализа показали, что 118 анализируемых последовательностей по-прежнему кластеризовались между собой и со штаммами подтипа А1 из Genbank, то есть по области ОТ также были вариантами IDU-A ВИЧ-1, как и по гену pol в целом. Два образца YAN-S4-1364 и YAN-36-832 по-прежнему кластеризовались с вариантами CRF01_AE.

Рисунок 3. Результаты филогенетического анализа фрагментов гена pol размером 1297 пар нуклеотидов, кодирующих PR и область RT. Анализ проведен в программе MEGA 3.1. Построение древа осуществляли методом ближайших соседей с последовательностями, полученными из GenBank с указанием номера и подтипа, в скобках указаны названия штаммов. Фигурные скобки объединяют варианты ВИЧ-1, относящиеся к указанному подтипу. Анализируемые образцы имеют трехбуквенный код, соответствующий названию региона (YAN-Ямало-ненецкий АО).

* - образцы с генотипом PR-A/RT-A; - образцы с генотипом PR-A/RT-AE; " образцы с генотипом PR-AE/RT-AE; - образцы с генотипом PR-AE/RT-A.

AY713407(A1) AF069673(A1) YAN-38-395* YAN-175-1313* YAN-173-1311" YAN-31-1211* YAN-21-774" YAN-6-105** YAN-7-104* YAN-571-1148* YAN-4-1202" YAN-89-1108* YAN-12-26-61" YAN-3-75-368* YAN-4-76k* YAN-535-1043* YAN-17-17a" YAN-29-204" YAN-540-1049* YAN-12-32* YAN-6-445* YAN-30-114* YAN-59-332* YAN-4-1230* YAN-9-857* YAN-6-1215* AB253656(AE) л. YAN-36-832" YAN-64-13S4" AY444805(AE) DQ859178(AE) AB052995.1 (AE) AB220947(AE) AF2S6237(A2)T' AF286238(A2)J

Рисунок 4. Результаты филогенетического анализа фрагментов гена pol размером 1000 пар нуклеотидов, кодирующих область RT. Анализ проведен в программе MEGA 3.1. как описано в подписи к рисунку 3. Фигурные скобки объединяют варианты ВИЧ-1, относящиеся к указанному подтипу. Анализируемые образцы имеют трехбуквенный код, соответствующий названию региона (YAN-Ямало-ненецкий АО). * - образцы с генотипом RT-A; ** - образцы с генотипом RT-AE.

Помимо программы HIVdb Program: Sequence Analysis, для генотипиро-вания ВИЧ-1 разработаны on-line программы REGA HIV-1 Subtyping Tool (версия 2) (http://hivdb.stanford.edu), COMET HIV-1 (http://comet.retrovirol-ogy.lu/), STAR HIV-1 (http://www.vgb.ucl.ac.uk/starn.shtml), позволяющие локализовать нуклеотидную последовательность по вирусному геному и определить подтип ВИЧ-1. Как следует из представленных в таблице 1 данных, результаты, полученные при использовании программ REGA HIV-1 и COMET HIV-1, полностью совпадали с данными филогенетического анализа фрагментов гена pol. При применении программы STAR HIV-1 удалось определить вариант вируса лишь у 36,2% образцов.

Таблица 1. Определение подтипов по фрагментам области гена pol, кодирующим PR и часть RT, с использованием программ REGA HIV-1 Subtyping Tool (версия 2), COMET HIV-1, STAR HIV-1.

REGA COMET STAR

А1 (А) 118(90,8%) 118(90,8%) 35 (26,9%)

CRF01_AE 2(1,5%) 2 (1,5%) 2 (1,5%)

CRF03 AB 8 (6,2%) 8 (6,2%) 8 (6,2%)

В 2(1,5%) 2(1,5%) 2(1,5%)

не определяется - - 83 (63,8%)

ВСЕГО 130(100%) 130(100%) 130(100%)

Благодаря проведенной работе, были определены подтипы ВИЧ-1 у всех исследованных образцов (130 образцов). Полностью подтверждено ...мнение предыдущих исследователей о доминировании в России подтипа А [Бобков и др., 2003; Суханова, 2006; Marlowe, 2009], который в ЯНАО составил 90,8%. Подтип В определялся лишь в 1,5% случаев, также выявлены рекомбинантные формы CRF03_AB (6%) и CRF01_AE (1,5%).

При динамическом анализе подтипов ВИЧ-1, циркулирующих в ЯНАО в 1995-2008 гг. (рис. 5), установлено, что вирус подтипа В попал в популяцию в начале эпидемического процесса (1995-1999 гг.) одновременно с вирусом подтипа А, однако подтип В не получил дальнейшего распространения, в то время как подтип А широко распространился в популяции. Кроме того, в 2000-2002 гг. зарегистрирован рекомбинант CRF03_AB (6 случаев) и рекомбинантСРР01_АЕ (1 случай). В период 2003-2008 гг. зарегистрировано еще 2 случая CRF03_AB и 1 случай CRF01_AE.

100%

» I Ii «Iii;:

-48-- m

Щи»

ЩЯБ

-mspoor-

118

Рисунок 5. Распределение подтипов ВИЧ-1 среди новых случаев ВИЧ-инфекции в различные периоды эпидемии.

При сравнении интенсивности распространения подтипов ВИЧ-1 через различные пути передачи (рис. 6, 7) можно отметить, что ВИЧ-1 подтипа А попал в популяцию ПИН в начале эпидемического процесса и стал основным этиологическим агентом, вызвавшим эпидемию ВИЧ-инфекции в среде ПИН. К началу 2009 года инфицированность вирусом подтипа А среди инъекционных наркоманов достигла 95,9% от всех случаев заражения, и лишь 4,1% приходилось на рекомбинант СР?Р03_АВ, который попал в популяцию ПИН в 2000-2002 гг., но не получил широкого распространения.

Ж !

, 4Й»

га f------

■ АЕ(абс) 1 1 2

в АВ(абс) 3 2 5

äß(&) 2 2

3 10 30 43

Рисунок 6. Распределение подтипов ВИЧ-1 (по гену pol) среди новых случаев ВИЧ-инфекции в различные периоды эпидемии в резервуаре наркотического пути передачи.

Рисунок 7. Распределение подтипов ВИЧ-1 (по гену pol) среди новых случаев ВИЧ-инфекции в различные периоды эпидемии в резервуаре полового пути передачи.

■ АВ(абс)

■ В(абс)

• А(абс)

■ АЕ(абс)

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

Анализ полового пути передачи указывает на большее разнообразие подтипов ВИЧ-1 (рис. 7), распространившихся этим способом. Резервуар полового пути представлен подтипом А (82,7%), рекомбинантом CRF03_AB (9,6%), подтипом В (3,85%), рекомбинантом CRF01_AE (3,85%).

Таким образом, профиль циркулирующих подтипов ВИЧ-1 менялся в зависимости от эпидемической ситуации, связанной с миграционными процессами, активизацией старых и появлением новых очагов ВИЧ-инфекции. Это подтверждает необходимость проведения постоянного молеку-лярно-генетического мониторинга ВИЧ-инфекции на территории ЯНАО.

Анализ мутаций лекарственной устойчивости

По результатам секвенирования гена pol ВИЧ-1 (175 образцов) выявлены мутации лекарственной резистентности, которые в зависимости от количественного вклада в формирование резистентности классифицированы по уровню значимости как «major score», «intermedia score» и «low score» [Celera's ViroSeq HIV-1 Genotyping System] (таблица 2).

Таблица 2. Частота выявления мутаций гена pol ВИЧ-1 у пациентов Ямало-Ненецкого центра СПИД.

№ Г руппа Количество Количество случаев Количество случаев

п/п пациентов исследований выявления мутации выявления мутации

«major score» . «low score»,

и «intermedia score», абс. (%)

абс. %)

к ИОТ к ИП к ИОТ к ИП

1. «Леченые» 50 лиц 33 3 10 50

пациенты (83 исслед.) (66%) (6%) (20%) (100%)

2. «Наивные» 80 лиц 0 0 20 78

пациенты (92 исслед.) (25%) (97,5%)

В проведенном исследовании отмечено, что «major score» и «intermedia-5Соге»-мутации в изученных образцах возникали на фоне приема противовирусных препаратов и переставали регистрироваться после их отмены. Появление «major score» и «intermedia score''-мутаций в штаммах ВИЧ-1, изученных нами, являлось свидетельством лекарственной резистентности, что подтверждалось соответствующими клинико-лабораторными показателями (ростом вирусной нагрузки ВИЧ, снижением показателей иммунного статуса, манифестацией клинических симптомов). Таким образом, селективным фактором для отбора и закрепления в вирусной популяции ВИЧ-1 подтипа А мутаций «major score» и «intermedia score» бесспорно являлась АРВТ, в то время как «low 8С0ге»-мутации не исчезали и не появлялись на фоне проводимой терапии и с одинаковой частотой встречались в группах «леченых» и «наивных» пациентов (рис. 8). Следовательно, АРВТ не могла являться фактором отбора «low зсоге»-мутаций для ВИЧ-1 подтипа А.

100,00% -г-""" ...................^ZT-"

80,00% 4.....~.............

60,00% —-—...........Ж Я -хгчаи-

15 00% Jt 41,25%

20,00% -К . ж 4 .................

. .«иг' " Щ Ä А я на фоне терапии

fo^ А* 2$0%' ............../* у наивных пациентов

" Ж # & 36,00%

Рисунок 8. Частота встречаемости различных «low stores-мутаций ВИЧ-1 подтипа А у пациентов Ямало-Ненецкого центра СПИД,

Поскольку референтной матрицей для выявления мутаций, как уже указывалось, являлась нуклеотидная последовательность подтипа В (НХВ-2), проведено сравнение частоты встречаемости «major score», «intermedia score» и «low score»-мутаций у подтипа В и подтипа А (таблица 3). Если встречаемость «major score» и «intermedia Бсоге»-мутаций среди ВИЧ-1 подтипов А и В практически совпадала, то при сравнении частоты встречаемости «low зсоге»-мутаций среди вариантов подтипа В и среди исследованных нами вариантов подтипа А, имелись существенные различия, отраженные в таблице 3.

Таблица 3.Частота встречаемости «tow scorev-мутаций у В- и не-В-подтипов.

Мутация Встречаемость Встречаемость Встречаемость Встречаемость

в исследованных среди В-подтипа в исследованных среди В-подтипа

нами образцах у (6488 образцов)*, нами образцах у (6620 образцов) *,

не-В-подтипов % не-В-подтипов %

(78 образцов), % (50 образцов), %

Наивные Наивные АРВТ АРВТ

Обратная транскриптаза

A62V 18,8 0,0 16 2,0

L101/V 15 0,0 6,0 3,0

Протеаза

K20R 3,8 2,0 2 15,0

M36I 97,5 13,0 100,0 35,0

L63P 18,8 55,0 18 78,0

V77I 41,3 25,0 36 27,0

* по данным сайта: Stanford University HIV Drug Resistance Database. (http://hivdb6. Stanford, edu)

Эпидемиология \Л771-содержащих генотипов

В ходе работы выявлена высокая частота встречаемости в последовательностях ВИЧ-1 подтипа А замены V77I в П (39,2%) и A62V в ОТ (17,7%), ранее известных как «low Бсоге»-мутации подтипа В.

Проведено исследование эпидемиологии генотипа Muty^. Крайне важным для этого мы считали точность и достоверность информации о пути заражения пациентов. С целью верификации первичного эпиданам-неза был проведен ретроспективный сбор эпидданных у всех пациентов выборки. Ретроспективный эпиданамнез собирали в обстановке длительно существующих доверительных отношений пациента с врачом консультативно-диагностического кабинета, и подтверждался многолетним клиническим наблюдением за пациентом. В результате сбора ретроспективного эпиданамнеза у 16-ти из 130-ти пациентов (12,3% выборки) половой путь заражения был изменен на наркотический. У пациентов с первоначально заявленным наркотическим путем заражения изменений не выявлено.

Верифицированные данные о путях заражения позволили более точно изучить эпидемиологию генотипа Mutv77l (рис. 9, 10) и показали, что в исследованной популяции с 1995 по 1997 гг. циркулировал только «дикий тип» ВИЧ-1 (Wt), распространяясь как через половой, так и через наркотический путь.

200С 2001 2C02 200S 2004j2005i2006 2007 2008 1994

MUIV77I

Рисунок 9. Соотношение Ш и Ми^71 среди новых случаев заражения при наркотическом пути передачи.

Рисунок ТО. Соотношение Ш и Ми^71 среди новых случаев заражения при половом пути передачи.

В 1998 году среди ПИН зарегистрированы штаммы, несущие замену 4/77*1 (М1%77,), которые до 2000 г. продолжали регистрироваться только в популяции ПИН. Период возникновения и распространения вируса Ми^-^

совпал со всплеском ВИЧ-инфекции среди ПИН, что послужило условием для максимального распространения Mirtym в популяции ПИН. Это позволило предположить, что MutW7l стал своеобразным маркером наркотического пути.

Тем не менее, регистрировались случаи передачи Mufyyyi половым путем (12 случаев). При анализе этих случаев выяснено, что все это были женщины, имевшие длительный половой контакт (постоянное многолетнее сожительство: от 2 до 8 лет) с ВИЧ-инфицированным наркоманом. Не выявлено ни одного случая заражения штаммом Mut^y, при случайных половых контактах.

Среди всех изученных случаев половой передачи, штамм Wt по-прежнему занимал лидирующие позиции (72,1%), при этом доля дикого штамма (Wt) в резервуаре наркотического пути с момента появления Mut^n существенно снизилась (со 100% до 49,3%),

Исследования гена pol вируса, выделенного от эпидемиологически связанных между собой лиц, подтверждают устойчивость генотипа MutW7|. Показана возможность передачи ВИЧ-1 с генотипом Mut^y, от человека к человеку наркотическим, половым и вертикальным путями. Кроме того, наблюдалось сохранение генотипа MutW7l при однократном и двукратном пассажах передачи от человека к человеку.

При динамическом наблюдении за пациентами, инфицированными вирусом Ми%71, которые обследовались 2- и 3-кратно с интервалом между обследованиями до двух лет, указанная мутация выявлялась на протяжении всего периода наблюдения, как до приема АРВТ, так и в процессе приема АРВТ, независимо от формирования резистентности к НИОТ, ННИОТ или ИП. При отмене терапии V77I сохранялась. При таком же динамическом наблюдении за пациентами, инфицированными штаммом Wt, в течение трех лет ни разу не отмечено появления V77I независимо от проведения или отмены АРВТ.

Поскольку ро/-генотип вируса сохраняется во всех случаях передачи ВИЧ-инфекции вне зависимости от пути заражения и воздействия АРВП, его использование в качестве эпидемиологического маркера может стать дополнительным инструментом в руках врачей-эпидемиологов при проведении молекулярно-эпидемиологических расследований.

Применение результатов секвенирования гена pol ВИЧ-1 в практике эпидемиологического анализа

Не менее важной задачей проводимой работы представлялось прикладное использование информации, получаемой молекулярно-биоло-гическими методами, для решения задач эпидемиологической практики. В проведенном исследовании приведены примеры расшифровки эпидемиологических очагов с помощью данных молекулярно-биологического анализа гена pol ВИЧ-1.

В работе описан случай профессионального заражения в городской больнице г. Новый Уренгой, эпизоды эпидемиологических расследований очагов ВИЧ-инфекции в г. Губкинский и г. Салехард (таблица 4). Из приведенных примеров видно, что без генетической информации эпидемиологическое расследование могло пойти по ложному пути. Это подтверждает возможность применения результатов секвенирования не только в клинической практике, но и в процессе эпидемиологического анализа и доказывает доступность современных методов молекулярно-эпидемиологического мониторинга для практикующих врачей-лаборантов и эпидемиологов.

Таблица 4. Применение результатов молекулярно-эпидемиологичес-кого мониторинга при проведении эпидемиологических расследований.

Расшифровка эпидочага по результатам эпиданамнеза Расшифровка эпидочага по результатам молекулярно-эпндемиологического мониторинга

1. Случай медицинской аварии в г. Новый Уренгой.

< ? <^659-1455 J

2. Расшифровк ä эпидочага в г. Губкинский.

:'•>'; , 64-Ш4

3. Расшифровка эпидочага в г. Салехарде.

i ? i— ■ 1 * i* *■ ......

Обсуждение данных, полученных в ходе проведения -молекулярно-эпидемиологического мониторинга ВИЧ-инфекции на территории ЯНАО

Таким образом, полученные в результате настоящего исследования данные позволили охарактеризовать подтипы ВИЧ-1, циркулирующие на территории ЯНАО, а также ретроспективно проследить динамику их распространения в ЯНАО. Однако методика определения подтипов ВИЧ-1 по гену pol вызвала ряд существенных трудностей и вопросов.

При определении подтипа ВИЧ-1 по гену pol в программе HIVdb Program были получены результаты, указывающие на массовое распространение рекомбинантных форм ВИЧ-1. Для объяснения многообразия «псевдоре-комбинантов», выявленных референс-программой HIVdb Program, следует подробнее остановиться на структуре генома рекомбинантной формы CRF01_AE ВИЧ-1 [Gao F, Robertson DL, Morrison SG, et al, 1996]. Данный

вариант вируса является результатом рекомбинации минимум двух вариантов ВИЧ-1 - подтипов А1 и Е со множеством точек рекомбинации. Дополнительная сложность заключается в том, что до сегодняшнего дня в природе не выявлены варианты ВИЧ-1 «чистого» подтипа Е, и его возможное существование подтверждается лишь наличием рекомбинанта АЕ. Дискор-дантные результаты субтипирования (А или АЕ), получаемые при использовании референс-программы HIVdb Program: Sequence Analysis для близкородственных нуклеотидных последовательностей, по-видимому, объясняются особенностями способа интерпретации данных, основанного на обнаружении совокупности мутаций полиморфизма, заложенных в этой программе. Особый интерес представляет тот факт, что ген pol рекомбинант-ного штамма полностью представлен последовательностью А1. Это означает, что для определения подтипа вариантов, принадлежащих CRF01_AE, анализа только гена pol недостаточно. Для получения истинной картины необходимо одновременно с pol анализировать области gag и env либо полноразмерный геном.

Помимо указанной программы HIVdb Program: Sequence Analysis, существуют несколько специализированных on-line программ, предназначенных для определения подтипа ВИЧ-1 по последовательностям различных фрагментов его генома. Не вдаваясь в подробности их организации, заметим, что все они функционируют по принципу сравнения анализируемой последовательности с ранее типированными последовательностями, имеющимися в базах данных. Недостаток последовательностей какого-либо вида в таких базах данных, а также различия математических принципов, заложенных в основу их работы, могут приводить к недостаточно точной, а иногда и ошибочной интерпретации соответствующих опытных образцов. Именно такой случай, очевидно, произошел с доминирующим в России генетическим вариантом IDU-A.

Принимая во внимание все вышеизложенное, можно сказать, что в связи со специфической ситуацией в России, где доминирует вариант IDU-A, определение подтипа вируса по фрагментам гена pol с применением программы HIVdb Program: Sequence Analysis нельзя считать достоверным, по крайней мере, в случаях выявления вариантов, отличных от PR-A/RT-A. Необходимо отметить, что трудности в определении подтипа по гену pol с использованием HIVdb Program: Sequence Analysis возникают и у других исследователей при определении не-В-подтипов (Mattias Mild, Швеция, Rolf Kaiser, Германия, личные сообщения). Следует подчеркнуть, что рефе-ренс-программа HIVdb Program очень полезна при анализе мутаций ЛУ и полиморфизма ВИЧ-1, но для определения подтипов по гену pol следует, по всей очевидности, использовать другие программы.

В результате проведенных исследований сложился следующий алгоритм определения истинных подтипов вариантов ВИЧ-1 на основании

анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена pol: в тех случаях, когда с использованием референс-программы HIVdb Program: Sequence Analysis выявляются варианты PR-A/RT-AE, PR-AE/RT-A, PR-AE/PT-AE, следует использовать в качестве вспомогательной программы REGA HIV-1 Subtyping Tool (версия 2) и COMET HIV-1, позволяющие установить подтип штамма, так как результаты определения подтипа ВИЧ-1 с помощью программ REGA HIV-1 Subtyping Tool (версия 2) и COMET HIV-1 в 130 образцах, изученных нами, полностью совпали с результатами филогенетического анализа, являющегося «золотым стандартом» межтиповой дифференциации. При этом для получения достоверного результата следует анализировать полноразмерный фрагмент гена pol, полученный в

системе генотипирования.

Программа STAR, основанная на сравнении и подсчете специфических для каждого подтипа нуклеотидных (аминокислотных) позиций в гене pol, показала низкую эффективность (36,2% успешных результатов) при определении подтипа ВИЧ-1 на основании анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена pol, так как в ее базе данных, по всей вероятности, не достает российских вариантов ВИЧ-1, являющихся вариантом подтипа А и имеющих ряд существенных особенностей в структуре практически всех областей генома [Суханова А.Л. с соавт., 2005; Лаповок И.А. с соавт., 2008].

При анализе мутаций лекарственной устойчивости (175 образцов), выявленных в гене pol ВИЧ-1 у не-В-подтипов с помощью тест-системы «ViroSeq HIV-1», использующей в качестве референтной матрицы нуклеотидную последовательность ВИЧ-1 подтипа В, выявлены различия роли «major/intermedia score» и «low зсоге»-мугаций, представленные в таблице 5.

Таблица 5. Различия в выявлении «major/Intermedia score» и «low эсоге»-мутаций у не-В-подтипов.

Критерий Сравнения «Major score» и «intermedia 5соге»-мутации «Low score»-мутации

Появляются на фоне ПВТ Да Нет

Исчезают при отмене ПВТ Да Нет

Совпадение частоты встречаемости с В-подтипом Совпадает Не совпадает

Таким образом, роль «low БСОге»-мутаций в формировании резистентности к АРВП зависит от подтипа ВИЧ-1 и не идентична у различных подтипов ВИЧ-1. Возможно, некоторые изученные нами «low scoreo-мутации являлись полиморфными сайтами у А-подтипов ВИЧ-1. Формирование

генетической популяции ВИЧ-1 - это сложный многогранный процесс в котором участвуют не только противовирусные препараты, но и другие факторы. Выяснение природы факторов отбора и закрепления в популяции ВИЧ-1 «low score-мутаций нуждается в дополнительных исследованиях и дальнейшем проведении молекулярно-эпидемиологического мониторинга.

Мутационные особенности варианта IDU-A ВИЧ-1 могут оказывать влияние на развитие лекарственной устойчивости. В связи с этим назрела необходимость создания национальной базы данных ВИЧ-1, циркулирующих в стране, доступной всем специалистам по разработке антиретрови-русных препаратов и лечению ВИЧ-инфекции, и тщательного анализа мутации ЛУ, формирующихся у пациентов на фоне различных схем терапии

На основании изучения 175-ти нуклеотидных последовательностей гена pol ВИЧ-1, выделенных от 130 ВИЧ-инфицированных пациентов проведено исследование эпидемиологии У771-содержащих генотипов ВИЧ-1 подтипа А, условно названных MutW7, Ранее, А.Л. Суханова [Суханова 2006] по результатам филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена pol ВИЧ-1 IDU-A в 146-ти образцах из различных регионов России, сделала вывод о двух «эффектах основателя», произошедших в ходе эпидемии ВИЧ-инфекции в России и приведших к образованию группы У771-содержащих вирусов. В исследованиях, проведенных на территории ЯНАО, установлена устойчивость и стабильность генетического варианта Mut^, при длительном динамическом наблюдении и при передаче вируса от человека к человеку различными путями. Полученные данные полностью согласуются с результатами исследований А.Л. Сухановой которая наблюдала сохранение генотипа Ми^7| при передаче вируса от человека к человеку.

Также в работе показана реальная возможность прикладного использования анализа нуклеотидной последовательности гена pol ВИЧ-1 в проведении эпидемиологических расследований.

выводы

1. В развитии ВИЧ-инфекции в Ямало-Ненецком автономном округе за весь период наблюдения (1995-2008 гг.) выделено и охарактеризовано три периода, различающиеся существенными колебаниями количественных и качественных показателей:

а) первый период (1995-1999 гг.), характеризующийся низкой интенсивностью (показатель заболеваемости: 0,6-6,9), наличием спорадических очагов ВИЧ-инфекции и небольшим количеством инфицированных лиц;

б) второй период (2000-2002 гг.), ознаменованный проникновением ВИЧ-1 в среду ПИН и характеризующийся резким подъемом заболеваемости (показатель заболеваемости: 35,4-58,2), высокой интенсивностью эпидемического процесса, формированием крупных очагов ВИЧ-инфекции и преобладанием парентерального пути передачи (до 93,2%), связанного с внутривенным употреблением психотропных веществ;

в) третий период (2003 - 2008 гг.), сопровождающийся снижением заболеваемости (показатель заболеваемости: 25,8-23,2) и интенсивности эпидемического процесса, значительным вовлечением в эпидемический процесс лиц женского пола, увеличением доли полового пути передачи до 38,3% против 6,65% в предыдущем периоде, расширением возрастных границ ВИЧ-инфекции.

2. В 2005 году зарегистрировано проникновение ВИЧ-1 в относительно изолированные этнические группы (ненцы, ханты, ямальцы), вызвавшее стремительное распространение ВИЧ-инфекции в данной популяции. Темпы роста заболеваемости ВИЧ-инфекцией среди коренных малочисленных народов Крайнего Севера в 3,3 раза превышают аналогичный показатель среди прочего населения, что представляет серьезную угрозу для существования этого этноса.

3. На территории ЯНАО зарегистрирована циркуляция четырех генетических вариантов ВИЧ-1 - подтипов А (90,8%) и В (1,5%), атакже рекомби-натных форм AB (6,2%) и АЕ (1,5%). Таким образом, на Ямале, как и во всей России, доминирует подтип А.

4. Для определения подтипа А ВИЧ-1 по нуклеотидной последовательности фрагментов гена pol рекомендовано применение программ REGA HIV-1 Subtyping Tool (версия 2) и COMET HIV-1, так как результаты определения подтипа, полученные в референс-программе HIVdb Program: Sequence Analysis, являются недостаточно точными.

5. Формирование мутаций «major score» и «intermedia score» всегда связано с воздействием АРВТ и ассоциировано с лекарственной резистентностью как у B-подтипа, так и у А-подтипа ВИЧ-1. «Low зсоге»-мутации

генетического варианта подтипа А, циркулирующего в России, не являются следствием отбора на фоне АРВТ и представляют собой полиморфные замены.

6. Существование устойчивого ро/-генотипа ВИЧ-1 с аминокислотной заменой V77I в протеазе подтверждается сохранением мутации V77I при назначении либо отмене противовирусных препаратов, а также сохранением мутации V77I при передаче вируса от человека к человеку различными путями.

7. Показана целесообразность и эффективность применения результатов секвенирования гена pol ВИЧ-1 с целью объективного установления источника заражения и эпидемических связей при проведении эпидемиологических расследований.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Л.Ю. Волова, Л.А. Грезниа. Исследование устойчивости ВИЧ-1 к АРВП и анализ встречаемости мутаций резистентности у ВИЧ-инфицированных пациентов Ямало-Ненецкого центра СПИД // Сборник трудов 6-ой всероссийской научно-практической конференции Генодиагностика инфекционных болезней. - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 113-116.

2. Л.Ю. Волова, Л.А. Грезниа. Опыт использования однокапил-лярного секвенатора ABI-PRISM-310 для секвенирования гена ро/ в формате тест-системы Viroseq HIV-1// Сборник трудов 6-ой всероссийской научно-практической конференции Генодиагностика инфекционных болезней. - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 118-120.

3. Л.Ю. Волова, Л.А. Грезниа. Применение результатов секвенирования гена ро/ в клинике и эпидемиологии ВИЧ // Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии. - 2008. - № 4. - С.92-95.

4. Л.Ю. Волова, Л.А. Грезниа. Обобщение результатов исследования резистентности ВИЧ-1 и сравнение частоты встречаемости мутаций с различными значениями «score» на территории Ямала // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. - 2009. - № 1. - С.50-54.

5. Л.Ю. Волова, Л.А. Грезниа, Т. И. Уланова. Результаты исследования резистентности ВИЧ-1 на территории Ямала и сравнение частоты встречаемости мутаций с различными значениями «score» // Клиническая лабораторная диагностика.- 2010. - № 2. - С.43-46.

6. Л.Ю. Волова, Л.А. Грезниа. Распространение субтипов ВИЧ-1 в Ямало-Ненецком автономном округе в различные периоды эпидемии // Здоровье населения и среда обитания. - 2010. - №7. - С.31-32.

7. Marlowe N., Swanson P., Fang L, Hezmayer V., Smith P., Bruce R„ Kondrashova T. et al„ Genetic Characterization of Diverse HIV-1 Strains Circulationng in Russia //17th Conference of retroviruses and Opportunistic Infections, 16-19 February, 2010. - San Francisco, USA.

8. Л.Ю. Волова, M.P. Бобкова, E. В. Казеннова, Л. А. Грезниа. Полиморфизм гена ро/ подтипов ВИЧ-1, распространенных на территории Ямало-Ненецкого АО // Сборник трудов 4-ой окружной научно-практической конференции по актуальным вопросам вирусных инфекций. - Екатеринбург, 2010.-С. 123-126.

9. E.B. Казеннова, И.В. Лаповок, A.B. Васильев, В.Ю. Лага, Л.А. Грезниа, Л.Ю. Волова, М.Р. Бобкова. Проблемы субтипирования ВИЧ-1 на основе анализа гена pol и способы их разрешения // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии.- 2010. - № 3. - С. 42-48.

10. Е.В. Казеннова, И.В. Лаповок, A.B. Васильев, В.Ю. Лага, Л.А. Грезниа, Л.Ю. Волова, М.Р. Бобкова. Применение специализированных on-line программ для генотипирования ВИЧ-1 на основе анализа гена pol // Сборник трудов 7-ой всероссийской научно-практической конференции Молекулярная диагностика. -Москва, 2010. -Т 1 -С 35-37.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CRF - рекомбинантные формы ВИЧ-1 IDU-A - вариант ВИЧ-1, принадлежащий подтипу А группы М и вызвавший эпидемию ВИЧ-инфекции среди ПИН в странах бывшего СССР MutW7| - ро/-генотип вариантов IDU-A, заключающийся в наличии

мутации V77I в области гена pol ВИЧ-1, кодирующей протеазу Pro - область гена pol ВИЧ-1, кодирующая протеазу

Rt - область гена pol ВИЧ-1, кодирующая обратную

транскриптазу Wt - «дикий тип»

АРВ - антиретровирусный АРВП - антиретровирусные препараты АРВТ - антиретровирусная терапия ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека первого типа ИОТ - ингибиторы обратной транскриптазы ИП - ингибиторы протеазы

ЛУ - лекарственная устойчивость

НИОТ - нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ННИОТ - ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы ОТ - обратная транскриптаза

П - протеаза

ПИН - потребитель инъекционных наркотиков СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита ЯНАО - Ямало-Ненецкий автономный округ

Автор выражает искреннюю благодарность и глубокую признательность: научному руководителю, главному врачу ГУЗ «Ямало-Ненецкий окружной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» к.м.н. Людмиле Юрьевне Воловой за руководство и предоставление возможности проведения данной работы; научному руководителю, заведующей отделом общей вирусологии ФГУ «НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России д.б.н. Марине Ридовне Бобковой за научное руководство, понимание и ценные советы при написании и оформлении диссертации; ведущему научному сотруднику лаборатории вирусов лейкозов ГУ «НИИ вирусологии имени Д.И. Ивановского» РАМН д.б.н. Елене Валерьевне Казеиновой за участие, поддержку, терпение и помощь при написании диссертации.

Автор выражает благодарность: врачу-лаборанту Республиканской клинической инфекционной больницы МЗСР РФ (п. Усть-Ижора) к.б.н. Галине Ивановне Коровиной и научному сотруднику Университета Томаса Джеферсона (США, Филадельфия) к.б.н. Анне Львовне Сухановой за творческий импульс в написании диссертации, а также Анатолию Степановичу Корякову и Анне Евгеньевне Аникиной за поддержку и понимание.

Для заметок

Грезина Л.А.

«Молекулярно-эпидемиологический мониторинг ВИЧ-инфекции на территории Ямало-Ненецкого автономного округа» (03.02.02 - вирусология), 2011 год, 32 с.

Подписано в печать 30.06.2011 г.

Отпечатано ИП Бердников И.К., формат 60x90/16, тираж 70 экз., заказ 1254, 2011 год.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Грезина, Лилия Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Характеристика эпидемии-¡ВИЧ/СПИД в мире.

2. Геном ВИЧ-1 как объект молекулярного мониторинга эпидемии.

2.1. Структурные гены и белки ВИЧ

2.2. Неструктурные гены и их белки* ВИЧ

2.3. Возможности и ограничения применения-различных областей генома ВИЧ-1 для слежения за эпидемическим5процессом.

3. Генетическое разнообразие ВИЧ-1.

3.1. Происхождение ВИЧ-1.

3.2. Классификация генетических вариантов ВИЧ-1.

3.3. Влияние различных факторов^на распространение подтипов!ВИЧ-1.

3.4. Репликативные свойства и вирулентность различных подтипов ВИЧ-1.

3.5. Молекулярно-генетическая характеристика эпидемии ВИЧ-1 в России.

4. Мутационная-изменчивость и полиморфизмгена pol ВИЧ-1 в.контексте феномена рез ИСТе 11ТНОСТИ.

4.1. Особенности эволюционных процессов применительно к ВИЧ-1.

4.2. Группы АРВП.

4.2.1. Структура и функции протеазы.

4.2.2. Ингибиторы протеазы.

4.2.3. Структурой функции обратной транскриптазы.

4.2.4. Нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной* транскриптазы.

4.3. Показания к началу антиретро вирусной терапии.

4.4. Виды мутаций лекарственной устойчивости и полиморфные проявления в гене pol ВИЧ-1.

4.5. Механизм селекции лекарственно-устойчивых штаммов. Феномен резистентности.

5. Методология анализа резистентности.

5. 1. Фенотипирование и генотипирование.

5.2. Автоматическое секвенирование.

5.3. Количественная оценка вклада мутаций резистентности.

6. Использование результатов генетического анализа гена pol ВИЧ-1 в молекулярно-эпидемиологическом мониторинге ВИЧ-инфекции.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1.1. Объект исследования.

1.2. Сбор клинико-эпидемиологических данных.

1.3. По дгото вка про б кро ви.

1.4. Определение уровня СБ4-лимфоцитов в крови пациента.

1.5. Определение вирусно й нагруз ки ВИЧ-1.

1.6. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента гена pol ВИЧ-1.

1.7. Определение подтипа ВИЧ-1.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ.

2.1. Характеристика групп пациентов.

2.2. Адаптация однокапиллярного секвенатора ABI pnsm-310 к тест-системе «Viroseq».

2.3. Проявления эпидемического процесса ВИЧ-инфекции на территории ЯНАО в

1995-2008 г.г.

2.4. Характеристика подтипов ВИЧ-1, выявленных на территории. ЯНАО.:.

2.4.1. Результаты выявления подтипов ВИЧ-1, циркулирующих на территории Ямало-Ненецкого АО.

2.4.2. Анализ распространения подтипов ВИЧ-1 в различные периоды эпидемии на территории Ямало-Ненецкого АО.

2.5. Мутации лекарственной устойчивости, выявленные в нуклеотидных последовательностях гена pol ВИЧ-инфицированных пациентов ЯНАО.

2.5.1. Частота встречаемости мутаций, выявленных в нуклеотидных последовательностях гена pol ВИЧ-1.

2.5.2. Анализ мутаций «major score» и «intermedia score».

2.5.3. Анализ мутаций «low-score»

2.6. Результаты молекулярно-эпидемиологического мониторинга, проведенного на основании анализа нуклеотидной последовательности гена pol ВИЧ-1, циркулирующего на территории ЯНАО.

2.6.1. Анализ связи штаммов ВИЧ-1, несущих мутацию V77I в области pro, и штаммов, свободных от этой мутации, с факторами эпидпроцесса.

2.6.2. Сохранение мутации V771 в области pro при передаче ВИЧ-1 от человека к человеку.

2.6.3. Сохранение мутации V77I в области pro при динамическом наблюдении за пациентом.

2.6.4. Прикладное использование молекулярно-эпидемиологического мониторинга в практике эпидемиологического анализа.

2.6.4.1. Случай медицинской аварии.

2.6.4.2. Эпидемиологическое расследование очага ВИЧ-инфекции в г. Салехарде.

2.6.4.3. Эпидемиологическое расследование очага ВИЧ-инфекции в г. Губкинский.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-эпидемиологический мониторинг ВИЧ-инфекции на территории Ямало-Ненецкого автономного округа"

Актуальность проблемы. Среди социально значимых заболеваний инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), занимает особое место, как по масштабам эпидемии, так и по степени опасности для жизни. Согласно данным статистики, ежегодно происходит удвоение числа инфицированных ВИЧ и больных СПИДом [Ри* е1 а1, 2005]. С момента начала эпидемии и до 2010 года в мире ВИЧ-инфекцией заразились почти 60 миллионов человек, и 25 миллионов человек умерли от заболеваний, связанных с ВИЧ-инфекцией [1ЖАГО8/08/39К]. Нет стран, в которых не обнаруживались бы случаи заражения этим вирусом; таким образом, распространение ВИЧ-инфекции в мире носит пандемический характер.

Эпидемия ВИЧ-инфекции и сопутствующих ей заболеваний, включая вирусные гепатиты и туберкулез, вот уже два десятилетия растет и развивается на территории Российской Федерации. Оценочное число ВИЧ-инфицированных лиц в стране превышает один миллион. Масштабы эпидемии и скорость ее распространения могут быть сравнимы только с другими странами СНГ.

В России в 2010 году общее число ВИЧ-инфицированных, состоящих на диспансерном учете, составило 573965 человек, в том числе 4693 ребенка. Ежегодно увеличивается как количество вновь выявленных случаев заражения (в 2010 году выявлено 64528 случаев), так и количество смертей ВИЧ-инфицированных пациентов (в 2010 году умерло 4833 человека), что в целом заставляет рассматривать эпидемиологическую ситуацию по ВИЧ-инфекции как стабильно ухудшающуюся.

В отсутствие мер специфической профилактики единственным способом ограничить эпидемию остается антиретровирусная терапия (АРВТ), успехи которой являются одним из наиболее впечатляющих достижений человечества последних лет. Своевременное назначение терапии и тщательный контроль ее эффективности способны значительно повысить качество и продлить срок жизни пациентов, хотя взять заболевание под полный контроль пока не удается. Одним из наиболее серьезных и часто встречающихся ограничений эффекта антиретровирусной терапии является феномен, получивший название лекарственной устойчивости (резистентности) и связанный с появлением специфических мутаций в составе вирусного генома. Следствием их существования становится неспособность лекарственных препаратов к воздействию на функциональные участки вирусных белков.

Лечение ВИЧ-инфекции и СПИДа непрерывно совершенствуется, и так же непрерывно создаются и развиваются новые лабораторные методы, призванные сопровождать и контролировать терапию. С повышением надежности лабораторных методологий и расширением их возможностей значительно усложнились технологии исследований и способы интерпретации полученных с их помощью результатов.

За время, прошедшее с момента регистрации первого случая заражения ВИЧ в России в 1987 году, создана обширная сеть специализированных учреждений, занимающихся организацией профилактических мероприятий, эпидемиологического надзора и учета инфицированных, наблюдения, и оказания всех видов• медицинской помощи, включая специфическую противовирусную терапию и лабораторный контроль ее эффективности. Самые передовые технологии лабораторного анализа, включая молекулярные методы, стали рутинными и включены в алгоритмы текущего обследования всех ВИЧ-инфицированных пациентов. Апофеозом современных лабораторных технологий [Лукашов В. В., 2009] стало внедрение в практику метода секвенирования генома ВИЧ в целях слежения за возникновением мутаций лекарственной устойчивости (ЛУ) ВИЧ [MP № ' 5958-РХ от 07.08.2007г.] ; первые лаборатории страны начали проводить этот вид исследований в 20052006 гг.

Появление в арсенале диагностических средств нового метода и предназначенных для его выполнения тест-систем расширило спектр возможностей не только для клиницистов, получивших средство для научно обоснованного назначения и замены схем терапии ВИЧ-инфекции. Дополнительные горизонты открылись также перед эпидемиологами, осуществляющими молекулярный мониторинг за эпидемией ВИЧ-инфекции.

Традиционно слежение за распространением генетических вариантов, в частности, подтипов (субтипов) вируса проводилось только в научно-исследовательских лабораториях главным образом путем анализа генов ВИЧ-1, кодирующих структурные белки Gag и Env. Такой выбор определялся тем, что гены gag и env в составе генома ВИЧ-1 удалены друг от' друга, что позволяет с высокой надежностью выявлять не только «чистые» субтипы, но и рекомбинантные формы вируса, образующиеся при инфицировании клеток-мишеней разными вариантами вируса с последующими рекомбинационными процессами при репликации. Появление тест-систем, предназначенных для анализа гена pol в клинических лабораториях, на первый взгляд, позволяло объединить решение двух задач — анализ мутаций ЛУ и субтипирование ВИЧ-1, однако в действительности дело оказалось сложнее.

Получив возможность использовать передовое оснащение и тест-системы, региональные клинические лаборатории столкнулись с прежде не виданными задачами, находящимися на грани клинической диагностики и науки; решение их столкнулось с рядом трудностей и требовало принципиально нового мышления. Одной из первых анализ генома ВИЧ-1 начала выполнять лаборатория Центра СПИД в г. Ноябрьске Ямало-Ненецкого автономного округа.

Согласно данным, полученным в ходе многолетнего молекулярного мониторинга ВИЧ-инфекции, известно, что, начиная с 1995 года, в российской популяции широко распространился вариант подтипа А ВИЧ-1 [Bobkov et al., 2004; Vazquez de Parga et al., 2005], который имеет ряд существенных особенностей в структуре практически всех областей генома [Суханова, 2005; Лаповок с соавт., 2009]. До настоящего времени этот вариант (IDU-A) продолжает доминировать на всей территории России, вызывая до 94% случаев ВИЧ-инфекции в России [Bobkov et al., 2004; Суханова, 2006]. Кроме него, в стране распространены еще два варианта ВИЧ-1 - подтип В и рекомбинант CRF03AB [Smolskaya Т. et al,2006; Marlowe N. et al., 2010].

Однако в мире наиболее изученным является геном ВИЧ-1 подтипа В, поскольку именно он доминировал в странах Северной Америки и Западной Европы, ставших «пионерами» эпидемии ВИЧ-инфекции. Это нашло свое отражение в создании диагностических средств, в основе которых лежала нуклеотидпая последовательность генома ВИЧ-1 подтипа В [Barlow et al, 1997], а также в создании противовирусных препаратов, экспериментальная эффективность которых была прежде всего подтверждена в отношении ВИЧ-1 подтипа В.

Возникшая вслед за внедрением АРВТ проблема лекарственной устойчивости ВИЧ-1 также была изучена преимущественно на примере ВИЧ-1 подтипа В; для этого были проведены широкие клинические и лабораторные испытания, как in vivo, так и in vitro. Неудивительно, что в качестве «дикого штамма», чувствительного к антиретро вирусным препаратам (АРВП), компьютерными программами, входящими в состав коммерческих тест-систем (ViroSeq HIV-1, HIV db Program) предлагается аминокислотная последовательность известного штамма НХВ-2 подтипа В [Celera's ViroSeq HIV-1 Genotyping System, 2002].

Тем не менее, генетические различия между подтипами ВИЧ-1 являются довольно существенными. Филогенетические дистанции между подтипами А и В ВИЧ-1 достигают 25% - 40% [Korber et al, 1998]; существует возможность различия репликативных свойств и вирулентности у различных подтипов ВИЧ-1 [Kanki et al, 1999, Neilson et al, 1999]. Мутации ЛУ, возникающие в составе ВИЧ-1 разных подтипов, могут различаться, хотя эти различия выражены не столь существенно [Kantor et а1.,2005]. Гораздо больше проблем возникает при анализе мутаций, уже возникших в геноме, поскольку характер фенотипического проявления мутаций, а значит, и их интерпретации, как выяснилось, в значительной степени зависит от генетического окружения. Это означает, что одни и те же мутации в составе геномов разных подтипов ВИЧ-1 могут быть интерпретированы по-разному вплоть до того, что у определенных генетических вариантов вируса эти мутации вовсе не будут вызывать лекарственной устойчивости.

Все эти вопросы являются в наше время предметом тщательного и многогранного изучения учеными всего мира. Особенное беспокойство факт неодинаковости интерпретации результатов генотипирования разных подтипов вызывает в связи с тем, что распространение в мире неВ-подтипов ВИЧ-1 носит лавинообразный характер, и все больше этих вариантов вируса встречается в высокоразвитых странах, где ранее почти полностью преобладал подтип В. Ошибки в интерпретации мутаций, вызванные неадекватностью существующих алгоритмов, могут привести к массовой неэффективности лечения и распространению устойчивых штаммов вируса.

Таким образом, Россия оказалась в ситуации, когда при условии доминирования в стране варианта подтипа А применяются тест-системы, разработанные на основе анализа генома подтипа В. Альтернативы этим системам на данный момент не существует, и освоение этих тест-систем в г. Ноябрьске, адаптацию их к условиям использования в региональной лаборатории и изучение способов анализа результатов генотипирования пришлось начинать «с нуля». В ходе этой работы были проведены исследования, которые позволили анализировать наличие мутаций ЛУ не только у леченых пациентов с целью подбора оптимальной для них схемы терапии, но и у «наивных» пациентов, тем самым была заложена основа национальной базы данных о полиморфизме циркулирующего в России генетического варианта в области гена pol. Эти данные составили базу для характеристики генетической изменчивости вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в изученном регионе России - Ямало-Ненецком округе.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы было изучение разнообразия вариантов ВИЧ-1 (по гену pot), циркулирующих в Ямало-Ненецком автономном округе, оценка распространенности и анализ мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ-1, характеризующихся различными значениями «score», а также исследование возможности применения современных молекулярных методов в практике эпидемиологическом анализа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести ретроспективной анализ эпидемии ВИЧ-инфекции на территории Ямало-Ненецкого АО (1995-2008 гг.).

2. Адаптировать существующее оборудования к выполнению анализа с применением тест-системы Viroseq HIV-1.

4. На оснований анализа генома ВИЧ-1 охарактеризовать подтипы ВИЧ-1, выявленные на территории ЯНАО, и частоту встречаемости значимых мутаций гена pol, у лиц, инфицированных разными вариантами вируса.

5. Оценить эффективность применения различных специализированных в on-line программ для определения подтипа ВИЧ-1 по гену pol. •

6. Оценить связь мутаций лекарственной устойчивости в составе подтипа А,: . характеризующихся разными уровнями значимости, . с проявлениями лекарственной устойчивости ВИЧ-1. '

7. Оценить способность вариантов ВИЧ-1, несущих мутацшг гена/?о/, к передаче . от человека к человеку.

8. Исследовать" возможность применения результатов сравнительного анализа . нуклеотидной последовательности тепа pol ВИЧ-1 в практике проведения эпидемиологических- расследований.

Положения, выносимые на защиту

1. Установлен факт доминирования генетического подтипа А ВИЧ-1 в Ямало-Ненецком автономном округе.

2. Разработан подход к определению подтипа ВИЧ-1 на основе использования Интернет-ресурсов с учетом особенностей молекулярно-эпидемиологической ситуации в России; даны рекомендации по использованию наиболее надёжных pecyjDCOB. ~

3. Показано, что наряду со структурными генами ВИЧ-1 ген pol может быть использован в качестве мишени для анализа, в ходе эпидемиологических расследований. * • .■■-,''

4: Установлено, что в составе генетического варианта ВИЧ-1. подтипа А, характерного для России, мутации «low score» не связаны с развитием . лекарственной резистентности. .

Научная новизна, работы

1. Показано распространение ВИЧ-инфекции среди коренных малочисленных народов Крайнего Севера (ненцы, ханты, ямальцы).- ' , , ;

2. В результате проведенной работы впервые охарактеризованы (по гену pol) генетические варианты ВИЧ-1, циркулирующие в Ямало-Ненецком автономном округе в различные периоды эпидемии, при этом исследуемая выборка составила 8;8% всей изучаемой популяции, что свидетельствует о ее репрезентативнети. Установлено, что на сегодняшний день на Ямале, как и во всей стране, доминирует ВИЧ-1 подтипа А (90,8%).

3:: Опробован алгоритм определения подтипов ВИЧ-1 на основании анализа, нуклеотидных последовательностей фрагментов гена pol с применением on-line программ. Впервые продемонстрирована неэффективность программы HIVdb Program: Sequence Analysis для определения подтипа А, доминирующего в России: . ,

4; Впервые показано, что наличие мутаций «major score» и «intermedia score» является свидетельством лекарственной резистентности независимо от подтипа ВИЧ-1. Наличие «low 5соге»-мутаций в штаммах ВИЧ-1 подтипа А не связано с развитием лекарственной резистентности, в то время как у подтипа В «low scorew-мутации ассоциированы с таковой. ; г 5. Для достоверного изучения эпидемиологии.У771-содержащих генотипов подтипа А ВИЧ-1 использованы данные уточненного . ретроспективного эпиданамнеза. Существование устойчивого генотипа ВИЧ-1 с заменой V77I в протеазе (Muty77i) подтверждено наличием V77I у наивных пациентов; сохранением V77I при назначении либо отмене противовирусных препаратов; сохранением замены V77I при передаче вируса от человека к человеку различными путями.

Практическая значимость работы. В рамках данной работы предложены методы адаптации однокапиллярного секвенатора «АВ1 prism-ЗЮ» для проведения исследований в тест-системе «Viroseq». Опробован и внедрен алгоритм определенияшодтипов ВИЧ1! на основании, анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена pol с применением on-line программ, что поможет практикующим врачам-лаборантам достоверно определять подтип исследуемых штаммов ВИЧ-1. Также показана доступность методов филогенетического анализа для проведения . реальных эпидемиологических расследований.

В целому результаты работы могут, служить научным подтверждением необходимости проведения молекулярно-эпидемиологического мониторинга ВИЧ-инфекции на основании анализа нуклеотидной последовательности гена pol . и возможности использования результатов секвенирования гена pol ВИЧ-1 не только в клинической практике, но и в процессе эпидемиологического анализа.

Апробация работы. Апробация работы состоялась 20 апреля, 2011 на совместном заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ, Отдела молекулярной вирусологии и Отдела общей вирусологии ГУ НИИ; вирусологии им: Д.И. Ивановского РАМН: Результатыисследований представлены в докладах на окружной научно-практической конференции1 «Актуальные вопросы противодействия. эпидемии ВИЧ/СПИД, в ЯН АО» (Ноябрьск, 2009 г.), научно-практической конференции «25 лет борьбы с ВИЧ-СПИД в России» (Суздаль, 2010 г.), на окружном семинаре «Актуальные вопросы ВИЧ-инфекции. Диспансеризация и лечение ВИЧ-инфицированных в ЯН АО» (Ноябрьск, 2011 г.).

J 1

Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Грезина, Лилия Анатольевна

Выводы

1. В развитии ВИЧ-инфекции в Ямало-Ненецком автономном округе за весь период наблюдения (1995-2008 гг.) выделено и охарактеризовано 3 периода, различающиеся существенными колебаниями количественных и качественных показателей: a) первый период (1995-1999 гг.), характеризующийся низкой интенсивностью (показатель заболеваемости: 0,6-6,9), наличием спорадических очагов ВИЧ-инфекции и небольшим количеством инфицированных лиц; b) второй период (2000-2002гг.), ознаменованный проникновением ВИЧ-1 в среду ПИН и характеризующийся резким подъемом заболеваемости (показатель заболеваемости: 35,4-58,2), высокой интенсивностью эпидемического процесса, формированием крупных очагов ВИЧ-инфекции и преобладанием парентерального пути передачи (до 93,2%), связанного с внутривенным употреблением психотропных веществ; c) третий период (2003 - 2008 гг.), сопровождающийся снижением заболеваемости (показатель заболеваемости: 25,8-23,2) и интенсивности эпидемического процесса, значительным вовлечением в эпидемический процесс лиц женского пола, увеличением доли полового пути передачи до 38,3% против 6,65% в предыдущем периоде, расширением возрастных границ ВИЧ-инфекции.

2. В 2005 году зарегистрировано проникновение ВИЧ-1 в относительно изолированные этнические группы (ненцы, ханты, ямальцы), вызвавшее стремительное распространение ВИЧ-инфекции в данной популяции. Темпы роста заболеваемости ВИЧ-инфекцией среди коренных малочисленных народов Крайнего Севера в 3.3 раза превышают аналогичный показатель среди прочего населения, что представляет серьезную угрозу для существования этого этноса.

3. На территории ЯНАО зарегистрирована циркуляция четырех генетических вариантов ВИЧ-1 - подтипов А (90,8%) и В (1,5%), а также рекомбинатных форм AB (6,2%) и АЕ (1,5%), при этом, как и во всей России, сохраняется доминирующая роль подтипа А.

5. Формирование мутаций «major score»- и «intermedia score» всегда связано с воздействием АРВТ и ассоциировано с лекарственной резистентностью как у В-подтипа, так и у А-подтипа ВИЧ-1. «Low score» мутации генетического варианта подтипа А, циркулирующего в России, не являются следствием отбора на фоне АРВТ и представляют собой полиморфные замены.

6. Существование устойчивого /wZ-генотипа ВИЧ-1 с аминокислотной заменой V77I в протеазе подтверждается сохранением мутации V77I при назначении либо отмене противовирусных препаратов, а также сохранением мутации V77I при передаче вируса от человека к человеку различными путями.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Грезина, Лилия Анатольевна, Москва

1. Агол В.И., Богданов A.A., Гвоздев В.А. и др. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот (учеб. для биол. спец. Вузов) // М.: Высш. шк. -1990.-с. 308-315.

2. Бобков А.Ф., Казенова Е.В., Селимова JI.M. и др. Нуклеотидные последовательности генов и изолятов вируса иммунодефицита человека типа 1, выявленных в России: обнаружение новых рекомбинантных вариантов // Вопр. вирусол. 2000. - №6. - С. 17-20.

3. Бобков А.Ф., Казеннова Е.В., Бобкова М.Р. и др. Молекулярно-генетическая характеристика ВИЧ-1 на>территории России // Вестник РАМН. 2002. - №8. -С.40-42.

4. Беляева В. В. Консультирование при ВИЧ-инфекции (пособие для врачей различных специальностей). М., CIDA, 77с., 2003.

5. Беляева В. В. Повышение приверженности к антиретровирусной терапии и предупреждение лекарственной устойчивости. — М., 52 е., 2009.

6. Бобков А.Ф., Казеннова Е.В., Селимова JI.M., и др. Молекулярно-вирусологические особенности эпидемии ВИЧ-инфекции в России и других странах СНГ // Вестник РАМН. 2003. - № 12. - С. 83-85.

7. Бобков А.Ф., Покровский В.В. Терапевтические ВИЧ-вакцины // М., 2001 — С. 1015.

8. Бобков А.Ф., Покровский В.В., Селимова JI.M. и др. Генетическая характеристика вариантов вируса иммунодефицита человека первого типа, вызвавших эпидемию среди наркоманов в странах СНГ// Вопр. Вирусол. -1998. -№43. -С.253-256.

9. Бобкова М. Р. Иммунитет и ВИЧ-инфекция (популярные лекции). — М.: Олимпия Пресс. 240 е., ил, 2006.

10. Бобкова М. Р. Лекарственная устойчивость ВИЧ и лабораторные методы ее определения (лекция)//Клиническая лабораторная диагностика.-2002-№1-С25-32

11. Бобкова М. Р., Буравцова Е. В., Суханова А. Л. и др Применение тест-систем AMPLICOR HIV-1 для диагностики ВИЧ-инфекции у новорожденных детей в России: первые результаты (2001-2001г.г.)//Клиническая лабораторная диагностика.-2002-№6-С49-53

12. Волова Л.Ю. Применение результатов секвенирования гена pol в клинике и эпидемиологии ВИЧ / Л.Ю. Волова, Л.А. Грезина// Журн. Микробиологии. — 2008. № 4. - С. 92-95.

13. Галегов Г.А. Лекарственная устойчивость и ее значение в процессе лечения ВИЧ-инфекции // Consilium medicum. 2001.- Экстра выпуск, ВИЧ-инфекция. - С.IIIS.

14. Коровина Г.И., Фомин Ю.А., Додонов К.Н., Улюкин И.М. К вопросу молекулярно-генетического мониторинга антиретровирусной терапии ВИЧ-инфекции // Terra Medica Nova 2005. № 3. — интернет-издание.

15. Казеннова E.B. Молекулярно-эпидемиологический анализ вариантов вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), циркулирующих в России, 19872003 г. Автореф. диссертации докт. биол. наук. М., 2005. 52 с.

16. Казеннова Е.В., Бобков А.Ф. Подтипы вируса иммунодефицита человека 1 типа: классификация, происхождение и распространение в Европе // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.' — 2003. №1. — С.90-96.

17. Казеннова Е.В., Бобков А.Ф., Селимова Л.М. и др. Анализ субтипов гена gag вариантов ВИЧ-1, выделенных в России, методом t сравнительной оценки электрофоретической подвижности гетеродуплексов // Вопр. Вирусол. 2001. -Т.46. - С. 12-16.

18. Казеннова Е. В., Васильев А. В', Коровина Г. И. и др. Сравнительный анализ систем генотипирования ВИЧ-1 Viroseq и Trugene в применении к вариантам вируса, распространенным в России // Клиническая лабораторная диагностика,-2009-№12-С46-51

19. Казеннова Е. В., Васильев А. В., Лаповок И. А. и др. Проблемы субтипирования ВИЧ-1 на основе анализа гена pol и способы их разрешения // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. 2010,Т.2, №3, С. 42-48.

20. Ладная И. И., Покровский В. В., Бобков А. Ф. и др. Распространение субтипов ВИЧ-1 в России // Эпидемиол. и инфекц. бол. — 1998. — № 5. — С. 19—23.

21. Лукашов В. В. Молеклярная эволюция и филогенетический анализ (учебное пособие) // М.: Бином-2009.-с. 5-8.

22. Методические Рекомендации «О проведении надзора за циркуляцией генетических вариантов вируса иммунодефицита человека, включая циркуляцию штаммов, резистентных к АРВП» утв. Минздравсоцразвития 06.08.2007г. № 5958-РХ

23. Научная деятельность ВОЗ. Вирус иммунодефицита человека// Бюллетень ВОЗ.-2006,- Т. 84, № I.-C.8-9.

24. Покровский В.В., Бобков А.Ф. Ладная П.Н. и др. Эпидемиологическая ситуация инфекции, вызываемая вирусом иммунодефицита человека, в России в 1991-1995 годах // Эпидемиол. и инфекц. бол. 1996. - №1. - С. 83-85 (а).

25. Покровский В.В., Ермак Т.Н., Беляева В.В., Юрин О.Г. ВИЧ-инфекция: клиника, диагностика и лечение. Под общ. ред. В.В. Покровского. — 2-е изд., испр. и доп.

26. М.: ГЭ ОТ АР-МЕД, 2003. — 488 е.: 73 ил.

27. Покровский В.В., Ладная H.H., Соколова Е.В. Буравцова Е.В. ВИЧ-инфекция // Информационный бюллетень. 2008. - № 30. - 36 с.

28. Покровский В.В., Янкина З.К. Эпидемиологическое расследование первого • случая СПИД, выявленного у гражданина СССР// Журнал микробиологии.1987,-№12,- С.8-11.

29. Суханова А. Л., Казеннова Е. В., Рудинский Н. И. и др. Генетическая изменчивость области, кодирующей прогеазу, у изолятов ВИЧ-1 подтипа А и рекомбинантов CRF03AB на территории СНГ // Вопр. вирусол. — 2004. № 6. -С. 4-9 (а).

30. Суханова А.Л., Казеннова Е.В., Бобкова М.Р. и др. Варианты вируса иммунодефицита человека типа 1, обнаруживаемые в России среди инфицированных половым путем // Вопр. вирусол. — 2004. — № 49. — С. 4-7 (Ь).

31. Суханова A.JL, Бобков А.Ф. Генетическое тестирование лекарственной устойчивости при ВИЧ-инфекции: проблемы и перспективы // Эпидемиология и1.инфекционные болезни. 2004. — N. 4. - С. 54-57 (с).

32. Суханова А. Л. Изменчивость гена pol вариантов вируса иммунодефицитачеловека первого типа (ВИЧ-1) подтипа А, циркулирующих в России. Автореф. диссертации докт. биол. наук. М., 2006 25 с.

33. Филдс Б.Н., Найп Д.М., Мэрфи Ф.А. и др. Вирусология (в 3-х томах) // М.: Мир.- 1989.-Т. 1. — с. 442-459.

34. Aiken С, Konner J, Landau NR, et al. Nef induces CD4 endocytosis: Requirement for a critical dileucine motif in the membrane-proximal CD4 cytoplasmic domain// Cell -1994.-Vol.76. -P.853-864.

35. Asante-Appiah E., Skalsa M. Molecular mechanisms in retrovirus DNA integration// Antiviral Res. -1997. Vol.36. -P. 139-156.

36. Ammaranond P., Cunningham P., Oelrichs R. et al. No increase in protease resistanceand a decrease in revei se transcriptase resistance mutations in primary HIV-1 infection:, 1992-2001 //AIDS. -2003a.-Vol. 17(2).-P. 264-267

37. Ammaranond P., Cunningham P., Oelrichs R. et al. Rates of transmission ofantiretroviral drug resistant strains of HIV-1 // J. Clin. Virol. — 2003. Vol.26. -P.153-161.

38. Barin F., Meyer L., R. Lancar et al. Development and Validation of an Immunoassay for Identification of Recent Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infections and Its Use on Dried serum Spots // J Clin Microbiol. 2005. - Vol. 43, N. 9 - P. 4441-4447.

39. Barre-Sinoussi F., Cherman J.C., Rey F. et al. Isolation of T-lymphotrofic retrovirus from patient at risk to AIDS // Science. 1983. - Vol. 220. - P.868-871.

40. Bayles E., Gao F., Bibollet-Ruche F. et al. Hibrid origin of SIV in chimpanzees // Science. 2003. - P. 1713.

41. Bebenek K., Abbotts J., Roberts J.D. et al. Specificity and mechanism of error-prone ' replication by human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase // J. Biol. Chem.- 1989.-Vol. 264(28). P. 16948-16956.

42. Beer В., Bailes E., Sharp P. et al. Diversity and evolution of primate lentiviruses. In HIV Sequence Compendium 2000, Los Alamos: Los Alamos National Laboratory.

43. Bobkov A. F., Kazennova E. V., Selimova L. M. et al. Temporal trends in the HIV-1 epidemic in Russia: predominance of subtype A // J. Med. Virol. — 2004. Vol. 74, N. 2.-P. 191-196.

44. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Garaev M., et al. Identification of an env G subtype and'heterogeneity of HIV-1 strains in the Russian Federation and Belarus // AIDS. -1994. Vol. 8, N. 12.-P.-1649-1655.

45. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Selimiva L. et al.' An HIV type 1 epidemic among injecting drug users in the former Soviet Union caused by a homogeneous subtype A strain//AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1997. - Vol.13. - P. 1195-1201.

46. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Selimova L. et al. Genetic heterogeneity of HIV-1 type 1 in Russia: identification of H variants and relationship with epidemiological data //AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1996. - Vol.12. - P.1687-1690.

47. Bobkova M., Kazennova E., Selimova L. et al. Serological approaches to subtyping of HIV-1 in injecting drug users in Russia: evidence of subtype homogeneity at the main sites of the epidemic // Int. J. STD&AIDS. 2001. -Vol.12. - P.34-40.

48. Brenner B.G., Routy J.-P., Petrella M. et al. Peisistance and fitness of multidrug-resistant human immunodeficiency virus type 1 acquired in primary infection // J. Virol.-2002.-Vol. 76.-P. 1753-1761

49. Bryant M, Ratner L. Myristoylation-dependent replication and assembly of human immunodeficiency virus 1// ProcNatl Acad Sei USA -1990. Vol. 87. -P.523-527

50. Bushman FD, Fujiwara T, Craigie R. Retroviral DNA integration directed by HIV integration protein in vitro// Science -1990. Vol. 249. -P.1555-1558.

51. Capon DJ, Ward RH. The CD4-gpl20 interaction and AIDS pathogenesis// Annu Rev Immunol -1991. Vol.9. -P.:649-678.

52. Carr JK, Nadai Y, Eyzaguirre L et al. Outbreak of a West African recombinant of HIV1 in Tashkent, Uzbekistan // JAIDS. 2005. - Vol. 39(5). - P.570-575.

53. Celera's ViroSeq HIV-1 Genotyping System. Инструкция к продукту. Celera Diagnostics, LLC. Копирайт 2001, 2002 С.49-53.

54. Clavel F., Guetard F., Brun-Vezinet S., et al. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS// Science. -1986. Vol.233. -P.343-346.

55. Coffin J.M. HIV population dynamics in vivo: implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy// Science. 1995. - Vol. 267(5197). -P.483-489.

56. Clever J., Sassetti C., and Parslow T.G. RNA secondary structure and binding sites for gag gene products in the 5' packaging signal of human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 1995. - Vol. 69, N. 4. - P. 2101 - 2109.

57. De Gruttola V. Communication betwecn resistance HIV and the answer to antivirus therapy: the researches used for standardization of the analytical data / V. De Gruttola// Antiviral Ther. -2005. Vol. 5, N 1. - P. 41-48.

58. Deeks S.G. International perspectives on antiretroviral resistance. Nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2001. -Vol. 26. — P.S25-33.

59. Domingo E. Quasispecies theory in virology // J. Virol. 2002. - Vol. 76. — P. 463465.

60. Domingo E., Holland J.J. RNA virus mutations and fitness for survival // Annu. Rev. Microbiol. 1997,-Vol. 51.-P. 151-178.

61. Domingo E., Menendez-Arias L., Quinones-Mateu M.E. et al. Viral quasispecies and the problem of vaccine-escape and drug-resistant mutants // Prog. Drug. Res. — 1997. — Vol. 48. — P.99-128.

62. Dunn B.M., Goodenow M.M., Gustchina A., Wlodawer A. Retroviral proteases // Genome Biol. 2002. - Vol. 3(4). - P.3006.1-3006.7.

63. Eigen M. On the nature of virus quasispecies. // Trends Microbiol. — 1996. — Vol.4(6). — P.216-218.

64. Eshleman S.H., Jackson J.B. Nevirapine resistance after single dose prophylaxis // AIDS Rev. 2002. - Vol.4(2). - P.59-63.

65. Ferdats A, Konicheva V, Dievberna I et al. An HIV type 1 subtype A outbreak among injecting drug users in Latvia // AIDS Res Hum Retroviruses. 1999. — Vol. 15(16). — P. 1487-1490.

66. Flint S.J., Enquist L.W., Krug R.M. et al. Principles of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. ASM Press, Washington, USA, 2000. - 804 p.

67. Fonjungo P.N., Mpoudi E.N., Torimoro J.N. et al. Human immunodeficiency virus type 1 group M protease in Cameroon: genetic diversity and protease inhibitor mutational features // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - P.837-845.

68. Franke EK, Luban J. Inhibition of HIV-1 replication by cyclosporine A or related compounds correlates with the ability to disrupt the Gag-cyclophilin A interaction// Virology -1996. Vol. 222. -P.279-282.

69. Franke EK, Yuan HE, Luban J. Specific incorporation of cyclophilin A into HIV-1 virions// Nature -1994. Vol. .372. -P.359-362.

70. Gallay P, Swingler S, Song J, et al. HIV nuclear import is governed by the phosphotyrosine-mediated binding of matrix to the core domain of integrase // Cell. -1995. Vol. 83, N. 4. - P. 569-576.

71. Gallo R.C. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patient with AIDS and at risk for AIDS// Science. -1984. Vol.224. -P.500-503.

72. Gao F., Vidal N., Li Y., et al. Evidence of two distinct subsubtypes within the HIV-1 subtype A radiation// AIDS Res Hum Retroviruses. -2001. -Vol.17. -P.675-688.

73. Gao F., A comprehensive panel of near-ful-length clones and reference sequences for non-suptipe B isolates of human immunodeficiency virus type 1/F. Gao, L. D. Robertson, C. D. Carruthers et al. II J. Virol.-1998.-V.72-P.5680-98.

74. Guidance for industry premarket notifications for in HIV drug resistance genotype assays. Specials controls. Draft Guidance, CBER, August 2004.

75. Haas G., Samri A., Gomard E. et al. Cytotoxic T-cell responses to HIV-1 reverse transcriptase, integrase and protease // AIDS. 1998. - Vol. 12(12). - P. 1427-1436.

76. Haase A.T. Population biology of HIV-1 infection: viral and CD4+ T cell demographics and dynamics in lymphatic tissues // Annu. Rev. Immunol. -1999. -Vol. 17. — P.625-656.

77. Hansen J.L., Long A.M., Schultz S.C. Structure of the RNA-dependent RNA polymerase of polio virus // Structure. 1997. - Vol. 5(8). - P.l 109-1122.

78. Harrison G.P, Lever A.M. The human immunodeficiency virus type 1 packaging signal and major splice donor region have a conserved stable secondary structure// J Virol -1992. Vol.66. —P.4144-4153.

79. Hcyndrickx L., Janssens W., Zekeng L., et al. Simplified Strategy for detection of recombinant human immunodeficiency virus type 1 Group M isolates by gag/env heteroduplex mobility assay// J. Virol. -2000. -Vol.74. -P. 363-370.

80. Huang H., Chopra R., Verdine G.L., Harrison S.C. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications tor drug resistance // Science. 1998. - Vol. 282(5394). - P. 1669-1675.

81. Helga-Maria C., Hammarskjold M., Rekosh D. An intact TAR element and cytoplasmic localisation are necessary for efficient packing of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA// J.Virol.-1999. Vol.73.- P.4127-4135.

82. Iversen A.K., Shafer R.W., Wehrly K. et al. Multidrug-resistant human immunodeficiency virus type 1 strains resulting from combination antiretroviral therapy // J. Virol. -1996. Vol. 70. - P. 1086-1090.

83. Jacks T, Power MD, Masiarz FR, et al. Characterization of ribosomal frameshifting in HIV-1 Gag-Pol expression// Nature -1988. Vol.331. -P.280-283.

84. Jeeninga R. E., Hoogenkamp M., Armand-Ugon M. et al. Functional differencesbetween the long terminal repeat transcriptional promoters of humaniimmunodeficiency virus type 1 subtypes A through G // J. Virol. — 2000. Vol. 74, N. 8.-P. 3740-3751.

85. Johnson V.A., Brun-Vezinet F., Clotet B. et al. Update of the drug resistance mutations in HIV-1: 2005 // International AIDS Society USA. - Topics in HIV Medicine. -Special Contribution. - 2005. - Vol. 13 (1). - P. 51-57.

86. Kantor R, Katzenstein DA, Efron B, et al., Impact of HIV-1 subtype and antiretroviral therapy on protease and reverse transcriptase genotype: results of a global collaboration // PLoS Med. 2005. - Vol. 2(4). - P. 0325-0337.

87. Kantor R., D. Katzenstein. Polymorphism in HIV-1 non-subtype, B protease and reverse transcriptase and its potential impact on drug susceptibility and drug resistance evolution // AIDS Rev. 2003. - Vol. 5. - P.25-35.

88. Kim SY, Byrn R, Groopman J, et al. Temporal aspects of DNA and' RNA synthesis during human immunodeficiency virus infection: Evidence for differential gene expression// J Virol -1989. Voli63. -P.3708-3713.

89. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies(of nucleotide sequence // J. Mol. Evol. 1980. - Vol. 16. — P.l 11-120.

90. Kohlstaedt L.A., Wang J., Friedman J.M. et al. Crystal structure at 3.5 A resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an inhibitor // Science. — 1992. -Vol.256(5065). P.1783-1790.

91. Kondo E., Mammano F., Cohen E., et al. The p6Gag domain of human immunodeficiency virus type 1 is sufficient for the incorporation of Vpr into heterologous viral particles//J.Virol.-1995. Vol.69. - P.2759-2764.

92. Koiber B., Muldon M., Theiler J. et al. .Timing the ancestor of the HIV-1 pandemic strains // Science. 2000. - Vol. 288. - P. 1789-1796.

93. Kosalaraksa P., Kavlick M.F., Maroun V. et al. Comparative fitness of multi-dideoxynucleoside-resistant human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) in an In vitro competitive HIV-1 replication assay // J. Virol. 1999. - Vol. 73. - P. 5356-5363.

94. Krebs R, Immendorfer U, Thrall SH et al. Single-step kinetics of HIV-1 reverse transcriptase mutants responsible for virus resistance to nucleoside inhibitors zidovudine and 3-TC // Biochemistry. 1997. - Vol. 36(33). - P. 10292-10300.

95. Kurbanov F, Kondo M, Tanaka Y, et al. Human immunodeficiency virus in Uzbekistan: epidemiological and genetic analyses '// AIDS Res Hum Retroviruses. — 2003.-Vol. 19(9). P.731-738.106.107.108.109.110.111.112.113.114.115116117118

96. Lu M., Ji H., Shen S. Subdomain folding and biological activity of the core structure from human ummunodeficiency virus type 1 gp41:implications for viral membrane fusion// J.Virol. -1999. Vol.73. -P.4433-4438.

97. Lukashov V., Karamov E., Eremin V., et al. Extreme founder effect in an HIV type 1 subtype A epidemic among drug users in Svetlogorsk, Belarus // AIDS Res.Hum.Retroviruses.-1998.-V.14.-P. 1299-1302.

98. Lukashov V.V., de Ronde A., de Jong J. et al. 2000 Epidemiology of HIV-1 and emerging problems // International Journal of Antimicob. Agents. 2000. - Vol. 16. — P. 463-466

99. Lukashov V.V., Kuiken C.L., Goudsmit J. Intrahost human immunodeficiency virus type 1 evolution is related to length of the immunocompetent period // J. Virol. 1995. -Vol. 69(11).-P. 6911-6916.

100. Lukashov W, Huismans R, Jebbink MF et al. Selection by AZT and rapid replacement in the absence of drugs of HIV type 1 resistant to multiple nucleoside analogs //AIDS Res. Hum. Retr. 2001. - Vol. 17(9). - P. 807-818.

101. Malim MH, Hauber J, Le SY, et al. The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA// Nature -1989. Vol.338. -P.254-257.

102. Mammano F., Petit C., Clavel F. Resistance-associated loss of viral fitness in human immunodeficiency virus type 1: phenotypic analysis of protease and gag coevolution in protease inhibitor-treated patients // J. Virol. 1998. -Vol.72(9). P.7632-7637.

103. Martinez-Picado J., Savara A.V., Shi L. et al. Fitness of human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitor-selected single mutants //Virology. 2000. - Vol. 275(2). -P.318-322.

104. Masemola A., Mashishi T., Khoury G. et al. Hierarchical targeting of subtype C human immunodeficiency virus type 1 proteins by CD8+ T cells: correlation with viral load // J. Virol. 2004. - Vol. 78(7). - P. 3233-3243.

105. Masharsky A.E., Klimov N.A., Kozlov A.P. 2003. Molecular cloning and analysis of flail-length genome of HIV type 1 strains prevalent in countries of the former Soviet Union // AIDS Res. Hum. Retroviruses. -2003. Vol. 19. - P. 933-939.

106. Mason R.D., Bowmer M.I., Howley C.M. et al. Antiretroviral drug resistance mutations sustain or enhance CTL recognition of common HIV-1 Pol epitopes // J. Immunol. 2004. - Vol. 172. - P. 7212-7219.

107. Masur H., Michelis M.A., Greene J.B. et al. An outbreak of community-acquired Pneumocystis carinii pneumonia: initial manifestation of cellular immune dysfunction// N. Eng. J. Med. -1981. Vol .305. -P. 1431-1438.

108. Maxam A.M., Gilbert W. A new method of sequencing DNA, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1977, v. 74, p. 560-564

109. Miller V, Larder BA. Mutational patterns in the HIV genome and cross-resistance following nucleoside and nucleotide analogue drug exposure // Antivir Ther. — 2001. -Vol. 6. P.25-44

110. Miller V. International perspectives on antiretroviral resistance. Nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. — 2001. — Vol. 26. P. S34-S50.

111. Miller R., Sarver N. HIV accessory proteins as therapeutic targets// Nat.Med. -1997. — Vol.3. -P.389-394.

112. Muesing MA, Smith DH, Cabradilla CD, et al. Nucleic acid structure and expression of the human AIDS/lymphadenopathy retrovirus//Nature. -1985. Vol. 313. -P.450-458.

113. Nath A., Conant K., Chen P., et al. Transient exposure to HIV-1 Tat protein results in cytokine production in macrophages and astrocytes// J.Biol.Chem. -1999. Vol.274. -P.17098-17102.

114. Najeira S, Sent Lui et al. Genotypic and phenotypic characterization of human immunodeficiency virus type 1 variants isolated from patients treated with the protease inhibitor Nelfinavir // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - Vol.42. - P.2637-2644.

115. Novitsky V.A., Montano M.A., Essex M. Molecular epidemiology of an HIV-1 subtype A subcluster among injection drug users in the Southern Ukraine // 1998 Aug 10;14(-12): 1079-85 from 1996, Odessa, no recomb

116. Nowak M., Schuster P. Error thresholds of replication in finite populations mutation frequencies and the onset of Muller's ratchet // J. Theor. Biol. 1989. - Vol. 137(4). -P.375-395.

117. Parkin NT, Chamorro M, Varmus HE. Human immunodeficiency virus type 1 gag-pol frameshifting is dependent on mRNA secondary structure: Demonstration by expression in vivo// J Virol -1992. Vol.66. -P.5147-5151.

118. Patel PH, Jacobo-Molina A, Ding J et al. Insights into DNA polymerization mechanisms from structure and function analysis of HIV-1 reverse transcriptase // Biochemistiy. 1995. - Vol. 34. -P. 5351.

119. Patick A. K., R. Rose, J. Greytok et al. Characterization of a human immunodeficiency virus type 1 variant with reduced sensitivity to an aminodiol protease inhibitor // J. Virol. 1995. - Vol. 69. - P. 2148-2152.

120. Patick A.K., Potts K.E. Protease inhibitors as antiviral agents // Clin. Microbiol. Rev. — 1998. Vol. 11 (4). - P.614-627.

121. Paxton W., Connor R.I., Landau N.R. Incorporation of ,Vpr into human immunodeficiency virus type 1 virions: requirement for the p6 region of gag and mutational analysis// J Virol. -1993. Vol.67. -P.7229-7237.

122. Piot P., Bartos M., Ghys P., et al. The global impact of HIV/AIDS// Nature. -2001. -Vol.410. -P.968-973.

123. Poch O., Sauvaget I., Delarue M., Tordo N. Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements // EMBO J. 1989. - Vol. 8(12). - P. 3867-3874.

124. Poon D., Li G., Aldovini A. Nucleocapsid and matrix protein contributions to selective human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA packaging// J.Virol. -1998. — Vol.72. -P.1983-1993.

125. Poznansky M, Lever A, Bergeron L, et al. Gene transfer into human lymphocytes by a defective human immunodeficiency virus type 1 vector// J Virol — 1991. Vol.65. — P.532-536.

126. Quinones-Mateu M.E., Arts E.J. Fitness of drug resistant HIV-1: methodology and clinical implications // Diug Resist Updat. 2002. - Vol. 5(6). - P.224-233.

127. Race E., Meynard J.-L., Soriano V., Zolopa A.R. Recomendations for management. In HIV Infection/ Antiviral resistance —scientufic basis and recommendations for management. Bash Medical Publishing. - 2004. - p. 110-123

128. Robertson D., Anderson J., Bradac J. et al. A reference guide to HIV-1 classification // HIV Sequence Database. Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. - 2000 (a).

129. Robertson D.L., Anderson J.P., Bradac J.A., et al. HIV-1 nomenclature proposal // Science. -2000. Vol. 288. -P.55-56 (b).

130. Robertson D. L. HIV-1 Nomenclature Prorosal / D. L. Robertson, J. P. Anderson, J. A. Bradac et al// Human Retroviruses end AIDS 1999. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos NM.-1999.- P. 492505.

131. Rossi J.J., June C.H., Kohn D.B. Genetic therapies against HIV // Nat. Biotechno 1. — 2007. Vol. 25, N. 12. - P. 1444-1454.

132. Roy S, Delling U, Chen CH, et al. A bulge structure in HIV-1 TAR RNA is required for Tat binding and Tat-mediated trans-activation// Genes Dev -1990. Vol .4. -P.1365.i

133. Ruben S, Perkins A, Purcell R, et al. Structural and functional characterization ofhuman immunodeficiency virus tat protein // J. Virol. -1989. Vol. 63, N.l. -P. 1-8.

134. Ruiz-Jarabo C.M., Arias A., Baranowski E. et al. Memory in viral quasispecies // J. Virol. 2000. - Vol.74(8). - P. 3543-3547.

135. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed syntesis with DNA polymerase, J. Mol. Biol., 1975, v. 94, p. 444-448

136. Servais J., Lambert C., Fontaine E. et al. Variant human immunodeficiency virus type 1 proteases and response to combination therapy including a protease inhibitor // Antimicrob. Agents Chemother. -2001. Vol. 45. - P.893-900. i

137. Shafer R.W. Genotypic testing for human immunodeficiency virus type 1 drug resistance // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 15(2). - P.247-277.

138. Sharp P.M., Bailes E., Chaudhuri R.R. et al. The origins of acquired immune deficiency syndrome viruses: where and when? // Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 2001. -Vol. 356. P. 867-876.

139. Soares MA, De Oliveira T, Brindeiro RM et al. A specific subtype С of human immunodeficiency virus type 1 circulates in Brazil // AIDS. 2003. — Vol. 17. — P. 1121.

140. Stanford University HIV Drug Resistance Database. (http://hivdb.Stanford.edu).

141. Thali M, Bukovsky A, Kondo E, et al. Functional association of cyclophilin A with HIV-1 virions// Nature -1994. Vol.372. -P.363-365.

142. Ulich C., Dunne A., Parry E., et al. Functional domains of tat required for efficient human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptoin// J.Virol. -1999. — Vol.73. -P.2499-2508.

143. UNAIDS/06.29R // Объединенная программа Организации Объединенных Наций по ВИЧ/СПИДу (ЮНЭЙДС). 2006. - ISBN 92 9 173545 0. - С. 1-94.

144. Ustina V, Zilmer К, Tammai L, et al., Epidemiology of HIV in Estonia // AIDS Res Hum Retroviruses. 2001. - Vol. 17(1). - P. 81 -85.

145. Weber J., Rangel H.R., Chakraborty B. et al. Role of baseline pol genotype in HIV-1 fitness evolution // J. Aquir. Immune Defic. Syndr. 2003. - Vol. 33. - P. 448-460.

146. Wei P, Garber ME, Fang SM, Fischer WH, Jones KA. A novel CDK9-assodated C-type cyclin interacts directly with HIV-1 Tat and mediates its high-affinity, loop-specific binding to TAR RNAII Cell. 1998. - Vol.92. -P.451-62.

147. Wei X., Ghosh S.K., Taylor M.E. et al. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection // Nature. 1995. - Vol. 373(6510). - P. 117-122.

148. Wen W, Meinkoth JL, Tsien RY, et al. Identification of a signal for rapid export ofproteins from the nucleus// Cell 1995. - Vol.82. -P.463-473.

149. Winters M.A., Coolley K.L., Girard Y.A. et al. A 6-basepair insert in the reverse transcriptase gene of human immunodeficiency virus type 1 confers resistance to multiple nucleoside inhibitors// J Clin Invest 1998. - Vol. 102. - P.1769-1775.

150. Wamberg M.A., Miller M.D., Quan Y. et al. In vitro selection and characterization of HIV-1 with reduced susceptibility to PMPA // Antivir. Ther. 1999. - Vol. 4(2). -P.87-94.

151. Walker B.D. and Korber B.T. Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity // Nature Immunology. 2001. - Vol. 2(6): 473-475.

152. Watkins L., Williams S. HIV Antivirial drug resistans // Epidemiology.- 2007. -Vol. 2(2):326-332

153. Wilson K.M., Johnson E.I.M., Croom H.A. et al. Incidence immunoassay for distinguishing recent from established HIV-1 infection in therapy-naive populations // AIDS. 2004. - Vol. 18 - P. 2253-2259.

154. Zapp MJI, Green MR. Sequence-specific RNA binding by the HIV-1 Rev protein// Nature 1989. - Vol.342. -P.714-716.

155. Zhang Y.M., Imamichi H., Imamichi T. et al. Drug resistance during indinavir therapy is caused by mutations in the protease gene and in its Gag substrate cleavage sites // J. Virol. 1997. - Vol. 71(9). - P. 6662-6670.

156. Ziermann R., Limoli K., Das K. et al. A mutation in human immunodeficiency virus type 1 protease, N88S, that causes in vitro hypersensitivity to amprenavir // J. Virol. — 2000. Vol. 74(9). - P.4414-4419.135

157. Zhou C., Rana TM. A bimolecular mechanism of HIV-1 Tat(protein interaction with RNA polymerase II transcription elongation complexes // J Mol Biol. — 2002. — Vol. 320.-P.925-942.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Грезина, Лилия Анатольевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.02

Диссертация

Молекулярно-эпидемиологический мониторинг ВИЧ-инфекции на территории Ямало-Ненецкого автономного округа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы