Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1

Карпенко, Лариса Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1"

На правах рукописи

003064568

Карпенко Лариса Ивановна

ПОЛИЭПИТОПНЫЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИРУСА ГЕПАТИТА В И ВИЧ-1

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 3 АВГ 2007

Кольцово - 2007

003064568

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор А.А. Ильичев

Официальные оппоненты доктор биологических наук Е.В. Дейнеко доктор медицинских наук И. А. Орловская доктор биологических наук А.Б. Беклемишев

Ведущая организация

Государственный научный центр Институт иммунологии Федеральное медико биологическое агентство России, г. Москва

Защита состоится « 2 » ноября, 2007 года в _9 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел.(383)336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « /О » Сьб-Ща^и^ 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Э.Г. Малыгин

Актуальность проблемы

Вакцинация является одним из наиболее эффективных методов борьбы с инфекционными заболеваниями человека и животных. Современная система вакцинации является решающим фактором снижения детской смертности, увеличения продолжительности и улучшения качества жизни всех возрастных групп населения. По данным ВОЗ, вакцины ежегодно спасают жизнь 3 млн. детей. Количество созданных вакцин против инфекций постоянно растет. За последние 30 лет оно увеличилось в два раза. В настоящее время на разных стадиях экспериментальной разработки и клинических испытаний находятся вакцины, направленные на профилактику более 60-ти видов заболеваний.

В 1798 г. Эдвард Дженнер впервые опубликовал сведения о применении про-тивооспенной вакцины. Он обнаружил, что люди, получившие прививку вирусом коровьей оспы, приобрели невосприимчивость к оспе натуральной. Э. Дженнер назвал данную процедуру вакцинацией. Это был первый случай применения вакцины для предотвращения развития заболевания. Применение вакцинации началось спустя столетие, благодаря блестящим работам Пастера. Успех иммунизации основывается на одной главной идее: у человека имеются специфические иммунологические механизмы, которые могут быть запрограммированы на защиту организма от возбудителей инфекционных заболеваний. Стимуляция иммунных механизмов осуществляется посредством прямого введения инфекционных агентов или их частей в форме вакцины. Несмотря на несомненную пользу используемых вакцин, они могут вызывать сенсибилизацию организма, содержат большой набор антигенов, среди которых могут встречаться и перекрестно реагирующие с антигенами человека, вызывают большую нагрузку на иммунную систему, реактогенны, токсичны и т. п.

Поскольку все без исключения используемые вакцины (отечественные и зарубежные) не лишены недостатков и нуждаются в дальнейшем совершенствовании [Медуницын, 2004], современная вакцинология стремится к созданию более совершенных вакцин, которые должны быть эффективны, безопасны и не иметь побочных свойств. Повышение требований к безвредности и чистоте препаратов стимулировало не только совершенствование традиционной вакцинологии, но и создание нового поколения искусственных вакцин: субъединичных, рекомби-нантных, антиидиотипических, ДНК-вакцин, съедобных вакцин и др. Необходимость разработки новых вакцин связана также с решением проблемы борьбы с еще не побежденными инфекциями. Среди них особую тревогу вызывают вирусные гепатиты и СПИД, они относятся к числу наиболее социально значимых инфекций.

По данным ВОЗ вирусным гепатитом В больны, инфицированы или переболели более 2 миллиардов человек (30% населения мира). Ежегодно в мире от этой инфекции умирает около 750 тыс. человек. Широкая распространенность гепатита В связана и с тем, что из общего числа первично инфицированных до 10% заболевших становятся хроническими носителями вируса. Всего в мире насчитывается более 350 миллионов хронически инфицированных. Применение дрожжевой рекомбинантной вакцины на основе HBsAg позволило снизить заболеваемость гепатитом В в несколько раз [Ni et al., 2001; Da Villa et al., 1998]. Однако, эта вакцина, широко применяемая в настоящее время, не лишена ряда недостатков. Основной из них - низкая иммуногенность вакцины. Так, для достижения длительного протективного ответа требуется трехкратная вакцинация. Кроме того, у

10% людей вообще не развивается сероконверсия после стандартной схемы вакцинации [Carman et al., 2000; Не et al, 2001]. Существенным недостатком существующей инъекционной формы вакцины на основе HBsAg является также то, что она не стимулирует мукозальный иммунный ответ и не обеспечивает резистентность у входных ворот инфекции, и это при том, что в последние годы быстро растет доля непарентерального пути передачи вируса [Arima et al., 2003; Mikhailov et al., 2002]. Наконец, вакцина на основе HBsAg не обеспечивает формирования полноценного клеточного иммунного ответа, который необходим для обеспечения более эффективной защиты организма от вируса. Клеточное звено иммунитета особенно важно для предотвращения хронизации вирусной инфекции. Было установлено, что при вирусной инфекции клеточный ответ иммунной системы возникает не на HBsAg, а на коровый белок вируса (HBcAg), причем величина ответа имеет существенное значение для исхода заболевания [Lohr et al., 1993; Missale et al., 1993; Chisari, 2000]. Применение активной иммунизации HBcAg в терапевтических целях может уменьшить риск развития хронической инфекции и будет полезно при лечении хронических больных.

Первые случаи СПИДа были описаны в 1981 г. С тех пор, несмотря на сани-тарно-просветительские меры и появление лекарственных препаратов, эпидемия ВИЧ/СПИДа продолжает распространяться. Сейчас ее скорость составляет 15 000 новых случаев инфекции ежедневно. Со времени регистрации первых случаев болезни более 67 млн. человек были инфицированы и более 25 млн. уже умерло. Особенность СПИДа состоит в том, что в процессе ВИЧ-инфекции не образуется протекгивного иммунитета, способного привести к выздоровлению, и поэтому в данном случае для создания вакцин невозможно использовать живой аттенуиро-ванный вирус.

В таких случаях становится все более очевидно, что пастеровские принципы исчерпали себя и необходимы новые подходы, основанные на последних достижениях современной биологии.

Один из наиболее перспективных подходов связан к созданием вакцин на основе специально отобранных В- и Т-клеточных эпитопов, которые содержат только необходимые для формирования специфического иммунитета фрагменты вирусных белков. Основной недостаток таких искусственных вакцин - их низкая иммуногенность. Поэтому очень важно правильно выбрать средства доставки антигенного материала, которые обеспечат запуск нужных механизмов гуморального, клеточного и мукозального звеньев иммунитета.

В нашей работе мы использовали подход, в основу которого заложен принцип объединения в одной конструкции оптимально подобранных вирусных эпитопов для создания искусственных иммуногенов ВИЧ-1 и гепатита В. В качестве средств доставки для разработанных иммуногенов использовали вирусоподобные частицы и аттенуированные штаммы сальмонелл.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы была разработка экспериментальных вакцин против вируса гепатита В и ВИЧ-1, способов представления их иммунной системе и оценка специфической активности созданных препаратов.

В связи с целью исследования необходимо было решить следующие задачи: 1. Исследовать потенциал корового белка вируса гепатита В (HBcAg) в качестве носителя эпитопов чужеродных белков. Выбрать оптимальное место

встройки чужеродных эпитопов, решить проблему самосборки химерных молекул корового белка.

2. Получить экспериментальную вакцину против гепатита В на основе химерного HBcAg, несущего основные иммуногенные области HBsAg: основной иммуногенный эпитоп "а", районы preSl и preS2. Исследовать специфическую активность созданных конструкций.

3. Оценить иммунный ответ при мукозальной иммунизации экспериментальных животных аттенуированными штаммами сальмонелл, продуцирующими HBcAg и штаммами, несущими ДНК-вакцину против гепатита В.

4. Исследовать возможности доставки полиэпитопного белка TBI с помощью вирусоподобных частиц (ВПЧ) и рекомбинантных штаммов сальмонелл.

5. Исследовать возможности доставки ДНК-вакцины, кодирующей ген TCI с помощью ВПЧ и аттенуированных штаммов сальмонелл.

6. Исследовать специфическую активность экспериментальной вакцины Ком-биВИЧвак (инъекционная форма).

7. Исследовать специфическую активность экспериментальной вакцины против ВИЧ-1 Сал-ВИЧ "Д" (суппозиторная форма).

Научная новизна и практическая значимость работы

Продемонстрированы новые возможности HBcAg как носителя чужеродных антигенных детерминант.

Впервые получен набор химерных частиц HBcAg, несущих эпитопы preSl, preS2 и основной эпитоп "а" поверхностного белка вируса гепатита В, и исследованы иммуногенные свойства полученных конструкций

Впервые предложен и разработан метод получения мозаичных вирусоподобных частиц на основе HBcAg с использованием системы векторов, обеспечивающих одновременный синтез химерного и нативного корового белка вируса гепатита В в одной бактериальной клетке.

Впервые показано, что при ректальной иммунизации рекомбинантный штамм сальмонеллы, несущий вирусный антиген в формате ДНК-вакцины, эффективно стимулирует вирусспецифический иммунный ответ. Это продемонстрировано на примере химерных антигенов ВГВ и ВИЧ-1 с использованием аттенуированных штаммов Salmonella enteritidis Е-23 и Salmonella typhimurium SL 7207.

Впервые предложена суппозиторная форма для перректальной иммунизации, обеспечивающая сохранность живых бактериальных клеток, и на ее основе создана экспериментальная вакцина против ВИЧ-1 - Сал-ВИЧ "Д". Доклинические испытания экспериментальных серий вакцины показали, что Сал-ВИЧ "Д" индуцирует ВИЧ-специфический гуморальный и клеточный. Вакцина не вызывает негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.

Впервые продемонстрирована эффективность доставки полиэпитопного антигена TBI в виде вирусоподобных частиц, сконструированных на основе реопо-лиглюкина. Показано, что представление иммунной системе белка TBI в составе ВПЧ способствует пролонгации иммунного ответа на белок TBI и вызывает адъювантный эффект, сравнимый с эффектом, вызываемым введением полного адъюванта Фрейнда.

Предложен новый подход конструирования вакцин против вирусов, основанный на объединении в одной конструкции двух иммуногенов: один в виде

белка, другой в виде ДНК вакцины. На основе данного подхода создана экспериментальная вакцина против ВИЧ-1 - КомбиВИЧвак (инъекционная форма). Доклинические испытания экспериментальных серий вакцины показали, что КомбиВИЧвак индуцирует ВИЧ-специфический гуморальный и клеточный ответ. Вакцина не вызывает негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.

Вакцины Сал-ВИЧ "Д" и КомбиВИЧвак и их компоненты защищены патентами РФ. Оформлена НТД на вышеуказанные вакцины, проведена предварительная регистрация в Министерстве здравоохранения и социального развития РФ. В настоящее время вышеперечисленные вакцины находятся на экспертизе в ГИСК им. JI.A. Тарасевича.

Положения, выносимые на защиту:

1. Область основной антигенной детерминанты cl корового белка вируса гепатита В (HBcAg) является перспективной для встроек чужеродных эпитопов.

2. Определенные физико-химические свойства пептидов (гидрофобность, объем и склонность к образованию ß-структур), встраиваемых в область cl, оказывают влияние на способность химерного HBcAg к самосборке.

3. Техника получения мозаичных структур или введение фланкирующих цис-теинов во встраиваемый пептид позволяет нивелировать отрицательное влияние встроек на самосборку химерных белков, получаемых на основе HBcAg.

4. HBcAg может выступать носителем имитаторов чужеродных вирусных эпитопов.

5. Химерные коровые белки HBcAg-HBs, HBc-preSl и HBc-preS2 собираются в вирусоподобные частицы, обладают антигенностью ВГВ, индуцируют синтез антител к встроенным эпитопам и формируют в организме животных клеточный иммунный ответ, сравнимый с ответом на HBcAg.

6. Рекомбинантный аттенуированный штамм Salmonella enteritidis E-23/pKHBc, продуцирующий HBcAg при ректальной иммунизации мышей линии Balb/c стимулирует как системный, так и мукозальный иммунный ответ к HBcAg.

7. ДНК-вакцина, содержащая ген HBcAg, индуцирует гуморальный иммунный ответ и клеточное звено иммунитета.

8. Искусственные вирусоподобные частицы (ВПЧ), полученные на основе рео-полиглюкина и экспонирующие на своей поверхности полиэпитопный белок GST-TBI, обладают высокой иммуногенностью.

9. Рекомбинантные штаммы S.typhimurium 7207/pGEX-TBI и S. enteritidis E23/pGEX-TBI, продуцирующие белок TBI, индуцируют системный и мукозальный иммунный ответ против ВИЧ-1 при перректальной иммунизации лабораторных животных

10. Интенсивность клеточного и гуморального ответов возрастает в ряду: "голая" ДНК вакцина, ДНК вакцина в составе ВПЧ (ВПЧ-pcDNA-TCI), рекомбинантная сальмонелла S.typhimurium 7207/pcDNA-TCI.

11. Экспериментальные вакцины КомбиВИЧвак и Сал-ВИЧ "Д" индуцируют ВИЧ-специфический гуморальный и клеточный ответ. Вакцины не вызывают негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.

Апробация работы и публикации

Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: Международные конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", 1999-2002г., Санкт-Петербург, Россия; "John Humphrey advanced summer programme in immunology", 1998, 2000, 2002, 2004, Pushino, Russia; "DNA vaccines", 2002, Edinburg, UK; "International Congress of Virology" 1996, 2002; "Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов", 2004г., Томск, Россия; "International symposium on HIV and emerging infectious diseases", 2004, France; "Russian-German workshop on infection and immunity - tools and strategies for novel vaccines", 2005, Germany; "New approaches to vaccine development, 2005, Germany; "Вакцинология 2006", Москва и на других конференциях.

Работа выполнена в 1993-2006 годах в ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзо-ра в рамках научных тем организации и по грантам государственных научно-технических программ "Новейшие методы биоинженерии", "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел: Защита от патогенов", по Федеральной Государственной программе "Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего". На разных этапах ее выполнения в ней приняли участие Т. А. Веремейко и Н. А. Некрасова, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ. По материалам диссертации опубликовано 43 статьи, получено 10 патентов Российской Федерации.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из 7 разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы". Работа изложена на 257 страницах машинописного текста и включает 46 рисунков, 13 таблиц. Библиография представлена 446 источниками отечественных и зарубежных авторов.

Основное содержание работы

Глава 1. HBcAg в качестве носителя чужеродных эпитопов

Коровый белок вируса гепатита В (HBcAg) является весьма перспективным носителем для встройки чужеродных пептидных последовательностей благодаря его уникальным физико-химическим и иммунологическим свойствам. HBcAg состоит из идентичных белковых субъединиц размером 21 кД, которые обладают способностью самоорганизовываться в вирусоподобную частицу [Crouther et al., 1994]. Привлекательность НВс-белка заключается, во-первых, в его способности к высокому уровню продукции и правильной самосборке в ко-ровые частицы природной формы в различных системах экспрессии; во-вторых, HBcAg обладает высокой иммуногенностыо и свойствами как Т-зависимого, так и Т-независимого иммуногена [Schodel et al., 1994\. НВс-белок, как носитель, имеет достаточно высокую емкость для встройки чужеродных последовательностей [Pumpens et al., 2001].

Выбор в белке-носителе района, подходящего для встройки вируснейтрали-зующего эпитопа, является критическим моментом в создании химерных капси-

дов НВсА£. Подходящие для встроек районы HBcAg должны быть экспонированы на поверхности частицы и находиться в антигенно-активной области. При встройке в этот район чужеродных пептидов не должна нарушаться сборка белка-носителя.

В первых работах, посвященных использованию HBcAg в качестве носителя эпитопов, встройки осуществлялись в или С-концевые районы белка [РишрепБ е1 а/., 1995]. Исследование иммуногенности таких химерных частиц показало, что антигенность и иммуногенность чужеродных эпитопов, внедренных в С- и Т^-конец НВсАд, были значительно ниже, чем у носителя (НВсАд). По-видимому, этот связано с недостаточной экспонированностью И- и С-конца на поверхности корового белка.

Более высокой экспонированности чужеродных эпитопов можно достигнуть путем встройки целевых пептидов в иммунодоминантный район HBcAg, который включает эпитоп с1 (основная детерминанта HBcAg) и образует неструктурированную петлю в области 73-94 а. о.

Для встройки эпитопов во внутреннюю петлю ранее [Карпенко Л.И., 1993] был создан вектор внедрения, в котором с помощью олигонуклеотиднаправлен-ного мутагенеза был организован уникальный рестрикционный сайт Хко\ в гене С. Другими авторами были получены вектора внедрения, содержащие рестрик-ционные сайты в позициях, соответствующих 75-й, 78-й, 82-й и 83-й а.о. HBcAg [РитрепБ е/ а1, 2001]. В эти сайты были осуществлены встройки различных пептидов, в том числе эпитопы поверхностного антигена вируса гепатита В, рино-вируса человека, вируса иммунодефицита человека, вируса иммунодефицита обезьян и др.[Карпенко и др., 2000]. Как показали дальнейшие исследования, иммунодоминантный район HBcAg обеспечивал лучшую экспонированность встроек и их доступность для соответствующих антител.

Однако, не все встройки оказываются безобидными для структуры белка-носителя. Так, например, встройка эпитопов РМБУ и ВЭЛ в HBcAg приводила к нарушению правильного фолдинга белка и потере его способности к сборке. Гибридные белки в этих случаях были нерастворимы и обнаруживались только во фракции дебриса. Одной из причин такого сильного изменения свойств гибридного белка, возможно, явилось то, что конформация чужеродных эпитопов не позволяла белку самоорганизоваваться в частицу при высокой плотности упаковки субъединиц НВсАя.

1.1. Анализ физико-химических параметров встроек в НВсАд

Столкнувшись с проблемой нарушения структуры HBcAg при встройке в него различных чужеродных эпитопов, мы решили проанализировать причины таких структурных изменений белка. Представлялось очевидным, что сохранение или утрата способности химерного HBcAg к сборке зависит от физико-химических свойств аминокислотных остатков, входящих в состав встраиваемого чужеродного пептида. Для использования HBcAg как универсального носителя чужеродных эпитопов была бы полезна разработка алгоритма, позволяющего предсказать организацию химерного HBcAg до получения желаемой конструкции. Для анализа физико-химических свойств встроек была сформирована база данных встроек в основную антигенную детерминанту HBcAg и последствий таких встроек. Часть ранее неопубликованных данных по отрицательным встройкам была любезно предоставлена нам другими исследователями.

Анализ аминокислотных последовательностей встроек проводили с использованием программы ProAnalyst [Eroshkin ci al.. 1995], а также программы SALIX и QSARPro [И в пни с en ко и Ерошкин, 1997]. С ПОМОЩЬЮ указанных программ определялись корреляции между физико-химически ми характеристиками встроек и способностью химерных fíe л кои к сборке. Для полноты исследования был взят широкий набор физико-химических свойств аминокислот: свойства Бо-гардта (гидрофобность, объем и полярность) [Bogardt et al., 1980], структурные параметры Чоу-Фасмша (склонность аминокислот к образованию сх-спиралсй, ß-структур, |]-поворотое) [Chou and Pasman, 1978J, зарад и др. Физико-химические характеристики встроек рассчитывались путем усреднения свойств а.о., входящих » анализируем ые последовательности. Физико-химичсс кпе параметры рассчитывались на 7, на 14 аминокислот с С конна пептидной встройки и на всю длину вставки. В результате были выявлены параметры, влияющие на способность белка формировать вирусоподобные частицы.

При анализе полных длин встроек, высокой корреляции между жизнеспособностью и физико-химическими характеристиками аминокислот, входящих в состав встраиваемых фрагментов, выявлено не было. Значения коэффициента корреляции, в наибольшей степени отличающихся от нуля, располагались в интервале от -0.36 до -0.42 с уровнями доверия, превышающими 90-95%. Физико-химическими характеристиками, с использованием которых были получены данные значения, являлись индекс ß-структуры, гидрофобность и объем аминокислот, Химерные частицы HBcAg, содержащие встройки с высокими значениями данных показателей, как правило, оказывались отрицательными.

Максимальная корреляция была выявлена при анализе фрагментов для С-концсвых участков встроек (длиной 7 а. о. с С-конца.). Среди всех найденных корреляций наиболее статистически значимыми, превышающими 99% порог доверия, оказались индексы ß-структуры (R=-0,G3), гидрофобность (R=-0,59) и объем (R=~0,55), что согласуется с корреляциями, наблюдаемыми для полных Последовательностей. Сходным был и характер выявленных связей (см. рис. I ): с ростом указанных параметров жизнеспособность химерных белков понижалась.

<S8¿ о8 3=8

..................

0.5 1,0 1,5 Индекс р-структу ры

Рис. 1. Анализ физико-химических параметров аминокислотных последовательностей встроек в основную атятенную детерминанту НВсАд

О встрой к позволяющие химерному бедку собираться в частицы, О встройки, нарушающие самосборку химерных белков

Исходя из наших результатов, можно рекомендовать при встраивании чужеродных пептидов в состав НВеА^, проводить предварительный анализ фши-

Í 9 8

l^XU.........U.„L,iJ

3(1 i 8 -16 S4 62 та

^yO O

......... ..............................I

20 28 35 44 52 60

Объем

Гидрофобность

ко-химических свойств пептидов-кандидатов в противовирусные вакцины. Если существует возможность выбора, предпочтение следует отдавать пептиду, имеющему более низкие параметры гидрофобности, объема а.о. и индекса р-структуры. В случае, когда пептид обладает хорошими иммунологическими свойствами, но не соответствует разработанным нами параметрам жизнеспособности, необходимо искать другие подходы.

1.2. Методические подходы решения проблемы сборки химерных частиц HBcAg

Процесс сборки HBcAg начинается с образования димеров корового белка, которые впоследствии самоорганизуются в вирусоподобные частицы [СгоШЬег е/ а1., 1994]. Кроме того, предполагается, что участок основной антигенной детерминанты HBcAg (аминокислотные остатки 76-87) представляет собой петлю. Вероятность образования полноценных димеров (в случае высокой гидрофобности встраиваемого пептида) можно повысить путем создания мозаичных частиц, которые содержат как субъединицы со встроенным чужеродным эпитопом, так и нативные субъединицы кора. В этом случае тенденция к вхождению в область контакта будет присуща только петлевому участку субъединицы, несущей вставку, поскольку петля нативного корового белка гидрофильна.

Для экспериментальной проверки данной гипотезы был выбран отрицательный эпитоп белка УР1 вируса ящура (РМОУ). Согласно нашим расчетам, пептид УР1 УЕЕ имеет высокую среднюю гидрофобность, что, по-видимому, и является причиной неспособности химерного белка HBcAg-FMDV к самосборке. С целью получения мозаичных капсидов мы разработали бинарную векторную систему, принципиальная схема которой представлена на рис. 2.

ген С с фрагментом гена белка FMDV (200-209) VP1FMDV

ген С дикого типа

Встройка в плазмидный вектор

Встройка в фаговый вектор

Одновременная экспрессия экспрессия в Е. coli

экспрессия в Е. cali в одних и тех же клетках ■

♦ £. coli J оО

Q 4

несобранные

мозаичные

нативные частицы HBcAg

Рис. 2. Схема конструирования мозаичных частиц HBcAg

В данной системе плазмидный вектор обеспечивает продукцию в клетках Е. coli химерного HBcAg, а вектор на основе нитевидного бактериофага М13НВс -после инфекции им тех же клеток - продукцию исходного HBcAg без встройки. Инфицирование бактериофагом М13НВс рекомбинантных клеток Е. coli, несущих плазмиду pKHBc-FMDV, приводило к появлению химерных мозаичных частиц, обладающих антигенностью как HBcAg, так и FMDV. Т.о., в результате одновременной экспрессии двух генов в одной клетке Е. coli удалось получить жизнеспособные мозаичные частицы, обладающие антигенностью как HBcAg, так и FMDV.

Другим возможным путем решения проблемы самосборки химерного HBcAg является введение фланкирующих цистеинов в целевой пептид, который предполагается встроить в коровый белок. К этому заключению мы пришли, анализируя ряд встроек. Так, пептид из иммунодоминантного района HBsAg (ICTKPTDGNCS) и пептид gp36 ВИЧ-2 (CNSWGCAFRQVCS), несмотря на «неблагоприятные» исходные физико-химические свойства, не нарушали сборку HBcAg.

С помощью масс-спектрометрии триптического гидролизата химерных белков как при обработке ДТТ, так и без восстановления мы показали, что SH-группы (83 и 90) в искомом пептиде находятся не в свободном состоянии, а образуют дисульфидную связь. Очевидно, подобная петлевидная структура, фиксированная дисульфидным мостиком, не нарушает естественную конформацию HBcAg, благодаря чему химерные молекулы не теряют способности к самосборке. Это позволяет нам рекомендовать фланкирование цистеинами чужеродных пептидов, предназначенных для встройки в HBcAg.

Презентация эпптопов ВИЧ на поверхности HBcAg

HBcAg перспективен в качестве носителя эпитопов ВИЧ-1 для создания соответствующих профилактических и терапевтических вакцин, поскольку HBcAg не только обеспечивает высокий иммунный ответ на встроенные пептиды, но и, по данным Милича с соавт. [Milich et al., 1997], является Т-независимым иммуно-геном. В нашей работе HBcAg был использован для презентации имитаторов антигенных детерминант ВИЧ, отобранных с помощью техники фагового дисплея (Табл.1).

Таблица X.

Последовательности эпитопов и имитаторов ВИЧ-1

№ Последовательность встройки Источник встройки

1 LEDPISCNSWGCAFRQVCSRDL gp36 ВИЧ-2

2 LEDPISIELLELDKWASLWNSRDL Эпитоп ВИЧ-1, узнаваемый МКА 2F5

3 LEDPISRDWSFDRWSLSEFWLSRDL Пептид-имитатор, узнаваемый МКА 2F5

4 LEDPISIGRSFLDRWSKVPRDPSRDL Пептид-имитатор, узнаваемый МКА 2F5

Полученные рекомбинантные белки, содержащие пептидр-эпитопы i, 2, 3 и 4, были охарактеризованы с помощью иммуноблотинга с МКА к HBcAg и МКА 2F5 к ВИЧ-1 (рис. 14). Показано, что вес химерные белки реагируют с МКА к HBcAg (рис. 3 "а"), а их электрофоретическая подвижность соответствует расчетной молекулярной массе (т.е., примерно на 1 Кд больше, чем исходный ) llíc/vg").

Для Исследования антигенности нативного 2Р5-зпитопа и его пептидных имитаторов в составе HBcAg использовали МКА 2F5. На рис. 3"б" представлен результат специфичного взаимодействуя лизатов Ecoli, продуцирующих каши конструкции, с монокдональными антителами 2F5. MICA активно связываются с исходным эпитопом ( ELL.ELDK W A S L W N ) ВИЧ-I, и одним из пегттидон-имитаторов (IGRSFLDR WS K.VPRPP S). Второй лепт ид-имитатор (RPWSFDRWSLSEFWLS), представленный в составе HBcAg, слабее взаимодействовал с moiюклопальными антителами 2F5. В то же время, будучи депонированным в составе нитчатого бактериофага, этот пептид-имитатор эффективно связывался с МКА 2F5 в И ФА, а при иммунизации лабораторных животных стимулировал образован не антител, способных нейтрализовать лабораторный штамм ВИЧ-1 [Туманова и др., 2003]. Менее эффективное связывания пептида* имитатора с МКА 2F5 в составе HBcAg, возможно, связано с его коиформанионными особенностями.

а о

12 3 4 5 6 12 3 456

21 кД -

Рис. 3. Иммуноблоттилг с использованием МКА к I IBcAg (а) и МКА 2F5 (б). Hei дорож-4V./. ttöHfcfceHbi разделенные с помощью S1 > ' ' лиэаÎ:.: рскогиб^шаитных кле-

ток E.coït, продуцирующих следующие белки:

!} ¡¡тошный HBcAg: 2) НВс со встрой кий пептида №1; 3) HB с со встройкой пептида №2; 4) НВс со встройкой пептид:! №3; 5) НВс со кстройкой пептида №4: 6} контроль лизат клеток Е. coli без гшачмщщ.

Таким образом, химерные капсиды НВсАз с экспонированными па их поверхности эпитоиамн инфекционных агентов, пространственная организация которых соответствует нативной и обеспечивает- адекватный защитный ответ, обладают очевидным преимуществом перед, традиционными методами создания им-муногенов. Для встройки в ПBcAg можно использовать не только линейные антигенные детерминанты, но и их имитаторы, мимикрирующие конформационные детерминанты и детерминанты, формируемые углеводными структурами, образующимися путем гдикозилировання а.о. в вирусных белках. Такие имитаторы Можно отбирать с помощью техники фагового дисплея.

Глава 2. Кандидатные вакцины на основе химерные белков HBcAg, несущих эпитопы HBsAg, preSl и preS2

Вакцина против гепатита В, основанная на использовании рекомбинантного HBsAg, позволила значительно снизить ежегодную Заболеваемость вирусным гс-патитом [Da Villa е( а!, 1998; iij el ai, 2001]. Тем не менее дрожжевая вакцина, применяемая сегодня, имеет ряд недостатков. Она обладает низкой иммуногенно-сгыо, слабо индуцирует цитотоксический ответ, пе способна индуцировать муко-зальный иммунный ответ. Коропый белок ВГВ (HBcAg) является гораздо более сильным иммуногеном, чем HBsAg [Milich et ai, 1987] и при этом способен стимулировать усиление иммунного ответа к поверхностному белку ВГВ. Поэтому было иесьма интересно объединить HBcAg с основными иммуногенными районами 1 IBsAg, preSl и prcS2, способными усиливать протективныЙ иммунный ответ к ВГВ.

На основании литературных данных по картированию и исследованию протективнш; евойстн фрагментов районов поверхностное белка ВГВ быт выбраны наиболее иммупогешше эпитопы для встройки в HBcAg. Это основной иммуногенный 'зпитоп "а" (137-147) HBsAg (ICTKPTDGNCS); фрагменты района pi eS | серотипа ayw (27-37 а.о.) н района prcS2 (131-145 а.о.):

27 37 131 145

dhqldpafran lqdprvrglyfpagg

Для получения бактериальных продуцентов химерных белков проводили конструирование плазмид с помощью стандартных методик. Для работы были использованы плазмиДы pKHBç и pUH Вс. с коп стр у ированн ые автором. Варианты Плазм ид рК.НВс и pUHBc, несущих ген HBcAg, со встройками фрагментов, кодирующих чужеродные эпитопы, получали путем клонирования синтетических олнгонуклеотидов с Использованием сайта рестрикции Х/ю 1. Продукция химерных белков в штаммах D115ctF', несущих плазмиды pUCSMBc-pj'cS], pUC8HBc-preS2 и pUCSHBc-l IBs составила5-10% от суммарного клеточного белка. На рис. 4 представлен электрофорез лизатов клеток полученных штаммов и иммуноблотинг с МКА к N-копцу молекулы HBcAg. л

Рис. 4. л. Элестрофорез лизатов клеток Е.coli r 15% 11ААГ Б. ИммукоблоТивГ белков после разделения в 15% ПАЛГ

б® КД С моноклонапьиыми анти селами к N

концу белка НГЗс. На дорожках:

45 кД

24 кД

Маркер молекулярной массы (18, 24,45 И 66 кД) Очищенный НВсАй Лизат клеток Е.соИ, продуцирующих белок НВс-ргеЭ! Лизат клеток Е.соК, продуцирующих белок МВс-рге52 Лизат клеток Е.соИ, продуцирующих белок МПс-КВа Лизат клеток Е.соИ

Для анализа организации молекул химерных белков препараты исследовали с помочило электронной микроскопии. Было обнаружено, что белки HBc-HBs и ИВс-preSl собираются в частицы, по размеру и морфологии подобные наги 8H ому HBcAg (рис. 5 А, Б, В). Белок HBc-preS2, выделенный из клеточного дебриеа, формировал большие частицы неправильной формы, превышающие размерами

нагивные частицы в несколько pay (рис. 5 Г).

Это свидетельствует о том, что данная встройка нарушает структуру белка, тем не менее, полученный белок также формирует большой поли-э питанный антиген. И мм у ноэ лек-тронная микроскопия белка HBc-HBs с использованием МКА к эпигону (137-147) а.о. ¡IBsAg меченных коллоидным золотом, показала, что химерные частицы, сформированные из полипе] ггн да HBcAg-HBs, взаимодействуют с МКА к HBsAg, а частицы HBcAg не взаимодействуют с этими МКА. Это свидетельствует о том, что зшггоп (137-147) а.о. HBsAg экспонирован па поверхности гибридной коровой частицы и представлен л антиген ио-активном виде.

Ряс. 5- Электронная микрофотография частиц НВсЛ^ (А) и химерных частиц I ИЗсЛц-ргеЙ I (Ь). ПВсА^-НВе (В), НВсДе,-|ЯХ'32 (Г). Негативное контрастирование уранил ацетатом.

Исследование иммуногенносги химерных частиц НПсА^

Для оценки иммуногеннасти полученных химерных белков проводили внутримышечную иммунизацию мышей линии ВАЬВ/с очищенными индивидуальными белками НВс-рге81 и НВс-ргеХ2 или НЙсА§, дезой 5 мкг. Сыворотки животных забирали на 28-й день после начала иммунизации и анализировали в ИФА. В качестве антигенов на планшеты сорбировали химерные? белки НВс-ргеЭ!, НВс-рге52, HBcAg. Результаты анализа представлены на рис. б. [401-

аНВс ^HBc-prcS 1 HIIBc-preS2

я 11е

иммунширо-

НВс

Н Вс-огеЯ 1 НВе-

Рис. 6. Оценка гуморального иммунного ответа ттогле од но-кратной иммунизации химерным» белками НВс-ргей!, НПс-рге52 и белком I ГПсАу В качестве антигена ДЛЯ ИФА били 1тспол1.зова-ньг очишеиньте реком-бинангныебелки НВсАд, НВс-ргеЗ! и НВс-ргеБЗ.

Из представленных результатов видно, что гуморальный иммунный ответ к химерным белкам НВс-preSl и HBc-prcS2 у мышей при однократной иммунизации остается близким к ответу, стимулированному исходным белком HBcAg. При этом иммунный отвег на сам носитель, HBcAg, п составе Химерных белков значительно ниже, чем на

химерный белок. Таким образом, эпитопы, встроенные в основную антигенную детерминанту HBcAg, уменьшают высокую антигенность белка-носителя HBcAg и стимулируют синтез антител против встроенных последовательностей.

Для оценки иммунного ответа непосредственно на внедренные в HBcAg последовательности из района ргеБ, сыворотки иммунизированных мышей анализировали с использованием синтетических пептидов с последовательностями встроенных эпитопов (рис. 7). Из рис. 7 видно, что иммунизация гибридными белками НВс-ргеБ1 и НВс-ргеБ2 стимулирует синтез антител, специфичных соответствующим пептидам. Антитела к пептиду рге81 появляются уже при однократной иммунизации химерным белком НВс-ргс31. При иммунизации мышей с адъюван-том Фрейнда обратный титр антител, специфично узнающих пептид рге81, увеличивается. В сыворотках мышей, иммунизированных белком НВс-рге82, обратный титр антител к пептиду ргс82 был ниже.

Возможно, этот факт может быть следствием различной иммуногенности эпитопов ргс51 и ргс82 или разной аффинностью антител, индуцированных иммунизацией этими белками. Вероятна и различная степень экспонирования встроенных эпитопов на поверхности белков НВс-ргеЗ 1 и НВс-рге82.

СЮ 405 нм А

■ НВс-рге82

- НВс-ргеБ 1 не

_ иммунизированные мыши

_1 ПЗс-ргеЭ 1

с адюъвантом Фрейнда

НВс-рге52 |— с адъвантом фрейнда

не иммунизированные

1/200 1/400 1/800 1/1600

Разведения сыворотки Рис. 7. Оценка гуморального иммунного ответа после однократной иммунизации (А) и трехкратной с адъювантом Фрейнда (Б). В качестве антигена для ИФА были использованы синтетические пептиды: ШСДОРАЕКАК (27-38 a-o.pre.Sl) [^ОРЯУКОЬУГРАСО (131-145 а.о. ргеБ2)

выяснить, повлияло ли внедрение чужеродных эпитопов в структуру HBcAg на способность этого иммуногена стимулировать клеточный иммунный ответ.

Изменения, вносимые в последовательность HBcAg при встройках чужеродных эпитопов, кроме уменьшения собственной анти-генности белка, могут повлиять и на другие параметры иммунного ответа, стимулируемого HBcAg. Следует отметить, что HBcAg является сильным индуктором Т-клеточного звена иммунитета, и данное качество может быть очень полезно для использования HBcAg или его химерных аналогов в качестве кандидата для терапевтических ГВ вакцин. Поэтому, было необходимо

Клеточный ответ с цен и пали по выявлению И л-2-проду пирующих лимфоцитов методом ЕиЗроГ у мышей линии ВАЬВ/с, иммунизированных белками НВсЛ§. НВс-НВй, НВс-ргс5 ] и НВс-рге52 (в/м, двукратно, 5 м к г/ж и в от не с). Полученные результаты показали (Рис. 8), что при индукции сплеиоцитов химерными белками, количество лимфоцитов, продуцирующих И л-2, увеличивается незначительно. Однако, индукция HBcAg лимфоцитов, мышей, иммунизированных химерными белками, увеличивает количество Ил-2 синтезирующих: клеток так же

Иммунизация НВеА£

Иммунизация НВе-Рге51

I [с иммунизированный мыши

1 2 Срок после второй иммунизации (недели)

Иммунизация НВс-ргс52

400

I 2

Срок после второй иммунизации (недели)

Иммунизация НВс-ЙШ

X ш 350 -

1 2 я 300 -

с В о 250 -

о Е ¡Е и с 200 -

ъ а и 150 -

я § "о 100

г>| 50 -

I 2

Срок после второй иммунизации (недели)

I 2

Срок после второй иммунизация (недели)

?цс- 8. Оценка количества етиещщнтоъ, продуцирующих Мл-! у мышей иммунизированных НВсЛй, ПВс-ргеХ I, [1Ве-ргеЯ2,1 !Вс-НВ\ Спленоциты стимулировали белками: В-НВс-рге5, НВс-рге82;

КЗ-НВс-ИВк, ОШ - ТВ1, ■ - без стимуляции.

эффективно, как и в группе мышей, иммунизированных НВсА.ё;. Вое исследованные вакцинные конструкции способны индуцировать специфический клеточный ответ у Иммунизированных животных также эффективно, как и катанный НВсА§, Следовательно, внедрение встроек в основную антигенную детерминанту значительно ие повлияло на способность химерных 11ВсА§ стимулировать клеточный иммунный ответ.

Т.о., сконструированные химерные белки HBc-preSl, HBc-preS2 стимулируют синтез антител к встроенным эпитопам. Встройки эпитопов в химерных белках HBc-preSl, HBc-preS2 и HBc-HBs существенно не повлияли на способность белков стимулировать клеточный иммунный ответ. Полученные результаты дают основание полагать, что сконструированные химерные белки HBcAg с эпи-топами поверхностного белка могут быть использованы в качестве компонентов вакцины против гепатита В.

Доставка HBcAg с помощью аттенуированного штамма сальмонеллы S. еп-teriditis Е-23

Известно, что вирус гепатита В проникает в организм хозяина двумя путями: парентеральным и через поврежденную слизистую орального, генитального или ректального тракта. Соответственно, эффективные вакцины против HBV должны стимулировать как общий, так и секреторный иммунитет. Для создания канди-датной вакцины, способной стимулировать мукозальное звено иммунного ответа к ВГВ, нами был получен аттенуированный штамм сальмонеллы, продуцирующий HBcAg. Штаммы сальмонелл представляют интерес в связи с возможностью непарентерального способа введения сконструированных на их основе вакцин, способностью активно индуцировать клеточное, гуморальное и секреторное звенья иммунитета, способствуя развитию резистентности у входных ворот инфекции [Schodel and Curtiss R 3r, 1995; Stocker, 2000].

Аттенуированный штамм S. enteriditis Е-23 был получен в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова и любезно предоставлен нам академиком A.A. Воробьевым и проф. М.Н. Бойченко. Данный штамм несет мутации в генах суа и сгр. На мышах, телятах и обезьянах было показано, что патогенность этого штамма снижена в 100 тыс. раз по сравнению с родительским штаммом при сохранении инвазивной активности [Рыжова и Бойченко, 1997]. ЛД5оДЛЯ штамма S. enteritidis Е-23 ЛД50- Ю7КОЕ (при внутрибрюшинном введении мышам).

В результате трансформации клеток S. enteritidis Е-23 плазмидой рКНВс был получен рекомбинантный штамм, обеспечивающий конститутивный синтез HBcAg. Для оценки иммуногенных свойств рекомбинантных штаммов сальмонелл проводили иммунизацию мышей линии BALB/c. Животным вводили пер-ректально по 108 клеток S. enteritidis Е-23, несущих плазмиду рКНВс. Ни у одной из мышей этой линии не было обнаружено признаков патологии или заболевания в течение эксперимента. В качестве отрицательного контроля использовали исходный штамм сальмонеллы, не содержащий рКНВс.

Сыворотку животных брали через 2, 3 и 4 недели после начала иммунизации и определяли количество специфических антител к HBcAg. На диаграмме (рис. 9 А) представлены результаты по определению специфических антител в сыворотке иммунизированных животных. Как следует из представленных данных, однократная перректальная иммунизация мышей S. enteritidis Е-23, продуцирующим HBcAg, приводила к появлению в сыворотке мышей антител к HBcAg.

Для анализа мукозального иммунного ответа было проведено исследование наличия антител IgA в смывах тонкого кишечника (рис. 9 Б). Полученные данные свидетельствуют о том, что происходит синтез специфических антител клас-

са и, следовательно, штамм Л' еШ&ШЖй Е-23/рК! I Вс стимулирует мукозаль-иый иммунный ответ к I ШсА§.

Т.о., результаты исследования иммуногенности штаммов епш-иШз Н-23, продуцирующего HBcAg, продемонетрпровали, что данный штамм при введении животным индуцируют специфический системный и мукозальный иммунный ответ к НВсА§.

□- S. entert tidhiрКНВ с ■- S enteritidy (control)

2 3 4

срок после иммунизации (недели)

Рте. 9 Оценка гуморального иммунного ответа у мышей, иммунизированных S.&tteritidis Н23/КНВс. Антитела, специфичные IIBcAg класса IgG в сыворотке животных (А), и антитела, специфичные HBcAg класса IgA в смывах, кишечника (Б).

Конструирование и исследование им му но генных свойств ДНК- в акции ьи несущей ген HBcAg

Большое количество исследований подтверждает, что именно недостаточность цитотоксического иммунного ответа к норовому белку HBV обуславливает хронизацию заболевания ГВ. Одним из современных подходов к усилению клеточного звена иммунитета при вакцинации является применение ДНК-вакцин. Было бы перспективно использование ДНК-вакцины на основе гена корового белка ВГВ для создания профилактической и терапевтической вакцин.

В данной работе была поставлена задача получения ДНК-вакцинной конструкции, содержащей ген HBcAg, и исследование ее иммуногегшых свойсгЯ-

Для конструирования ДНК-иакцины был попользован вектор pcDNA3.1, содержащий пито мс га.'ю вирусный промотор. Схема сконструированной плазмиды приведена на рис. 10. Структура полученной рекомбинантноЙ плазмиды была подтверждена рестрикций иным анализом и секве-нированием района встройки. Способность полученной плазмиды индуцировать синтез HBcAg в эук ар И от и1чес к их клетках была подтверждена трансфекцией COS-клеток

плазмидой рсВЫАЗЛ-НВс с последующим выявлением HBcAg с помощью специфических антител.

Для увеличения иммуногенности ДНК-вакцины плазмидную ДНК упаковывали в вирусоподобные частицы, содержащие полиглюкин [Лебедев и др., 2000]. Было проведено исследование иммуногенных свойств HBcAg при иммунизации мышей линии ВАЬВ/с вирусоподобными частицами, содержащими ДНК-вакцину рсОЫАЗЛ-НВс (100 мкг ДНК на дозу) (внутримышечно, двукратно с интервалом в две недели). Было зафиксировано появление антител к HBcAg в сыворотках мышей, иммунизированных ДНК-вакциной рсОЫАЗЛ-НВс.

Клеточный иммунный ответ исследовался с помощью метода Е1Л8ро1, было проведено сравнение количества спленоцитов, продуцирующих ИФН-у, Ил-2, и Ил-4 после индукции HBcAg, HBeAg и контрольным белком. Результаты экспериментов приведены на рис. 11. Было выявлено, что количество клеток, синтезирующих ИФН-у и Ил-2, после индукции HBcAg, достоверно превышало количество клеток, продуцирующих ИФН-у или Ил-2 и стимулированных белком ТВ1 в качестве отрицательного контроля или не стимулированных. В то же время достоверного повышения количества клеток, синтезирующих Ил-4, при стимуляции НВсА£ или HBeAg не было выявлено. Таким образом, на основании этих результатов можно сделать вывод о стимуляции Тх1 звена иммунного ответа к HBcAg после иммунизации ДНК-вакциной рсОЫАЗЛ-НВс.

300

ИФНл

д о

250

200

Р §

150 100

-Ил-2

Ш\ Ш

тт тт

« <ч

Срок после второй иммунизации (недели)

50 0

1 2 3

Срок после второй иммунизации (недели)

Рис. 11.

Оценка количества спленоцитов, продуцирующих цитокины у мышей иммунизированных ВПЧ рсРЫАЗЛ-НВс. Спленоциты стимулировали □НВсАа И HBeAg, Щ ТВ1, ■ без стимуляции.

И ^

Таким образом, сконструированная ДНК-вакцина, содержащая ген HBcAg, способна представлять НВсАя иммунной системе и стимулировать специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ.

Глава 3. Средства доставки подаэпчтопных ВЙЧ-1 нммупогенов

Получение вирусоподобных частиц, несущих полиэпитопны й белок TBI

Белок TBI (Т and В eel! epitopes containing immunogen) был сконструирован и виде пОЛИПептада с заранее заданной третичной структурой, в основу которой положен 11 етырехспнраяы:ый пучок. Его аминокислотная последовательность включает четыре Т-клеточпых эпитопов и пять В-клеточных нейтрализующих эпигонов из белков Env и Gag ВИЧ-1 [Eroshkin et at., 1995]. l eti tbi был получен путем клонирования соответствующих синтетических олигонуклеотидов в составе плазми-ды pRSIII [Eroshkin et at,, 1995].

В качестве системы доставки искусственного белка ТВ! мы выбрали вирусоподобные частицы. Технология получения вирусоподобных частиц была предложена Л. Р. Лебедевым с соавторами [Лебедев Л. Р. и др., 2000]. 11 ре парат представляет собой микрочастицы, в центре которых находится гюлинуклеотидный комплекс (дсРНК), окруженный полисах аридной матрицей (состоящей из конъгогата сперм иди н-пол игл юкин-глутатион), а на поверхности экспонирован белок GST-TS1. В нашей работе мы использовали полиглкжин с молекулярной массой 60 к Да, который разрешен к применению в медицинской практике. Спермидин (I BN(CH:)4NH(CH2)jNR2) относится к природным полиаминам, в его присутствии происходит конденсация нуклеиновых кислот. Считается, что комплекс ДПК-спермидин обладает повышенной устойчивостью к действию нукпеаз [BioomfieH, V. A. et а!., 1996, Dunlap D. P. et al., 1997]. Глутатион служит для аффинного связывания с гибридным белком GST-TBL П о ли нуклеотид ный комплекс представляет собой дсРНК штамма SaCcharomyc.es cerevisiae М437 Y116 и является основным компонентом лекарственного препарата "Ридосгин", применяемого на практике в качестве стимулятора неспецифической резистентности [ВФС 42-2457-94 Ридостии для инъекций]. Схематично строение ВПЧ представлено на рис.12.

Рис. 12. Схематичное строение в и русо л о лобной частицы.

1 •• дсРНК

2 конъюгат до лигтокин-сдер ми дн н - г лутаг ион

3 рекомбинантный белок GST-TB!

Конструкция ВПЧ имела следующее соотношение компонентов: на ] молекулу нуклеотидного материала приходилось в среднем 48 молекул нолисахаридной вставки и 100 молекул гибридного белка. По данным атом но-с ил оной микроскопии, препарат ВПЧ-pcDNAJ. I .-TBI содержит сферические частицы диаметром от 40 до 100 им. Исходя из молекулярных масс компонентов, эти размеры соответствуют теоретически рассчитанным оценкам

Исследование иммуногепиых свойств препаратов ВГ1Ч-ТВ1 и В П Ч-pcD IN АЗ. 1 ,-ТВ I

Для оценки иммунологической активности полученных вакцинных конструкций проводили иммунизацию мышей линии BALB/c. В качестве группы срав-

нения использовали мышей, иммунизированных рекомбииантным белком, введенным совместно с полным вдъювантом Фрейнда. Схема иммунизации включала н себя Зх-кратное введение иммуногенов с интервалом 2 недели, доза составляла 45 мкг/ но белку GST-TBI и 50 мкг/ по плазмиде peDNA3.1.-TBI. В сыворотке крови иммунизированных животных определяли содержание антител против белка GST-TB1 и рекомбинантных белков ВИЧ-] (gp 120, gp4l, р24) с помощью иммупоферментного анализа (ИФЛ). Введение вакцинных конструкций приводило к появлению специфических антител в Сыворотке иммуминированных животных. Сыворотка животных контрольных групп не реагировала ни е одним из использованных а нтк reí (он на протяжении нее го эксперимент. Результаты иммунизации представ л сны на рис. 13, При введении аслиэпитошюга белка TBI в виде различных конструкций наблюдается статистически достоверное различие между группами, проявляющиеся как в разной динамике появления антител, гак и и уровне их продукций. Наиболее высокие значения специфических антител были зарегистрированы в группах мышей, вакцинированных ВПЧ-ТВ1 и очищенным белком GST-TBI, введенным совместно с адъювантом. Между собой эти группы отличались динамикой накопления иммуноглобулинов. При введении белка в составе ВПЧ, значения антител практически не изменялись вплоть до окончания эксперимента (62 сутки). В группе животных, иммунизированных GST-TBl+ПАФ с течением времени наблюдалась тенденция к снижению выраженности гуморального иммунного отаста и начиная с 55 суток после иммунизации титры антител становятся ниже соответствующих показателей группы ВПЧ-ТВ1

Наряду со значениями титров антител, индуцируемых в ходе иммунизации, очень важным показателем эффективности вакцинации является вируспейтрали-зующая активность сывороток иммунизированных животных. Вирус нейтрализующую активность сывороток иммунизированных животных оценивали на 35 день после начала вакцинации на культуре клеток МТ-4 с использованием штамма ВИЧ-1 ГКВ 4046 (рис 14). Доза вируса составляла 100ТСГОзо. В качестве но-

Рие. 13. Уровень продукции антител в сыворотке крови иммунизированных животных по данным ИФЛ. В качестве антигенов использовали гибридный белок GST-TBJ и рекомбинан гные белки ВИЧ-1.

Группа I- животные, иммунизированные ВПЧ-ТВ1

Группа 2- животные, нммушетроваппые GST-TB1 + полный адыовант Фрейнда

62 55

35 Су гкн после 3 иммунизации

ложительного контроля использовали сыворотку ВИЧ-инфицированного пациента. В качестве отрицательных конгролей были использованы нормальная человеческая сыворотка и нормальная мышиная сыворотка. Результаты учитывали на четвертые сутки, определяя содержание вирусного белка р24 в каждом образце методом иммуй0ферментного анализа. Проценты вирусной репликации и опыте рассчитывали по отношению концентрации белка р24 при использовании сыворотки иммунизированного животного к концентрации белка р24 при использовании нормальной мышиной сыворотки. Реакцию учитывали при жизнеспособности клеток МТ-4 не менее 80%. Было установлено, что сыворотки животных опытных групп проявляли аируснейтралшующую активность: при разведении сыворотки 1:50 процент вирусной репликации составлял около 45%, при этом не было выявлено достоверно значимых отличий между сыворотками крови животных опытных групп.

Рис. 14. Реакция нейтрализации вируса ВИЧ-1 (штамм ГКВ 4046) сыворотками животных, иммунизированных белком ГШ с полным адъшвинтом Фрейчда (ТВ1 - НАФ) и искусственными частицами. несущими белок ТВ1 (ВПЧ-ТВ1). В каче-цоиожитепьнсип контроля си-

воротку ВИЧ-инфицированного пациента (СБ ВИЧ-1). В качестве отрицательных контролей использовали нормальную человеческую сыворотку (ПЧС) ' нормальную мьтщиную сыворотку (НМС).

СБВИЧ-1 НМС TBI+ПАФ ВПЧ-ТВ1

Таким образом, при использовании ВПЧ в качестве системы доставки рекомбинацию го белка GST-TB1 показатели гуморального и клеточного Иммунного ответа (ИО) практически не отличались от таковых при введении белка с адъю-ваптом Фрейнда. Использование микрочастиц для доставки ДНК позволило повысить и мм ун ore н п ость вакцинной конструкции, при этом к основным эффектам иммунизации ВПЧ-pcDNA-TBI следует отнести пролонгацию ИО, что выражалось в высоких показателях клеточного и гуморального ИО на 62 сутки наблюдения. Препараты ВПЧ не были токсичны и не вызывали других побочных эффектов в организме подопытных животных. Это говорит о том, что ВПЧ могут быть использованы в качестве системы доставки вакцинных конструкций.

Получение и исследование свойств ре ком Пикантных штаммов сальмонеллы, несущих полизпиюпный белок TBI

Помимо системного ответа, эффективная вакцина против ВИЧ-инфекции должна индуцировать местный (мукозалвпый) ответ, поскольку вирус попадает в организм как паре шальным, так и половым путем.

Для получения рекомбинантных штаммов сальмонеллы, продуцирующих белок TBI, клетки S. typhimurvum SL7207 и S. enteritidis Е-23 трансформировали пдазмидой pGEX-TBL Продукцию белка GST-TB1 исследовали с помощью SDS-электрофореза. Молекулярная масса пом пептида составляла 45 к Да, что соотвст-

ствовало ожидаемой. Было показано, что уровень продукции белка TBI в штаммах сальмонеллы относительно высокий и составляет примерно 10% от суммарного клеточного белка, по продуктивности полученные штаммы практически не отличались.

Рекомбинантные штаммы сальмонелл были протестированы на способность сохранять исходные биохимические признаки, характеризующие их аттенуацию. Определение биохимического профиля позволяло контролировать однородность культур сальмонелл и выявлять контаминацию вакцинных штаммов бактериями других таксономических групп. Исследование способности утилизировать цитрат в качестве единственного источника углерода показало, что полученные рекомбинантные штаммы не реверсировали в сторону штамма дикого типа (S. enteritidis 1791). Отсутствие роста на агаре Симмонса и начало продукции сероводорода только через 48 часов при посеве на среду Клиглера также являлись важными признаками атгенуации бактерий. Таким образом, установлено, что ни одна плазмидная конструкция не оказывает влияния на биохимические свойства аттенуированных штаммов.

Исследование антигенных свойств показало, что вакцинные штаммы однородны по своему составу и достоверно определяются как представители рода Salmonella. Гибридные штаммы не обладают способностью к спонтанной агглютинации и по антигенной структуре соответствуют серовару исходного бесплаз-мидного штамма.

Была проведена оценка стабильности плазмидных конструкций pGEX-2T-TBI и pcDNA-TBI в клетках сальмонелл. Стабильность плазмид в составе бактериальных клеток оценивалась путем подсчета колоний бактерий при многократных пересевах культуры на твердых средах. Оказалось, что количество клеток сальмонелл, несущих плазмиды pGEX-2T-TBI и pcDNA-TBI, при многократных пересевах (10 раз) достоверно не уменьшается, что позволяет говорить о стабильности сохранения плазмид в составе бактериальных клеток in vitro.

Определение ЛД50 аттенуированных штаммов сальмонеллы при ректальном введении

Ранее для каждого штамма сальмонеллы было определено ЛД50 при внутри-брюшинном введении животным [Рыжова С.А. и Бойченко М.Н. 1997]. В наших экспериментах мы планировали использовать рекомбинантные штаммы для пер-ректальной иммунизации. Поэтому перед началом иммунизации необходимо было провести дополнительные эксперименты по определению ЛД50 для каждого штамма при ректальном способе введения сальмонеллы. Мыши линии BALB/c были разделены на несколько групп по 10 животных в каждой. Животным рек-талыю вводили по 30 мкл клеток сальмонелл штаммов S. enteritidis Е-23 и 5. ty-phimurium SL7207 в различных дозах: от 103 до Ю10. Наблюдали за состоянием мышей в течение 50 суток. Результат эксперимента учитывали по гибели животных. ЛД50 определяли по методу Рида и Менча. В результате экспериментов было установлено, что lg ЛД50 для S. enteritidis Е-23 при перректалыюм введении бактерий составляет 7,5 КОЕ, а для S. typhimurium SL7207 составляет 8,5 КОЕ. Учитывая полученные результаты, для иммунизации лабораторных животных были выбраны дозы 107 и 108 клеток сальмонеллы/мышь соответственно.

Иммупогениые свойства вакцинных штаммов сальмонеллы

Для исследования иммуногенных свойств рекомбйщйтных штаммов сальмонеллы, выступающих в качестве систем доставки белка С5Т-ТВ!, была проведена однократная перрекгальная иммунизация мышей линии ВА1В/с, Выбор перрскталышго способа введения был сделан на основании сравнении результатов ранее проведенных -экспериментов по изучению эффективности орального и перрскталышго способов введения иммуногена [Карпенко _Г1.И. и др. 2003],

Показатели клеточного иммунитета оценивали в реакции блаеттраз 1сформа-нии лимфоцитов. Было выявлено, что начиная с 14 суток спленоциты иммунизированных животных отвечают повышенной пролиферацией па оба используемые в реакции специфических ангигена (белок 05Т-ТШ и лизат ВИЧ-1). Пролифера-л-ивпая активность сплепоцитов мышей, иммунизированных Л'. (урЫгШгшт 7207.'рОЕХ-ТВ1, достоверно не отличалась от показателей клеток животных, которым вводили 5. еШегШ¿и Е-23/рОЕХ-ТВ1 на каждый из наблюдаемых сроков. Пе было отмечена снижения пр о л и ф ератив ной активности спленоцитов при их стимулировании митогеном (конканавалнпом А). Эти результаты позволяют предположить, что иммунизация рекомбинаптпыми штаммами сальмонелл, несущими полиэпитопный белок ТВ], пе вызывает супрессирующего действия на организм мышей.

Системный гуморальный ответ оценивался но выявлению ГцО в сыворотке крови иммунизированных животных. Результаты эксперимента предстал л сны на рис. 15.

250 - -

« 150 -н

I 100

г£

гв 35

сутки после иммунизации

□ ЭтурГтигшт У207 /рСЕ£Х-ТВ ОЗ.ег1егШ£*5 Е-23 /рЗЕХ-ТВ! П ?' :ури :.. г.;" ЗЬ 7207 (контроль) □ Е-23{контроль)

]'|1С.]5. Гуморальный иммунный ответ у мьгшей, иммунизирован них рекомбипант-ными штаммами сальмонеллы. В качестве антигена использовали белок {ЙТ-ТВГ Антитела класса 1§А в смывах кишечника (А), антитела класса в сыворотке крови мышей (В).

Согласно полученным результатам, введение рекомбинантных штаммов сальмонеллы, продуцирующих белок GST-TBI, приводило к появлению специфических IgG в организме иммунизированных животных. Следует отметить, что на 14 сутки после иммунизации значения выявляемых антител в опытных и контрольных группах не отличались, что, возможно, свидетельствует о наработке антител, специфичных к антигенам введенных бактериальных клеток. К 28 суткам титр специфических антител в опытных группах возрастает, в то время как титр антител в сыворотках крови животных контрольных групп уменьшается. Задержку в появлении антител можно объяснить фактом наличия процесса незавершенного фагоцитоза сальмонелл в АПК (макрофагах, дендритных клетках кишечника), вследствие чего презентация целевого антигена происходит не сразу после введения, а только после завершения процесса полного лизиса клеток носителя.

При сравнении результатов иммунизации двумя штаммами сальмонеллы (S. typhimurium SL 7207 и S.enteritidis Е-23) были выявлены различия в значениях титров антител. В то же время, по данным SDS-электрофореза, продукция белка GST-TBI в клетках сальмонелл этих штаммов находилась на одинаковом уровне. Учитывая этот факт, к наиболее вероятным причинам различий в индуцируемом иммунном ответе можно отнести особенности существования бактерий в макроорганизме, такие как инвазирующая способность, время персистенции в органах иммунной системы и др.

Мукозальный иммунный ответ оценивался по выявлению специфических IgA в слизистой тонкого кишечника иммунизированных животных (Рис. 7). Исследование смывов кишечника животных, вакцинированных рекомбинантными штаммами сальмонелл показало наличие специфических IgA. Максимальный уровень специфических антител наблюдался на 35 сутки после иммунизации. Значимость индукции секреторного иммунитета особенно высока при создании вакцинных препаратов, направленных против инфекций, передающихся половым путем, таких как ВИЧ-инфекция

Таким образом, использование аттенуированных штаммов сальмонеллы способствует развитию системного и мукозального иммунного ответа на целевой иммуноген. Полученные результаты позволяют сделать вывод о перспективности использования аттенуированных штаммов сальмонелл как систем доставки вакцинных конструкций.

Изучение нммуногенных свойств поли-ЦТЛ эпнтопного белка TCI

В качестве Т-клеточного иммуногена в рамках работы было проведено исследование белка TCI, представляющего собой поли-ЦТЛ-эпитопную конструкцию [Bazhan S.I. et al. 2004]. При конструировании белка TCI (Т cell immunogen) были выбраны эпитопы, которые индуцируют как С08+-ЦТЛ, так и CD4+ (Т-хелперы), и включают в себя последовательности из основных вирусных белков-антигенов Env, Gag, Pol и Nef. В результате белок TCI имеет 80 оптимально отобранных ЦТЛ-эпитопов и состоит из 392 аминокислотных остатков. Последовательность полиэпитопного иммуногена включает в себя ряд B-клеточных эпитопов, которые перекрываются с Т-клеточными эпитопами.

В состав гена TCI были включены дополнительные последовательности, кодирующие эпитопы способные представляться совместно с МНС I мышей и Macaque rhesus. Это дает возможность использовать указанные виды животных в

качестве экспериментальных моделей при изучении иммуногенности вакцин на основе TCI.

Для доставки гена ГС/ мы использовали следующие конструкции: ДНК-вакцина pcDNA-TCI, ВПЧ и аттенуированный штамм сальмонеллы S. typhimurium SL7207. Группы животных, иммунизированных векторной плазмидой pcDNA3.1., а также исходным штаммом сальмонеллы S. typhimurium SL7207, выступали в качестве отрицательного контроля. В рамках исследования иммуногенных свойств ДНК вакцины pcDNA-TCI было проведено тестирование гуморального и клеточного иммунного ответа у иммунизированных животных.

Клеточный цитотоксический ответ оценивали по выявлению IFN-y-продуцирующих лимфоцитов в реакции ELISPOT. Полученные в результате теста показатели представлены на рис. 16. Прежде всего, необходимо отметить, что введение полиэпитопной конструкции (как в виде "голой" ДНК, так и в составе вирусоподобных частиц и клеток сальмонелл) индуцировало появление у иммунизированных животных клона специфических клеток, продуцирующих IFN-y. Успешное использование для рестимуляции спленоцитов in vitro как полноразмерного белка TCI, так и отдельных пептидов, входящих в его состав, указывает на то, что происходит экспрессия гена TCI, процессинг целевого белка и представление детерминант CD8+ лимфоцитам вместе с МНС I класса. При использовании в качестве неспецифического стимулятора иономицина, количество IFN-y-продуцирующих клеток составляло порядка 400-600 клеток/105спленоцитов.

В группах животных, иммунизированных комбинированными препаратами Bn4-(pcDNA-TCI/TCI-GST), содержащими одновременно плазмиду pcDNA-TCI (внутри) и белок GST-TCI (на поверхности), было отмечено, что уже на 7 сутки после введения можно обнаружить специфические лимфоциты, отвечающие продукцией IFN-y в ответ на стимуляцию специфическими антигенами. Это указывает на то, что оба компонента вакцинной конструкции (ДНК и белок) вносят вклад в индукцию цитотоксических лимфоцитов.

При иммунизации препаратом вирусоподобных частиц, содержащих только ДНК вакцину, клеточный ответ был примерно на том же уровне, что и при иммунизации плазмидной ДНК. Однако, в отличие от иммунизации "голой" плазмид-ной ДНК, вакцинация плазмидой в составе ВПЧ приводила к более пролонгированному ответу. Максимальный ответ достигался на 14-21 дни после иммунизации и сохранялся до конца периода наблюдения. Можно предположить, что пролонгированный ЦТЛ ответ при иммунизации Bn4-(pcDNA-TCI) по сравнению с pcDNA-TCI связан с тем, что в составе ВПЧ плазмидная ДНК защищена от действия ДНКаз и, следовательно, может функционировать более длительный период, обеспечивая экспрессию белка TCI.

Следует отметить, что при иммунизации животных S. typhimurium SL7207/pcDNA-TCI наблюдается самая длительная задержка в клеточном ответе, хотя в этой группе животных на 30 сутки наблюдения был выявлен самый значительный ответ со стороны лимфоцитов. Возможно, в данном случае эффект задержки развития иммунного ответа обусловлен тем, что плазмида pcDNA-TCI находится в составе сальмонеллы, которая, попадая в макрофаги, может некоторое время жить в них, не подвергаясь полному лизису. При этом задерживается и экспрессия целевого гена, поскольку ДНК-вакцина проникает в ядро макрофагов только после разрушения бактерий.

Гуморальный иммунный отпет оценивали но обнаружению специфический антител п сыворотке иммунизированных животных в реакции непрямого ИФА. Полученные результаты позволяют сделать заключение, что при иммунизации мышей плазм идои pcDNA-TCI как в чистом виде, так и в составе вирусоподобных частиц и в клетках сальмонелл, происходит наработка специфических антител, которые связываются как с белком ТС!, гак и с рскомбинантными белками ВИЧ-i (Env, Gag) и л из атом ВИЧ-1. Следует, отметить, что титры антител к белкам Env и Gag, а также лнзату ВИЧ-1 оказались относительно невысокими (не выше, чем 1:80), что является вполне закономерным, т.к. проектирование белка ТС! было проведено в форме полно питанного Т-клеточного иммуногена. Наиболее высокие титры антител были обнаружены в группе животных иммунизированных S iyphimurium SL7207/ pcDNA-TCI,

л В

О 7 14 21 30 сутки посла иммкиэа ции

□ от р. контроль {BHECj в TCI И N15+N1E

V ку. ГМЛИ HUM ytva ,

7 10 14 21 30 4a сутки после имглуниээци*

Гнс. 15. Клеточный иммунный ответу животных, иммунизированных. различными вариантами конструкций ДНК вакцины pcDNA-TCl Спленопиты стимул провалю смесью пептидов N15 (DRVIEVVQGAYRAIK- район gp4¡) и N16 (KQIINMWQEVGKAMYA- pairan gpl20), рс-комбпнаитпым белком GST-TC1, белком 1: Л ! (вылелеи из неинфекцнонного штамма Е- culi).

□ от р.контроль (ВНЕС) ита □ N15+M1S

Оценка нейтрализующая активности сывороток иммунизированных животных была проведена с использованием трех штаммов вируса ПИЧ-1; ГКО 899А,

ГКВ 4005 (ВИЧ-lcvk) и ГКВ 4046, полученными из коллекции НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что все сыворотки животных опытных групп проявляли нейтрализующую активность. Наиболее высокий титр нейтрализующих антител был зафиксирован в группе животных, иммунизированных S. typhimurium SL7207/pcDNA-TCI. Реципрокный титр составлял 1:640 при 52%-ой нейтрализации штамма ВИЧ-1-899А. Эффективность подавления двух других штаммов ВИЧ-1 (ГКВ 4046 и ГКВ 4005) сывороткой крови животных этой группы была достоверно ниже и составляла 1:150 и 1:200 соответственно (Р<0,01). Показатели ингибирования р24 сыворотками крови мышей, иммунизированных ДНК вакцинной, инкапсулированной в вирусоподобные частицы, также приводила к стимуляции вируснейтрализующих антител, однако титры не превышали значений 1:100. При этом не было отмечено зависимости показателей теста вирусной нейтрализации от используемого штамма вируса (0,01<Р<0,05). Отмечено значительное снижение вируснейтрализующей активности сывороток крови мышей, иммунизированных "голой" ДНК вакциной: 50% подавление накопления белка р24 при разведениях сыворотки 1:50.

Таким образом, наименьший уровень гуморального (включая вирус-нейтрализующую активность антител) и клеточного иммунного ответа был отмечен у животных, иммунизированных "голой" pcDNA-TCI, введенной в/м. В результате наших исследований было показано, что используемые способы доставки как с помощью ВПЧ, так и с помощью клеток сальмонеллы позволяют повысить эффективность ДНК иммунизации.

Глава 4. Кандмдатные вакцины КомбиВИЧвак и Сал-ВИЧ "Д" Кандидатная вакцина Сал-ВИЧ "Д"

Опираясь на данные о высокой иммуногенности рекомбинантных аттенуиро-ванных сальмонелл, несущих ДНК-вакцину pcDNA-TCI, нами было решено создать экспериментальную вакцину для предполагаемых клинических испытаний в виде суппозиторной формы, получившей название Сал-ВИЧ "Д". Действующим началом вакцины Сал-ВИЧ "Д" является культура аттенуированного рекомбинант-ного штамма Salmonella enteritidis Е23, полученного трансформацией плазмидой pcDNA3.1.-TCI.

Аттенуация штамма Salmonella enteritidis Е-23 (суа, CRP) проведена в Московской Медицинской Академии им. Сеченова [Бойченко М.Н., 1994]. Штамм Salmonella enteritidis Е-23 обладает пониженной вирулентностью. На мышах, телятах и обезьянах показано, что вирулентность этого штамма снижена примерно в 106 раз по сравнению с родительским штаммом, при сохранении инвазивной активности [Бойченко М.Н., 1995]. После введения мышам в дозе 10б штамм обладает способностью ограниченно персистировать в организме и не выявляется на 45 сут. Перси-стенция Salmonella enteritidis Е-23 не оказывает влияния на состав основных представителей нормофлоры кишечника мышей, опосредующих колонизационную резистентность; общее количество энтеробактерий, бифидобактерий, лактобацилл и дрожжеподобных грибов на протяжении 60 суток с момента инфицирования статистически достоверно не отличается от контрольных показателей (Отчет о доклиническом изучении безопасности препарата Сал-ВИЧ «Д», вакцины против ВИЧ-

1/СПИД, суппозитории ректальные, ГНЦ ВБ «Вектор», 2006). Стабильность авиру-лентного фенотипа Salmonella enteritidis Е-23 было показано путем многократного пассирования через организм лабораторных животных [Рыжова С.А, Бойченко М.Н.,. 1997].

Оригинальная технология получения суппозиториев, содержащих живую культуру клеток рекомбинантных штаммов сальмонелл в составе жировой основы, была разработана с помощью Г. М. Левагиной. В процессе изготовления вакцины Сал-ВИЧ "Д", содержащей живые клетки рекомбинантных сальмонелл, возникает проблема их хранения в течение длительного времени, стандартизации и стабильности биомассы. Необходимым условием является то, что клетки ре-комбинантной сальмонеллы должны быть в состоянии активного деления, т.е. в фазе логарифмического роста. Решением этой проблемы является лиофилизация биомассы. Было показано, что лиофилизованная биомасса Salmonella enteritidis £23/pcDNA-TCI хранится без потери клетками жизнеспособности и стабильности в течение 12 месяцев. Суппозитории, изготовленные с использованием лиофили-зованной биомассы Salmonella enteritidis £23/pcDNA-TCI, также могут храниться в течение 12 месяцев при 14 - 8 С°. При этом клетки не теряют жизнеспособности и стабильно сохраняют плазмиду.

Для оценки иммуногенных свойств вакцины Сал-ВИЧ "Д", изготавливали суппозитории объемом 100 мкл, содержащих 108 клеток Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI. Мышей линии Balb/c иммунизировали перректально, предварительно проводя очищение кишечника.

500

400

Рис. 16. Анализ системного гуморального ответа к очищенному вирусу ВИЧ-1 сывороток мышей, иммунизированных штаммом Salmonella enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI по данным ИФА. Представлены средние значения титров антител объединенного пула сывороток, полученных от пяти мышей каждой группы.

300

200 •

О 7 14 21 28

Сутки после иммунизации

СЗ S. enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI (Сал-ВИЧ "Д") СЛ S. enteritidis Е-23

1600 1400 1200

Рис. 17. Анализ системного гуморального ответа к очищенному белку TCI сывороток мышей, иммунизированных штаммом Salmonella enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI по данным ИФА. Представлены средние значения титров антител объединенного пула сывороток, полученных от пяти мышей каждой группы.

Л 1000 • • р П 800 • -

0 7 14 21 28 Сутки после иммунизации

s. enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI (Сал-ВИЧ "Д") I—I S. enteritidis Е-23

Образцы сывороток забирали на 7, 14, 21 и 28 сутки после иммунизации. Оценивали иммунный ответ как непосредственно к белку TCI (рис. 17), так и к белкам ВИЧ-1 (рис. 16). Антитела в сыворотке иммунизированных животных появлялись на 14 сутки после иммунизации и достигали максимума на 21-28 сутки.

Поскольку вакцина Сал-ВИЧ "Д" разрабатывалась как клеточный иммуно-ген, очень важно было исследовать способность суппозиторной формы стимулировать клеточный иммунный ответ. Исследование клеточного ответа проводили с помощью метода ELISPOT, оценивали количество ИФН-у продуцирующих клеток. Селезенки животных забирали на 7, 10, 14 и 21 сутки после иммунизации. Для стимуляции спленоцитов были использованы как белок TCI, так и синтетические пептиды Р15 и Р16, соответствующие эпитопам ВИЧ-1. Клеточный ответ регистрировали уже на 7 сутки после иммунизации, он достигал пика на 10 сутки.

Иммунопатогенность вакцины Сал-ВИЧ "Д"

В рамках программы доклинического изучения вакцины Сал-ВИЧ "Д" проведено исследование ее специфической активности и безвредности в условиях перректального введения. В ходе токсикологического исследования на мышах и морских свинках было показано, что ни однократное, ни многократное введение вакцины Сал-ВИЧ "Д" не вызывало значительных или длительно сохраняющихся изменений физиологических, биохимических, морфологических и гематологических показателей, которые можно было бы квалифицировать как токсические. Препарат не оказывал токсического действия на функцию центральной нервной системы, систему крови и гемопоэз, не проявлял аллергизирующей активности (Отчет о доклиническом изучении безопасности препарата Сал-ВИЧ "Д", вакцины против ВИЧ-1/СПИД, суппозитории ректальные, ГНЦ ВБ "Вектор", 2006).

Независимые исследования патогенности штаммов Salmonella enieritidis Е-23 и Salmonella enieritidis E-23/pcDNA-TCI при пероральном и в/б введении лабораторным животным проведенные в Научно-исследовательском Центре Токсикологии и Гигиенической регламентации Биопрепаратов (НИЦ ТБП) Минздрава РФ показали, что изучаемые штаммы Salmonella enieritidis Е-23 и Salmonella enieritidis E-23/pcDNA-TCI являются невирулентными, нетоксигенными, малотоксичными и относятся к непатогенным штаммам для теплокровных животных. В связи с этим работы с указанными штаммами не представляют опасности для здоровья человека, т.е. относятся к первой категории риска.

Были изготовлены экспериментальные серии (рис.18) вакцины Сал-ВИЧ "Д" (Вакцина против ВИЧ-1\СПИД, суппозитории ректальные).

Рнс.18. Экспериментальная серия вакцины Сал-ВИЧ "Д"

Подготовлен комплект документов, который зарегистрирован в Министерств здравоохранения и социального развития. Комплект включает следующие документы: Литературная справка; Отчет о лабораторном изучении препарата; Отчет о доклиническом изучении безопасности препарата; Инструкция по изготовлению и контродо препарата; Проект ФСП; Пояснительная записка к проекту ФСП; Проект Инструкции по применению; Проект маркировки; Протокол клинических исследований. Серии вакцины и комплект документов переданы для экспертизы в ГЙСК им. Л.Д. Тарасовича.

Экспериментальная вакцина КомбиВИЧвак

есмотря на определенные достоинства вакцины Сал-ВИЧ "Д", следует отмстить, что она несет только Т-клеточный иммуногеп TCI и поэтому стимулирует в основном Т-клегочнос звено иммунитета. В последние годы сложилось мнение, что эффективная вакцина против ВИЧ-1 должна индуцировать как специфический цитотоксический ответ, гак и высокий уровень антител, обладающих вирус-нейтрализуюшей активностью. Исходя из проведенных нами исследований мы решили сконструировать комбинированную вакцину, объединяющую цолиэпи-гопные В- и Т-клеточные иммуногепы ТВ! и ТС1 в одной конструкции. Такая конструкция вакцины, получившая название КомбиВИЧвак, представляет собой Вирусоподобную частицу (ВПЧ), в центре которой находится Д1 [К-вакпина pcDNA-TCI, покрытая конъюгатом спермидин-полш-лкжин-TBl.

Физико-химические свойства вакцины КомбиВИЧвак

По данным атомно-силовоЙ микроскопии, препарат вакцины КомбиВИЧвак содержит шарообразные частпы, диаметром от 40 до 100 им (рис. 19). Исходя щ молекулярных масс компонентов, эти размеры соответствуют теоретически рассчитанным оценкам, которые в среднем составляют 70 нм. Таким образом, но своим размерам полученная конструкция сравнима с величиной ВИЧ.

Для анализа полноты упаковки нуклеотидного материала в собранной конструкции проводили обработку последней раствором ДНКазЫ (0,05 мг/мл). Ьыло показано, что если для исходной илазмшшой ДНК рсЕ^ А-ТС1 полная деградация наблюдалась уже через 30 мип инкубации, то внутри ВПЧ ДНК сохраняется ин-такгной в течение суток.

Размеры частиц позволяют значительно повысить иммуногенность белка TBI, который представлен во множестве копий на поверхности частицы. Кроме того, оболочка из реополиглюкина защищает ДНК вакцину от действия нуклеаз, и т.о. способствует повышению иммуногенности ДНК вакцины за счет повышения вероятности захвата антигенпрезентирующими клетками.

Исследование иммуногенных и токсических свойств вакцины КомбиВИЧвак

Мышей линии BALB/c иммунизировали двукратно (0-й и 28-й день) вакциной КомбиВИЧвак. Опытной группе животных вводили одну дозу вакцины КомбиВИЧвак (75 мкг рекомбинантной плазмидной ДНК pcDNA-TCI; 50 мкг реком-бинантного белка TBI). Контрольной группе животных вводили векторную плаз-миду pcDNA 3.1 в оболочке из реополиглюкина (в дозе 75 мкг pcDNA 3.1 на животное или физиологический раствор. Кровь забирали на 7, 14, 28, 35, 62 день и анализировали с помощью ИФА и иммуноблота. Спленоциты брали на 35 день (т. е. через 7 дней после второй иммунизации) для проведения реакции ELISPOT.

Результаты нашего исследования показали, что полиэпитопные иммуногены TBI и TCI в составе вакцины КомбиВИЧвак эффективно презентируются и индуцируют вирусспецифический гуморальный и клеточный ответы (рис. 20, рис. 21).

Следует отметить, что белок TBI, компонент вакцины КомбиВИЧвак, отвечающий за индукцию гуморального иммунного ответа, не является аналогом вирусных белков. Он сконструирован в виде полипептида с заранее заданной третичной структурой в виде четырех-спирального пучка. TBI включает пять консервативных вируснейтрализующих В-клеточных эпитопа один эпитоп из высоковариабельной области вируса - V3 петли и четыре Т-клеточных эпитопа ВИЧ-1 из белков Env и Gag. В-клеточные эпитопы представляют собой гибкие гидрофильные петли, Т-клеточные эпитопы - амфипатические альфа-спирали [Eroshkin et al., 1995]. Здесь важно отметить, что, являясь полностью искусственным имму-ногеном, белок TBI в составе вакцины КомбиВИЧвак индуцирует у иммунизированных мышей антитела, которые узнают как рекомбинантные, так и природные антигены ВИЧ-1 (рис. 20).

Очевидно, что наибольший титр антител был получен при использовании в качестве антигена гомологичного белка TBI (рис. 20). Сыворотки животных, иммунизированных КомбиВИЧвак, узнавали также и рекомбинантные белки ВИЧ-1, сорбированные на планшетах коммерческой тест-системы Унибест-ВИЧ 1,2 AT (ЗАО "Вектор-Бест"). Кроме того, сыворотки давали хороший сигнал при использовании в ИФА в качестве антигена лизата ВИЧ-1 (рис. 44).

Дополнительное подтверждение специфичности сывороток, полученных от мышей, иммунизированных КомбиВИЧвак, было получено при использовании двух разных тест-систем в иммуноблоттинге. Антитела, индуцированные в ответ на введение вакцины, специфически распознавали белки как нативного ВИЧ-1 на стрипах из набора "New-Lav-Blotl ", так и рекомбинантные аналоги белков Env и Gag ВИЧ-1 на стрипах из набора "Блот-ВИЧ 1/2+ О " (ЗАО Вектор Бест).

Одним из основных показателей эффективности вакцины является способность индуцировать антитела, которые могут не только узнавать, но и нейтрализовать вирус. Оценка вируснейтрализующей активности сывороток была проведена в системе in vitro на культуре клеток МТ-4. На зараженной вирусом ВИЧ-1

(штамм ГКВ4046) культуре клеток сыворотки мышей, иммунизировакных К'ом-биВИНвак, эффективно подавляли пиру сную репликацию, также как и сыворотка инфицированного человека. Таким образом, кандидата» вакцина КомбиВИЧнак индуцирует высокий гуморальный ответ, причем антитела высоко специфичны, они не только распознают антигены ВИЧ-1, но и способны нейтрализовать вирус в системе т \'Нго. Все эти данные свидетельствуют о том, что В-клеточные эпигоны в составе частиц КомбиВИЧнак доступны для узнавания В-к леткам и и информационно близки природным

е-4 1, Т

СП 2 г 1 ? Р ri~ 1 г

сутки после лммунинцин

Контропь □ КомбиВИЧеак

□ Контроль

□ КсмбиВЧ Чва«

т Л 1 щ

п н " 1* -г Г1" -

14 ■а 35 сутки после иммунизации а а

Рис. 20, Титры анти-lgG антител на 14, 28. 35, 42 к 62 сутки после иммунизации мышей КомбиВИЧнак (опытная группа) н 0,9% NaCl (контрольная группа). При анализе сывороток в качестве антигена были сорбированы TBI (А). лизаг г? рекомбинзнт-пые белки ВИЧ-1 коммерческой тест-системы "КомбиБесг Аптп-ВИЧ-1,2" (Всктор-Бест, Россия) (С") Данные представлены как среднее значение титра ± стандартное отклонение (п = 5).

эпитопам ВИЧ-1 белков. Кроме того, вакцина КомбиВИЧвак стимулирует и CTL-ответ, что было показано в 3-х различных тест-системах ELISPot (INF-gamma, IL-2 и IL-4) (рис. 21).

Использование для рестимуляции спленоцитов in vitro как полноразмерного белка TCI, так и отдельных эпитопов входящих в его состав (пептиды N15 и N16), указывает на то, что при ДНК-иммунизации происходят все стадии, необходимые

Таблица 2.

Оценка вируснейтрализующей активности сывороток_

Сыворотка Индекс нейтрализации*

Разведение сыворотки 1/10 Разведение сыворотки 1/50

объединенная сыворотка иммунизированных КомбиВИЧвак мышей 81,90% 75,60%

ВИЧ - инфицированного человека (СПИД центр) 99,41% 77,83%

* Индекс нейтрализации рассчитывали по формуле: ИН=(ОПнегат1,в.сыворот1<и - ОПткт„руе„ой сыворотки) /(ОП„сгат„в сы.оротки - ОПКОНТрОЛ1, клеток) х 100% [Карамов и др., 2003].

для доставки целевого иммуногена иммунной системе, а именно: экспрессия гена TCI, процессинг целевого белка, представление полученных пептидов (детерминант) CD8+ лимфоцитам (CTL) совместно с МНС I класса. Как уже отмечалось, в состав TCI были включены эпитопы, которые являются высоко консервативными среди 3-х основных субтипов ВИЧ-1 (А, В и С), и включают последовательности из основных вирусных белков Env, Gag, Pol и Nef. Это позволяет надеяться, что кандидатная вакцина КомбиВИЧвак будет эффективно работать против генетически измененных вариантов ВИЧ-1 путем индукции высокого уровня CD8+ CTL, специфичных к консервативным Т-клеточным эпитопам.

Исследование токсичности кандидатной вакцины были проведены сотрудниками отдела биологических испытаний НИКТИ БАВ под руководством Е.Д. Даниленко. При исследовании токсичности КомбиВИЧвак в дозе, предполагаемой для введения человеку, у иммунизированных животных не было обнаружено значительных отклонений исследуемых параметров в сравнении с контрольными животными. Однократное и многократное внутримышечное введение вакцины КомбиВИЧвак мышам не вызывало существенных или длительно сохраняющихся изменений интегральных физиологических, гематологических и биохимических показателей у животных. Препарат при однократном и многократном введении не вызывал нарушения структуры внутренних органов. В месте введения вакцины не зарегистрировано патологических изменений.

Одним из основных показателей эффективности вакцины является способность индуцировать антитела, которые могут не только узнавать, но и нейтрализовать вирус. Оценка вируснейтрализующей активности сывороток была проведена в системе in vitro на культуре клеток МТ-4 (Табл. 2). На зараженной вирусом

ВИЧ-| (штамм I КВ4046) культуре клеток сыворотки мышей, иммунизировании КомбиВИЧвак, эффективно подавляли вирусную репликацию, также как сыворотка инфицированного человека. Таким образом, канлитная вакцина Комбн-ВИЧвак индуцирует высокий гуморальный ответ, причем антитела высоко специфичны - они не только распознают антигены ВИЧ-1, но и способны нейтрализовать вирус в Системе in vitro. Bee эти данные свидетельст вуют о том, что В-клеточные энитопы в составе частиц КомбиВИЧвак доступны для узнавания В-клетками я информационно близки природным эоитопам ВИЧ- i белков.

и 1 г

N1l+riia SJT-^c С ■ I

•л Burnt,

ЗМЦ-------

•fefer

■ О i-.JpVm: □ vl Р-Г'-'Ч'ХС '. ■

9 Г1 о JUI. _ г i rt

I tlx -ijpIf,

NH+M16 (КЯ-ТО СстНгс* IEHECJ АпИдвич

Рис. 21. Исследование цитотоксичеЙКой а[Стввно-стч сплсш.титоа животных, иммунизированных КомбиВИЧвак {опытная группа) и 13ПЧ-рсСЫЛЗ,1 (контрольная группа). Отпет СТ1. оценивали по выявлению [£.-2- (А), Ш-4- (В) и ГОЧу-продуцируюших спленошггов ((') в реакции Е:1_ 15-ро) у иммунизированных мышеи ВАШ,'с. Селезенки мышей (п " 5} из каждой группы были объе-дилемм в одну смесь. Для специфической стимуляции продукции питокннов суспензией сплеко-цитов испопьзовэ а: рскомбинантиый белок а-а-ТС1 и смеет, двух входящих в него пептидов N15 (ГЖУШУУдСАУИМа - эпитоп из белка §р41) и N16 (КдПЫМУЛЗЕУОКАМУЛ - чпитоп из белка цр120), И качееше негативного контроля был использован полипептид ВНЕС Результаты представлены как среднее цнтокпн-продуцируюших клеток на 10' епленоцнтои.

Т. о., кандидатная вакцина КомбиВИЧвак обладает рядом уникальных свойств. Она объединяет В и Т клеточные иммуногены в одной конструкции, один из которых является белком, а другой ДНК вакциной. Вакцина индуцирует как гуморальный, гак и клеточный иммунный ответ. Эплтопы, входящие в состав полюпитопкых иммушгенеш, являются консервативными среди субтшюв А, В и С и представлены разными белками ВИЧ-1 Вакцина КомбиВИЧвак может рассматриваться как профилактическая и как терапевтическая, поскольку индуцирует ответы СТЦ способные уничтожать инфицированные клетки мишени. Доклинические испытания вакцины показали, что КомбиВИЧвак не вызывает длительно сохраняющихся изменений в организме животных и, таким образом, может быть рекомендована для проведения клинических испытаний.

Получены экспериментальные серии вакцины КомбиВИЧвак (рис.22). Подготовлен комплект документов па препарат КомбиВИЧвак (Вакцина против ВИЧ-ПСПИДХ который прошел предварительную регистрацию в Министерстве здравоохранения и социального развития РФ. Комплект включает следующие документы: Литературная справка; Отчет о лабораторном изучении препарата; Отчет о доклиническом изучении безопасности препарата; Инструкция по изготовлению и контроли препарата; Проект ФСП; Пояснительная записка к проекту ФС11; Проект Инструкции по применению; Проект маркировки; Протокол клинических исследований. Серии вакцины и комплект документов переданы дм экспертизы в ГИСК им. Л, А.Тарасевнча.

Экспериментальная серия вакцины КомбиВИЧвак

В заключение необходимо отметить, что сама биология ВИЧ-1 заставляет разработчиков отказаться от ряду, привычных представлений на процесс создания вакцин. Поскольку традиционные подходы получения вакцин не работают в отношении СПИДа, приходится искать новые пути решения этой сложнейшей задачи. Разработанные канди латные вакцины Сал-ВИЧ "Д" и КомбиВИЧвак основаны на современных знаниях о биологии ВИЧ-1, сконструированы с использованием новейших методов молекулярной биологии, а идеология создания вакцины находится в русле последних представлений в этой области.

выводы

1. Впервые предложена и экспериментально доказана возможность использования области cl корового белка вируса гепатита В (HBcAg) для встроек чужеродных эпитопов. Разработан алгоритм, позволяющий предсказать влияние физико-химических параметров антигенных детерминант на способность рекомбинант-ного химерного HBcAg к сборке. Установлено, что сборка химерных белков в вирусоподобные частицы нарушается в тех случаях, когда встраиваемые в состав HBcAg чужеродные последовательности включают в себя а.о., обладающие высокой гидрофобностью, большим объемом и склонностью к образованию ß-структур.

2. Предложены и экспериментально обоснованы подходы, позволяющие нивелировать отрицательное влияние встроек на самосборку химерных белков:

• Разработана техника получения мозаичных структур химерного HBcAg путем одновременной экспрессии двух генов HBcAg (химерного и нативного) в одной клетке Е. coli.

• Показано, что введение фланкирующих цистеинов в пептид-встройку приводит к формированию S-S мостика внутри пептида и обеспечивает сборку химерных белков HBcAg.

3. Установлено, что HBcAg способен экспонировать на своей поверхности не только точные копии чужеродных эпитопов, но и их имитаторы, отобранные с помощью фагового дисплея. Имитаторы антигенных детерминант в составе HBcAg сохраняют свои антигенные свойства, что было показано на примере ми-метиков антигенной детерминанты белка gp41 (ВИЧ-1), узнаваемой МКА 2F5.

4. Получены химерные варианты HBcAg, включающие антигенные детерминанты поверхностного белка ВГВ:

• HBcAg-HBs, несущий последовательность основной иммуногенный эпи-топ "а" 137-147 a.oHBsAg;

• HBc-preSl со встройкой эпитопа 27-37 а.о. района preSl;

• HBc-preS2 со встройкой эпитопа 131-145 а.о. района preS2. Продемонстрировано, что химерные белки собираются в вирусоподобные частицы, обладают антигенностыо как HBcAg, так и соответствующих районов HBsAg, стимулируют синтез антител к встроенным эпитопам и формируют в организме животных клеточный иммунный ответ, сравнимый с ответом на исходный HBcAg.

5. Получен рекомбинантный аттенуированный штамм Salmonella enteritidis Е-23/рКНВс, продуцирующий HBcAg. Показано, что рекомбинантный штамм при ректальной иммунизации мышей линии Balb/c стимулирует как системный, так и мукозальный иммунный ответ к HBcAg.

6. Сконструирована ДНК-вакцина, содержащая ген HBcAg. Показано, что внутримышечная иммунизация мышей линии BALB/c полученной конструкцией стимулирует гуморальный иммунный ответ и клеточное звено иммунитета типа Thl к HBcAg.

7. Впервые показано, что искусственные вирусоподобные частицы (ВПЧ), полученные на основе реополиглюкина и экспонирующие на своей поверхности поли-эпитопный белок GST-TBI, обладают высокой иммуногенностыо, обеспечивают специфический клеточный ответ и образование антител, обладающих вируснейт-

рализующей активностью. Обнаружено, что адьювантные свойства конструкции не уступают по эффективности адъюванту Фрейнда.

8. Впервые показано, что перректальная иммунизация лабораторных животных рекомбинантными штаммами Х (ур/итигшт 7207/рСЕХ-ТВ1 и еМегШсНя Е23/рОЕХ-ТВ[, продуцирующими белок ТВ1, стимулирует системный и муко-зальный иммунный ответ против ВИЧ-1.

9. Сконструированы ВПЧ и рекомбинантный штамм сальмонеллы, включающие ДНК-вакцину рсОМА-ТС1. Сравнительный анализ иммуногенности полученных конструкций продемонстрировал, что интенсивность клеточного и гуморального ответов возрастает в ряду: «голая» ДНК вакцина, ДНК вакцина в составе ВПЧ (ВПЧ-рсОМА-ТС1), рекомбинантная сальмонелла Я. 1урЫтипит 72()7/рсОЫА-ТС1.

10. Создана экспериментальная вакцина против ВИЧ-1\СПИД - КомбиВИЧвак (инъекционная форма), содержащая полиэпитопный В-клеточный иммуноген ТВ1 и плазмиду рсБКА-ТС!, кодирующую ген полиэпитопного Т-клеточного имму-ногена ТС1. Доклинические испытания экспериментальных серий вакцины показали, что КомбиВИЧвак индуцирует ВИЧ-специфический гуморальный и клеточный ответ. Вакцина не вызывает негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.

11. Создана экспериментальная вакцина против ВИЧ-1\СПИД - Сал-ВИЧ "Д", суппозитории ректальные, содержащая вмешанную в суппозиторную основу лиофилизированную биомассу живых микробных клеток аттенуированного штамма 5. еМегШсШ Е23, трансформированных плазмидой рсОЫА-ТС1. Доклинические испытания экспериментальных серий вакцины показали, что Сал-ВИЧ "Д" индуцирует ВИЧ-специфический гуморальный и клеточный ответ. Вакцина не вызывает негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Karpenko L.I., Ilyichev A. A., Eroshkin A.M., Lebedev L.R., Uzhachenko R. V., Nekrasova N. A., Plyasunova O.A., Belavin P. A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Danilenko E.D., Masycheva V.l., Bazhan S.I. Combined virus like particle-based polyepitope DNA/protein HIV-1 vaccine. Design, immunogenicity and toxicity studies // Vaccine. - 2007, Mar 25. - 4312 - 4323.

2. Веремейко T.A., Ильичев A.A., Карпенко Л.И. Подходы к созданию вакцин против гепатита В на основе HBcAg // Биопрепараты. - 2007. - №1 - С. 5 - 7.

3. Бажан С.И., Карпенко Л.И., Ужаченко Р.В., Ильичев A.A. Новые направления конструирования вакцин против ВИЧ -1 // Биопрепараты. - 2007. - №1. -С.29-31.

4. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Ерошкин A.M., Лебедев Л.Р., Ужаченко Р.В., Некрасова H.A., Плясунова O.A., Белавин П.А., Серегин C.B., Данилюк Н.К., Даниленко Е.Д., Зайцев Б.Н., Масычева В.И., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С. Вакцина "КомбиВИЧвак", содержащая полиэпитопные В- и Т-клеточные имму-ногены ВИЧ-1 // ДАН. - 2007. - т.413, №4. - С.553 - 556.

5. Веремейко Т.А., Лебедев Л.Р., Чикаев H.A., Ильичев A.A., Карпенко Л.И. Гуморальный иммунный ответ у мышей линии BALB/c, иммунизированных химерными белками HBcAg, несущими эпитопы поверхностного белка вируса гепатита В // Вопросы вирусологии. - 2007. - №1. -С.40 - 45.

6. Карпенко Л.И., Бажан С.И, Лебедев Л.Р., Терещенко Т.А., Даниленко Е.Д., Левагина Г.М., Веремейко Т.А., Белавин П.А., Серегин C.B., Данилюк Н.К., Некрасова H.A., Ужаченко Р.В., Прокуда О.В., Богрянцева М.П., Масычева В.И., Ильичев A.A. Разработка генно-инженерных вакцин против ВИЧ/СПИД на основе векторных систем, включающих искусственные гены, кодирующие актуальные Т- и В- антигенные детерминанты ВИЧ - КомиВИЧвак (инъекционная форма) и Сал-ВИЧ "Д" (суппозиторная форма) // Физиология и патология иммунной системы. — 2006. - №9. — С.3-9.

7. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Ужаченко Р.В., Некрасова H.A., Лебедев Л.Р., Агафонов А.П., Веремейко Т.А., Левагина Г.М., Даниленко Е.Д., Масычева

B.И., Богрянцева М.П., Плясунова O.A., Ильичев A.A. Различные формы канди-датных вакцин против ВИЧ-1, несущих полиэпитопные иммуногены // Биопрепараты. - 2006. №4. - С.8 - 11.

8. Чеканова Т.А., Воробьева М.С., Расщепкина М.Н., Николаева И.А., Коробова C.B., Сидорович И.Г., Карпенко Л.И., Ильичев A.A., Гудима Г.О., Бек-тимиров Т.А. Разработка информативных методов контроля кандидатных вакцин против ВИЧ-1 // Физиология и патология иммунной системы. - 2006. - №3. -

C.10- 16.

9. Чеканова Т.А., Карпенко Л.И., Плясунова O.A., Воробьева М.С., Некрасова H.A., Расщепкина М.Н., Бектимиров Т.А., Бажан С.И., Ильичев A.A. Изучение показателей индукции иммунного ответа у мышей при введении первых отечественных экспериментальных вакцин против ВИЧ/СПИД //Физиология и патология иммунной системы. - 2006. - №4. - С.20 - 24.

10. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Некрасова H.A., Юдина О.С., Ключ Б.П., Веремейко Т. А., Белавин П.А., Серегин C.B., Данилюк Н.К., Лебедев Л.Р., Терещенко Т.А., Левагина Г.М., Масычева В.И., Чеканова Т.А., Расщепкина М.Н., Воробьева М.С., Ильичев A.A. Инъекционная и суппозиторная формы кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД на основе полиэпитопных иммуногенов // Физиология и патология иммунной системы - 2005. - N8. - С.90 - 95.

11. Максимов Н.Л., Неверов A.A., Агафонов А.П., Карпенко Л.И., Ильичёв A.A., Игнатьев Г.М. Изучение иммуногенности и безопасности ДНК-вакцинации кори в эксперименте // Вопросы вирусологии. - 2005. - №1. - С.4 - 9.

12. Карпенко Л.И., Веремейко Т.А., Туманова О.Ю., Пика И.С., Чикаев H.A., Меламед Н.В., Нагайцева Н.В., Кувшинов В.Н., Рязанклн И.А., Ильичев A.A. Проблемы презентации эпитопов ВИЧ с помощью HBcAg// Вестник РАМН. -2005.-№1,-С. 41-40.

13. Ильичев A.A., Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Лебедев Л.Р., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Белавин П.А., Серегин С.С., Данилюк Н.К., Бажан С.И. Использование различных систем доставки ВИЧ-1 ДНК-вакцины, кодирующей поли-ЦТЛ -эпитопный иммуноген //Вестник РАМН. - 2005. - №1. - С. 41-44.

14. Веремейко Т.А., Лебедев Л.Р., Зайцев Б.Н., Некрасова H.A., Ильичев A.A., Карпенко Л.И. Конструирование химерных частиц HBcAg, несущих эпи-

топы районов preS поверхностного белка вируса гепатита В // Сибирский медицинский журнал. - 2004. -Т. 19, №2. - С.48 - 50.

15. Некрасова H.A., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Ильичев A.A., Карпенко Л.И. Исследование системного и мукозального иммунного ответа при иммунизации мышей кандидатной ВИЧ-1 вакциной // Сибирский медицинский журнал. - 2004. -Т.19, №2. - С.60 - 62.

16. Бажан С.И., Белавин П.А., Серегин C.B., Данилюк Н.К., Бабкина И.Н., Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Лебедев Л.Р., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С. Конструирование искусственного иммуногена, кандидата ДНК-вакцины, кодирующей множественные CTL-эпитопы ВИЧ-1 // ДАН. - 2004. - Т.395, №6. - С.825 -827.

17. Karpenko L.I., Nekrasova N. A., llyichev A.A., Lebedev L.R, Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Zaitsev B.N., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Bazhan S.I. Comparative analysis of the immunogenicity of artificial VLP and attenuated Salmonella strain carrying a DNA-vaccine encoding HIV-1 polyepitope CTL-immunogen // Vaccine. - 2004, Apr 16; 22(13-14): 1692-9.

18. Bazhan S.I., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Poryvaeva V.A., Aborneva I.V., Ilyichev A.A. Designing and engineering of DNA-vaccine construction encoding multiple CTL epitopes of major HIV-1 antigens // Vaccine. - 2004, Apr 16; 22(13-14):1672-82.

19. Ильичев A.A., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Бабкина И.Н., Белавин П.А., Серегин C.B., Данилюк Н.К., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Нестеров А.Е., Ря-занкин И.А., Поздняков С.Г., Щелкунов С.Н., Масычева В.И., Сизов A.A., Пус-тошилова Н.М., Левагина Г.М., Даниленко Е.Д., Лебедев Л.Р., Кашперова Т.А., Терещенко Т.А., Одегов A.M., Литовченко Л.Л., Федосова Л.К., Афиногенова Г..Н., Михайлова В.И., Меламед Н.В., Веремейко Т.А., Хомякова С.Н., Некрасова H.A., Савкин И..В., Воробьева М.С., Жучков A.B., Шекшеев Э.М., Сандахчиев Л.С. Разработка генно-инженерных вакцин против ВИЧ/СПИД на основе векторных систем, включающих искусственные гены, кодирующие актуальные антигенные детерминанты ВИЧ // Аллергология, астма и клиническая иммунология. -2003. -Т.7, №9. - С. 121 - 125.

20. Воробьев A.A., Бойченко М.Н., Донин М.В., Веремейко Т.А., Карпенко Л.И., Ильичев A.A. Перспектива создания нового поколения терапевтической вакцины против гепатита В // Молекулярная медицина. -2003. - №2. - С.54 - 56.

21. Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Проняе-ва Т.Р., Мурашев Б.В., Романович А.Э., Климов H.A., Козлов А.П., Ильичев A.A. Иммунный ответ при оральной и ректальной иммунизации аттенуированным штаммом сальмонелл, несущим ДНК-вакцину против ВИЧ инфекции // Вопросы вирусологии. -2003. - №4. - С. 16 - 20.

22. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Игнатьев Г.М., Лебедев Л.Р., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С. Искусственные анти-ВИЧ иммуногены и способы их доставки // Вестник РАМН. - 2003.-№1 - С.24 - 30.

23. Karpenko L.I., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Poryvaeva V.A., Pronyaeva T.R., Ryabchikova E.I., Pokrovsky A.G., Ilyichev A.A. Construction of artificial virus-like particles exposing HIV epitopes, and the study of their immunogenic properties // Vaccine. - 2003. - Jan 17; 21(5-6): 386 - 392.

24. Кандрушина М.Н., Гришаев М.П., Порываева В.А., Аборнева И.В., Карпенко Л.И., Чикаев H.A., Гришаева О.Н., Мычка Н.В., Кувшинова И.Н., Скудар-нова И.М., Топычканова Н.Г. Модифицированная тест-ситема для выявления НВе-антигена в сыворотке крови больных гепатитом В // Бюллетень ВосточноСибирского научного центра СО РАН. - 2002 - Т.1, №4. - С.48 - 50.

25. Порываева В.А., Кандрушина М.П., Аборнева И.В., Карпенко Л.И., Чикаев H.A., Вторушина И.А., Гришаев М.П. Использование биотехнологических подходов при создании тест-ситемы для выявления НВе-антигена // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАН. - 2002 - Т.1, №4. - С.107-108.

26. Goncharova Е.Р., Ryzikov A.B., Bulychev L.E., Sizov A.A., Lebedev L.R., Poryvaev V.D., Karpenko L.I., Ilyichev A.A. A study of systems for delivering antigens and plasmid DNA for intranasal immunization against tick-borne encephalitis virus // Wien Klin Wochenschr (The middle European journal of medicine). - 2002. -V.l 14 (13-14).-P.630 -635.

27. Лебедев Л.Р., Сизов A.A., Карпенко Л.И., Порываева В.А., Одегов A.M. Молекулярные конструкции экспериментальных комбинированных вакцин // Молекулярная генетика. - 2002. -№2. - С. 17 -21.

28. Карпенко Л.И., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Порываева В.А., Лебедев Л.Р., Веремейко Т.А., Некрасова H.A., Ильичев A.A. Конструирование и исследование аттенуированных штаммов сальмонелл, продуцирующих белок TBI // Вопросы вирусологии. - 2002. - №2 - С.25 - 28.

29. Лебедев Л.Р., Сизов A.A., Масычева В.И., Карпенко Л.И., Рязанкин И.А. Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-мишени // Биотехнология. -2001. - №1. - С.З - 12.

30. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Игнатьев Г.М., Порываева В.А., Рябчикова Е.И., Белявская В.А., Гилева И.П., Азаев М.Ш., Ильичев A.A. Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1, и исследование их иммуногенных свойств // Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы». - 2001.-Т.5, №2 - С.51 - 58.

31. Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Порываева В.А., Лебедев Л.Р., Веремейко Т.А., Климов H.A., Козлов А.П., Ильичев A.A. Конструирование и исследование иммуногенных свойств рекомбинантного штамма сальмонеллы, продуцирующего белок TBI // Инфекция и иммунитет: Сборник статей материалов, приуроченных к V Международному форуму по глобальной вакцинологии «Вакцины и иммунизация». - Минск, 2001. - С.69 - 77.

32. Карпенко Л.И., Веремейко Т.А., Игнатьев Г.М., Порываева В.А., Байбо-родин С.И., Бойченко М.Н., Ильичев A.A., Воробьев A.A. Сравнительное исследование эффективности представления иммунной системе HBcAg с помощью аттенуированных штаммов Salmonella сероваров S. enteritidis и S. typhimurium // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001. - №5 - С.34 -38.

33. Лебедев Л.Р., Гилева И.П., Карпенко Л.И., Ерошкин A.M. Конструирование оригинальных искусственных иммуногенов - кандидатов в вакцины против HIV-I // Молекулярная генетика. - 2000. - №3. - С. 36 - 40.

34. Karpenko L.I., Ivanisenko V.A., Pika I.A., Chikaev N.A., Eroshkin A.M., Veremeiko T.A., Ilyichev A.A. Insertion of foreign epitopes in HBcAg: how to make the chimeric particle assemble // Amino Acids. - 2000.-V. 18(4). - P.329 - 337.

35. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Порываева В.А., Азаев М.Ш., Рябчикова Е.И., Гилева И.П., Ильичев A.A. Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1 // Молекулярная биология. - 2000. - Т. 34, №3. -С.480 - 485.

36. Карпенко Л.И., Иванисенко В.А., Пика И.А., Чикаев H.A., Ерошкин A.M., Меламед Н.В., Веремейко Т.А., Ильичев A.A. Анализ чужеродных эпито-пов, встроенных в HBcAg. Возможные пути решения проблемы самоорганизации химерных коровых частиц // Молекулярная биология. - 2000. - Т.34, №2. -С.223 -229.

37. Карпенко Л.И., Игнатьев Г.М., Кожина Е.М., Кашенцева Е.А., Порываева В. А., Меламед Н.В., Байбородин С.И., Смирнова О.Ю., Ильичев A.A. Получение и исследование рекомбинантных штаммов Salmonella typhimurium SL7207, продуцирующих HBcAg и HBcAg-HBs // Вопросы вирусологии. - 2000. - Т.45, №2.-С. 10- 14.

38. Ярославцева O.A., Нетесова И.Г., Карпенко Л.И., Мельникова О.В., Зайцев С.А., Ильичев A.A. Разработка и апробация тест-системы "Гепа Бест ан-ти-НВс IgG" для выявления антител к коровому антигену вируса гепатита В // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1998. - №4. - С.49 -52.

39. Карпенко Л.И., Ильичев A.A. Химерные частицы корового антигена вируса гепатита В как система презентации эпитопов чужеродных белков // Вестник РАМН. - 1998. - №3. - С.6-9.

40. Карпенко Л.И., Рязанкин И.А., Чикаев H.A., Колесникова Л.В., Ильичев A.A. N-конец корового белка вируса гепатита В спрятан внутри коровой частицы // Молекулярная биология. - 1997. - Т.31, №5. - С.1052-1060.

41. Karpenko L.I., Ryazankin I.A., Chikaev N.A., Kolesnikova L.V., Ilyichev A.A. Localization of the amino terminus of the hepatitis В virus core antigen within the core particle // Virus Res. - 1997. - Nov; 52(1). - P.15-23.

42. Loktev V.B., Ilyichev A.A., Eroshkin A.M., Karpenko L.I., Pokrovsky A.G., Pereboev A.V., Svyatchenko V.A., Ignat'ev G.M., Smolina M.I., Melamed N.V., Le-bedeva C.D., Sandakhchiev L.S. Design of immunogens as components of a new generation of molecular vaccines // J Biotechnol. - 1996. - Jan 26; 44(1-3). - P.129-37.

43. Карпенко Л.И., Рязанкин И.А., Чикаев H.A., Серегин С.С., Ильичев A.A., Петренко В.А. Локализация N-концевого эпитопа НВе антигена вируса ге-патитаВ //Молекулярная генетика. - 1993. -№3. - С.29-31.

Патенты

1. Заявка патент РФ №2006100808, приоритет 10.01.06 г. "Рекомбинантная вакцина против вируса иммунодефицита человека 1 типа"; Л.И.Карпенко, С.И.Бажан, Л.Р.Лебедев, Н.А.Некрасова, П.А.Белавин, С.В.Серегин, Н.К.Данилюк, А.М.Ерошкин, А.А.Ильичев

2. Патент РФ № 2296560; МПК А 61 К 9/02, опубл. БИ №10 от 10. 04. 2007 г. "Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций"; Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Веремейко Т.А., Левагина Г.М., Терещенко Т.А., Малахова Т.В., Ильичев A.A., Масычева В.И., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П.

3. Патент РФ № 2295570; МПК С 12 N 15/63, опубл. БИ №8 от 20. 03. 2007 г. "Рекомбинантная плазмидная ДНК pUC8HBc-preSl, кодирующая ген белка корового антигена вируса гепатита В, включающий эпитоп preSl района поверх-

ностного белка вируса гепатита В (27-37 а.к.), и штамм бактерий E.coli - продуцент гибридного белка HBc-preSl"; Веремейко Т.А., Карпенко Л.И., Ильичев A.A., Лебедев Л.Р., Зайцев Б.Н., Некрасова H.A.

4. Патент РФ № 2248396; МПК С 12 N 15/48, опубл. БИ №8 от 20.03.2005 г. "Рекомбинантная плазмидная ДНК pcDNA-TCI, обеспечивающая экспрессию искусственного гена TCI в клетках эукариот, и рекомбинантный аттенуирован-ный штамм бактерий Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI как кандидат для конструирования живой ДНК-вакцины против вируса иммунодефицита человека"; Карпенко Л.И., Бажан С.И., Некрасова H.A., Белавин П.А., Данилюк Н.К., Серегин C.B., Бабкина И.Н., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Бойченко М.Н., Воробьев A.A., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С.

5. Патент РФ № 2237089; МПК С 12 N 1/21, опубл. БИ №27 от 27. 09. 2004 г. "Рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteriditis E23/pGEX-2T-TBI как кандидат для конструирования живой вакцины против вируса иммунодефицита человека"; Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Игнатьев Г.М., Ильичев A.A., Бойченко М.Н., Воробьев A.A.

6. Патент РФ №2217162; МПК А 61 К 39/00, опубл. БИ № 33 от 27.11.2003 "Вакцина против вирусных инфекций"; Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Ильичев A.A.

7. Патент РФ №2216590; МПК С 12 N 1/21, опубл. БИ № 32 от 20.11.2003 г. "Рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella typhimurium TlO/pKHBc как продуцент корового антигена вируса гепатита В"; Карпенко Л.И., Веремейко Т.А., Игнатьев Г.М., Ильичев A.A., Бойченко М.Н., Воробьев A.A.

8. Патент РФ № 2192886; МПК А 61 К 39/12, опубл. БИ № 32 от 20.11.2002 г. "Штамм бактерий Salmonella typhimurium Т-10 ВМС160 для иммунизации против вируса иммунодефицита человека"; Козлов A.A., Воробьев A.A., Бойченко М.Н., Климов H.A., Мурашев Б.В., Машарский А.Э., Романович А.Э., Ду-ховлинов И.В., Духовлинова E.H., Сандахчиев Л.С., Ильичев A.A., Карпенко Л.И., Некрасова H.A.

9. Патент РФ № 2121504; МПК С 12 N 15/51, опубл. БИ № 31 от 10. И. 1998 "Рекомбинантная плазмида pUHBc, кодирующая ген белка корового антигена вируса гепатита В и позволяющая экспонировать чужеродные эпитопы на поверхности кора, и штамм бактерий Е. coli - продуцент корового антигена вируса гепатита В"; Карпенко Л.И., Чикаев H.A., Ильичев A.A.

10. Патент РФ № 2112039; МПК С 12 N 15/51, опубл. БИ № 15 от 07. 05.1998 "Рекомбинантная плазмидная ДНК рКНВс-33, кодирующая ген белка корового антигена вируса гепатита В, содержащего последовательность главного нейтрализующего эпитопа HBsAg, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент кор-антигена вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности главным нейтрализующим эпитопом HBsAg": Карпенко Л.И., Чикаев H.A., Ильичев A.A., Меламед Н.В., Байбородин С.И.

Подписано к печати 16 июля 2007 г. Тираж 150 экз. Заказ № 597. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Карпенко, Лариса Ивановна

Часть I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы 4 Цели и задачи исследования 6 Научная новизна и практическая значимость работы 7 Основные положения, выносимые на защиту 8 Апробация работы

Часть II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Часть III МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Часть IV РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. HBcAg в качестве носителя чужеродных эпитопов

Глава 2. Кандидатные вакцины на основе химерные белков HBcAg, несущих эпитопы HBsAg, preSl и preS

Глава 3. Средства доставки полиэпитопных ВИЧ-1 иммуногенов

Глава 4. Кандидатные вакцины КомбиВИЧвак и СалВИЧ Д

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1"

Актуальность проблемы

В 1798 г. Эдвард Дженнер впервые опубликовал сведения о применении противооспенной вакцины. Он обнаружил, что люди, получившие прививку вирусом коровьей оспы, приобрели невосприимчивость к оспе натуральной. Э. Дженнер назвал данную процедуру вакцинацией. Это был первый случай применения вакцины для предотвращения развития заболевания. Применение вакцинации началось спустя столетие. Успех иммунизации основывается на одной главной идее: у человека имеются специфические иммунологические механизмы, которые могут быть запрограммированы на защиту организма от возбудителей инфекционных заболеваний. Стимуляция иммунных механизмов осуществляется посредством прямого введения инфекционных агентов или их частей в форме вакцины. Несмотря на несомненную пользу используемых вакцин, они могут вызывать сенсибилизацию организма, содержат большой набор антигенов, среди которых могут встречаться и перекрестно реагирующие с антигенами человека, вызывают большую нагрузку на иммунную систему, реактогенны, токсичны и т. п.

Поскольку все без исключения используемые вакцины (отечественные и зарубежные) не лишены недостатков и нуждаются в дальнейшем совершенствовании [Медуницын,

2004], современная вакцинология стремится к созданию более совершенных вакцин, которые должны быть эффективны, безопасны и не иметь побочных свойств. Повышение требований к безвредности и чистоте препаратов стимулировало не только совершенствование традиционной вакцинологии, но и создание нового поколения искусственных вакцин: субъединичных, рекомбинантных, антиидиотипических, ДНКвакцин, съедобных вакцин и др. Необходимость разработки новых вакцин связана также с решением проблемы борьбы с еще не побежденными инфекциями. Среди них особую тревогу вызывают вирусные гепатиты и СПИД, на сегодняшний день они входят в число 4 наиболее социально значимых инфекций.

УПо данным ВОЗ, вирусным гепатитом В больны, инфицированы или переболели более 2 миллиардов человек (30% населения мира). Ежегодно в мире от этой инфекции умирает около 750 тыс. человек. Широкая распространенность гепатита В связана и с тем, что из общего числа первично инфицированных до 10% заболевших становятся хроническими носителями вируса. Всего в мире насчитывается более 350 миллионов хронически инфицированных. Применение дрожжевой рекомбинантной вакцины на основе HBsAg позволило снизить заболеваемость гепатитом В в несколько раз [Ni et al., 2001; Da Villa et al, 1998]. Однако, эта вакцина, широко применяемая в настоящее время, не лишена ряда недостатков. Основной из них - низкая иммуногенность вакцины. Так, для достижения длительного протективного ответа требуется трехкратная вакцинация. Кроме того, у 10% людей вообще не развивается сероконверсия после стандартной схемы вакцинации [Carman et al, 2000; Не et al, 2001]. Существенным недостатком существующей инъекционной формы вакцины на основе HBsAg является также то, что она не стимулирует мукозальный иммунный ответ и не обеспечивает резистентность у входных ворот инфекции, и это при том, что в последние годы быстро растет доля непарентерального пути передачи вируса [Arima et al., 2003; Mikhailov et al., 2002]. Наконец, вакцина на основе HBsAg не обеспечивает формирования полноценного клеточного иммунного ответа, который необходим для обеспечения более эффективной защиты организма от вируса. Клеточное звено иммунитета особенно важно для предотвращения хронизации вирусной инфекции. Было установлено, что при вирусной инфекции клеточный ответ иммунной системы возникает не на HBsAg, а на коровый белок вируса (HBcAg), причем величина ответа имеет существенное значение для исхода заболевания [Lohr et al., 1993; Missale et al., 1993; Chisari, 2000]. Применение активной иммунизации HBcAg в терапевтических целях может уменьшить риск развития хронической инфекции и будет полезно при лечении хронических больных.

Первые случаи СПИДа были описаны в 1981 г. С тех пор, несмотря на санитарно-просветительские меры и появление лекарственных препаратов, эпидемия ВИЧ/СПИДа продолжает распространяться. Сейчас ее скорость составляет 15 000 новых случаев инфекции ежедневно. Со времени регистрации первых случаев болезни более 67 млн. человек были инфицированы и более 25 млн. уже умерло. Особенность СПИДа состоит в том, что в процессе ВИЧ-инфекции не образуется протективного иммунитета, способного привести к выздоровлению, и поэтому в данном случае для создания вакцин невозможно использовать живой атгенуированный вирус.

В нашей работе мы использовали подход, в основу которого заложен принцип объединения в одной конструкции оптимально подобранных вирусных эпитопов для создания искусственных иммуногенов ВИЧ-1 и гепатита В. В качестве средства доставки для разработанных иммуногенов использовали вирусоподобные частицы и аттенуированные штаммы сальмонелл.

Цели и задачи исследования

В связи с целью исследования необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать возможности корового белка вируса гепатита В (HBcAg) в качестве носителя эпитопов чужеродных белков. Выбрать оптимальное место встройки чужеродных эпитопов, решить проблему самосборки химерных молекул корового белка.

6. Исследовать специфическую активность экспериментальной вакцины КомбиВИЧвак (инъекционная форма).

7. Исследовать специфическую активность экспериментальной вакцины против ВИЧ-1 Сал-ВИЧ-Д (суппозиторная форма).

Научная новизна и практическая значимость работы

Продемонстрированы новые возможности HBcAg как носителя чужеродных антигенных детерминант.

Впервые предложена суппозиторная форма для перректальной иммунизации, обеспечивающая сохранность живых бактериальных клеток, и на ее основе создана экспериментальная вакцина против ВИЧ-1 - СалВИЧ Д. Доклинические испытания экспериментальных серий вакцины показали, что Сал-ВИЧ Д индуцирует ВИЧ-специфический гуморальный и клеточный. Вакцина не вызывает негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.

Впервые продемонстрирована эффективность доставки полиэпитопного антигена TBI в виде вирусоподобных частиц, сконструированных на основе реополиглюкина. Показано, что представление иммунной системе белка TBI в составе ВПЧ способствует пролонгации иммунного ответа на белок TBI и вызывает адъювантный эффект, сравнимый с эффектом, вызываемым введением полного адъюванта Фрейнда.

Предложен новый подход конструирования вакцин против вирусов, основанный на объединении в одной конструкции двух иммуногенов: один в виде белка, другой в виде ДНК вакцины. На основе данного подхода создана экспериментальная вакцина против ВИЧ-1 - КомбиВИЧвак (инъекционная форма). Доклинические испытания экспериментальных серий вакцины показали, что КомбиВИЧвак индуцирует ВИЧ-специфический гуморальный и клеточный ответ. Вакцина не вызывает негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных. 7

Вакцины СалВИЧ Д и КомбиВИЧвак и их компоненты защищены патентами РФ. Оформлена НТД на вышеуказанные вакцины, проведена предварительная регистрация в а

Министерстве здравоохранения и социального развития РФ. В настоящее время вышеперечисленные вакцины находятся на экспертизе в ГИСК им. JI.A. Тарасевича.

Положения, выносимые на защиту:

1. Область основной антигенной детерминанты с/ корового белка вируса гепатита В (HBcAg) является перспективной для встроек чужеродных эпитопов.

2. Физико-химические свойства а.о. входящих в состав пептидов (гидрофобность, объем и склонность к образованию Р-структур), встраиваемых в область cl HBcAg, оказывают влияние на способность химерного HBcAg к самосборке.

3. Техника получения мозаичных структур или введение фланкирующих цистеинов во встраиваемый пептид позволяет нивелировать отрицательное влияние встроек на самосборку химерных белков, получаемых на основе HBcAg.

4. HBcAg может выступать носителем имитаторов чужеродных вирусных эпитопов.

6. Рекомбинантный аттенуированный штамм Salmonella enteritidis Е-23/рКНВс, продуцирующий HBcAg при ректальной иммунизации мышей линии Balb/c стимулирует как системный, так и мукозальный иммунный ответ к HBcAg.

7. ДНК-вакцина, содержащая ген HBcAg, индуцирует гуморальный иммунный ответ и клеточное звено иммунитета.

8. Искусственные вирусоподобные частицы (ВПЧ), полученные на основе реополиглюкина и экспонирующие на своей поверхности полиэпитопный белок GST-TBI, обладают высокой иммуногенностью.

10. Интенсивность клеточного и гуморального ответов возрастает в ряду: "голая" ДНК-вакцина, ДНК-вакцина в составе ВПЧ (ВПЧ-pcDNA-TCI), рекомбинантная сальмонелла S.typhimurium 7207/pcDNA-TCI.

11. Экспериментальные вакцины КомбиВИЧвак и Сал-ВИЧ Д индуцируют ВИЧ-специфический гуморальный и клеточный ответ. Вакцины не вызывают негативных длительно сохраняющихся изменений в организме животных.

Апробация работы *

Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: "СПИД, рак и родственные проблемы", 1999-2002г., Санкт-Петербург, Россия; "John Humphrey advanced summer programme in immunology", 1998, 2000, 2002, 2004, Pushino, Russia; "DNA vaccines", 2002, Edinburg, UK; "International Congress of Virology", 1996, 2002; "Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов", 2004г., Томск, Россия; "International symposium on HIV and emerging infectious diseases", 2004, France; "Russian-German workshop on infection and immunity -tools and strategies for novel vaccines", 2005, Germany; "New approaches to vaccine development, 2005, Germany; "Вакцинология 2006", Москва и на ряде других конференций.

Работа выполнена в 1993-2006 годах в ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в рамках научных тем организации и по грантам государственных научно-технических программ, "Новейшие методы биоинженерии", "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел: Защита от патогенов", по Федеральной Государственной программе "Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего". На разных этапах ее выполнения в ней приняли участие Т. А. Веремейко и Н. А. Некрасова, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ. По материалам диссертации получено 10 патентов Российской Федерации, опубликовано 44 статьи.

Часть II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

Еще за тысячу лет до Рождества Христова в Китае существовал метод защиты от оспы путем переноса содержимого оспенных пустул от больных людей здоровым. Затем этот метод стали использовать в Индии, Малой Азии, Европе.

В 1798 г. Эдвард Дженнер впервые опубликовал сведения о применении противооспенной вакцины. Он обнаружил, что люди, получившие прививку и зараженные вирусом коровьей оспы, приобретали невосприимчивость к оспе натуральной. Дженнер назвал данную процедуру вакцинацией. Это был первый случай применения вакцины для предотвращения развития заболевания. Применение метода вакцинации началось спустя столетие и связано с именем Луи Пастера, который показал, что вакцинация является универсальным способом предупреждения инфекционных заболеваний. Успех иммунизации основывается на одной главной идее: у человека имеются специфические иммунологические механизмы, которые могут быть запрограммированы на защиту организма от возбудителей инфекционных заболеваний. Стимуляция иммунных механизмов осуществляется посредством прямого введения инфекционных агентов или их частей в форме вакцины. Благодаря использованию этого принципа была одержана победа в борьбе с такими вирусными и бактериальными инфекциями как оспа, полиомиелит, дифтерия, корь, бешенство и рядом других.

Используемые в практике вакцины можно разделить на 3 типа: 1) инактивированные (или убитые) вакцины, которые содержат возбудителя, не могущего размножаться в организме хозяина, но сохраняющего антигенные свойства и способность стимулировать выработку антител; 2) живые, аттенуированные вакцины, приготовленные из жизнеспособных, но ослабленных микроорганизмов, которые не могут вызвать развернутую картину заболевания; 3) субъединичные вакцины, созданные на основе отдельных иммуногенных компонентов микроорганизмов.

Живые (аттенуированные) или инактивированные вакцины на сегодняшний день по-прежнему составляют подавляющее большинство в перечне используемых препаратов. Главное достоинство живых вакцин состоит в том, что образующийся при их введении приобретенный иммунитет не отличается от естественного и, как правило, является прочным и продолжительным. Однако у живых вакцин имеются существенные недостатки. Они могут вызывать сенсибилизацию организма, содержат большой набор антигенов, среди которых могут встречаться и перекрестно реагирующие с антигенами человека, вызывают большую нагрузку на иммунную систему и т. п. Живые вакцинные штаммы некоторых вирусов могут стать причиной тяжелых персистентных инфекций, вызывать поражение генетического аппарата клеток.

Убитые вакцины обычно менее иммуногенны, чем живые, но также имеют недостатки: сенсибилизация организма, большая нагрузка на его иммунную систему, реактогенность и токсичность, обусловленные наличием ЛПС и других химических соединений.

В субъединичных вакцинах используются отдельные иммуногенные компоненты микроорганизмов. Главный вывод, который следует из успешной практики применения субъединичных вакцин - использование отдельных компонентов микроорганизма может вызвать иммунный ответ, достаточный для предотвращения инфекции [Pumpens and Grens, 2001], и в то же время позволяет избежать побочных эффектов, связанных с введением целого патогена. В отличие от живых вакцин, которые могут, в принципе, "вернуться" к исходной вирулентной форме, хорошо очищенные субъединичные вакцины безопасны в плане возникновения инфекции. Однако их применение также сопряжено с рядом проблем экономического, технологического и медико-биологического характера [Kazaks eta!., 2004].

С развитием методов молекулярной биологии появилась возможность выявлять, изолировать и клонировать биологические макромолекулы либо их фрагменты, которые могут использоваться в качестве иммуногенных компонентов. Молекулярные конструкции, собранные из таких компонентов, составляют основу субъединичных вакцин нового поколения (включая пептидные и полиэпитопные вакцины), которые могут минимизировать побочные эффекты, присущие традиционным вакцинам. Применение вычислительных технологий в молекулярной иммунологии позволяет разрабатывать новые вакцинные препараты на более строгой теоретической основе. На данном этапе развития науки уже можно целенаправленно подбирать иммуногены с прицелом на те иммунные процессы (эффекторные механизмы иммунного ответа), которые должна "запускать" будущая вакцина. Искусственные конструкции могут создаваться и в тех случаях, когда вакцина с данной специфичностью уже имеется, но обладает выраженными побочными эффектами, малоэффективна или дорога в производстве.

Исследования по получению искусственных вакцин начались с известных работ М.

Села, проведенных на курином лизоциме [Sela, 1969, Arnon et al., 1969]. Схема исследования заключалась в следующем: вначале из лизоцима белка куриного яйца путем ограниченного протеолиза был выделен иммунологически активный фрагмент молекулы с

60-го по 83-й а. о. Этот пептид обладал способностью конкурировать с лизоцимом за связывание с антисывороткой. Затем полученный пептид был конъюгирован с молекулами поли-D, L-аланина. Иммунизация этим конъюгатом кроликов и коз привела к

11 выработке антител, реагирующих с лизоцимом. Иммунизация животных конъюгатом химически синтезированного пептида с поли-0,Ь-аланином так же, как и в первом случае, привела к образованию антител, которые специфически взаимодействовали как с искусственным пептидом, так и с целой молекулой лизоцима.

Работы М. Села показали, что ограниченные районы белка могут обладать антигенностью и иммуногенностью, а также впервые продемонстрировали возможность использования полностью синтетической молекулы для получения антител, реагирующих с нативным белком. В последующих работах Лернера [Lerner, 1982] и Арнона [Arnon et al., 1983] были разработаны методы изучения и локализации иммуногенных сайтов белковых молекул с помощью поликлональных и моноклональных антител против синтетических пептидов. Было показано, что при иммунизации белковыми молекулами антитела образуются к определенным иммунодоминантным районам с определенной последовательностью а. о. Таким образом, появилось понятие белковой антигенной детерминанты как минимальной аминокислотной последовательности, способной индуцировать образование антител.

Расшифровка антигенных сайтов (названных В-эпитопами), связывающихся с нейтрализующими антителами, стимулировала исследования по созданию синтетических пептидных вакцин [Van Regenmortel et al, 1990; Иванов и др., 1988]. Было показано, что синтетические пептиды могут вызывать протективный иммунный ответ у экспериментальных животных к вирусу ящура, вирусу гриппа, полиовирусу и холерному вибриону [Doel Т. R. et a.l, 1990; Shapira et al., 1984; Ferguson et al., 1985, Jacob et al,

1984]. По сравнению с традиционными, пептидные вакцины обладают рядом преимуществ: отсутствием контаминирующих и балластных примесей, строго контролируемой структурой и относительной дешевизной наработки. Однако, несмотря на первоначальный энтузиазм, постепенно становились очевидными недостатки подхода создания вакцин на основе синтетических пептидов. Среди этих недостатков - трудности, связанные с разнообразной конформацией, принимаемой пептидом в растворе и слабая иммуногенность коротких пептидов [Muller, 1990]. Пептиды в растворе существуют в нескольких метастабильных конформациях [Попов и др., 1992], не все из них соответствуют оптимальной конформации для связывания с рецепторами лимфоцитов.

Т.е. олигопептидные эпитопы как иммуногены нуждаются не только в воспроизводстве первичной структуры, но и должны также соответствовать определенным конформационным требованиям. Конформацию пептида можно зафиксировать, присоединив его к белку-носителю. Кроме того, иммуногенность пептидов в составе конъюгата можно значительно усилить в случае, если Т-хелперные эпитопы белка носителя стимулируют иммунный ответ на присоединенный синтетический В-эпитоп

Ройт, 1991]. Поэтому синтез пептид-белковых конъюгатов стал более популярным способом получения противопептидных антител, чем использование просто пептидов. Обычно в качестве адъювантов используют производные длинноцепочечных жирных кислот или многозарядные полимеры [Петров и др., 1988]. Рядом исследователей (одними из первых были Петров с соавт. [Петров и др., 1988] было предложено использовать в качестве носителей пептидных детерминант вместо белков синтетические полианионы. Авторы показали, что конъюгация пептидных антигенов с синтетическими полиэлектролитами не только повышает их иммуногенность, но и делает антигены тимуснезависимыми [Хаитов, 1988].

Недостаток конъюгатов заключается в том, что присоединение пептидов с помощью традиционных бифункциональных реагентов (таких как глутаровый альдегид, карбодиимиды, дитиоцианаты и т.п.) может существенно повлиять на активность антигенных детерминант, существующих в пептиде, так как в формирование связи может быть вовлечено несколько разных а. о. [Muller, 1990]. Неизбежна также модификация аминокислотных остатков белка-носителя в процессе синтеза конъюгата, что ведет к появлению нежелательных высокоиммуногенных гаптеновых групп [Швалье, 1992].

Технология генной инженерии дала возможность конструировать иммуногенные препараты, в которых структура присоединенного эпитопа в наибольшей степени соответствует природной конформации. Имеются в виду иммуногены, представляющие собой надмолекулярные структуры, на поверхность которых вынесены (экспонированы) заданные олигопептидные детерминанты, введенные генно-инженерным путем. В качестве примера можно привести отдельные вирусные белки, способные к самосборке в надмолекулярные гомогенные структуры, такие как поверхностный и коровый белки вируса гепатита В (Pumpens et al, 2001), белки оболочки бактериофагов, ретротранспозон дрожжей (Ту) [Adams et al., 1987] и даже целые бактериофаги, экспонирующие на своей поверхности чужеродные эпитопы [Ilyichev et al., 1992; Minenkova et al., 1993].

Еще одно перспективное направление связано с созданием на основе Т- и В-клеточных эпитопов вирусов синтетических полиэпитопных вакцин [Hanke et al., 1998; Woodberry et al., 1999; Firat et al, 2001; Bazhan et al, 2004; Karpenko et al., 2004; Lorin et al, 2005]. Такие вакцины будут свободны от многих недостатков, присущих традиционным вакцинам и вакцинам, созданным на основе белковых молекул. Об этом направлении будет более подробно рассказано в главе, посвященной экспериментальным ВИЧ-вакцинам.

Эффекторные механизмы иммунного ответа, которые необходимо учитывать при разработке современных вакцин

Формирование иммунного ответа начинается со связывания антигена В- и

Т-лимфоцитами, несущими мембранные белки-рецепторы, способные специфически распознавать отдельные участки - антигенные детерминанты (эпитопы) чужеродных молекул. Иммуноглобулиновые рецепторы В-лимфоцитов (как и свободные антитела) распознают расположенные на поверхности участки антигена - так называемые Вэпитопы. Рецепторы Т-лимфоцитов взаимодействуют с пептидными фрагментами

Т-эпитопами) антигена, расщепленного в клетке. Т-эпитопы представлены на поверхности клетки, будучи нековалентно связанными с белками МНС (Major

Histocompatibility Complex, главный комплекс гистосовместимости). Комплексы МНС класса I связывают фрагменты белков, которые экспрессируются в самой клетке и расщепляются в протеасомах. Комплексы МНС класса II связывают фрагменты антигенов, подвергшихся протеолизу в эндолизосомальной системе и захваченных антигенпрезентирующей клеткой по механизму энодоцитоза. Рецепторы Т-клеток связываются с антигенными детерминантами, ассоциированными с МНС, поэтому специфичность этого связывания определяется не только структурой антигенного пептида, но и белками самого

МНС. У человека эти белки получили название HLA (Human Leukocyte Antigens, антигены лейкоцитов человека). При взаимодействии Т-лимфоцита с клеткой, презентирующей антиген, происходит стимуляция лимфоцита, которая ведет либо к его гибели, либо к пролиферации соответствующего Т-клеточного клона. Каждый из классов

МНС кодируется группой локусов (генов), представленных множественными аллелями.

Этот полиморфизм следует учитывать как при выявлении Т-эпитопов, так и при конструировании вакцин. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) инициируют запуск сложного каскада реакций, приводящих к гибели клеток, несущих соответствующие

Т-эпитопы. Большая часть ЦТЛ-клеток несет маркер CD8 и взаимодействует с MHC-I, чем и объясняется ключевая роль ЦТЛ в устранении клеток, пораженных внутриклеточной инфекцией. Клетки, распознающие пептиды, ассоциированные с MHC-II, или Т-хелперы

Th-лимфоциты), несут маркер CD4. Они разделяются на подгруппы, отличающиеся по набору продуцируемых ими цитокинов. Считается, что клетки подтипа Thl принимают участие в стимуляции цитотоксических реакций, а клетки подтипа Th2 стимулируют продукцию антител. Однако такое разделение не абсолютно. Представления о механизмах

Th-стимуляции антителообразования укладываются в достаточно четкую схему. Влимфоцит взаимодействует с поверхностным участком этого антигена (В-эпитопом) с помощью своего иммуноглобулинового рецептора. Связанный таким образом антиген подвергается интернализации и протеолизу с последующей презентацией полученных

14 пептидов в составе MHC-II. Th-лимфоциты связываются с В-лимфоцитами, несущими специфичные Т-эпитопы процессированного антигена. Отметим, что В-эпитопы, связываемые рецепторами В-клеток и презентируемые ими Т-эпитопы, как правило, относятся к разным частям антигена. Взаимодействие между Т-хелперами и В-клетками способствует запуску процессов пролиферации В-лимфоцитов. Часть размножающихся В-клеток дает начало плазматическим клеткам, синтезирующим антитела. Часть Т- и В-лимфоцитов, пролиферирующих после стимуляции, дает начало так называемым клеткам памяти, которые обуславливают более быстрое развитие иммунных реакций при вторичном ответе на соответствующий антиген. Собственно, на этом явлении и основана вакцинация. Более подробно эта информация изложена в [Ройт, 2000; Игнатов, 2002; Ярилин, 1999]. Прежде всего при разработке вакцины нужно определить эффекторные механизмы иммунного ответа, которые должны быть реализованы в ответ на введение препарата. Разные типы вакцинных конструкций индуцируют различные эффекторные механизмы. Синтетические пептиды и рекомбинантные белки вызывают в основном ответные реакции В-клеток и Т-клеток CD4+ с возможной Th-стимуляцией гуморального иммунитета. Для индукции цитотоксического иммунитета нужны другие носители - такие как вирусные векторы или ДНК-вакцины [Rappuoli, Guidice, 1999]. Важно учитывать и тип антител, которые индуцируются при данном способе введения. В тех случаях, когда воротами инфекции служат слизистые оболочки (пожалуй, самый распространенный из естественных способов инфицирования, характерный также и для ВИЧ-1, и гепатита В), антитела типа IgA играют ведущую роль в реакциях гуморального иммунитета. В связи с этим вполне обоснованна разработка мукозальных вакцинных препаратов, которые вводятся через слизистую [Rappuoli, Guidice, 1999].

Очевидно, что иммунный ответ на инфекцию гораздо сложнее, чем кратко описанный выше процесс. Более того, до сих пор не известны все особенности противовирусного и противобактериального иммунного ответа, поскольку каждый патоген создал собственную «систему избежания» иммунного ответа хозяина. Поэтому, создавая новые вакцины, необходимо учитывать все особенности конкретного патогена и особенности ответа на него иммунной системы хозяина. При этом выбор антигенов для конструирования вакцины должен осуществляться с учетом тех звеньев иммунитета, которые необходимы в борьбе с инфекцией. В связи с этим особое внимание необходимо уделять выбору способов представления создаваемой вакцины иммунной системе.

Далее в литературном обзоре будут более подробно описаны проблемы создания вакцин против гепатита В и ВИЧ-1, наиболее социально-значимых заболеваний в современном мире.

ВИРУС ГЕПАТИТА В

Вирус гепатита В, относящийся к семейству Hepadnaviridae, обнаруживается у человека и у обезьян [Robertson and Margolis, 2002]. Было показано, что изолятами ВГВ, выделенными у человека можно заражать обезьян [Barker et al., 1975]. Вопрос о возможности заражения человека вирусом гепатита В, циркулирующим в популяции обезьян, остается не выясненным. Существуют близкородственные вирусы - вирус гепатита пекинских уток, североамериканских сурков и земляных белок, которые служат моделью для исследования ВГВ [Ponzetto and Forzani, 1991; Cova et al., 1993].

Геном вируса гепатита В представляет собой кольцевую молекулу ДНК, состоящую из двух цепей, одна из которых - плюс-цепь на 1/3 короче минус-цепи. В геноме вируса закодировано четыре белка (рис.1). Ген "s" имеет три стартовых кодона, которые обеспечивают синтез трех белков разной длины. Самый маленький из них содержит только основную часть и имеет обозначение S (small). Второй по длине - белок М (medium), имеет дополнительный район, называемый preSl. Наиболее крупный белок L (long) состоит из трех частей - основной, preSl и preS2 районы. Поверхностные белки закреплены в липидной мембране и образуют оболочку вирусной частицы. Соотношение белков различной длины в оболочке 3:2:5 (L:M:S) [Heermann et al., 1984]. S-белок является каркасным, составляющим основную часть оболочки. PreSl район поверхностного белка несет сайт связывания с рецепторами гепатоцитов [Pontisso et al, 1989]. Функции района preS2 не ясны, но есть данные о сайте связывания сывороточного альбумина в районе рге82-белка [Krone et al., 1990].

Другой ген - "с" обеспечивает синтез двух белков НВс и НВе (рис. 1). НВс организуется в цитоплазме сначала в димерную форму, а затем в икосаэдрические частицы по 180 или 240 субъединиц, называемые кором или HBcAg. Внутри коровой частицы упаковывается геномная ДНК и молекула ДНК-полимеразы. НВе имеет дополнительный участок с N-конца белковой молекулы, позволяющий ему секретироваться из клетки. Присутствие этого антигена в сыворотке пациента позволяет судить о высоком уровне репликации вирусной ДНК. Несмотря на идентичность большей части аминокислотной последовательности НВс- и НВе-белков, антигенные и иммуногенные свойства двух антигенов различаются [Bichko et al., 1993]. Это отражает разницу третичной структуры белков и способность НВс-белка, в отличие от НВе, формировать частицы.

Два другие гена кодируют вирусную ДНК-полимеразу и Х-белок. Считается, что Х-белок является регуляторным и влияет на многие процессы жизненного цикла вируса и жизнедеятельность клетки-хозяина [Murakami, 2001].

Основной мишенью вируса являются гепатоциты, однако существует ряд работ, в которых указываются также и другие типы клеток, использующихся вирусом для репликации: эндокринные клетки поджелудочной железы, мононуклеарные клетки крови и некоторые другие [Yoshimura et al, 1981; Pontisso et al, 1984; Lieberman et al, 1987]. A

PreS2

М-белок (HBsAg+preS2)

S-белок (HBsAg)

Липидная мембрана

L-белок

HBsAg+preS2+preS 1)

HBcAg

ДНК вируса

Рис. 1.

Структура генома (А) и строение вирусиой частицы вируса гепатита В (Б).

Заражение вирусом гепатита В может происходить парентерально при переливаниях крови и других медицинских и немедицинских (внутривенное введение наркотических средств, маникюр, татуировки) манипуляциях, при половых контактах, а также при родах инфицированными матерями.

Способность накапливаться в высоких концентрациях в крови зараженных пациентов, высокая инфекционность и устойчивость вируса к действию окружающей среды обеспечивают широкое распространение вируса среди населения. Инкубационный период для ВГВ составляет 3-4 месяца. На его продолжительность влияет доза заражения. При постранфузионном заражении продолжительность инкубационного периода короче, т.к. инфицирующая доза выше.

Инфекция может протекать тремя различными путями - острый, хронический и фульминантный гепатит. Возможно так же бессимптомное вирусоносительство [Соринсон, 1996]. В случае развития острого гепатита первой в сыворотке обнаруживается ДНК вируса, а затем и другие маркеры инфекции - HBsAg и HBeAg. В результате развивающегося цитотоксического ответа инфицированные гепатоциты разрушаются, и небольшое количество HBcAg выходит из клеток. Несмотря на незначительную концентрацию в крови, этот сильнейший иммуноген вызывает образование антител сначала класса IgM, а затем и IgG. Через 3 недели появляются антитела к HBeAg, и только через месяц после заражения возникает гуморальный ответ к HBsAg. На рис.2А представлен график появления маркеров ВГВ в сыворотке больных острым гепатитом. Если иммунный ответ к вирусу недостаточно выражен, заболевание переходит в хроническую стадию. В этом случае ДНК вируса продолжает реплицироваться, антигены циркулируют в крови, а синтез антител осуществляется только к HBcAg. График изменения маркеров ВГВ в случае заболевания с исходом в хронизацию представлен на рис. 2Б.

Фульминантная форма заболевания встречается относительно редко, и причины генерализованного поражения печени точно не установлены. Существует масса гипотез и, среди главных причин обычно указывают мутации в геноме вируса и неадекватный иммунный ответ организма пациента [Bonino arid Brurtetto, 1993].

Поверхностный белок ВГВ имеет 9 субтипов, отражающих генетическую вариабельность вируса. Основная антигенная детерминанта - "а" является общей для всех субтипов, другие детерминанты (d, у, г, w) у разных субтипов представлены в различных сочетаниях. Наиболее распространенные в мире серотипы adw, adr, ayw. Для Российской Федерации характерно распространение ayw серотипа [Нетесоваи др., 2004]. Хотя

ДНК HBV

HUsA«

Анти-НВс IgG

Анти-HBs Ig

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 дни A

ДНК HBV Б

Рис. 2.

Динамика появления специфических маркеров HBV в сыворотке больных. А. Острое течение заболевания с последующим выздоровлением Б. Заболевание с исходом в хронизадию. Соринсон, 1996) основной вклад в гуморальный ответ дают антитела к "а" детерминанте, разница серотипов должна учитываться при вакцинации. Было показано, например, что сыворотка людей, вакцинированных поверхностным белком серотипа adw, взаимодействует с белком серотипа ayw в 2-3 раза слабее, чем с белком серотипа adw [Heijtink et al., 2002].

В протективном гуморальном ответе участвуют также районы preSl и preS2. Так, антитела к PreSl наблюдаются у пациентов с острым гепатитом В и не обнаружены у большинства хронических больных [Coursaget et al., 1991]. Отмечена корреляция между высоким уровнем содержания вирусной ДНК в крови и наличием preSl антигена. В то же время появление антител к данному району сопровождается уменьшением вирусной нагрузки и улучшением самочувствия пациентов [Mi et al., 1999]. В работе Нейрата [Neurath et al., 1989] показано протективное действие иммунизации шимпанзе пептидом 21-47 а. о. фрагментом preSl.

Противоречивые данные имеются об иммунном ответе к району preS2. Так, в одной из работ авторы указывают на наличие IgG к этому району у пациентов в острой фазе инфекции и отсутствие существенных титров антител в сыворотке хронически больных [Petit et al., 1992]. В работе других авторов [Suga el al., 1991], напротив, делается вывод об одинаковом иммунном ответе к этому району и при остром гепатите, заканчивавшимся выздоровлением пациента, и при развитии хронической инфекции. Тем не менее, моноклональные антитела к району preS2 обладают вирус-нейтрализующими свойствами [Ryu et al., 1997], а пептидные аналоги эпитопов данного района оказывают протективный эффект при иммунизации шимпанзе [Neurath et al., 1986].

Гуморальный иммунный ответ к HBcAg, по-видимому, не играет роли в элиминации вируса. При остром течении инфекции после проявления на клетках маркеров вируса (а это в основном HBcAg) развивается цитотоксический иммунный ответ и разрушение гепатоцитов, пораженных вирусом. В отсутствие у заболевших цитотоксического иммунного ответа заболевание переходит в хроническую стадию [Lohr et al., 1993; Missale et al., 1993]. В работе Чизари [Chisari, 2000] было показано, что этот механизм элиминации вируса из организма даже преобладает, особенно на первых этапах заболевания. Таким образом, клеточный ответ иммунной системы на вирус имеет существенное влияние на протекание заболевания, особенно в первые недели после заражения.

Вакцины против гепатита В на основе HBsAg Инактивированные вакцины

Первый опыт активной иммунизации против гепатита В принадлежит американскому педиатру С. Кругману. В 1971 году было показано, что прокипяченная сыворотка носителей ВГВ иммуногенна, не приводит к заражению и, следовательно, может быть использована в качестве вакцины [Krugman et al., 1971]. Впоследствии значительные усилия исследователей были направлены на очистку поверхностного антигена из сывороток пациентов и инактивацию остающегося в препаратах вируса. Было показано, что после различных способов инактивации (тепловое воздействие, ультрафиолет, обработка мочевиной и ферментами протеолиза) HBsAg в достаточной мере сохранял свои антигенные свойства [Karelin et al., 1980].

Результатом этих работ стала разработка коммерческого продукта Heptavax В, содержащей очищенный поверхностный белок ВГВ, обработанный формалином. Вакцина прошла клинические испытания. Более 1000 молодых людей Нью-Йорка, гомосексуальной ориентации были вовлечены в исследования. У 95% вакцинированных были обнаружены антитела к HBsAg, при этом титр антител определялся в течение не менее 2 лет. За этот период среди вакцинированных лиц, заболевших ГВ, было выявлено 3,2 %, в то время как в контрольной группе оказалось 25,6 % заболевших [Szmuness et al.,

1981]. Положительные результаты вакцинации были получены и для других групп риска - пациентов, нуждающихся в гемодиализе и медицинских работников [Szmuness et al.,

1982].

Таким образом, было доказано, что создание эффективной вакцины против ГВ возможно. Однако, инактивированные вакцины имели серьезные недостатки - очень высокая цена сырья - сыворотка крови и вероятность недостаточной инактивации ВГВ и других патогенов при производстве вакцины.

Вакцины на основе рекомбинантного HBsAg

Развитие генной инженерии сделало возможным синтез необходимых белков в прокариотических и эукариотических клетках. Попытка экспрессировать ген белка HBsAg в прокариотической системе Е. coli [Charnay et al., 1980] оказалась неудачной -рекомбинантный HBsAg не был гликозилирован и по антигенным характеристикам отличался от природного антигена. Эта проблема была решена с помощью другой системы экспрессии - Saccharomyces cerevisiae, в которой белки гликозилируются. В работе Валенсуэлы и соавт. [Valenzuela et al., 1982] впервые сообщалось о клонировании гена поверхностного белка в клетках дрожжей. В дальнейшем была показана антигенная и иммунологическая эквивалентность полученного белка и HBsAg, выделенного из сыворотки носителей ВГВ [Emini et al., 1986].

В настоящее время несколько зарубежных и отечественных фирм производят препараты вакцин на основе дрожжевого рекомбинантного HBsAg. Многочисленные клинические испытания подтвердили эффективность вакцины для различных групп населения. Так в одной из первых работ показано, что после трехкратной иммунизации вакциной "Энджерикс-В" (СмитКлайн Бичем Биомед) молодых людей со средним возрастом 20 лет сероконверсия происходит у 96% иммунизированных [Zuckerman, 1998]. При применении данной вакцины для новорожденных достигается уровень сероконверсии 98,3-100% [Poovorawan et al., 1992]. Были выявлены факторы, снижающие эффективность вакцинации - возраст старше 50 лет, избыточный вес и курение [Wood et al., 1993].

Важным показателем является не только процент лиц, у которых была выявлена сероконверсия, но и титр антител к HBsAg. Еще в работах по вакцинации препаратами, приготовленными из сывороток крови носителей ВГВ, было показано, что протективным является титр антител порядка 10 mIU/ml [Jack, 1999]. Надо отметить, что с течением времени после вакцинации титр антител неизбежно падает. И если изначально он составлял 100 mIU/ml, то снижение титра антител в десять раз происходит в течение первого года после вакцинации, а через 4 года титр антител уменьшается в сто раз [Jilg et al., 1988]. Клинические исследования, проводимые разными авторами, дают различающиеся средние результаты уровня титра антител, даже если применялся препарат одной фирмы и по единой схеме иммунизации [Treadwell et al, 1993]. Были проведены исследования, в которых попытались максимально приблизить антиген к природному аналогу, добиваясь синтеза HBsAg в клетках млекопитающих. Однако существенного преимущества перед HBsAg, продуцируемым в дрожжах, обнаружено не было [Diminsky etal., 1997].

Длительные наблюдения за массовой вакцинацией в эндемичных районах показали, что применение вакцин на основе HBsAg позволяет снизить заболеваемость в 10 раз. Например, на Тайване до начала компании по вакцинации новорожденных количество носителей ВГВ достигало 15-20% населения [Ni et al., 2001]. Через 15 лет были обследованы пятнадцатилетние подростки, получившие вакцину при рождении, и молодые люди 15-20 лет, которые родились раньше и не вошли в число привитых. Среди пятнадцатилетних у 0,7% обнаруживался HBsAg, в то время как во второй группе таких лиц оказалось 7%. Аналогичное исследование, проведенное до начала программы вакцинации, выявило 9,8% носителей HBsAg. Такой же успех был достигнут в северной Италии [Da Villa et al., 1998]. Заболеваемость острым гепатитом В уменьшилась с 63 случаев в год на 100.000 населения до 3 на 100.000, а количество носителей HBsAg уменьшилось с 6,8% до 0,7% за 15 лет.

Тем не менее, дрожжевая вакцина, применяемая сегодня, имеет ряд недостатков: высокая стоимость препарата и необходимость трехкратного введения для достижения длительного протективного ответа. Эти факторы мешают осуществлению масштабных программ профилактики, особенно в развивающихся странах. Следует также отметить, что элиминацию вируса гепатита В нельзя осуществить в короткий срок массовой вакцинации, как это произошло с вирусом натуральной оспы, т. к. существует резервуар вируса - хронические больные гепатитом В, лечение которых на сегодняшний день является нерешенной проблемой. Таким образом, в случае гепатита В массовая вакцинация должна охватывать большой временной промежуток, не меньше продолжительности жизни носителей вируса.

При массовой вакцинации выявилась еще одна проблема - мутации в геноме вируса, позволяющие патогену избежать элиминации из организма вакцинированных. Так, в работе [Carman et al, 1990] описано 44 случая заболевания детей в больницах южной Италии после вакцинации. У 32 пациентов были обнаружены маркеры активной репликации вируса. Исследования вирусных геномов показали, что большинство изолятов вируса содержали мутации в районе основной антигенной детерминанты HBsAg -аминокислотные замены или делеции. В другом регионе проведения вакцинации - в Китае из 176 здоровых иммунизированных взрослых людей через год после вакцинации у шести была обнаружена вирусная ДНК в сыворотке крови. В четырех изолятах вируса были выявлены мутации в главной антигенной детерминанте HBsAg [Не et al, 2001].

Еще одна проблема применения современных вакцин - не 100%-ная эффективность. Этот параметр не так важен для массовых вакцинаций населения, 5-10% лиц не внесут кардинальных изменений в эпидемиологическую ситуацию. Однако есть группы профессионального риска, в первую очередь медицинские работники, для которых важна гарантия защиты от заболевания гепатитом В.

Одно из направлений улучшения вакцины на основе S антигена - включение в ее состав районов preSl и preS2 HBsAg. Испытания вакцин, включающих в себя не только HBs, но и районы preS целиком или частично, показали, что такие препараты у 90-95% вакцинированных индуцируют синтез антител к preS районам [Miskovsky et al., 1991]. Более того, такие препараты вызывали синтез антител к HBsAg у 65% пациентов, иммунная система которых раньше не отвечала на стандартную вакцину. Исходя из роли в иммунном ответе районов preS (см. гл. 1. 2) можно ожидать, что вакцины, включающие preSl и preS2, окажутся в некоторых случаях весьма полезными.

Таким образом, несмотря на эффективность существующих препаратов, есть необходимость продолжать исследования по разработке новых вакцин для профилактики гепатита В, превосходящих или дополняющих используемую в настоящее время вакцину.

Вакцины на основе HBcAg

Кроме поверхностного белка ВГВ, большой интерес для создания вакцины представляет коровый белок или HBcAg. HBcAg представляет собой частицы диаметром 28 нм, состоящие из 180 или 240 мономеров белка. Третичная структура белка HBcAg точно не установлена, так как присутствие двух форм частиц HBcAg затрудняет ренгеноструктурные исследования этого белка. Тем не менее, после экспериментов с использованием криомикроскопии [Crowther et al., 1994, Pumpens et al, 2001] была предложена модель укладки полипептидной цепи HBcAg (рис.3). Исследования, проведенные с помощью антител и протеаз, позволили картировать участки белка, представленные на поверхности частиц HBcAg. Одним из таких районов оказался ранее выявленный иммунодоминантный эпитоп HBcAg (78-82 а. о.) [Salfeld et al., 1989]. HBcAg обладает уникальными иммунологическими качествами.

Он вызывает сильный гуморальный иммунный ответ у всех видов лабораторных животных. Например, в работе [Milich et at, 1987] было иммунизировано 7 линий мышей. У всех линий мышей после иммунизации HBcAg в сыворотке крови обнаруживался значительный титр антител к коровому белку. В то же время иммунизация поверхностным белком ВГВ индуцировала значительно более слабый гуморальный ответ у этих же линий мышей, а у двух других линий мышей антител к HBsAg не было обнаружено вовсе. Надо отметить, что для индукции значительного титра антител при иммунизации поверхностным белком необходимо использовать адьювант. Коровый белок вызывает напряженный иммунный ответ и без использования адъювантов [Milich et al., 1997].

HBcAg является как Т-зависимым, так и Т-независимым иммуногеном [Milich et al., 1987]. Но в отличие от многих Т-независимых антигенов, индуцирующих в основном антитела IgM класса и не оставляющих иммунологической памяти, иммунизация коровым белком стимулирует гуморальный ответ с существенным титром антител изотипа IgG3, характерным для Т-независимых антигенов 2 типа и образование клеток памяти даже у бестимусных мышей. Таким образом, HBcAg способен вызывать иммунный ответ и при патологиях иммунной системы, что очень важно для создания вакцин. В то же время, коровый белок является и Т-зависимым антигеном, так как при иммунизации мышей с Т-лимфоцитами титры антител в сыворотке значительно выше, чем у бестимусных мышей, иммунизированных HBcAg.

Рис. 3. Пространственная структура HBcAg моделированная на основе данных криомикроскопии [Crowther et al., 1994. Pumpens et al, 2001]. Согласно Краузеру, сборка коровых частиц начинается с димеризации двух субъединиц НВс-белка. MIR-(major immunodomonant region) основной иммунодоминантный район HBcAg.

Такие свойства HBcAg частично можно объяснить его полимерной структурой. Иммунизация мышей мономерным коровым белком показала, что сила гуморального ответа значительно снижается по сравнению с иммунным ответом на целые частицы [Milich et al., 1987]. Другой белок ВГВ - HBeAg, имеющий сходную аминокислотную последовательность с белком кора, но не формирующий полимерных частиц, также стимулирует значительно более слабый гуморальный иммунный ответ по сравнению с HBcAg как при иммунизации лабораторных животных рекомбинантными белками, так и в течение инфекции ВГВ у людей [Milich et al., 1997]. С другой стороны, полимерность белка, по-видимому, не является достаточным условием его высокой иммуногенности, так, поверхностный белок ВГВ тоже имеет полимерную структуру, но является более слабым иммуногеном, чем HBcAg.

Высокая иммуногенность HBcAg, вероятно, обусловлена особенностями взаимоотношений HBcAg с В-лимфоцитами иммунной системы. Кроме своих непосредственных функций синтеза антител, В-клетки могут выступать в качестве антигенпрезентирующих клеток. В-клетки очень эффективно выполняют функцию презентации антигена, т. к. несут на своей поверхности иммуноглобулиновые рецепторы, значительно увеличивающие вероятность взаимодействия клетки с антигеном. Однако в организме до встречи с антигеном количество специфичных В-клеток ничтожно мало, и презентация антигена В-клетками играет несущественную роль. Как было показано в работе Као [Cao et al., 2001], HBcAg способен неспецифично связываться с иммуноглобулинами на поверхности наивных В-клеток. В результате HBcAg способен присоединяться к иммуноглобулиновым рецепторам 4-8% В-клеток неиммунизированных мышей, в то время как другие антигены способны взаимодействовать не более чем с 0,0001% В-клеток. Также показано, что HBcAg увеличивает на поверхности В-клеток количество молекул В7-рецепторов, необходимых для презентации антигена. Таким образом, HBcAg может активно презентироваться В-клетками, что и обеспечивает высокую чувствительность иммунной системы к этому белку. Для индукции специфического ответа у мышей необходимо ничтожное количество HBcAg - 0,025 мкг [Milich et al., 1997]. Количество коровых частиц без внешней оболочки вируса, попадающих в кровь пациентов, инфицированных ВГВ, также ничтожно. Тем не менее, гуморальный иммунный ответ к HBcAg развивается гораздо быстрее, чем к другим белкам ВГВ.

Т-хелперные клетки, активируемые коровым белком, стимулируют и В-лимфоциты, синтезирующие антитела, специфичные к поверхностному белку вируса ВГВ. В результате иммунизация мышей поверхностным белком совместно с HBcAg усиливает гуморальный иммунный ответ к поверхностному белку [Lobaina et al., 2005]. Это является

26 одной из возможных причин протективного действия HBcAg при иммунизации этим белком шимпанзе у electron cryomicroscopy. Iwarson et al, 1985]. HBcAg принадлежит значительная роль и в стимуляции цитотоксического ответа. Было показано, что во время острой фазы инфекции у большинства пациентов развивается цитотоксический иммунный ответ к клеткам, несущим на поверхности эпитопы HBcAg в комплексе с MHCI. Пациенты, у которых такой реакции не наблюдалось, часто переходили в стадию хронического заболевания гепатитом В [Penna et al., 1997; Ferrari et al., 1990].

Цитотоксический ответ был отмечен и при иммунизации мышей рекомбинантным HBcAg. Увеличение концентраций IL-2 и IFN-y в крови и соотношение изотипов антител в сыворотке IgGl/IgG2a свидетельствуют о значительной стимуляции цитотоксического ответа [Milich et al., 1995]. Способность стимулировать Т-клеточный иммунный ответ позволяет рассматривать коровый антиген в качестве компонента терапевтических вакцин.

Важным свойством HBcAg является способность формировать коровые частицы во всевозможных системах экспрессии, как в эукариотических [Kniskern et al., 1986; Zhou and Standring, 1991; Roossinck et al., 1986], так и в бактериальных [Pasek et al., 1979; Hardy et al., 1981]. Это качество HBcAg весьма привлекательно и с точки зрения технологии производства вакцин на основе этого белка. Все выше перечисленные свойства HBcAg указывают на то, что он идеально подходит на роль носителя чужеродных антигенных детерминант.

Большое число хронических больных гепатитом В ставит острую проблему лечения таких пациентов. Определенные успехи в лечении этого заболевания были достигнуты применением препаратов противовирусной терапии, таких как ламивудин, и цитокиновой терапией. Тем не менее, эффект лечения достигается у 30-40%, и у половины ответивших на лечение пациентов возникает рецидив [Thomas et al., 1994; Malik and Lee, 2000]

Инфекция ВГВ может переходить в хроническую стадию вследствие толерантности организма к поверхностным антигенам ВГВ при перинатальном заражении, когда иммунная система еще не сформирована, или во взрослом состоянии по еще не очень ясным причинам. Факторами, влияющими на возникновение хронического заболевания, могут служить дефекты иммунной системы, сопутствующие заболевания и т.д. Таким образом, для элиминации вируса из организма необходимо преодолеть барьер толерантности, вызвать продукцию антител к поверхностным антигенам ВГВ.

Ряд попыток было предпринято для использования в качестве терапевтического препарата рекомбинантный белок HBsAg. При введении HBsAg пациентам с хронической формой гепатита В было обнаружено уменьшение вирусной нагрузки у большинства

27 пациентов. Временные улучшения происходят примерно у 30 % пациентов, и эта цифра существенно не увеличивается при использовании дополнительных средств терапии [Pol et al., 1998]. Иной подход заключается в использовании иммуногенных свойств другого белка ВГВ - HBcAg, способного активно стимулировать клеточный ответ. Как было показано в ряде работ [Lohr et al., 1993; Missale et al., 1993; Chisari, 2000], клеточный ответ иммунной системы на коровый антиген вируса имеет существенное значение для исхода заболевания.

Иммунизация препаратом, содержащим HLA А2 ЦТЛ-эпитоп HBcAg (18 - 27 а. о.) и два остатка пальмитиновой кислоты, индуцировала у здоровых людей цитотоксический ответ, сравнимый с ЦТЛ-ответом пациентов с острой фазой гепатита В [Livingston et al., 1997]. Экспериментаторы считают, что одного ЦТЛ-эпитопа недостаточно для преодоления толерантности. Более напряженный ЦТЛ-ответ возникает, если к ЦТЛ-эпитопу добавить Т-хелперный эпитоп. Эксперименты на многих объектах, в том числе на HIV, LCMV, вирусе герпеса, подтверждают, что без поддержки Т-хелперных клеток индукция ЦТЛ-ответа значительно ниже [Shirai et al., 1994; Von Herrath et al., 1996; Cardin et al., 1996]. Однако, присоединение Т-хелперного эпитопа столбнячного токсина 830-843 а. о. к ЦТЛ-эпитопу HBcAg и к остаткам пальмитиновой кислоты не дало в результате эффективной терапевтической вакцины. Иммунизация этим пептидным препаратом хронически больных ГВ пациентов не вызывала элиминации вируса и существенно не влияла на клиническую картину заболевания [Heathcote et al., 1999]. ЦТЛ-ответ у иммунизированных пациентов повысился, однако остался существенно ниже, чем у пациентов в острой фазе инфекции ВГВ. Очевидно, единичные эпитопы активных белков не способны вызвать достаточный иммунный ответ у хронически инфицированных ВГВ пациентов. Учитывая разнообразие типов HLA в популяции, трудно предполагать, что использование одного эпитопа будет перспективным для создания вакцин.

Недавно был разработан новый подход к исследованию реакций иммунного ответа человека на вакцинные и лечебные препараты. Для эксперимента используются мыши, содержащие периферические лимфоциты крови человека - тримерные мыши. Химерные животные получают следующим образом: мышей подвергают радиоактивному облучению, уничтожая тем самым клетки костного мозга. Затем внутривенно вводят клетки костного мозга мышей с SCID (тяжелый, комбинированный иммунодефицит) и перитонеально вводят периферические лимфоциты крови человека. Такие химерные организмы позволяют исследовать реакцию В- и Т-звеньев иммунного ответа человека на вакцинацию, проводя эксперименты на лабораторных животных. Если для получения тримерных мышей использовать периферические лимфоциты крови людей, хронических носителей патогена, то можно изучать и терапевтический эффект вакцинации [Reisner and Dagan, 1998].

Используя тримерных мышей с лимфоцитами здоровых людей, Бочер и соавторы показали эффективную индукцию В-клеточного и Т-хелперного ответа после иммунизации рекомбинантным HBsAg [Bocher et al., 1999]. Но при иммунизации мышей с периферическими лимфоцитами крови пациентов, хронически больных ГВ, стимуляция иммунного ответа обнаружена не была [Bocher et al., 2000]. Таким образом, препараты на основе HBsAg не способны преодолеть толерантность организма к вирусу у хронически инфицированных пациентов. Позднее теми же авторами были проведены исследования и с использованием HBcAg. Была показана индукция Т-хелперов и цитотоксических клеток после иммунизации химерных животных рекомбинантным белком HBcAg или ДНК-вакциной, содержащей ген HBcAg, как в случае тримерных мышей, содержащих периферические лимфоциты здоровых людей, так и в случае мышей, содержащих лимфоциты крови пациентов, хронически больных гепатитом В [Bocher et al, 2001]. Хотя клинические испытания конструкций на основе HBcAg еще не были проведены, данные, полученные В. Бочер с соавторами, свидетельствуют о том, что HBcAg может оказаться более эффективным терапевтическим средством, чем HBsAg.

Способы доставки антигенов ВГВ

Новые направления в вакцинологии связаны в основном со способом доставки вирусных антигенов. Применение различных средств доставки антигенов может позволить существенно удешевить вакцинный препарат, использовать неинъекционный путь введения препарата, стимулировать не только системный иммунный ответ, но и иммунитет слизистых, уменьшая вероятность передачи вируса половым путем, а также корректировать иммунный ответ, усиливая стимуляцию клеточного звена иммунитета. Следует отметить, что гепатит В оказался очень удачным объектом, на котором молекулярные биологи начали отрабатывать новые подходы к созданию вакцин. Вакцина на основе HBsAg не только стала первой рекомбинатной вакцины, но и первые ДНК-вакцины, а также и растительные вакцины были сконструированы на его основе.

ДНК-вакцины против вируса гепатита В

Новые перспективы в вакцинологии открылись в начале 90-х годов прошлого столетия, когда было показано, что простая инъекция плазмидной ДНК в мышцу приводит к поглощению этой ДНК клетками и экспрессии кодируемого плазмидой репортерного гена [Wolff et al., 1990]. Сравнительно простой способ конструирования и возможность использования единого подхода ко многим патогенам позволили в короткие сроки создать ряд кандидатнных ДНК-вакцин к широкому спектру вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций.

ДНК-вакцина представляет собой бактериальную плазмиду, содержащую ген одного или нескольких антигенов инфекционного агента под контролем эукариотического промотора. ДНК-вакцины сравнительно просто получить в значительных количествах. Причем весь производственный процесс предельно унифицирован - меняются только гены, которые включаются в плазмиду. ДНК-вакцины производятся просто, дешево и безопасно, так как этот процесс включает в себя лишь культивирование непатогенных бактерий, содержащих гибридную плазмиду, с последующим выделением плазмидной ДНК. Поскольку ДНК-вакцины включают меньшее число компонентов, они менее аллергенны по сравнению с цельновирусными вакцинами. Наконец, ДНК-вакцины устойчивы и могут, в растворе или в сухом виде, храниться при обычных условиях, выдерживая высокие и низкие температуры и разный уровень влажности.

ДНК-вакцины обладают тем преимуществом, что они мимикрируют презентацию антигенов, подобно тому как это происходит в естественных условиях. При внутрикожном или внутримышечном введении в организм рекомбинантная плазмидная ДНК попадает в ядро клеток, где происходит транскрипция матричной РНК с ее последующим выходом в цитоплазму клетки, где с нее транслируется целевой белок. После прохождения посттрансляционной модификации он экспонируется на наружной клеточной мембране и становится доступным для имму некомпетентных клеток. Введение ДНК-вакцин индуцирует развитие полноценного иммунного ответа с наработкой и специфических антител, и клонов специфических Т-лимфоцитов. Титры индуцируемых специфических антител зависят от дозы, кратности (одно- или многократно) и пути введения ДНК-вакцины. Продолжительность продукции антител значительно варьирует в зависимости от используемой модели ДНК- вакцины и может достигать до 1,5 лет [Deck et al, 1997, Robinson et al., 1997]. Показано, что ДНК-вакцины индуцируют образование антител всех классов (IgG, IgM, IgA). При этом среди IgG-антител преобладает субтип IgG2a, который отличается высокой аффинностью. Следует отметить, что помимо антигенсвязывающих, образуются вируснейтрализующие антитела. Последнее, в частности, может служить доказательством того, что целевой белок, экспрессируемый рекомбинантной плазмидой, имеет конформационную структуру, сходную с таковой природного нашвного антигена [Donnelly et al., 1996]. В отличие от убитых и субъединичных вакцин, ДНК-вакцины, так же как и вирусный агент, презентируются в составе комплекса МНС класса I с целевым антигеном, который синтезируется в цитоплазме клеток. При этом индуцируется полноценный клеточный иммунный ответ с активацией субпопуляции Т-хелперов первого типа и клона цитотоксических лимфоцитов.

При использовании ДНК-вакцин синтез иммуногенов происходит непосредственно в клетках хозяина, что снимает проблему неправильного процессинга и выделения рекомбинантных белков. ДНК-вакцинация имитирует представление антигена клеткам иммунной системы при поражении вирусом, т.к. белок синтезируется непосредственно в цитоплазме, а эпитопы антигена экспонируются на поверхности клетки в комплексе с МНС I. В результате введения ДНК-вакцин Т-клеточное звено иммунного ответа стимулируется в большей степени. Таким образом, этот способ введения антигена наиболее эффективен при создании иммунитета против вирусных инфекций.

В ряде работ [Davis et al., 1996; Bohm et al., 1996; Geissler et al., 1997] иммунизация мышей ДНК-вакциной, содержащей ген HBsAg, стимулировала формирование выраженного цитотоксического ответа и индукцию Т-хелперов. Цитотоксический ответ обнаруживался уже через неделю после иммунизации и прослеживался в течение нескольких месяцев [Geissler et al, 1997]. Индуцировался и гуморальный иммунный ответ. Высокий титр антител, преимущественно IgG2a изотипа, наблюдался на 4-8 неделе и сохранялся по крайней мере в течение 17 недель после однократной инъекции. Титр антител увеличивался при введении бустерной дозы ДНК-вакцины или рекомбинантного HBsAg [Davis et al., 1996а].

Испытание ДНК-вакцины с геном S-антигена на шимпанзе показало, что двукратное введение 2 мг препарата индуцировало высокий уровень антител, до 1100 mUI/ml. Однако титр антител быстро снижался, и его удавалось сохранить на длительный срок только после двух дополнительных инъекций. Введение более низких доз (400 мкг) не способствовало формированию устойчивого уровня антител в сыворотке крови, и титр антител не превышал 60 mUI/ml [Davis et al., 1996b]. Трехкратная иммунизация новорожденных шимпанзе ДНК-вакциной не стимулировала гуморальный ответ, но оказалась достаточной для предотвращения инфекции после заражения животных [Prince et al., 1997].

Кроме этого, проводились исследования ДНК-вакцин, содержащих гены белков HBcAg и HBeAg. ДНК-вакцины, содержащие эти гены, индуцировали примерно одинаковый иммунный ответ [Kuhrober et al., 1997]. Поливалентная ДНК-вакцина, содержащая гены поверхностного и корового белков ВГВ, стимулировала гуморальный и клеточный ответу мышей разных линий к обоим белкам [Wild et al., 1998].

Существенную роль в индукции иммунного ответа играет количество синтезированного антигена в клетках организма. Для оптимизации экспрессии гена были испробованы несколько эукариотических промоторов: промоторы ранних генов

31 цитомегаловируса и вируса SY40, промотор гена белка десмина, активно транскрибирующегося в мышцах [Cazeaux et al., 2002; Xiang et al, 1995; Kwissa et al, 2000]. При использовании всех перечисленных последовательностей инициации транскрипции эффективно индуцировался гуморальный ответ. Следует отметить, что иммунизация животных ДНК-вакциной с промотором цитомегаловируса позволяла добиться более высокого гуморального ответа, чем при вакцинации конструкцией с промотором гена десмина [Cazeaux et al., 2002]. Это, вероятно, обусловлено тем, что промотор цитомегаловируса обеспечивает эффективную транскрипцию целевого гена не только в специализированных клетках мышц.

Представление вирусных антигенов иммунной системе после введения ДНК-вакцины происходит совместно с молекулами МНС I класса. При этом вирусные антигены распознаются специфическими Т-лимфоцитами не как полноразмерные белки, а как короткие пептиды (8-12 а. о.), ассоциированные со специфическими молекулами МНС I класса. Эти короткие антигенные эпитопы появляются из вирусных цитоплазматических белков в результате протеасома-опосредуемого процессинга. Поэтому для увеличения иммуногенности поли-СТЬ-эпитопных вакцин необходимо стремиться к созданию конструкций, обеспечивающих их эффективный процессинг и освобождение детерминант. Действительно, было показано, что увеличенная деградация белков повышает продукцию, презентацию и иммуногенность антигенных пептидов [Livingston et al., 2001].

Возможно повышение эффективности ДНК-вакцин путем введения в их состав генов цитокинов. Иммунизация мышей ДНК-вакцинами, содержащими гены разных цитокинов, показала, что введение генов 1L-2,1L-12, IFN-y [Chow et al., 1998;Niethammer etal., 2001; Du et al., 2003] увеличивает цитотоксический ответ, при этом секретируются антитела преимущественно IgG2a субтипа. Введение в состав вакцины гена IL-4 увеличивает синтез иммуноглобулинов субтипа IgGl и ведет к снижению цитотоксического ответа [Chow et al., 1998].

Таким образом, исследования на животных убедительно показывают возможность вакцинации против ВГВ ДНК-вакцинами.

Клинические испытания ДНК-вакцины, содержащей ген поверхностного белка ВГВ, начались в 90-х годах. Была использована низкая доза плазмидной ДНК - 0,25 мг. Двукратно введенный в кожу сорбированный на золоте препарат ДНК-вакцины вызвал высокий титр антител только у одного из вакцинируемых [Tacket et al., 1999]. Использование большей дозы препарата (4 мг) позволило достичь индукции гуморального ответа у всех 12 испытуемых, титр антител составлял не менее 10 mUI/ml. Среди индуцированных Т-хелперных клеток преобладали Txl. Вакцинация стимулировала развитие цитотоксического ответа, и препарат ДНК-вакцины хорошо переносился испытуемыми.

Доставка антигенов ВГВ с помощью вирусных носителей

Рекомбинантные вирусы, несущие гены белков патогена, также могут служить векторами доставки антигена в организм. Этот подход сочетает в себе преимущества ДНК-вакцины: синтез белка происходит в организме хозяина со всеми посттрансляционными модификациями. Кроме того, в отличие от доставки с помощью ДНК-вакцин, антиген попадает в организм целенаправленно, большое количество антигенпрезентирующих клеток принимают участие в активации иммунного ответа. Вирус-носитель является дополнительным стимулятором иммунной системы, вызывая синтез цитокинов. При введении рекомбинантных вирусов через слизистые, формируется мукозальный иммунный ответ.

Наиболее изученным вирусным вектором доставки является вирус осповакцины, который имеет большую емкость, стабильность и делает возможным создание поливалентных вакцин. Применение данного вируса в качестве вакцины в течение длительного времени и большой объем накопленных знаний о взаимоотношении данного вируса и организма человека объясняют большое внимание исследователей к этому вектору доставки.

Первые рекомбинантные штаммы вируса осповакцины содержали основной белок оболочки ВГВ - HBsAg. Синтезируемый белок подвергался гликозилированию и сборке в частицы, подобные нативным частицам поверхностного антигена. Иммунизация мышей такими штаммами показала весьма обнадеживающие результаты, так как титр антител к HBsAg был высоким [Watanabe et al, 1989]. Однако иммунизация шимпанзе не приводила к появлению сколько-нибудь заметного титра антител, хотя и защищала часть обезьян от инфекции ВГВ, вероятно, за счет активации цитотоксического иммунного ответа [Moss et al., 1984]. Для повышения эффективности вакцины в ее состав вводились последовательности, кодирующие районы preS поверхностного белка, гены HBcAg и HBeAg [Kunke et al, 1993; Nemeckova et al, 1991; Беляев и др., 1990]. Однако препараты данного типа пока не получили применения в медицинской практике из-за потенциальной возможности развития осложнений.

Аденовирусные вектора также использовали для создания нового типа вакцин против ГВ. Аденовирусы, несущие ген HBsAg, обеспечивали продукцию белка в клетках млекопитающих. При вакцинации рекомбинантные штаммы способны вызывать ответ на HBsAg, при этом титр антител к аденовирусу тоже высок [Hung et al., 1988]. Вакцинация шимпанзе рекомбинантными аденовирусами не позволила полностью защитить животных от инфекции ВГВ [Levrero et al, 1991]. Попытка вакцинировать людей аденовирусами, содержащими ген HBsAg, не привела к индукции синтеза специфических антител [Tacket et al, 1992]. Это может быть связано с наличием иммунитета к носителю, если вакцинируемые ранее уже были инфицированы дикими штаммами аденовируса. Спорный вопрос о безопасности применения гибридных аденовирусов с учетом низкой протективной активности таких векторов не позволяет надеяться на успешное создание вакцины на основе рекомбинантных аденовирусов.

Использовались и другие вирусные вектора доставки - полиовирус [Cho et al., 2000], вирус кори [Singh et al., 1999] и ретровирусы [Sallberg et al, 1997]. Рекомбинантные вирусы были способны индуцировать цитотоксический и гуморальный иммунный ответ к антигенам ВГВ, но протективные свойства таких вакцин не исследовались.

Съедобные вакцины (трансгенные растения)

Одним из новых подходов к доставке антигенов в организм является создание трансгенных растений, продуцирующих белки патогена. Трансгенные растения интересны в качестве векторов доставки, так как синтез белка происходит со всеми характерными эукариотам посттраскрипционными модификациями, доставка антигена происходит перорально, нет необходимости инъекций, и производство таких препаратов легко наладить. Низкая стоимость препарата позволила бы провести массовые вакцинации населения даже в развивающихся странах. Для разработки вакцин такого типа используются различные сельскохозяйственные культуры - люпин, томаты, картофель, соя, салат, бананы и др. Показано, что белки различных патогенов, синтезированных в растениях, могут индуцировать иммунный ответ у животных и человека, употребивших в пищу такие трансгенные продукты [Kong et al., 2001].

Интенсивно идут разработки по созданию трансгенных растений, синтезирующих поверхностный белок ВГВ. В работе Капусты с соавт. [Kapusta et al., 1999] показано, что двукратное употребление в пищу 200 г трансгенного салата позволило увеличить уровень антител к HBsAg в сыворотке крови вакцинированных людей до 10 mUI/ml, считающегося протективным. К сожалению, титр антител снизился в 10 раз через месяц.

Главная проблема создания вакцин на основе трансгенных растений - слишком низкая доза антигена, способная дойти до антигенпрезентирующих клеток. В работе [Kong et al., 2001] улучшение поглощения антигена клетками эпителия кишечника было достигнуто с помощью создания химерного белка HBsAg с холерным токсином. У мышей, которым скармливали три раза по 5 г картофеля, продуцирующего такой химерный белок, формировался напряженный гуморальный иммунный ответ, титр антител достигал 100 mUI/ml. В группе мышей, которым скармливали картофель с HBsAg без холерного токсина, титры антител не превышали 10 mUI/ml. Скармливание животным вареного трансгенного картофеля не приводило к синтезу антител, хотя при последующем введении антигена развивался вторичный иммунный ответ на HBsAg. Увеличить количество антигена, попадающего в организм, можно и за счет повышения его синтеза клетками растений. В вышеописанных экспериментах доля антигена составляла не более 0,00001% от общей биомассы.

Таким образом, дальнейшие усилия по созданию вакцин на основе трансгенных растений должны быть направлены на увеличение продукции антигена, улучшение поглощения антигена клетками кишечника, и необходимо уделить больше внимания культурам, не требующим термической обработки для употребления в пищу.

Штаммы сальмонелл как вектора доставки антигенов ВГВ

Аттенуированные штаммы сальмонелл - наиболее изученный бактериальный вектор доставки чужеродных антигенов. Множество работ в этом направлении объясняется хорошей изученностью аттенуированных штаммов, полученных при создании живых вакцин против сальмонеллеза и брюшного тифа.

Клетки сальмонелл проникают в лимфатическую систему через М-клетки Пейеровых бляшек, расположенных на стенках тонкого кишечника. Распространяясь по лимфотоку, клетки сальмонелл попадают в лимфатические узлы и селезенку, где фагоцитозом захватываются макрофагами и дендритными клетками. Таким образом, создавая рекомбинантные сальмонеллы, осуществляющие синтез белков патогена, можно получать живые вектора, которые могут обеспечить адресную доставку целевого антигена иммунной системе. Бактериальные вектора, инвазируя слизистую кишечника, индуцируют мукозальный иммунный ответ, что весьма важно при создании вакцин против ряда вирусных инфекций, передающихся половым путем. Кроме того, несмотря на то, что клетки сальмонелл не проникают в цитоплазму эукариотических клеток и остаются ассоциированными с фагосомами, они стимулируют как гуморальный иммунный ответ, так и клеточное звено иммунитета.

В настоящее время создан широкий спектр аттенуированных штаммов Salmonella enterica различных сероваров - S. typhi, S. typhimurium, S. choleresis, S. enteritidis. В первых работах по созданию таких штаммов использовались химические мутагены и встраивающиеся в геномную ДНК сальмонелл бактериофаги. С помощью таких приемов были созданы ауксотрофные штаммы с нарушенным синтезом ароматических аминокислот - аго-мутанты. Аттенуированные штаммы сальмонелл разных сероваров, как с одной, так и с двумя аго-мутациями, показали себя безопасными при больших дозах введения и в то же время вызывали напряженный иммунный ответ к инфекции дикими штаммами сальмонелл [Hoiseth and Stacker, 198 la; Dougan et al, 1987].

Другой тип аттенуации - мутации по генам аденилат-циклазы (суа) и рецептора цАМФ. Продукты этих генов влияют на экспрессию широкого спектра генов, затрагивающих утилизацию Сахаров, аминокислот, репертуар белков клеточной стенки и др. Такие изменения отражаются и на времени генерации штамма, так аттенуированный Д суа, Д crp S. typhimurium имеет время генерации в два раза превышающее время генерации дикого штамма. Исследования иммуногенных свойств мутантов такого типа показали высокую степень аттенуации штаммов при сохранении иммуногенных свойств [Curtissand Kelly, 1987].

С разработкой методов направленного мутагенеза появилась возможность создавать аттенуированные штаммы с мутациями непосредственно в генах, ответственных за патогенность сальмонелл и выживание внутри клеток хозяина. Так, были получены штаммы с делециями по генам локуса phoP/phoQ, отвечающего за перестройку клеток сальмонелл в агрессивной среде фагосом эукариотической клетки [Galan and Curtiss, 1989]. Также были получены сальмонеллы с мутациями в генах ошрС и ompF, генах системы репарации, генах патогенности SP1-I и SPI-II - ssa, sse, spt, sop, sip, гене ДНК аденин метилазы dam, и др. [Raupach and Kaufmann, 2001]. Сравнительные исследования эффективности доставки гетерологичных антигенов штаммами сальмонелл с различными типами аттенуации показали высокую эффективность аго, суа crp, sseC, htrA мутантов, более низкую эффективность показали мутанты по генам pur, aro-htrA, sseD [Dunstan et al., 1998; Medina et al., 1999; Roberts et al., 2000].

Использование аттенуированных штаммов сальмонелл для доставки чужеродных антигенов было начато с попыток создания бивалентных вакцин, способных защитить вакцинированного не только от брюшного тифа, но и от другой инфекции. Для создания живых аттенуированных вакцин на основе сальмонелл, пригодных для человека, как считали исследователи, необходим серовар S. typhi, специфичный человеку. Серовар

S. typhimurium использовался как модель, пригодная для исследования вакцины на мышах, т.к. инфекция, вызываемая S. typhimurium у мышей очень сходна по многим параметрам с инфекцией, вызываемой S. typhi у человека [Pasetti et al., 2003]. После проведения исследований вакцины на мышах, предполагалось создание аналогичного рекомбинантного штамма S. typhi. Однако клинические исследования нескольких

36 вакцинных рекомбинантных штаммов S. typhi показали, что иммунный ответ на гетерологичный антиген у человека на эти штаммы низок или не детектируется совсем, в то время как на мышах результаты были более чем обнадеживающими. Так, клинические исследования аттенуированного штамма S. typhi (cya-,crp-, asd-), несущего плазмиду, обеспечивающую синтез химерного HBcAg, закончились неудачей [Nardelli-Haefliger et al., 1996; Tacket et al., 1997]. Оральное и ректальное введение суспензий клеток сальмонелл легко переносилось испытуемыми и не вызывало серьезных побочных эффектов, но специфического иммунного ответа к химерному HBcAg зафиксировано не было, хотя присутствовали IgG и секреторные IgA антитела на собственные антигены сальмонеллы. Иммунизация мышей аналогичным штаммом S. typhi вызывала индукцию высокого иммунного ответа [Schodel et al., 1994].

Аналогичные результаты были получены в случае использования продуцентов столбнячного токсина и белков Helicibacter pylori [Tacket et al., 2000; DiPetrillo et al,

1999]. В то же время вакцинация S. typhimurium (PhoPc,PhoQc), продуцирующая тот же белок Helicibacter pylori, стимулировала синтез антител к антигену у половины вакцинированных [Angelakopoulos and Hohmann, 2000].

Таким образом, распространенное мнение о том, что серовар S. typhimurium является аналогичным S. typhi, и различаются они только хозяевами, не совсем верно. По-видимому, эти серовары различаются особенностями взаимоотношений с организмом-хозяином. Например, была отмечена более длительная персистенция in vitro клеток S. typhimurium в макрофагах человека по сравнению со штаммами S. typhi [Schwan et al,

2000]. Все эти исследования дают основание предположить, векторные штаммы S. typhimurium, продуцирующие гетерологичные антигены, могут быть непосредственно использованы для разработки вакцин для человека.

Для разработки вакцин на основе аттенуированных штаммов сальмонелл, продуцирующих гетерологичные белки, испытываются и штаммы других сероваров, например, S. dublin [Schodel et al., 1990].

Для изучения иммунного ответа при различных способах введения рекомбинантных сальмонелл, мыши были иммунизированы S. thyphimurium (Phopc), несущей ген HBcAg четырьмя различными способами - орально, ректально, интраназально и вагинально [Hopkins et al., 1995]. Различия в титре анти НВс IgG в разных группах мышей были незначительны, хотя интраназальное введение обеспечивало несколько больший уровень антител и появление специфических антител к HBcAg немного раньше, чем при других способах введения. Секреторные IgA, специфичные к HBcAg, обнаруживались в слюне, вагинальных смывах и фекалиях вне зависимости от способа иммунизации. При этом количество специфических секреторных антител было больше в слизистой, участвовавшей в проникновении сальмонелл в организм.

С помощью сальмонелл возможна доставка и ДНК-вакцин. Возможность доставки ДНК-вакцин с помощью штаммов Listeria и Shigella объяснима, т.к. данные бактерии обитают в цитоплазме эукариотических клеток и при разрушении бактерий, ДНК-вакцины могут попадать в ядро клетки [Dietrich et al., 1999]. Для штаммов Salmonella, являющихся внутриклеточными паразитом, но обитающими в специализированных фагосомах, тоже была показана способность доставлять ДНК-вакцины [Darji et al., 1997], но каким образом плазмидная ДНК из клеток сальмонелл попадает в ядро эукариотической клетки, пока не выяснено. Однако эффективность такого подхода была показана во многих работах. При иммунизации животных штаммами сальмонелл, несущими ДНК-вакцины регистрировались не только гуморальный и клеточный ответ к целому ряду антигенов, но и протективный иммунный ответ [Flo et al., 2001; Wedemeyer et al, 2001]. Иммунизация сальмонеллами с ДНК-вакцинами, как правило, вызывает стимуляцию преимущественно клеточного звена иммунитета. Индукция специфических антител при этом незначительна. Подобные результаты были получены и при иммунизации мышей аттенуированным штаммом S. typhimurium, несущим плазмиду с геном HBsAg. Индукция гуморального ответа оказалась очень слабой, но цитотоксический ответ был более напряженный, чем после внутримышечной инъекции ДНК-вакцины, продукция IFN-y оказалась высокой, а IL-4 слабой [Woo et al., 2001].

Эффективность доставки гетерологичных антигенов с помощью аттенуированных сальмонелл можно повысить, применяя штаммы, продуцирующие разрушающие стенку фагосомы ферменты, в таком случае бактерии оказываются в цитоплазме клетки-хозяина. В исследованиях in vitro показано увеличение МНС I презентации антигена при инфекции рекомбинантными штаммами S. typhimurium, секретирующими гемолизин и несущим плазмиду, содержащую ген овальбумина под эукариотическим промотором [Catic et al., 1999]. Подобные исследования, проведенные с использованием штамма, продуцирующего гемолизин и несущего плазмиду с геном белка GFP под эукариотическим промотором, показали двух-трехкратное увеличение количества перитонеальных макрофагов, синтезирующих GFP белок [Gentschev et al., 2001].

Таким образом, используемые в настоящее время вакцины способны вызывать протективный иммунный ответ, а их применение способно уменьшить заболеваемость ГВ. В то же время недостатки существующей вакцины и необходимость поиска новых средств терапии хронических больных ГВ ставят задачу разработки новых вакцинных препаратов.

ВИРУС ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА

К тяжелейшим последствиям СПИДа относится распространение этого заболевания в странах развивающегося мира. СПИД принес беспрецедентные страдания, инвалидность и смерть миллионам людей, нарушил семейную, социальную и экономическую стабильность. В связи с высокой стоимостью медикаментозного лечения СПИДа и большими организационными трудностями, медико-биологическое сообщество пытается решить проблему создания вакцины против ВИЧ-инфекции. Поиски вакцины от СПИДа начались более 15 лет назад в атмосфере огромного оптимизма и больших ожиданий. Когда было установлено, что причиной СПИДа является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), казалось, что создание вакцины - дело ближайшего будущего. Однако проблема оказалась более сложной, и, несмотря на огромные усилия, прогресс на этом пути не соответствовал ожиданиям.

Почему 200 лет назад, в отсутствие современной биотехнологии создание вакцины против оспы так быстро увенчалось успехом, в то время как создание вакцины против

СПИДа остается нерешенной задачей? Молочницы Дженнера представляли собой защищенную группу", и это было ключевой информацией, необходимой для создания вакцины. К сожалению, в случае ВИЧ-инфекции значительных по численности групп с четкой резистентностью не существует, и, таким образом, неизвестны параметры иммунитета, коррелирующие с защитой от инфекции. В Найроби была выявлена группа экспонированных ВИЧ, но серонегативных секс-работниц [Rowland-Jones et al., 1998], высказывались надежды, что эта группа может дать ценную информацию об иммунной устойчивости к вирусу. К сожалению, защита не всегда была длительной, и механизм устойчивости не был четко определенным; поэтому так и не удалось получить информацию о критически важных маркерах, которые могли бы стать ориентиром при разработке вакцины. Разработка вакцины против ВИЧ возможна и без наличия коррелятов иммунитета или искусственного (суррогатного) маркера защиты, однако при этом путь к созданию вакцины является значительно более трудным. Отсутствие иммунных коррелятов остается одной из наиболее серьезных проблем для разработки вакцины от

СПИДа. Еще одним критическим барьером является выявление иммуногенов, которые вызывают длительный иммунитет с широким спектром. Другая трудность связана с генетической изменчивостью (разнообразием) вируса: ВИЧ обладает необычно высокой изменчивостью, которая осложняет создание вакцины, универсально эффективной в отношении различных субтипов и штаммов вируса [Saag et al, 1988]. Отметим, что в отличие от ВИЧ, межштаммовые вариации других вирусов, таких как вирус полиомиелита, для которого была успешно создана вакцина, являются относительно небольшими. Так, во всем мире успешно используется вакцина против полиомиелита на

39 основе всего трех штаммов вируса [Melnick, 1996; Chanock, 1996]. Прогресс в области создания вакцины против ВИЧ также осложняется трудностями, связанными с использованием экспериментальных животных. Инфекция, вызываемая лентивирусами у низших (негуманоидных) приматов, является хорошей моделью для разработки вакцины против вируса и дала важные данные в отношении иммунопатогенеза ВИЧ. Однако, несмотря на значительное сходство в симптоматике и патологии, имеются различия, которые могут повлиять на эффективность вакцины. Например, вирусы иммунодефицита обезьян (ВИО) существенно отличаются от соответствующих вирусов человека. В плане организации генома вирусный дополнительный белок Vpx ВИО отсутствует в геноме ВИЧ-1, генный продукт Vpu, присутствующий в ВИЧ-1, отсутствует в геноме ВИО [Luciw, 1996], и функции белка Vpr также отличаются у этих вирусов. Хотя некоторые штаммы ВИЧ вызывают заболевание у шимпанзе, этот вид в значительной степени устойчив к CCR5-TponHbiM первичным изолятам, ответственным за большинство случаев инфекции у человека [Novembre, et al., 1997], что указывает на видоспецифические различия в ответе организма на вирус. Характеристики молекулярных клонов и вирусов, адаптированных в лаборатории, также отличаются от характеристик вируса, вызывающих инфекцию в естественных условиях. Несмотря на привлекательные характеристики обезьяньей модели, очевидно, что для разработки эффективных вакцин потребуются клинические исследования на человеке. Такие испытания требуют производства вакцин клинического уровня качества и соответствующих исследований по безопасности и токсичности, а это создает дополнительные проблемы. В ходе испытаний наиболее важная задача заключается в определении выбора перспективных кандидатов для клинических испытаний по фазе III. В таких испытаниях тестируется эффективность вакцины, полученной на основании ограниченной информации.

Строение вириона. Жизненный цикл ВИЧ-1

В начале 80-х в Соединенных Штатах были зарегистрированы первые случаи ранее неописанного заболевания, отличительными признаками которого были приобретенный иммунодефицит и развитие оппортунистических инфекций, вызываемых микроорганизмами, с которыми обычно иммунная система справлялась. Этот синдром был отмечен в группах гомосексуалистов и у лиц, принимающих внутривенно наркотики.

Новое заболевание получило название синдром приобретенного иммунодефицита

СПИД). В 1983 году агент, вызывающий это заболевание был идентифицирован. Им оказался вирус из семейства ретровирусов, получивший в дальнейшем название вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Существует два типа вируса иммунодефицита: ВИЧ-1 и

ВИЧ-2. ВИЧ-2 вызывает развитие СПИДа менее чем у 25% инфицированных, в то время

40 как ВИЧ-1 в 100% случаев. ВИЧ-2 родственен ВИЧ-1, у них одинакова в основных чертах структура и они оба способны вызывать СПИД. ВИЧ-2 распространен преимущественно в Западной Африке, тогда как ВИЧ-1 - по всему миру.

Вирусная частица (диаметром 110 нм) имеет конусообразное ядро, основой которого является белок р24. Внутри этого капсида находятся две идентичные одноцепочечные молекулы РНК, размером приблизительно 9,2 kb каждая, с которыми ассоциированы обратная транскриптаза и внутренние белки капсида. Ферменты для репликации, такие как рибонуклеаза, интеграза и протеаза также содержатся внутри капсида. Внутренняя часть капсида представлена белком р17, который выполняет поддерживающую функцию для вириона. Поверхность вириона покрыта 72 шипами, представляющими собой тримеры и тетрамеры комплексов белков с липидами. Каждый такой шип содержит поверхностный белок оболочки gpl20, нековалентно связанный с трансмембранным белком gp41, который пронизывает липидный бислой. Поверхность вириона содержит также белки, необходимые для присоединения и проникновения в клетку (ICAM, \52-микроглобулин). Геном ВИЧ-1, подобно геномам других ретровирусов, содержит три основных гена, фланкированных длинными концевыми последовательностями (LTR-последовательности), которые необходимы для репликации. К основным генам относятся gag, pol и env. Gag- ген кодирует белок р55, который в дальнейшем нарезается вирусными протеазами на структурные белки р24, р17 и р6. Pol-ген кодирует белок-предшественник, после протеолитического расщепления которого образуются три фермента: pi 1-протеаза, р66/р51-обратная транскриптаза, и рЗ2-интеграза. Продукт гена env представлен белком-предшественником gpl60, который протеолитически расщепляется на два поверхностных белка — gpl20 и gp41. В дополнение к этим генам вирусный геном кодирует и другие дополнительные белки, необходимые для вирусной репликации и инфицирования клеток.

Инфицирование начинается с прикрепления вируса к клетке-мишени. Основными клетками для проникновения ВИЧ являются клетки, экспрессирующие маркер CD4. К таким клеткам прежде всего можно отнести Т-хелперы, моноциты, макрофаги, дендритные клетки и клетки микроглии головного мозга. Инфицирование клетки инициируется связыванием белка оболочки вируса gpl20 с С04-рецептором на поверхности клеточной мембраны. Это связывание опосредовано CD4 связывающим доменом (локализованного в С-концевой части gpl20), взаимодействующим с V3 петлей gpl20. Молекула CD4 содержит иммуноглобулинподобные петлевые структуры, которые первыми вовлекаются во взаимодействие с gp 120. В последующем, gpl20-CD4- взаимодействие приводит к конформационным изменениям в вирусном белке gpl20, которые способствуют доступности мест связывания вируса для клеточных корецепторов. Эти корецепторы были идентифицированы в семействе хемокиновых рецепторов и являются необходимыми для того, чтобы обеспечить слияние между вирусной и клеточной мембранами. Хемокиновый рецептор CXCR4 и хемокиновый рецептор CCR5 выступают как кофакторы для тропных к Т-клеткам и макрофагальнотропных штаммов ВИЧ-1 соответственно. Конформационные изменения молекулы gpl20 приводят к слиянию мембран вируса и хозяйской клетки и проникновению вируса в клетку.

После проникновения вируса в клетку вирусный геном освобождается в цитоплазме путем раздевания вирусного кора, затем следует активация обратной транскриптазы, инициирующей синтез негативной цепи ДНК на матрице геномной РНК. После этого разрушается РНК-цепь в ДНК/РНК гибриде и на первой цепи-матрице синтезируется вторая цепь ДНК. В результате двухцепочечная ДНК является провирусной формой вирусного генома, которая проходит в ядро и встраивается в геном хозяйской клетки с помощью интегразы. Интегрированная вирусная ДНК может оставаться долгое время латентной, вплоть до момента активации. В момент активации вирусная ДНК транскрибируется клеточной РНК полимеразой. Провирусная транскрипционная активность регулируется несколькими клеточными транскрипционными факторами, а также факторами, кодируемыми вирусным геномом. К вирусным факторам относятся белки Tat, Rev, Nef. В течение посттрансляционного периода, белки оболочки гликозилируются и нарезаются клеточными протеазами на белки gpl20 и gp41. Затем белки оболочки, белки гена gag и pol и новый вирусный геном ассоциируется в новую вирусную частицу, которая покидает клетку, отпочковываясь от клеточной мембраны, при этом сама клетка чаще всего погибает.

Анти-ВИЧ гуморальный иммунитет

Антитела является важным компонентом защиты против вирусных инфекций и особенно важны в ограничении распространения вирусов вне клетки. Первичный контроль репликации ВИЧ-1 осуществляется именно за счет действия нейтрализующих антител [Albert J. et al., 1992]. Наиболее выраженный гуморальный ответ наблюдается против Env (gpl20 и gp41) и Gag (р24 и р 17) белков. Основным механизмом, с помощью которого осуществляется нейтрализация вируса, является ингибирование антителами при прикреплении вириона к клетке-мишени. Для прикрепления вируса к клетке-мишени необходим многосторонний контакт в определенной области. Связывание антител с вирусной поверхностью делает невозможным прикрепление вируса к клетке.

Дополнительными механизмами нейтрализации является индукция конформационных изменений в gpl20, приводящая к диссоциации gpl20 и gp41 [Yahi et al., 1994]. Основные

42 нейтрализующие эпитопы обнаружены в поверхностных белках вируса. При изучении нейтрализации культурального вируса сыворотками ВИЧ-инфицированных и иммунизированных gpl20 людей было показано, что третья вариабельная петля (V3) gpl20 является основным нейтрализующим доменом гликопротеина [Javaherian et al., 1989]. В составе белков оболочки было выявлено три основных нейтрализующих эпитопа: два - конформационных расположены на gpl20, третий находится на gp41 и имеет линейное строение [Chanh et al, 1986].

Не было выявлено закономерностей между нейтрализующими серотипами, генетическими субтипами и биологическими свойствами (тропностью) вируса [Moore et al, 2001.] Так, при изучении нейтрализующей активности сывороток крови людей, инфицированных вирусами, относящихся к субтипу А, В, С, D в тесте нейтрализации, оказалось, что все они нейтрализуют вирус, относящийся к субтипу В. При этом были нейтрализованы как тропные к макрофагам, так и Т-тропные штаммы вируса [Weber et al, 2001].

Ряд опытов in vitro показал, что некоторые антитела, не имеющие специфической активности против вирусных белков, также могут нейтрализовать вирус. Большинство из них направлены на белки клеточной мембраны, такие как ICAM-1 (CD54), LFA-1 (CD11 a/CDl 8), HLA-DR, МНС1 [Rizzuto et al., 2000].

Другой мишенью для антител могут быть регуляторные белки, например, tat, высвобождение которого из инфицированных клеток приводит к активации репликации вируса в соседних клетках [Frankel et al., 1988]. Оказалось, что антитела против tat ингибировали ВИЧ-1ШВ in vitro, и их наличие коррелировало с отсутствием развития СПИДа in vivo [Zagury, 1998].

Помимо нейтрализации, антитела принимают участие в другом механизме борьбы с вирусом - антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) [Rowland-Jones, 1997]. Данный механизм основан на том, что антитела связываются с белками вируса на поверхности инфицированной клетки и индуцируют связывание Fc фрагмента IgG со специфическим Fc-рецептором (CD16) на лейкоцитах, обладающих способностью к АЗКЦ. Связывание активирует высвобождение медиаторов лизиса эффекторной клеткой, что приводит к лизису клетки-мишени. [Forthal et al., 2001]. Было показано, что уровень АЗКЦ обратно коррелирует с уровнем вирусной нагрузки [Forthal et al, 2001].

Другой способ защиты обусловлен тем, что натуральные киллеры (НК) при стимуляции их Fc-рецептора выделяют хемокины, которые в свою очередь блокируют корецепторы ВИЧ, лигандами для которых они являются [Heeney et al, 1998].

Таким образом, эффективность гуморального иммунного ответа в ограничении распространения вируса in vivo определяется как минимум тремя факторами:

43 чувствительностью вирусного изолята к нейтрализации, репертуаром вырабатываемых антител и временным отрезком, в течение которого синтезируются эти антитела.

Анти-ВИЧ клеточный иммунитет

Помимо гуморального, ВИЧ активирует и клеточное звено иммунитета. Важным звеном в контролировании размножения и распространения вируса в организме являются CD8+ цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) [Letvin, 1998]. Они распознают на поверхности инфицированной клетки эпитопы вирусных белков размером 8-11 аминокислотных остатков в ассоциации с молекулами главного комплекса гистосовместимости первого типа (МНС-1) [Townsend, Bodmer, 1989]. Распознавание комплекса МНС-1 и вирусного пептида происходит Т-клеточным рецептором (ТКР) совместно с CD8 корецептором, что приводит к функциональной активации ЦТЛ [Wange and Samelson, 1996; Weiss and Littman, 1994; Purbhoo et al., 1998].

Репликация ВИЧ-1 в CD4+ Т-клетках может быть ингибирована присутствующими в организме инфицированного CD8+ клетками [Walker et al., 1986] через механизмы, которые включают в себя лизис клетки и высвобождение хемокинов и цитокинов. Количество вируса на ранней стадии ВИЧ-1 инфекции соответствует по времени наработке вирусоспецифических ЦТЛ [Pantaleo et al., 1994]. У пациентов с хроническим течением болезни высокие значения ЦТЛ ответа коррелируют с низким вирусным уровнем и стабильным течением заболевания [Ogg et al., 1998]. Важная роль CD8+ ЦТЛ была подтверждена путем удаления в инфицированных ВИО обезьян вирусспецифических CD8+ клеток с помощью моноклональных антител. Было показано, что при этом у инфицированных ВИО обезьян происходило увеличение вирусной нагрузки и развивалась иммуносупрессия [Schmitz et al, 1999, Jin et al., 1999].

Несмотря на выраженный клеточный иммунитет, организму не удается избавиться от вируса. Предполагается, что клетки иммунной системы, ответственные за выполнение функций клеточного иммунитета (Т-хелперы и ЦТЛ), по-видимому, функционируют неадекватно [Brander and Walker, 1999]. Это прежде всего связано с тем, что сами CD4+ являются клетками-мишенями для вируса, при этом вирус-специфические CD4+ Тх-клетки подвергаются клональной делеции на ранних стадиях инфекции, т. к. именно они активируются в ответ на стимуляцию вирусом, что способствует их заражению. Этот процесс идет настолько быстро, что вирус-специфические клетки памяти не успевают образоваться. Было также показано, что ВИЧ-специфические Т-клетки памяти содержат большее количество провирусной ДНК, по сравнению с другими клетками [Douek et al, 2002]. Инфицированные клетки разрушаются за счет прямого цитопатического действия вируса и ЦТЛ [Cicala et al., 2000]. Значительная часть CD4+ клеток погибает за счет апоптоза. Существуют и другие механизмы, с помощью которых вирусу удается избежать давления иммунитета. Так, оболочечные белки вируса вызывают анергию CD4+ клеток. Все это приводит к тому, что ЦТЛ не получают дополнительной активации со стороны Тх-клеток и не могут нормально функционировать. У инфицированных отмечено снижение уровня перфорина в ЦТЛ, что также отрицательно сказывается на уничтожении вируса. Кроме того, высокая генетическая изменчивость вируса предотвращает распознавание инфицированных клеток специфическими ЦТЛ. Мутации в геноме ведут к исчезновению имеющихся вирусных эпитопов, снижению связывания вирусных пептидов с МНС I, неэффективному процессингу вирусных белков и пониженному распознаванию Т-клеточным рецептором инфицированных клеток [McMichael and Phillips, 1997]. Одним из примеров действия вирусных белков на клетки, является установленный факт влияния белка Nef HIV-1 на увеличение продукции FasL (CD95L), индуцирующего апоптоз ВИЧ-специфических ЦТЛ [Xu et al., 1994]. Nef также снижает экспрессию молекул МНС I на поверхности зараженной клетки, что затрудняет распознавание их НК-клетками [Schwartz etal., 1996, Collins et al., 1998].

Таким образом, клеточный иммунитет играет важную роль в ограничении развития ВИЧ в организме инфицированного. Именно наличие выраженного ответа со стороны Т-лимфоцитов рассматривается в настоящее время как один из основных показателей эффективности создаваемых вакцин [Goulder et al, 1999].

Мукозальный иммунитет

Помимо системного иммунного ответа, большое значение в предотвращении заражения и развития ВИЧ должна играть иммунная система слизистых оболочек. На сегодняшний день установлено, что слизистая является основным местом проникновения вируса, по разным оценкам, от 50 до 80% случаев инфицирования происходит именно этим путем [Dunn and Newwell, 1992, Fowler, 1997].

Инфицирование через слизистую оболочку может осуществляться за счет прямого проникновения вируса в эпителиальные клетки и его передачи через эпителий слизистой в иммунокомпетентные клетки, находящиеся в нижележащих тканях [Furuta et al., 1994; Bomsel, 1997]. Наиболее подвержены заражению ВИЧ-1 М-клетки [Amerongen etal, 1991; Neutra et al., 1996], которые располагаются в интестинальном тракте, в небных и подъязычных миндалинах. Эти специализированные клетки обладают способностью путем эндоцитоза захватывать макромолекулы и микроорганизмы на апикальной поверхности и транспортировать их к базальной поверхности. При этом лежащие под эпителием кишечника лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки могут быть инфицированы ВИЧ. После локальной инфекции зараженные вирусом клетки могут быстро распространиться к периферическим лимфатическим узлам и другим лимфоидным тканям. Следует отметить, что разрушение эпителия в гастроинтестинальном и генитальном тракте вследствие травмы, воспаления или инфекции обеспечивает прямой доступ ВИЧ к микроциркулирующим мононуклеарным клеткам в lamina propria [Bomsel, 1997].

Мукозальная иммунная система характеризуется наличием схожих с системным иммунитетом механизмов защиты, представленных гуморальным и клеточным звеньями. Гуморальный иммунитет обеспечивается действием иммуноглобулинов, преимущественно класса А, которые селективно транспортируются в секреты слизистой. Следует отметить, что именно IgA, а не IgG, как в случае системного гуморального ответа, являются более значимыми для защиты слизистых. Такое отличие обусловлено тем, что, во-первых, иммуноглобулины класса А являются более устойчивыми к действию протеолитических ферментов, присутствующих в секретах слизистых. Во-вторых, молекула IgA является димерной и имеет четыре антигенсвязывающих сайта, что в 2 раза увеличивает вероятность связывания антигенов по сравнению с молекулой IgG. В работе Hocini с соавт. показано, что an™-gpl60 IgA-антитела являются более эффективными по сравнению с анти-gpl 60 IgG по их способности предотвращать проникновение ВИЧ через эпителиальный барьер [Hocini etal., 1997].

Защита слизистой от проникновения патогенов осуществляется также за счет ряда других факторов мукозального иммунитета. Это в том числе предотвращение контакта патогена с эпителиальной поверхностью, формирование иммунных комплексов, захват антигенов при их прохождении через эпителиальные клетки, внутриклеточная нейтрализация с участием в этой реакции нейтрализующих антител [Brandtzaeg et al., 1999; Mazanecetal., 1992].

Т-лимфоциты слизистой могут вовлекаться в механизмы защиты от заражения и развития ВИЧ как путем активации цитолитической активности, так и за счет продукции цитокинов с последующим вовлечением в защитные реакции других имму некомпетентных клеток [Lohman et al, 1995]. Иммунный ответ цитотоксических лимфоцитов ограничивает репликацию вируса на ранних стадиях развития инфекции, что уменьшает вирусемию и позволяет длительное время не проявляться клиническим признакам заболевания у инфицированного [Но et al., 1995]. Активность локальных цитотоксических лимфоцитов может рассматриваться как один из определяющих моментов при оценке эффективности кандидатных вакцинных препаратов. Данный тезис был выдвинут группой американских ученых и подтвержден в ряде работ Белякова с

46 соавт. на примере ректального заражения мышей и макак рекомбинантным вирусом vPE16, экспрессирующим ген env IIIB-изолята ВИЧ-1 [Belyakov et al., 1998; Berzofsky and Belyakov, 2001; Hel, et al., 2001].

Вакцины против ВИЧУСПИДа

Разработка ВИЧ-1-вакцины началась сразу же после идентификации агента, вызывающего СПИД. В 1984 году ученые полагали, что вакцинный препарат будет создан в течение 3-10 лет. Сегодня, более чем 20 лет спустя, проблема получения эффективного вакцинного препарата остается по-прежнему актуальной, хотя, несомненно, успехи в исследовании патогенеза ВИЧ-инфекции и иммунном ответе на ВИЧ позволяют надеяться на получение вакцины в ближайшее время. Разработка безопасной и эффективной вакцины затруднена из-за ряда факторов, среди которых наиболее значимы высокая генетическая вариабильность ВИЧ-1, недостаток знаний об иммунных механизмах защиты, отсутствие животных моделей инфекции и сложность проведения массовых клинических испытаний.

Вакцины на основе аттенуированного вируса

Одними из первых были начаты исследования по возможности применения аттенуированного вируса в качестве ВИЧ-вакцины. Предпосылками этого направления послужил тот факт, что аттенуированные вирусы вызывают стимуляцию как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. При этом антигенные детерминанты представлены у них в нативном виде н, следовательно, должны вызывать адекватный иммунный ответ [Ruprecht, 1999]. Такие вакцины преуспели в прошлом. Несмотря на ряд преимуществ вакцин данного типа, работы в этом направлении сдерживаются по соображениям безопасности. Оказалось, что у обезьян, вакцинированных аттенуированным вирусом с делецией в 12 нуклеотидных пар в гене nef, через какое-то время произошло полное восстановление поврежденного участка, т.е. вирус снова приобрел вирулентные свойства [Whatmore et al., 1995].

Субъединичные вакцины

Первоначально большинство попыток создания ВИЧ-1 вакцины было направленно на создание вакцинной конструкции, основу которой составляли белки оболочки вируса gp41 и gpl20. На основе оболочечных гликопротеидов были созданы различные варианты субъединичных вакцин, некоторые из которых в настоящее время проходят доклинические и клинические испытания.

Несомненные их преимущества - невысокая стоимость получения и возможность высокой степени очистки, а также относительная безопасность применения, однако, имеется несколько значимых ограничений к их использованию. Было показано, что иммунизация рекомбинантными белками защищала шимпанзе от внутривенного заражения ВИЧ-1 [Вегшап and Groopman, 1988]. Однако эти исследования были проведены с культуральным вирусом, который плохо реплицируется в организме обезьян. Кроме того, антитела, образованные в организме животных в ответ на иммунизацию, не могли нейтрализовать первичные вирусные изоляты in vitro. Также результаты второй фазы клинических испытаний субъединичной вакцины на основе gp 160 свидетельствуют, что отсутствует положительная динамика течения инфекции, несмотря на индукцию значительного Т-хелперного ответа [Goebel et al, 1999]. В другом, более крупном по масштабу, исследовании этого же рекомбинантного белка было отмечено временное улучшение клинической картины заболевания, наблюдавшееся в течение двух лет, затем эффект иммунизации становился незначительным [Sandstrom and Wahren, 1999]. В 2005 году стали известны результаты 3-ей фазы клинических испытаний, которые оценили корреляцию гуморального ответа индуцируемого этими вакцинам с инцидентами инфицирования. Исследования продемонстрировали, что вакцина, индуцируя комплексный иммунный ответ, не способна снизить распространение ВИЧ-1 инфекции [Gilbert et al., 2005]. Таким образом, к сожалению, 3-я фаза клинических испытаний первой субъединичной рекомбинантной вакцины против ВИЧ/СПИД показала бесперспективность используемого авторами подхода. Причина неудачи, возможно, связана с низкой иммуногенностью рекомбинантных субъединичных вакцин. И, кроме того, иммунизация рекомбинантными белками не приводит к индукции CD8+ ответа, который играет одну из ключевых ролей в контролировании инфекционного процесса [Mascola et al, 1996].

Полиэпитопные иммуногены в качестве кандидатных ВИЧ-1 вакцин

Одним из перспективных подходов к созданию нового поколения надежных и безопасных вакцин основан на идентификации Т- и В-клеточных эпитопов внутри белковых антигенов ВИЧ-1 и создании на их основе полиэпитопных вакцин [Borras-Cuesta et.al., 1987]. Такие вакцины должны быть лишены дефектов, которые присущи субъединичным вакцинам, а также вакцинам, создаваемым на основе аттенуированного вируса. В частности, такие вакцины не имеют нежелательных эпитопов, которые индуцируют супрессорные клетки и ингибируют протективный иммунитет, а также являются потенциальными аутоантигенами или онкогенами.

В 1989 и 1993 году были проведены первые эксперименты по применению данного подхода при создании вакцин против ВИЧ-1 [Palker et al„ 1989; Ahlers et al., 1993]. Полученные конструкции показали невысокую иммунологическую активность, что, возможно, являлось следствием недостаточного количества протективных эпитопов в их составе, либо неправильной сборкой рекомбинантного белка. Недостатки описанных работ были учтены при создании искусственного белка, получившего название TBI (Т and В cell epitopes containing immunogen). Этот ВИЧ-иммуноген был спроектирован и получен в ГНЦ ВБ "Вектор" A.M. Ерошкиным с соавт. и представляет собой четырех-а-спиральный белок, содержащий 4 Т-клеточных эпитопа и 5 В-клеточных нейтрализующих эпитопов из белков ENV и GAG ВИЧ-1 [Eroshkin et al, 1995], (рис. 4). С использованием методов математического моделирования заранее была задана третичная структура белка, поэтому конформация В-клеточных участков мимикрирует структуру соответствующих районов в белках ВИЧ-1, что является необходимым условием для стимуляции гуморального ответа [Eroshkin et al., 1993]. Впервые для белка с гипотетически заданной на основе элементов функциональных белков третичной структурой выращены кристаллы, дифрагирующие рентгеновские лучи [Михайлов и др., 1999]. Известно, что только природные белки способны к кристаллизации, следовательно, белок TBI по своей структуре подобен природным белкам. Таким образом, вакцина, созданная на основе белка TBI, должна обладать следующими свойствами: высокой иммуногенностью (так как это уже не пептид, а белок длиной 146 а.о., имеющий Т-клеточные эпитопы; эффективностью в гетерогенной по HLA-антигенам человеческой популяции (так как TBI содержит четыре различных Т-клеточных эпитопа, способных стимулировать ответ у 85-90% людей); способностью стимулировать ответ к разным В-клеточным эпитопам; конформационной адекватностью внутренних В-эпитопов (петли); отсутствием нежелательных эпитопов.

Ген белка TBI был получен путем химического синтеза и клонирован в ряд плазмидных конструкций для экспрессии в системе прокариотических клеток. Иммунизация мышей искусственным иммуногеном приводила к формированию выраженного гуморального иммунного ответа.

К сожалению, авторами не было проведено комплексное исследование иммунного ответа при введении различных конструкций, содержащих белок TBI, которое, возможно, позволило бы сделать вывод о наиболее перспективной форме доставки этого иммуногена.

В настоящее время появляется все больше доказательств, свидетельствующих о том, что цитотоксические лимфоциты, индуцируемые при ВИЧ-инфекции, являются важными медиаторами противовирусного иммунитета, и, следовательно, эпитопы, стимулирующие ЦТЛ, могут быть важным компонентом эффективной вакцины против ВИЧ-1 [Moss et al., 1996; Rowland-Jones et al., 1995; Letvin, 1998].

Были предприняты попытки создания полиэпитопных анти-ВИЧ-вакцин, включающих различное количество ЦТЛ-эпитопов, объединенных в одну полипептидную цепь [Thomson et.al., 1995, Thomson et al., 1996, Hanke et al, 1998]. Томсон с соавт. сконструировали два искусственных иммуногена для изучения процессинга ЦТЛ-эпитопов и их иммуногенности. Один белок содержал 10 смежных ЦТЛ-эпитопов, рестриктированных пятью аллелями МНС 1 класса мышей. Другой белок состоял из девяти смежных CD8+ ЦТЛ-эпитопов, рестриктированных аллелями HLA 1 класса. В результате работы было установлено, что каждый эпитоп в составе иммуногенов индуцировал специфический ЦТЛ-ответ, при этом на процессинг эпитопов не оказывало влияние отсутствие фланкирующих последовательностей.

Несколько иной подход при конструировании полиэпитопных иммуногенов использовали Ханке с соавт., которые в своих конструкциях объединили частично перекрывающиеся 20 ЦТЛ-эпитопов, рестриктированных 12 различными HLA I класса. При иммунизации мышей искусственными антигенами в составе ДНК-вакцины и модифицированного вируса Анкара наблюдалось появление клонов специфических CD8+ Т-лимфоцитов, отвечающих продукцией IFN-y при рестимуляции специфическими пептидами [Hanke et al., 1998а; Hanke etal., 1998b]. env (255-266) exiv (102-118 ) env ( 309-317) env(421-437) . 1 0. 2 0 . 3 0 .— 4 0. • 5 0.60 env(730-742) env(827-841) gag(351-361) gag(291

305) С gag(92-109) 130 . „ . 14CK 14 6

Локализация T и В эпитопов в последовательности белков ВИЧ-1

I I Т-клеточные эпитопы (область а-спирали) обозначены как зеленые участки А, В, С, D;

I □ В-клеточные эпитопы обозначены фиолетовым цветом

Рис. 4. Модель белка TBI

В дальнейшем стратегия получения полиэпитопных конструкций с использованием перекрывающихся эпитопов получила свое развитие в работе Бажана с соавт. [Bazhan et al, 2004] (рис. 5). При конструировании белка TCI (Т cell immunogen) были выбраны эпитопы, которые индуцируют как CD8+-LJ,TJI, так и CD4+ (Т-хелперы), и включают в себя последовательности из основных вирусных белков-антигенов Env, Gag, Pol и Nef. Чтобы создаваемая вакцина могла покрыть генетическое разнообразие антигенов МНС I класса в популяции практически любого географического района, в рассмотрение принимались CD8+ ЦТЛ-эпитопы, которые в совокупности рестриктированы десятью различными оптимально подобранными аллелями HLA I класса [Hanke et al., 1998; Sidney et al, 1996]. Были исключены нежелательные эпитопы, которые обладают перекрестной специфичностью с нормальными клеточными белками, чтобы выбранные эпитопы не обладали способностью индуцировать аутоиммунные реакции. В результате белок TCI имеет 80 оптимально отобранных ЦТЛ-эпитопов и состоит из 392 а.о. Последовательность полиэпитопного иммуногена включает в себя ряд В-клеточных эпитопов, которые перекрываются с Т-клеточными эпитопами. Это позволяет предполагать, что полученная конструкция может индуцировать как Т-клеточный, так и В-клеточный иммунитет. Для того чтобы исследовать цитотоксический ответ, индуцируемый вакциной на экспериментальных животных, в состав целевого иммуногена включены дополнительные эпитопы, которые представляют собой молекулы МНС I класса мышей и обезьян Macaque rhesus. В ходе данной работы предполагается исследование антигенных и иммуногенных свойств полиэпитопного иммуногена.

ДНК-вакцины ВИЧ-1

Принцип ДНК-вакцинации активно используются для разработки вакцин против ВИЧ [Rollman et al., 2004]. В ряде работ было показано, что наиболее иммуногенные белки ВИЧ-1, gpl20 и gpl60 в формате ДНК-вакцины, при введении мышам и обезьянам индуцируют гуморальный и клеточный иммунитет [Boyer et al., 1997; McMichael and Hanke, 1999]. Были предприняты попытки использовать и другие гены ВИЧ-1 для конструирования ДНК-вакцин. Так ДНК-вакцина, содержащая ген белка vif, являющийся наиболее консервативным геном белком ВИЧ-1, индуцирует специфический анти-ВИЧ гуморальный и клеточный иммунитет [Ayavoo et al., 1997].

Отмечено, что у лиц, инфицированных ВИЧ-1, но остающихся серонегативными, часто выявляются ЦТЛ специфичные по отношению к Nef-белку. На основе этих данных была сконструирована ДНК-вакцина, обеспечивающая продукцию белка Nef. Данная конструкция при введении лабораторным животным индуцировала образование Nef-специфичных ЦТЛ [Asakura et al, 1996]. Тем не менее, образование цитотоксических лимфоцитов, специфичных только к Nef белку, является недостаточным для защиты организма от заражения вирусом.

При вакцинации шимпанзе ДНК-вакциной, содержащей гены env, rev, gag/polBH4-l, наблюдалось образование гуморального и клеточного иммунитета, а также защита от последующей инфекции не только гомологичным, но и гетерологичным штаммом ВИЧ-1. ДНК-вакцина, обеспечивающая продукцию гликопротеинов оболочки ВИЧ-1, не только индуцировала выраженный гуморальный и клеточный иммунитет, но при введении обезьянам, ранее инфицированным ВИЧ-1, существенно снижала симптомы заболевания, т. е. оказывала иммунотерапевтическое действие [Boyer et al., 1997].

Разработки ДНК-вакцин против ВИЧ идут быстрыми темпами, и, несмотря на существование «белых пятен» в понимании многих сторон механизма иммунного ответа, клинические испытания ДНК-вакцин начаты уже с 90-х годов. Изучена эффективность HIV-1 ДНК-вакцины, несущей гены env и rev H1V-1. Она была введена с помощью генной пушки 15 асимптомным больным СПИДом. У всех привитых наблюдалось образование антител к env- и rev-белкам HIV, у некоторых отмечалось также увеличение количества антигенспецифических ЦТЛ и усиление пролиферации В-лимфоцитов [MacGregor et al, 1998]. Ни в одном случае у вакцинированных не появлялись какие-либо побочные реакции местного или системного характера, а также антитела к чужеродной ДНК. Другая ДНК-вакцина, кодирующая регуляторные гены HIY-1 (nef, tat, rev), была введена 9 асимптомным больным СПИДом. Она индуцировала появление антигенспецифических ЦТЛ и усиливала пролиферацию специфических Т-лимфоцитов. Однако при этом не было отмечено снижение вирусемии [Calaroto et al.', 1998; Calaroto et al., 1999].

В связи с клиническими испытаниями ДНК-вакцин в литературе широко обсуждается их безопасность. Обеспокоенность связана со следующими причинами: потенциальная интеграция плазмидной ДНК в геном клетки-хозяина; потенциальная индукция иммунологической толерантности или аутоиммунных реакций; и потенциальная индукция антител к введенной ДНК [Donnelly et. al., 2000]. Одна из главных проблем безопасности для ДНК-вакцин - риск хромосомной интеграции и последующей активации онкогена или нарушение целостности гена-супрессора онкогенеза или другого регуляторного гена [Donnelly et. al, 2000, Montgomery et. al., 1997]. Интеграция может происходить беспорядочно или в результате гомологичной рекомбинации. Оптимальными условиями для интеграции как результата гомологичной рекомбинации являются: параллельная репликация ДНК хозяина и плазмиды, а также присутствие больших (>600 п.н.) близко расположенных областей, гомологичных у хозяина и плазмиды. Однако в случае в/м ДНК-вакцинации вводится плазмида, не содержащая origin репликации функциональный в клетках человека. В таком случае трансфицированные клетки (миоциты или макрофаги/дендритные клетки) практически не делятся, а используемые нуклеотидные последовательности имеют очень ограниченную гомологию с последовательностью ДНК млекопитающих [Donnelly et. al, 2000].

Случайная интеграция может происходить в 10000 раз чаще, чем рекомбинация, однако большое количество экспериментов по иммунизации живыми вакцинными штаммами ДНК вирусов (например, аденовирусом или вирусом осповакцины) не выявило последствий, связанных с интеграцией в геном чужеродной ДНК. В прямом эксперименте было показано, что при использовании очищенной геномной ДНК, у иммунизированных животных не выявлено ни одного случая интеграции, на уровне чувствительности ПЦР 17,5 молекул плазмидной ДНК на 150000 ядер. Эта величина не превышает 0,1% от уровня частоты спонтанных мутаций в геномной ДНК млекопитающих. На основании этих данных можно заключить, что теоретически вероятность события интеграции после ДНК иммунизации крайне низка [Donnelly et. al, 2000, Montgomery et. al., 1997].

Есть опасность, что деструкция клеток, экспрессирующих чужеродные гены, может привести к выходу клеточных элементов, что теоретически может стимулировать аутоиммунный ответ. Однако не было зарегистрировано появление анти-ДНК антител при ДНК-вакцинации волонтеров [MacGregor et al., 1998, Caralota et al, 1998]. Отмечен единичный случай появления анти-ДНК антител после генетической иммунизации, однако у вакцинированного отмечался повышенный уровень антител к нуклеиновым кислотам до начала проведения иммунизации [MacGregor et al, 2000]. В исследовании Мора с соавт. обнаруживалось появление на короткое время анти-ДНК антител при введении плазмидной ДНК мышам [Мог et al., 1997]. Несмотря на это, уровень индуцируемых антител был недостаточным для развития системного аутоиммунного ответа [Gurunathan et al., 2000; Мог et al, 1997].

Следует отметить еще одну проблему, связанную с ДНК-вакцинацией. Так, при введении ДНК-вакцинных конструкций приматам регистрировался более слабый иммунный ответ, чем при введении этих же конструкций более мелким животным. Причем ответ развивался не у всех обезьян, а лишь у части вакцинированных. Для индукции иммунного ответа требовалось введение значительно более высоких доз ДНК, что в свою очередь может потенциально увеличить негативные побочные эффекты вакцинации. Но даже при введении больших доз ДНК (до 1 мг на животное) зачастую требовалось проведение повторных иммунизации рекомбинантным белком или вирусным вектором, несущим целевые иммуногены для получения хороших показателей иммунного ответа [Putkonen et al., 1998]. Повышение уровня гуморального ответа можно достигнуть с помощью увеличения продукции белка после введения ДНК-вакцины путем оптимизации кодонов репортерного гена. Кодоны вирусного генома не являются оптимальными для синтеза вирусных белков в клетках человека Так, замена кодонов нативных генов gp\2Q и gag HIV на кодоны высоко экспрессируемых генов человека приводит к значительному увеличению экспрессии модифицированных генов, титров антител и активности CTL у иммунизированных животных [Andre et al., 1998; zur Megede et al., 2000].

В настоящее время проводятся интенсивные исследования по поиску систем доставки ДНК-вакцин, которые бы позволили без увеличения дозы вводимой ДНК увеличить ее иммуногенность. Имеется ряд экспериментальных разработок подобных систем, включающих в себя вектора на основе микроорганизмов, совместное введение с ДНК-вакциной иммуностимулирующих молекул (цитокинов, хемокинов), а также использование искусственных систем, таких как липосомы, микросферы и наночастицы.

Способы доставки вакцин против ВИЧ-1 Микросферы

Микросферами называют структурные образования размером от 1 до 1000 мкм, в которые можно включать различные целевые субстанции, в том числе ДНК. Для иммобилизации биологически активных веществ могут использоваться природные и синтетические материалы различных классов, как не разрушающиеся в организме, так и подверженные биологической деградации. В настоящее время ведущей тенденцией в области микрокапсулирования является переход от инертных материалов к созданию биодеградируемых частиц, полностью разрушающихся в организме до естественных метаболитов.

Спектр материалов, пригодных для получения биодеградируемых микросфер, весьма многообразен и включает как природные (белки, полипептиды, полисахариды), так и искусственные субстанции. Из всего многообразия биодеградируемых полимеров наибольший практический интерес применительно к вакцинам представляют синтетические полиэфиры (полилактиды) полимолочной и полигликолевой кислот (полилактид-ПЛ и полигликолид-ПГ) и их сополимеры (ПЛ-ПГ).

Интенсивно изучается возможность повышения иммуногенности полинуклеотидных вакцин путем использования системы ПЛ-ПГ. В частности, установлено, что инкапсулированная таким образом плазмидная ДНК обеспечивала более высокий уровень трансфекции in vitro, в том числе не фагоцитирующих клеток [Walter and Merkle, 2002]. При подкожном или внутримышечном введении мышам плазмидной ДНК в инкапсулированной в ПЛ-ПГ форме она в течение длительного времени (до 100 дней) депонировалась в месте инъекции и региональном лимфатическом узле, после внутривенного применения - в лимфоидных органах и клетках РЭС. При этом значительное число дендритных клеток содержали плазмидную ДНК [Lunsford et al., 2000; Lutsiak et al., 2002]. Создана инкапсулированная форма ДНК-вакцины против СПИДа, кодирующая gag- и епу-белки вируса иммунодефицита человека. При однократной парентеральной иммунизации мышей, морских свинок и обезьян она индуцировала образование специфических антител в высоких титрах и CD8+ Т-лимфоцитов [O'Hagan et al., 2001].

Значительного усиления иммуногенности удается достичь путем включения в микросферы из ПЛ-ПГ одновременно ДНК-вакцины и адъюванта. Так, плазмида, обеспечивающая синтез микобактериального белка теплового шока (hsp65), инкапсулированая в ПЛ-ПГ микросферы, содержащие иммуноадъювант трегалозо-димиколат (ТДМ), уже после однократного внутримышечного введения мышам в дозе 30 мкг стимулировала образование IgG-антител к hsp65 в высоких титрах. При этом животные были защищены от интраназального заражения микобактериями. Свободная ДНК-вакцина вызывает аналогичный эффект только при 3-кратном введении в суммарной дозе 300 мкг [Lima et al., 2003].

Характер взаимодействия микросфер с иммунокомпетентными клетками зависит главным образом от их размера. При парентеральном (п/к, в/м, в/в, в/б) введении микросферы размером до 100 мкм непосредственно фагоцитируются макрофагами. Микрочастицы диаметром 1-10 мкм остаются в месте инъекции и действуют как адъювант депонирующего типа (например, гидрогель алюминия). Аналогичная картина наблюдается при пероральном введении полилактидных микросфер. Частицы размером более 10 мкм захватываются М-клетками, покрывающими Пейровые бляшки с последующим проникновением в макрофаги. При этом микросферы диаметром, превышающим 10 мкм, поглощаются не только макрофагами лимфоидной ткани кишечника, но и макрофагами мезентериальных лимфатических узлов, что обусловливает развитие наряду с мукозальным системного иммунного ответа на инкапсулированные антигены. Сходные процессы взаимодействия полилактидных микросфер с иммунокомпетентными клетками происходят и при интраназальном применении. Возможности использования полимерных микросфер для переноса генов сейчас интенсивно изучаются [Cui et al., 2003; Panyam and Labhasetwar 2003; Dhiman et al, 2000].

Вакцины против ВИЧ на основе рекомбинантных вирусных векторов

Наибольшее число исследований и публикаций, посвященных ВИЧ-вакцинам на основе рекомбинантных вирусных векторов (как и в случае ВГВ), посвящено векторам на основе поксвирусов, таких как вирус осповакцины, модифицированный вирус Анкара, вирус оспы канареек и др. [Girard et al., 2006]. Живые рекомбинантные вакцины обладают тем преимуществом, что они мимикрируют презентацию антигенов подобно тому, как это происходит в естественных условиях. Их недостатком является то, что рекомбинантные вектора потенциально способны вызывать заболевания у вакцинированных людей, особенно у иммуннокомпромисных хозяев. Кроме того, следует учитывать тот факт, что значительная часть населения мира иммунизирована против оспы. Таким образом, вектор будет быстро удаляться из организма. Кроме того, вирус осповакцины сам по себе вызывает поствакцинальные осложнения, что снижает привлекательность его использования.

Тем не менее, было сконструировано несколько различных векторных вакцин против ВИЧ/СПИД, и некоторые из них находятся на стадии доклинических и клинических испытаний.

Первые работы на модели вируса иммунодефицита обезьян (ВИО), показали, что, если при первой иммунизации обезьянам вводить рекомбинантный вирус оспы, экспрессирующий белки оболочки ВИЧ, а при второй рекомбинантный белок ВИЧ, то в последующем не происходит заражения животных некоторыми патогенными штаммами ВИО [Ни et al., 1992]. Однако последующие эксперименты показали, что векторы на основе поксвирусов не защищают полностью от инфицирования. Полной защиты можно было достигнуть только в том случае, если вектор был создан на основе вируса, гомологичного тому, что использовался при заражении. Протективную роль в данном случае играли образовавшиеся штамм-специфические антитела [Cranage et al., 1997].

Успешные результаты были получены при доклинических испытаниях с рекомбинантными поксвирусами. Вариант вакцины, полученный на основе рекомбинантного модифицированного вируса вакцины Ankara и несущий гены структурных белков вируса ВИЧ-1 (MVA.HIVA), прошел доклинические испытания на rhesus macaques и рекомендован для апробирования на первой стадии клинических испытаний [Hanke, et al, 2005].

Другой поксвирусный рекомбинант, полученный на основе вируса оспы птиц и генов близкосвязанных между собой подтипов АЕ вируса ВИЧ-1 (Gag, Pol, Env, Tat, Rev), прошел испытания на pigtail macaques и также был рекомендован для клинических испытаний. Эта вакцина индуцировала как CD4, так CD8 Т-клеточный иммунный ответ со значительно расширенным спектром действия [De Rose etal, 2005].

Создание рекомбинантного аденовируса, несущего гены ВИЧ-1, представляет собой другой обещающий подход в разработке вакцин против ВИЧ/СПИД. Рекомбинантный аденовирус типа 5 (rAd5), разработанный компанией Merk, обладает повышенной безопасностью благодаря мутации, повлиявшей на его репликацию. В I и II фазах клинических испытаний этот вектор продемонстрировал наиболее сильный и продолжительный цитотоксический клеточный иммунный ответ по сравнению с другими, протестированными на людях кандидатными вакцинами против ВИЧ/СПИД. Однако данные этих испытаний также показали, что предварительная экспозиция к аденовирусу типа 5 (Ad5) стимулирует выработку анти-Аё5-антител в очень высоких титрах, и эти aнти-Ad5-aнтитeлa значительно уменьшают процент волонтеров, которые реагируют на rAd5 вектор. Эта проблема антивекторного иммунитета сильно снижает возможность использования такой вакцины в развивающихся странах, где инциденты предварительной экспозиции к Ad5 очень велики. Если такая предварительная экспозиция к Ad5 отсутствует, то вакцина может быть очень эффективной [Barouch et al., 2004].

Другой рекомбинант, разработаный компанией Targeted Genetics в сотрудничестве с Columbus Children's Research Institute на основе аденоассоцированного вируса (AAV), при доклинических испытаниях продемонстрировал как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы при испытании на обезьянах. Первая фаза клинических испытаний началась уже началась в Бельгии и Германии (The global clinical pipeline http://www.iavi.org/viewfile).

Дошел до стадии клинических испытаний и первый альфавирусный рекомбинант, созданный на основе вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (VEE) и генов ВИЧ-1. Вакцина AlphaVax's задумана как репликоновая частица, преимущества которой заключены в высокоуровневой экспрессии встроенных генов ВИЧ-1, управляемых VEE-репликоном [Dong et al., 2003].

Перспективными считаются векторы, созданные на основе поксвирусов со сниженной вирулентностью или с незавершенным циклом репликации, что приводит, в свою очередь, к снижению негативного действия векторного вируса на организм вакцинируемого. Один из них - модифицированный штамм вируса Анкара, прошедший много пассажей in vitro и потерявший свою патогенность в результате делеции ряда генов [Meyer et al., 1991]. Другой - вирус оспы канареек, имеющий незавершенный цикл репликации в клетках человека [Marovich et al., 2002]. Несколько рекомбинантных поксвирусов успешно прошли доклинические испытания и начали исследоваться на людях. На первой стадии клинических испытаний было показано, что векторы на основе вакцинного вируса оспы и ослы канареек безопасны и вызывают активацию специфических CD8+ и CD4+ клеток. При этом у большинства вакцинированных добровольцев развивался антигенспецифический лимфопролиферативный ответ, а у трети - ЦТЛ специфический иммунный ответ [Gorse et al, 2001, The AIDS Vaccine Evaluation Group, 2001]. Однако значительная часть населения мира иммунизирована против оспы. Таким образом, вектор будет быстро удаляться из организма. Кроме того, вирус осповакцины сам по себе вызывает поствакцинальные осложнения, что снижает привлекательность его использования.

Аттенуированные штаммы сальмонеллы в качестве системы доставки ВИЧ иммуногенов

По данным статистики, в настоящее время половой путь занимает ведущее место в распространении ВИЧ-инфекции. Поэтому эффективная вакцина против ВИЧ-1 должна защищать как от парентерального проникновения инфекции, так и от заражения через слизистые оболочки [Nathanson et al., 2000, Letvin, 1998]. Большинство препаратов, находящихся в стадии клинических испытаний, не удовлетворяют этому требованию, поскольку предусматривают парентеральный путь введения. Парентеральная иммунизация обычно не индуцирует мукозальный иммунный ответ, или он очень низок [Robinson et al, 1999; Kozlowski et al, 2003].

Одним из вариантов решения указанной проблемы может быть использование мукозальных систем доставки вакцин и адъювантов, стимулирующих иммунный ответ слизистых [Eldridge et al., 1993; Newton et al., 1989; Sturesson et al, 2000]. К мукозальным адъювантам можно отнести ряд веществ, в основном микробного происхождения (холерный токсин, белок теплового шока HSP70, токсин Е. coli), которые активируют продукцию СС-хемокинов и вызывают пролиферацию и созревание дендритных клеток, Т- и В-лимфоцитов. При этом холерный токсин стимулирует преимущественно Т^-тип иммунного ответа [VanHeyningen et al., 1976]. Токсин Е. coli вызывает активацию обоих звеньев иммунной системы [Takahashi et al., 1996], а микобактериальный белок HSP70-ТХ|-ответ на совместно вводимый антиген [Lehner et al., 2000]. При использовании систем доставки антигенов, например, полилактидных микросфер, удается повысить мукозальный потенциал вакцины, однако, в ходе клинических испытаний была показана низкая иммуногенность препарата [Lambert et al., 2001].

Необходимо отметить, что ряд разработанных технологий для мукозальной вакцинации являются очень сложным многостадийным процессом, что увеличивает стоимость препаратов и делает невозможным их применение в развивающихся странах. Как уже отмечалось в главе "Вакцины против гепатита В", вакцины на основе аттенуированных штаммов бактерий, таких как Shigella, Salmonella, стимулируют выраженный иммунный ответ и отличаются простотой приготовления и применения [Fouts et al, 1995; Medina, 2000]. Одним из основных преимуществ данного направления является тот факт, что аттенуированные микроорганизмы способны к ограниченной инфекции, мимикрируя тем самым инфекционный процесс, что приводит к эффективной активации всех звеньев иммунной системы, как на системном, так и на местном уровнях [Levine, 1983; Staats etal., 1994].

При создании вакцин против ВИЧ также использовались рекомбинантные штаммы сальмонелл. В работе Шата с соавт. [Shata et al., 2002] была показана индукция Env-специфического мукозального и системного иммунитета при введении животным аттенуированного штамма S. typhimurium SL7207, несущего ДНК-вакцину pcDNA3.1.-Env. После трехкратной оральной иммунизации клетками сальмонеллы наблюдалось появление CD8+ клеток, способных отвечать продукцией IFN-y при стимуляции специфическим пептидом. Цитотоксический ответ при использовании сальмонеллы для доставки ДНК-вакцины по количеству IFN-у-продуцирующих клеток соответствовал значениям ответа при внутримышечном введении 50 мкг ДНК-вакцины. Однако при иммунизации рекомбинантным штаммом сальмонеллы наблюдалась индукция не только системного, но и мукозального ЦТЛ-ответа, наличие которого имеет большое значение для защиты от проникновения вируса через слизистые [Shata et al., 2002]. По данным Гонзало, уровень специфического gp 120 ЦТЛ-ответа после назальной иммунизации клетками сальмонеллы был сравним с ответом, полученным при двукратном перитонеальном введении рекомбинантного вируса Анкара [Gonzalo et al., 1999].

Наряду с клеточным иммунным ответом, мукозальная ДНК-иммунизация вызывает стимуляцию и гуморального ответа с наработкой специфических иммуноглобулинов класса А и G. Интраназальное введение аттенуированных штаммов Shigella и Salmonella, несущих ДНК-конструкцию pcDNA-syngpl20, индуцировало появление специфических системных IgG в сыворотке иммунизированных животных, а также специфических IgA в слизистой влагалища [Vecino et al., 2002]. Данный пример показывает, что при введении антигенов через слизистые оболочки мукозальный иммунный ответ развивается не только в месте введения антигена, но и участках слизистой, удаленных от места аппликации.

Вместе с тем необходимо отметить, что имеется потенциальный риск применения живых штаммов микроорганизмов. Реверсия к вирулентному состоянию остается возможным отрицательным моментом. Однако на протяжении более двух десятков лет использования аттенуированных штаммов не было зарегистрировано ни одного подобного случая, что дает основания говорить о малой вероятности реверсии к дикому штамму.

В любом случае, сегодня общепризнанно, что окончательный вывод относительно эффективности той или иной вакцинной стратегии может быть сделан только на основании широких испытаний на человеке. Наступление ведется широким фронтом и по многим направлениям. Несмотря на то что первая вакцина против ВИЧ (на основе белка gpl20) фирмы VaxGen при проведении крупномасштабных клинических испытаний оказалась неэффективной, ученые продолжают упорно трудиться в этом направлении, чтобы разработать новые вакцины. В настоящее время 33 вакцины (табл. 1) находятся на разных стадиях клинических испытаний (по данным Каролинского института, Швеция wvvw.iavireport.org).

Наиболее далеко (III фаза клинических испытаний в Таиланде) продвинулась вакцина ALVACvCP1521, совместная разработка фирм Sanofi Pasteur и Vaxgen. Вакцина создана на основе живого рекомбинантного вектора ALVAC-HIV, кодирующего белки env(B,E), gag/pol и бустерного компонента gpl20 В/Е (AIDS VAX В/Е).

Вероятно, первое поколение успешных ВИЧ-вакцин обеспечит некоторую форму защиты, но они не будут полностью протективными (поскольку ни одна из существующих противовирусных вакцин не эффективна на сто процентов). По мере углубления и появления новых знаний о ВИЧ последующие поколения профилактических вакцин станут более совершенными и эффективными. Но даже частично эффективная вакцина, которая могла бы уменьшить число новых инфекций на 15-20% , могла бы способствовать сохранению жизни и здоровья миллионам людей и существенно сократить пандемию.

Таблица 1

Клинические испытания профилактических вакцин против ВИЧ/СПИДа испытания Название Дата нача ла Организация, производитель Страна Название вакцины Антиген (субтип)

III фаза. Тестирование эффективности вакцины в широкомасштабных клинических испытаниях на популяции с высоким риском

RV 144 Клинические испытания рекомбинантной вакцины ALVAC-HIV (VCP1521) Sanofi Pasteur (прайм) и gpl20 В/Е (AIDS VAX В/Е) VaxGen (буст) Окт. 2003 DoD, МОРН, NIAID TAVEG, Sanofi, VaxGen Таиланд (8) Прайм: ALVAC-HIV VCP1521 Буст: AIDS VAX В/Е env (В,Е); gag/pol, env (B,E)

II фаза. Тестирование безопасности и иммуногенности вакцины в среднемасштабных клинических испытаниях на популяции с высоким и низким риском заражения

IAVI А002 Плацебо- контролируемые клинические испытания безопасности и иммуногенности tgAAC09, ДНК-вакцины содержащей gag-PR-ART (ВИЧ-1, тип С) и инкапсулированного в капсид адено-ассоциированного вируса (AAV); 2-кр. иммунизация, 3 разные дозы, 2 интервала иммунизации Нояб. 2005 IAVI, Targeted Genetics Северная Африка, Уганда, Замбия tgAAC09 gag, PR, ART (C)

HVTN 204 Клинические исследования безопасности и иммуногенности мультитопной ДНК-вакцины VRC-HIVDNА-016-00-VP (прайм) и рекомбинантной вакцины VRC-HIVDNA-014-00-VP с использованием в качестве вектора аденовируса (буст) Сен. 2005 NIAID, Vical, GenVec США (7), Бразилия (2), Северная Африка (3). Далее: Гаити, Ямайка Прайм: VRC-HIVDNA-0 16-00-VP Буст: VRC-HIVDNA-014-00-VP Gag, pol, nef (B), env (A,B,C); gag, pol (B), env (A,B,C)

HIVIS 03 Клинические исследования с целью изучения безопасности и иммуногенности кандидатной ВИЧ-вакцины по схеме плазмидная ДНК/MBA прайм-буст Дек. 2006 MUCHS, Karolinska institute, SMI, Vecura, USMHRP Танзания Прайм: HIVIS ДНК Буст: MVA-CMDR env (A,B,C), gag (A,B), RT (B), rev (B), env (E), gag (A), pol (E)

RV 172 Клинические исследования с целью изучения безопасности и иммуногенности мультитопной ДНК-вакцины против ВИЧ-1, VRC-H1VDNА-016-00-VP (прайм), и мультитопной Май 2006 USMHRP, NIAID Кения, Уганда, Танзания Прайм: VRC-HIVDNA-016-00-VP Буст: VRC-ADV- gag, pol, nef (B), env (A,B,C), gag, pol (B), env (A,B,C)

63 рекомбинантной ВИЧ-1 вакцины на основе аденовируса-5, VRC-ADV-014-00-VP (буст) 014-00-VP

HVTN 042 Клинические исследования с целью изучения безопасности и иммуногенности вакцины LIPO-5 и ALVAC-HIV (vCP1452) по отдельности и в комбинации Апр. 2004 N1AID, ANRS США (10) Прайм: ALVAC-HIV (VCP1452) Буст: LIPO-5 или ALVAC-HIV (vCP1452) и LIPO-5 env, gag, pol + ЦТЛ-эпитопы из nef/pol (В); 5 липопептидов (ЦТЛ-эпитопы) из gag, pol, nef{ В)

HVTN 083 Фаза lb клинических исследований по сравнению безопасности, толерогенности и иммуногенности ДНК-плазмидной вакцины при внутримышечном введении (прайм) и рекомбинантной ВИЧ-вакцины на основе аденовирусного вектора (буст) в случае внутримышечной, подкожной и внутрикожной инъекциях Нояб. 2006 ADARC, IAVI США (6) Прайм: VRC-HIVDNA-009-00-VP Буст: VRC-ADV-014-00-VP gag, pol, nef (В), env (А,В,С), gag, pol (B), env (A,B,C)

DHO-0586 Клинические исследования по изучению безопасности и иммуногенности рекомбинантной ВИЧ-вакцины на основе МВА, экспрессирующего слитные гены env/gag-pol и nef-tat типа С (ADMVA), вводимой однократно внутримышечно добровольцам, получившим предварительно три дозы ДНК-вакцины ВИЧ-1 класс С (ADVAX) Окт. 2006 ADARC, IAVI США ADMVA env/gag-pol и nef-tat (C)

HPTN 027 Исследование безопасности и иммуногенности ALVAC-HIV vCP1521 Окт. 2006 NIAID, Sanofi Уганда ALVAC-HIV VCP1521 em (A,E)

C86P1 Открытое параллельное исследование безопасности и иммуногенности У2-делетированного gpl40 по схеме 3-кратная назальная иммунизация с адъювантом LTK63 (прайм)/ внутримышечная инъекция с адъювантом MF59 (буст) Сен. 2006 SGUL, Richmond Pharmacology, Novartis Vaccine Великобритания Прайм: gpl40 совместно с LTK63 Буст: gpl40 совместно с MF59 em>(B)

VRC Oil (061-0149) Клиническое исследование мультитипной ВИЧ-1 ДНК-вакцины (VRC-HIVDNA-016-00-VP) при внутримышечной, подкожной и внутрикожной инъекциях, и мультитопной ВИЧ-1 рекомбинантной вакцины на основе аденовирусного вектора, VRC-ADV-014-00-VP Май. 2006 NIAID США Прайм: VRC-HIVDNA-0 16-00-VP Буст: VRC-ADV-014-00-VP gag, pol, mfiW), env (A,B,C), gag, pol (B), env (A,B,C)

HVRF-380131004 Клиническое исследование безопасности и толерогенности вакцины ВИЧРЕПОЛ, несущей химерный рекомбинантный белок, содержащий С-конец р17, полноразмерный р24 и иммунореактивный фрагмент gp41, совместно с адъювантом полиоксидонием Март 2006 Институт иммунологии, Москва, Россия ВИЧРЕПОЛ совместно с адъювантом полиоксидонием env, gag (B)

HVTN 065 Клиническое исследование безопасности и иммуногенности ДНК-вакцины pGA2/JS7#2 и рекомбинантной вакцины МВА-ВИЧ 62 Март 2006 NIAID, Geovax США (5) Прайм: HIVB DNA pGA2/JS7#2 Буст: МВА-ВИЧ 62 gag, pro, RT, env, tat, rev, vpu (B); gag, pol, env (B)

HVTN 068 Клиническое исследование по изучению кинетики иммунного ответа безопасности двух способов праймирования, вакцины на основе аденовирусного вектора (VRC-ADV-014-00-VP) и ДНК-вакцины (VRC-HIVDNA-009-00-VP), и последующего введения вакцины на основе аденовируса (буст) Март 2006 NIAID США (5) Прайм: VRC-HIVDNA-014-00-VP или VRC-HIVDNA-009-00-VP Буст: VRC-ADV-014-00-VP gag, pol, nef (В), env (A,B,C), gag, pol (В), em (A,B,C)

Id >аза. Тестирование безопасности и иммуногенности вакцины в клинических испытаниях на небольших группах с низким риском заражения

RV 138 Исследование живой рекомбинантной ALVAC-HIV вакцины [vCP 205, HIV-1 env/gag/pol] при подкожном введении трансфицированных ex vivo аутологичных дендритных клеток, внутрикожно или внутримышечно Март 2006 USMHRP США ALVAC-HIV vCP 205 env, gag, pol (B)

HIVIS 02 Клинические исследования Sanofi Pasteur по изучению безопасности и иммуногенности МВА, несущего гены env, gag и pol, у добровольцев, которые предварительно получали плазмидную ДНК, кодирующую аналогичные гены ВИЧ-1 в HIVIS 01 Янв. 2006 Karolinska institute, SMI, Vecura, USMHRP Швеция MVA-CMDR env (E), gag (A), pol (E)

HVTN 064 Клиническое исследование, направленное на изучение безопасности и иммуногенности рекомбинантной белковой вакцины ЕР-1043 и ДНК-вакцины ЕР HIV-1090 по отдельности или в комбинации Янв. 2006 NIAID, Phamexa- Epimmune США (3), Перу (2) ЕР-1043, ЕР HIV-1090 em, gag, pol, vpu (B); gag, pol, vpr, nef (A,B,C,D,F,G)

IAVI D001 Рандомизированное, плацебо-контролируемое исследование, направленное на изучение безопасности и иммуногенности ТВС-М4 MVA HIV-1 мультигенной вакцины на основе вируса типа С Дек. 2005 IAVI, Therion Индия ТВС-М4 MVA env, gag, tat,rev, nef, ART (C)

IAVI V001 Рандомизированное, плацебо-контролируемое исследование безопасности и иммуногенности ДНК-вакцины на основе многочисленных подтипов ВИЧ-1 и рекомбинантной мультитипной ВИЧ-1 вакцины на основе аденовирусного вектора, совместно или по отдельности Нояб. 2005 IAVI, NIAID Руанда, Кения Прайм: VRC-HIVDNA-016-00-VP Буст: VRC-ADV-014-00-VP gag, pol, nef (B), env (A,B,C); gag, pol (B), em (A,B,C)

HVTN 063 Клиническое исследование безопасности и иммуногенности ДНК-вакцины на основе Gag ВИЧ-1 отдельно или в комбинации с ИЛ-15, буст - Gag ДНК-вакцина + ИЛ-15 ДНК или ИЛ-12 Сен. 2006 NIAID, Wyeth США (7), Бразилия (2) Прайм: GENEVAX Gag-2692 +/- ИЛ-15 ДНК Буст: RC529-SE + ГМ-КСФ или GENEVAX Gag- +/-ИЛ-12 ДНК gag (B), env, gag, nef (В) или gag (B)

Учитывая важность проблемы СПИДа, ставящего под угрозу само выживание человечества, развитие современной науки, первые успехи в поиске новых решений и огромные силы и средства, брошенные на решение этой проблемы, можно надеяться, что эффективная вакцина против ВИЧ/СПИДа будет создана. Более того, по мнению первооткрывателя ВИЧ нобелевского лауреата Р. Гало, такая вакцина уже существует в лабораториях исследователей. Какая из них найдет применение в практической медицине, станет ясно только после расширенных клинических испытаний.

Часть III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Реактивы

В работе использованы реактивы следующих фирм:

Sigma", США: ЭДТА, 2-меркаптоэтанол, агароза А9539, акриламид, метиленбисакриламид, глицин, MOPS (морфолинопропансульфоновая кислота), изопропил-ДО)-тиогалактопиранозид (IPTG), пунцовый С, белковые маркеры молекулярных весов, кумасси R-250, ТЕМЕД, коньюгаты антител с пероксидазой и щелочной фосфотазой, субстраты 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат, нитротетразолевый синий, АЕС, конканавалин A, Tween-20, тритон Х-100, адъювант Фрейнда "Amersham", нитроцеллюлозные фильтры Hybond-C

Serva": сахароза, бромистый этидий, бромфеноловый синий, ксиленцианол, SDS. "Fluka", Швейцария: дрожжевой экстракт, пептон. "Difco", США: триптон, бакто-агар.

Сибэнзим", г. Новосибирск, Р.Ф.: X-Gal, буферы для эндонуклеаз рестрикции (1(B), 2(G), 4(W), 5(Y)).

Все остальные реактивы были произведены в ВО "Реахим" и имели квалификацию "ос.ч", "чда" и "хч".

Bioclot", Германия: Фетальная бычья сыворотка

2. Культуральные и питательные среды

Среда LB. На 1л: Триптон Bacto - Юг, дрожжевой экстракт - 5г, NaCl - Юг. рН 7.2. Среда 2*YT. На 1л: Триптон Bacto - 16г, дрожжевой экстракт - Юг, NaCl - 5г. рН 7.2. Среда RPMI-1640 ( "Биолот",Санкт-Петербург, Россия) Среда DMEM ("Биолот", Санкт-Петербург, Россия)

3. Ферменты

Эндонуклеазы рестрикции BamHI, BglH, EcoRI, Haelll, Hindlll, Kpnl, PstI, PvuII, Xhol, Xbal, Sail, и др., ДНК-лигаза фага Т4, полинуклеотидкиназу, щелочную фосфотазу и Taq-полимеразу были получены из ТОО "Сибэнзим", Новосибирск.

4. Бактерии штаммы Escherichia coli : JM103 (lac-proAB), thi-1, strA, supE, endAl, hsdR, sbcB15, (F', traD36, proAB, lacIqZAM15) и DH5a(F", <|>80d/acZAM15, recA\, end AI, gyrA96, thi-\, hsdR17(rk", mk+), supEU, re/Al, deoR) Д (/acZYA-argF)U169, коллекция ГНЦ ВБ "Вектор". Штамм Salmonella typhimurium SL 7207(2337-65 (=WRAY) hisG46 DEL407[aroA544::Tn 10]) любезно предоставлен Prof. Stacker В. (Стэнфордский университет, США)

Штамм Salmonella enteritidis E-23 (Лсуа, A crp) любезно предоставлен Бойченко M.H. (Медицинская Академия им. Сеченова, г. Москва) [Рыжова и Бойченко, 1997]. Дифференциальные микробиологические среды: среда Симонса, Ютиглера ("НПО Питательные среды", Махачкала), ацетатный агар, среда Эндо ("ННПЦ ГИП", Москва). Биохимические отличия аттенуированных штаммов от исходных родительских штаммов -отсутствие роста на среде Симонса и уменьшенная продукция H2S (на среде Клиглера слабое почернение). 5. Вирусы

В работе были использованы 3 штамма вируса ВИЧ-1:

1) ВИЧ-1-899А (выделен в НИИ им. Д.И. Ивановского, г. Москва, депонент ГКВ 899)

2) ВИЧ-1 ГКВ 4046 (выделен в лаборатории ретровирусов ГНЦ ВБ '"Вектор" НИИ молекулярной биологии, депонент 4046)

3) ВИЧ-1 ГКВ 4005 (выделен в лаборатории ретровирусов ГНЦ ВБ '"Вектор" НИИ молекулярной биологии, депонент 4005)

6 Плазмиды pcDNA3.1.(+) «Invitrogen» pGEX-TBI [Лебедев и др., 2000] pcDNA-TCI [Bazhan S.I. et al, 2004] pRS III [Eroshkin A.M. et al, 1995] pUC8 [Vieira and Messing, 1982] pKHBc [Карпенко, 1993] бактериофаг MlЗНВс [Карпенко, 1993]

7. Растворы

ТЕ - 10 мМ трис-HCl, рН 7.4, 1 мМ ЭДТА.

ТБЕ - 0.089 М трис-борат рН 9.0, 0.089 М борная кислота.

ТАЕ - 20 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА, 40 мМ трис, рН 8.0 доводили ледяной уксусной кислотой.

Трис-глициновый буфер - 25 мМ трис рН 8.3, 192 мМ глицин, 0.1 % SDS.

Буфер (х 6) для нанесения проб ДНК на ПААГ: 0,25 % бромфеноловый синий, 0,25% ксиленцианол, 30 % глицерин.

PBS - 5,84г NaCl, 4,72г Na2HP04, 2,64 г NaH2P04x 2Н20, рН 7,2 - на 1 л.

8. Конструирование рекомбинантных ДНК

Конструирование плазмид проводили с помощью стандартных методик [Маниатис и др., 1988]. Варианты плазмид, несущие ген HBcAg, со встройками фрагментов, кодирующих чужеродные эпитопы (FMDV, ВИЧ-1, ВИЧ-2, HBsAg, preSl, preS2) получали путем клонирования синтетических олигонуклеотидов с использованием сайта рестрикции Xho I. В качестве примера на рис. 6 приведено конструирование плазмид pKHBc-preSl и pKHBc-preS2. Плазмиды pUC8HBc-preSl и pUC8HBc-preS2 получали последовательным клонированием ПЦР фрагмента гена белка НВс в плазмиду pUC8 с использованием сайта рестрикции Eco RI и последующим клонированием модифицированных генов плазмид pKHBc-preSl и pKHBc-preS2, pKHBc-HBs в плазмиду pUC8HBc с использованием сайта рестрикции Bgl II (рис. 6). pcDNA3.1-HBc конструировали путем клонирования гена белка НВс в плазмиде pcDNA3.1 с использованием сайта рестрикции Eco RI.

9. Трансформация клеток К coli плазмидной ДНК

Трансформацию проводили по стандартному методу [Маниатис Т. 1984] с модификациями. 1 мл клеточной культуры E.coli, достигшей оптической плотности D6oo=0.4-0.6 о.е., центрифугировали 1 мин. при 4000 об/мин. Осадок ресуспендировали на холоду в 1мл буфера1: 10 мМ MOPS, 10 мМ RbCI, рН 7.0. Суспензию центрифугировали I мин. при 4000 об/мин, осадок ресуспендировали в буфере 100 мМ MOPS, 10 мМ RbCI, 50 мМ СаС12, рН 6.5 и оставляли во льду на 15 мин. После центрифугирования в течение 40 сек. при 3000 об/мин тщательно удаляли супернатант, ресуспендировали осадок в 0.2 мл буфера 2, добавляли 3 мкл ДМСО и не более 10 мкл раствора, содержащего плазмидную ДНК. Смесь выдерживали во льду в течение 30 мин, затем прогревали 2 мин при 42°С, добавляли 1 мл среды LB и выдерживали 60 мин при 37°С. После чего бактерии высевали на агаризованную среду с соответствующим антибиотиком.

10. Трансформация клеток сальмонеллы плазмидной ДНК

Трансформацию клеток сальмонеллы (S. typhimurium SL 7207, S. enteritidis Е-23) проводили методом электропорации с использованием электропоратора фирмы "Bio-Rad" согласно рекомендациям изготовителя. 1 мл клеточной культуры бактерий, достигшей оптической плотности Ббоо-О.З о.е., центрифугировали 1 мин при 6000 об/мин в охлажденном роторе. Осадок ресуспендировали в 800 мкл деионизованной воды. Процедуру повторяли 5 раз. Затем осадок растворяли в 200 мкл 10% глицерина и центрифугировали 1 мин при 6000 об/мин в охлажденном роторе. К ресуспендированному в 40 мкл 10%-ного глицерина осадку добавляли 1-2 мкл плазмидной ДНК. Электропорацию проб вели при напряжении 2.5 кВ. Сразу после электропорации добавляли в смесь 1 мл среды LB и инкубировали 1 час при 37°С, после чего высевали на агаризованную среду с соответствующим антибиотиком.

P(LAC) £colU<54) l«uti[[ (64)

Jvui] (179)

ALPHA

Вдй\ (i6o)

XM (316)

HBc

ВдШ (599) ficoRI (1094) BomHI (1290)

-J-^ppla; ftjull (4156)

Гидролиз рестриктазой EcoR I и BamH I

Лигирование

P(LAC)

ЕюИ (54)

--------Rga 1(144)

A7ioI (300) HBc

7«I (583)

BaitHll (6(2) PduII (733)

P(BLA)

Pulil (4197)

Гидролиз рестриктазой Bgl

Лигирование

Ml (144)

Xhtl Cnoo) 'FUJI (315) . " BoniIiI(3ift) "fcoRI (336) HBc-preS1 Cgll [622) BanUl (651) I (772)

P(BLA)

Получение фрагмента ДНК, кодирующего белок HBc с помощью ПЦР, гидролиз фрагмента ДНК рестриктазами EcoRl и Bam HI

Bonffl (5884) tac £coRI (71) БдЛ (160)

Ad (316)

PuuII (331) ' BanMl (334) 'Eco R! (352) pKHBc-preS 1

6071 bp

Гидролиз рестриктазой Bgl II

Рис. 7. Схема конструирования плазмид pUC8HBc-preS 1 и pUC8HBc-preS2 на примере пламиды pUC8HBc-preS 1.

11. Секвенирование ДНК на автоматическом секвенаторе

Приготовление пробы. Культуру Е. coli выращивали при покачивании не более 15 часов в 5 мл среды LB. Пробирки с культурой помещали в лёд на 5-10 минут, затем культуру переносили в 1,5 миллилитровые центрифужные пробирки и осаждали клетки на центрифуге Eppendorf 5415С 10 минут при 5500 об/мин. Супернатант сливали, а осадок подсушивали. В каждую пробирку добавляли по 200 мкл буфера STE, ресуспендировали, добавляли 300 мкл буфера LSTET. Смесь перемешивали переворачиванием, выдерживали 3 минуты при комнатной температуре, затем переносили на 1,5 минуты в кипящую водяную баню, после этого помещали в лёд на 17 минут, центрифугировали 30 минут при 13500 об/мин. Супернатант забирали в чистые пробирки, не стряхивая последних капель, и добавляли в каждую по 400 мкл изопропанола. После перемешивания центрифугировали на центрифуге Eppendorf 5410 в течение 20 минут при 14000 об/мин. Осадок растворяли в 90 мкл воды, добавляли 10 мкл буфера для протеиназы К и 2 мкл протеиназы К 20 мг/мл. Инкубировали смесь в течение 1 часа при 56°С. Затем добавили 100 мкл воды и 200 мкл фенола, перемешивали, центрифугировали и переносили водную часть в новую пробирку. Добавляли 200 мкл 100% изоамилового спирта, перемешивали и центрифугировали. Удаляли верхнюю часть и интерфазу и переосаждали ДНК обычным способом. Количество выделенной ДНК определяли электрофорезом в 1 % агарозном геле.

Секвенирование ДНК. Брали 2 мкл ДНК, 1,5 мкл универсального праймера и 2 мкл BigDye Terminator. Реакции секвенирования проводили на амплификаторе (GeneAmp PCR System 9700, РЕ Applied Biosystems, США) в следующих условиях: 96°С - 20 секунд; 96°С -10 секунд, 64°С - 4 минуты, 2 цикла; 96°С -10 секунд, 60°С - 4 минуты, 4 цикла; 96°С -10 секунд, 50°С - 7 секунд, 64°С - 4 минуты, 12 циклов; 96°С-10 секунд, 60°С - 4 минуты, 4 цикла; 96°С - 10 секунд, 50°С - 7 секунд, 60°С - 4 минуты, 12 циклов.

После реакции амплификации проводили очистку от невключившихся флуоресцентно меченных дидезоксинуклеотидтрифосфатов. К 5 мкл реакционной смеси добавляли 35 мкл воды, встряхивали, переносили в 1,5 миллилитровые пробирки, добавляли 60 мкл изопропанола, перемешивали и выдерживали 15 минут при комнатной температуре. После этого центрифугировали на Eppendorf 5410 при 14000 об/мин. Быстро удаляли супернатант, добавляли 200 мкл изопропанола, встряхивали и осаждали в течение 5 минут на Eppendorf 5410. Супернатант удаляли, осадок подсушивали 1 минуту при 90°С.

Электрофорез реакционных смесей проводили в Межинститутском Центре

Секвенирования ДНК на автоматическом секвенаторе ДНК модели ABI PRISM 310

Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). После электрофореза полученные данные

72 анализировали программой Chromas 1.45 (School of Health Science, Griffith University, Австралия).

12. Выделение плазмидной ДНК

Для скрининга плазмидную ДНК выделяли из 1,5 мл или из 5 мл культуры при плотности 109 клеток/мл щелочным методом [Маниатис Т. 1984] с последующим освобождением от примесей нагреванием препарата в течение 10 мин при 75°С в 5 М LiCl. ДНК осаждали из супернатанта, добавляя 2,5 объема этанола.

Электрофорегическое фракционирование ДНК. Фракционирование фрагментов ДНК электрофорезом проводили, как описано ранее [Остерман Л.А. 1981]. Использовали 4%, 6% и 8% ПААГ с соотношением акриламид: бисакриламид 30:1 и 0,8% агарозу в ТАЕ-буфере. Визуализацию ДНК проводили окрашиванием геля раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл). В качестве маркера молекулярных масс использовали Styl-гидролизат ДНК фага X и Bsu RI-гидролизат плазмиды pBR322.

Препаративные количества рекомбинантной плазмидной ДНК (пригодной для иммунизации лабораторных животных) получали несколькими способами: 1. Endotoxinfree Maxiprep Plasmid Purification kit (Promega); 2. щелочной метод, включающий дополнительную стадию с рядом осаждений ацетатом аммония [Saporito-Irwin S.M. et al. J 997] описанного ниже.

Ночную культуру Е. coli (2,5 мл) добавляли в 250 мл среды 2*YT с соответствующими антибиотиками, инкубировали при 37°С в течение 16 ч. Клетки осаждали центрифугированием 10 мин при 10000 xg в охлажденном роторе. Высушенный осадок ресуспендировали в 6 мл раствора I (150 мкл 1,0 М Трис-HCl, рН 7,6; 150 мкл 0,4М ЭДТА, рН 8,0; 600 мкл 0,5 М глюкозы; 12 мг лизоцима; 5,1 мл воды). После 20 минутной инкубации во льду добавляли 12 мл раствора II (600 мкл 20 % SDS; 480 мкл 5 М NaOH; 10,92 мл воды). Выдерживали 10 мин во льду, затем вносили 9 мл ледяного 7.5 М раствора ацетата аммония (рН 7,6), интенсивно встряхивали 5-10 сек и после 10 минут инкубации во льду центрифугировали при 10 мин при 10000 х g в охлажденном роторе. К супернатанту добавляли 16 мл изопропанола, оставляли на 10 мин при комнатной температуре, затем осаждали в течение 10 мин при 10000 х g в охлажденном роторе. Осадок аккуратно растворяли в 4 мл 2 М раствора ацетата аммония (рН 7,4) и после 10 мин инкубации во льду центрифугировали 10 мин при 10000 х g. Далее проводили осаждение ДНК из супернатанта 1 объемом (3 мл) изопропанола так, как описано выше. Высушенный осадок растворяли в 2 мл стерильной дистиллированной воды с добавлением 10 мкл раствора РНК-азы (5 мг/мл), с последующей инкубацией в водяной бане (37°С) в течение 20 мин. В пробирку вносили 1 мл ледяного раствора 7,5 М раствора ацетата аммония и через 5 мин центрифугировали при 10000 х g 10 мин. Далее проводили повторное осаждение плазмиды из супернатанта 1 объемом (3 мл) изопропанола. Полученный сухой осадок дважды промывали 70% этанолом и растворяли в стерильной дистиллированной воде.

Для анализа соответствия полученного препарата ДНК исходной форме плазмиды проводили рестрикционный анализ с последующим электрофорезом в 1% агарозном геле, а также прямое секвенирование по Сенджеру с помощью автоматического секвенатора. Для оценки чистоты препарата исследовали спектр его оптического поглощения в диапазоне длин волн 230-280 нм. Форма спектра и отношения оптических плотностей A260hm/A230hm и А260нм/А280нм характеризуют очистку препаратов ДНК от примесей белков и полисахаридов. В норме эти параметры должны быть не ниже 1,9 и 1,75 соответственно.

13. Выделение химерных частиц HBcAg

Клетки E.coli DH5aF', содержащие плазмиды pUC8HBc, pUC8HBc-preSl, pUC8HBc-preS2, pUC8HBc-HBs, растили на среде YT*2 в течение 16 часов при 37°С. Биомассу бактериальных клеток разрушали с использованием ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т (РФ). После разрушения биомассы клеток Е. coli, содержащих плазмиды pUC8HBc, pUC8HBc-preSl или pUC8HBc-HBs, целевой белок обнаруживается как в растворимой, так и в нерастворимой фракции биомассы примерно в равных пропорциях, в то же время белок HBc-preS2 напротив, находился только в нерастворимой фракции биомассы бактериальных клеток. По этой причине, для очистки белков HBc-preSl и НВс-HBs проводили гель-фильтрацию растворимой фракции биомассы с использованием сефадекса CL-4B. Нерастворимую фракцию биомассы клеток Е. coli, содержащую белок HBc-preS2, предварительно растворяли в 6 М мочевине, проводили гель-фильтрацию также в растворе 6 М мочевины с последующим ступенчатым диализом против 0,1 М трис-HCl. Однако полученные растворы белков содержали значительные примеси белков E.coli, для повышения чистоты препарата был использован метод аффинной гель-фильтрации, с использованием конъюгированных с сефарозой антител к HBcAg, любезно предоставленных Н.А. Чикаевым. Белки сорбировали на колонку в растворе 0,02 М трис-HCl, 0,5 М NaCl, 0,001 М ЭДТА, затем колонку промывали тем же раствором. Элюировали белок 50мМ раствором диэтиламина рН 11,5.

Препаративное выделение химерных частиц HBcAg также осуществляли с помощью ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы (10%-60%), как было описано в работе (Konig et al, 1998). Растворимую фракцию биомассы (или растворенный в 6 М мочевине и диализованный раствор белка в случае HBc-preS2) в объеме 200 мкл наносили на градиент

10-60% сахарозы. Для получения градиента в пробирку объемом 5 мл наносили по 750 мкл растворов сахарозы 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, и 10%. Центрифугировали на центрифуге "Beckman" L8-M, (ротор SW-50.1) в течение 2 часов при 41000 об/мин. Полученные фракции анализировали на наличие белка с помощью электрофореза в 15% акриламидном геле. Раствор белка освобождали от сахарозы диализом против раствора 0,15 М NaCl, 10 шМ ЭДТА, рН 7,2. Концентрацию белка измеряли по Лоури (Кочетов, 1980). Степень очистки белка контролировали с помощью электрофореза в 15% полиакриламидном геле.

14. Выделение рекомбинантных белков gst-TBI и gst-TCI

Для наработки биомассы рекомбинантных клеток Е.coli/pGEX-TBI или E.coli!pGEX-TCI выросшие на селективной (Ар) среде клоны вносили в 100 мл L-бульона. Подращивали до оптической плотности Д55о = 1,0, добавляли ампициллин до конечной концентрации 500 мкг/мл и инкубировали в течение 2 ч для лизиса безплазмидных клеток. После этого засевали 1,6 л L-бульона (8 колб по 200 мл). Индукцию биосинтеза целевого белка проводили добавлением в среду изопропилтиогалактопиранозида до конечной концентрации 0,1 мМ. Гибридные белки gst-TBI и gst-TCI накапливаются в бактериальных клетках в нерастворимой форме в тельцах включения.

Для очистки гибридного белка gst-TBI или gst-TCI, 3 г клеток суспендировали в 15 мл буфера А следующего состава: 10 мМ Трис-HCl (рН 8,3), 0,1 мМ СиСЬ, 0,1 ZnCh. Суспензию подвергали обработке ультразвуком до снижения оптической плотности суспензии при длине волны 550 нм до 50% от исходной. Тельца включения осаждали центрифугированием и еще дважды промывали буфером А. Гибридный белок растворяли в 6 М растворе мочевины в буфере А в течение 2 ч, удаляли осадок центрифугированием и затем проводили его ренатурацию, последовательно инкубируя при концентрациях мочевины 3 М (5 ч) и 1,5 М (16 ч), после этого проводили диализ против буфера А, не содержащего денатурирующего агента. Для доочистки использовали аффинную хроматографию на глутатион-сефарозе согласно рекомендациям фирмы Pharmacia Biotech.

15. Выделение рекомбинантного белка recA-TBI

Для наработки препаративного количества recA-TBI культивировали рекомбинантные клетки Е.со/г'/pRSlII в LB среде (содержащей 200 мкг ампициллина на 1 мл). Клетки растили в колбах на качалке при 37°С до плотности 1 о.е., вносили индуктор ( налидиксовую кислоту) до концентрации 0,01 мМ и продолжали ращение в течение 6 часов на качалке. Клетки собирали центрифугированием при 5000 об/мин (ротор JA10).

Полученную биомассу лизировали в буфере следующего состава: 50мМ трис-HCl рН8, 1 мМ ЭДТА, 0.5 М NaCl, 0.5 мМ PMSF, 0.1 мг/мл лизоцим.

10 г клеток ресуспендировали в 50 мл буфера и проводили лизис до прекращения вязкости, затем обрабатывали ультразвуком до снижения вязкости. Разрушенные мембраны клеток собирали ценрифугированием при 2000 об/мин, ротор JA-20. Тельца включения, содержащие белок recA-TBI, отмыты буфером, и затем целевой белок был растворён в растворе мочевины (6 Моль/л). Белок был очищен при помощи двух последовательных хроматографий на ДЕАЕ-целлюлозе и гель-фильтрации на сефарозе CL-6B. Конечный препарат переведен в физиологический раствор при помощи диализа. Чистоту белка оценивали с помощью белкового электрофореза. Чистота белка составляла более 95 %.

16. Электрофоретический анализ белка

Электрофоретическое разделение белков проводили по Лэмли [Laemmly U.K. 1970] в прерывистой буферной системе в присутствии 0,1 % SDS в трис-глициновом буфере. Разделяющий гель содержал 0,375 М трис-HCl, рН 8.8, 0.1 % SDS, 10 % акриламид, 1 % ^ТМ-метиленбисакриламид (80 % объема геля); концентрирующий гель - 0,125 М трис-HCl, рН 6.8, 0.1 % SDS, 4 % акриламид, 0.5 % !чГ,1Ч-метиленбисакриламид. Пробы наносили в буфере, содержащем 0.0625 М трис-HCl, рН 6.8, 2 % SDS, 5 % 2-меркаптоэтанол, 0.01 % бромфеноловый синий, 10 % глицерин. Перед нанесением пробы прогревались 10 минут при 95°С. Электрофорез вели в режиме 10 В/см. Гель окрашивали 0,2 % кумасси R-250 в 20 % этаноле, 10 % уксусной кислоте. Краситель отмывали кипячением в дистиллированной воде.

17. Масс-спектрометрия:

Для подтверждения аминокислотной последовательности белков TBI и HBsAg была проведена масс-спектрометрия. Анализ был выполнен Серебряковой М. Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва.

Триитический гидролиз белка провели следующим образом: 10 мкл раствора хроматографической фракции высушили и перерастворили в 10 мкл 0.05М NH4HCO3, 0.01М дитиотреит, рН 7.5. Добавили 2 мкл раствора трипсина (Promega) с концентрацией 20 мкгхмл"1 . Гидролиз проводили в течение 2 ч при 56 °С, затем добавили 10 мкл 0.5% ТФУ в 10% водном ацетонитриле и полученный раствор использовали для получения MALDI-масс-спектра.

Подготовка образцов для масс-спектрометрии проводилась следующим образом: на стальной масс-спектрометрической подложке (мишени) смешивали по 0.5 мкл раствора образца и раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (Aldrich, 10 мгхмл"1 в 30 % ацетонитриле в воде с 0.5 % ТФУ). Полученную смесь высушивали на воздухе.

Масс-спектры были получены на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия), оснащенном азотным УФ лазером (Х=337нм). Частота регистрации сигнала составляет 2 ГГц. Каждый масс-спектр получен суммированием от более 200 лазерных импульсов. Интенсивность лазерного удара подбиралась минимально достаточной для получения спектров.

Масс-спектр белка получен в линейном режиме, измеряли значения масс положительно заряженных ионов. Погрешность измерения не превышает 0.05%.

Масс-спектр фрагментации целого белка в источнике ионов (ICD) получен в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона. Погрешность измерения не превышает 0.02%.

Масс-спектр материала триптического гидролизата белка получен в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона. Спектры докалиброваны по известным пикам автолиза трипсина, погрешность измерения масс не превышает 0.01%.

Идентификацию белка проводили с помощью программы Mascot (Matrixscience, США) по базам данных Национального центра биотехнологической информации США (NCBInr), принимая точность определения массы ионов равной 0.01% и допуская возможность окисления метионинов.

18. Электронная микроскопия

Для электронной микроскопии HBcAg, химерные коровые частицы, несущие встройки чужеродных эпитопов, ВПЧ-ТВ1 и частицы КомбиВИЧвак адсорбировали на сеточках с формваровой подложкой в течение 1-2 мин. Электронная микроскопия коровых частиц была проведена Б.Н. Зайцевым (ГНЦ ВБ "Вектор"). Был применен метод негативного контрастирования образцов 1%-ным раствором уранилацетата. Исследование проводили с использованием электронного микроскопа JEM100C (Япония).

Иммуноэлектронная микроскопия была проведена JI.B. Колесниковой (ГНЦ ВБ "Вектор"). Для иммуноэлектронной микроскопии образцы после адсорбции помещали на 20 мин в 1%-ный бычий сывороточный альбумин, приготовленный на 0,01 М фосфатном буфере (PS) рН 7,4. Моноклональные антитела против HBsAg (производство АО "Вектор-Бест", Кольцово) разводили в соотношении 1:1000 PS и инкубировали с образцами 45 мин при 37°С. После этого образцы промывали 3 раза по 5 мин в PS с 0,01% tween 20. Козьи антитела против IgG мыши, меченные золотом (5 нм), разводили в 70 раз PS и инкубировали с образцами 30 мин при 37°С. После инкубации образцы промывали 3 раза по 5 мин в PS с 0,01% tween 20, затем промывали 5 мин в ФБ, затем 5 мин в дистиллированной воде и окрашивали 1%-ным раствором уранилацетата (Hayat, 1981). Исследование проводили с использованием электронного микроскопа JEM100C.

19. Атомно-силовая микроскопия

Для атомно-силовой микроскопии препараты частиц были адсорбированы на подложке. Для обессоливания проводили отмывку препаратов дистиллированной водой дважды. Анализ препаратов был проведен с помощью атомно-силового микроскопа Solver P47BIO (NT-MDT, Россия) в intermittent-contact mode на воздухе. Работа проведена Б.Н. Зайцевым в ГНЦ ВБ "Вектор".

20. Исследование иммуногенности химерных частиц HBcAg

20.1. Иммунизация лабораторных животных

Для иммунизации были использованы мыши линии BALB/c, весом 15-17 граммов, полученные из питомника лабораторных животных ГНЦ ВБ "Вектор". Животные содержались на стандартном рационе. Все процедуры с животными проводили в соответствии с протоколом, утвержденным Биоэтическим комитетом ГНЦ ВБ "Вектор".

Иммунизацию проводили внутримышечно белками в физиологическом растворе в объеме 100 мкл. Гидроокись алюминия вводили в дозе 0,3 мг или адъювант Фрейнда (полный или неполный) - в объеме, равном объему раствора белка. Забор крови проводили из орбитального синуса. Забой животных осуществлялся цервикальной дислокацией.

Иммунизацию суспензией клеток рекомбинантных штаммов сальмонелл проводили ректально в объеме 50 мкл, предварительно проводя очищение кишечника животных. Суспензию клеток сальмонелл подготавливали разведением нужного количества бактериальных клеток в PBS.

20.2. Оценка гуморального иммунного ответа при иммунизации химерными частицаими HBcAg (ИФА и иммуноблоттинг)

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Титр образующихся антител в сыворотках мышей анализировали с помощью ИФА. Для выявления антител против химерных белков использовали очищенные рекомбинантные белки HBcAg-preS, HBc-preS2, HBc-HBs. Рекомбинантный белок (10 нг на лунку в объеме 100 мкл) сорбировали на планшеты в течение ночи в карбонатном буфере (15тМ Ыа2СОз, 35 тМ NaHC03, рН 9,2) при 8°С. Для разведения сывороток использовали буфер TBS (147mM NaCl, 3mM КС1, ЮтМ трис-HCl, рН 7,2) с добавлением 0,1% раствора казеина. Инкубацию с сыворотками мышей проводили в течение часа при 37°С. Для промывки планшетов использовали буфер TBS с добавлением 0,05% tween-20. Для выявления антител использовали антивидовой конъюгат антител со щелочной фосфатазой и краситель SIGMA FAST p-nitrophenyl phosphat. Результаты оценивали на спектрофотометре (BIO-RAD-608) при длине волны 405 нм. Титр определяли как разведение сыворотки, при котором оптическая плотность двукратно превышает фоновое значение. Все измерения титров антител были проведены трехкратно. Используя данные титров сывороток мышей одной группы, вычисляли среднее арифметическое и стандартное отклонение (доверительный интервал рассчитан для 95% уровня значимости).

Для выявления антител, специфичных к эпитопам preSl (27-37 а.о.) и preS2 (131-145 а.о.), использовали биотинилированные синтетические пептиды с аминокислотной последовательностью эпитопа preSl (27-37 DHQLDPAFRAN) и preS2 (131-145 LQDPRVRGLYFPAGGSR). Стрептавидин (10 нг на лунку в объеме 100 мкл) сорбировали на планшеты в течение ночи в карбонатном растворе при 8°С. Для сорбции биотинилированных пептидов и разведения сывороток использовали буфер TBS с 0,1% казеином. Пептиды сорбировали в течение часа при 37°С (100 нг на лунку в объеме 100 мкл). Для промывки планшетов использовали TBS-tween 20. Инкубацию с сыворотками мышей проводили в течение часа при 37°С. Для выявления антител использовали антивидовой конъюгат антител со щелочной фосфатазой. Используя данные сывороток мышей одной группы, вычисляли среднее арифметическое, стандартное отклонение и доверительный интервал (доверительный интервал рассчитан для 95% уровня значимости).

Для выявления антител к встроенным в HBcAg последовательностям также использовали иммуноферментный анализ сывороток, предварительно истощенных HBcAg (в концентрации 1 мкг/мл) или соответствующими синтетическими пептидами (в концентрации 1 мкг/мл). Сыворотки перед нанесением на планшеты инкубировали с антигенами в течение 1 часа при 37°С. Остальная схема эксперимента была аналогична методике иммунноферментного анализа с использованием рекомбинантных белков, которая была приведена выше.

Наличие антител класса IgA анализировали в смывах тонкого кишечника мышей. Извлекали фрагмент кишечника, удаляли содержимое и тщательно промывали 200 мкл PBS. Иммуноферментный анализ проводили аналогично описанному выше с использованием антивидового конъюгата к IgA.

20.3. Иммуноблоттинг

Электрофоретическое разделение белков проводили в 15%-ном полиакриламидном геле по Лэммли [Laemmly U.K. 1970]. Рекомбинантные бактериальные клетки осаждали из 1 мл культуры. К осадку добавляли 40 мкл лизирующего буфера (1М трис-HCl рН 8,8, 5% ДСН, 20% глицерин, 10% меркаптоэтанол, 0,02% бромфеноловый синий) и выдерживали на кипящей водяной бане 5 мин. Электрофоретическое разделение белков проводили в полиакриламидном геле в присутствии 0,1% ДСН. Перенос белков из геля на фильтр осуществляли по методике Бурнета [Burnette, 1981] при напряжении электрического поля 10 В/см в течение часа. Фильтры помещали в 3%-ный раствор БСА в 0,01М трис-HCl, рН 7,5, 0,05% тритон Х-100 на 1 час, после чего инкубировали 1 час со специфическими антителами в буфере 0,05М трис-HCl, рН 7,5, MgCl2 0,005М, 0,15М NaCI, 0,05% тритон Х-100. Этот же раствор использовали для последующей отмывки фильтров и для инкубации с конъюгатом антител козы к IgG (кролика или мыши) со щелочной фосфатазой. Последнюю промывку проводили буфером 0,05М трис-HCl, рН 9,2, MgCl2 0,005М, 0,15М NaCI. В качестве субстратов для щелочной фосфатазы при выявлении иммунных комплексов использовали 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат (BIP) и нитротетразолевый синий (NBT). В случае использования метода дот-блота бактериальные культуры лизировали в растворе 0,1 М трис-HCl, 1% ДСН, 10% меркаптоэтанол. Лизаты наносили на нитроцеллюлозный фильтр и далее проводили иммуноблоттинг, как описано выше.

20.4. Оценка клеточного иммунного ответа при иммунизации химерными частицами HBcAg (ELISPOT)

ELISPOT

Исследование количества клеток селезенки, продуцирующих ИФНу, IL-2, IL-4, проводилось с использованием наборов фирмы "BD" для ИФНу и " Mabtech " для IL-2 и IL-4.

На 96- луночные плашки с нитроцеллюлозой наносили раствор антител к ИФНу (или IL-2 или IL-4) по 100 мкл, с концентрацией 5 мкг/мл и инкубировали в течении ночи при 4 °С. Затем плашки промывали раствором PBS с 0,25% Tween-20 и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре с раствором PBS, содержащим 10% фетальную сыворотку КРС. Селезенки иммунизированных мышей растирали в 2 мл среды RPMI-1640. Клетки промывали два раза той же средой по 2 мл, затем ресуспендировали в 500 мкл RPMI-1640 с 10% фетальной сывороткой КРС. Концентрация клеток определялась в камере Гаряева. Суспензию клеток наносили на плашки в количестве 2*105 для ИФНу и 4*105 для IL-2 и IL-4. К клеткам добавляли растворы белков для индукции синтеза цитокинов, конечная концентрация белков составляла 1 мкг/мл. Культуры клеток инкубировали в течение суток при 37°С и 5% атмосфере СО2. Затем плашки отмывали PBS с 0,25% tween-20 и инкубировали при комнатной температуре с биотинилированными антителами к ИФНу (или IL-2 или IL-4) в течение 2 часов. После следующей промывки PBS с 0,25% tween-20 плашки инкубировали с конъюгатом авидина с пероксидазой хрена в течении часа и снова промывали планшеты. Окраска проводилась реактивом АБС в течении 10-30 мин и останавливалась промывкой планшета водой. Используя результаты, полученные у мышей одной группы, вычисляли среднее арифметическое, стандартное отклонение и доверительный интервал (доверительный интервал рассчитан для 95%-ного уровня значимости).

21. Определение ЛД5о аттенуированных штаммов сальмонеллы при перректальном введении

Мыши линии BALB/c были разделены на несколько групп по 10 животных в каждой. Животным ректально вводили по 30 мкл клеток сальмонелл штаммов S.enteritidis 1791 (штамм дикого типа), S. enteritidis Е-23 и S. typhimurium SL7207 в различных дозах: от 101 до 10ю. Наблюдали за состоянием мышей в течение 50 сут. Результат эксперимента учитывали по гибели животных. ЛД50 определяли по методу Рида и Менча с использованием следующей формулы:

50-а)

ЛД50=АГ (Ь-а) где А - доза, которая дает <50% смертности

В - доза, которая дает >50% смертности а - % реагирующих на дозу А b - %реагирующих на дозу В f- фактор разведения

22. Исследование антигенной структуры сальмонелл

Изучение антигенной структуры бактериальных штаммов проводили путем постановки реакции агглютинации на стекле с видоспецифическими монорецепторными сыворотками к О- и Н-антигенам сальмонелл [Рыжова, Бойченко, 1997].

23. Исследование персистенции сальмонелл в органах лабораторных животных

Персистенцию сальмонелл определяли путем высева разведений гомогенатов, приготовленных из стерильно извлеченных органов животных (кишечник, печень, селезенка) на дифференциально-диагностические среды с последующим инкубированием и подсчетом характерных для рода Salmonella колоний. Колонии серотипировали специфическими видовыми О- и Н- сыворотками. Результаты выражали в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) на орган.

24. Конструирование вакцины КомбиВИЧвак

Центральным ядром кандидатной вакцины КомбиВИЧвак является плазмида pcDNA-TCI, а оболочкой является конъюгат спермидина-полиглиглюкина-TBI. Для получения оболочки 15 мг (0,25 мкМ) полиглюкина (60000 Д) обрабатывали 0,05 М раствором периодата натрия в течение 20-30 мин и затем отделяли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-50 в 20 мМ фосфатном буфере (рН 7,6). После этого в раствор активированного полиглюкина вносили 5,5 мг белка TBI (0,25 мкМ) и 0,4 мг спермидина (2,6 мкМ). Смесь инкубировали в течение 5 ч, затем добавляли боргидрид натрия, перемешивали еще 2 ч и образовавшийся конъюгат отделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-50, используя 100 мМ Трис-HCl (рН 8,3). Так как исходные компоненты (TBI и спермидин) вносились в соотношении на 0,25 мкМ полиглюкина 0,25 мкМ TBI и 2,6 мкМ спермидина, то можно предположить, что и полученный конъюгат содержит их в соотношении 1 молекула полиглюкина: 1 молекула TBI: 10 десять молекул спермидина.

Для сборки вакцины КомбиВИЧвак к раствору, содержащему 7,5 мг pcDNA-TCI (около 1,8 нМ) в физиологическом растворе, добавляли полисахаридный конъюгат, смесь инкубировали 2 ч при 4°С. Полученную конструкцию отделяли от несвязавшихся компонентов гель-фильтрацией на сефарозе CL-6B в физиологическом растворе. Одна доза вакцины объемом 0,2 мл содержит: 75 мкг рекомбинантной плазмидной ДНК pcDNA-TCI; 50 мкг рекомбинантного белка TBI.

Для контроля была получена конструкция, состоящая из векторной плазмиды pcDNA 3.1 (Promega), не содержащей ген TCI, покрытая оболочкой из конъюгата спермидин-полиглюкин. Конъюгат получали, как описано выше, за исключением того, что белок TBI в реакционную смесь не вносили. Сборка конструкции КомбиВИЧвак проводилась JT.P. Лебедевым ГНЦ ВБ "Вектор".

25. Конструирование вакцины СалВИЧ Д

25.1. Приготовление суппозитория Сал-ВИЧ "Д", содержащего живые клетки аттенуированного рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI

Компоненты основы суппозитория в виде навесок ( твердый кондитерский жир - 470,0 ± 1,0 г и эмульгатор Т2 - 25,0 ±0,1 г) количественно переносят в стакан вместимостью 1 л, который помещают на водяную баню, нагретую до 55° С, и выдерживают до полного расплавления смеси. Стакан с расплавленной основой помещают в смеситель-гомогенизатор и перемешивают при 200 об/мин до получения однородной массы. Основу охлаждают при постоянном перемешивании до температуры (39± 1)°С. Биомассу клеток Salmonella enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI соединяют с 5 мл стерильной очищенной воды и ресуспендируют до получения однородной суспензии, которую вводят в охлажденную суппозиторную основу, тщательно перемешивая до получения однородной массы. Суппозиторную массу выливают в подготовленные формы и охлаждают при температуре минус (15± 2)°С в течение 60 мин. Приготовление суппозиториев проводила Т.А. Терещенко по технологии, разработанной Г.М. Левагиной.

25.2. Определение подлинности препарата суппозитория для иммунопрофилактики ВИЧ на примере суппозитория Сал-ВИЧ "Д"

Подлинность препарата определяется наличием Salmonella enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI и плазмиды pcDNA TCI. Проверку сохранности плазмиды в штамме-продуценте проводят способом прямого посева на диагностическую среду с L-агаром, содержащим ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Наличие роста указывает на сохранность плазмиды в штамме-продуценте. Определение наличия плазмиды pcDNA TCI, встроенной в штамм-реципиент Salmonella enteritidis Е-23, проводят с помощью рестрикционного картирования на соответствие авторскому препарату плазмиды, описанному в [Bazhan et al., 2004].

25.3. Определение жизнеспособных клеток в суппозиториях

Один суппозиторий весом 2,0 г, содержащий клетки аттенуированного штамма

Salmonella enteritidis Е-23 со встроенной плазмидой pcDNA-TCI, размягчают при 37°С в фосфатном буфере до однородного состояния и готовят 10-кратные разведения суспензии.

Из растворов 6-го, 7-го и 8-го разведений делают высевы по 100 мкл на чашках Петри с Lагаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина, и термостатируют сутки при 37°С. По истечении времени проводят визуально подсчет количества колоний на чашках.

Количество жизнеспособных колоний рекомбинантных сальмонелл в суппозитории (X) находят по формуле:

N х 10р X - количество жизнеспособных колоний;

X = --------------, где: N - количество колоний;

Vp 1 Op - номер разведения;

Vp - объем высеваемого разведения, мкл; (100 мкл) Количество жизнеспособных колоний в суппозитории после подсчета составляет от 106 до 108.

26. Исследование иммуногенности кандидатных вакцин против ВИЧ-1

26.1. Иммунизация лабораторных животных

Для иммунизации были использованы мыши линии BALB/c, весом 15-17 граммов, полученные из питомника лабораторных животных ГНЦ ВБ "Вектор". Животные содержались на стандартном рационе. Все манипуляции с животными проводили с применением седативных средств в соответствии с ветеринарным законодательством. Применяли несколько способов иммунизации:

1) внутримышечное введение рекомбинантных белков в физиологическом растворе в объеме 100 мкл совместно с полным или неполным адъювантом Фрейнда;

2) внутримышечное введение экспериментальных ДНК вакцин в физиологическом растворе в объеме 100 мкл;

3) внутримышечное введение препаратов вирусоподобных частиц в физиологическом растворе в объеме 100 мкл;

4) перректальное введение суспензии клеток рекомбинантных аттенуированных штаммов сальмонелл в растворе PBS в объеме 30 мкл.

Забор крови производили из ретроорбитального синуса. Эвтаназия животных осуществлялась методом цервикальной дислокации.

26.2. Иммуноферментный анализ

Для иммуноферментного анализа антиген (рекомбинантные белки: GST- TBI, GST-TCI; лизат вируса ВИЧ-1) разводили в буфере PBS до концентрации 1 мкг/мл и вносили по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета CORNING. Инкубировали в течение ночи при 4°С. После удаления АГ лунки промывали три раза буфером 0,1%PBS-Tween 20. Места неспецифического связывания насыщали 3% раствором казеина в буфере PBS, при 37°С 2 часа. После этого лунки вновь промывали трижды буфером 0,1%PBS-Tween 20. Вносили по 100 мкл/лунку последовательных разведений сыворотки в буфере PBS с 3% казеином. Инкубировали при покачивании 1 час при 37° С. Промывали трижды буфером 0,1% PBS-Tween 20. Специфически связавшиеся антитела выявляли с помощью меченных пероксидазой антител кролика против IgG мыши в разведении 1/10000. Инкубировали 1 час при 37°С. После трехкратной промывки 0,1 % PBS-Tween в лунки добавляли хромоген - ТМБ в цитратно-фосфатном буфере и инкубировали 30 минут при

84 комнатной температуре. Реакцию останавливали внесением 100 мкл/лунку серной кислоты. Результат регистрировали при длине волны 450 нм.

Для выявления специфических антител к рекомбинантным белкам - gag, gpl20, envl и env2 ВИЧ-1 использовали планшеты «Тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу иммунодефицита человека первого типа - Антиген», производства «Вектор-БиАльгам» и тест-систему Унибест-ВИЧ 1,2 AT (ЗАО «Вектор-Бест»). В «Тест-системах.» коньюгат против IgG человека был заменен на коньюгат против IgG мыши в разведении 1:100000. Проведение реакции совпадало с вышеописанной процедурой ИФА.

26.3. Иммуноблоттинг белков с иммунными сыворотками

Иммуноблоттинг проводили с использованием нитроцеллюлозных фильтров с сорбированными белками ВИЧ-1 коммерческих тест-систем «New-Lav-Blotl» (Bio-Rad) и «Блот-ВИЧ 1/2+ О» («ЗАО Боисервис», Россия). При исследовании специфичности мышиных сывороток иммуноблоттинг проводили согласно инструкции по применению к тест-системам, за исключением того что конъюгат против IgG человека был заменен на коньюгат против IgG мыши с пероксидазой хрена («Sigma»).

26.4. Реакция бласттрансформации

Реакция бласттрансформации спленоцитов была проведена совместно с Г.М.Игнатьевым и А.Е. Нестеровым (ГНЦ ВБ "Вектор") по ранее описанной методике [Хоробых В.В. и др. 1983]. В качестве специфических антигенов использовали очищенный инактивированный ВИЧ-1, в качестве неспецифического антигена -очищенный инактивированный у-излучением вирус энтерита норки. В качестве митогена использовали конканавалин А (пр-во "Sigma", США) в концентрации 5 мкг/мл. Клетки, стимулированные антигенами, инкубировали в течение 78 ч. За 18 ч до окончания срока инкубации вносили 3Н-тимидин в дозе 2 мкКи на лунку. Клеточный ответ оценивали по показателю индекса стимуляции, который характеризует отношение пролиферации спленоцитов, индуцированных специфическими антигенами, к спонтанной пролиферации спленоцитов.

26.5. Определение специфических IFN-у-продуцирующих клеток в реакции ELISPOT

Тест проводился с использованием наборов фирмы "BD" (США). При постановке реакции ELISPOT на первом этапе проводили сорбцию анти-IFN-y- моноклональных антител с концентрацией 5 мкг/мл на лунку 96-луночного планшета ImmunoSpot М200. После инкубации в течение 12 часов при 4°С каждую лунку дважды промывали раствором PBS и блокировали средой RPMI-1640, содержащей 10% фетальную бычью

85 сыворотку в течение 2 часов. В качестве клеток-эффекторов использовали спленоциты иммунизированных животных в концентрации 106/мл. Для стимуляции клеток использовали белок TCI (1 мкг/мл) и два пептида: Р15 (DRVIEVVQGAYRAIR), Р16 (KQIINMWQEVGKAMYA), для оценки неспецифической продукции использовали белок ЕНЕС (неинфекционный штамм E.coli). Клетки культивировали в присутствии 5% СОг при 37°С в течение 24 часов. IFN-у-секретирующие клетки визуализировали, используя 0,5 мкг/мл биотинилированнных анти- IFN-y-антитела и 0,25 мкг/мл конъюгата Avidin-HRP. Окрашивание производили добавлением субстратов для пероксидазы (4-хлор-1-нафтол, диаминобензидин фосфат). Реакцию останавливали удалением реагентов, лунки промывали 3 раза дистиллированной водой. Подсчет количества IFN-у-продуцирующих клеток осуществляли с помощью микроскопа. Результаты оценивали как количество IFN-у-продуцирующих клеток на 105 спленоцитов.

26.6. Реакция вирусной нейтрализации

Реакцию нейтрализации проводили, используя дозу вируса, равную 100 TCID50. В реакции вируснейтрализации были использованы несколько штаммов ВИЧ-1:

1)ГКВ-4046 (выделен в лаборатории ретровирусов ГНЦ ВБ "'Вектор" НИИ молекулярной биологии, депонент 4046);

2) ВИЧ-1 -899А (получен в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, г. Москва);

3) ГКВ-4005 (ВИЧ-1 сук) (выделен в лаборатории ретровирусов ГНЦ ВБ '"Вектор" НИИ молекулярной биологии, депонент 4005).

Сыворотки иммунизированных животных прогревали на водяной бане при 56°С в течение 30 мин. В лунки 96-луночного планшета Cell-Cult вносили по 50 мкл суспензии вируса и равные объемы последовательных разведений сыворотки (от 1:50 до 1:1080). Культуральные планшеты помещали в СОг-инкубатор на 1 ч. После инкубации в каждую лунку вносили по 100 мкл взвеси чувствительных клеток МТ-4 с концентрацией 2,0 х 106 кл/мл для адсорбции вируса на клетках. После чего разбавляли клетки до посевной концентрации 0,5х10б/мл питательной ростовой средой RPMI-1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, и вновь помещали планшеты в СОг-инкубатор. В качестве положительного контроля использовали сыворотку ВИЧ-инфицированного пациента. В качестве отрицательных контролей были использованы нормальная человеческая сыворотка и нормальная мышиная сыворотка. ВИЧ-положительная сыворотка была получена и охарактеризована в Новосибирском государственном областном центре по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями. Результаты учитывали на четвертые сутки, определяя содержание вирусного белка р24 в каждом образце методом иммуноферментното анализа ("Тест-система иммуноферментная для определения белка р24 вируса ВИЧ-1", "ЗАО Вектор-Бест", Кольцово, Новосибирская обл.).

Учитывая конечное разведение опытных и контрольных проб, определяли количественное содержание р24 при помощи построения калибровочной прямой, сопоставляя среднее по трем лункам значение ОП исследуемых проб с ОП в лунках с разведениями стандартного положительного образца, прилагаемого к тест-системе. Стандартный контрольный образец с известным содержанием рекомбинантного р24 (320 пг/мл) предварительно был проверен и оттитрован по стандарту "Antigen HIV-1 Standard" ("BioRad"). Проценты вирусной репликации в опыте рассчитывали по отношению концентрации белка р24 при использовании сыворотки иммунизированного животного к концентрации белка р24 при использовании нормальной мышиной сыворотки. Реакцию учитывали при жизнеспособности клеток МТ-4 не менее 80%.

27. Статистическая обработка полученных результатов

Статистическая обработка результатов экспериментов включала в себя вычисление средних значений и среднестатистических отклонений (М±ш) с использованием пакета программ для статобработки Microsoft Excel. Достоверность полученных данных оценивалась с использованием критерия Манна-Уитни с различными уровнями значимости с помощью программы Statistica для Windows ХР.

28. Математические методы исследований

Математическая часть исследований была проведена совместно с В.А. Иванисенко, И.С. Пика и А.Г. Бачинским (ГНЦ ВБ "Вектор"). Для анализа гомологии эпитопов вируса с белками человека использовали последовательности белков, хранящиеся в банке данных SWISSPROT и TrEMBL на сервере Европейского института Биоинформатики (ftp://ftp.ebi.ac.uk). Анализ проводился с помощью программы SIM [Huang and Miller, 1991], полученной на том же сервере. Анализ физико-химических параметров аминокислотных последовательностей встроек проводили с использованием программы ProAnalyst [Eroshkin, 1995], а также программы SALIX и QSARPro [Иванисенко и Ерошкин, 1997].

Часть IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Карпенко, Лариса Ивановна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Общепризнанный факт - человечество стало вакцинозависимым [Медуницын, 2004]. Однако, отношение к вакцинам в настоящее время не однозначно. Несмотря на то, что благодаря вакцинации удалось победить ряд опасных инфекций (оспа, полиомиелит и др.), все чаще поднимается вопрос о тех осложнениях, которые могут вызвать и вызывают традиционные вакцины, основанные на аттенуированных или инактивированных патогенах.

Современная вакцинология стремится к созданию «идеальных» вакцин, которые должны быть эффективны, безопасны и не иметь побочных свойств. Успехи молекулярной биологии и иммунологии, повышение требований к безвредности и чистоте препаратов стимулировало создание нового поколения искусственных вакцин: субъединичных, рекомбинантных, антиидиотипических, ДНК-вакцин и др. Необходимость разработки новых вакцин связана также с решением проблемы борьбы с еще не побежденными инфекциями. Среди них особую тревогу вызывают вирусные гепатиты и СПИД. На сегодняшний день это наиболее социально значимые вирусные инфекции.

Один из перспективных подходов к созданию вакцин основан на выборе В- и Т-клеточных эпитопов, которые содержат только необходимые для формирования специфического иммунитета фрагменты вирусных белков. Размер эпитопа соизмерим с активным центром антитела или клеточного рецептора, и обычно не превышает 20 а .о. Основной недостаток искусственных вакцин на основе пептидов (эпитопов) - их низкая иммуногенность. Поэтому очень важно правильно выбрать средства доставки иммуногена, которые обеспечат запуск нужных механизмов гуморального, клеточного и мукозального звеньев иммунитета.

В нашей работе мы использовали подход, в основу которого заложен принцип объединения в одной конструкции оптимально подобранных вирусных эпитопов для создания искусственных иммуногенов ВИЧ-1 и гепатита В. В качестве средств доставки для сконструированных иммуногенов нами были разработаны вирусоподобные частицы и рекомбинантные штаммы сальмонелл.

Идея использования HBcAg в качестве носителя чужеродных эпитопов является

187 очень заманчивой, поскольку он обладает всеми свойствами "идеального" иммуногена. HBcAg представляет собой частицу, способную экспонировать на своей поверхности множество антигенных детерминант. Благодаря своей структуре HBcAg обладает высокой иммуногенностью, обладает свойствами Т-зависимого и Т-независимого иммуногена, способен собираться в вирусоподобные частицы в эукариотических и прокариотических системах экспрессии.

В большинстве работ, посвященных дизайну HBcAg, встройки осуществлялись в N-или С-концы белка, т. е., в соответствующие области гена С, где существовали уникальные рестрикционные сайты, данные природой.

В нашей работе мы осуществляли встройки чужеродных эпитопов в поверхностно-экспонированную и антигенноактивную область el HBcAg, используя для клонирования уникальный сайт Xhol, введенный нами [Карпенко, 1993] с помощью олигонуклеотиднаправленного мутагенеза. Мы полагали, что размещение чужеродного эпитопа в природном иммунодоминантном районе может привести к усилению ответа на него. Действительно, нам удалось провести ряд встроек в область el HBcAg и доказать перспективность использования выбранной области для конструирования искусственных иммуногенов. Поэтому мы провели масштабный анализ влияния физико-химических параметров а.о. встроек на сборку химерных белков, полученных на основе HBcAg. Данный анализ был проведен как на основе наших результатов по встройкам различных детерминант, так и с использованием результатов, полученных другими авторами. Проведенные исследования дают нам право рекомендовать при встраивании чужеродных пептидов в HBcAg проводить анализ физико-химических свойств пептидов-кандидатов в противовирусные вакцины с использованием выведенного алгоритма. Если существует возможность выбора, то желательно выбрать такой пептид-кандидат, который обладал бы невысокими параметрами гидрофобности, объема Р-структуры. В случае, когда пептид обладает хорошими иммунологическими свойствами, но не соответствует предлагаемым параметрам, удовлетворяющим сборке химерного белка, необходимо использовать другие подходы. Так, мы показали, что одним из возможных путей решения проблемы сборки химерного HBcAg является введение фланкирующих цистеинов в целевой пептид, который предполагается встроить в коровый белок. Другим способом решения проблемы может быть разработанная в данном исследовании техника получения мозаичных структур химерного HBcAg.

В нашей работе мы показали, что для встройки в HBcAg можно использовать не только линейные антигенные детерминанты, но и имитаторы конформационных детерминант. Такие имитаторы возможно отобрать с помощью техники фагового дисплея.

В настоящей работе эта возможность была продемонстрирована на примере миметиков

188 антигенной детерминанты белка gp 41 (ВИЧ-1), узнаваемой МКА 2F5, отобранных с помощью техники фагового дисплея.

Химерные капсиды HBcAg с экспонированными на их поверхности эпитопами инфекционных агентов, пространственная организация которых соответствует нативной и обеспечивает адекватный защитный ответ, обладают очевидным преимуществом перед традиционными методами создания иммуногенов. Гибридные капсиды HBcAg безопасны, т.к. не несут в себе вирусной ДНК, высокоиммуногенны и могут быть получены в больших количествах с высокой степенью чистоты. Очевидно, что данное направление по-прежнему будет оставаться одним из важнейших для создания рекомбинантных вакцин в обозримом будущем.

Очевидно, что наиболее заманчивым было бы использование HBcAg для получения экспериментальных вакцин против гепатита В. В данной работе на основании литературных данных были выбраны иммуногенно значимые фрагменты районов preS-поверхностного белка ВГВ. Были сконструированы химерные коровые белки HBc-preSl, HBc-preS2, несущие выбранные эпитопы поверхностного белка ВГВ. Показана сборка белков в частицы в клетках бактерий. Исследование иммуногенных свойств полученных конструкций показало, что химерные белки индуцируют синтез антител к эпитопам поверхностного белка ВГВ. При иммунизации белком HBc-preSl, антител к встроенной последовательности регистрируется больше, чем при иммунизации белком HBc-preS2. Этот факт может быть следствием природных различий в способности индуцировать иммунный ответ у эпитопов preSl и preS2. Вероятна и различная степень экспонирования встроенных эпитопов на поверхности химерных HBcAg.

Выявлено уменьшение антигенности белка-носителя (HBcAg) у химерных белков

HBc-preSl, HBc-preS2 и HBc-HBs, возникшее в результате нарушения основной антигенной детерминанты белка НВс при введении встроек. Уменьшение антигенности белка-носителя очень важный фактор для использования HBcAg в качестве универсального носителя чужеродных детерминант, поскольку иммунный ответ к носителю не должен превосходить иммунный ответ к целевым эпитопам. В то же время, в данном случае HBcAg используется не только как носитель эпитопов, но и как один из антигенов вируса, против которого предполагается разработка кандидатной вакцины. С другой стороны, надо отметить, что наибольшую ценность для создания вакцины имеет свойство HBcAg стимулировать клеточный иммунный ответ. Большое количество исследований подтверждает, что именно недостаточность цитотоксического иммунного ответа к коровому белку ВГВ обуславливает хронизацию заболевания ВГВ [Lohr et al.,

1993; Missale et al., 1993; Chisari, 2000]. Антитела к этому белку регистрируются на всех стадиях заболевания, и не обнаружено корреляции между появлением антител к данному

189 белку и исходом заболевания [Соринсон, 1996]. Гуморальный иммунный ответ, необходимый для предотвращения заболевания и способный предотвратить хронизацию заболевания, направлен на поверхностный белок вируса, как на основную его часть, так и на район preS [Neurath et al., 1989; Ryu et al, 1997; Mi etal., 1999].

Сравнительное исследование клеточного иммунного ответа при иммунизации коровым белком и химерными белками HBc-preSl, HBc-preS2 и HBc-HBs показало, что встройки, внедренные в HBcAg, не оказывают существенного влияния на индукцию клеточного ответа. Это важный факт, поскольку внедрение эпитопов в белок может существенно изменить его иммунологические свойства, и, как было отмечено выше, стимуляция клеточного ответа коровым белком является значимым свойством этого белка при создании вакцин. Таким образом, сконструированные антигены способны стимулировать иммунный ответ к внедренным эпитопам и сохраняют способность корового белка стимулировать клеточный иммунный ответ. Такие антигены могут быть использованы при создании вакцин против ВГВ.

В настоящее время в медицинской практике широко используется вакцина на основе поверхностного белка ВГВ (HBsAg). Недостатком этого препарата является то, что его применение не стимулирует мукозальный иммунный ответ и не обеспечивает резистентность у входных ворот проникновения инфекции. И это пр том, что доля непарентерального пути передачи вируса в последние годы драматически увеличивается [Mikhailov et al, 2002; Arima et al, 2003]. Для создания кандидатной вакцины, способной стимулировать мукозальное звено иммунного ответа к ВГВ нами был получен аттенуированный штамм сальмонеллы, продуцирующий HBcAg. Показано, что сконструированный штамм индуцирует как мукозальный, так и системный иммунный ответ при перректальной иммунизации мышей.

Помимо задачи сокращения заболеваемости вирусным гепатитом В, существует серьезная проблема лечения пациентов с хронической формой этого заболевания. Контроль над инфекцией HBV в организме осуществляется как со стороны гуморального иммунного ответа, так и клеточного звена иммунитета. Как было показано в ряде работ [Lohr et al., 1993; Missale et al., 1993; Chisari, 2000], клеточный ответ иммунной системы на коровый антиген вируса имеет существенное значение на исход заболевания. Поэтому есть основания предполагать, что применение активной иммунизации HBcAg в терапевтических целях может уменьшить риск развития хронической инфекции, а также будет полезно и при лечении хронических больных. Усиление клеточного звена иммунного ответа можно достичь применением ДНК-вакцин. В данной работе была сконструирована ДНК-вакцина на основе корового белка НВУ, показано, что иммунизация мышей полученной конструкцией стимулирует иммунный ответ к HBcAg.

Таким образом, в данной работе был получен набор конструкций для создания кандидатных вакцин профилактического и терапевтического назначения против вируса гепатита В.

В условиях продолжающегося распространения эпидемии СПИДа во всем мире задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение и требует создания новых подходов к разработке эффективных анти-ВИЧ-вакцин. Один из перспективных подходов связан с созданием синтетических полиэпитопных вакцин [Hanke et al, 1998; Woodberry et al, 1999; Firat et al, 2001; Bazhan et al, 2004; Lorin et al, 2005]. Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» были сконструированы два полиэпитопных иммуногена TBI и TCI для стимуляции гуморального и клеточного иммунного ответа [Eroshkin et al., 1995; Bazhan et al., 2004]. В данной работе были разработаны оригинальные способы доставки этих искусственных антигенов и исследованы их иммуногенные свойства.

В качестве системы доставки белка TBI нами был разработан оригинальный способ доставки иммуногена в виде вирусоподобных частиц (ВПЧ), экспонирующих на своей поверхности белок GST-TBI. Использование ВПЧ для доставки белка TBI способствовало пролонгации иммунного ответа на целевой иммуноген, при этом было выявлено, что ВПЧ проявляют адъювантный эффект, сравнимый с эффектом, вызываемым полным адъювантом Фрейнда. Эти результаты позволяют рассматривать вирусоподобные частицы как весьма перспективную систему представления вирусных и бактериальных антигенов иммунной системе.

При парентеральном введении иммуногенов удается активировать в основном только системный иммунный ответ, в то время как местный иммунитет очень важен для предотвращения проникновения вируса через слизистые оболочки. Для создания кандидатной вакцины, способной активировать мукозальный иммунитет, были получены рекомбинантные штаммы сальмонеллы, продуцирующие белок GST-TBI. Мы показали, что перректальная иммунизация мышей рекомбинантными сальмонеллами приводила к формированию как системного, так и местного гуморального ответа.

Другой полиэпитопный иммуноген - TCI, был спроектирован как Т-клеточный иммуноген. На наш взгляд, применение белка TCI в формате ДНК-вакцины является одним наиболее предпочтительных способов применения этого иммуногена. Для доставки

ДНК-вакцины использовали вирусоподобные частицы. Мы показали, что оболочка из полиглюкина защищает ДНК от быстрой деградации. Иммунизация лабораторных животных конструкцией ВПЧ-pcDNA-TCI вызывала более эффективную стимуляцию иммунного ответа (как клеточного, так и гуморального звеньев) по сравнению с

191 использованием "голой" ДНК-вакцины. Следует отметить, что основным эффектом применения ВПЧ для доставки ДНК-вакцины, как и в случае использования ВПЧ для доставки рекомбинантного белка, является пролонгация иммунного ответа, что является одним из важных показателей эффективности вакцинной конструкции.

С целью повышения иммуногенности ДНК-вакцины pcDNA-TCI в качестве систем доставки использовали так же аттенуированный штамм сальмонеллы S. typhimurium SL7207. В эксперименте по сравнительной оценке иммуногенности наиболее высокий уровень ИО был зарегистрирован в группе животных, иммунизированных клетками сальмонеллы, несущих ДНК-вакцину.

В ходе работы были выбраны конструкции, при иммунизации которыми был зафиксирован наиболее высокий уровень иммунного ответа. На основе ВПЧ-ТВ1 и рекомбинантного штамма сальмонеллы, несущей ДНК-вакцину pcDNA-TCI, были созданы две экспериментальные вакцины против ВИЧ-1: КомбиВИЧвак и СапВИЧ Д.

КомбиВИЧвак, вакцина против ВИЧ-1\СПИД (инъекционная форма), содержащая полиэпитопный Т- и В-клеточный иммуноген ВИЧ-1 (рекомбинантный белок TBI-recA в коньюгате с полиглюкином и аргинином) и плазмиду pcDNA-TCI, кодирующую ген полиэпитопного Т-клеточного иммуногена TCI.

Кандидатная вакцина КомбиВИЧвак обладает рядом уникальных свойств. Она объединяет В- и Т-клеточные иммуногены в одной конструкции, один из них является белком, а другой - ДНК-вакциной. Вакцина индуцирует как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. Эпитопы, входящие в состав полиэпитопных иммуногенов, являются консервативными среди субтипов А, В и С и представлены разными белками ВИЧ-1. Вакцина КомбиВИЧвак может рассматриваться как профилактическая и как терапевтическая, поскольку индуцирует ответы CTL, способные уничтожать инфицированные клетки мишени.

Вторая вакцина - Сал-ВИЧ Д - , представляет собой ректальные суппозитории, содержащие вмешанную в суппозиторную основу лиофилизированную биомассу живых микробных клеток аттенуированного штамма Salmonella enteritidis Е23, трансформированных плазмидой pcDNA-TCI, несущей ген искусственного белка TCI.

Доклинические испытания показали, что вакцины КомбиВИЧвак и Сал-ВИЧ Д не вызывают длительно сохраняющихся изменений в организме животных и, таким образом, могут быть рекомендованы для проведения клинических испытаний.

Подготовлен комплект документов на препарат КомбиВИЧвак (Вакцина против ВИЧ-1\СПИД) и препарат Сал-ВИЧ Д, вакцина против ВИЧ-ПСПИД, суппозитории ректальные. Документы зарегистрированы в Министерстве здравоохранения и социального развития и переданы для экспертизы в ГИСК им. JI. А. Тарасевича. Комплект (см. Приложение 1, 2) включает следующие документы: Литературная справка; Отчет о лабораторном изучении препарата; Отчет о доклиническом изучении безопасности препарата; Инструкция по изготовлению и контролю препарата; Проект ФСП; Пояснительная записка к проекту ФСП; Проект Инструкции по применению; Проект маркировки; Протокол клинических исследований.

В заключение необходимо отметить, что сама биология ВИЧ-1 заставляет разработчиков отказаться от ряда привычных представлений о процессе создания вакцин. Поскольку традиционные подходы получения вакцин не работают в отношении СПИДа, приходится искать новые пути решения этой сложнейшей задачи. Разработанные кандидатные вакцины САЛ-ВИЧ-Д и КомбиВИЧвак основаны на современных знаниях о биологии ВИЧ-1, сконструированы с использованием новейших методов молекулярной биологии, а идеология создания вакцины находится в русле последних представлений в этой области.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Карпенко, Лариса Ивановна, Кольцово

1. Бойченко М. Н., Воробьев А. А. Использование сальмонелл в качестве вектора при создании рекомбинантных вакцин. // Вестн. РАМН. 1997. - N 3. - С. 43-46.

2. Бойченко М. Н., Елкина С. И. Изучение вирулентности и иммуногенных свойств у мутантов S.typhimurium по цАМФ. // Журнал микробиологии. 1980. - N12. - С. 4749.

3. Бойченко М.Н., Воробьев А.А., Тымчук С.Н. Перспектива получения мутантов суа и сгр сальмонелл для использования в качестве вакцинных штаммов. // Вестн. РАМН. 1995,- N 10. - С. 37-39.

4. Грен Е., Пумпен П. 1988. Рекомбинантные вирусные капсиды новое поколение иммуногенных белков и вакцин. И ЖВХО им. Менделеева 33:531-536.

5. Иванисенко В.А., Ерошкин A.M. 1997. Поиск сайтов, содержащих функционально важные замены в наборах родственных или мутантных белков. // Молекул, биол. 31:880-887.

6. Иванов В. Т., Вольпина О. М., Андронова Т. М. Пептидные антигены и адъюванты в синтетических вакцинах. IIЖВХО. 1988. 33(5): 523-530.

7. Игнатов П.Е. Иммунитет и инфекция. 2002. Время, Москва.

8. Калинина Т.Н., Макеева Н.В., Худяков Ю.Е., Самошин В.В., Смирнова Е.А., Семилетов Ю.А., Павлюченкова Р.И., Кадочников Ю.Н., Смирнов В.Д. Введениегетерологичных эпитопов в N-концевую часть core -белка вируса гепатита В. // Молекул, биол. 29:199-209.

9. Карпенко Л.И. Дис. канд. биол. наук. Новосибирск, 1993. 113 с.

10. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Игнатьев Г.М., Лебедев Л.Р., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Искусственные анти-ВИЧ иммуногены и методы их доставки. // Вест.Рос. акад. Наук- 2003. N1.- С. 24-30

11. Карпенко Л.И., Ильичев А.А. 1998. Химерные частицы корового антигена вируса гепатита В как система презентации эпитопов чужеродных белков. // Вести. РАМН. 6:6-9.

12. Карпенко Л.И., Рязанкин И.А., Чикаев Н.А. Серегин С.С., Ильичев А.А., Петренко В.А. 1997. N-конец корового белка вируса гепатита В спрятан внутри коровой частицы. I/ Молекул, биология. 31: 919-924.

13. Кочетов Г.А. 1980. Практическое руководство по энзимологии. Высшая школа,. Москва.

14. Лебедев Л.Р., Гилева И.П., Карпенко Л.И., Ерошкин A.M. 2000. Конструирование искусственных иммуногенов кандидатных вакцин против HIV-1. II Мол. ген. микробиол. еирусол. 3:36-40.

15. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Порываева В.А., Азаев М.Ш., Рябчикова Е.И., Гилева И.П., Ильичев А.А. Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1. //Молекул, биология,-2000.- Т. 34, N3,- С. 480-485

16. Макеева Н.В., Калинина Т.Н., Худяков Ю.Е., Самохин В.В., Смирнова Е.А., Семилетов И.А., Павлюченкова Р.П., Кадошников И.П., Смирнов В.Д. 1995. Гетерологичные эпитопы в центральной части соге-белка вируса гепатита В. // Молекул, биология. 29:211-224.

17. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1988. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Мир, Москва.

18. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984218

19. Материалы ВОЗ: Prevention of Hepatitis В in India. // World Health Organization Regional Office for South-East Asia New Delhi. August 2000. and Report Meeting On Hepatitis В Control Through Immunization. Tokyo, Japan, 26-28 June 2002.

20. Медуницын Н.В. Вакцинология. M., "Триада-Х", 2004.

21. Нетесова И.Г., Свенсон П.Д., Калашникова Т.В., Нетесов С.В., Фаворов М.О. 2004. Субтипы HBsAg вируса гепатита В в Восточной Сибири. // Вопр. вирус. 49:17-20.

22. Остерман Л.А. Методы исследований белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ульграцентрифугирование (практическое пособие). М., "Наука", 1981.

23. Петров Р. В., Кабанов В. А., Хаитов Р. М. Искусственные антигены и вакцины. // ЖВХО. 1988. 33(5): 502-522.

24. Попов Е. М., Ахмедов Н. А., Махмудова Т. А. Подход к изучению природных пептидов от структуры к функции. // Биоорг. химия. 1992. 18(12): 1454-1463.

25. Ройт А. В кн: Основы иммунологии. М. Мир. 1991. С. 203.

26. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. 2000. Мир, М.

27. Рыжова С.А., Бойченко М.Н. Исследование стабильности авирулентного фенотипа и способности к ограниченной персистенции в организме мышей авирулентного мутанта Salmonella enteritidis. II Бюл. эксперимент, биологии и медицины. 1997, (10): 429-431.

28. Соринсон С.Н. 1996. Вирусные гепатиты A,B,C,D,E, ни-А-Е в клинической практике. Теза, Санкт-Петербург.

29. Хаитов Р. М. Синтетические антигены в иммунодиагностике и иммунопрофилактике. // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Иммунология. 1988. 21: 3-170.

30. Хоробых В.В., Пронин А.В., Киркин А.Ф., Санин А.В. Методы постановки реакции бласттрансформации в микромодификации. I/Иммунология. 1983. -N3. - С.76-79.

31. Швалье А. Ф. Синтез и исследование иммуномодулируюъщих пептидов и их конъюгатов. Дис. канд. хим. наук. -1992. Кольцово.

32. Ярилин А.А. Основы иммунологии. 1999. Медицина, Москва.

33. Adams SE, Burns NR. Layton GT, Kingsman AJ. Hybrid Ту virus-like particles. // Int Rev Immunol. 1994; 11(2): 133-41.

34. Albert J, Franzen L, Jansson M, Scarlatti G, Kataaha PK, Katabira E, Mubiro F, Rydaker M, Rossi P, Pettersson U, et al. Ugandan HIV-1 V3 loop sequences closely related to the U.S./European consensus. // Virology. 1992. Oct; 190(2):674-81.

35. Amerongen H.M., Weltzin R., Farnet C.M., Michetti P., Haseltine W.A., Neutra M.R. Transepithelial transport of HIV-1 by intestinal M cells: a mechanism for transmission of AIDS. // JAcquir Immune Dejic Syndr. -1991- V. 4(8) P. 760-765.

36. Anderson J., Clark R.A., Watts D.H., Till M., Arrastia C., Schuman P. Idiopathic genital ulcers in women infected with human immunodeficiency virus. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. // Hum. Retrovirol. -1996. V. 13(4). - P.343-7.

37. Anderson R.M., May R.M. The population biology of the interaction between HIV-1 and HIV-2: coexistence or competitive exclusion? // AIDS. 1996. - V. 10 (14). - P. 1663-73.

38. Andre S., Seed В., Eberle J., Schraut W., Bultmann A., Haas L. 1998. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl 20 sequence with optimized codon usage. II J. Virol. 72:1497-1503.

39. Angelakopoulos H., Hohmann E.L. 2000. Pilot study of phoP/phoQ-deleted Salmonella enterica serovar typhimurium expressing Helicobacter pylori urease in adult volunteers. // Infect. Immun. 68:2135-2141.

40. Argos P, Fuller SD. A model for the hepatitis В virus core protein: prediction of antigenic sites and relationship to RNA virus capsid proteins. // EMBO J. 1988 Mar;7(3):819-24.

41. Arima S., Michitaka K., Horiike N., Kawai K., Matsubara H., Nakanishi S., Abe M., Hasebe A., Tokumoto Y., Yamamoto K., Onji M. 2003. Change of acute hepatitis В transmission routes in Japan. //./ Gastroenterol. 38:772-775.

42. Arnon R., Sela M. Antibodies to unique region in lysozyme provoked by a synthetic antigen conjugate. // Proc. Natl. Acad. Sci. Usa. 1969. 62: 163-171.

43. Arnon R., Shapira M., Jacob С. O. Synthetic vaccines. // J. Immunol. Meth. 1983. 61: 261-273.

44. Asakura Y., Mohri H„ Okuda K. Perinatal transmission of HIV-1. // JAMA. -1996- V. 23-30,276(16)-P. 1300- 1301.

45. Babiuk L.A., Tikoo S.K. 2000. Adenoviruses as vectors for delivering vaccines to mucosal surfaces. II J. Biotechnol 83:105-113.

46. Barker L.F., Maynard J.E., Purcell R.H., Hoofnagle J.H., Berquist K.R., London W.T. 1975. Viral hepatitis, type B, in experimental animals. II Am. J. Med. Sci. 270:189-195.

47. Barouch DH, Pau MG, Custers JH, et a/.,Immunogenicity of recombinant adenovirus serotype 35 vaccine in the presence of pre-existing anti-Ad5 immunity. // J hnmunol. 2004 May 15;172(10):6290-7

48. Benoist C., Mathis D. 2001. Autoimmunity provoked by infection: how good is the case for T cell epitope mimicry? // Nat. Immunol. 2:797-801.

49. Berman P.W., Groopman J.E., Gregory Т., Clapham P.R., Weiss R.A., Ferriani R.,

50. Riddle L., Shimasaki C., Lucas C., Lasky L.A., et al. Human immunodeficiency virus221type 1 challenge of chimpanzees immunized with recombinant envelope glycoprotein gpl20. // Proc Natl Acad Sci USA. -1988- V. 85(14)-P. 5200-5204.

51. Berzofsky J.A., Ahlers J.D., Belyakov I.M. Strategies for designing and optimizing new generation vaccines. I/ Nat Rev Immunol.- 2001.- V.1.-N3.- P. 209-19.

52. Bichko V., Schodel F., Nassal M., Gren E., Berzinsh 1., Borisova G., Miska S., Peterson D.L., Gren E., Pushko P. 1993. Epitopes recognized by antibodies to denatured core protein of hepatitis В virus. // Mol. Immunol. 30:221-231.

53. Bloomfield V. A. DNA condensation. // Curr. Opin. Struct. Biol. -1996,- V.6(3).-P.334-41.

54. Bocher W.O., Marcus H., Shakarchy R., Dekel В., Shouval D., Galun E„ Reisner Y. 1999. Antigen-specific В and T cells in human/mouse radiation chimera following immunization in vivo. /У Immunology 96:634-641.

55. Bogardt R.A. Jr., Jones B.N., Dwulet F.E., Garner W.H., Lehman L.D., Gurd F.R. 1980. Evolution of the amino acid substitution in the mammalian myoglobin gene. // J. Mol. Evol. 15:197-218.

56. Bohm W, Thoma S, Leithauser F, Moller P, Schirmbeck R, Reimann J. T cell-mediated, IFN-gamma-facilitated rejection of murine B16 melanomas. // J Immunol. 1998 Jul 15;161(2):897-908.

57. Bomsel M. Transcytosis of infectious human immunodeficiency virus across a tight human epithelial cell line barrier. // Nat Med. -1997- V. 3(1) V. 42-47.

58. Bonino F., Brunetto M.R. 1993. Hepatitis В virus heterogeneity, one of many factors influencing the severity of hepatitis B. // J. Hepatol. 18:5-8.

59. Borras-Cuesta F., Petit-Camurdan A., Fedon Y. Engineering of immunogenic peptides by co-linear synthesis of determinants recognized by В and T cells. // Eur J Immunol. -1987-V. 17(8)-P. 1213-1215.

60. Boulter N.R., Glass E.J., Knight P.A., Bell-Sakyi L., Brown C.G., Hall R. 1995. Theileria annulata sporozoite antigen fused to hepatitis В core antigen used in a vaccination trial. // Vaccine 13:1152-1160.

61. Brander C., Walker B.D. T lymphocyte responses in HIV-1 infection: implications for vaccine development. // Curr Opin Immunol. -1999- V. 11(4)- P. 451-459.

62. Brandtzaeg P., Farstad I.N., Johansen F.E., Morton H.C., Norderhaug I.N., Yamanaka T. The B-cell system of human mucosae and exocrine glands. // Immunol Rev. -1999- V. 171-P. 45-87.

63. Calarota S., Bratt G., Nordlund S., Hinkula J., Leandersson A.C., Sandstrom E., Wahren B. Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-1-infected patients. // Lancet, -1998-V. 2,351(9112) P. 1320-1325.

64. Calaroto S. A, Bratt G., Nordlung S. et al.,Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-infected patients. -// Lamet, 1998, 351, 1320-1325

65. Calaroto S.A., Leandersson A.C., Brutt G. Immune responses in asymptomatic HIV-1-infected patients after DNA-immunization followed by highly active antiretroviral treatment. // J. Immunol., 1999, 163,2330-2338

66. Cao Т., Lazdina U., Desombere I., Vanlandschoot P., Milich D.R., Sallberg M., Leroux-Roels G. 2001. Hepatitis В virus core antigen binds and activates naive human В cells in vivo: studies with a human PBL-NOD/SCID mouse model. H J. Virol. 75:6359-6366.

67. Cardin R.D., Brooks J.W., Sarawar S.R., Doherty P.C. 1996. Progressive loss of CD8+ T cell-mediated control of a gamma-herpesvirus in the absence of CD4+ T cells. // J. Exp. Med. 184:863-871.

68. Carman WF. S gene variation of HBV. // Acta Gastroenterol Belg. 2000 Apr-Jun;63(2): 182-4.

69. Carman W.F., Zanetti A.R., Karayiannis P., Waters J., Manzillo G., Tanzi E., Zuckerman A.J., Thomas H.C. 1990. Vaccine-induced escape mutant of hepatitis В virus. // Lancet. 1990 Aug 11; 336:325-329.

70. Cattozzo E.M., Stocker B.A., Radaelly A., De Giuli Morghen C., Tognon M. Expression and immunogenicity of V3 loop epitopes of HIV-1, isolates SC and WMJ2, inserted in Salmonella flagellin. // JBiotechnol. 1997. - Vol. 56. - P. 191 -203.

71. Chanh T.C., Kennedy R.C., Alderete B.E., Kanda P., Eichberg J.W., Dreesman G.R. Human immunodeficiency virus gpl20 glycoprotein detected by a monoclonal antibody to a synthetic peptide. II Eur J Immunol. 1986. - V.16.-N11.- P. 1465-8.

72. Chanock, R. M. Reminiscences of Albert Sabin and his successful strategy for the development of the live oral poliovirua vaccine. // Proc. Assoc. Am. Phys. 108,117-126 (1996).

73. Charnay P., Gervais M., Louise A., Galibert F., Tiollais P. 1980. Biosynthesis of hepatitis В virus surface antigen in Escherichia coli. // Nature 286:893-895.

74. Chisari F.V. 2000. Rous-Whipple Award Lecture. Viruses, immunity, and cancer: lessons from hepatitis В. П Am. J. Pathol. 156:1117-1132.

75. Cho S.P., Lee В., Min M.K. 2000. Recombinant polioviruses expressing hepatitis В virus-specific cytotoxic T-lymphocyte epitopes. // Vaccine 18:2878-2885.

76. Chou P.Y., Fasman G.D. 1978. Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence. П Adv. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol. 47:145-148.

77. Cicala C., Arthos J., Rubbert A., Selig S„ Wildt K., Cohen O.J., Fauci A.S. HIV-1 envelope induces activation of caspase-3 and cleavage of focal adhesion kinase in primary human CD4(+) T cells. II Proc Natl Acad Sci USA. -2000- V. 97 (3) P. 11781183.

78. Clarke B.E., Carrol A.R., Brown A.L., Jon J., Parry N.R., Rud E.W., Francis M.J., Rowlands D.J. Vaccines '91 / Eds Brown F., Chanock R.M., Ginsberg H.S., Lerner R.A. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1991. P. 313-318.

79. Cohen H., Levy R.J., Gao J., Fishbein I., Kousaev V., Sosnowski S., Slomkowski S., Golomb G. Sustained delivery and expression of DNA encapsulated in polymeric nanoparticles. // Gene Ther. 2000. - V.7(22).- P. 1896-905.

80. Cohen S., Powell C.J., Dubois D.R., Hartman A., Summers P.L., Eckels K.H. Expression of the envelope antigen of dengue virus in vaccine strains of Salmonella. // Res. Microbiol.-1990. V.141 (7-8). - P.855-8.

81. Collins K.L., Chen B.K., Kalams S.A., Walker B.D., Baltimore D. HIV-1 Nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes. // Nature. -1998- V. 22,391 (6665) P. 397-401.

82. Coursaget P., Buisson Y., Bourdil C., Yvonnet В., Molinie C., Diop M.T., Chiron J.P., Bao O., Diop-Mar I. 1990. Antibody response to preSl in hepatitis-B-virus-induced liver disease and after immunization. // Res. Virol 141:563-570.

83. Coursaget P., Lesage G., Le Cann P., Mayelo V., Bourdil C. 1991. Mapping of linear B-cell epitopes of hepatitis В surface antigen. II Res. Virol. 142:461-467.

84. Cova L., Fourel I., Yitvitski L., Lambert V., Chassot S., Hantz О., Trepo C. 1993. Animal models for the understanding and control of HBV and HDV infections. // J. Hepatol. 17 S 3:143-148.

85. Crowther RA, Kiselev NA, Buttcher B, Berriman JA, Borisova GP, Ose V, Pumpens P. Three-dimensional structure of of hepatitis В virus core particles determined by electron cryomicroscopy. II Cell, 1994. 77, 943-950.

86. Cui Z., Mumper R.J. Microparticles and nanoparticles as delivery systems for DNA vaccines. // CritRev Ther Drug Carrier Syst. -2003- V. 20(2-3)- P. 103-137.

87. Cui Z., Mumper R.J. Microparticles and nanoparticles as delivery systems for DNA vaccines. // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 2003.-20(2-3). - P. 103-37.

88. Curtiss R. 3rd, Goldschmidt R.M., Fletchall N.B., Kelly S.M. Avirulent Salmonella typhimurium delta cya delta crp oral vaccine strains expressing a streptococcal colonization and virulence antigen.// Vaccine.-1988.- V.6(2).- P. 155-60.

89. Curtiss R. 3rd, Kelly S.M. 1987. Salmonella typhimurium deletion mutants lacking adenylate cyclase and cyclic AMP receptor protein are avirulent and immunogenic. // Infect. Immun. 55:3035-3043.

90. Curtiss R. 3rd, Kelly S.M. Salmonella typhimurium deletion mutants lacking adenylate cyclase and cyclic AMP receptor protein are avirulent and immunogenic. // Infect. 1ттип.-Ш1. V.55(12).- P.3035-43.

91. Dalla Pozza Т., Yan H., Meek D., Guzman C.A., Walker M.J. Construction and characterisation of Salmonella typhimurium aroA simultaneously expressing the five pertussis toxin subunits. // Vaccine. 1998. - V.l 6 (5). - P.522-9.

92. Daniel M.D., Kirchhoff F., Czajak S.C., Sehgal P.K., Desrosiers R.C. Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene. // Science. -1992- V. 18,258(5090)-P. 1938-1941.

93. Darji A., Guzman C.A., Gerstel В., Wachholz P., Timmis K.N., Wehland J., Chakraborty Т., Weiss S. 1997. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. II Cell 91:765-775.

94. Davis H.L., Mancini M., Michel M.L., Whalen R.G. 1996. DNA-mediated immunization to hepatitis В surface antigen: longevity of primary response and effect of boost. // Vaccine 14:910-915.

95. Davis H.L., McCluskie M.J., Gerin J.L., Purcell R.H. 1996. DNA vaccine for hepatitis B: evidence for immunogenicity in chimpanzees and comparison with other vaccines. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7213-7218.

96. De Rose R, Chea S, Dale CJ, et al., Subtype AE HIV-1 DNA and recombinant Fowlpoxvirus vaccines encoding five shared HIV-1 genes: safety and T cell immunogenicity in macaques// Vaccine. 2005 Mar 14;23( 16): 1949-56

97. Deck R.R., DeWitt C.M., Donnelly J.J., Liu M.A., Ulmer J.B. Characterization of humoral immune responses induced by an influenza hemagglutinin DNA vaccine. // Vaccine.-1997- V. 15(1) P. 71-78.

98. Delmastro P, Meola A, Monaci P, Cortese R, Galfre G. Immunogenicity of filamentous phage displaying peptide mimotopes after oral administration.

99. Vaccine. 1997 Aug; 15(11):1276-85.

100. Desrosiers R.C. Prospects for an AIDS vaccine. // Nat Med. -2004- V. 10(3) P. 221223.

101. Dhiman N., Dutta M., Khuller G.K. Poly (DL-lactide-co-glycolide) based delivery systems for vaccines and drugs. // Indian J Exp Biol. -2000-V. 38(8) P. 746-752.

102. Dietrich G., Gentschev 1., Hess J., Ulmer J.B., Kaufmann S.H., Goebel W. 1999. Delivery of DNA vaccines by attenuated intracellular bacteria. // Immunol. Today 20:251-253.

103. Dietrich G., Gentschev I., Hess J., Ulmer J.В., Kaufmann S.H., Goebel W. Delivery of DNA vaccines by attenuated intracellular bacteria. // Immunol. Today. 1999. - V.20 (6).-P.251-3.

104. DiPetrillo M.D., Tibbetts Т., Kleanthous H„ Killeen K.P., Hohmann E.L. 1999. Safety and immunogenicity of phoP/phoQ-deleted Salmonella typhi expressing Helicobacter pylori urease in adult volunteers. // Vaccine 18:449-459

105. Doel T. R., Gale C., DoAmaral С. M., Mulcahy G., Dimarchi R. Heterotypic protection induced by synthetic peptides corresponding to three serotypes of FMDV. // J. Virology. 1990. 64(5): 2260-2264.

106. Dong M, Zhang PF, Grieder F, et al., Induction of primary virus-cross-reactive human immunodeficiency virus type 1-neutralizing antibodies in small animals by using an alphavirus-derived in vivo expression system // J Virol. 2003 Mar;77(5):3119-30

107. Donnelly J.J., Liu M.A., Ulmer J.B. Antigen presentation and DNA vaccines. // Am J Respir Crit Care Med. -2000- Y. 162, N 2. P. 190-193.

108. Donnelly J.J., Martinez D., Jansen K.U., Ellis R.W., Montgomery D.L., Liu M.A. Protection against papillomavirus with a polynucleotide vaccine. // J Infect Dis. -1996- V. 173(2)-P. 314-320.

109. Donnelly J.J., Ulmer J.В., Shiver J.W., Liu M.A. DNA vaccines. // Annu. Rev. Immunol.-1997,- V.l 5.- P.617-48.

110. Donnelly J.J., Wahren В., Liu M.A. DNA vaccines: progress and challenges. // J. Immunol.-2005,-V.l75(2).- P.633-9.

111. Donnelly JJ, Wahren B, Liu MA. DNA vaccines: progress and challenges. И J Immunol. 2005 Jul 15;175(2):633-9.

112. Douek D.C., Betts M.R., Hill B.J., Little S.J., Lempicki R., Metcalf J.A., Casazza J., Yoder C., Adelsberger J.W., Stevens R.A., Baseler M.W., Keiser P., Richman D.D.,

113. Davey R.T., Koup R.A. Evidence for increased T cell turnover and decreased thymic output in HIV infection Л J Immunol -2001- V. 1 (11) 6663-6668.

114. Dougan G., Maskell D., Pickard D., Hormaeche C. 1987. Isolation of stable aroA mutants of Salmonella typhi Ty2: properties and preliminary characterisation in mice. // Mol Gen. Genet. 207:402-405.

115. Dreesman G.R., Sparrow J.T., Frenchick P.J., Kennedy R.C. 1985. Synthetic hepatitis В surface antigen peptide vaccine. // Adv. Exp. Med. Biol. 185:129-137.

116. Du A., Wang S. Efficacy of a DNA vaccine delivered in attenuated Salmonella typhimurium against Eimeria tenella infection in chickens. // Int. J. Parasitol. 2005,-V.35.-N7.- P. 777-85.

117. Du D. W„ Jia Z.S., Li G.Y., Zhou Y.Y. 2003. HBV DNA vaccine with adjuvant cytokines induced specific immune responses against HBV infection. // World J. Gastroenterol. 9:108-111.

118. Dunn D.T., Newell M.L., Ades A.E., Peckham C.S. Risk of human immunodeficiency virus type 1 transmission through breastfeeding. //Lancet. -1992- V. 5,340(8819) P. 585-588.

119. Dunstan S.J., Simmons C.P., Strugnell R.A. 1998. Comparison of the abilities of different attenuated Salmonella typhimurium strains to elicit humoral immune responses against a heterologous antigen. IIInfect. Immun. 66:732-740.

120. Dunstan S.J., Simmons C.P., Strugnell R.A. Comparison of the abilities of different attenuated Salmonella typhimurium strains to elicit humoral immune responses against a heterologous antigen. И Infect. Immun.-1998. V.66(2).- P.732-40.

121. Eldridge JH, Staas JK, Chen D, Marx PA, Tice TR, Gilley RM. New advances in vaccine delivery systems. // Semin Hematol. 1993 0ct;30(4 Suppl 4): 16-24; discussion 25.

122. Emini E.A., Ellis R.W., Miller W.J., McAleer W.J., Scolnick E.M., Gerety R.J. 1986. Production and immunological analysis of recombinant hepatitis В vaccine. // J. Infect. 13 Suppl A:3-9.

123. Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva 1.Р., Lomakin A.S., Lebedev L.R., Kamyinina T.P., Pereboev A.V., Ignat'ev G.M. Design of four-helix bundle protein as a candidate for HIV vaccine. // Protein Eng. 1995. - V. 8(2). - P. 167-173.

124. Eroshkin A.M., Zhilkin P.A., Shamin Y.Y., Korolev S., Fedorov B.B. Artificial protein vaccines with predetermined tertiary structure: application to anti-HIV-1 vaccine design. // Protein Eng. -1993- V. 6(8) P. 997-1001.

125. Fairweather N.F., Chatfield S.N., Charles I.G., Roberts M., Lipscombe M., Li L.J., Strugnell D., Comerford S., Tite J., Dougan G. Use of live attenuated bacteria to stimulate immunity. //Res. Microbiol.-\990. V.141 (7-8). - P.769-73.

126. Fehr Т., Skrastina D., Pumpens P., Zinkernagel R.M. 1998. T cell-independent type 1 antibody response against В cell epitopes expressed repetitively on recombinant virus particles. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9477-9481.

127. Ferguson M., Evans D. M. A., Magrath D. I., Minor P. D„ Almond J. W., Schild G. С. A construction of a new poliovirus vaccines. // Virology. 1985. 143: 505-510.

128. Flo J., Tisminetzky S., Baralle F. 2001. Oral transgene vaccination mediated by attenuated Salmonellae is an effective method to prevent Herpes simplex virus-2 induced disease in mice. // Vaccine 19:1772-1782.

129. Forthal D.N., Landucci G., ICeenan B. Relationship between antibody-dependent cellular cytotoxicity, plasma HIV type 1 RNA, and CD4+ lymphocyte count. // AIDS Res Hum Retroviruses. 2001. - V. 10 (6). - P. 553-561.

130. Fouts T.R., Lewis G.K., Hone D.M. Construction and characterization of a Salmonella typhi-based human immunodeficiency virus type 1 vector vaccine.// Vaccine. 1995,-V. 13 (6).- P. 561-9.

131. Fowler M.G. Update: transmission of HIV-1 from mother to child. // Curr Opin Obstet Gynecol. -1997- V. 9(6)- P. 343-348.

132. Francis M.J., Hastings G.Z., Brown A.L., Grace K.G., Rowlands D.J., Brown F., Clarke B.E. 1990. Immunological properties of hepatitis В core antigen fusion proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2545-2549.

133. Frankel A.D., Bredt D.S., Pabo C.O. Tat protein from human immunodeficiency virus forms a metal-linked dimer. // Science. 1988. - V.240 (4848). - P. 70-73.

134. Furuta Y., Eriksson K., Svennerholm В., Fredman P., Horal P., Jeansson S., Vahlne A.,

135. Galan J.E., Curtiss R. 3rd 1989. Virulence and vaccine potential of phoP mutants of Salmonella typhimurium.// Microb. Pathog. 6:433-443.

136. Geissler M„ Tokushige K., Chante C.C., Zurawski V.R., Wands J.R. 1997. Cellular and humoral immune response to hepatitis В virus structural proteins inmice after DNA-based immunization. // Gastroenterology 112:1307-1320.

137. Gentschev 1., Dietrich G., Spreng S., Kolb-Maurer A., Brinkmann V., Grode L., Hess J., Kaufmann S.H., Goebel W. 2001. Recombinant attenuated bacteria for the delivery of subunit vaccines. // Vaccine 19:2621-2628.

138. Gilman R.H., Hornick R.B., Woodard W.E., DuPont H.L., Snyder M.J., Levine M.M., Libonati J.P. Evaluation of a UDP-glucose-4-epitneraseless mutant of Salmonella typhi as a liver oral vaccine. II J. Infect. Dis. 1977. - V. 136(6).- P.717-23.

139. Girard M. P., Osmanov S. K., Kieny M. P. A review of vaccine research and development: The human immunodeficiency virus (HIV). // Vaccine, 2006 May 8;24(19):4062-81.

140. Gonzalo R.M., Rodriguez D., Garcia-Sastre A., Rodriguez J.R., Palese P., Esteban M. Enhanced CD8+ T cell response to HIV-1 env by combined immunization with influenza and vaccinia virus recombinants. // Vaccine. 1999,- V. 17(7-8).- P.887-92.

141. Goulder P.J., Rowland-Jones S.L., McMichael A.J., Walker B.D. Anti-HIV cellular immunity: recent advances towards vaccine design. // AIDS. -1999- V. 13 P. 121-136.

142. Grillot-Courvalin C., Goussard S., Huetz F., Ojcius D.M., Courvalin P. Functional gene transfer from intracellular bacteria to mammalian cells. // Nat. Biotechnol. 1998.-V.16(9).- P.862-6.

143. Gulig P.A., Curtiss R. 3rd. Plasmid-associated virulence of Salmonella typhimurium.// Infect. Immun. 1987,- V.55(12).-P.2891-901.

144. Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. DNA vaccines: immunology, application, and optimization. // Annu Rev Immunol. -2000- V. 18 P. 927-974.

145. Hackett J. Use of Salmonella for heterologous gene expression and vaccine delivery systems. // Curr Opin Biotechnol. 1993. - V.4(5).- P.611-5.

146. Hanke T, Schneider J, Gilbert SC, Hill AV, McMichael A. DNA multi-CTL epitope vaccines for HIV and Plasmodium falciparum: immunogenicity in mice. // Vaccine. -1998. V.16 (4).- P. 426-35.

147. Hanke Т., Blanchard T.J., Schneider J., Ogg G.S., Tan R., Becker M„ Gilbert S.C., Hill

148. Hardy K., Stahl S., Kupper H. 1981. Production in B. subtilis of hepatitis В core antigen and a major antigen of foot and mouth disease virus. Nature 293:481-483.

149. Hasan U.A., Abai A.M., Harper D.R., Wren B.W., Morrow W.J. Nucleic acid immunization: concepts and techniques associated with third generation vaccines. // J Immunol Methods. -1999- V. 29,229(1-2)- P. 1-22.

150. Hayat M.A. 1981. Principles and techniques of electron microscopy. London: Edvard. Arnold.

151. He C., Nomura F., Itoga S., Isobe K., Nakai F. 2001. Prevalence of vaccine-induced escape mutants of hepatitis В virus in the adult population in China: a prospective study in 176 restaurant employees. // J. Gastroenterol. Hepatol 16:1373-1377.

152. Heermann K.H., Goldmann U., Schwartz W., Seyffarth Т., Baumgarten H„ Gerlich W.H. 1984. Large surface proteins of hepatitis В virus containing the pre-s sequence. J. Virol 52:396-402.

153. Ho D.D. HIV-1 dynamics in vivo. // J Biol Regul Homeost Agents. -1995- V. 9(3) P. 76-77.

154. Hoiseth S.K., Stacker B.A. 1981. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. // Nature 291:238-239.

155. Hoiseth S.K., Stacker B.A. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. I/Nature. 1981. - V. 291(5812).- P.238-9.

156. Hopkins S., Kraehenbuhl J.P., Schodel F., Potts A., Peterson D., de Grandi P., Nardelli-Haefliger D. 1995. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine induces local immunity by four different routes of immunization. // Infect. Immun. 63:3279-3286.

157. Jack A.D., Hall A.J., Maine N., Mendy M., Whittle H.C. 1999. What level of hepatitis В antibody is protective?//./. Infect. Dis. 179:489-492.

158. Jacob С. O., Pines M., Arnon R. Vaccines: progress and resent trends. // EMBO J. 1984. 3: 2889-2892.

159. Jang J.-H. and Shea L.D. Intramuscular delivery of DNA releasing microspheres: microsphere properties and transgene expression. // J. Control. Release. 2006. -V.l 12(1).- P.120-8.

160. Jegerlehner A., Storni Т., Lipowsky G., Schmid M., Pumpens P., Bachmann M.F. 2002. Regulation of IgG antibody responses by epitope density and CD21-mediated costimulation. // Eur. J. Immunol. 32:3305-3314.

161. Jilg W., Schmidt M., Deinhardt F. 1988. Persistence of specific antibodies after hepatitis В vaccination. // J. Hepatol. 6:201-207.

162. Kapusta J., Modelska A., Figlerowicz M., Pniewski Т., Letellier M., Lisowa O., Yusibov V., Koprowski H., Plucienniczak A., Legocki A.B. 1999. A plant-derived edible vaccine against hepatitis В virus. I/FASEBJ. 13:1796-1799.

163. Karelin V.P., Babaeva E.E., Gubenko E.F., Kaulen D.K., Zhdanov V.M. 1980. A vaccine prepared from the 22 nm particles of surface hepatitis В antigen(HBsAg). // J. Med. Virol. 5:331-341.

164. Katare Y.K., Muthukumaran Т., Panda A.K. Influence of particle size, antigen load, dose and additional adjuvant on the immune response from antigen loaded PLA microparticles. // Int. J. Pharm. 2005. - V. 301(1-2).- P.149-60.

165. Kaufmann S.H. and Hess J. Immune response against Mycobacterium tuberculosis: implications for vaccine development. // J. Biotechnol. 2000. - V. 83(1-2).- P. 13-7.

166. Kniskern P.J., Hagopian A., Montgomery D.L., Burke P., Dunn N.R., Hofmann K.J., Miller W.J., Ellis R.W. 1986. Unusually high-level expression of a foreign gene (hepatitis В virus coreantigen) in Saccharomyces cerevisiae. // Gene 46:135-141.

167. Koletzki D., Zankl A., Gelderblom H.R., Meisel H., Dislers A., Borisova G., Pumpens P., Kruger D.H., Ulrich R. 1997. Mosaic hepatitis В virus core particles allow insertion of extended foreign protein segments. // J. Gen. Virol. 78:2049-2053.

168. Kong Q„ Richter L., Yang Y.F., Arntzen C.J., Mason H.S., Thanavala Y. 2001. Oral immunization with hepatitis В surface antigen expressed in transgenic plants. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11539-11544.

169. Konig S., Beterams G., Nassal M. 1998. Mapping of homologous interaction sites in the hepatitis В virus core protein. // J. Virol. 72:4997-5005.

170. Konishi E., Terazawa A., Imoto J. 2003. Simultaneous immunization with DNA and protein vaccines against Japaneseencephalitis or dengue synergistically increases their own abilities to induce neutralizing antibody in mice. // Vaccine 21:1826-1832.

171. Kozlowski PA, Neutra MR. The role of mucosal immunity in prevention of HIV transmission. // CurrMolMed. 2003. - V. 3(3).-P.217-28.

172. Kratz P.A., Bottcher В., Nassal M. 1999. Native display of complete foreign protein domains on the surface of hepatitis В virus capsids. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96:1915-1920.

173. Krone В., Lenz A., Heermann K.H., Seifer M., Lu X.Y., Gerlich W.H. 1990. Interaction between hepatitis В surface proteins and monomeric human serum albumin. // Hepatology 11:1050-1056.

174. Krugman S., Giles J.P., Hammond J. 1971. Viral hepatitis, type В (MS-2 strain). Studies on active immunization. II JAMA. 2171:41-45.

175. Kunke D., Broucek J., Kutinova L., Nemeckova S., Ludvikova V., Strnad I., Kramosil J., Nemcova J., Schramlova J., Simonova V. 1993. Vaccinia virus recombinants co-expressing hepatitis В virus surface and core antigens. // Virology 195:132-139.

176. Kuroki K., Floreani M., Mimms L.T., Ganem D. 1990. Epitope mapping of the PreSl domain of the hepatitis В virus large surface protein. // Virology 176:620-624.

177. Kushibiki Т., Tomoshige R., Fukunaka Y., Kakemi M., Tabata Y. In vivo release and gene expression of plasmid DNA by hydrogels of gelatin with different cationization extents. //J. Control Release. 2003,- V.90(2).- P.207-16.

178. Laemmly W.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the heard of bacteriophage T4. // Nature 227:680-685.

179. Lehner Т., Bergmeier L.A., Wang Y., Tao L., Sing M., Spallek R., van der Zee R. Heat shock proteins generate beta-chemokines which function as innate adjuvants enhancing adaptive immunity. /У Eur J Immunol. -2000- V. 30(2)- P. 594-603.

180. Lerner R. A. Taping the immunological repertoire to produce antibodies of predetermined specificity. Nature. 1982. 299: 593-596.

181. Letvin N.L. Progress in the development of an HIV-1 vaccine. // Science. 1998. - V. 19;280(5371). - P. 1875-1880.

182. Letvin N.L. What immunity can protect against HIV infection. // J Clin Invest. -1998- V. 1,102(9)-P. 1643-1644.

183. Levine M.M., Kaper J.B., Black R.E., Clements M.L. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development. // Microbiol Rev.- 1983,-Dec;47(4).- P.510-50.

184. Lieberman H.M., Tung W. W., Shafritz D.A. 1987. Splenic replication of hepatitis В virus in the chimpanzee chronic carrier. // J. Med. Virol. 21:347-359.

185. Livingston B.D., Newman M., Crimi C., McKinney D., Chesnut R., Sette A. 2001. Optimization of epitope processing enhances immunogenicity of multiepitope DNA vaccines. // Vaccine 19: 4652-4660.

186. Lohman B.L., Miller C.J., McChesney M.B. Antiviral cytotoxic T lymphocytes in vaginal mucosa of simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques. // J Immunol. -1995- V. 155(12) P. 5855-5860.

187. Luciw, P. A. in Fields Virology (eds Fields, B. N„ Knipe, D. M. & Howley, P.M.) 18811952 (Lippincott-Raven, Philadelphia, 1996).

188. Lunsford L., McKeever U., Eckstein V., Hedley M.L. Tissue distribution and persistence in mice of plasmid DNA encapsulated in a PLGA-based microsphere delivery vehicle. // J Drug Target. -2000- V. 8(1) P. 39-50.

189. Lutsiak C.M., Sosnowski D.L., Wishart D.S., Kwon G.S., Samuel J. Use of a liposome antigen delivery system to alter immune responses in vivo. // J Pharm Sci. -1998- V. 87(11)-V. 1428-1432.

190. MacGregor R.K., Boyer J.D., Ugen K.E. et al,First human trial of a DNA-based vaccine for treatment of human immunodeficiency virus type 1 infection: safety and host response. -// J. Inf. Dis., 1998, 178, 92-100

191. Malik A.H., Lee W. 2000. Chronic hepatitis В infection: treatment strategies for the next millenium. //Ann. Intern. Med. 132:723-731.

192. Mazanec M.B., Kaetzel C.S., Lamm M.E., Fletcher D., Nedrud J.G. Intracellular neutralization of virus by immunoglobulin A antibodies. H Proc Natl Acad Sci U S A. -1992- V. 89(15) P. 6901 -6905.

193. McMichael A.J., Hanke T. Is an HIV vaccine possible? // Nat Med. 1999. - V. 5(6). -P. 612-616.

194. McMichael A.J., Phillips R.E. Escape of human immunodeficiency virus from immune control. //Annu Rev Immunol. -1997- V. 15 P. 271-296.

195. Medina E., Guzman C.A. Modulation of immune responses following antigen administration by mucosal route. // FEMS Immunol. Med. Microbiol.- 2000. V. 27(4).-P.305-11.

196. Melnick, J.L. in Fields Virology (eds Fields, B. N., Knipe, D. M. & Howley, P. M.) 655712 (Lippincott-Raven, Philadelphia, 1996).

197. Meyer H., Sutter G., Mayr A. Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence. // J Gen Virol. -1991- V. 72, N 5 P. 1031-1038.

198. Mi Z., Feng F., Zhang X., Lian Z., Wang H., Tong Y. 1999. The clinical and epidemiological significance of serum PreSl/anti-PreSl in HBV infection. // Chin. Med. J. (Engl.) 112:321-324.

199. Mikhailov M.I., Gomberg M.A., Dolzhanskaya N.A., Koubanova A.A. 2002. Significance of sexual route of transmission of hepatitis В and С in Russia. II Int. J. STD AIDS. S. 2:9-11.

200. Milich D.R. 1987. Genetic and molecular basis for T- and B-cell recognition of hepatitis В viral antigens. /У Immunol. Rev. 99:71-103.

201. Milich D.R., Peterson D.L., Schodel F„ Jones J.E., Hughes J.L. 1995. Preferential recognition of hepatitis В nucleocapsid antigens by Thl or Th2 cells is epitope and major histocompatibility complex dependent. II J. Virol. 69:2776-2785.

202. Milich D.R., Schodel F., Hughes J.L., Jones J.E., Peterson D.L. 1997. The hepatitis В virus core and e antigens elicit different Th cell subsets: antigen structure can affect Th cell phenotype. II J. Virol 71:2192-2201.

203. Minenkova O.O., Ilyichev A.A., Kiscenko G.P., Petrenko V.A. Design of specific immunogens using filamentous phage as the carrier. // Gene. 1993. 128: 85-88.

204. Montgomery D.L., Ulmer J.В., Donnelly J.J., Liu M.A. DNA vaccines. // Pharmacol Ther. -1997- V. 74(2)- P. 195-205.

205. Moore J.P., Ho D.D. Antibodies to discontinuous or conformationally sensitive epitopes on the gpl20 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 are highly prevalent in sera of infected humans. //J Virol. 1993. -V. 67(2). - P. 863-875.

206. Moore J.P., Parren P.W., Burton D.R. Genetic subtypes, humoral immunity, and human immunodeficiency virus type 1 vaccine development. // J Virol. -2001. Y. 75(13). - P. 5721-5730.

207. Мог G., Singla M., Steinberg A.D., Hoffman S.L., Okuda K„ Klinman D.M. Do DNA vaccines induce autoimmune disease? // Hum Gene Ther. -1997- V. 10;8(3)-P. 293-300.

208. Moss В., Smith G.L., Gerin J.L., Purcell R.H. 1984. Live recombinant vaccinia virus protects chimpanzees against hepatitis В. /У Nature 311:67-69.

209. Moss D.J., Schmidt C., Elliott S., Suhrbier A., Burrows S., Khanna R. Strategies involved in developing an effective vaccine for EBV-associated diseases. // Adv Cancer Res. -1996-V. 69-P. 213-245.

210. Muller S. Immunization with peptides. In: Synthetic polypeptides as antigens. / Ed. Burdon R. H., Van Knippenberg P. H. // Elsevier Science Publishers В. V. North-Holland. Amsterdam. 1990. 19: 131-144.

211. Muller S. Peptide-carrier conjugation. In: Synthetic peptides as antigens. Ed. Burdon R. H., Van Knippenberg P. H. // Elsevier Science Publishers В. V., North-Holland. Amsterdam. 1990. 19: 95-127.

212. Murakami S. 2001. Hepatitis В virus X protein: a multifunctional viral regulator. // J. Gastroenterol. 36:651-660.

213. Murray K., Shiau A.L. 1999. The core antigen of hepatitis В virus as a carrier for immunogenic peptides. // Biol. Chem. 380:277-283.

214. Muster T, Steindl F, Purtscher M, Trkola A, Klima A, Himmler G, Ruker F, Katinger H. A conserved neutralizing epitope on gp41 of human immunodeficiency virus type 1. /// Virol. 1993 Nov;67(l l):6642-7.

215. Nassal M. Total chemical synthesis of a gene for hepatitis В virus core protein and its functional characterization. // Gene. 1988 Jun 30;66(2):279-94.

216. Nassal M., Rieger A., Steinau O. Topological analysis of the hepatitis В virus core particle by cysteine-cysteine cross-linking.// J. Mol. Biol. -1992 -V.225 -P. 1013-1025

217. Nathanson N., Mathieson B.J. Biologic^/ considerations in the development of a human immunodeficiency virus vaccine. // J Infect Dis. -2000-V. 182(2) P. 579-589. Epub 2000 Jul 28.

218. Nelson R. New HIV vaccine shows promising results in preclinical studies. ULancet. -2003,-V. 10;361(9369).- P. 1627.

219. Neurath A.R., Seto В., Strick N. 1989. Antibodies to synthetic peptides from the preSl region of the hepatitis В virus (HBV) envelope (env) protein are virus-neutralizing and protective. // Vaccine 7: 234-236.

220. Neutra M.R., Frey A., Kraehenbuhl J.P. Epithelial M cells: gateways for mucosal infection and immunization. I/Cell. -1996- V. 86(3) P. 345-348.

221. Newton S.M., Jacob C.O., Stocker B.A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. // Science. -1989- V. 7, 244(4900) P. 70-72.

222. Ni Y.H., Chang M.H., Huang L.M., Chen H.L., Hsu H.Y., Chiu T.Y., Tsai K.S., Chen D.S. 2001. Hepatitis В virus infection in children and adolescents in a hyperendemic area: 15 years after mass hepatitis В vaccination. // Ann. Intern. Med. 1359:796-800.

223. Novembre, F. 1. et al Development of AIDS in a chimpanzee infected with humanimmunodeficiency virus type I. II J. Virol 71, 4086-4091 (1997).243

224. O'Hagan D.T., Ugozzoli M., Barackrnan J., Singh M., Kazzaz J., Higgins K., Vancott T.C., Ott G. Microparticles in MF59, a potent adjuvant combination for a recombinant protein vaccine against HIV-1. // Vaccine. -2000- V. 18(17) P. 1793-1801.

225. Pantaleo G., Fauci A.S. Tracking HIV during disease progression. // Curr Opin Immunol. -1994- V. 6(4)- P. 600-604.

226. Panyam J. and Labhasetwar V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. //Adv. Drug Deliv. Rev. 2003.- V. 55(3).- P.329-47.

227. Paran N., Geiger В., Shaul Y. 2001. HBV infection of cell culture: evidence for multivalent and cooperative attachment. // EMBOJ. .20:4443-4453.

228. Pascual D.W., Powell R.J., Lewis G.K., Hone D.M. Oral bacterial vaccine vectors for the delivery of subunit and nucleic acid vaccines to the organized lymphoid tissue of the intestine. // Behring. Inst. Mitt.-1997. V.98. - P. 143-52.

229. Pasek M., Goto Т., Gilbert W„ Zink В., Schaller H., MacKay P., Leadbetter G., Murray K. 1979. Hepatitis В virus genes and their expression in E. coli. // Nature 282:575-579.

230. Pasetti M.F., Levine M.M., Sztein M.B. 2003. Animal models paving the way for clinical trials of attenuated Salmonella enterica serovar Typhi live oral vaccines and live vectors. // Vaccine 21:401-418.

231. Patterson L.J., Malkevitch N., Venzon D., Pinczewski J., Gomez-Roman V.R., Wang L.,

232. Petit M.A, Strick N, Dubanchet S, Capel F, Neurath A.R. 1991. Inhibitory activity of monoclonal antibody F35.25 on the interaction between hepatocytes (HepG2 cells) and preSl-specific ligands. UMol. Immunol. 28:517-521.

233. Pol S, Couillin I., Michel M.L, Driss F, Nalpas B, Carnot F, Berthelot P, Brechot C. 1998. Immunotherapy of chronic hepatitis В by anti HBV vaccine Acta. U Gastroenterol. Belg. 61:228-233.

234. Pontisso P, Poon M.C, Tiollais P, Brechot C. 1984. Detection of hepatitis В virus DNA in mononuclear blood cells. // Br. Med. J. (Clin. Res. Ed.) 288:1563-1566.

235. Pontisso P., Ruvoletto M.G, Gerlich W.H, Heermann K.H, Bardini R, Alberti A. 1989. Identification of an attachment site for human liver plasma membranes on hepatitis В virus particles. // Virology 173:522-530.

236. Ponzetto A, Forzani B. 1991. Animal models of hepatocellular carcinoma: hepadnavirus-induced liver cancer in woodchucks. II Ital. J. Gastroenterol 23:491-493.

237. Poovorawan Y, Sanpavat S, Pongpunglert W, Chumdermpadetsuk S, Sentrakul P„ Vandepapeliere P, Safary A. 1992. Long term efficacy of hepatitis В vaccine in infants born to hepatitis В eantigen-positive mothers. // Pediatr. Infect. Dis. J. 11:816-821.

238. Prince A.M., Whalen R, Brotman B. 1997. Successful nucleic acid based immunization of newborn chimpanzees against hepatitis В virus. // Vaccine; 15: 916-919.

239. Pumpens P, Borisova G.P, Crowther R.A, Grens E. 1995. Hepatitis В virus core particles as epitope carriers. // lntervirology 38:63-74.

240. Pumpens P., Grens E. HBV Core Particles as a Carrier for В Cell/T Cell Epitopes. // Intervirology 2001;44:98-114

241. Randrianarison-Jewtoukoff V, Perricaudet M. 1995. Recombinant adenoviruses as vaccines. // Biologicals. 23:145-157.

242. Rappuoli R., Guidice G. Del. From Concept to Clinic. In: Vaccine. CRC Press LLC, Boca Raton, Boston, London, New York, Washington DC. 1999., 5-17.

243. Raupach В., Kaufmann S.H. 2001. Bacterial virulence, proinflammatory cytokines and host immunity: how to choose the appropriate Salmonella vaccine strain? // Microbes Infect. 3:1261-1269.

244. Reisner Y., Dagan S. 1998. The Trimera mouse: generating human monoclonal antibodies and an animal model for human diseases. // Trends Biotechnol. 16:242-246.

245. Rizzuto C., Sodroski J. Fine definition of a conserved CCR5-binding region on the human immunodeficiency virus type 1 glycoprotein 120. II AIDS Res Hum Retroviruses. -2000.-V. 16(8).-P. 741-750.

246. Roberts M., Chatfield S., Pickard D., Li J., Bacon A. 2000. Comparison of abilities of Salmonella enterica serovar typhimurium aroA aroD and aroA htrA mutants to act as live vectors. IIInfect. Immun. 68:6041-6043.

247. Roberts M., Chatfield S.N., Dougan G. Salmonella as carries of heterologous antigens. P.27-58 In D.T. О Hagan (ed.), Novel delivery system for oral vaccines. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla

248. Robertson B.H., Margolis H.S. 2002. Primate hepatitis В viruses genetic diversity, geography and evolution. // Rev. Med. Virol 12:133-141.

249. Robinson H.L. DNA vaccines for immunodeficiency viruses. // AIDS. -1997- V. 11 SupplA- P. 109-119.

250. Rollman E., Hinkula J., Arteaga J., Zuber В., Kjerrstrom A., Liu M., Wahren В., Ljungberg K. Multi-subtype gpl60 DNA immunization induces broadly neutralizing anti-HIV antibodies. // Gene Ther. -2004- V. 11 (14) P. 1146-1154.

251. Roossinck M.J., Jameel S., Loukin S.H., Siddiqui A. 1986. Expression of hepatitis В viral core region in mammalian cells. // Mol. Cell. Biol 6:1393-1400.

252. Rowland-Jones S., Tan R. Control of HIV co-receptor expression: implications for pathogenesis and treatment. // Trends Microbiol. 1997. -V. 5(8). - P. 300-302.

253. Rowland-Jones S.L., McMichael A. Immune responses in HIV-exposed seronegatives: have they repelled the virus? // Curr Opin Immunol. -1995- V. 7(4) P. 448-455.

254. Rowland-Jones, S.L. et al. Cytotoxic T-cell response to multiple conserved epitopes in HIV-resistant prostitutes in Nairobi.///. Clin. Invest 102, 1758-1765 (1998).

255. Ruprecht R.M. Live attenuated AIDS viruses as vaccines: promise or peril? // Immunol. Rev.-\999. N170. - P. 135-49.

256. Ryu C.J., Gripon P., Park H.R., Park S.S., Kim Y.K., Guguen-Guillouzo C., Yoo O.J., Hong H.J. 1997. In vitro neutralization of hepatitis В virus by monoclonal antibodies against the viral surface antigen. // J. Med. Virol 52:226-233.

257. Saag, M.S. et al. Extensive variation of human immunodeficiency virus type-1 in vivo. // Nature 334, 440-444(1988).

258. Salfeld J., Pfaff E., Noah M., Schaller H. 1989. Antigenic determinants and functional domains in core antigen and e antigen from hepatitis В virus. II J. Virol. 63:798-808.

259. Sandstrom E., Wahren B. Therapeutic immunisation with recombinant gpl60 in HIV-I infection: a randomised double-blind placebo-controlled trial. Nordic VAC-04 Study Group. I/Lancet. -1999-V. 353(9166)-P. 1735-1742.

260. Saporito-Irwin SM, Geist RT, Gutmann DH. Ammonium acetate protocol for the preparation of plasmid DNA suitable for mammalian cell transfections. // Bioteclmiques. -1997,-V. 23(3).-P. 424-7.

261. Schodel F., Curtiss R. 3rd. 1995. Salmonellae as oral vaccine carriers. // Dev. Biol. Stand. 84:245-253.

262. Schodel F„ Kelly S.M., Peterson D.L., Milich D.R., Curtiss R. 3rd. 1994. Hybrid hepatitis В virus core-pre-S proteins synthesized in avirulent Salmonella typhimurium and Salmonella typhi for oral vaccination. // Infect. Immun. 62:1669-1676.

263. Schodel F., Milich D.R., Will H. 1990. Hepatitis В virus nucleocapsid/pre-S2 fusion proteins expressed in attenuated Salmonella for oral vaccination. II J. Immunol. 145:4317-4321.

264. Schodel F., Peterson D., Hughes J., Wirtz R., Milich D. 1996. Hybrid hepatitis В vims core antigen as a vaccine carrier moiety: 1.presentation of foreign epitopes. // J. Biotechnol. 44:91-96.

265. Schodel F., Thomas W., Will H„ Milich D. 1990. Recombinant HBV core particles earring immunodominant B-cell epitopes of HBV preS2-region. Vaccines '90. New York Cold Spring Harbor Laboratory Press.: 193-198.

266. Schodel F., Will H., Milich D. 1991. Hubrid hepatitis В virus core/pre-S particles expressed in live attenuated Salmonellae for oral immunization. Vaccines '91. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.:319-325.

267. Schoen C., Stritzker J., Goebel W., Pilgrim S. Bacteria as DNA vaccine carriers for genetic immunization, l/lnt. J. Med. Microbiol.- 2004,- V. 294,- N5.- P. 319-35.

268. Schwan W.R., Huang X.Z., Hu L., Kopecko D.J. 2000. Differential bacterial survival, replication, and apoptosis-inducing ability of Salmonella serovars within human and murine macrophages. II Infect. Immun. 68:1005-1013.

269. Schwartz O., Marechal V., Le Gall S., Lemonnier F., Heard J.M. Endocytosis of major histocompatibility complex class 1 molecules is induced by the HIV-1 Nef protein. // Nat Med. -1996- V. 2(3) P. 338-342.

270. Sela M. Antigenicity: some molecular aspects. Science. 1969. 166(3911): 1365-1374.

271. Shapira M., Jibson., Muller G., Arnon R. Immunity and protection against influenza virus by synthetic peptide corresponding to antigenic sites of hemagglutinin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. 81: 2461-2467.

272. Shata M.T., Reitz M.S. Jr., DeVico A.L., Lewis G.K., Hone D.M. Mucosal and systemic HIV-1 Env-specific CD8(+) T-cells develop after intragastric vaccination with a Salmonella Env DNA vaccine vector. П Vaccine. 2001. - V.20(3-4).- P.623-9.

273. Shiau A.L., Murray K. 1997. Mutated epitopes of hepatitis В surface antigen fused to the core antigen of the virus induce antibodies that react with the native surface antigen. // J. Med. Virol. 51:159-166.

274. Shirai M., Pendleton C.D., Ahlers J., Takeshita Т., Newman M., Berzofsky J.A. 1994. Helper-cytotoxic T lymphocyte (CTL) determinant linkage required for priming of anti-HIV CD8+ CTL in vivo with peptide vaccine constructs. // J. Immunol. 152:549-556.

275. Sidney J., Grey H. M., Kubo R.T. Practical, biochemical and evolutionary implications of the discovery of HLA class I supermotifs. // Immunol. Today. 1996. - V. 17. - P. 261266

276. Singh M., Cattaneo R., Billeter M.A. 1999. A recombinant measles virus expressing hepatitis В virus surface antigen induces humoral immune responses in genetically modified mice. // J. Virol. 73:4823-4828.

277. Singh M., Kazzaz J., Ugozzoli M., Malyala P., Chesko J., O'Hagan D.T. Polylactide-co-glycolide microparticles with surface adsorbed antigens as vaccine delivery systems. // Curr. Drug. Deliv. 2006. - V.3(l).- P.l 15-20.

278. Sominskaya I., Bichko V., Pushko P., Dreimane A., Snikere D., Pumpens P. 1992. Tetrapeptide QDPR is a minimal immunodominant epitope within the preS2 domain of hepatitis В virus. /I Immunol. Lett. 33:169-172.

279. Spearman P. Current progress in the development of HIV vaccines. // Curr Pharm Des. -2006.-V. 12. N9.- P. 1147-67.

280. Staats HF, Jackson RJ, Marinaro M, Takahashi I, Kiyono H, McGhee JR. Mucosal immunity to infection with implications for vaccine development. // Curr Opin Immunol.- 1994. V.6(4).-P. 572-83.

281. Stahl S.J., Murray K. 1989. Immunogenicity of peptide fusions to hepatitis В virus core antigen. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6283-6287.

282. Stocker B.A. 2000. Aromatic-dependent salmonella as anti-bacterial vaccines and as presenters of heterologous antigens or of DNA encoding them. // J. Biotechnol. 83:45-50.

283. Stocker B.A. Aromatic-dependent salmonella as anti-bacterial vaccines and as presenters of heterologous antigens or of DNA encoding them. II J. Biotechnol. 2000. - V. 83(1-2).- P.45-50.

284. Stocker BA. Auxotrophic Salmonella typhi as live vaccine. // Vaccine 1988. - V. 6(2).-P.141-5.

285. Sturesson C., Degling Wikingsson L. Comparison of poly(acryl starch) and poly(lactide-co-glycolide) microspheres as drug delivery system for a rotavirus vaccine. // J Control Release. -2000- V.3, 68(3) P. 441-450.

286. Suga M., Arima K., Yachi A. 1991. Detection of IgM, IgA, and IgG antibodies to preS2 antigen in hepatitis В virus infection. // Digestion 50:153-161.

287. Szmuness W., Stevens C.E., Harley E.J., Zang E.A., Alter H.J., Taylor P.E., DeVera A., Chen G.T., Kellner A. 1982. Hepatitis В vaccine in medical staff of hemodialysis units: efficacy and subtype cross-protection. UN. Engl. J. Med. 307:1481-1486.

288. Szmuness W„ Stevens C.E., Zang E.A., Harley E.J., Kellner A.A 1981. Controlled clinical trial of the efficacy of the hepatitis В vaccine (Heptavax B): a final report. // Hepatology 1:377-385.

289. Tacket C.O., Losonsky G., Lubeck M.D., Davis A.R., Mizutani S., Horwith G., Hung P., Edelman R., Levine M.M. 1992. Initial safety and immunogenicity studies of an oral recombinant adenohepatitis В vaccine. // Vaccine 10:673-676.

290. Tacket C.O, Roy M.J, Widera G, Swain W.F, Broome S, Edelman R. 1999. Phase 1 safety and immune response studies of a DNA vaccine encoding hepatitis В surface antigen delivered by a gene delivery device. // Vaccine 17:2826-2829.

291. Taneja V, David C.S. 1998. HLA transgenic mice as humanized mouse models of disease and immunity. // J. Clin. Invest. 101:921-926.

292. Tavegp T. The AIDS Vaccine Evaluation Group Cellular and humoral immune responses to a canarypox vaccine containing human immunodeficiency virus type 1 Env, Gag, and Pro in combination with RGP120. // J Infect Dis. 2001-V.183 - P.563-570

293. Three dimensional structure of hepatitis В virus core particles determined by electron cryomicroscopy. //Cell 1994;77:943-950.

294. Tisch R„ Wang В., Weaver D.J., Liu В., Bui Т., Arthos J., Serreze D.V. 2001. Antigen-specific mediated suppression of beta cell autoimmunity by plasmid DNA vaccination. // J. Immunol. 166:2122-2132.

295. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding current status and outlook. //J. Immunol Meth. - 1984. - V. 72,- p. 313-340.

296. Townsend A., Bodmer H. Antigen recognition by class I-restricted T lymphocytes. // Annu Rev Immunol. -1989- V. 7- P. 601-624.

297. Treadwell T.L., Keeffe E.B., Lake J., Read A., Friedman L.S., Goldman I.S., Howell C.D., DeMedina M., Schiff E.R., Jensen D.M., 1993. Immunogenicity of two recombinant hepatitis В vaccines in older individuals. H Am. J. Med. 95:584-588.

298. Truong-Le V.L., August J.T., Leong K.W. Controlled gene delivery by DNA-gelatin nanospheres. II Hum. Gene Ther. 1998,- V. 9(12).- P. 1709-17.

299. Ugandan HIV-1 V3 loop sequences closely related to the U.S./European consensus. // Virology. 1992 0ct;190(2):674-81.

300. Valenzuela P., Medina A., Rutter W.J., Ammerer G., Hall B.D. 1982. Synthesis and assembly of hepatitis В virus surface antigen particles in yeast. // Nature 298:347-350.

301. Van Heyningen WE, Van Heyningen S, King CA. The nature and action of cholera toxin. // Ciba Found Symp.-l 976. V.42.-P. 73-88.

302. Van Regenmortel M. H.V., Briand J. P., Plaue S. Synthetic polypeptides as antigen. /Ed. Burdon R. H., Van Knippenberg P. H. Elsevier Science Publishers В. V., North-Holland. Amsterdam. 1990. 19: 217.

303. Velin D., Hopkins S., Kraehenbuhl J.P. 1998. Delivery systems and adjuvants for vaccination against HIV. I/ Pathobiology. V.66, N3-4. - P. 170-175.

304. Vieira J., Messing J. 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. // Gene 19:259-268.

305. Walker C.M., Moody D.J., Stites D.P., Levy J.A. CD8+ lymphocytes can control HIV infection in vitro by suppressing virus replication. // Science. -1986- V. 234(4783)- P. 1563-6.

306. Walker G.T., Fraiser M.S., Schram J.L., Little M.C, Nadeau J.G., Malinowski D.P. Strand displacement amplification—an isothermal, in vitro DNA amplification technique. /'/ Nucleic Acids Res. 1992,- V.l 1;20.- P. 1691-6.

307. Walter E., Merkle H.P. Microparticle-mediated transfection of non-phagocytic cells in vitro. //J Drug Target. -2002- V. 10(1) P. 11 -21.

308. Wange R.L., Samelson L.E. Complex complexes: signaling at the TCR. // Immunity. -1996- V. 5(3)-P. 197-205.

309. Watanabe K., Kobayashi H., Kajiyama K., Morita M., Yasuda A., Gotoh H., Saeki S., Sugimoto M., Saito H., Kojima A. 1989. Improved recombinant LC16m0 or LC16m8 vaccinia virus successfully expressing hepatitis В surface antigen. // Vaccine 7:53-59.

310. Weber J. The pathogenesis of HIV-1 infection. H Br Med Bull. 2001. - V.58. - P. 6172.

311. Wedemeyer H., Gagneten S., Davis A., Bartenschlager R., Feinstone S., Rehemiann B. 2001. Oral immunization with HCV-N S3-transformed Salmonella: induction of HCV-specific CTL in a transgenic mouse model. // Gastroenterology 121:1158-1166.

312. Weintraub H., Cheng P.F., Conrad K. Expression of transfected DNA depends on DNA topology. // Cell.-1986. V. 46(1). - P. 115-22.

313. Weiss A., Littman D.R. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors.// Cell.1994-V. 76(2) P. 263-74.

314. Whatmore A.M., Cook N., Hall G.A., Sharpe S., Rud E.W., Cranage M.P. Repair and evolution of nef in vivo modulates simian immunodeficiency virus virulence. // J Virol.1995-V. 69(8)-P. 5117-5123.

315. Wild J., Gruner В., Metzger K., Kuhrober A., Pudollek H.P., Hauser H., Schirmbeck R., Reimann J. 1998. Polyvalent vaccination against hepatitis В surface and core antigen using a dicistronic expression plasmid. // Vaccine 16:353-360.

316. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P., Chong W., Acsadi G., Jani A, Feigner P.L. 1990. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. // Science 247:1465-1468.

317. Woo P.C., Wong L.P., Zheng B.J., Yuen K.Y. 2001. Unique immunogenicity of hepatitis В virus DNA vaccine presented by live-attenuated Salmonella typhimurium. // Vaccine 19:2945-2954.

318. Wood R.C., MacDonald K.L., White K.E., Hedberg C.W., Hanson M., Osterholm M.T.1993. Risk factors for lack of detectable antibody following hepatitis В vaccination of

319. Minnesota health care workers. II JAMA 270:2935-2939.253

320. Wyatt R., Sodroski J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. И Science.V. 280(5371). P. 1884-8.

321. Xiang Z.Q., Spitalnik S.L., Cheng J., Erikson J., Wojczyk В., Ertl H.C. 1995. Immune responses to nucleic acid vaccines to rabies virus. // Virology. 209:569-579.

322. Xiao-wen H., Shu-han S., Zhen-lin H., Jun L., Lei J., Feng-juan Z., Ya-nan Z., Ying-jun G. 2005. Augmented humoral and cellular immune responses of a hepatitis В DNA vaccine encoding HBsAg by protein boosting. // Vaccine 23:1649-1656.

323. Yoshimura M., Sakurai I., Shimoda Т., Abe К., Okano Т., Shikata Т. 1981. Detection of H<})BsAg in the pancreas. // Acta. Pathol. Jpn. 31:711 -717.

324. Young K.R., McBurney S.P., Karkhanis L.U., Ross T.M. Virus-like particles: Designing an effective AIDS vaccine. //Methods.- 2006- V. 40.-N1P. 98-117

325. Zakis V., Strastina D., Borisova G., Kuranova I. 1992. Immunodominance of T-cell epitopes on foreign sequences of the hepatitis В virus nucleocapsid fusion proteins. Vaccines '92. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.:341 -347.

326. Zho F., Neutra M.R. 2002. Antigen delivery to mucosa-associated lymphoid tissues using liposomes as a carrier. // Biosci. Rep. 22:355-369.

327. Zhou S.L., Standring D.N. 1991. Production of hepatitis В virus nucleocapsidlike core particles in Xenopus oocytes: assembly occurs mainly in the cytoplasm and does not require the nucleus. // J. Virol. 65:5457-5464.

328. Zuckerman A.J. Viral hepatitis and liver disease. New York, Alan R Liss Inc., 1988, 1071-1073.

329. Zur Megede J., Chen M.C., Doe В., Schaefer M., Greer C.E, Selby M., Otten G.R., Barnett S.W. 2000. Increased expression and immunogenicity of sequence-modified human immunodeficiency virus type 1 gag gene. II J. Virol 74:2628-2635.

Информация о работе

Карпенко, Лариса Ивановна
доктора биологических наук
Кольцово, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1 ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Карпенко, Лариса Ивановна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1"

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Карпенко, Лариса Ивановна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Карпенко, Лариса Ивановна, Кольцово

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология