Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пептиды-имитаторы эпитопов ВИЧ-1, узнаваемых нейтрализующими антителами широкого спектра действия

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Пептиды-имитаторы эпитопов ВИЧ-1, узнаваемых нейтрализующими антителами широкого спектра действия"

на правах рукописи

ЧИКАЕВ Антон Николаевич

Пептиды-имитаторы эиитопов ВИЧ-1, узнаваемых нейтрализующими антителами широкого спектра действия

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13 МАЙ 2015 005568576

Кольцово 2015

005568576

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Научный руководитель: Ильичев Александр Алексеевич, доктор

биологических наук, профессор, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующий отделом биоинженерии

Официальные оппоненты: Невинский Георгий Александрович, доктор

химических наук, профессор, заведующий лабораторией ферментов репарации, Институт химической биологии и фундаментальной медицины сибирского отделения Российской академии наук

Попова Нэлли Александровна, кандидат биологических наук, профессор,

Новосибирский национальный исследовательский университет

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России

Защита состоится «05» июня 2015 г. в 9°° часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: р.п. Кольцове, Новосибирского района, Новосибирской области, 630559, тел. 8(383) 336-74-28. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» http://www.vector.nsc.ru

Автореферат разослан «2// » 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор В.А. Белявская

Общая характеристика работы

Актуальность темы. ВИЧ-1 является одним из самых хорошо изученных вирусов, однако до сих пор не удается найти эффективное средство профилактики данного заболевания. Заметного прогресса удалось добиться лишь в области разработки методов антиретровирусной терапии, позволяющих значительно продлевать жизнь ВИЧ-инфицированных. Тем не менее, они по-прежнему остаются паллиативным средством борьбы с вирусом и не способны остановить пандемию ВИЧ-1. Общепризнано, что единственно возможным и реальным способом предотвратить распространение ВИЧ-инфекции является создание профилактической вакцины. Однако исследования в данной области сопряжены с принципиальными затруднениями: высокая генетическая и, как следствие, антигенная изменчивость ВИЧ-1 позволяет ему ускользать от защитного действия иммунной системы.

Одним из важнейших направлений исследований по созданию вакцины против ВИЧ-1 является идентификация фрагментов вирусных белков, узнаваемых нейтрализующими антителами широкого спектра действия (broadly neutralizing antibodies, bnAbs). Они связываются с консервативными участками вирусных белков, практически не подверженных мутагенезу, за счет чего обладают нейтрализующей активностью в отношении большого разнообразия первичных изолятов ВИЧ-1. Очень перспективной выглядит идея создания вакцин, способных индуцировать наработку подобных антител. Однако на практике реализовать ее оказалось сложно, поскольку большинство эпитопов, узнаваемых bnAbs, имеют сложную пространственную организацию, которую до сих пор не удается воспроизвести в составе искусственных иммуногенов. Возможным решением данной проблемы является создание рекомбинантной конструкции, которая экспонирует эпитопы в виде линейных аминокислотных последовательностей, имитирующих нативные участки поверхностных гликопротеинов ВИЧ-1. Предполагается, что при иммунизации она будет индуцировать образование одного или нескольких нейтрализующих антител, обладающих сходными с bnAbs-прототипами характеристиками. Для поиска могут использоваться методы комбинаторной биологии, в частности метод фагового дисплея, который позволяет проводить скрининг пептидных библиотек бактериофагов для идентификации последовательностей, обладающих требуемыми антигенными свойствами. Огромное разнообразие пептидов, располагающихся на

поверхности фагов, обеспечивает возможность выявить среди них те, которые эффективно взаимодействуют с антиген-распознающими участками антител, имитируя, таким образом, конформацию нативных эпитопов.

Целью данной работы является получение с помощью фагового дисплея пептидов-миметиков, узнаваемых нейтрализующими ВИЧ-1 антителами широкого спектра действия, и изучение их антигенных и иммуногенных свойств. В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

• отобрать из комбинаторных пептидных библиотек клоны бактериофагов, связывающиеся с ЬЫАЬб ZlЗe\, 1§С1Ы2 и УЯС01. Определить аминокислотные последовательности пептидов, экспонируемых на поверхности отобранных бактериофагов;

• провести анализ специфичности связывания отобранных фаговых клонов/пептидов с моноклональными антителами ZlЗel, 1§С1Ы2 и УЯС01 с помощью иммуноблотинга;

• оценить способность селектированных пептидов/фаговых клонов подавлять нейтрализующую активность ЬЫАЬэ ZlЗel, 1§С1Ы2 и У11С01 в реакции вирус-нейтрализации с использованием модели псевдовирусов;

• изучить иммуногенные свойства отобранных фаговых клонов/пептидов и их способность индуцировать нейтрализующие ВИЧ-1 антитела.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые установлено, что отобранные пептиды-имитаторы способны конкурировать с ВИЧ-1 (штамм N1.4-3) за связывание с нейтрализующими антителами широкого спектра действия 1§С1Ы2 и УЯС01 в реакции вируснейтрализации. Впервые установлено, что сыворотки кроликов, иммунизированных фагами, которые экспонируют пептиды-миметики эпитопов, узнаваемых антителами 213е1, 1§01Ы2 и УЯС01, обладают нейтрализующей активностью в отношении псевдотипированных частиц ВИЧ-1. Полученные пептиды-имитаторы могут быть использованы для конструирования искусственных иммуногенов, индуцирующих антитела против широкого спектра изолятов вируса иммунодефицита. Кроме того, пептиды-миметики можно будет использовать и для выявления ВИЧ-специфических антител.

Основные положения, выносимые на защиту. Аффинная селекция фаговых пептидных библиотек позволяет отобрать клоны, специфично взаимодействующие с

нейтрализующими ВИЧ-1 антителами широкого спектра действия 213е1, 1§С1Ь12 и УЯССН. В аминокислотных последовательностях пептидов, связывающихся с МКА УЯС01 и 213е1, обнаружены консенсусные мотивы. Отобранные бактериофаги экспонируют пептиды, которые, по крайней мере, частично имитируют фрагмент петли §р120, связывающейся с С04-рецептором. Отобранные пептиды-имитаторы способны подавлять нейтрализующую активность антител УЯС01 в реакции конкурентного ингибирования. Иммунизация мышей отобранными против МКА г13е1 фаготопами вызывает наработку §р41-специфических антител. Сыворотки лабораторных животных, иммунизированных пептидами-миметиками в контексте бактериофагов, обладают нейтрализующей активностью в отношении псевдотипированных вирусов, полученных на основе различных штаммов ВИЧ-1. Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи, 4 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК для защиты диссертаций. Также результаты работы были представлены на международных и российских конференциях, по итогам которых было опубликовано 14 тезисов.

Личный вклад автора. Все основные эксперименты, включая аффинную селекцию с использованием фаговых пептидных библиотек, выделение и очистку фаговой ДНК, иммуноблотинг, иммунизацию лабораторных животных, оценку способности пептидов-имитаторов подавлять нейтрализующую активность антител УЯС01, ^С1Ь12 в реакции конкурентного ингибирования, выполнены автором лично. Оценка вируснейтрализующей активности сывороток иммунизированных животных с использованием епу-псевдотипированных частиц ВИЧ-1 проводилась совместно с Щербаковой Н.С. и Шаламовой Л.А. (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»). Компьютерный анализ, включавший построение моделей пептидов-миметиков, молекулярный докинг и определение соответствия между отобранными последовательностями пептидов и антигеном §р120 путем наложения смоделированных структур пептидов на комплекс УЯС01-§р120, был выполнен канд. биол. наук Бакулиной А.Ю., теоретический отдел ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Регрессионный анализ данных по вируснейтрализующей активности антисывороток выполнен совместно с канд. биол. наук Антонцом Д.В., теоретический отдел ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста, включая 20 рисунков и 13 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (184 наименования).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовались коммерческие фаговые библиотеки Ph.D.-12, Ph.D.-7, Ph.D.-C7C Phage Display Peptide Library Kit производства New England Biolabs (США). В наборах Ph.D.-7 и Ph.D.-12 фаги несут случайные пептидные фрагменты длиной 7 и 12 аминокислотных остатков (а.о.) соответственно, кодируемые в одной рамке считывания с минорным белком оболочки рШ фага М13. В библиотеке Ph.D-С7С рандомизированный пептидный фрагмент фланкирован по обоим концам цистеинами, в результате чего экспонируется в виде петли. Моноклональные антитела человека VRC01, Z13el и IgGlbl2 были получены в рамках программы NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Пептиды, входящие в состав отобранных фаготопов, были синтезированы компанией GenScript (США) с чистотой >80 %, без введения N- и С-концевых модификаций. Плазмиды, необходимые для получения епу-псевдотипированных частиц ВИЧ-1, также были получены в рамках программы NIH AIDS Reagent Program.

Аффинная селекция пептидов, специфично взаимодействующих с bnAbs Z13el, VRC01 и IgGlbl2, проводилась по схеме, описанной в руководстве New England Biolabs. Секвенирование фаговых ДНК в области встраивания рандомизированных олигонуклеотидов проводилось в ЦКП «Геномика» СО РАН. На основе результатов секвенирования определялись аминокислотные последовательности пептидов, экспонированных на поверхности отобранных бактериофагов. Специфичность их связывания с bnAbs подтверждали с помощью дот-блот анализа. Для выравнивания аминокислотных последовательностей, а также поиска гомологий между а.о. пептидов и гликопротеинов ВИЧ-1 использовались программы BioEdit, Clustalw2, Pepitope и PdMap. Способность потенциальных пептидов-миметиков конкурировать с ВИЧ-1 за связывание с bnAbs определялась путем постановки реакции конкурентного ингибирования. Для построения предполагаемых моделей взаимодействия

комплексов пептид-антитело-эпитоп применялся метод молекулярного докинга. Для изучения иммуногенных свойств потенциальных пептидов-миметиков фаготопами, экспонирующими данные пептиды, иммунизировались лабораторные животные; их сыворотки проверялись в вестерн-блот анализе, а также путем постановки реакции вируснейтрализации с использованием епу-псевдотипированных частиц ВИЧ-1.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Поиск пептидов-имитаторов эпитопа ВИЧ-1, узнаваемого нейтрализующим моноклональным антителом Z13el После проведения трех раундов селекции из 12-мерной библиотеки для дальнейшего анализа было взято 40 бактериофагов, из 7-мерной - 45. Обе выборки превосходят указанное в руководстве производителем фаговых библиотек число в 1020 клонов, которое обычно считается достаточным для определения консенсусного мотива. Из отобранных фагов выделялась одноцепочечная ДНК, затем производилось ее секвенирование в районе встройки рандомизированного олигонуклеотида.

По результатам секвенирования определялись последовательности аминокислотных остатков, входящих в состав найденных пептидов. После этого проводился сравнительный анализ выбранных последовательностей для того, чтобы избежать многократного анализа повторяющихся клонов, а также исключить те из них, которые содержат мотивы, обуславливающие неспецифическую сорбцию ("Plastic binders", или "РВ-клоны"). Последовательности пептидов, не вошедших в группу РВ-клонов, были выровнены с помощью программы Clustalw2 с целью идентификации консенсусного мотива (таблица 1).

При сравнении последовательностей 12-мерных пептидов был обнаружен консенсусный мотив вида NxxDIT. Из литературных данных известно, что моноклональное антитело (МКА) Z13el узнает линейный фрагмент вида WASLWNWFDITN на поверхности внешнего мембранно-проксимального участка (MPER) гликопротеина gp41. При этом ключевую роль в связывании Z13el с пептидом играют аминокислотные остатки N671 и D674. В обнаруженном мотиве NxxDIT присутствуют оба этих остатка, также разделенных двумя аминокислотами. Исключением является пептид SSWLDYHDLTNM, в котором вместо аспарагина в консенсусном мотиве присутствует противоположная по заряду аспарагиновая

кислота. Тем не менее, данный пептид специфически взаимодействует с 713е1 в дот-блоте. По-видимому, замена заряда каким-то образом компенсируется другими остатками, входящими в его состав. Среди 7-членных пептидов какой-либо общий мотив не выявляется, несмотря на то, что представительность 7- и 12-мерной библиотек не отличалась (~109 индивидуальных фаговых клонов).

Таблица 1.

Аминокислотные последовательности пептидов, входящих в состав селектированных с

использованием МКА 731е1 бактериофагов

Библиотека РЬ.О-12* Библиотека РЬ.Р-7

Номер фага Количество Номер фага Количество

Экспонируемый пептид отобранных фагов Экспонируемый пептид отобранных фагов

9 ---ЕДОТ иь I ЫЪА— 4 2 БУББ1АР--- 1

3 —ак V содо— 2 4 НМИББЕБ--- 1

32 — БОБЬ ДОДО I БР--- 1 11 УУРТТРБ--- 1

37 -ТАИОУ |1 ь е---- 1 5 ТЫКУЬР1--- 1

20 ----БДО док I МЬБЬ- 1 24 -ЭМУРТЬИ— 1

25 ---ЕРА ДОИ. I БЬА- 2 25 -СТУРНБН— 1

28 —ТБДОУ (ДБ I ьи— 1 14 -вМЪЕБЬЫ— 1

30 -БРНАЕ дом V т---- 1 3 ---БНТЬЫЕЬ 1

39 ---ТУН УБ I ЕАЬ — 1 7 ЕДОТЫДОЬО--- 1

24 — В.ННЕ УТ I ИЕ--- 1 13 вАЮ/ЬЗО--- 1

10 — БЫТЬ ТЬ ь БТ 7 42 ТТНББАБ--- 1

23 —ЬРМЬ ЕЪ ь ОЬ 1 40 ЕУРЫЬНА--- 1

36 — 1РРЬ НЕ ь ИУ 1 38 НТАБУУ1--- 1

2 —ББДОЬОУН ь ЫМ 1 8 АНБАРЯБ--- 1

1 -ДОТКОС УЬ I V 4 6 АТНА1НР--- 1

7 — УСРЪ У1 I ОР 1 27 КЬРРЬИТ--- 1

6 БАЫРДОЕ МУ V 1 35 -БРРЬЮУЮ — 1

19 БНММОЬ иь ь 1 18 -ТРРТ1РС— 1

43 —ННЫЬ УН ь РЬ 1 1 ЪКААТНУ--- 1

35 — ЭРГИ. ЫУ I ЕЬ 1 39 ТБ0У1БУ--- 1

40 ----Ш ТБ I 01ЬК 1 21 ОРРИИРУ--- 1

42 —ИШК ЬУ I тк 1 26 1НТРОС1Я--- 2

4 ОУШЕБЬ УЫ I 1 16 —ЭЕБСНМН- 1

8 ----БЪ НН I ББКУ 1 41 -УБЬКСНЫ— 1

*В списке пептидов не указаны последовательности из 12-мерной библиотеки, в которых

консенсусньш мотив не наблюдается

Специфичность связывания полученных бактериофагов с ЬпАЬ 213е1 подтверждали с помощью дот-блот анализа. В эксперименте анализировались только те клоны, в состав которых входят различные по аминокислотному составу пептиды. Результаты взаимодействия фаговых клонов, отобранных из 12-мерной библиотеки, приведены на рис. 1. Аналогичная проверка фагов, отобранных из библиотеки РЬ.О-7,

показала, что среди них отсутствуют клоны, способные специфично связываться с антителом ZlЗel. Очевидно, отобранные после трех раундов селекции фаги являются результатом либо слабоаффинного взаимодействия с Z^3el, либо неспецифического отбора на подложку, либо их комбинации. По-видимому, пептидные последовательности длиной 7 а.о. слишком коротки для того, чтобы эффективно связываться с паратопом МКА Z1 Зе I. По этой причине в дальнейших экспериментах данные клоны не использовались.

_Номер фагового клона_

Титр фагов. 1 9 7 28 2 23 3 25 24 37 19 30 20 43 К-

бое/мл

мо10 • •<>••• •

в*1«9 • • • © • *

в*1°8 о • О о

Рис. 1. Дот-блот-гибридизация исследуемых фаговых клонов с антителами 21 Зс 1. На нитроцеллюлозную мембрану наносили последовательные десятикратные разведения фаговых частиц. В качестве отрицательного контроля (К-) был использован бактериофаг, не содержащий искусственную пептидную встройку. Титр бактериофагов указан в бое/мл. На рисунке не представлены результаты анализа клонов, для которых специфического взаимодействия с ЬпАЬ г 1 Зе 1 обнаружено не было

Дальнейший анализ результатов показал, что бактериофаги, продемонстрировавшие в дот-блоте максимальные сигналы, экспонируют пептиды, среди которых выявляется консенсусный мотив вида NW/Y/F/XDI/L/v/T (где X обозначает присутствие в цепи любого а.о., а символы, написанные через наклонную черту, указывают на присутствие в конкретной позиции одного из перечисленных остатков). Выделенный консенсус по ряду ключевых позиций имеет большое структурное сходство с эпитопом gp4\, узнаваемым 213е1. В первую очередь это N671) Об74 и Т676. В позиции 1675 обнаруживаются также Ь и V. Известно, что обе эти аминокислоты имеют сходные с I алифатические радикалы и относятся к одной и той же группе. Что касается \V672, то в аналогичной позиции среди отобранных пептидов, помимо остатка триптофана, обнаруживаются фенилаланин или тирозин, радикалы которых также являются ароматическими.

Таким образом, отобранные последовательности имеют высокую гомологию с эпитопом gp41, что говорит об успешном использовании библиотеки Р1Ш-12 для решения поставленной задачи.

Иммуногенные свойства отобранных пептидов в составе бактериофагов Бактериофагами, продемонстрировавшими максимальные сигналы в дот-блот анализе, были иммунизированы лабораторные животные. Кроликам под номерами 1 и 2 подкожно вводились суспензии образцов фага № 1, несущего на своей поверхности пептид \VTKDHNYLDITV, и №9 (экспонирует пептид Е\УШШ,ОГгаЪА). Контрольный кролик №3 был иммунизирован бактериофагом М13, не содержащим пептидной вставки.

Вируснейтрализующую активность антисывороток определяли с использованием псевдовирусов. Схема эксперимента представлена на рис. 2.

Рис. 2. Тест вируснейтрализации. Рисунок взят из работы Осаки и др. (Ozaki et. al., 2012). Env-псевдотипированные вирусные частицы получали путем котрансфекции "скелетной" (backbone) плазмиды, содержащей полный геном ВИЧ-1 за исключением гена env, и векторов, несущих кассету env/rev ВИЧ-1 различных субтипов. Для инфицирования использовалась клеточная линия Tzm-bl, содержащая рецептор CD4 и корецепторы CCR5 и CXCR4, а также репортерный ген люциферазы, который активируется при попадании белков ВИЧ-1 в цитоплазму. Экспрессия активированного гена люциферазы в инфицированных клетках детектировалась с помощью люминометра

Использовалась панель псевдовирусных частиц, полученных на основе штаммов ВИЧ-1 субтипов А, В и AG. Реакцию вируснейтрализации проводили с последовательными разведениями иммунных сывороток (в диапазоне от 1:40 до 1:625000), забор которых производился через неделю после третьей иммунизации. Уровень люминесцентного сигнала выражался в RLU (относительные единицы люминесценции). Для каждого штамма псевдовирусов проводилось три параллельных ряда измерений; из значений люминесценции вычитался фоновый сигнал, регистрируемый в отсутствие псевдовирусов. Полученные данные

антисыворотки

логарифмировались, далее вычислялось среднее арифметическое значение. Распределения полученных значений люминесценции представлены на рис. 3.

Кролик 1

Кролик 2

. о о о о о о о ^ о о о о о о

СМ о о о о о

о о о о о о о

а О О О О О

СМ О О О О О

т- Л Ш 1Л Ю

СМ СМ СМ

Кратность разведения сыворотки Кратность разведения сыворотки

Кролик 3 Отрицательный контроль

Кролик 4 Отрицательный контроль

к 4.0 -О

б/с §

Кратность разведения сыворотки Кратность разведения сыворотки

Рис. 3. Распределение значений люминесценции, полученных при постановке вируснейтрализации с использованием различных концентраций сывороток экспериментальных животных. Кролики №3 и №4- отрицательный контроль, были иммунизированы бактериофагом М13, не содержащим рандомизированной встройки; б/с - отсутствие сыворотки, т.е. сигнал, производимый смесью псевдовирусы+клетки

Как можно заметить, в случае опытных образцов видна четкая обратная зависимость уровня сигнала от концентрации добавляемой антисыворотки. При этом разница между фоновым сигналом (б/с) и сигналом сыворотки при разведении 1:40 намного превышает аналогичную величину для контрольных сывороток.

Для обработки данных использовался многофакторный регрессионный анализ, производившийся с использованием программы Я. Было создано несколько моделей, включающих в разных комбинациях такие факторы как штамм вируса, субтип, титр сыворотки, индивидуальные особенности животного и антиген. Затем с помощью информационного критерия Акаике был произведен отбор факторов и выбрана наилучшая модель. По результатам анализа было установлено, что, несмотря на значительное влияние индивидуальных особенностей животных на эффективность

нейтрализации, наблюдается достоверное дозозависимое снижение инфекционности под действием антисывороток по сравнению с контрольной.

Помимо кроликов, бактериофагами № 1 и № 9 были иммунизированы также и мыши. Иммунизировали две группы животных (самцов мышей линии ВАЬВ/с); после третьей иммунизации проводили анализ антисывороток с помощью вестерн-блота. Было показано, что в сыворотках мышей, иммунизированных бактериофагами № 1 и № 9, определяются антитела, специфично взаимодействующие с белком §р41 ВИЧ-1 (рис. 4, дорожки 2 и 3). Таким образом, при селекции 12-мерной библиотеки был обнаружен ряд клонов, содержащих общий консенсусный мотив, который имеет очевидное сходство с аминокислотными последовательностями, обнаруженными в работах других авторов, хотя и не в точности копирует их. Анализ антигенных и иммуногенных свойств полученных фаговых клонов подтверждает, что входящие в их состав пептиды способны имитировать антигенную детерминанту, узнаваемую ЬпАЬгПе!

3 3 л 3 S р68/66 » г " » 3 6 а = *- SP120 gpll0/120

р52/51 р40 ► рйШ» р24/25 ► р18Л7 » 1 - ■ - gp41

— mm -

1 2 3 4

Рис. 4. Специфическая активность сывороток иммунизированных животных с помощью тест-системы NewLav Blot 1.1- сыворотка мышей, иммунизированных бактериофагом без встройки (отрицательный контроль); 2 - бактериофагом № 9 (пептид-имитатор EWTNWLDITNLA); 3 -бактериофагом № 1 (пептид-имитатор WTKDHNYLDITV); 4 - положительный контроль - сыворотка ВИЧ-положительного пациента

Результаты аффинной селекции и анализ фаговых клонов, селектированных с использованием моноклональных антител аЫ2

^01Ь12 является одним из первых открытых нейтрализующих антител широкого спектра действия. Узнаваемый им эпитоп перекрывается с последовательностью СЭ4Ьб §р120 ВИЧ-1 и сформирован дискретным набором а.о. Поэтому при проведении аффинной селекции с использованием данных антител дополнительно использовалась "кольцевая" библиотека РЬ.О-С7С. Производитель рекомендует использовать этот набор, если в качестве молекулы-мишени используется антитело, узнающее конформационный эпитоп (например, располагающийся в контексте поверхностных петель).

После проведения трех раундов селекции для дальнейшего анализа из каждой обогащенной библиотеки произвольно было взято по 60 фаговых клонов. Среди пептидов, экспонируемых на поверхности исследуемых бактериофагов, не было обнаружено сколько-нибудь протяженных мотивов. Кроме того, существенная часть пептидов имела гомологию с РВ-клонами, которые являются результатом неспецифического отбора на пластик иммунологических планшетов.

Для проверки специфичности связывания отобранных бактериофагов с ЬпАЬ ^С1Ь12 использовался дот-блот анализ. В зависимости от интенсивности окраски спотов на нитроцеллюлозной мембране им присваивалось соответствующее обозначение: символ ++++ обозначает самые яркие пятна; +- соответствует спотам с наименьшей интенсивностью окраски; прочерк обозначает отсутствие сигнала.

Наиболее сильный сигнал продемонстрировали фаги № 2 и № 33, экспонирующие 7-мерные кольцевые пептиды. Положительные клоны (№№ 1, 8, 9, 11, 19, 21, 39) из 12-мерной библиотеки дали значительно менее интенсивные сигналы (см. таблицу 2). Во всех остальных случаях фаговые частицы с ^С1Ы2 не взаимодействовали.

Пептиды, обнаруженные в результате скрининга фаговых библиотек Р1Ш-12 и Р1Ш-С7С, были синтезированы и проверены в тесте вируснейтрализации на способность связываться с ЬпАЬ 1§01Ы2 и ингибировать его вируснейтрализующую активность. Список синтезированных пептидов представлен в таблице 3. Эксперимент выполнялся по схеме, приведенной на рис. 5.

Таблица 2.

Интенсивность сигналов в дот-блоте при анализе бактериофагов, отобранных с использованием МКА ^С1Ы2

Фаговая библиотека Номер пептида (клона) Интенсивность окраски слотов при различных титрах бактериофагов Аминокислотная последовательность пептида

5*10'" 5*10® 1*10'

Ph.D-C7C 2 ++++ +++- + PFRLLDD

5 ++ +- - LLADTVS

33 +++ ++ - WFPSLRD

к- - - - -

Ph.D-12 1 + + - SSYYLTHPTFAI

8 ++ + - SHWWTRWNALAL

9 ++ + - WHYPRLHSWFTQ

11 + +- - FHRSHWYQTWVP

19 ++ + - WHFTWWVDNRMT

21 ++ + - FHTRFLSLYALQ

39 ++ + - HPWYIHHWQSRL

К- - - - -

Ph.D-7 1 - - - FWYNWPR

2 - - - FHWTWYW

5 - - - PWYHWPN

21 - - - PWYAWPR

35 - - - GWYWWSW

IC- - - - -

Рис. 5. Схема постановки эксперимента по оценке способности отобранных пептидов связываться с МКА и ингибировать его вируснейтрализующую активность. Эффективность нейтрализации связана обратной зависимостью с уровнем люминесценции в ячейках планшета, в которые вносятся клетки TZM-bl, инфицируемые ВИЧ-1. Предварительно вирусные частицы получают путем трансфекции клеток 293Т плазмидным вектором, кодирующим геном вируса. Синтез люциферазы в клетках TZM-bl запускается при попадании в цитоплазму белка TAT ВИЧ-1. При полной нейтрализации антителами уровень люминесценции снижается до фонового уровня. При добавлении пептида-миметика происходит блокировка антител, вследствие чего увеличивается количество вирусных частиц, способных к заражению. Соответственно, возрастает люминесцентный сигнал

Таблица 3.

Список синтезированных пептидов

Библиотека № пептида Структура пептида

А1 0иЧНРЮ1Т50К.У

А2 рш^нмусутур

АЗ у/нуряшв^/ртд

А4 FHKTWWTAALSR

А5 ОУЕАУРАР1ЖЫ

А6

Ph.D-12 А7 \VHYTDFTRWNRQ

А8 НР\¥У1НН\¥(^1

А9 НО^ШУтНР

А10 FHWNKSWYMMPT

Ы2-7

Ы2-8 WHYPRLHSWFTQ

Ы 2-9 FHRSHWYQTWVP

Ы2-10 FHKTWWTAALSR

Ы2-1 CPFRLLDDC

Ы2-2 СЬЬАЭТУЗС

Ph.D-C7C Ы2-3 СУУРРБГ^БС

Ы2-4 CDFRSLDRC

Ы2-5 СЬЬАОТУБС

Ы2-6 CWFPSLRDC

В тех случаях, когда пептиды хорошо растворялись в водных системах, рабочие концентрации составляли 1 мг/мл. Для растворения гидрофобных пептидов использовались органические растворители. В этих случаях рабочие растворы приходилось разбавлять водой для достижения физиологически допустимых значений органических добавок (-1%), в результате чего концентрации пептидов существенно понижались.

В ходе опыта было обнаружено, что пептид А7 (фаговый клон № 48) продемонстрировал статистически значимое ингибирующее влияние на нейтрализующую активность антител (рис. 6).

М2

- инфекционность без добавления пептида

# S

а а а п л л л

г г

< < < < <

S S значимо отличающиеся от фонового сигнала (1 test; Р<0,05)

Рис. 6. Ингибирование нейтрализующей активности ЬпАЬ 1§01Ы2 в реакции вируснейтрализации с использованием синтезированных пептидов. За 100% принято показание люминесценции, производимое вирусом без добавления антител и пептидов. Красной пунктирной линией обозначен уровень сигнала, производимый вирусом с добавлением антител без пептидов (отрицательный 5" контроль). Символом * обозначены

значения люминесценции, статистически

Илшуногенные свойства отобранных пептидов в составе бактериофагов

Исходя из приведенных выше рассуждений, для проверки иммуногенных свойств потенциальных фаготопов были выбраны клоны, продемонстрировавшие наилучшие результаты хотя бы в одном из выше описанных тестов. Таким образом, для последующей иммунизации мышей использовались клоны №№ 48 (из библиотеки РЬ.О-12), 2, 5 и 33 (РЬ.Б-С7С), несущие, соответственно, пептиды А7, Ы2-1, Ы2-2 и Ы2-3. Контрольной группе вводилась суспензия бактериофага М13, не содержащего рандомизированной пептидной вставки.

Антисыворотки проверяли в тесте вируснейтрализации с использованием псевдовирусов, полученных на основе штаммов <ЗН0692.42 и Р\Ю.4 ВИЧ-1. Штамм С>Н0692.42 относится к группе среднеустойчивых к нейтрализующему действию ЬпАЬ 1§01Ы2, в то время как РУО.4 обладает повышенной устойчивостью к действию этих антител. Результаты представлены в таблице 4 в виде значений 1С50, рассчитанных путем обработки данных интенсивности люминесценции методом пробит-регрессии.

Эксперименты показали, что одна из антисывороток, полученная после иммунизации мышей бактериофагом № 2, вызывает заметное снижение люминесцентного сигнала в тесте вируснейтрализации по сравнению с сывороткой контрольных животных, иммунизированных контрольным фагом (таблица 4). В таблицу 5 не включены результаты анализа антисывороток, полученных после иммунизации животных фагами № 48, 5 и 33, поскольку для них не было получено заметного превышения сигнала.

Таблица 4.

Чувствительность Епу клонов к нейтрализации сыворотками мышей, иммунизированных отобранными фаговыми клонами

Клон Епу 1С50 в клетках Т/М-Ы, мкг/мл общих ^О!1

Фаг № 2 Фаг М13 (отрицательный контроль) МКА дошг3

(ЗН0692.42 228 (83; 380)2 894 (472; 2380) 1,0

РУО.4 448 (259; 997) 2627(1366; 6796) >50

1 - значение 1С50 выражено в концентрации антител (мкг/мл), при которой происходит снижение люминесцентного сигнала на 50%. 2 - цифры в скобках обозначают соответствующий доверительный интервал при р=0,05. 3 -значения взяты из литературных данных (\Уи. е! а1., 2009)

Таким образом, несмотря на то, что последовательность пептида в фаге № 2 не содержала выявленного другими авторами консенсуса, результаты вируснейтрапизации указывают на то, что содержащийся в нем пептид является миметиком эпитопа, узнаваемого ЬпАЬ ^С1Ы2. Полученные в результате иммунизации антисыворотки содержали антитела, способные подавлять инфекционность не только среднеустойчивого штамма (}Н0692.42 ВИЧ-1, но и высокоустойчивого РУО.4.

Результаты аффинной селекции и анализ фаговых клонов, селектированных с использованием моноклональных антител УЯС01 Эпитоп, узнаваемый УИС01, перекрывается с областью СЭ4Ьэ §р120 ВИЧ-1 и также является конформационным. Поэтому аффинная селекция с использованием данных антител проводилась со всеми тремя библиотеками, включая кольцевую. После проведения биопэннинга из 12-мерной библиотеки было взято 130 фаговых клонов и по 60 фагов из 7-мерных библиотек, ДНК отобранных клонов была секвенирована. По результатам анализа было проведено выравнивание аминокислотных последовательностей (таблица 5).

Было показано, что среди пептидов, отобранных из разных библиотек, гомологичных последовательностей нет. Среди фагов внутри библиотек Р1Ш-12 и Р1Ш-С7С удалось обнаружить мотивы длиной 5 и 3 а.о. соответственно. При этом большинство фаговых клонов, отобранных из библиотеки РЬ.О-12, экспонировали пептиды, имеющие вид иОххЛ1хх\Уххх, где X - любой аминокислотный остаток, и - гидрофобный неароматический (Ь, I либо V), О-в либо Т, Л - отрицательно заряженный ^ либо Е). "Кольцевые" 7-мерные пептиды имеют более разнородный состав, обший мотив выглядит следующим образом: х\УхЕ/1ууХхР/у.

Специфичность связывания выделенных бактериофагов с МКА подтверждалась с помощью дот-блот анализа. Для дальнейших экспериментов были выбраны те из них, которые продемонстрировали специфические сигналы.

Таблица 5.

Последовательности пептидов, входящие в состав отобранных фаговых клонов из библиотек РЬ.О-12 и РЬ.О-С7С в эксперименте с использованием МКА УЯС01*

Библиотека рь.о-12 Библиотека рь.о-С7С

Номер групп Экспонируемый пептид Количество отобранных Номер групп фагов Экспонируемый пептид Количество отобранных

фагов фагов фагов

1 1|§10Е1ТА1ЯРЕБ— 1 1 N Е И 5

2 — СОРЯТТИЬЕБЫТ 2 2 N Е И 5

3 1Т АРЕЬУАСгГСБ— 1 3 Е В Я 1

4 1Т ЬРЕЬНАИКЕЫ— 1 4 Е Т ЕС 1

5 УБДОРЕЬУКИТИБ— 16 5 Т Г ИС 1

б 1Т ЫАЕЬТШШС— 2 6 0 Т уы 1

7 ¡8 тбе1уы!/пшт— 3 7 Б Т Ьй 5

8 УТ ЬСЕЬУБИРАЕ— 1 8 Р у мс 1

9 МОЬАЕЬБШРНА— 1 9 Б N мв 5

10 ЫОЕЬЬТИТАУ— 1 10 б N мс 5

11 ЮСЕМНТЮТУО— 20 11 р v НС 4

12 МЕЕЬТЕЩБУУ— 1 12 о Ь НС 1

13 ЬБЕБЬЕИКЭР— 1 13 р М БС 1

14 ЯЕЕЬЬЕШАЗР— 1 14 ь м Е 1

15 РБЕБЬЕИОЭР— 1 15 Е Б иб 6

16 НТЕЪЬНЮШМ— 1 16 n Б ьб 1

17 ЪБХАОЬУЕШЫТБ— 1 17 т т ьб 4

18 ОАОУДОАИОТЭ— 1 18 б б ьо 1

19 -т ТЕ01Ь0УДОТБ1Я- 4 19 Ь б тс 1

20 -яошеуирмпны- 1 20 т б БС 1

21 б б кю 3

22 I Е ьс 2

23 тнзкабб 1

*Примечание: В таблице не представлены данные селекции из 7-мерной линейной библиотеки, поскольку среди выявленных пептидных последовательностей значимого консенсуса обнаружено не было. Цветом выделены гомологичные аминокислотные остатки

Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей пептидов,

взаимодействующих с ЬпАЪ \ RC0l

Чтобы выявить а.о., за счет которых отобранные пептиды способны

взаимодействовать с УЯСОЦ использовался метод компьютерного моделирования.

Был проведен независимый анализ выборки 12- и 7-мерных (кольцевых) пептидов,

входящих в состав фагов, показавших наиболее интенсивные сигналы в дот-блоте. Их

последовательности сопоставили с фрагментом гликопротеина §р120 ВИЧ-1 в районе

контакта с УЯС01. Для этого использовалась программа рс1Мар. Функционально она

сходна с приложением Реркоре, применяемым при картировании конформационных

эпитопов методом фагового дисплея. Однако в отличие от последней, рс!Мар

позволяет производить поиск гомологий в заданном участке белковой молекулы, а не

на всей ее поверхности, что потенциально может обеспечить более точные

18

результаты. Данные о структуре комплекса УЯСО1 -§р 120 были взяты из литературных источников. В результате с помощью р<1Мар удалось найти соответствие консенсусной последовательности 12-мерных линейных пептидов участку §р120 в районе С04-связывающей петли. Поиск соответствующего района §р120 был изначально ограничен остатками, входящими в состав эпитопа У11С01. На рис. 7 показано выравнивание фрагмента §р120 с пептидами из клонов, взаимодействие которых с УЯС01 было подтверждено методом иммуноблотинга. Как уже отмечалось, консенсусный мотив среди 12-мерных пептидов имеет вид иОххЛ1хх\Уххх.

В то же время в литературе отмечено, что в число пяти ключевых остатков, вносящих наибольший вклад в связывание §р120 с У11С01, входят О и I371. В найденной консенсусной последовательности этим остаткам соответствуют J (О/Е) и и (Ь/1/У), имеющие схожие физико-химические параметры и аналогичным образом расположенные друг относительно друга.

е1 -VSVIPE -|yk|tws-

е2 --ITAPE- -fy.^ifgs-

ез —-LTWGE- -mht|tvq-

е4 --ЬТМЕЕ -JtpJsvy-

е5 --ITLPE- -fhafken-

е6 --ITIvE -|ta^pes- c4 CEis|w3|C---

е8 ---ITHAE- -JtmJnng- c23 ct|t|ls|c—

е7 ---LTNQE- ci CStr|l«C—

е9 —mdla|- -|sn|pha- 09 W: L:-'§F ' —

ею -----TTFD- -|ldywtsn c19 ct!s|s|fc—

е11 - -LSIAD- "Jyr|nts- c2 cii?e|wk|c—

е13 ■ ---ITT3E- -|yn§rdt- c3 cm|e|wk|c—

е17 ltpiе~ -1le«!dsp- cll cq|t|yn|c—

е18 --LSWEE- -IlhJasp- c12 cewf|we|c---

е19 ■ ---LTHTE- -SlhImgm- CI 5 cm|e|wk|c—

cons оо . j -fxxixxx- cons -x|xxxx|----

др!20 —p|gg|le|tmh---- gpl20-PSGGDLEITMH

Рис. 7. Выравнивание пептидов из клонов, имеющих наибольшее сродство к МКА VRC01 и фрагмента 365-371 gpl20 ВИЧ-1 (его аминокислотная последовательность расположена внизу рисунка). Цветом выделены а.о., соответствующие консенсусной последовательности.

Консенсусный мотив обозначен словом «cons»

Для пептидов, отобранных из кольцевой и линейной 7-мерных библиотек использованием тех же методов поиска, сходства с фрагментом §р120 в области С04Ьб на уровне аминокислотных последовательностей найдено не было.

Оценка способности отобранных фаготопов конкурировать с МКА УИС01 за связывание с узнаваемым им эпитопом Пептиды, полученные в результате скрининга фаговых библиотек РЬ.О-12 и РЬ.О-С7С, были синтезированы и проверены в тесте вируснейтрализации на

19

способность конкурировать с ВИЧ-1 за связывание с МКА УЯС01. Использовали два разведения пептидов с концентрациями 1 мг/мл и 0,2 мг/мл; при этом количественное соотношение антитело/пептид составляло 1:5000 и 1:1000, соответственно. В ходе опыта было обнаружено, что 9 из 44 пептидов продемонстрировали статистически значимое ингибирующее влияние на нейтрализующую активность антител (таблица 7).

Таблица 7.

Пептиды, показавшие наиболее высокую способность ингибировать нейтрализующую активность ЬпАЬ УЯС01

Ph.D-12 Ph.D-C7C

Номер пептида пептид № соотв. фагового клона Номер пептида пептид № соотв. фагового клона

El VSWPELYKWTWS 5 С1 CSWTLLGYC 7

Е2 ITAPELYAWFGS 3 С5 CTFTYWGFC 5

ЕЮ TTFDILDYWTSN 19 С9, С17 CSWNLMGFC 10

Ell LSIADLYRWNTS 17 С13 CSWSLNGFC 21

Обращает на себя внимание тот факт, что не все из этих пептидов продемонстрировали зависимость доза-эффект (см. рис. 8). В частности, для пептидов El, ЕЮ и Ell уровень инфекционности ВИЧ-1 возрастал при уменьшении их концентрации. Возможно, при высоких концентрациях указанных пептидов сказывался ингибирующий эффект органических добавок, используемых для их растворения.

£ 1М

| Концентрация пептида 1 мг/мл d Концентрация пептида 0,2 мг/мл

■---инфекционность без добавления пептида

VRC01

iUiijuliA

Iii.

..i l'.l'

з s и 2 s з is

г г s

Рис 8. Ингибирование нейтрализующей активности МКА VRC01 в реакции вируснейтрализации с использованием синтезированных пептидов. За 100% принято показание люминесценции, производимое вирусом без добавления антител и пептидов. Красной пунктирной линией обозначен уровень сигнала, производимый вирусом с добавлением антител без пептидов (отрицательный контроль). Символом * обозначены значения люминесценции, статистически значимо отличающиеся от отрицательного контроля (t test; Р<0,05)

Кроме того, была проверена способность пептидов Е1 и С1 (как наиболее перспективных) конкурировать с ВИЧ-1 за связывание с IgGlbl2 для того чтобы убедиться, что данные пептиды специфически подавляют нейтрализующую активность антитела VRC01. С обоими антителами было проведено 6 независимых экспериментов по заражению клеток смесью вирус-антитело-пептид. Как видно на рис. 9, использование VRC01 приводило к восстановлению инфекционности вируса, с Ы2 уровень инфекционности незначительно отличался от значения отрицательного контроля. Этот результат свидетельствует о том, что пептиды Е1 и С1 специфично связываются с bnAb VRC01, блокируя его нейтрализующую активность.

Следует отметить, что не всегда пептиды, демонстрировавшие сигнал в дот-блоте (находясь в составе бактериофагов), обладали также способностью конкурировать с нативным белком ВИЧ за связывание с антителами. Вероятно, это связано с аминокислотным окружением, в контексте которого находится пептид в составе бактериофага. Также данный эффект может быть связан с тем, что не все свободные пептиды обладали достаточной растворимостью.

Рис. 9. Реакция конкурентного ингиби-рования нейтрализующей активности антител VRC01 и IgG 1Ы 2 пептидами Е1 и С1. За 100% принято показание люминесценции, производимое вирусом без добавления антител и пептидов. Для оценки фонового сигнала люциферазная активность вируса была измерена при добавлении в реакцию антител VRC01 (IC90 = 6,26 мкг / мл) и [gGlbl2 (IC90 = 12,5 мкг/мл), но в отсутствие пептидов. Символом * обозначены значения, статистически значимо отличающиеся от отрицательного контроля (t test; Р<0,05)

Модель взаимодействия комплекса VRC01-gpl20 и пептидов, входящих в состав селектированных бактериофагов Для проверки соответствия структуры отобранных пептидов фрагменту gpl20 в области эпитопа, узнаваемого антителом VCR01, были построены компьютерные модели с использованием метода молекулярного докинга. В этих моделях проверялась возможность перекрывания фрагментов пептидов, продемонстрировавших в конкурентном ингибировании наилучшие результаты, с

21

комплексом УЯС01^р120. Оказалось, что фрагменты пептидов Е1 (8\УРЕЬ), Е2 (ТАРЕЬ), ЕЮ (ТТРЭ1) и Е11 (81АОЬ) способны имитировать район 365-371 §р120 без каких-либо стерических препятствий (рис. 10). Аналогичную модель для пептидов из библиотеки РЬ.О-С7С построить не удалось, поскольку не было найдено гомологии между пептидами из данной библиотеки и эпитопом, узнаваемым ЬпАЬ У11С01. Вероятно, взаимодействие кольцевых пептидов с УЯС01 происходит иным образом. Полученные практические результаты указывают на то, что найденные пептиды по крайней мере частично имитируют фрагмент С04-связывающий петли.

Рис. 10. Модели перекрывания между фрагментами пептидов, продемонстрировавших способность ингибировать нейтрализующую активность bnAb VRC01, и комплексом VRC01-gpl20. Антитело изображено в виде поверхности (серый цвет), кристаллическая структура гликопротеина gpl20 выделена синим цветом, аминокислотные остатки, входящие в его состав и образующие мотив SGGLEI, обозначены красным, фрагменты пептидов El (SWPEL), Е2 (TAPEL), ЕЮ (TTFDI) и Ell (SIADL) изображены в виде цветных толстых линий (А, В, С и D соответственно)

Проверка нейтрализующей активности сывороток животных, иммунизированных препаратами бактериофагов Бактериофаги, экспонирующие пептиды, которые продемонстрировали лучшие результаты в реакции конкурентного ингибирования, были использованы для иммунизации кроликов. Животные под номерами 5 и 6 были иммунизированы смесью фаговых клонов, в состав которых входили пептиды Е1 (УЗМТЕЬУКЧП^З), Е2 (ГГАРЕЬУАШ^), С1 (С8\УТ1ХСУС) и С9 (С5\УЫЬМСРС). Кролика №7 иммунизировали только фагом, экспонирующим пептид С1, а кролика № 8 -фаготопом, содержащим пептид Е1. Забор сывороток производился через неделю после третьей иммунизации

Нейтрализующую активность сывороток также проверяли в тесте нейтрализации псевдовирусов. Схема постановки вируснейтрапизации аналогична описанной ранее (см. рис. 2). В качестве отрицательного контроля использовались сыворотки кроликов, иммунизированных фагом М13 без пептидной вставки.

Полученные данные также обрабатывались с помощью многофакторного регрессионного анализа. Исходные модели, как и в предыдущем случае, включали такие факторы как штамм вируса, субтип, титр сыворотки, индивидуальные особенности животного и антиген. С помощью информационного критерия Акаике был произведен отбор факторов и выбрана наилучшая модель. Затем, используя функцию сак.геИтр из пакета ге/атро для /?, была определена относительная важность каждого из факторов, учтенных в модели. В результате выяснилось, что в данном случае индивидуальные особенности животных оказывают еще большее влияние на нейтрализующую активность сывороток (рис 11).

Субтип

Индивидуальные Ьс^ю(титр сыворотки)

особенности животного

Рис. 11. Относительная значимость факторов в модели, построенной на основе данных анализа сывороток от кроликов, иммунизированных фаготопами, отобранными с использованием ЬпАЬ УЯС01). На рисунке представлены только независимые факторы

Тем не менее, было также зафиксировано достоверное дозозависимое снижение

инфекционное™ псевдовирусных частиц при использовании опытных сывороток по

23

сравнению с контрольными. Таким образом, в результате проведения экспериментов по скринингу пептидных 12-мерной и 7-мерной циклической фаговых библиотек против антител УЯС01 был найден ряд фаготопов, которые проявляют антигенную активность, по свойствам имитирующую нативный эпитоп исследуемого антитела.

Выводы

1. С помощью аффинной селекции из фаговых библиотек отобраны клоны фагов, которые содержат пептиды, специфично взаимодействующие с моноклональными антителами 213е1, 1§С1Ы2 и УЯС01, обладающими широким спектром вируснейтрализующей активности в отношении ВИЧ-1.

2. Определены структуры рандомизированных пептидов, экспонированных в составе поверхностных белков отобранных фагов. Идентифицированы консенсусные мотивы в аминокислотных последовательностях пептидов, связывающихся с антителами УЯС01 и 713е1.

3. С помощью иммуноблотинга подтверждена специфичность взаимодействия пептидов, выявленных в составе отобранных фагов, с антителами 213е1, ^С1Ь12 и УЯС01.

4. Выявлены пептиды, способные конкурировать с ВИЧ-1 (N1,4-3) за связывание с антителами и УЯС01 в реакции вируснейтрализации.

5. Анализ, проведенный при помощи программного обеспечения рс1Мар с использованием трехмерной модели комплекса §р120-УЯС01-пептид, показал, что отобранные пептиды-имитаторы по крайней мере частично имитируют фрагмент С04-связывающий петли.

6. Антисыворотки к фагам, содержащим идентифицированные пептиды-миметики эпитопов, узнаваемых антителами Z\3el, ^С1Ь12 и УЯС01, проявляют нейтрализующую активность в отношении псевдовирусов, полученных на основе ВИЧ-1 субтипов А, В и АО.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах из списка ВАК, рекомендованных для защиты диссертаций:

1. Чикаев А.Н., Щербакова Н.С., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Лебедев Л.Р., Ерошкин A.M., Рыжиков А.Б., Ильичев А.А. Разработка искусственных полиэпитопных В-клеточных иммуногенов в качестве вакцин против ВИЧ-1 // Бюллетень ВосточноСибирского научного центра СО РАМН. — 2011. -№ 3, ч.1. — С. 229-232.

2. Щербакова Н.С., Чикаев А.Н., Карпенко Л.И., Ильичев А.А. Влияние биотинипи-рования антител 2F5 на отбор пептидов из комбинаторной фаговой библиотеки // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2012. - № 1. - С. 20-25.

3. Чикаев А.Н., Пирожкова Д.С., Бакулина А.Ю., Федина Н.В., Карпенко Л.И., Ильичев А.А. Поиск пептидов-имитаторов эпитопов ВИЧ-1, узнаваемых вирус-нейтрализующими антителами VRC01 // Вестник НГУ Серия: Биология, клиническая медицина. -2013. -№ 2. - С. 13-19.

4. Chikaev A.N., BakulinaA.Yu., Burdick R.C., Karpenko L.I., Pathak V.K., Ilyichev A.A. Selection of peptide mimics of HIV-1 epitope recognized by neutralizing antibody VRC01 // PLOS ONE - 2015. - V. 10 -N 3. doi: 10.1371/journal.pone.0120847.

Тезисы на всероссийских и международных конференциях:

1. Chikaev A., Scherbakova N., Tumanova О., Karpenko L., Ilyichev A. Recombinant proteins carrying peptide mimics of HIV-1 // Retrovirology. 2009; 6 (Suppl 3): - P. 333. Published online 2009 October 22. doi: 10.1186/1742-4690-6-S3-P333.

2. Ильичев A.A., Карпенко Л.И., Козлова H.C., Ильичева Т.Н., Антонец Д.В., Чикаев А.Н., Бажан С.И. Современные технологии конструирования вакцины против ВИЧ-1, разрабатываемые во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» // Сборник докладов и материалов «Рабочее совещание по рассмотрению хода выполнения распоряжения правительства Российской Федерации № 1905-р.». - Новосибирск: ЦЭРИС, 2009. -С. 88-92.

3. Чикаев А.Н., Козлова Н.С., Ильичев А.А. Рекомбинантные белки, несущие имитаторы эпитопов ВИЧ-1 // XLVII Международная научная студенческая

конференция "Студент и научно-технический прогресс", 11-15 апреля 2009 г. Новосибирск, Россия.-С. 151.

4. Щербакова Н.С., Чикаев А.Н., Туманова О.Ю., Карпенко Л.И., Ильичев А.А. Функциональные имитаторы антигенных детерминант ВИЧ-1 для конструирования В-клеточных иммуногенов // III Конференция по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, 28-30 октября 2009, Москва, Россия. — С. 131.

5. Chikaev A.N., Shcherbakova N.S., Tumanova O.Y., Ilyichev А.А. Mimics of B-cell epitopes recognized by broadly neutralizing mAb 2gl2 for designing HIV-1 vaccine // AIDS Vaccine 2010 (Atlanta, Georgia) abstract book. - 2010. - P. 257.

6. Ilyichev A., Shcherbakova N., Chikaev A., Karpenko L. Mimics of B-cell epitopes for designing of HIV-1 vaccine candidates // BIT Life sciences 2nd Annual World Vaccine 2010 (Beijing), Abstract book. - P.203.

7. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Лебедев Л.Р., Каплина О.Н., Щербакова Н.С., Даниленко Е.Д., Даниленко А.В., Чикаев А.Н., Богрянцева М.П., Масычева В.И., Нечаева Е.А., Ильичев А.А. Разработка кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД в ГНЦ ВБ «Вектор» // (17-19 ноября 2010 г., Новосибирск): Сборник трудов. -Новосибирск: ЦЭРИС, 2010. - С. 95-103.

8. Щербакова Н.С., Карпенко Л.И., Чикаев А.Н., Бажан С.И., Лебедев Л.Р., Ерошкин A.M., Рыжиков А.Б., Ильичев А.А. Полиэпитопный подход для разработки искусственных В-клеточных иммуногенов в качестве ВИЧ-1 вакцин // (17-19 ноября 2010 г., Новосибирск): Сборник трудов. - Новосибирск: ЦЭРИС, 2010. - С. 169-172.

9. Чикаев А.Н., Щербакова Н.С. Имитаторы конформационного эпитопаВИЧ-1, узнаваемого МКА 2gl2 // Под ред. В.А. Козлова, С.В. Смирновой, В.Т. Манчука -Абакан: Издательство ГОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова», 2011.-С. 177-178.

10. Чикаев А.Н., Щербакова Н.С., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Лебедев Л.Р., Ерошкин A.M., Рыжиков А.Б., Ильичев А.А. Разработка искусственных полиэпитопных В-клеточных иммуногенов в качестве вакцин против ВИЧ-1 // II Межрегиональная научно-практическая конференция молодых ученых «Человек: здоровье и экология», г. Иркутск 15-16 сентября 2011 г. - С. 9.

11. Федина Н.В., Чикаев А.Н. Поиск пептидов-имитаторов, узнаваемых широко нейтрализующими ВИЧ-1 антителами Ь12 // Теоретические и прикладные проблемы науки и образования в 21 веке. Сборник научных трудов по материалам Международной заочной научно-практической конференции 31 января 2012 г. Тамбов, 2012.-С. 149-150.

12. Чикаев А.Н., Федина Н.В., Карпенко Л.И., Ильичев A.A. Получение имитаторов эпитопов, узнаваемых вирус-нейтрализующими моноклональными антителами Ь12, Z13el и VRC-01, для создания вакцины против ВИЧ-1 // Гигиенические аспекты в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения (Сборник статей, посвященных 90-летию государственной санитарно-эпидемиологической службы РФ). - Новосибирск, 2012. - С. 393-400.

13. Ильичев A.A., Чикаев А.Н., Щербаков Д.Н., Федина Н.В., Бакулина А.Ю., Карпенко Л.И. Использование фаговых пептидных библиотек для изучения эпитопов, узнаваемых нейтрализующими ВИЧ-1 антителами широкого спектра действия Z13el, VRC03 и VRC01 // В сборнике: «Бактериофаги: Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». Материалы международной научно-практической конференции. Ульяновск, 23-25 апреля, 2013. - Том I. - С. 7-14.

14. А.Ю. Бакулина, А.Н. Чикаев, Н.В. Волкова. Поиск структурного соответствия между гликопротеином ВИЧ gpl20 и пептидами-имитаторами, полученными методом фагового дисплея // 1-я Международная конференция молодых ученых биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов «OpenBio», Кольцове, 7 октября 2014 г. - С. 106-108.

Подписано в печать15.04.2015 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. Заказ № 257

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

á П

/V ^