Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антитела к основной нейтрализующей детерминанте вируса иммунодефицита человека

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Антитела к основной нейтрализующей детерминанте вируса иммунодефицита человека"

Ьо ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Л Г< М"] '"НИИ ВИРУСОЛОГИИ км. ДЛЛВАНОВСКОГО

■>- и Цнк! •>*•• •

На пропах рукописи УЛК 578.828: [575.113.1+577.21]

РЖАНИНОВА Алла Анатольевна

антитела к основной нейтрализующей детерминанте вируса иммунодефицита человека

Специальность 03.00.06 - Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1994

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии научно-исследовательского института вирусологии ии.д.И.Ивановского РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

доктор биологических наук мм. гараев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

профессор, доктор медицинских наук В.Г. НЕСТЕРЕНКО локюр биологических наук со. вязов

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

Центральный институт эпидемиологии МЗ РФ

/Я ¿/¿£>МО Зашита диссертации состоится '-¿г-^ _1994 г.,

в '(М.' часов на заседании специализированного совета

л 001.20.01 при нии вирусологии им.д.и.ивановского рамн

по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи,1С.

С диссертацией можно ознакомиться в бибилнотеке НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Автореферат разослан "-•---1-1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник *. АМ. жуковский

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Вирус иммунодефицита человека типа I (ВИЧ-1) является одним из двух , идентифицированных к настоящему времени, возбудителей синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) - тяжелого расстройства иммунной системы, сопрововдакхцегося развитием вторичных инфекций и приводящего к летальному исходу.

Учитывая то обстоятельство, что распространение ЕИЧ-ин-фекции в мире приняло характер пандемии, изучение закономерностей изменчивости вирусного генома и роли этого явления в молекулярных механизмах вирусного патогенеза представляется актуальным и важным для решения фундаментальных проблем и задач практической медицины.

Хорош известно, что ВИЧ-1- в инфицированном организме индуцирует образование антител, которые обладают нейтрализующей активностью. Главный участок, против которого направлены эти антитела, расположен в гипервариабельном домене 43 белка др120 оболочки вируса. По данным литературы, практически у всех ВИЧ-инфицированных пациентов обнаруживаются антитела к основной нейтрализующей детерминанте. Однако, значение анти-УЗ антител для замедления развития патологического процесса до сих пор не ясно, поскольку их наличие не приводит к элиминации вируса из организма и, в конечном итоге не припятствует развитию СПИД хотя, несомненно, они являются одним из факторов, позволяющим пролонгировать бессимптомный период ВИЧ-инфекции.

Всвязи с этим, нам представляется крайне важным изучение вариантов структур области уз и особенностей формирования вирус-нейтралнз ующих антител у пациентов с различным характером течеьля ВИЧ-инфекции. Исследование динамики гуморального иммунного ответа к основным вирусным нейтрализующим эпитопам необходимо для разработки эффективных профилактических и лечебных вакцинных препаратов против СПИД создание которых является первоочередной задачей современной медицинской науки.

-2-

Цели и задачи исследования.

Ссновной целью настоящего исследования яеилось изучение характера антител к основной нейтрализующей антигенной детерминанте ЗИЧ-1 в популяции инфицироБанных. пациентов, имеющих общий источник заражения.

Необходимым условием достижения поставленной цели явилось решение следующих задач:

1. Получение набора синтетических олкгопептидов, гомологичных 10-23 а. о. области V3 gpI20 вариантов ВИЧ-I, получивших распространение в внутрибольничных очагах ВИЧ-инфекции юга России.

2. Разработка метода детекции антител к основной нейтрализующей детерминанте ВИЧ-I на основе синтезированных .пептидов, с помощью непрямого твердофазного ИФА.

3. Анализ спектров реактивности антител к вариантам v3, получившим распространение среди ВИЧ-инфицированных пациентов, внутрибольнг-ных очагов юга России.

4. Картирование антигенной детерминанты области петли V3 поверхностного гликопротеида gpI20 варианта ВИЧ-I, получившего распространение в когортной популяции инфицированных лиц юга России.

5. Изучение специфичности антител к области V3 вариантов ВИЧ-I, присутствующий у пациентов с различным характером течения ВИЧ-инфекции

6. Оценка активизации патологического процесса у инфицированных пациентов с использованием методов выявления вирусного. антигена р24 в составе иммунных комплексов. -

Научная новизна работы.

Впервые проведен анализ плазм крови большого массива пациентов, инфицированных ВИЧ-I из одного источника, на наличие антител к вариантам основного нейтрализующего эпитопа ВИЧ-1, получившим распространение в данной популяции. В качестве модели для проведения исследования были использованы материалы от ВИЧ-инфицированных лиц юга России.

Выявлены наиболее распространенные в данной популяции антигенные варианты области петли V3 gpI20 ВИЧ-I на основе определения нуклеотидных последовательностей непосредственно в лимфоцитах инфицированных лиц. Синтезированы тетрадекапептиды, гомологичные выявленным вариантам v3.

С использованием синтезированных пептидов разработан метод детекции антител к основной нейтрализующей детерминанте

ВИЧ-1 на основе непрямого твердофазного ИФА.

В результате анализа реактивности плазм крови ВИЧ-инфицированных пациентов к синтетическим уЗ-антигенам была локализована основная антигенная детерминантя петли уз в области последовательности ¡.бРйЦАУ. Замены этих а. о. приводят к резкому снижению реактивности плазм. Следующие а. о., расположенные в (-1) и (+1) положении от указанной последовательности, оказывают слабое влияние на реактивность плазм.

В плазмах ВИЧ-инфицированных лиц обнаружены антитела, способные узнавать пептиды, соответствующие области УЗ штаммов, циркулирующих в организме данного пациента.

Впервые на большом массиве плазм ВИЧ-инфицированных, имеющих общий источник заражения, проведен анализ динамики изменения спектров антител, который показал, что в начальный период вирусоносительства в крови инфицированных присутствуют антитела, обладающие высокой специфичностью по отношению к кон-сенсуской последовательности для этой популяции. В дальнейшем происходит расширение спектра узнавания УЗ-антигенов за счет кросс-реактивности антител и снижение их аффинности по отношению к консенсусному варианту.

Установлено, что при прогрессировании заболевания происходит не только нарастание вариабельности последовательностей, кодирующих область УЗ, но и увеличение общих различий с кон-сенсусной последовательностью.

Практическое значение работа Полученные в результате исследования данные могут бьггь использованы для создания специальных диагностических препаратов на основе синтетических пептидов для серотипирования вариантов ВИЧ-1, а также для изучения структуры антительного ответа ВИЧ-инфицированных лиц к гипервариабельным вирусным антигенам.

На защиту выносятся следующие положения:

I. Синтезирован набор олигопептидов, гомологичных 10-23 а. о. и 15-23 а. о. области УЗ др120 вариантов ВИЧ-1, получивших распространение во внутрибольничных очагах ВИЧ-инфекции юга России.

На основе синтезированных пептидов разработан лабораторный вариант тест-системы для определения антител к основной нейтрализующей детерминанте ВИЧ-1

3. Проведен анализ спектров реактивности антител к вариантам уЗ , получившим распространение в популяции ВЙЧ - инфицированных лиц юга России.

-44. Установлено, что основная антигенная детерминанта петли ¥3 расположена в области последовательности цвРерл. Замены этих а. к. приводят к резкому снижению реактивности плазм. Следующие а. к., расположенные в (-1) и (+1) положении от указанной последовательности, оказывают слабое влияние на реактивность плазм.

5. В плазмах ВИЧ-инфицированньК лиц обнаружены антитела, способные узнавать пептиды, соответствующие области УЗ штаммов, циркулирующих в организме данного пациента.

6. Установлено, что в процессе прогрессирования ВИЧ-инфекции происходит снижение аффинности анти-УЗ антител по отношению к консенсусному варианту для данной популяции.

Публикация результатов исследоьанич и апробация работы.

. По материалам диссертации опубликовано 8 работ. Результаты представлены на I х Международной конференции по СЩД {Берлин, 1993), Международном симпозиуме "100 лет вирусологии" (С.-Петербург, 1992), I Международной конференции по СПИД (Вильнюс, 1993).

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора лите-' рагуры, экспериментальной части, обсуждения результатов, заключения и выводов. Объем работы составляет страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 10 таблицами и 16 рисунками. Список литературы включает наименование.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Выбор популяций ВИЧ-инфицированных пациентов.

В качестве основных моделей для проведения данного исследования были выбраны две группы ВИЧ-инфицированных, которые различались по характеру эпидпроцесса.

Одна из них (когортная группа) - по данным эпидемиологического расследования и анализа нуклеотидных последовательностей вирусов, получивших распространение в этой популяции, имела единственный общий источник инфицирования и была сформирована в 1988-1989 годах за счет распространения ВИЧ-инфекции

среди детей, находившихся в стационарах Северо-Кавказского региона, Калмыкии, Астраханской и Волгоградской областей. Трансмиссия вируса в этой популяции осуществлялась за счет использования нестерильного медицинского инструментария при парентеральных процедурах. В результате распространения инфекции на Юге России было инфицировано около 250 человек, при этом основные очаги заболевания были расположены в детских стационарах Ростова-на-Дону и Элисты (Покровский и др., 1990, СЬепдвопд-Ророу е1 а1.,1992).

Вторая группа инфицированных (некогортная группа) ВИЧ-позитивные лица, проживающие в различных регионах СНГ. Основными источниками инфицирования этой группы явились ВИЧ-инфицированные иностранцы, преимущественно выходцы из африканских стран, при этом трансмиссия вируса осуществлялась за счет половых контактов. В работе использовались инфекционные материалы, собранные в период 1938 - 1993 годов. В результате проведенных работ создан банк плазм и сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов жителей СНГ, который включает 435 образцов от 263 ВИЧ-инфицированных лиц.

В настоящей работе были исследованы материалы от 59 пациентов, инфицированных ВИЧ-1 во виутриболиничньсс огачах ига России (Калмыкии и Северо-Кавказского региона) в период 1988-89 гг, а также от 37 ВИЧ- инфицированных лиц из Москвы, Белоруссии , одессы, Краснодарского края, Екатеринбурга. Среди пациентов юга России были исследованы 4 взрослых и 55 детей в возрасте 3-16 лет. По клиническому статусу 24 пациента находились в стадии 2В с генерализованной лимфаденопатией и гепа-тоспленомегалией, у 12 диагностирована стадия ЗА с гепатосп-леномегалией, кандидозом , частыми ОРВИ , пневмониями и другими заболеваниями, вызываемыми условно-патогенной микрофлорой. 12 и II детей, соответственно, находились в поздних стадиях ВИЧ-инфекции ЗБ и ЗВ-4 . Среди инфицированных некогортной группы исследованы плазмы от 31 взрослого и 5 детей, клинический статус которых не определяли.

Собранные материалы от ВИЧ-инфицированных лиц нозокоми-альных очагов юга России представляют собой уникальную модель для решения задач, поставленных перед настоящем исследованием в силу следующих обстоятельств: в этой популяции циркулирует единственный вариант ВИЧ-1; размер популяции ВИЧ-инфицированных (около 250 пациентов) обеспечивает создание панели плазм, которая представляет собой статистически достой ,-рнув выборку; в ранее проведенных в лабонто], и биотехнологии работах накоп-

лены Uöt:дашт ^ ----------

ВИЧ-I, циркулирующих в этой популяции.

2. Синтез олигопептидов, соответствующих участкам гипервариабельного домена V3 др120 штаммов ВИЧ-1, циркулирующих во виутрибольничных очагах юга России, и анализ их антигенной активности.

2.1 Выбор последовательностей для синтеза олигопептидов.

Ранее нчыи бьио показано, что в популяциях ВИЧ-инфицированных лиц нозокоииальных очагов юга России (так называемая "элистинская вспышка") получил распространение вариант ВИЧ-I с консенсусной последовательностью а. о. в области петли V3 gpI2tt ctrpnnntrksisigpgqafyttgei1 gdi rqahc (Chelngsong-Popov et а 1., 1993). При этом вариабельные позиции а.о. были отмечены в положения 13,14,18,20,22,25 и 32 (Нумерацию области V3 проводили, принимая за первую аминокислоту «-концевой цистеин в положении 296 штамма тв, как описано в статье Ratner et аТ., 1985). Особый интерес представляли замены в позициях 13, 14, 20 и 22, которые прилегали непосредственно к консервативному участку gpg и, по-видимому,. входят в состав основной нейтрализующей антигенной детерминанты v3.

Для анализа антител к v3 были синтезированы тетрадекапеп-тидк, гомологичные 10-23 а. о. последовательностей вариантов V3, обнаруживаемых в исследуемой популяции. Выбор этого участка был обусловлен двумя обстоятельствами. Во-первых, в его составе находится основная нейтрализующая детерминанта, которая была картирована в районе последовательности 61y-Pro-61y (Goudsmtt »t ab, 1988; Javaherian et al., 1989; Heloen et al., 1989;; во-вторых, около 70% всех замэн в.изучаемой популяции сосредоточено в этом районе. Проведенный нами анализ характера закон а.о. в этом участке V3 (Garaev et al., 1993) позволил установить, что основная масса вариантов (более 50% от общего числа последовательностей) представлена 7 вариантами . структура которые продемонстрированы в таблице I.

' Необходимо отметить, что приведенные варианты области V3 имеют широкое распространение среди пациентов изучаемой популяции, так как обнаруживаются у 91% ВИЧ-инфицированных лиц.

Таблица I.

Частота встречаемости вариантов 10-23 а. о. области ¥3, в популяциях ВИЧ инфицированных юга России *.

Номер V3 последовательности Структура Частота встр от общего числа последовательностей ечаемости, % от числа пациентов

I И m IV V VI VII 10 23 К SI SLGPGQAFYTT . I I I F I I I Г I î I I Г - - - - F A........ - - - I......... - - - R I......... - - - H F.....I - - - 23,2 29 ** 7,2 9 5,6 7 4,8 G 4,0 5 6,4 8 4,8 6 54.5 (12)*" 18,2 4 13.6 3 18,2 4 13,6 3 18,2 4 4,6 1

Примечение. *) - частоту встречаемости определяли как отношение числа последовательностей, соответствующих указанным УЗструктурам, к общему числу проанализированных последовательностей в изучаемой популяции.

**) - в скобках приведено абсолютное число последовательности гомологичных пептиду. Общее число последовательностей

***) - в скобках указано число пациентов у которых обнаружена последовательность, гомологичная пептиду. Общее число пациентов • 22.

2.2. Твердофазный синтез олигопептидов.

Пептида (Pl-PVIl), гомологичные наиболее распространенным вариантам V3 (i-vil) (табл.1), были синтезированы на твердой фазе вручную с использованием Вое /в -стратегии. В качестве носителя использовали хлорметилированную матрицу (тефлон с ра-диационно привитым полистиролом (potapov et al., 1979). Полученные пептиды были охарактеризованы методами тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, количественного аминокислотного анализа и определения удельных углов оптического вращения.

2.3. Разработка лабораторного варианта тест-системы для определения антител к области V3 gpI2Q ВИЧ-I на основе синтетических пептидов.

Для анализа реактивности плазм использовали метод непрямого ИФА с использованием синте- тгрованных пептидов. При отработке метода пептидного ИФА особое внимание было обращено на подбор концентрации пептида при сорбции, расчет значений cut off и выбору планшетов. Нами или опробованы различные варианты планшетов: полистироловыз "Costar", "Ltnbro", "Hune" и гибкие полихлорвиниловь» "Costar". Наилучшие результаты'были получены при использовании полихлорвиниловых планшетов флрмы

"Costar"(Cat. No 6695). Использование этих планшетов давало максимальное значение отношения ОП положительных и отрицательных плазм. Для подбора насыщающей концентрации антигена предварительные эксперименты были проведены с использованием пептида pt и панели из 22 плазм ВИЧ-инфицированных когортной популяции. Было установлено, что насыщающие концентрации пептида, использованного для сорбции составляют 1,25-2, 5 мкг на мл. Аналогичные эксперименты, проведенные с другими пептидами, дали близкие значения насыщающих концентраций. В качестве cut off было выбрано значение среднего арифметического для отрицательных плазм плюс три стандартных отклонения. Как правило, в наших экспериментах значение cut off не превышало 0,1 - 0,2 единиц ОП. Специфичность тест-системы, определенная на панели из 100 ВИЧ-1 негативных сывороток и плазм с использованием этого критерия составила 98%, что можно считать вполне удовлетворительным результатом, позволившим использовать эту тест-систе* ' для решения задач, поставленных перед настоящим-исследованием.

2. 4. Анализ реактивности панели ВИЧ I - позитивных плазм к синтетическим V3 пептидам.

На разработанном нами варианте лабораторной тест-системы был проанализирован спектр антител к 7 синтетическим УЗ-анти-генам у ВИЧ-инфицированных пациентов из внутрибольничных очагов юга России, а также в некогортной группе, включающей 37 ВИЧ - положительных плазм от пациентов из Москвы, Краснодарского края, Белоруссии, Одессы и др. регионов СНГ. Этот анализ показал высокую эффективность связывания синтетических пептидов с плазмами пациентов когортной группы и низкий уровень ре-активност.. образцов, полученных от эпидемиологически не связанных лиц (рис.1). В частности, для плазм когортной группы доля позитивных по отношению к pi составляет 100%, в то время как для пациентов некогортной группы только 18% (6 'пациентов из 37). Интересно отметить, что'.2 пациента (zln iikts) из некогортной группы имели схожие варианты последовательностей области V3 с пациентами из когортной группы, а для двух других не совсем ясна эпидемиология: не исключена их связь с пациентами из "элистинской вспышки". Таким образом, реальное число плазм пациентов некогортной группы, способных реагировать с пептидом pi, может быть еще меньше. Учитывая эти результаты, по-видимому, при эпидемиологических обследованиях использова-

100

40

р1 ри рш р1у ру ру1

Рис.1. Доля плазм, реагирующих с пептидами р1-руп в ко-гортной (а) и некогортной (Б) популяциях ВИЧ-инфицированных лиц. Число исследованных образцов составляло 70 для когортной популяции и 37 для некогортной.

ние разработанного наш варианта тест-системы ыожет быть полезно для предварительного серотипирования.

3. Картирование антигенной детерминанты области УЗ 6Р120 ВИЧ-1.

3.1. Определение положения антигенной детерминанты уз с помощи пептидов разной длины.

К моменту проведения настоящего исследования в литературе имелись экспериментальные д ные И компьютерные предсказания о наличие дополнительных эпитопов в области 8-14 аминокислотных остатков уЗ (мооге, 1991), Ввиду уникальности когбртной популяции ВИЧ-инфицированных юга России представляло интерес по-

пьггаться идентифицировать эти эпитопы. Однако, синтезированные нами пептиды были лишены этих последовательностей. Всвязи с этим мы воспользовались любезно предоставленными нам С. М. Андреевым пептидами, соответствующими 6-26, 10-26 а. о. консенсус-ной последовательности когортной группы, в структуре которых присутствовали предполагаемые эпитопы. При этом можно было ожидать существенного повышения уровня реактивности плазы когортной популяции к этим пептидам по сравнению с пептидом Р1.

Результаты сравнительного анализа показали, что уровень реактивности плазм не зависел от наличия дополнительных а. о. на м- и с-концах Р1 (рис.2). Такой результат может свидетельствовать либи об очень низкой концентрации антител к дополнительным последовательностям (в этом случав он должен составлять не более 10-20% от уровня реактивности к Р1), либо об отсутствии иммуногенной активности этих последовательностей. С другой стороны, укорочение пептида с н-конца до глицина в позиции 15, в- дящего в состав основной антигенной детерминанты, приводит к резкому падению числа образцов плазм пациентов когортной популяции, способных реагировать с пептидом (рис. 2).

Таким образом, район последовательности петли 1/3, определяющий характер взаимодействия с антителами расположен в пределах выбранного нами участка 10-23 а. о..

3. 2. Картирование эпитопа (/3 с помощью набора пептидов, гомологичных последовательностям маркерных вггаммов ВИЧ-1.

Для тонкого картирования основной антигенной детерминанты мы воспользовались анализом реактивности плазм когортной популяции с пептидами, соответствующими последовательностям УЗ маркерных штаммов NN. НА1, г2>, 2321 и гб (рис.3). Структура этих пептидов - позволяет достаточно подробно охарактеризовать значимость отдельных позиций УЗ для связывания' с • антителами. На основании такого анализа можно более точно локализовать положение основной нейтрализующей детерминанты в районе- последовательности ЮРбрАРУ.

Таким образом, антигенная значимость аминокислотных 'остатков падает при продвижении от центральной последовательности сред влево и вправо, при этом позиции -2 и +4 уже не оказывают влияния на реактивность плазм.

1 5 10 15 20 25 30 35

* • •' • • • • *

К/Е С 1 г р п п и 1 г к 1 8 L 0 Р 0 0 л Р У 1 1 е е 1 1 В (1 1 г Ч а Ь с

РУШ 0 Р 0 0 л Р У 1 1 3%

РХ • к в 1 в I. 0 Р в 0 л Р V 1 1 100% (N-70)

НМг-17 к в 1 Б I. 0 Р 0 0 л Р У 1 1 8 е 1 100% (N»70)

ИЫ-18 г к в 1 в Ь 0 Р 0 0 л Р У 1 1 в е 1 100% (N-15)

Р1Х 1 г к в 1 8 ь 0 Р 0 0 л Р У 1 1 8 е 1 100% (N»48)

Предполагаемый участок взаимодействия с полианнонаын

Доля позитивных плаэи

Рис. 2. Реактивность плазм пациентов когортной группы к УЗ пептидам различной длины. Индексам« слева обозначены: ЯД - консенсусная последовательность УЗ др!20 ВИЧ-1 для когортной популяции; Р1,Р¥Ш,Р1Х,N4-17,НМ-18 - соответствующие синтетические пептиды; N - число проанализированных образцов. Цифры над последовательностью - полохение соответствующих а. о.

10 15 20 25

« « * *

Я/Е Я К Б I $ 1 В р с ч А Р У т Т б Е 100, 0%

ин — Я - н -- - - я -- - - - К N 48, 0%

2321 — - - - — - - я -- р А - - N II, Ъ%

МАС - я в н г - - — - 1 - - - в N 48, 0%

16 - 0 - т р I - 1 — - 1 - - - Я Ц II, 5%

13 - 0 - - я I - - - К У - - А К - е 8, ОХ

ЭПИГГОП

Доля позитивных шизм (N=74)

Рис. 3. Реактивность плазы пациентов когортной группы к УЗ пептидам маркерных штаммов ШЧ-Т Индексами слева обозначены: ЯД - консенсусная последовательность УЗ др120 ВИЧ-1 для когортной популяции; Ж, 2321, НА, 26, гз - синтетические пептиды, соответствующие УЗ последовательностям маркерных «таимое, Н- число проанализированных образцов. Цифры над последовательности • полохение соот. .г-ствутрх а. о.

-123.3. Локализация области неспецифического взамодействия антител с v3 пептидами.

При анализе данных реактивности плазм с v3 пептидами маркерных штаммов обращает на себя внимание высокий уровень узнавания пептида hn (рис.3.). Сравнение последовательностей области основных антигенных детерминант пептида pi (lgpgqafy) и mn пептида (igpgrafy) обнаруживает существенное отличив в позиции 18 (замена Q—>r), которое должно приводить к резкому падению реактивности gpgq-специфичных иммуноглобулинов, то есть практически не узнаваться плазмами когортной популяции. Для объяснения такого поведения плазм было вцдвинуто предположение о наличие неспецифического связывания этого пептида с антителами, основанного на зарядовых взаимодействиях. Существенный вклад в формирование заряженной области пептида ми вносят остатки аргинина и лизина (рис.3).

Всвязи этим мы сравнили реактивность плазм когортной группы с пептидом hn и его модифицированным аналогом, ' который содержал ацильные остатки по эпсилон-аминогруппе лизина. .Реактивность плазм когорортной группы падала ниже значения cut off при использовании в реакции модифицированного пептида hn. Резкое падение было также отмечено и для случайной выборки нк-по-зитивных плазм некогортной группы. Высокий урогень узнавания пептида mn отмечался ранее в работах ряда авторов (Goudsntt et ab, I9SI), а также и нами (Chengsong-Popov et al.,1992). По-видимому, выводы о широком распространении вариантов hn-по-добных вирусов в популяциях ВИЧ-инфицированных Северной Америки и Европы, сделанные на основе серологического анализа, требуют дополнительной проверки с помощью методов прямого определения нуклеотидных последовательностей. Интересно отметить, что в случае аналогичных экспериментов с пептидом 91, который также содержал в положении 10 положительно заряженный лизин падение значений ОП, близкое к cut off было отмечено только для 10% плазм пациентов когортной группы.

Таким образом, неспецифическая реактивность плазм по от- • ношению к пептиду hn, по-видимому, объясняется наличием высокого положительного заряда.

4. Изучение специфичности антител к основной нейтрализующей детерминанте ВИЧ-1..

Как уже отмечалось выше, практически все исследуемые об-

разцы плазм пациентов когортной группы способны реагировать с пептидом р1 , являющимся гомологом 10-23 а. о. консенсусной последовательности области УЗ для данной популяции. Всвязи с этим ш воспользовались уровнем реактивности к р1, как мерой для измерения реактивности плазм по отношению к другим пептидам Для проведения таких экспериментов значения ОП для пептида р1 должны били находиться в линейной части кривой зависимости ОП от разведения плазмы. Поэтому в этих экспериментах разведения плазм подбирали таким образом, чтобы величина ОП для р1 лежала в пределах 0,8-1,5 и учет относительной реактивности каждой плазмы по отношению к пептидам р1-руш проводили на одном планшете.

4.1. Определение групп реактивности плазм по отношению к УЗ пептидам.

Анализ относительной реактивности плазм инфицированных пациентов когортной группы позволил разделить эти образцы на группы реактивности. Отнесение той или иной плазмы к данной группе определялось способностью связываться с одним из семи проанализированных нами пептидов. При этом I.лаз мы, способные узнавать пептид Р1У, который имеет максимальные различия с зпитопом консенсусного варианта, были способны реагировать и со всеми остальными, имеющими меньшие различия с пептидом с антигенной детерминантой р1. Графически отношения между выделенными Группами реактивностями представлены на рисунке 4. Множество плазм, реагирующих с пептидом р1у является собственным подмножеством плазм узнающих пептид рун, которое в свою очередь является подмножеством плазм с реактивностью к РШ и так далее. Иерархические взаимоотношения между группами образцов по их способности реагировать с различными пептидами можно записать следующим образом р1,ру,ру1< рп < рш< руп<р1у. Как видно, в этом ряду нарастают различия с консенсусным пептидом р1. На основании этих данных мы разделили анализируемые образцы на 3 группы: группу "1", (pi.pv.pvi), группу "е" (+рп.гл1, рун) и группу "ра" \,+р1у) (рис.4).

Высокий уровень корреляций между реактивностью плазм по отношению к указанным пептидам и строгая зависимость этой корреляции от Синонимичности замин в позиции 14, позволило выдвинуть предположение о существовании ограниченного числа типов антител, которые обеспечивают взаимодействие со зсеми 'пептидами за счет кросс-реактивности. Зсвязи с этим нами были прове-

-14-А.

500 400 300 200 ICO О

|Группа | ]Тнп реактивности | "L" | PI ,PV,PVI| PII 1 PIII 1 ■F* PII.PIII 1 1 PII.PIII,PVII| | •FA* | PIV |

| Пс типу реактив.| 1 1

| Число образцов | 16 | Ч I 4 15 < 1 и 1

| %от общего числа| 25,8 . 1 1<,5| 6,5 24,2 6,5 | 22,6|

| По группа« | | Число образцов | | "-гг общего числа[ 16 1 г 5.« | 32 51,6 1 1 1 - 1 14 | 22.61

Рис. 4. Профиль иымунореактивности для 53 ВИЧ-позитивных плазм с пептидами PI I, PI 11, PVII, PI V в твердофазном ИФА.

А. По оси абсцисс - порядковый номер плазму по оси ординат - относительная реактивность плазм к данному варианту пеп-; тида, взятая в % от величины ОП для Pl. Ь Те se данные в виде таблицы.

дены эксперименты по ' конкурентному ингибированию пептидами, находящимися в растворе, взаимодействия плазм с пептидом, сорбированным на твердой фазе.

4.2. Определение иммунологического перекреста в реактивности плазм по отношению к изучаемым пептидам.

Для проведения анализа были отобраны по две-три плазмы из каждой ранее описанных групп реактивности. На твердую фазу сорбировали пептид PI, соответствующий консенсусной последовательности изучаемого участка петли V3. Пептиды добавляли в концентрации 10,100,1000 и 10000 иг/мл к плазмам ВИЧ-инфицированных лиц. Реактивность с пептидом PI в отсутствии конкурента принимали за 100%. Результаты экспериментов приведены на рисунке 5.

Как видно из представленных данных, 50%-ные ингибирующие концентрации для пептидоь pv и рvi практически не отличаются от таковых для консенсусного варианта - пептида PI. Кроме того, необходимо отметить, что характер кривых ингибирования (угол наклона линейной части кривой) одинаков для pi, pv и pvi при рассмотрении каждой отдельной плазмы, однако, для разных пациентов этот показатель заметно различается. Сопоставление углов наклона кривых ингибирования связывания антитёл с пептидом PI представлено на отдельном графике (рис.6). Из представленного рисунка следует, что при анализе плазм пациентов, относящихся к группе реактивности "L", мы наблюдали быстрое падение кривых ингибирования. Напротив, углы наклона кривых ингибирования для плазм, относящихся к "F" и, "F А" группам реактивности имели более низкие значения.

Таким образом, реактивность к пептидам pi,pv, pvi, по-видимому, определяется одной группой антител; при этом замена лейцина на изолейцин в положении 14 не является существенной для эффективности связывания пептидов с антителами. Также, очевидно, малое влияние на связывание антител оказывает замена' серина на аргинин в 13-ой позиции, несмотря на существенные тг.зличия в химической природе радикала.

Наличие перекрестной реактивности в связывании ВИЧ-позитивных плазм с,пептидами pi,pn,pill,plv,pvii было также установлено методом конкуртного ИФА. На рисунке 5 представлены результаты экспериментов по подавлению связывания анти-УЗ антител с PI, сорбированным на твердой фазе, пептидами, содержащими фенилаланин в позиции 14. Как следует из приведенных кривых

А. vrnSIl -16Г. »

100 100

во во

60 60

40 40

----pvii

го V —ру 20

п \ —pi 0

1гШ0

«Ы01

100 100

ео 80

60 \ xv 60

40 40

—-pv1

20 -pv 20

0 —pi 0

io loo - îooo loooo

10 100 1000 ioooq

Рис.5. Конкурентное ингибирование связьшания с PI, сорбированный на твердой фазе, антител ВИЧ-инфицированных пациентов пептидами PV и P-V1 (а,б,в) и пептидами pu и Pill (г,д,е). На каждом графике, кроме того, приведена кривая ингибирования PI в качестве контроля.

Кодовые номера патентов указаны над соответствующим рисунком.

По оси абсцисс - концентрация конкурента в нг/мл; по оси ординат - уровень остаточной активности образца в К.

50

25

75

0

а

— lnc -ehr -beh

~Pch -ízd

СРП СгчЛ!»

Рис.6. Углы наклона кривых конкуренции PI для плазм ВИЧ-инфицированных пациентов когортной группы с разными тнпзмя реактивности антител: rzelCß, ízd509 - "L"; pchII4, bchI50 -"F"; 1 ne526, chrI46 - "FA". (На твердой фазе PI).

ингибирования, добавление даже в высоких концентрациях (да 10 исг/мл) пептидов РП шы Pill практически не оказывает влияние на связывание с PI плазм группы "L". С другой сторонн пептида PII и PI II эффективно подавляют связывание антител в плаз »их. пациентов остальных групп. Нгобходаш отметить, что тксвавху-ные эффекты подавления мы наблюдали у пациентов "FA" группы реактивности (рис. 5).

Иными словами, расширение спектра реактивности плазм происходит за счет появления низкоспецкфпчных антител, ' способных узнавать широкий набор пекгидрв с заиэнаин в 14 тагожевин.

Суммируя данные этого раздела исследований, изжно сделать вывод о том, что расширение спектра реактивности шшзм происходит за счет появления шпюспецифичных антителу сгособных узнавать широкий набор Y3 пгпгядов с заменами в 14 голвженки.

5. Антитела к основной нейтрализующей детершшгктв ВИЧ-1 у инфицированных лиц, находящихся на разных стадиях заболевания.

Скорость прогресспроЕания ЕИЧ-икфзхцил не одаакова у различных пациентов и, чах. известно, кгр.-ду с бьетрыи развитием симптомов заболевания у одной группы щфщцроватшх зщ, наблвдается длительное бессшштонное вирусоноснтедьстно у другой. Одним из факторов, позволяющим пролонгировать бессимнг©»-ный период ВИЧ-инфекции, является присутствие в крови вейтра-

лизуицих антител. Поскольку прогрессированна ВИЧ-инфекции сопровождается вирусемшши, для оценки активизации патологического процесса наш был использован метод определения антигена р24, как один ^з объективных показателей прогрессии ВИЧ-инфекции. Естественно, что при этой учитывались и клинические показания, а также данные лабораторных иммунологических анализов.

5.1. Изучение частоты возникновения вирусемии у ВИЧ-1 инфицированных лиц с известной структурой области \ГЗ.

Сопоставление клинического статуса с результатами определения антигена р24 у 78 ВИЧ-1 инфицированных лиц позволило выявить вираженнув корреляцию между наличием р24 антигена в плазме крови и клиническим статусом пациентов (табл.2). Воз-

Таблица 2.

Частота обнаружения р24 антигена в плазмах крови ВИЧ-инфицированных пациентов с различным клиническим статусом.

Клинический ciaiyc ва- емдов ОБ^ее число обследованных Количество пациентов с р24 антигеном X

Бессимиамкые вирусаносм iели 6 0 0

Лица с гемера-моовамшзй аич-(оадешпаппей 32 S 16

¡Бальные с проявлением СЭДД-ассо-"¡цшфпваииых огам-pjyuhcimuetxiu инфекций 32 16 50 .

Больные С1ЭД 8 б 75

Ихиго 78 27 34,6

¡растаыие частота обнаружения р24 антигена у больных в зависимости от стадии заболевания, по-видамому, связана с учащением шазнишовешш вируоешш при прогресснровании ВИЧ инфекции, как <&ыло атедаоmm в математической модели Новака (Nowak and ¡knien, ил, ЮЭ1} .

Таким образом, тестирование антигена р24 в крови ВИЧ инфицированных лиц с предварительным разрушением комплексов ан-1шв-зкгиш0 позволяет выявлять наличие вирусемии у 35Х пациенте д, прячем частота появления р24 в плазме нарастает по мере шригресшрования заболевания.

Поскольку появление р24 антигена является указанием на активную вирусную продукции мы провели его измерение при нескольких заборах крови, взятых в разное время, и сопоставили эти данные с последовательностями УЗ, которые бьши обнаружены у этих у пациентов (табл.3). Представленные результаты свидетельствуют, что у пациентов 1гк530, рсЬП4, Ь<1г537, ггпЮЗ, , к11<1545 й рV1537 при тестировании образцов плазм, взятых в течение 1,5 лет, р24 антиген ни в одном случае обнаружен не бьи.

Таблица 3.

Измерения антигена р24 в плазмах ВИЧ-инфицированных пациентов в динамике и их сопоставление со структурой антигенно значимого участка области УЗ.

Код Обнаружение р24 анти- Консеисгсная структура участка 10-23 а.о. области

пациента гена в динамике

время от первого забора УЗ ВИЧ-1, обнаруживаемых

мес «|ы у пациентов

0-2 1-5 6-9 10-14

1гк530 _ К515ССР60АРУТТ

ггтЮЗП - +/-

рсЫ 1 ♦ кЬс!545 : + -

Ь<1г537 • - _ - - - 11 I.........

РУ1538 - - - - - - I.........

Г7()107 + + - - - - Т.....1 - - -

1пс526 - + + + + ----ТА'-1.....

аЫЮ + + + ----РА........

дгЬ559 + + + + - - - - Г.....1 - - -

Из таблицы 3 видно, что консенсусные последовательности участка 10-23 а. о. области уЗ, определенные для этих пациентов, соответствуют структуре синтезированных нами пептидов Р1, РУ или РVI. Только в одном случае у пациента кьа545 с консенсусным вариантом, гомологичным пептиду Р1, обнаруживался р24 антиген, и у пгаЮЗ результат одного измерения бьи сомнительным (+/-)• Однако, следует отметить, что у пациента кЬс1545 присутствовала минорная последовательность, сильно отличающаяся по структуре от основного варианта. С другой стороны, при анализе плазм а1 VНО, 1пс526, гг<1107 и дгЬ559 обнаруживали практически постоянную антигенемикх Сопоставление этих данных со структурой фрагментов УЗ, обнаруживаемых у этих пациентов, показало, что у пациентов а1У110 и 1пс526 основной является последователь-

ность, соответствующая синтетическому пептиду рг у, а у п<1107 и дгЬ55Э консенсусный вариант был структурно гомологичен пептиду РШ (51 зяСРбОАЬУТТ). Видно, что для рассматриваемых последовательностей общей является аминокислотная замена I на г в положении 14 и, кроме того, согласно нашим ранее описанным данным, изменение Б(15) на А в составе основной детерминанты СРС, оказывается оказывается крайне существенным для связывания УЗ эпитопа с антителами.

Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что различная частота возникновения вирусомий у ВИЧ-1 инфицированных пациентов зависит от структуры а. к. последовательности области УЗ вирусов, циркулирующих в организме. Установлено, что появление последовательности А\с)РбЧА в составе анитегнной детерминанты у пациентов юга России сопровождалось длительными вирусгмиями в отличие от вариантов (i\igpgqa), для которых вероятность обнаружения вирусного антигена существенно ниже.

5.2. Изучение соответствия между специфичностью антител к УЗ эпитопу и первичной структурой аминокислотных последовательностей этой области, обнаруживаемых у изучаемых пациентов.

Одной из задач, стоящих перед настоящем исследованием, было изучение соответствия между специфичностью антител к УЗ эпитопу и первичной структурой аминокислотных последовательностей этой области др120 вариантов БИЧ-1, обнаруживаемых у изучаемых пациентов. Всвязи с этим мы провели сопоставление результатов иммунологического и структурного анализов (рис.7). На рисунке 7 в левой колонке приведены аминокислотные последовательности вариантов области УЗ, обнаруженных у ВИЧ-инфицированных пациентов, в правой колонке реактивность плазм по отношению к пептидам Р1-РУП. Анализ представленных данных позволяет сделать вывод о наличии высокого уровня соответствия между реактивностью плазм и последовательностями УЗ. Действительно, почти у всех изученных пациентов наличие после-доватея" 'остей, гомологичных структуре пептидов Р1-РУП свидетельствовало о присутствии у них антител, способных узнавать эти последовательности. Однако, при рассиэтрении обратной зависимости (то есть наличия последовательностей в зависимости от типа реактивности) мы не обнаружили однозначного соответствия. Среди вариантов структур УЗ, выявленных у пациента »1-1)529, не было обнаружено последовательностей, гомологичных

СОИ

игмЮЗ сон

КБНиРбдАРУТТ Число последовав ль ноете й

Р1

Р1

Профиль реактивности плзгч

2.0 1.8 ;.в 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

ягтоз

р1 р11 рш р1v ру ру1 рун

РУ1538 СОН

2 РУ I РУ* I Р1

ру153э

р1 р11 рш р1у ру ру1 рун

А

РСНП4 СОН.

-КР--ЙР--И--Н-

1.0

3 0.9

Р1 0.8

2 РШ 0.7

I РШ* 0.6

I 0.5

0.4

I 0.3

I 0.2

0.1

0.0

р1 р11 рш р1у ру ру1 рун

Л1 УНО

сои

2 Р1V

2 РП I

3

2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 О.в 0.6 0.4

о.г о.о

Р> Р11 р))) р1у ру ру] рун

1т526 С 04

—м-СА-

-I —

914

РП

р| рп рш р1у ру ру1 рун

Рис.7. Соответствие между специфичностью антител к УЗ эпитопу и первичной структурой а. к. последовательностей этой области, обнаруживуемых у пациентов.

Кодовые номера пациентов указаны над соответствующим рисунком.

Слева - последовательности УЗ, обнаруживуеыых у данного пациента. Сверху приведена консенсусная последовательность области УЗ (10-23 а. о.) для когортной группы. Совпадающие а. о. показаны "-". Число справа указывает на количество совпадающих последовательностей. Первая строка после шифра пациента - консенсусная последовательность для данного пациента.

(О - обозначены последовательности, не соответствующие пептидам Р1-рVII.

Справа - профиль реактивности плазм к пептидам Р1-Р¥П. По оси ординат - нормированные по отношению к Р1 значения ОП реактивности плазм (*).

связываться с этими шштидим. ипол^*«»-»**«... л—„—------

ружена .нами для препаратов, полученных от пациентов ech5I3, 1nc526, al vIIO, odnlCH, shsI02. Эти результату по-видиюиу, могут отражать либо малое число проанализированных v3 последр-вательностэй, либо наличие широкой кросс-реахтивностн ан-ти-УЗ-антител, что было продемонстрировано нами в предадуяэй главе.

, Таким образом, в крови ВИЧ-инфицированных присутствует антитела, способные взаимодействовать с вариантами области «3 вирусов, циркулирующих в данный момент в организме инфицированного.

5.3. Связь между типом реактивности плаз к по отношении к V3 пептидам и стадией заболевания.

Учитывая тот фзкт, что существует хорошая корреляция между последовательностями области »3 и реактивностью образцов плазм с одной стороны, а также нарастание вариабельности »3 по мере прогрессировзния заболевания с другой стороны; быта надвинуто предположение о связи типа реактивности плазм по отношению к УЗ пептидам и стадией заболевания.

Для проверки этого предположения мы сопоставили давнж иммунологического анализа с клиническим статуса я и результатами анализа р24 антигена для 48 образцов плазм пациентов юга России, находящихся на разных стадиях ИЯ-иифекция. Среди исследованных плазм 19 (402) была получены от лиц с лшфадзтпз-тией (стадия 2В), у 10 пациентов была установлена стадо* ЗА (2IX), a 9(I9X) и 10(20*) находились на стадиях ВИЖ-ияфекщш ЗБ и с 3-4, соответственно. Для оценки наличия активной продукция вируса мы измеряли в исследуеных образцах антиген р24- Etesyaibr-таты представлены в таблице 4. Как следует га приведенных дзи-ных, пациенты с узкоспецифячной реактивностью к PI, Pi, PtfJ, в основное находились на стада» 2В (80S) или ЗА (13%) и толыЬ у одного пациента была установлена стадия 35. Измерен® вирусного антигена в плззнах с этик тшюи реактизетсга показала положительный результат в 13* щиб. Напротив, среди гпззм; обладающих дополнительной реажствнзстыэ к Pit phi к P*ii„ анпяген бьш выявлен в 12 образцах, что составило 63&. Клинический статус пациентов данной группы быя различные причвн отЕпситель-ное число пациентов на стадии 23 и больных СШЩ (33-4) различалось незначительно - 37 к 2S. 5Z. Анализ шизм; стассбгах

Таблица 4.

Типы реактивности анти-уЗ антител у пациентов с различным клинически • статусом.

Рактивность к пептидам Изме Число проб рение р24 из них позитивных Стадия ВИЧ-инфекции

28 ЗА ЗБ 38-4

Ч* 15 2(1 ЗХ) 12(801) 2(13«) К61Ч 0

'Г 19 12(63*) 7(374 5(26«) 2(104 5(26 X)

'ТА' 14 10(71«) 0 3(2!«) 6(43«) 5(36%)

Всего: 4В 22(461) 19(40«) 10(21«) 9(19%) 9(19«)

связываться с пептидом Р1V. показал, что уровень р24-пазитявных проб в данной группе реактивности является максимальным (71%). Кроме того, как видно из таблицы 4, все плазмы, способныв реагировать с пептидом р1v, были получены от пациентов с вторичными проявлениями ВИЧ-инфекции.

Дополнительные доказательства изменения специфичности ан-ти-уЗ антител при прогрессировашш ВИЧ-инфекции были получены при анализе плазм от одних и тех же пациентов, взятых в разные периоды от инфицирования и с разной скоростью прогрессии заболевания в указанные периоды. У пациентов с быстрой прогрессией заболевания происходит появление антител к пептидам, содержащим в 14 положении фенилалашш и увеличение относительной реактивности к ним, в то время как для пациентов с низкой скоростью прогрессировашш заболевания за время наблвдения резких изменений в реактивности сывороток отмечено не было.

Таким образом при прогрессировашш заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов по мере накопления новых вариантов БИЧ-1 происходит.расширение спектра реактивности плазм по отношению к основной нейтрализующей детерминанте области уз поверхностей) гликопротеида дрХ20.

заключение

Одной из основных проблем при создании аффективных проти-, вовирусных вакцинных препаратов является гипервариабе.^ьнчсъ-,' его генома, в частности основной нейтрализующей детерминанты -

области УЗ поверхностного гликопротеида. В связи с этим нами было предпринято изучение антител к этому эпитопу у пациентов с различным характером течения ВИЧ-инфекции.

В качестве основной модели для проведения данного исследования были выбрана популяция ВИЧ-инфицированных пациентов, имеющих единственный общий источник инфицирования.

Анализ аминокислотных последовательностей участка уЗ др1?.0 вариантов ВИЧ-1, циркулирующих в изученной популяции позволил выделить 7 основных структур, в пределах которых укладывается более 60% всех последовательностей. Эти последовательности были обнаружены практически у всех пациентов когорт-ной популяции. В соответствии с ними были синтезированы 7 пептидов, на основе которых был разработан метод непрямого твердофазного ИФА для тестирования антител к уз. Синтезированные нами пептиды обладают высокой специфичностью по отношению к образцам когортной популяции в реакции ИФА. Это обстоятельство* по-видимому, позволяет использовать подобного рода тест-системы для анализа эпидемиологических цепочек.

Учитывая тот факт, что нами была собрана статистически значимая выборка плззм ЕИЧ-инфицировакных из популяции, имеющей единственный источник заражения, представляло интерес тонкое картирование основной антигенной детерминанты уЗ. Было установлено, что для данной популяции основная антигенная детерминанта V3 расположена в пределах 14-21 аминокислоты и представляет собой последовательность ССРСРДР.

Изучение спектров реактивности плазм у отдельных пациентов позволило выделить три группы пациентов по характеру реактивности с данными пептидами. В группе I объединены образцы образцы, которые способны реагировать только с пептидами, у кото^ х в 14 полохзнии находятся лейцин или очень близкая к нему амшгакислотз изолейцик. Характерным признаком плазм группы V язляется способность узназать помимо пептидов, содержащих в 14 положении лейцин или изолекцин, также и фенилаланин. Группу РА составляли сыворотки, которые реагировали со всеми исследованными нами пептидами и даже с пептидом 4, несущим закону глицина 15 на аланян в структуре аре.

Анализ реактивности сывороток с помощью метода конкурентного ИФА позволил установить, что расширена спектра реактивности сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов связан с падением специфичности антител одного и того же класса. При этом, параллельно с расширением спектров реактивности происходило падение аффинности антител.

Таким образом на основании полученных данных о существовании корреляций между последовательностями области УЗ и реактивностью образцов плазм с одной стороны, а также нарастание вариабельности /3 по мере прогрессирования заболевания с другой стороны, можно сделать следующее заключение. При прогрес-сировании заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов по мере накопления новых вариантов ВИЧ-1 происходит расширение спектра реактивности плазм по отношению к основной нейтрализующей детерминанте области УЗ поверхностного гликопротеида др120, которое обусловлено падением аффинности этих антител.

ВЫВОДЫ

1. На основе синтезированного набора тетрадекапептидов, гомологичных 10-23 а. о. области УЗ др120 вариантов ВИЧ-1, получивших распространение в внутрибольничных очагах ВИЧ-инфекции юга России, разработан лабораторный вариант тест-системы для определения гнгител к основной нейтрализующей детерминанте ВИЧ-1.

2. Основная антигенная детерминанта петли УЗ расположена в области последовательности 1.6Р6(ЗАРУ. Замены этих а. к. приводят к резкому снижению реактивности плазм. Следующие а. к., расположенные в (-1) и (+1) положении от указанной последовательности, оказывают слабое влияние на реактивность плазм.

3. Анализ спектров антител к вариантам УЗ, получившим распространение в популяции ВИЧ - инфицированных лиц юга России, позволил выделить несколько групп реактивности установить наличие соответствия между реактивностью и последовательностями.

4. В плазмах ВИЧ-инфицированных лиц обнаружены антитела, способные узнавать пептиды, соответствующие области УЗ штам-

" мов, циркулирующих в организме данного пациента.

5. Установлено, что в процессе прогрессирования- ВИЧ-инфекции происходит снижение специфичности и падение аффинности анти-УЗ антител по отношению к консенсусному варианту для данной гопуляции.

Список публикаций по теме диссетрации

1. Казеь.юва Е Е , Ржанинова А. А., Бобков А. Ф., Бобкова М. Р., Гараев М. М. "Метод ферментативной амплификации нуклеиновых кислот и его применение для изучения вирусных геномов." Сб. науч. трудов "Методы исслед. в молек., общей и мед. виру-сол. ",1992г., с. 13-24

2. Garaev К. Н., Chei ngsong-Popov R., Bobkov A., Callow D., Rzhaninova A. A. , Weber J. "Molecular characterization of the principal neutralizing determinant of HIV-I prevalent in Russia". International Symposium "100 Years of Virology". St.-Petersburg, 21-25 September 1992, P. 32-33

3. Garaev M., Chei ngsong-Popov R., Bobkov A., Rzhaninova A., Pitman R., Weber 0." V3loop diversity in the cohort of patients with multiple trans- missions of HIV-I presumably Originating from the same source".IXth Internat. Conference on AIDS. 1993. Berlin, Germany. Abst. PO-aII-0185

4. Pokrovsky A., N.Fedyuk, M. Garaev, A. ftzhani nova. "Detection of HIV p24 antigen in sera of HIV-infected patients from Russian Federation". Ath Internat. Conference of AIDS, (14-15 June 1993), Vilnus .Abstract

5. Bobkov A., Garaev M., Chei ngsong-Popov R., Kaleebu P., Rzhaninova A., Weber 0." Olversity of HIV-I envelope V3 domain: a study of the HIV -I epidemic in'the former Soviet Union with different routes of transmission". IXth Internat. Conference on AIDS.I993. Berl i n, Germany. Abst. PO-AlI-0184.

6. Chei ngsong-Popov R., Bobkov A., Garaev N., Kaleebu P., Callow D., Rzhaninova A. et al. -"Identification of..HIV-I subtypes and their distribution 1n the former Soviet Union by ierologlc V3 binding assays and V3 analysis". Journal of infectious Deseases. 1993, v. 168, No 8, p. 292-297

7. Bobkov A.F., Garaev M. M., .Rzhaninova A. A. Pitman R., Weber J., Cheingsong-Popov R.-"Molecular epidemiology of ];IV-I in the former Soviet Union : analysis of env V3 sequences and their correlation with epidemiologic data". 1994, AIDS, Vol.8, Ho5, P. 619-624.

8. Семилетов 1й A., Ржанинова А. А., Гараев M. M. -"Синтез и сравнительный анализ антигенной активности пептидов, соответствующих различным геномным последовательностям гипервариабельной области v3 поверхностного гликопротеида др 120 ви-

• руса иммунодефицита человека типа I". 1994, Биооргг m .¡екая химия, т. 20^ N08, стр. 18-23.