Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антитела к основной нейтрализующей детерминанте вируса иммунодефицита

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Антитела к основной нейтрализующей детерминанте вируса иммунодефицита"

госсийская академия медицинских наук

НИИ ВИРУСОЛОГИИ км. дл-ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи УДК 578.828:1575.113.1 +577.21]

РЖАНИНОВА Алла Анатольевна

антитела к основной нейтрализующей детерминанте вируса иммунодефицита человека

Специальность 03.00.06 - Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии научно-исследовательского института вчрусологии им.д.И.Ивановского РАМН.

научный руководитель

доктор биологических наук ММ. Гараев

официальные оппоненты

профессор, доктор медицинских наук В.г. НЕСГЕРЕНКО доктор биологических наук СО. вязов

ведущее учреждение

Центральный институт эпидемиологии ИЗ Рч>

Защита диссертации состоится •-■-1994 г.,

в *_" часов на заседании специализированного совета

д 001.20.01 при нии вирусологии нм.д.и.Ивановского раин по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи,16.

С диссертацией мокко ознакомиться в бибилиотеке НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Автореферат разослан "_"_I_:_1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник '. АМ. ЖУКОВСКИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Вирус иммунодефицита человека типа I (ВИЧ-1) является одним из двух , идентифицированных к настоящему времени, возбудителей синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) - тяжелого расстройства иммунной системы, сопровождающегося развитием вторичных инфекций и приводящего к летальному исходу.

Учитывая то обстоятельство, что распространение ВИЧ-инфекции в мира приняло характер пандемии, изучение закономерностей изменчивости вирусного генома и роли этого явления в молекулярных механизмах вирусного патогенеза представляется актуальным и важным для решения фундаментальных проблем и задач практической медицины.

Хорошо известно, что ВИЧ-1- в инфицированном организме индуцирует образование антител, которые обладают нейтрализующей активностью. Главный участок, против которого направлены эти антитела, расположен в гипервариабельном домене \гЗ белка др120 оболочки вируса. По даньым литературы, практически у всех ВИЧ-инфицированных пациентов обнаруживаются антитела к основной нейтрализующей детерминанте. Однако, значение анти-УЗ антител для замедления развития патологического процесса до сих пор не ясно, поскольку их наличие не приводит к элиминации вируса из организма и, в конечном итоге не припятствует развитию СПИД, хотя, несомненно, они являются одним из факторов, позволяющим пролонгировать бессимптомный период ВИЧ-инфекции.

Всвязи с этим, нам представляется крайне важным изучение вариантов структур области УЗ и особенностей формирования вирус -нейтрализующих антител у пациентов с различным характером течения ВИЧ-инфекции. Исследование динамики гуморального иммунного ответа к основным вирусным нейтрализумчим эпитопам необходимо для разработки эффективных профилактических и лечебных вакцинных препаратов против СПИД, создание которых является первоочередной задачей современной медицинской науки.

-2-

Цели и задачи исследования.

Основной целью настоящего исследования яьилось изучение характера антител к основной нейтрализующей антигенной детерминанте ЗИЧ-1 в популяции инфицированных пациентов, имеющих общий источник заражения.

Необходимым условием достижения поставленной цели явилось решение следующих задач:

1. Получение набора синтетических олпгопептидов, гомологичных 10-23 а. о. области УЗ др120 вариантов ВИЧ-1, получивших распространение в внутрибольничных очагах ВИЧ-инфекции юга России.

2. Разработка метода детекции антител к основной нейтрализующей детерминанте ВИЧ-1 на основе синтезированных .пептидов, с помощью непрямого твердофазного ИФА.

3. Анализ спектров реактивности антител к вариантам . уз, получившим распространение среди ВИЧ-инфицированных пациентов, внугрибольнг"чых очагов юга России.

4. Картирование антигенной детерминанты области петли 1/3 поверхностного гликопротеида др120 варианта ВИЧ-1, получившего распространение в когортной популяции инфицированных лиц юга России.

5. Изучение специфичности антител к области УЗ вариантов ВИЧ-1, присутствующий у пациентов с различным характером течения ЕИЧ-инфекции

6. Оценка активизации патологического процесса у инфицированных пациентов с использованием методов выявления вирусного. антигена, р24 е составе иммунных .комплексов.

Научная новизна работы.

Впервые проведен анализ плазм крови большого массива пациентов, инфицированных ВИЧ-1 из одного источника, на наличие антител к вариантам основного нейтрализующего' эпитопа ВИЧ-1, получившим распространение в данной популяции. В качестве модели для проведения исследования были использованы материалы от ВИЧ-инфицированных лиц юга России.

Выявлены наиболее распространенные в данной популяции антигенные варианты области петли УЗ др120 ВИЧ-1 на основе определения нуклеотидных последовательностей непосредственно в лимфоцитах инфицированных лиц. Синтезированы тэтрадекапептида, гомологичные выявленным вариантам чЗ.

С использованием синтезированных пептидов разработан метод детекции антител к основной нейтрализующей детерминанте

БИЧ-1 на основе непрямого твердофазного ИФА.

В результате анализа реактивности плазм крови ВИЧ-инфицированных пациентов к- синтетическим уЗ-антигенам была локализована основная антигенная детерминанта петли УЗ в области последовательности ^бРачАУ. Замены этих а. о. приводят к резкому снижению реактивности плазм. Следующие а. о., расположенные в (-1) и (+1) положении от указанной последовательности, оказывают слабое влияние на реактивность плазм.

В плазмах ВИЧ-инфицированных лиц обнаружены антитела, способные узнавать пептиды, соответствующие области уз штаммов, циркулирующих в организме данного пациента.

Впэрвые на большом массиве плазм ВИЧ-инфицированных, имеющих общий источник заражения, проведен анализ динамики изменения спектров антител, который показал, что в начальный период вирусоносительства в крови инфицированных присутствуют антитела, обладающие высокой специфичностью по отношению к кон-сенеуской последовательности для этой популяции. В дальнейшем происходит расширение спектра узнавания УЗ-антигенов за счет кросс-реактивности антител и снижение их аффинности по отношению к консенсусному варианту.

Установлено, что при прогрессировали заболзвангш происходит не только нарастание вариабельности последовательностей, кодирующих область УЗ, но и увеличение общих различий с кон-сенсусной последовательность!!

Практическое значение работы Полученные в результате исследования данные могут быть использованы для создания специальных диагностических препаратов на основе синтетических пептидов для серотипирования вариантов ВИЧ-1, а также для изучения структуры антительного ответа ВИЧ-инфицированных лиц к гипервариабельным вирусным антигенам.

На защиту выносятся следующие положения:

I. Синтезирован набор олигопептидов, гомологичных 10-23 а. о. и 15-23 а. о. области УЗ др120 вариантов ВИЧ-1, получивших распространение во внутриболъничных очагах ВИЧ-инфекции юга России.

На основе синтезированных пептидов разработан лабораторный вариант тест-системы для определения антител к основной нейтрализующей детерминанте ВИЧ-1

3. Проведен анализ спектров реактивности антител к вариантам УЗ , получившим распространение в популяции ВИЧ - инфицированных лиц юга России.

-44. Установлено, что основная антигенная детерминанта петли УЗ расположена в области последовательности |.6Р6(}А. Замены этих а. к. приводят к резкому снижению реактивности плазм. Следующие а. к., расположенные в (-1) и (+1) положении от указанной последовательности, оказывают слабое влияние на реактивность плазм.

5. В плазмах ВИЧ-инфицированных лиц обнаружены антитела, способные узнавать пептиды, соответствующие области уз штаммов, циркулирующих в организме данного пациента.

6. Установлено, что в процессе прогрессирования ВИЧ-инфекции происходит снижение аффинности анти-\'3 антител по отношений к консенсусному варианту для данной популяции.

Публикация результатов исследованич и апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Результаты представлены на IX Международной конференции по СПИД (Берлин, 1993), Международном симпозиуме "100 лет вирусологии" (С.-Петербург, 1992), I Международной конференции по СПИД (Вильнюс, 1993).

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора лите-раауры, экспериментальной масти, обсуждения результатов, заключения и выводов. Объем работы составляет страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 10 таблицами и 16 рисунками. Список литературы включает наименование.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выбор популяций ВИЧ-инфицированных пациентов.

В качестве основных моделей для проведения данного исследования были выбраны две группы ВИЧ-инфицированных, которые различались по характеру эпидпроцесса.

Одяа из них (когортная группа) - по данным эпидемиологического расследования и анализа нуклеотидных последовательностей вирусов, получивших распространение в этой популяции, имела единственный общий источник инфицирования и была сформирована в 1988-1989 годах за счет распространения ВИЧ-инфекции

среди детей, находившихся в стационарах Северо-Кавказского региона, Калмыкии, Астраханской и Волгоградской областей. Трансмиссия вируса в этой популяции осуществлялась за счет использования нестерильного медицинского инструментария при парентеральных процедурах. В результате распространения инфекции на Юге России было инфицировано около 250 человек, при этом основные очаги заболевания были расположены в детских стационарах Рэстова-на-Дону и Элисты (Покровский и др., 1990, СИепд$опд-Ророу е1 а1.,1992).

Вторая группа инфицированных (некогортная группа) ВИЧ-позитивные лица, проживающие в различных регионах СНГ. Основными источниками инфицирования этой группы явились ВИЧ-инфицированные иностранцы, преимущественно выходцы из африканских стран, при этом трансмиссия вируса осуществлялась за счет половых контактов. В работе использовались инфекционные материалы, собранные в период 1938 - 1993 годов. В результате проведенных работ создан банк плазм и сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов жителей СНГ, который включает 435 образцов от 263 ВИЧ-инфицированных лиц.

В настоящей работе были исследованы материалы от 59 пациентов, инфицированных ВИЧ-1 во внугрибол^ничных огачах юга России (Калмыкии и Северо-Кавказского региона) в период 1988-89 гг, а также от 37 ВИЧ- инфицированных лиц из Москвы, Белоруссии , одессы, Краснодарского края, Екатеринбурга. Среди пациентов юга России были исследованы 4 взрослых и 55 детей в возрасте 3-16 лет. По клиническому статусу 24 пациента находились в стадии 2В с генерализованной лимфаденопатией и гепа-тоспленомегалией, у 12 диагностирована стадия ЗА с гепатосп-леномегалией, кандидозом , частыми ОРВИ , пневмониями и другими заболеваниями, вызываемыми условно-патогенной микрофлорой. 12 и II детей, соответственно, находились в поздних стадиях ВИЧ-ннфекции ЗБ и ЗВ-4 . Среди инфицированных некогортной группы исследованы плазмы от 31 взрослого и 5 детей, клинический статус которых не определяли.

Собранные материалы от ВИЧ-инфицированных лиц нозокоми-альных очагов юга России представляют собой уникальную модель для решения задач, поставленных перед настоящем исследованием в силу следующих обстоятельств: в этой популяции циркулирует единственный вариант ВИЧ-Г, размер популяции ВИЧ-инфицированных (около 250 пациентов) обеспечивает создание панели плазму которая представляет собой статистически досго. ;рнук выборку; в ранее проведенных в лаборэто; и биотехнологии работах накоп-

лвны сведения о последовательностях области петли УЗ вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в этой популяции.

2. Синтез олигопептидов, соответствующих участкам гипервариабельного домена >/3 др120 штаммов ВИЧ-1, циркулирующих во виутрибольничных очагах юга России, и анализ их антигенной активности.

2.1 Выбор последовательностей для синтеза олигопептидов.

Ранее нами было показано, что в популяциях ВИЧ-инфицированных лиц нозокоыиальных очагов юга России (так наэываеыая "элистинская вспышка") получил распространение вариант БИЧ-1 с консенсусной последовательностью а. о. в области петли УЗ др12й СТЙРНМТНШЗЮРСОАРУтЕПеотдАНС (Сье»пд5опд--Ророу е1 а1., 1993). При этом вариабельные позиции а. о. были отмечены в положения 13,14,18, 20, 22,25 и 32 (Нумерацию области уЗ проводили, принимая за первую аминокислоту м-концевой цистеин в положении 296 штамма IIIВ, как описано в статье йагпег е1 аЧ.,1985). Особый интерес представляли замены в позициях 13, 14, 20 и 22, которые прилегали непосредственно к консервативному участку БРв и, по-видимому, входят в состав основной нейтрализующей антигенной детерминанты УЗ.

Для анализа антител к УЗ были синтезированы тетрадекапеп-тиды, гомологичные 10-23 а. о. последовательностей вариантов УЗ, обнаруживаемых в исследуемой популяции. Выбор этого участка был обусловлен двумя обстоятельствами. Во-первых, в его составе находится основная нейтрализующая детерминанта, которая была картирована в районе последовательности С1у-Рго-С1у (СоиаяпП »г аЬ, 1988; ОауаНеИап ег а!., 1989; Ие1оеп »1., 1989); во-вторых, около 70% всех замен в.изучаемой популяции сосредоточено в этом районе. Проведенный нами анализ характера замен а. о. в этом участке УЗ (сагаеу е1 а1., 1993) позволил установить, что основная масса вариантов (более 50% от общего числа последовательностей) представлена 7 вариантами структуры, которые продемонстрированы в таблице I.

Необходимо отметить, что приведенные варианты области УЗ имеют широкое распространение среди пациентов изучаемой популяции, так как обнаруживаются у 91% ВИЧ-инфицированных лиц.

Таблица I.

Частота встречаемости вариантов 10-23 а. о. области УЗ, в популяциях БИЧ инфицированных юга России *.

Номер V3 последовательности Структура Частота встр от общего числа последовательностей ечаемости, % от числа пациентов

I II Ш IV V VI VII 10 23 К S I SL GPGQAFYTT - - - - Г ----- Í - - - - - - - F А........ - - - - I......... - - - R 1......... - - - N F.....I - - - 23,2 (29)** 7,2 9 5,6 7 4,8 С 4,0 5 6,4 8 4,8 6 54.5 (12)*** 18,2 4 13.6 3 18,2 4) 13,6 3 18,2 4 4,6 1)

Примечение. *) - частоту встречаемости определяли как отношение числа последовательностей, соответствующих указанным УЗструктурам, к общему числу проанализированных последова(ель-ностеи в изучаемой популяции.

**) - в скобках приведено абсолютное число последовательностей, гомологичных пептиду. Общее число последовательностей

***) • в скобках указано число пациентов у которых обнаружена последовательность, гомологичная пептиду. Обцее число пациентов • 22.

2.2. Твердофазный синтез олигопептидов.

Пептиды (PI-PVII), гомологичные наиболее распространенным вариантам v3 (i-VIl) (табл.1), были синтезированы на твердой фазе вручную с использованием Boc/Bzl-стратегии. В качестве носителя использовали хлорметилированкую матрицу (тефлон с ра-диационно привитым полистиролом (РоtapoV et al., 1979). Полученные пептиды были охарактеризованы методами тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, количественного аминокислотного анализа и определения удельных углов оптического вращения.

2.3. Разработка лабораторного варианта тест-системы для определения антител к области V3 gpI20 ВИЧ-I на основе синтетических пептидов.

Для анализа реактивности плазы использовали метод непрямого ИФА с использованием синте :1рованных пептидов. При отра-5отке метода пептидного ИФА особое внимание было обращено на подбор концентрации пептида при сорбции, расчет значений cut iff и выбору планшетов. Нами шш опробованы различные варианты планшетов: полистироловые "Costar", "Llnbro", "Nunc" и гиб-сие полихлорвиниловые "costar". Наилучшие результаты'были получены при использовании полихлорвиниловых планшетов ф:граы

"Costar"(Cat. No 6695). Использование этих планшетов давало максимальное значение отношения ОП положительных и отрицательных плазм. Для подбора насыщающей концентрации антигена предварительные эксперименты были проведены с использованием пептида pi и панели из 22 плазм ВИЧ-инфицированных когортной популяции. Было установлено, что насыщающие концентрации пептида, использованного для сорбции составляют 1,25-2,5 мкг на мл. Аналогичные эксперименты, проведенные с другими пептидами, дали близкие значения насыщающих концентраций. В качестве cut off было выбрано значение среднего арифметического для отрицательных плазм плюс три стандартных отклонения. Как правило, в наших экспериментах значение cut off не превышало 0,1 - 0,2 единиц ОП. Специфичность тест-системы, определенная на панели из 100 ВИЧ-1 негативных сывороток и плазм с использованием этого критерия составила 98%, что можно считать вполне удовлетворительным результатом, позволившим использовать эту тест-систе" • для решения задач, поставленных перед настоящим исследованием.

2. 4. Анализ реактивности панели ВИЧ I - позитивных плазм к синтетическим V3 пептидам.

На разработанном нами варианте лабораторной тест-системы был проанализирован спектр антител к 7 синтетическим УЗ-анти-генаы у ВИЧ-инфицированных пациентов из внутрибольничных очагов юга России, а также в некогоргной группе, включающей 37 ВИЧ - положительных плазм от пациентов из Москвы, Краснодарского края, Белоруссии, Одессы и др. регионов СНГ. Этот анализ показал высокую эффективность связывания синтетических пептидов с плазмами пациентов когортной группы и низкий уровень реактивности образцов, полученных от эпидемиологически не связанных лиц (рис.1). В частности, для плазм когортной группы доля позитивных по отношению к pi составляет 100%, в то время как для пациентов некогортной группы только 18% (6 "пациентов из 37). Интересно отметить, что'.2 пациента (zln и kts) из некогортной группы имели схожие варианты последовательностей области уЗ с пациентами из когортной группы, а для двух других не соЕсем ясна эпидемиология: не исключена их связь с пациентами из "элистинской вспышки". Таким образом, реальное число плазм пациентов некогортной группы, способных реагировать с пептидом PI, может бьгть еще меньше. Учитывая эти результаты, по-видимому, при эпидемиологических обследованиях использова-

P] Pll Pill PIV PV PVl PV]

Рис.1. Доля плазм, реагирующих с пептидами pi-pvii в ко-гортной (а) и некогортной (Б) популяциях ВИЧ-инфицированных лиц. Число исследованных образцов составляло 70 для когортной популяции и 37 для некогортной.

ние разработанного нами варианта тест-системы может быть полезно для предварительного серотипирования.

3. Картирование антигенной детерминанты области V3 gp120 вич-1.

3.1. Определение положения антигенной детерминанты v3 с помощи "о пептидов разной длины.

К моменту проведения настоящего исследования в литературе имелись экспериментальные д ные и компьютерные предсказания о наличие дополнительных эпитопов в области 8-14 аминокислотных остатков v3 (hoore, 1991). Ввиду уникальности когбртной популяции ВИЧ-инфицированнцх юга России представляло интерес по-

пытаться идентифицировать эти эпитопы. Однако, синтезированные нами пептиды были лишены этих последовательностей. Всвязи с этим мы воспользовались любезно предоставленными нам С. М. Андреевым пептидами, соответствующими 6-26, 10-26 а. о. консенсус-ной последовательности когортной группы, в структуре которых присутствовали предполагаемые эпитопы При этом можно было ожидать существенного повышения уровня реактивности плазм когортной популяции к этим пептидам по сравнению с пептидом Р1.

Результаты сравнительного анализа показали, что уровень реактивности плазы не зависел от наличия дополнительных а. о. на н- и С-концах р1 (рис.2). Такой результат молсет свидетель-' ствовать либо об очень низкой концентрации антител к дополнительным последовательностям (в этом случае он должен составлять не более 10-20% от уровня реактивности к р1), либо об отсутствии иымуногенной активности этих последовательностей. С другой стороны, укорочзнкэ пептида с н-конца до глицина в позиции 15, в- дящего в состав основной антигенной детерминанту приводит к резкому падению числа образцов плазм пациентов когортной популяции, способных реагировать с пептидом (рис. 2).

Таким образом, район последовательности петли УЗ, определяющий характер взаимодействия с антителами расположен в пределах выбранного нами участка 10-23 а.о..

3. 2. Картирование эпитопа УЗ с помощью набора пептидов, гомологичных последовательностям маркерных штаммов №4-1.

Для тонкого картирования основной антигенной детерминанты мы воспользовались анализом реактивности плазм когортной популяции с пептидами, .соответствующими последовательностям УЗ маркерных штаммов м, НА1_, гЗ, г321 и 16 (рис.3). Структура этих пептидов - позволяет достаточно подробно охарактеризовать значимость отдельных позиций УЗ для связывания' с антителами. На основании такого анализа можно более точно локализовать положение основной нейтрализующей детерминанты в района-последовательности ЮРйрАРУ.

Таким образом, антигенная значимость аминокислотных 'остатков падает при продвижении от центральной последовательности србс влево и вправо, при этом позиции -2 и +4 ухе не оказывают влияния на реактивность плазм.

10

15

20

25

30

35

R/E ctrpnnntrksiSLOPOQAFYttgeiigdirqahc

PVIIX PI . Nili-17 NU-18 PIX

OPOQAFYtt ksiSLOPGQAFYt t ksiSLOPOOAFYttgei rksiSLOPGQAFYt tgei trksiSLOPOQAFYttgei

Предполагаемый участок взаимодействия с полианионаин

3%

100% (N-70) 100% (N-70) 100% (N-15) 100% (N>48)

доля позитивных плазм

Рис. 2. Реактивность плазы пациентов когортной группы к УЗ пептидам различной длины. Индексам« слева обозначены: НД - консенсусиая последовательность УЗ др120 ВИЧ-1 для когортной популяции; Р1, Р VIII, Р1X, НН-17, НИ-18 - соответствующие синтетические пептиды; N - число проанализированных образцов. Цифры над последовательностью - положение соответствующих а. о.

10 15 20 25

* * * *

R/E R К S I S L G Р G Q A F Y Т Т G Е 100, 0%

МН -- R - н -- - - R -- - - - К N 48, 0%

2321 -- - - - -- - - R -- F А - - N И, 5%

NAL - R G н F - - -- - L - - - G N 48, ОХ

Z6 - Q - Т р I - L -- - L - - - R Q II, 5%

Z3 - Q - - R 1 - - - К V - - А К - G 8, ОХ

ЭПИТОП

Доля позитивных плазы (N=74)

Ríe. 3. Реактивность плазы пациентов когортной группы к V3 пептидам! маркерных штампов ВИЧ-Т Индексам« слева обозначены: R/í. - консенсусиая последовательность V3 др120 ВИЧ-1 для когортной популяции; MN,Z321,H4., 26,23 - синтетические пептиды, соответствующе V3 последовательностям маркерных штажоа, N- число проанализированных образцов. Цифры над последовательностью - положение соот л-ствутрх а. о. '

1

-123.3. Локализация области неспецифического взамодействия антител с V3 пептидами.

При анализе данных реактивности плазм с v3 пептидами маркерных штаммов обращает на себя внимание высокий уровень узнавания пептида mn (рис.3.). Сравнение последовательностей области основных антигенных детерминант пептида pi (lgpgqafy) и mn пептида (igpgrafy) обнаруживает существенное отличие в позиции 18 (замена q—>r), которое должно приводить к резкому падению реактивности gpgq-специфичных иммуноглобулинов, то есть практически не узнаваться плазмами когортной популяции. Для объяснения такого поведения плазм было выдвинуто предположение о наличие неспецифического связывания этого пептида с антителами, основанного на зарядовых взаимодействиях. Существенный вклад в формирование заряженной области пептида мп вносят остатки аргинина и лизина (рис.3).

Всвязи этим мы сравнили реактивность плазм когортной группы с пептидом mn и его модифицированным аналогом, ' который содержал ацильные остатки по эпсилон-аминогруппе лизина. Реактивность плазм когорортной группы падала ниже значения cut off при использовании в реакции модифицированного пептида мн. Резкое падение было также отмечено и для случайной выборки ИИ-позитивных плазм некогортной группы. Высокий урогень узнавания пептида mn отмечался ранее в работах ряда авторов (Goudsnlt et al., I9SI), а также и нами (Chengsong-Popov et al., 1992). По-видимому, выводы о широком распространении вариантов нн-по-добных вирусов в популяциях ВИЧ-инфицированных Северной Америки и Европы, сделанные на основе серологического анализа, требуют дополнительной проверки с помощью методов прямого определения нуклеотидных последовательностей. Интересно отметить, что в случае аналогичных экспериментов с пептидом PI, который также содержал в положении 10 положительно заряженный лизин падение значений ОП, близкое к cut off было отмечено только для 10% плазм пациентов когортной группы

Таким образом, неспецифическая реактивность плазм по oír- • ношению к пептиду mn, по-видимому, объясняется наличием высокого положительного заряда.

4. Изучение специфичности антител к основной нейтрализующей детерминанте ВИЧ-1..

Как уже отмечалось выше, прячтически все исследуеше об-

разцы плазм пациентов когортой группы способны реагировать с пептидом р1 , являющимся гомологом 10-23 а. о. консенсусной последовательности области УЗ для данной популяции. Всвязи с этим мы воспользовались уровней реактивности к Р1, как мерой для измерения реактивности плазм по отношению к другим пептидам. Для проведения таких экспериментов значения ОП для пептида р1 должны были находиться в линейной части кривой зависимости ОП от разведения плазмы. Поэтому в этих экспериментах разведения плазы подбирали таким образом, чтобы величина ОП для р1 лежала в пределах 0,8-1,5 и учет относительной реактивности каждой плазмы по отношению к пептидам рI —рVIII проводили на одном планшете.

4.1. Определение групп реактивности плазы по отношению к УЗ пептидам.

Анализ относительной реактивности плазм инфицированных пациентов когортной группы позволил разделить эти образцы на группы реактивности. Отнесение той или иной плазмы к данной группе определялось способностью связываться с одним из семи проанализированных нами пептидов. При этом к лаз мы, способные узнавать пептид р1v, который имеет максимальные различия с эпитопом консенсусного варианта, были способны реагировать и со всеми остальными, имеющими меньшие различия с пептидом с антигенной детерминантой р1. Графически отношения между выделенными группами реактивностями представлены на рисунке 4. Множество плазм, реагирующих с пептидом РIV является собственный подмножеством плазы узнающих пептид ру11, которое в свою очередь является подмножеством плазм с реактивностью к рш и так далее. Иерархические взаимоотношения между группами образцов по их способности реагировать с различными пептидами можно записать следующим образом р1,ру,руК рп < рнк руп<Р1У. Как видно, в этом ряду нарастают различия с консенсусным пептидом р1. На основании этих данных мы разделили анализируемые образцы на 3 группы: группу "1", (pi.pv.pvi), группу "г" (-и>п,гл1, рун) и группу "ра" ч+Р1v) (рис.4).

Высокий уровень корреляций между реактивностью плазм по отношению к указанным пептидам и строгая зависимость этой корреляции от Синонимичности зам«н в позиции 14, позволило выдвинуть Предположение о существовании ограниченного числа типов антител, которые обеспечивают взаимодействие сс зсеыи пзптида-ыи за счет кросс-реактивности. Тсвяэи с этим нами были прове-

-14-А.

400 -

300 -

200 -

100 -

ошрп всврш

ПППШРУП ШШ_1ивР1у

53

Количество пациентов в разных группах реактивности

0

Группа

Тип реактивности

По типу реактив. Число образцов %от общего числа

■L"

PI.PV.PVI

16 25,8

I •

•F" l'FA-

PII | PIII | PII.PIII | PII.PIII,PVII| PIV

-1-1--1-1-1

I I I I

9 | 4 | 15 | .4 | 14

14,5| 6,5 | 24,2 | 6,5 | 22,6

по группам число образцов общего числа

16 25,8

32 51,6

I

I " I 22.6 I

Рис. 4. Профиль иммунореактивности для 53 ВИЧ-позитивных плазм е пептидами РП,РП 1,РVII, Р1У в твердофазной ИФА.

А. По оси абсцисс - порядковый номер плазмц по оси ординат - относительная реактивность плазм к данному варианту пеп-; тида, взятая в % от величины 0П для Р1.

Е Те же данные в виде таблицы. * .'-.'

денн эксперименты по ' конкурентному ингибированию пептидами, Находящимися в растворе, взаимодействия плазм с пептидом, сорбированным на твердой фазе.

4.2. Определенна иммунологического перекреста в реактивности плазм по отношению к изучаемы паптядан.

Для проведения анализа были отобраны по две-три плазмы из каждой ранее описанных групп реактивности. На твердую фазу сорбировали пептид р1, соответствующий коисенсусной последовательности изучаемого участка петли УЗ. Пептиды добавляли в концентрации 10,100,1000 и 10000 нг/ыл к плазмам ВИЧ-инфицированных лиц. Реактивность с пептидом р1 в отсутствии конкурента принимали за 100%. Результаты экспериментов приведены на рисунке 5.

Как видно из представленных данных, 50Ж-ныз ингибируида концентрации для пептидов РУ и РУ1 практически не отличается от таковых для консексусного варианта - пептида р1. Кроме того, необходимо отметить, что характер кривых пнгкбпрования (угол наклона линейной части кривой) одинаков для р1, ру и ру1 при рассмотрении каждой отдельной плазнц однако, дян рзз*шх пациентов этот показатель заметно различается. Сопоставление углов наклона кривых ингибирования связывания антител с пептидом р1 представлено на отдельной графике (рис.6). Из представленного рисунка следует, что при анализе плазм пациентов, относящихся к группе реактивности Ч", ны наблюдали быстрое падение кривых ингибирования. Напротив, углы иа&хона кривых ингибирования для плазм, относящихся к "г" и, "Я а" группам реактивности имели более низкие значения.

Таким образои, реактивность к пептидам Р1.РУ, Р»1, по-на-димаму, определяется одной группой антител; при этом заксна лейцина на изолейцин в положении 14 не является суовстЕеннай для эффективности связывания пептидов с вптятеяака. Также, очевидно, налое влияние ва связывание антител оказывает зааивна" серина на аргинин в 13-ой позиции, несмотря ва сузестееинш г'зличия в химической природе радикала.

Наличие перекрестной реактивности в связшашш ВИчвоэш-тивных плазм с.пептидами Р1,РИ,Р1И,Р1у,рун быш тзкяе установлено изтодои конкуртного ИЗД. На рисунке 5 предртавязны результаты экспериментов по подавленно связывания аптя-УЗ ант-тел с Р1, сорбированным ва твердой фазе, пептндаки, содгржада-ми фешляланин в позиции 14 Как следует из прнведгнных кргвых

-16-

А. Г.

shsl02 як£*8

в.______________________L. г.

«ИШ1 achSI]

Еле.5. Ношурентша ингибирование связывания с PI, сорби-рзшш на твердой фазе, антител БИЧ-инфицированных пациентов швшщдаш р« к (а,б,в) и пептидами PII я Pill ( г, д. е). На ¡каздом гпа|цке, кроив того, приведена кривая ингибирования PI в адчестаза контроля.

* Кодовую шмвра пациентов указаны кад соответствупдам ри-сугшж.

По оси абсцисс - концентрация конкурента в нг/шц по оси ©ЮТшат — уровень остаточной активности образца в %.

25

75

50

0

-Inc

—ehr

—-beh

— Pch

— izd

— rzn

300

1000

5000

tPI] (ng'ml)

Рис.6. Углы наклона кривых конкуренции pi для плазм ВИЧ-инфицированных пациентов когортной группы с разными типами реактивности антител: rzniœ, izd509 - "L"; pchII4, bchI50 -"f"; 1 ne526, ehr 146 - "fa". (На твердой фазе pi).

ингибирования, добавление даже в высоких концентрациях (до 10 мкг/мл) пептидов рп или piii практически не оказывает влияние на связывание с pi плазм группы "L". С другой стороны, пептиды pii и pill эффективно подавляют связывание антител в плазмах, пациентов остальных групп. Необходимо отметить, что максимальные эффекты подавления мы наблвдали у пациентов "FА" группы реактивности (рис. 5).

Иными слова™, расширение спектра реактивности плазм происходит за счет появления низкоспецифичных антител, способных узнавать широкий набор пептидов с заменами в 14 положении.

Суммируя данные этого раздела исследований, можно сделать вывод о том, что расширение спектра реактивности плазм происходит за счет появления низкоспецифичных антител, способных узнавать широкий набор v3 пептидов с заменами в 14 положении.

5. Антитела к основной нейтрализующей детерминанте ВИЧ-1 у инфицированных лиц, находящихся на разных стадиях заболевания.

Скорость прогрессирования ВИЧ-инфокции не одинакова у различных пациентов и, как известно, нар..ду с быстрым развитием симптомов заболевания у одной группы инфицированных лиц, наблюдается длительное бессимптомное вирусоносительство у другой. Одним из факторов, позволяющим пролонгировать бессимптомный период ВИЧ-инфекции, является присутствие в крови нейтра-

лизущих антител. Поскольку про гре с с про ва ние ВИЧ-инфекции сопровождается вирусемиями, для оценки активизации патологического процесса наши был использован метод определения антигена р24, как один объективных показателей прогрессии ВИЧ-инфекции. Естественно, что при этом учитывались и клинические показания, а также данные лабораторных иммунологических анализов.

5. I. Изучение частоты возникновения вирусеыии у ВИЧ-1 инфицированных лиц с известной структурой области УЗ.

Сопоставление клинического статуса с результатами определения антигена р24 у 78 ВИЧ-1 инфицированных лиц позволило выявить вцраженную корреляции между наличием р24 антигена в ллазмэ крови и клиническим статусом пациентов (табл.2). Воз-

Таблица 2.

Частота обваругзвая р24 антигена в плазмах крови ВИЧ-ин-

фадированныг пациентов с различным клиническим статусом.

Хдмиическмй статус м-euica Общее число обследованных Количество пациентоа с р24 антигеном X

Бедопсномш вирусонвсмтелн б 0 0

■Лида с генерализованной MN-фоаденапагмей 32 5 16

¡Больные с ¡проявлением СЩД-ассо-щииравамыш штэ-pijfHncmMBcmx «шфекций 32 16 so

¡Больные СЩД 8 е 75

Итого 78 27 34,6

растение частоты обнаружения ¿>24 антигена у больных в зависимости iOT стадии заболевания, го-гвдаж>му, связана с учащением возникновения вирусеыии при прогрессировании ВИЧ инфекции, как было предложено в математической подали Новака (Novak and Anile г-ь 011,1991).

Таким образом, тестирование антигена р24 в крови ВИЧ инфицированных зшц с предварительный разрушением комплексов ан-тигвн-ангитело позволяет выявлять наличие вирусемии у 35% па-циеытрв, причем частота появления р24 в плазма нарастает по lepe прогрессирования заболевания.

Поскольку появление р24 антигена является указанием на активную вирусную продукцию, мы провели его из игрение при нескольких заборах крови, взятых в разное время, н сопоставили эти данные с последовательностями УЗ, которые были обнаружены у этих у пациентов (табл.3). Представленныэ результаты свидетельствуют, что у пациентов ик53(Х рс!)П4, Ь(1г537, ггпТОЗ, ■ кьа545 й ру)537 при тестировании образцов плазм, взятых в те-чрЬпе 1,5 лет, р 24 антиген ни в одном случав обнаружен не был.

Таблица 3.

Измерения антигена р24 в плазмах ВИЧ-ин$5Щиро ванных пациентов в динамике и их сопоставление со структурой антигенно значимого участка области УЗ.

Код Обнаружение р24 анти- Кснсенсмэая структур* участка 10- ?3 а. о. области ¥3 ВИЧ-1, обкарухявгемих

пациента гена в Аинамасе

время от первого згбсрг

иес щы у пациентов

0-2 1-Ь 6-9 10-И

ггк530 _ К 5 I БСеРбОАРУТТ

ггвйОЗП - V- --------------

рсЫН к(н1545 - ■

Ь<1г537 - - - - ---И I.........

ру1538 - - ----1---------

гай! 07 + -..-р-----1.---

1пс526 - +■ у + ----ГА--------

11*110 + + ----РА--.....-

дгЬ559 + + + ----Г.....I---

1Ь таблицы 3 видно, что консенсуснвЕ последрвзтежьнэсти участка 10-23 а. о. области УЗ, определение дня этих патентов, соответствуют структуре синтезировашгкт на ял пепгидрв Р1, рт вж РУ1. Только в одной случае у пагдаенга кЬ<1545 с коЕсенсхтаиш вариантом, гомологичны» пептиду Р1, обнаруживайся р24 зитан; н у ггвТОЗ результат одного гаийренгя был сомшнгелькыа (+/-)-Однако, следует ответить, что у пациента кНй545 присутствовала минорная последовательность, сильно отхичэдззяся то сгруидае от основного варианта. С другой сторокд, прш анялгизе шгап а1уПСЬ 1пс526, ггдКЛ и дгЬ55Э обнаруживался праюпгаески_тс-тоянную антигене кип. Сопоставление этвх лянямт со стррсф)! фрагментов УЗ, обнаруживаемых у этих пациентов, говшзалэ, что у пациентов а1 уПО и 1 пс52б оснозта явхяется шслвдавятедь-

ность, соответствумдая синтетическому пептиду РТУ, а у гг<)107 и дгЬ55Э консенсусный вариант был структурно гомологичен пептиду Р1II (Б1$рср6ЧА1_утт). Видно, что для рассматриваемых последовательностей общей является аминокислотная замена I на г в положении 14 и, кроме того, согласно нашим ранее описанным данным, изменение с(15) на А в составе основной детерминанты ере, оказывается оказывается крайне существенным для связывания ¥3 эпитопа с антителами.

Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что различная частота возникновения вирусомий у ЕИЧ-1 инфицированных пациентов зависит от структуры а. к. последовательности области УЗ вирусов, циркулирующих в организме. Установлено, что появление последовательности в составе анитегнной детерминанты у пациентов юга России сопровождалось длительными вирусеыияии в отличие от вариантов (I \LGPGQA), для которых вероятность обнаружения вирусного антигена существенно ниже.

5. 2. Изучение соответствия между специфичностью антител к уЗ эпитопу и первичной структурой аминокислотных последовательностей этой области, обнаруживаемых у изучаемых пациентов.

Одной из задач, стоящих перед настоящем исследованием, было изучение соответствия между специфичностью антител к УЗ эпитопу и первичной структурой аминокислотных последовательностей этой области др120 вариантов ВИЧ-1, обнаруживаемых у изучаемых пациентов. Всвязи с этим мы провели сопоставление результатов иммунологического и структурного анализов (рис.7). На рисунке 7 в левой колонке приведены аминокислотные последовательности вариантов области УЗ, обнаруженных у ВИЧ-инфицированных пациентов, в правой колонке реактивность плазм по отношению к пептидам Р1-РУП. Анализ представленных данных позволяет сделать вывод о наличии высокого уровня соответствия между реактивностью плазм и последовательностями УЗ. Действительно, почти у зсех изученных пациентов наличие после-довател- 'остей, гомологичных структуре пептидов Р1 -Р VII свидетельствовало о присутствии у них антител, способных узнавать эти последовательности. Однако, при рассмотрении обратной зависимости (то есть наличия последовательностзй в зависимости от типа реактивности) мы не обнаружили однозначного соответствия. Среди вариантов структур УЗ, выявленных у пациен-а *гп529, не было обнаружено ' последовательностей, гомологичных

сон

шиЮЗ сон

кэтоРврАРУТТ Число после-доваельностей

р1 р1

Профиль реактивности пл.ч-.

2.0

1.8

1.4 -р

1.2 гр

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2 К

п.п

Р1 РИ РП1 Р1V РУ РУ1 РУН

р vi. 538 сон

-а-

2 ру i ру* i р1

РИ РП1 Р1У ру РУ) РУН

РСК114 сом;

3 р1 2 рш i рш< I I I

РСН114

Р1 РИ РШ Р1У РУ РУ1 РУН

Л1 у 110

сон

—Ы-----

---(Г-------

—р----1

2 р IV

2 рп I

3

-222.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

РУ] РУН

1НТ526 СОН

---ра—__

---Р.Р-

-са-

ри

р11

1ЫС526

Р1 РИ РИ! Р1У РУ РУ1 РУН

Рис. 7. Соответствие между специфичностью антител к уз эпитопу л первичной структурой а. к. последовательностей этой области, обнаружнвуемых у пациентов.

Кодовые.номера пациентов указаны над соответствующим рисунком.

Слева - последовательности УЗ, обнаруживуемьк у данного пациента. Сверху приведена консенсусная последовательность области уз (10-23 а. о.)для когортной группы. Совпадающие е. о. показаны "-". Число справа указывает на количество совпадающих последовательностей. Первая строка после шифра пациента - консенсусная последовательность для данного пациента.

(*) - обозначены последовательности, не соответствующие пептидам р1-рун.

Справа - профиль реактивности плазм к пептидам р1-руп. По оси ординат - нормированные по отношению к р1 значения ОП реактивности плазм (ДО- >

пептиду pli, piv, хотя образцы плазм обладали способностью связываться с этими пептидом. Аналогичная ситуация была обнаружена .нами для препаратов, полученных от пациентов mch5I3, Inc526, alvIIO, odnlOI, shsI02. Эти результаты, по-видимому, могут отражать либо малое число проанализированных V3 последовательностей, либо наличие широкой кросс-реактивности ан-ти-УЗ-антител, что бшо продемонстрировано нами в предыдущей главе.

Таким образом, в крови ВИЧ-инфицированных присутствуют антитела, способные взаимодействовать с вариантами области v3 вирусов, циркулирующих в данный момент в организме инфицированного.

5. 3. Связь между типом реактивности плазм по отношении к V3 пептидам и стадией заболевания.

Учитывая тогфзкт, что существует хорошая корреляция между последовательностями области v3 и реактивностью образцов плазм с одной сторонч а также нарастание вариабельности v3 по мере прогрессирования заболевания с другой стороны, было выдвинуто предположение о связи типа реактивности плазм по отношению к V3 пептидам и стадией заболевания.

Для проверки этого предположения мы сопоставили данные иммунологического анализа с клиническим статусом и результата- • ми анализа р24 антигена для 48 образцов плазм пациентов юга России, находящихся на разных стадиях ВИЧ-инфекции. Среди исследованных плазм 19 ( 40%) были получены от лиц с лимфаденопа-тией (стадия 2В), у 10 пациентов была установлена стадия ЗА (21%),а 9(19%) и 10(20%) находились на стадиях ВИЧ-инфекции ЗБ и ¿3-4, соответственно. Для оценки наличия активной продукции вируса мы измеряли в исследуемых образцах антиген р24. Результаты представлены в таблице 4. Как следует из приведенных данных, пациенты с узкоспецифичной реактивностью к pi, pv, pvi, в основном, находились на стадии 2В (80%) или ЗА (13%) и только у одного пациента была установлена стадия ЗЕ. Измерение вирусного антигена в плазмах с этим типом реактивности показало положительный результат в 13% проб. Напротив, среди плазм, обладающих дополнительной реактивностью к PII РГП и PVII, антиген был выявлен в 12 образцах, что составило 63%. Клинический статус пациентов данной группы был различны^ причем относительное число пациентов на стадии 2В и больных С1ВД (ЗВ-4) различалось незначительно - 37 ir 26.5%. Анализ плазм; способных

Таблица 4.

Типы реактивности анти-уЗ антител у пациентов с различным клинически • статусом.

Рактивность к пептидам Изме Число проб рение р24 из них позитивных Стадия ВИЧ-инфекции

2В ЗА ЗБ ЗВ-4

Ч" 15 2(13*) 12(80%) 2(13%) 1(6%) 0

.р. 19 12(63%) 7(37%) 5(26%) 2(10%) 5(26%)

"РА" 14 10(71%) 0 3(21») 6(43%) 5(36%)

Всего: 48 22(46%) 19(40%) 10(21%) 9(19Г) 9(19%)

связываться с пептидом Р1V, показал, что уровень р24-позитив-ных проб в данной группе реактивности является максимальных (71%). Кроме того, как видно из таблицы 4, все плазмы, способные реагировать с пептидом Р1V, были получены от пациентов с вторичными проявлениями ВИЧ-инфекции.

Дополнительные доказательства изменения специфичности ан-ти-УЗ антител при прогрессировании ВИЧ-инфекции были получены при анализе плазм от одних и тех же пациентов, взятых в разные периоды от инфицирования и с разной скоростью прогрессии заболевания в указанные периоды. У пациентов с быстрой прогрессией заболевания происходит появление антител к пептидам, содержащим в 14 положении фенилаланин и увеличение относительной реактивности к ним, в то время как для пациентов с низкой скоростью прогрессирования заболевания за время наблюдения резких изменений в реактивности сывороток отмечено не было.

Таким образом при прогрессировании заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов по мере накопления новых вариантов ВИЧ-1 происходит,расширение спектра реактивности плазм по отношении к основной нейтрализующей детерминанте области 1/3 поверхностного гликопротеида др120.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из основных проблем при создании эффективных протри, вовирусных вакцинных препаратов является гипервариабедъюс*^; его генома, в частности основной нейтрализующей детерминанты -

бласти УЗ поверхностного гликопротеида. В связи с этим нами ыло предпринято изучение антител к этому эпитопу у пациентов различным характером течения ВИЧ-инфекции.

В качестве основной модели для проведения данного иссле-рвания были выбрана популяция ВИЧ-инфицированных пациентов, меющих единственный общий источник инфицирования.

Анализ аминокислотных последовательностей участка 1/3 р120 вариантов ВПЧ-1, циркулирующих в изученной популяции озволил выделить 7 основных структур, в пределах которых укалывается более 60% всех последовательностей. Эти последова-елькости были обнаружены практически у всех пациентов когортой популяции. В соответствии с ними были синтезированы 7 пеп-идов, на основе которых был разработан метод непрямого твер-;офазного ИФА для тестирования антител к 1/3. Синтезированные :ами пептиды обладают высокой специфичностью по отношению к бразцам когортной популяции в реакции ИФА Это обстоятельст-ю, по-видимому, позволяет использовать подобного рода ест-системы для анализа эпидемиологических цепочек.

Учитывая тот факт, что нами была собрана статистически начиная выборка плззм ВИЧ-инфицированных из популяции, имею-1ей единственный источник заражения, представляло интерес тон-ое картирование основной антигенной детерминанты 1/3. Было ус-'ановлзно, что для данной популяции основная антигенная детер-пшанта 1/3 расположена в пределах 14-21 аминокислоты и преде-■авляет собой последовательность ибРСЦАР.

Изучение спектров реактивности плазм у отдельных пациен-•ов позволило выделить три группы пациентов по характеру реак-'ивности с данными пептидами. В группе 1. объединены образцы |бразцы, которые способны реагировать только с пептидами, у ;отор -х в 14 полоязнии находятся лейцин или очень близкая к [ему аминокислота из о лейцин. Характерным признаком плазм груп-[ы г является способность узнавать пошило пептидов, содержащих 1 14 положении, лейцин или изолейцин, также и фенилаланин. 'руппу РА составляли сыворотки, которые реагировали со всеми [сследованными нами пептидами и даже с пептидом 4, несущим загону глицина 15 на аланин в структуре вРС.

Анализ реактивности сывороток с помощью метода конкурент-юго ИФА позволил установить, что расширение спектра реактив-юсти сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов связан с падением ¡пецифичности антител одного и того же класса. При этом, па->аллельно с расширением спектров реактивности происходило падение аффинности антител.

Таким образом на основании полученных данных о существовании корреляций между последовательностями области УЗ и реактивностью образцов плазы с одной стороны, а также нарастание вариабельности >/3 по мере прогрессирования заболевания с другой стороны, можно сделать следующее заключение. При прогрес-сировании заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов по мере накопления новых вариантов ВИЧ-1 происходит расширение спектра реактивности плазм по отношению к основной нейтрализующей детерминанте области УЗ поверхностного гликопротеида др120, которое обусловлено падением аффинности этих антител.

в ы В О д ы

1. На основе синтезированного набора тетрадекапептидов, гомологичных 10-23 а. о. области УЗ др120 вариантов ВИЧ-1, получивших распространение в внутриболъничных очагах ВИЧ-инфекции юга России, разработан лабораторный вариант тест-системы для определения антител к основной нейтрализующей детерминанте ВИЧ-1.

2. Основная антигенная детерминанта петли УЗ расположена в области последовательности [.бРвЧАРУ. Замены этих а. к. приводят к резкому снижению реактивности плазм. Следующие а. к., расположенные в (-Г) и (+1) положении от указанной последовательности, оказывают слабоэ влияние на реактивность плазм.

3. Анализ спектров антител к вариантам УЗ, получившим распространение в популяции ВИЧ - инфицированных лиц юга России, позволил выделить несколько групп реактивности установить наличие соответствия между реактивностью и последовательностями.

4. В плазмах ВИЧ-инфицированных лиц обнаружены антитела, способные узнавать пептиды, соответствующие области УЗ штаммов, циркулирующих в организме данного пациента.

5. Установлено, что в процессе прогрессировать ВИЧ-инфекции происходит снижение специфичности и падение аффинности анти-УЗ антител по отношению к консенсусному варианту для данной популяции.

Список публикаций по теме диссетрации

1. Казеь.юва ЕВ, Рнсанинова А-А., Бобков А. Ф., Бобков 11 Р.,Гараев И. Е "Метод ферментативной амплификации нуклеиновы кислот и его применение для изучения вирусных геномов." Сб науч. трудов "Методы исслед. в молек., общей и мед виру со л.", 1992г., с. 13-24

2. Garaev М. М., Chei ngsong-Popov R., Bobkov A., Callow V., Rzhaninova A. A. , Weber J. "Molecular characterization о the principal neutralizing determinant of HIV-I prevalent 1 Russia". International Symposium "100 Years of Virology" St.-Petersburg, 21-25 September 1992, P. 32-33

3. Garaev M., Chei ngsong-Popov R. , Bobkov A., Rzhaninova A., P'tman R., Weber J." V3 loop diversity In the cohort о patients with multiple trans- missions of HIV-I presuroabl originating from the same source".IXth Internet. Conference о AIDS. 1993. Berlin,Germany. Abst. P0-AII-OI85

4. Pokrovsky A., N. Fedyuk, M. Garaev, A. Rzhani nova, "Detection of HIV p24 antigen 1n sera of HIV-infected patient: from Russian Federation". /Eth Internat. Conference of AIDS, (14-15 June 1993), Vilnus .Abstract

5. Bobkov A., Garaev M., Chei ngsong-Popov R., Kaleebu C., Rzhaninova A., Weber J." Diversity of HIV-I envelope Vi domain: a study of the HIV -I epidemic In'the former Sovie Onion with different routes of transmission". IXth Internet. Conference on AIDS.1993. Berlin, Germany. Abst. PO-AlI-0184.

6. Chei ngsong-Popov R., Bobkov A. , Garaev M., Kaleebu

Callow p., Rzhaninova A. et al. -"Identification of.HIV-'.

iubtypes and their distribution in the former Soviet Union b; Serologic V3 binding assays and V3 analysis". Journal ot infectious Oeseases. 1993, v. 168, No 8, p. 292-297

7. Bobkov A.F., Garaev M. N., .Rzhaninova A. A. Pitman R., Weber J., Chei ngsong-Popov R. -"Mol ecul ar epidemiology of JIIV-I in the former Soviet Union : analysis of env V3 sequences and their correlation with epidemiologic data". 1994, AIDS, Vol.8, Ho5, P.619-624.

8. Сешлетов 11 A., Ржанинова A. A., Гараев M. M. -"Синтез и сравнительный анализ антигенной активности пептидов, соответствующих различным геномным последовательностям гипервариабельной области V3 поверхностного гликопротеида др 120 вируса иммунодефицита человека типа I". 1994, Биооргг ти зсная химия, т. 20, Нов,. стр. 18-23.