Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование псевдовирусных векторов для поиска и изучения эффективных антиретровирусных препаратов

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование псевдовирусных векторов для поиска и изучения эффективных антиретровирусных препаратов"

На правах рукописи

Григорьев Илья Владимирович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПСЕВДОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ПОИСКА И ИЗУЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНЫХ АНТИРЕТРОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

03.01.04 — биохимия 03.01.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

005538812 Новосибирск-2013

005538812

Работа выполнена в ГОУ ВПО Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Покровский Андрей Георгиевич

Официальные оппоненты: Усынин Иван Федорович

доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной биологии клетки ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН

Локтев Валерий Борисович

доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, г. Москва

Защита состоится «10» декабря 2013 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 при ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН по адресу г. Новосибирск, ул. Тимакова 2, 630117, тел: (383) 33354-81.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН.

Автореферат разослан « ^ » ноября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н. Русских Галина Сергеевна

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Термин псевдовирусы появился для описания вирусных частиц, образованных при совместной инфекции клеток двумя разными вирусами, при этом образовывались вирусные частицы, содержащие кор одного вируса, а поверхностные белки от другого. Позднее этот термин стал употребляться для описания искусственно созданных вирусов, получаемых в результате трансфекции клеток различными плазмидами, экспрессирующими белки кора и оболочки различных вирусов. Наибольшее распространение получили псевдовирусы на основе ретровирусов. Основным преимуществом псевдовирусов служит возможность создания на их основе так называемых вирусов одного цикла (single cycle virus) - вирусов, способных только к одному циклу размножения, что обеспечивает безопасность работы с такими вирусами

Одной из основных проблем при создании псевдовирусов является обеспечение эффективной трансфекции ДНК в различные типы клеток. Для доставки ДНК используются многочисленные химические и физические подходы, но их эффективность сильно различается, и в значительной степени зависит от типа трансфицируемых клеток. В целом эта проблема решена для фибробластов, эпителиальных клеток, но до настоящего времени не удается обеспечить эффективную трансфекцию лентивирусных векторов в лимфоидные и макрофагальные клетки.

Эффективная трансфекция плазмид - важный этап при получении псевдовирусов, и для его реализации применяются самые разнообразные подходы. Исторически в 70-е годы стал использоваться простой и недорогой кальций-фосфатный метод трансфекции, потом последовало использование положительно заряженных комплексов с ДНК DEAE-декстрана, полиэтиленимина, расширен метод электропорации, использованы катионные липоплексы и различные биополимеры E.I. Golub, et al. 1989. Катионные агенты защищают ДНК от деградации нуклеазами и являются посредником при проникновении в клетку и последующем высвобождении из эндосом, что повышает эффективность трансфекции. Применение катионных поверхностно-активных веществ (ПАВ), несмотря на очевидные преимущества (простота синтеза и доступные реагенты, низкие концентрации, высокая комплексообразующая способность) имеет существенный недостаток, кроющийся в низкой эффективности трансфекции, в связи с чем поиск новых систем-переносчиков является актуальной задачей.

Тест-система оценки активности противовирусных соединений, построенная на основе псевдолентивирусной технологии имеет преимущество перед системой на основе изолированных вирусных ферментов, поскольку последняя не пригодна для оценки проникновения соединений в клетку и оценки активности т.н. пролекарств, для которых необходимо метаболические преобразования в клетке. Примером может служить азидотимидин, из которого должен образоваться трифосфат азидотимидина для проявления его ингибиторной активности в отношении обратной транскриптазы. Псевдолентивирусная технология по сравнению с вирус-клеточной системой обладает значительно более высокой биобезопасностью, а также позволяет вычленить и изучить отдельные стадии вирусного цикла. Это может быть необходимо при изучении активности, механизмов действия и специфики антиретровирусных препаратов различных классов, в том числе новосинтезированных и ранее не изучавшихся. С другой стороны преимуществом системы является совпадение жизненных стадий вируса и псевдовируса от проникновения в клетку до продукции вирусных частиц, что недостижимо при исследовании ингибиторов на изолированных ферментах in vitro.

Целью настоящей работы являлся поиск и изучение эффективных антиретровирусных препаратов с использованием псевдовирусных векторов.

В задачи настоящего исследования входило:

■ Разработать модельную систему для оценки активности антиретровирусных соединений, построенной на основе псевдолентивирусной технологии и метода проточной цитометрии и проверить эффективность системы с использованием известных ингибиторов.

■ Проверить эффективность геминальных поверхностно-активных веществ (ГЛАВ) с алкиламмонийной головной группой для проведения трансфекции в различные типы клеток, определить оптимальные условия для проведения трансфекции.

■ С использованием разработанной тест-системы оценить эффективность новых антиретровирусных соединений на основе интерферирующих РНК, направленных против консервативных сайтов-мишеней в последовательностях генов белка вирусного капсида (gag), обратной транскриптазы и интегразы (pol).

Научная новизна и практическая ценность работы.

Хотя существует значительное продвижение в исследовании ретровирусных инфекций, доступные терапевтические соединения обладают рядом недостатков (токсичность, недостаточная селективность, короткая продолжительность действия, возникновение устойчивых к препаратам вариантов вирусов). Одним из необходимых этапов на пути к созданию более эффективных антиретровирусных препаратов является получение адекватной модельной тест-системы. Проведена оптимизация модельной лентивекторной псевдовирусной системы и проверка малых органических соединений и новых бЬРНК в качестве антиретровирусных агентов.

В первой части работы на полученной и оптимизированной нами тест-системе оценки активности противовирусных соединений были исследованы известные антиретровирусные препараты. Данная система дает возможность оценивать эффективность кандидатных препаратов еще до стадии доклинических испытаний.

Впервые найдена и испытана группа соединений на основе катионных геминальных поверхностно-активных веществ (ГЛАВ) с алкиламмонийной головной группой. Изучены эффективности трансфекции с помощью соединений и цитотоксичность. Соединения, обладающие трансфекционной способностью, находятся в стадии патентования.

В заключительной части работы были изучены новые антиретровирусные препараты на основе интерферирующих РНК по отношению к эффективности ингибирования лентивирусной инфекции. Наибольшую активность показали бЬРНК, направленные на сайты-мишени обратной транскриптазы. Получены данные о влиянии числа замен в нуклеотидной последовательности мишени на эффективность ингибирования продукции псевдовируса.

Результаты исследовательской работы и наработанные методики активно применяются в учебном процессе у студентов 3-го курса Медицинского факультета НГУ на практических занятиях по предмету «Микробиология и Вирусология»

Положения, выносимые на защиту:

1. Соединения на основе катионных геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) с алкиламмонийной головной группой способны к трансфекции плазмидной ДНК в различные типы клеток.

Оптимизирована процедура трансфекции и достигнуты значения эффективности свыше 50% клеток НЕК293Т.

2. Разработана тест-система оценки активности противовирусных соединений на основе псевдолентивирусной технологии и метода проточной цитометрии, что оптимизирует процедуру поиска и изучения эффективных антиретровирусных препаратов.

3. На псевдолентивирус-клеточной системе исследована эффективность соединений на основе коротких шпилечных бЬРНК, направленных против продукции псевдовируса. Наибольшую активность (до 90% ингибирования репродукции псевдовируса) показывают бЬРНК, направленные на сайты-мишени обратной транскриптазы.

4. Эффекторные молекулы анти-ВИЧ бЬРНК с не более чем одним несоответствием между последовательностями интерферирующей РНК и транскрипта-мишени в сайте связывания демонстрируют высокую эффективность ингибирования.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы в журналах из рекомендованного списка ВАК и отправлена заявка на патент. Результаты представлены на более чем 10 международных научных конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 126 страницах, содержит 22 рисунка и 6 таблиц. Библиография включает в себя 255 литературных источника.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мультиплазмидная система экспрессии лентивирусного генома. Рекомбинантные псевдотипированные лентивирусы (псевдолентивирусы) получали котрансфекцией плазмид - pWPI (Addgene repository plasmid 12254), psPAX2 (Addgene repository plasmid 12260) и pMD2. G (Addgene repository plasmid 12259).

Клеточные линии. Клеточная линия НЕК293Т (почечный эмбриональный эпителий человека), использованная в качестве клеток-продуцентов псевдолентивирусов и как модельная линия клеток-мишеней. Линия поддерживалась в среде на основе DMEM с добавлением 10% термоинактивированной (30 мин при температуре 65°) фетальной сыворотки коров (FBS, HyClone), 2 мМ 1-глутамина и смеси антибиотиков (пенициллин (100 ед/мл)/стрептомицин (50 мг/мл)). Клеточные линии МТ-4 (Т-лимфоидная линия) и U937 (моноцитарно/макрофагальная линия), использованные в качестве клеток-мишеней, наиболее близких к естественным мишеням ВИЧ-1, поддерживались в среде на основе RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки коров (FBS, HyClone), 2 мМ L-глутамина и смеси антибиотиков для ведения клеточных культур (пенициллин (100 ед/мл)/стрептомицин (50 мг/мл)). Клетки пересаживались каждые 3-4 дня; при пересадке МТ-4 и U937 с применением окраски трипановым синим определялась доля жизнеспособных клеток (не ниже 0.9).

Инфекция клеток-мишеней псевдолентивирусами. Клетки-мишени модельной линии НЕК293Т, рассаженные в 96-луночный культуральный планшет за день до инфекции, заражали разведенным в ростовой среде вирусным препаратом (в тройном повторе) при плотности клеточного монослоя -50-70% методом центрифугирования-осаждения вируса на поверхность клеток-мишеней при 600g и 4° С. Клетки-мишени лимфоидной и моноцитарной линий предварительно обрабатывали протаминсульфатом (8 мкг/мл) в ростовой среде в течение 1 ч при 37° С и заражали концентрированным вирусным препаратом в малом (-100 мкл) объеме с соответствующей концентрацией протаминсульфата с предварительной адсорбцией вируса на поверхности клетки в течение 1 ч при 4°С G.N. Nikolenko, et al. 2005. Затем суспензия клеток с адсорбированным вирусом разводилась в соответствующем объеме ростовой среды и переносилась в 96-луночный планшет (Каждый эксперимент выполнялся в тройном повторе (трипликате)).

Степень инфекции определяли качественно (с помощью флуоресцентного микроскопа) и количественно (доля GFP-

экспрессирующих клеток, детектированных методом проточной цитометрии с помощью прибора FACS Canto II («Becton Dickinson», США)) через три дня после инфицирования. Клетки линии НЕК293Т предварительно фиксировали 0.5% раствором формальдегида в фосфатном буфере для культуральных работ (ФСБ), клетки линий МТ-4 и U937 анализировали без предварительной фиксации. В качестве положительного контроля для проточной цитометрии использовали клетки, инкубируемые без экспериментальных препаратов при тех же условиях. Измерения проводили по второму каналу флуоресценции (FL-2) при длине волны 488 нм (стандарт для фиксации флуоресценции белка eGFP) на проточном цитометре FACS Canto II («Becton Dickinson», США). Далее из полученных данных рассчитывали процент флуоресцентных клеток, средние значения и стандартные отклонения для популяций с использованием программы FACS Diva («Becton Dickinson», США).

Изучение новых поликатионных липидов как потенциальных трансфектантов. В качестве трансфекционных агентов исследованы алкиламмонийные геминальные поверхностно-активные веществам (АГПАВ) формулы:

1

R I "(СН2)т

N

\

R

СН3 СН3

т = 4-12; Я=СН3; С2Н4ОН; Я,= н-СпН2п+1; где п = 10, 12, 14, 16, водные растворы которых обеспечивают эффективную доставку ДНК в клетки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Инфекционность для разных культур клеток. Исследование стабильности получаемых препаратов, определение оптимального метода проведения инфицирования

Псевдовирусный препарат с высоким трансдуцирующим титром порядка 106 инфекционных единиц в миллилитре, как было определено методом кратных конечных разведений/титрованием с использованием клеток линии НЕК293Т в качестве мишени, был получен методом кальций-фосфатной трансфекции плазмид экспрессии лентивирусного генома в клетки-продуценты, как описано выше. Очищенный и десятикратно сконцентрированный препарат был заморожен в аликвотах и для применения в различных концентрациях для модели ВИЧ-1 инфекции в клетках различных типов - линии НЕК293Т и более близких в физиологическом отношении к естественным мишеням вируса лимфоидных клеток линии МТ-4 и клетках моноцитарной линии 11937. Инфицирование проводили с применением различных методик (спинокулирование вируса, адсорбция вируса на клетках-мишенях с помощью протаминсульфата). Эксперименты с ингибированием инфекции азидотимидином и его фосфонатом проводились без предварительной обработки клеток ингибитором, который добавлялся к клеткам одновременно с вирусом.

Рис.1. Слева представлена микрофотография

флуоресцирующих клеток-продуцентов линии НЕК293Т через 48 ч после трансфекции тремя плазмидами лентивекторной системы р\¥Р1, рзРАХ2, рМ02.0. Справа - флуоресцирующих клеток-мишеней линии НЕК293Т через 48 ч после момента инфицирования псевдовирусным препаратом, полученном на клетках-продуцентах. Высокий уровень флуоресцентного сигнала.

На Рис. 1 экспрессия гена GFP в составе трансферной плазмиды через 48 ч после трансфекции тремя плазмидами лентивекторной системы. Пример клеточной культуры, которая использовалась как линия-продуцент для получения псевдотипированных лентивирусных препаратов. Хороший уровень флуоресценции и большой процент трансфицированных клеток свидетельствуют о возможности нарабатывать высокотитровый препарат псевдовируса. Сигнал от белка GFP с интегрированного лентивекторного провируса через 48 ч после момента заражения (при разведении вируса 1:10) охватывает практически весь клеточный слой, свидетельствуя о достаточной трансдуцирующей активности полученного на клетках-продуцентах псевдовирусного препарата.

Полученный псевдовирусный препарат был проверен на способность заражать различные типы клеток, к примеру, первичные фибробласты человека.

Подавление псевдолентнвнрусной инфекции в линиях НЕК293Т, лимфоидных клетках линии МТ-4 и моноцитах линии U-937

Клетки широко применяемой линии НЕК293Т были выбраны в качестве первичных мишеней в связи с простотой культивирования и инфицирования в растущем клеточном монослое методом спинокуляции. Для инфекции были подобраны разведения концентрированного псевдовирусного препарата, приблизительно соответствующие значениям 10-20% и 80-90% инфицированных GFP-экспрессирующих клеток соответственно, чтобы промоделировать физиологический и более высокий уровни инфекции. Для подбора величин MOI (multiplicity of infection) для экспериментов с ингибиторами исследована кривая зависимости степени инфекции (% GFP-экспрессирующих клеток) от разведения псевдовирусного препарата в серии разведений 1:50, 1:100, 1:250, 1:500, 1:1000, 1:2500, 1:5000, 1:10000. В последующих опытах с ингибированием инфекции использовались разведения 1:100 и 1:1000.

Ингибирование AZT при более высоком по сравнению с физиологическим уровнем инфекции начинается уже в диапазоне концентраций 5-10 нМ, а для фосфоната AZT спад кривой ингибирования начинается в интервале 50-100 нМ. Данные представлены в таблице 1.

Ингибирование псевдолентнвнрусной инфекции в лимфоидных клетках линии МТ-4 и моноцитах линии U-937

Те же свойства, которые определили наш выбор в сторону линии НЕК293Т для апробации предлагаемой псевдовирус-клеточной системы (простота культивирования, нетрудоемкий и эффективный метод

инфекции, и то, что эти клетки являются быстроделящимися, что позволяет наработать необходимое количество клеток для определения большого числа ингибирующих соединений), будут востребованы при биотехнологическом использовании системы - для поточного скрининга и первичного отбора перспективных ингибиторов.

Таблица 1. Сравнение активностей нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ в разных типах клеток.

Тип клеток/условия эксперимента Концентрация 50% ингибирования (IC50)/ опубликованные данные) (мкМ) Концентрация 50% ингибирования (IC50)/ наши данные) (мкМ) Ссылки

АЗТ Фосфонат АЗТ Фосфонат

Модельные клетки-мишени НЕК293Т, НеЬа Р4/115) / однократная репликация 0.040.2 мкм 0.8 мкм 5 мкм {Nikolenko, 2005 #282}

Лимфоидные клетки (линия МТ-2, первичные культуры лимфоцитов) / многократная репликация 0.010.2 мкм 0.01-0.1 мкм {Aquaro, 1997 #281}, {Parikh, 2005 #283}, {Machado, 1999 #284}

Лимфоидные клетки (линия МТ-4) / однократная репликация 5 мкм 40 мкм

Первичные моноциты/макрофаги / многократные циклы репликации 0.01 мкм 0.2 мкм {Aquaro, 1997 #281}

Моноцитарная линия и937 / однократная репликация 100 мкм ~ 100 мкм

Для определения и количественного описания ингибирующих свойств АХТ и фосфонат-АХГ, клетки Т-лимфоидной линии МТ-4 и премоноцитарной линии 11937 заражали псевдолентивирусным препаратом в густой клеточной суспензии в присутствии протаминсульфата для более эффективной адсорбции вируса на мембранах клеток-мишеней. После этого клеточную суспензию дополняли необходимым количеством ростовой среды, добавляли ингибиторы в разных концентрациях и рассаживали в 96-луночный

планшет (в триплнкатах). Зараженные вирусом, но необработанные ингибиторами клетки, как и в предыдущем случае, использовали в качестве положительного контроля. Такой экспериментальный дизайн позволил добиться почти 100% уровня инфекции в неингибированном контроле у МТ-4 и 50% инфицированности клеток при отсутствии ингибиторов у Ш37.

Стоит отметить различие ингибирующих концентраций в экспериментах с однократным или многократным репликационным циклом вируса. Аккумуляция ингибирующего эффекта в последних приводит к снижению ингибирующих концентраций на 1-2 порядка.

Как видно из приведенных данных, наши оценки активности АЗТ в модельных клеточных линиях (в экспериментах с одиночным циклом репликации) близки к опубликованным данным. Незначительные отличия могут объясняться использованием разных клеток-мишеней и высоким значением МОГ в наших экспериментах, что ведет к росту эффективных концентраций.

Ввиду сложности трансфекции Т-лимфоидной линии МТ-4 и премоноцитарной линии Ш37 были предприняты различные модификации имеющихся методов. Были использованы различные варианты аналогов поликатионных трансфектантов под торговой маркой Метафектен, варьирование характеристик протоколов для методов электропорации, кальций-фосфатной трансфекции и других методов. Однако результатом этих экспериментов было получение счетного числа трансфицированных клеток. Имеющиеся данные не позволяли получить значительную продукцию псевдовирусных частиц, достаточную для заражения клеток-мишеней. Как клетки-продуценты использовались культуры НЕК293Т. Для всех клеток-мишеней использовались псевдовирусные препараты, полученные на НЕК293Т. Представлялось интересным сравнить получаемые препараты с псевдовирусами от Т-лимфоидной линии МТ-4 и премоноцитарной линии Ш37. В период проведения исследовательской квалификационной работы в Казанском научном центре был синтезирован новый класс органических соединений, которые способны повышать эффективность трансфекции ДНК. Естественным образом, было интересно попробовать использовать новые соединения в нашей системе.

Новые катионные липидные трансфектанты как средства доставки плазмидной ДНК в клетки

Используемые соединения различаются длиной спейсерного фрагмента (значением т), гидрофобностью (длина алкильного радикала Я,) и присутствием гидроксиэтильного фрагмента в головной группе.

Различие в их химической структуре обусловливает разные значения критической концентрации мицеллообразования (ККМ): m = 6; R=CH3; Ri= н-С16Н33 (16-6-16); ККМ 0.04 мМ m = 6; R=CH3; R^ н-С10Н2, (10-6-10); ККМ 7 мМ ш = 4; R=C2H40H; R,= h-CI6H33 (16-4-16(ОН)); ККМ 0.0018 мМ ш = 6; R=C2H40H; R^ н-С,6Н33 (16-6-16(ОН)); ККМ 0.0036 мМ ш = 12; R=C2H40H; R^ н-С16Н33 (16-12-16(ОН)); ККМ 0.0096 мМ вместо (СН2)т линкера использовался -CH2-C6HrCH2-, R=C2H40H; Ri= н-Ci6H33 (16-bz-16(OH)); ККМ 0.011 мМ

Формирование комплексов исследуемых соединений с ДНК

На рис. 2 приведены фотографии гелей (электрофореграммы) по комплексообразованию катионных агентов с плазмидной ДНК, полученные методом электрофоретического разделения в агарозном геле, по изменению электрофоретической подвижности плазмиды в агарозном геле после инкубации смесей ДНК/катионное ПАВ различного состава.

Для всех соединений при росте концентрации потенциальных трансфектантов вплоть до достижения отношения молей аминогрупп к молям фосфатных групп ДНК (далее N/P соотношения) около единицы (для 16-12-16(ОН) это соответствует концентрации 0,03 мг/мл) наблюдалось уменьшение доли свободной плазмидной ДНК, что являлось показателем формирования комплексов. Таким образом, все потенциальные катионные трансфектанты эффективно взаимодействуют с ДНК. Примечательно, что при N/P > 1 для 16-12-16(ОН) видно снижение сигнала практически до полного исчезновения. Это говорит о более высокой эффективности комплексообразования по сравнению с N/P < 1. Для других потенциальных трансфектантов было обнаружено формирование промежуточных интермедиатов, которые видны на дорожках геля, имеющего меньшую подвижность по отношению к ДНК без липоплексов. Можно предположить, что отличия, наблюдаемые для липоплекса ДНК/1 б-12-16(ОН) связаны со спецификой агрегатов этого ПАВ, поскольку наличие гибкого дистанционирующего элемента (спейсера) большой длины может способствовать структурным перестройкам в системе, в частности, переходам мицелла-везикула.

Определение цитотоксичности соединений на клетках линии НЕК293Т

Из полученных данных (Рис. 3) понятно, что соединения без ДНК более токсичны. Вероятным объяснением данного явления является отсутствие возможности образования комплексов с плазмидной ДНК в среде, что и придает отрицательное влияние на жизнеспособность из-за взаимодействия с поверхностью клеток.

16-6-16(ОН)

2. 10-6-10

ili

3. 16-4-16(OH)

16-

1 O^VJJrl)

5. 16-6-16

Рис.2. Электрофореграммы подвижности плазмидной ДНК peGFP-Nl в агарозном геле при формировании комплексов катионных ПАВ с ДНК при различном соотношении N/P, пошагово варьируемом в диапазоне от 1\4 (4х кратное преобладание фосфатных групп нуклеиновых кислот) до 64 (64х кратное преобладание аминогрупп потенциального трансфектанта). На электрофореграммах 1-5 левая и на электрофореграмме 6 - крайняя справа дорожки являются маркером молекулярной массы.

мг/мл

<Ш [

0,02

CD

Ii

fc fc К fc ^

# ^ df ° DNA~

л> S« V

-V ^ ^

Рис. 3. Определение цитотоксичности потенциальных трансфектантов методом МТТ-теста. Использовали культуру НЕК293Т клеток. МТТ-реагент добавляли через 48 ч после трансфекции ДНК с помощью новых соединений. В качестве контроля выступали клетки с добавлением плазмидной ДНК без потенциальных трансфектантов. После 3 ч инкубации с МТТ определялась оптическая плотность по протоколу из материалов и методов. Сплошным цветом отмечены столбики, соответствующие пробам ДНК + трансфектант, штриховкой - пробы только с потенциальными трансфектантами

Определение эффективности трансфекции клеток НЕК293Т

После проведения первичной оптимизации с нахождением принципиально возможных условий положительной доставки плазмидной ДНК в клетки, было проведено пошаговое изменение концентраций трансфектантов во всем рабочем диапазоне, наблюдение за цитотоксическим эффектом к культурам клеток. Полученные значения эффективности трансфекции с помощью различных соединений приведены в таблице 3. При высоких концентрациях соединений наблюдается значительная гибель клеточной популяции, а также большой разброс в эффективности трансфекции. Приведен процент флуоресцентной популяции относительно доли живых клеток.

Таблица 2. Значения эффективности трансфекции для различных геминальных ПАВ с указанием используемых значений концентрации препаратов__

Соединение Концентрация мкмоль/л Эффективность трансфекции ОРР(+), %

16-12-16(ОН) 2,3 0,8 ±0,3

5,5 43,7 ± 6,5

11 51,3 ± 10.0

22 6,6 ± 1,5

16-4-16(ОН) 3 31,7— 4.7

25 13,3 ± 4,2

250 5,0 ± 1,3

2500 7,8 ± 2,5

16-бз-16(0Н) 232 14,1 ±4,5

116 10,1 ±4,3

58 3,9 ± 0.8

29 1,9 ± 0,4

Ме1аГес1епе Н.д. 54 ± 7

Вне всякого сомнения, показатель эффективности трансфекции и цитотоксичность - два наиболее важных показателя для систем доставки генетического материала. Значения эффективности трансфекции с помощью геминальных поверхностно-активных веществ с алкиламмонийной головной группой максимальны в случае трансфектантов 16-12-16(ОН), 16-4-16(ОН), 16-Ьг-16(0Н) (Таблица 3). Они относятся к одному семейству, структурно различаясь лишь длиной и типом линкеров.

Обработка клеток другими потенциальными трансфектантами не обеспечивает эффективной трансфекции. Ближайшими монокатионными аналогами заявляемых веществ, выбранными в качестве соединений сравнения, являются ПАВ цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) и Цетилгидроксиэтилдиметиламмоний бромид (ЦГАБ) Б.М. МеРшкоу, е/ а1. 1995 , Р. Pinnaduwage, е1 а1. 1989, 1Р. С1атше, е1 а1. 2000, Э. АШага, е( а1. 2007.

К недостаткам использования указанных монокатионных ПАВ в качестве средств доставки ДНК в клетки можно отнести (1) значительно более высокие значения критических концентраций мицеллообразования (ККМ ЦТАБ и ЦГАБ составляют 0.87 и 0.75 мМ соответственно), (2) более низкий поверхностный потенциал, что требует более высоких концентраций ПАВ для достижения сравнимых эффектов компактизации ДНК и смены заряда комплексов ПАВ/ДНК; (3) пониженную трансфекцию ДНК.

В работах О. Ап1ага, е1 а1. 2007 , Ь. Zakharova, е1 а1. 2012 исследовали эффект исключения бромистого этидия при комплексообразования олиго- и полинуклеотидов амфифильными катионными агентами. Показано, что степень связывания ДНК с каликсаренами и катионными ПАВ выходит на плато при Ы/Р> 1 и

Рис. 4. Изображения флуоресценции клеток НЕК293Т. Пример сравнения эффективностей трансфекции плазмидной ДНК реОРР-Ы 1 между новым соединением 16-12-16(ОН)-изображение в левой части рисунка, и коммерческим трансфектантом МсЧаГесСепе -справа.

приводит к существенному уменьшению наблюдаемой флуоресценции. Эти данные хорошо согласуются с результатами по эффективности взаимодействия амфифильных агентов с ДНК, установленные при электрофоретическом разделении в геле и измерении дзета-потенциала липоплексов. Соединения с длинным алкильным линкером и большей

гидрофобностью показали более значительное падение флуоресценции, что предполагает более эффективное комплексообразование.

Данные флуоресцентной микроскопии на Рис. 4 говорят о сходной эффективности трансфекции нового исследуемого соединения и Metafectene. В нашем случае наблюдается подобная зависимость, где наибольшая эффективность получена при использовании соединения 16-12-16(ОН), имеющего боковую цепь С16, тогда как соединения типа 10-х-10 значительно уступали в эффективности трансфекции. Это свидетельствует о том, что наряду со стехиометрическими электростатическими взаимодействиями в образование липоплексов вносит вклад кооперативный заряд агрегированных ПАВ. Ранее было показано, что преорганизация в мицеллы оказывается важной для эффективной компактизации в малые наночастицы. Плазмидная ДНК, вероятно, служит «липкой лентой», наматывая и собирая вместе позитивно заряженные частицы L. Baldini, et al. 2007 230, R.V. Rodik, et al. 2011 .

Таким образом, полученные нами данные показывают, что лучшей способностью к трансфекции культур клеток обладают АГ11АВ 16-4-16(ОН) и 16-12-16(ОН). Вероятно, это объясняется оптимальной длиной линкера при подобранном NYP соотношении образуя комплексы с ДНК, способные эффективно проникать в клетки 293Т. Однако, высокая эффективность достигается в малом диапазоне концентраций. Тем не менее, дальнейшее использование этого агента может быть перспективно для трансфекции ДНК в самые разные клеточные линии, и это исследование будет продолжено в будущем.

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК С ПРИМЕНЕНИЕМ ПСЕВДОЛЕНТИВИРУСНОЙ СИСТЕМЫ В КЛЕТКАХ Выбор мишеней для РНК-интерференции. Сайты-мишени для интерферирующих РНК были определены ранее по последовательности инфекционного изолята ВИЧ-1 субтипа A 97CDKP58e (Accession number AF316544) Н. Чуриков, et al. 2006 . Были выбраны два эволюционно консервативных сайта в гене вирусной обратной транскриптазы и по одному консервативному сайту в областях генов интегразы, белка вирусного матрикса gag (р17)и поверхностного гликопротеина env (gpl20). Для каждого сайта-мишени ранее были созданы генетические конструкции на основе вектора psiSTRIKE (Promega), которые кодируют двуцепочечные интерферирующие РНК длиной 18-21 или 27 п.н. соответственно Н. Чуриков, et al. 2006. Последовательности сайтов-мишеней и их локализация в геноме ВИЧ-1 представлены в таблице 4.

Выравнивание последовательностей мишеней shPHK относительно последовательностей ВИЧ-1, экспрессирующихся в составе плазмид системы экспрессии лентивирусного генома для получения псевдовирусов, и определение количества и расположения мутаций в районе сайта-мишени проводилось с помощью алгоритма попарного выравнивания нуклеотидных последовательностей BLAST.

Получение рекомбинантных псевдолентивирусов и

подавление их продукции интерферирующими РНК.

Рекомбинантные псевдотипированные лентивирусы

(псевдолентивирусы) получали котрансфекцией плазмид

мультиплазмидной системы экспрессии лентивирусного генома в клетки-продуценты линии НЕК 293Т (клетки эмбрионального почечного эпителия человека).

Трансфекцию проводили в 24-луночном культуральном планшете с помощью липополикатионного препарата Metafectene Pro («Biontex», Германия). Для получения псевдолентивирусов в отсутствие ингибирования shPHK использовалось 2,5 мкг смеси плазмид системы экспрессии лентивирусного генома в соотношении pWPI: psPAX2 : pMD2. G = 3 : 2 : 1 на лунку. Для изучения эффективности ингибирования образования псевдолентивирусов, применяли котрансфекцию того же количества описанной выше смеси с 0,5 мкг плазмиды, экспрессируюшей анти-ВИЧ или контрольную shPHK. Соотношение общего количества плазмидной ДНК к объему трансфектанта (мкг/мкл), использовавшееся для трансфекции, равнялось 1:1. В остальном протокол соответствовал предлагающемуся инструкцией производителя трансфектанта. Каждый эксперимент по трансфекции проводился в тройном повторе (в трипликате лунок). После трансфекции клетки помещались в инкубатор, через 48 ч после трансфекции содержащая лентивирусные частицы ростовая среда отбиралась для последующего определения титра вируса в ней. Мерой интенсивности инфекции, соответствующей титру псевдолентивирусного препарата, полученного в тех или иных условиях, служила доля экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок клеток в зараженных исследуемыми лентивирусными препаратами культурах.

Высокая эффективность анти-ВИЧ shPHK (от 60 до 90% снижения титра образующегося псевдовируса) ассоциируется со слабо вырожденными сайтами-мишенями (не более одного несоответствия между последовательностями интерферирующей РНК и транскрипта-мишени), в то время как 2 или 3 нуклеотидных замены в области мишени характеризовали shPHK с низкой эффективностью (10 - 30%).

Табл. 3. Описание последовательностей анти-ВИЧ бЬРНК для сайтов-мишеней в транскриптах системы лентивирусной экспрессии и

количества нуклеотидных несоответствий в мишени.

Название shRNA (район в изоляте ВИЧ-1) Последовательности вставок шпилечных конструкции Мишень Мишень в лентивекторн ой системе N нукл. несоотв

anti-HIV-1 23 п.н. (2435-2457 п.н.) anti-HIV-1-27 27 п.н.(2435-2461 п.н.) AAACATCAGAAAGAACCT CCATTcttcctgtcaAATGGAGG ТТСТТТСTGA'TGTTTttttt AAACATCAGAAAGAACCT CCATTCCrrttcaagagaAAGGA ATGG A GGTTCTTTCTG ATG TTTttttt Обратная транскрипта за psPAX2 (gagpol транскрипт) 0 0

anti-HI V-2 19 п.н. (2309-2327 п.н.) anti-HIV-2-27 27 п.н. (2304-2330 п.н.) ATAGTGATCTACCAATACA cttcctgtcaTGTATTGGTAGATC ACTATttttt CAGAAATAGTGATCTACCA ATACATGGttcaagagaCCATGT ATTGGTAGATCACTATTTC TGttttt Обратная транскрипта за psPAX2 (gagpol транскрипт) 2 3

anti-HI V-3 19 п.н. (3905-3923 п.н.) anti-HIV-3-27 27 п.н. (3901-3927 п.н.) GTAGTGGAATCTATGAATA cttcctgtcaTATTCATAGATTCC ACTACttttt A G G A G l'A GT G G А А ТС Г AT GAATAAAGAttcaagagaTCTTT ATTCATAGATTCCACTACT CCTttttt интеграза psPAX2 (gagpol транскрипт) 2 2

anti-HI V-4 19 п.н. (5366-5384 п.н.) anti-HIV-3-27 28 п.н. (5361-5388 п.н.) GGACCATAGTGTATATAG ActtcctgtcaTCTATATACACTA TGGTCCttttt AGTGTGGACCATAGTGTA TATA GAATATtcaagagAT ATT CTATATACACTATGGTCCA c.vci ttttt Vpu К ORF dVPU 5 5

aGAGl 19 п.н. (3-21) aGAGl-27 27 п.н. (1-27) GCGAGAGCGTCAATATTA AttcaagagaTTAATATTGACGC TCTCGCttttt GTGCGAGAGCGTCAATAT TAAGCGGGGttcaagagaCCCC GCTTAATATTGACGCTCTC GCACttttt PI 7(gag) 5' район gag как в pWPI, так и в psPAX2 1 1

anti-HI V-5 18 п.н. (6380-6397 п.н.) anti-HIV-5-27 28 п.н. (6376-6402 п.н.) GGACAAGCCTTCГАГАСАс ttcctgtcaTGTATAGA A GGCTT GTCCttttt ACCAGGACAAGCCTTCTA 'lAC'AAACAGttcaagagaCTGTT TGTATAGAAGGCTTGTCCT GGTttttt GP120 Нет мишени в рамке env psPAX2 и pWPI Нет мишен и

Рис.5. Инфекция контрольным Инфекция препаратом,

препаратом, полученным при полученным котрансфекцией с антиВИЧ-1

котрансфекции с вЫША без мишени эЫША

Рис.6. Слева гистограмма распределения флуоресценции в клетках, инфицированных лентивирусным препаратом без подавления экспрессии shRNA, справа -в клетках, инфицированных лентивирусным препаратом с подавлением экспрессии анти-ВИЧ -1 shRNA

Сравнение флуоресценции в популяциях клеток, инфицированных псевдовирусным препаратом без подавления экспрессии shRNA (левая половина) и с подавлением экспрессии при помощи анти-ВИЧ -1 shRNA. Верхняя часть представляет собой микрофотографии флуоресцении популяции клеточной культуры, нижняя - гистограммы распределения флуоресценции, полученные после анализа популяции методом проточной цитометрии.

Котрансфекция контрольных плазмид с shPHK (anti-HIV 5, anti-HIV 5-27) с лентивирусными плазмидами, в принципе, не должно

направленно подавлять экспрессию лентивирусных генов. Тем не менее, нами обнаружено снижение титра образующегося в результате такой трансфекции лентивируса до 30% от контрольного, что, возможно, объясняется общей активацией клеточного механизма ответа на появление двуцепочечных РНК и ее влиянием на упаковку псевдолентивируса в клетках-продуцентах. Характерно, что такой же уровень эффективности ингибирования выявляется и для shPHK с сильно вырожденными мишенями (2 или 3 нуклеотидных замены), что позволяет считать характер их воздействия также, в большей степени, ненаправленным (неспецифическим).

Выводы

1. Впервые найдена и испытана группа соединений на основе катионных геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) с алкиламмонийной головной группой на способность к трансфекции плазмидной ДНК в различные типы клеток и на цитотоксичность. Была оптимизирована процедура трансфекции и достигнуты значения эффективности свыше 50% клеток НЕК293Т.

2. Разработана тест-система оценки активности противовирусных соединений на основе псевдолентивирусной технологии и метода проточной цитометрии. Оптимизирована процедура инфекции клеток псевдовирусными частицами.

Работоспособность тест-системы подтверждена методом ингибирования обратной транскриптазы с применением стандартных ингибиторов AZT, Н-фосфоната AZT. Для линии клеток-мишеней 293Т в случае AZT полученная концентрация IC50 составила 0,8 мкМ, для Н-фосфоната AZT IC50 - 5 мкМ.

3. Проведена оценка антиретровирусной активности в отношении псевдолентивирусной инфекции ВИЧ-1 соединений на основе коротких шпилечных shPHK. С применением псевдолентивирус-клеточной системы исследована эффективность этих соединений, направленная против направленных против продукции псевдовируса. Мишенями являются консервативные сайты в последовательностях генов белка вирусного капсида (gag), обратной транскриптазы и интегразы (pol). Наибольшую активность (до 90% ингибирования репродукции псевдовируса) показали shPHK, направленные на сайты-мишени обратной транскриптазы.

4. Сравнение активностей анти-ВИЧ shPHK с наличием нуклеотидных замен между последовательностями интерферирующей РНК и транскрипта-мишени показало, что только эффекторные молекулы с не более чем одним несоответствием между последовательностями интерферирующей РНК и транскрипта-мишени в сайте связывания

проявляли высокую эффективность ингибирования. Использование shPHK с сильно вырожденными сайтами-мишенями (5 нуклеотидных замен) приводило к полному подавлению активности исследуемых соединений, в то время как 2 или 3 нуклеотидных замены вызывали снижение ее эффективности в отношении инфекции на 10 — 30%.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Чересиз C.B., Григорьев И.В., Семенова Е.А., Пустыльняк В.О., Власов В.В., Покровский А.Г. Псевдовирусная система для оценки активности противовирусных соединений с использованием различных культур клеток-мишеней. // Доклады Академии наук, 2010; 435(1): С. 126130

2. Чересиз C.B., Григорьев И.В., Чересиз Е.А., Алембеков И. Р., Кретова О.В., Чуриков H.A., Покровский А.Г. Изучение антиретровирусных препаратов на основе интерферирующих РНК в псевдовирус-клеточной системе. Вестник Новосибирского Государственного университета. Серия: Биология, клиническая медицина,

2011. Т. 9, № 1, С. 5-14

3. Григорьев, И. В.; Коробейников, В. А.; Чересиз, С. В.; Покровский, А. Г.; Захарова, Л. Я.; Воронин, М. А.; Лукашенко, С. С.; Коновалов, А. И.; Зуев, Ю. Ф. Катионные геминальные ПАВ как новые средства доставки плазмидной ДНК в клетки// Доклады Академии наук. -

2012.-С. 349-352

4. Чересиз C.B., Семёнова Е.А, Григорьев И.В., Пустыльняк В.О., Власов В.В., Покровский А.Г. Применение псевдолентивирусов для поиска и изучения антиретровирусных препаратов // В кн.: Сборник трудов научной конференции "Химическая биология - фундаментальные проблемы биотехнологии", 10-14 июня 2009 г. Новосибирск. -Новосибирск: ИХБиФМ СО РАН. 2009. С. 100.

5. Чересиз C.B., Семенова Е.А., Григорьев И.В., Покровский А.Г. Система тестирования противоретровирусных соединений на основе псевдолентивирусной клеточной системы Российско-немецкий семинар Форум Кох-Мечникова Новосибирск 2009, С. 182

6. Григорьев И.В., Чересиз C.B., Алембеков И.Р. Использования shRNA гомологичных разным участкам генома ВИЧ-1 для подавления экспрессии лентивирусных генов. Материалы конференции МГУ «Ломоносов-2010», Секция Биоинженерия и Биоинформатика.

7. Григорьев И.В., Чересиз C.B., Чуриков H.A., Покровский А.Г. Применение псевдолентивирусов для изучения антиретровирусных соединений, международная научная студенческая конференция "Студент

и научно-технический прогресс", Новосибирск: НГУ, 2010. Секция Биология

8. Григорьев И.В. Использование псевдолентивирусной системы для исследования антиретровирусных препаратов на основе shRNA. Материалы конференции МГУ «Ломоносов-2011», Секция Биология, подсекция вирусология, раздел устные доклады, С.67

9. Коробейников В.А., Григорьев И.В. Трансфекция клеток с помощью алкиламмонийных геминальных поверхностно-активных веществ. XII Международная научная конференция "Интеллект и наука", Железногорск: Железногорский филиал СФУ, 2012. С. 246.

10. Коробейников В.А., Григорьев И.В. Новые катионные липидные трансфектанты как средства доставки плазмидной ДНК в клетки. 50-я юбилейная международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск: НГУ, 2012. Секция Биология: С. 168.

11. Чересиз C.B., Чересиз Е.А., Кононова A.A., Григорьев И.В., Разумова Ю.В., Покровский Ю.В. Псевдовирусы, конструкции на основе лентивирусов и вируса везикулярного стоматита. Использование для поиска и изучения противовирусных препаратов. Всероссийская конференция с международным участием «Актуальные проблемы молекулярной медицины», посвященная 10-летию Медицинского факультета НГУ, 2013

Подписано в печать 08.11.2013 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2 Тираж 100 экз. Заказ № 186

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Григорьев, Илья Владимирович, Новосибирск

ГОУ ВПО Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

04201456603

Григорьев Илья Владимирович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПСЕВДОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ ПОИСКА И ИЗУЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНЫХ АНТИРЕТРОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

03.01.04 - биохимия

03.01.03 - молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

д.м.н., проф. Покровский А. Г.

Новосибирск - 2013

На правах рукописи

Оглавление

1 Список сокращений..............................................................4

2 Введение..................................................................................7

3 Обзор литературы...............................................................11

3.1 Способы трансфекции ДНК............................................................................................11

3.1.1 Доставка ДНК в клетки при помощи ПАВ................................................................12

3.2 Рекомбинантные системы на основе ретровирусов...................................................17

3.2.1 Жизненный цикл ВИЧ.................................................................................................17

3.2.2 Взаимодействие с рецепторами и проникновение в клетку.....................................18

3.2.3 Репликация и транскрипция ВИЧ...............................................................................19

3.2.4 Сборка и выход новых вирусных частиц...................................................................20

3.2.5 Лентивирусные векторы для доставки ДНК в клетки..............................................22

3.2.6 Конструкция биобезопасных и высокоэффективных векторов на основе ВИЧ-1. 24

3.2.7 Получение репликационно-дефектных лентивирусных препаратов......................25

3.2.8 Преобразование вируса в вектор................................................................................26

3.2.9 Эволюция дизайна векторов........................................................................................27

3.2.10 Структура используемой трехплазмидной лентивекторной системы..................29

3.2.11 Упаковочная кассета экспрессии (Вспомогательная / хелперная плазмида).......32

3.2.12 Векторные кассеты (Трансферный вектор).............................................................35

3.2.13 Вектор экспрессии вирусной оболочки...................................................................37

3.2.14 Псевдотипирование лентивирусных векторов........................................................40

3.2.15 Структура используемой в исследовании трехплазмидной псевдолентивирусной системы и функции различных компонентов вектора.......................................................42

3.3 Ингибиторы ВИЧ..............................................................................................................46

3.4 Ингибиторы ВИЧ на основе интерферирующих РНК...............................................47

3.4.1 Расщепление дцРНК....................................................................................................48

3.4.2 Регулирование транскрипции.....................................................................................49

3.5 Заключение обзора литературы.....................................................................................51

4 Материалы и методы..........................................................52

4.1 Реактивы, используемые в работе.................................................................................52

4.1.1 Приготовление электрокомпетентных клеток культуры JM109.............................53

4.1.2 Электропорация бактериальных клеток с использованием ячеек Bio-Rad............53

4.1.3 Электропорация клеток линии МТ-4 с использованием ячеек Bio-Rad.................54

4.1.4 Протокол выделения плазмид из бактериальной культуры с помощью набора Pure Yield Plasmid Maxiprep system......................................................................................54

4.2 Получение псевдотипированных лентивирусных препаратов и исследование их свойств.......................................................................................................................................56

4.2.1 Исследуемые соединения для трансфекции..............................................................57

4.2.2 Трансфекция ДНК с помощью новых соединений...................................................58

4.2.3 Определение цитотоксичности соединений к клеткам линии НЕК293Т...............59

4.2.4 Определение эффективности формирования комплексов катионный трансфектант - ДНК......................................................................................................................................59

4.2.5 Анализ трансфекции клеток методом проточной цитометрии................................60

5 Результаты и обсуждение...................................................61

5.1.1 Стабильность выделенных очищенных лентивекторов...........................................61

5.1.2 Инфекционность для разных культур клеток. Исследование стабильности получаемых препаратов, определение оптимального метода проведения инфицирования......................................................................... .............................................63

5.1.3 Ингибирование псевдолентивирусной инфекции в лимфоидных клетках линии МТ-4 и моноцитах линии И-937........................................................................................67

5.2 Новые катионные липидные трансфектанты как средства доставки плазмидной ДНК в клетки.........................................................................................................................71

5.2.1 Формирование комплексов исследуемых соединений с ДНК...............................72

5.2.2 Определение цитотоксичности соединений на клетках линииНЕК293Т.............74

5.2.3 Определение эффективности трансфекции клеток НЕК293Т...............................75

5.3 Оценка эффективности антиретровирусных препаратов на основе интерферирующих РНК с применением псевдолентивирусной системы в клетках81

5.3.1 Выбор мишеней для РНК-интерференции...............................................................81

5.3.2 Получение рекомбинантных псевдолентивирусов и подавление их продукции интерферирующими РНК...................................................................................................81

5.3.3 Определение вирусного титра и эффективности ингибирования продукции лентивирусов с помощью анти-ВИЧ зЫША....................................................................83

6 Заключение.........................................................................94

7 Выводы................................................................................98

8 От автора............................................................................99

9 Список литературы.........................................................100

1 Список сокращений

ATP - аденозин-5'-трифосфат

att Attachment sites сайты связывания интегразы

B-CLL B-cell chronic lymphocytic leukemia Хронический лимфоцитарный лейкоз

bGHpA bovine growth hormone polyadenylation последовательность

полиаденилирования гормона роста коров ВМИ В lymphoma Mo- MJ1V insertion region 1 homolog ген, кодирующий репрессорный белок, влияющий на регуляцию белков р16 и р19, являющихся ингибиторами клеточного цикла CD46 рецептор системы комплемента

CD50 Концентрация, при которой 50% популяции клеток погибают СНМР Комитет по производству лекарственных препаратов для человека cHS4 последовательность сайта гиперчувствительности 4 CMV Цитомегаловирус

CMVie ранний протеин, экспрессирующийся в зараженных цитомегаловирусом

CRM1 Главный кариоферин, экспортин, отвечающий за экспорт белков из ядра.

СТЕ Конститутивный транспортный элемент

CTS Central Termination Sequence центральная терминирующая

последовательность DC-SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-grabbing Non-integrin Рецептор лектинов С-типа, представленный как в дендритных клетках, так и макрофагах dGTP - дезозксирибогуанозин-5'-трифосфат DMSO - диметилсульфоксид dNTP - дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат dTTP - дезоксириботимидин-5'-трифосфат EGF Epidermal growth factor Эпидермальный фактор роста Env ген поверхностного вирусного белка

FACS Fluorescence-activated cell sorting Проточная цитометрия

флуоресцентно активированных клеток FIV Вирус иммунодефицита кошек

Flp От "flip" рекомбиназа дрожжей, используемая в сайт-направленной

рекомбинации FM fusion molecule молекула для слияния

FSC Forward Scattering прямое светорассеяние

gag Один из трех главных генов ВИЧ. Кодирует 4 структурных белка,

формирующих вирусный капсид GFP Green fluorescent protein Зеленый флуоресцентный белок gp120 Поверхностный гликопротеин ВИЧ gpt ген гуанинфосфорибозилтрансферазы

Hepes - М-(2-гидроксиэтил)пиперазин-М'-2-этансульфоновая кислота hSCF фактор стволовых клеток человека

HSPCs hematopoietic stem progenitor cells гематопоэтические стволовые/

прогениторные клетки HTLV Human T-lymphotropic virus Т-лимфотропный вирус человека НХВ2 Молекулярный клон ВИЧ

l-Scel site-specific homing enzyme Нуклеаза рестрикции, расщепляющая

ч

75

ДНК после специфического фрагмента длиной 18 п.н. IDLVs integration-deficient lentiviral vectors лентивирусные векторы,

неспособные к интеграции LB Lysogeny broth medium. Среда для наращивания бактерий

LEDGF/p lens epithelium-derived growth factor Фактор роста, полученный из

эпителия хрусталика LEF/TCF Lymphoid enhancer-binding factors-cell specific factor Семейство

транскрипционных факторов LM02 LIM domain only 2 (rhombotin-like 1) Ромботин-подобный белок 1 LTR - длинные концевые повторы (long terminal repeat)

MOI Multiplicity of Infection отношение инфекционных агентов (в данном

случае вирусов) к мишеням инфекции (в данном случае клеткам) MPMV Mason-Pfizer вирус обезьян

МТТ 3-(4, 5-диметил-2-тиазолил)-2, 5-дифенил-2Н-тетразолия бромид.

Реагент, использующийся для определения цитотоксичности клеток MV Edmonson measles virus Вирус кори Эдмонстона

Nef Nef -Негативный регуляторный фактор

NF-kB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells

Универсальный ядерный транскрипционный фактор NFAT Nuclear factor of activated T-cells, ядерный транскрипционный

фактор активированных Т-клеток NILVs nonintegrating lentiviral vectors неинтегрирующиеся лентивирусные векторы

OD Optical density оптическая плотность

ORF Открытая рамка считывания PBS primer-binding site сайт связывания праймера PEG - полиэтиленгликоль PPT Полипуриновый тракт

PRE посттранскрипционный регуляторный элемент RAC Консультативный комитет по рекомбинантным ДНК RCLs Репликационно компетентные лентивирусы RD114 Поверхностный гликопротеин для псевдотипирования Rev Ген регуляторного белка, связывающего РНК

RHSA Recombinant Human Serum Albumin Рекомбинантный сывороточный альбумин человека

RRE Rev-response element Взаимодействует с Rev. Необходим для

процессинга и транспорта вирусных РНК RSV Вирус саркомы Рауса

RTC Reverse transcription complex Комплекс обратной транскрипции

SD Регуляторный элемент, последовательность Шайна-Дальгарно

SDS - додецилсульфат натрия

SFV Вирус леса Семлики

shPHK Small hairpin РНК малые шпилечные РНК

SIN Self-inactivating Самоинактивирующиеся модифицированные LTR

SIV Вирус иммунодефицита обезьян

SLAM signaling lymphocyte activation molecule сигнальная молекула активации лимфоцитов- семейство рецепторов, участвующих в регуляции некоторых типов клеток иммунной системы SP1 Specificity Protein 1, транскрипционный фактор человека

SSC Side Scattering Боковое светорассеяние U3 - U3 нетранслируемый регион LTR

U5 - U5 нетранслируемый регион LTR

UTR Vpr

VSV-G

WHV

WPRE

X-SCID1

ZFNs aCD20

ВИЧ-1 кДа MCK ПАВ ПИК c-KIT (CD117) СПИД ТЕ/мл Трис ЦГАБ ЦТАБ

Untranslated region нетранслируемая область

Viral Protein R, вирусный протеин R, регулирующий ядерный импорт

преинтеграционного комплекса

G-белок оболочки вируса везикулярного стоматита

Woodchuck hepatitis virus Вирус гепатита сурка

Woodchuck post-transcriptional regulatory element

Посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита

сурка

X-linked severe combined immunodeficiency связанный с X-хромосомой тяжелый комбинированный иммунодефицит Zinc-finger nucleases Химерные нуклеазы типа цинкового пальца Клетки, экспрессирующие моноспецифические поверхностные иммуноглобулины для CD20

- вирус иммунодефицита человека 1-го типа

- килодальтон

Мезенхимальные стволовые клетки Поверхностно-активные вещества Преинтеграционный комплекс

proto-oncogene c-Kit or tyrosine-protein kinase Kit рецептор цитокинов

- Синдром приобретенного иммунодефицита Трансдуцирующих единиц в миллилитре

- трис(гидроксиметил)аминометан Цетилгидроксиэтилдиметиламмоний бромид Цетилтриметиламмоний бромид

2 Введение.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вместе с несколькими сходными представителями класса ретровирусов выделены в особую группу - семейство лентивирусов. Одно из главных смыслов перевода "ленти" - "медленный".

Первый описанный лентивирус (выделенный от коз) [1], удивил ученых непривычным для вируса поведением: он почти ничем не выдавал своего присутствия, и инфицированные на протяжении длительного времени с виду были здоровы. И лишь спустя несколько лет у животных проявлялось вызванное вирусом заболевание, которое становилось смертельным. Сходную картину представляет патогенез иммунодефицита, вызываемого ВИЧ: инфицированные люди могут годами являться носителями вируса. Анализ крови такого человека может дать высокую концентрацию вирусных частиц.

Фундаментальные исследования, направленные на выяснение молекулярных механизмов патогенеза ВИЧ, а также разрешение многих вопросов терапевтического плана, необходимое для успешной борьбы с этой ретровирусной инфекцией, не всегда требуют использования инфекционных вирусов, относящихся к природным изолятам ВИЧ. Развитие в понимании структуры и биологии ВИЧ привело к появлению безопасных и эффективных псевдовирусов на их основе. Термин псевдовирусы появился для описания вирусных частиц, образованных при совместной инфекции клеток двумя разными вирусами, при этом образовывались вирусные частицы, содержащие кор одного вируса, а поверхностные белки от другого [2-4]. Позднее этот термин стал употребляться для описания искусственно созданных вирусов, получаемых в результате трансфекции клеток различными плазмидами, экспрессирующими белки кора и оболочки различных вирусов. Наибольшее распространение получили псевдовирусы на основе ретровирусов. Основным преимуществом псевдовирусов служит возможность создания на их основе так называемых вирусов одного цикла (single cycle virus) - вирусов, способных только к одному циклу размножения, что обеспечивает безопасность работы с такими вирусами [5].

Одной из основных проблем при создании псевдовирусов является обеспечение эффективной трансфекции ДНК в различные типы клеток. Для доставки ДНК используются многочисленные химические [6] и физические подходы, но их эффективность сильно различается, и в значительной степени

зависит от типа трансфицируемых клеток. В целом эта проблема решена для фибробластов, эпителиальных клеток, но до настоящего времени не удается обеспечить эффективную трансфекцию лентивирусных векторов в лимфоидные и макрофагальные клетки.

Эффективная трансфекция плазмид - важный этап при получении псевдовирусов, и для его реализации применяются самые разнообразные подходы. Исторически в 70-е годы стал использоваться простой и недорогой кальций-фосфатный метод трансфекции, потом последовало использование положительно заряженных комплексов с ДНК DEAE-декстрана, полиэтиленимина, расширен метод электропорации, использованы катионные липоплексы и различные биополимеры [7]. Катионные агенты защищают ДНК от деградации нуклеазами и являются посредником при проникновении в клетку и последующем высвобождении из эндосом, что повышает эффективность трансфекции. Применение катионных поверхностно-активных веществ (ПАВ), несмотря на очевидные преимущества (простота синтеза и доступные реагенты, низкие концентрации, высокая комплексообразующая способность) имеет существенный недостаток, кроющийся в низкой эффективности трансфекции, в связи с чем поиск новых систем-переносчиков является актуальной задачей.

Тест-система оценки активности противовирусных соединений, построенная на основе псевдолентивирусной технологии имеет преимущество перед системой на основе изолированных вирусных ферментов, поскольку последняя не пригодна для оценки проникновения соединений в клетку и оценки активности т.н. пролекарств, для которых необходимо метаболические преобразования в клетке. Примером может служить азидотимидин, из которого должен образоваться трифосфат азидотимидина для проявления его ингибиторной активности в отношении обратной транскриптазы. Псевдолентивирусная технология по сравнению с вирус-клеточной системой обладает значительно более высокой биобезопасностью, а также позволяет вычленить и изучить отдельные стадии вирусного цикла. Это может быть необходимо при изучении активности, механизмов действия и специфики антиретровирусных препаратов различных классов, в том числе новосинтезированных и ранее не изучавшихся. С другой стороны преимуществом системы является совпадение жизненных стадий вируса и псевдовируса от проникновения в клетку до продукции вирусных частиц, что недостижимо при исследовании ингибиторов на изолированных ферментах in vitro.

Целью настоящей работы являлся поиск и изучение эффективных антиретровирусных препаратов с использованием псевдовирусных векторов.

В задачи настоящего исследования входило:

■ Разработать модельную систему для оценки активности антиретровирусных соединений, построенной на основе псевдолентивирусной технологии и метода проточной цитометрии и проверить эффективность системы с использованием известных ингибиторов.

■ Проверить эффективность геминальных поверхностно-активных веществ (ГПАВ) с алкиламмонийной головной группой для проведения трансфекции в различные типы клеток, определить оптимальные условия для проведения трансфекции.

■ С использованием разработанной тест-системы оценить эффективность новых антиретровирусных соединений на основе интерферирующих РНК, направленных против консервативных сайтов-мишеней в последовательностях генов белка вирусного капсида (gag), обратной транскриптазы и интегразы (pol).

Научная новизна и практическая ценность работы.

Хотя существует значительное продвижение в исследовании ретровирусных инфекций, доступные терапевтические соединения обладают рядом недостатков (токсичность, недостаточная селективность, короткая продолжительность действия, возникновение устойчивых к препаратам вариантов вирусов). Одним из необходимых этапов на пути к созданию более эффект