Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев

Даниленко, Алексей Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев"

005056018

На правах рукописи

Даниленко Алексей Валерьевич

Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 НОЯ 2012

Кольцово - 2012

005056018

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Карпенко Лариса Ивановна, доктор биологических наук, доцент, ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующая лабораторией рекомбинантных вакцин

Масычева Валентина Ивановна - доктор биологических наук, профессор, ИМБТ ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», директор

Поздняков Сергей Геннадьевич - кандидат биологических наук, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, лаборатория медицинской химии, н.с.

ФГБУ «Государственный научный центр Институт иммунологии», г. Москва

Защита состоится «21» декабря 2012г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу:

р.п. Кольцово Новосибирского района Новосибирской области, 630559, тел. 8(383)336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан «16» ноября 2012 года

Научный руководитель

Официальные оппоненты:

Ведущая организация

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

"7 Трошкова Г. П.

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Разработка безопасной и эффективной вакцины против ВИЧ-1 является приоритетной задачей мирового здравоохранения. Прошло более 25 лет с момента идентификации вируса иммунодефицита человека. За это время в мире было инфицировано ВИЧ-1 почти 70 миллионов человек и около 30 миллионов инфицированных уже умерли. Очевидно, что создание вакцины против ВИЧ-1 позволило бы сдержать развитие пандемии СПИДа. Работы по созданию вакцины против ВИЧ-инфекции активно ведутся и в России, и за рубежом.

Среди новых направлений в создании профилактических и терапевтических вакцин против различных патогенов весьма перспективными считаются ДНК-вакцины. Принцип ДНК-вакцинации активно используется для разработки вакцин против ВИЧ-1. К настоящему времени уже получен ряд кандидатных ДНК-вакцин против ВИЧ-1 и показана способность таких вакцин индуцировать вирус-специфический иммунный ответ как на лабораторных животных, так и в процессе клинических испытаний.

В то же время эксперименты по ДНК-вакцинации обозначили определенные проблемы. Одна из них связана с низкой иммуногенностью ДНК-вакцин, в результате чего при внутримышечных инъекциях для достижения достаточно высокого иммунного ответа приходится вводить значительные количества плазмидной ДНК. Это обстоятельство предполагает поиск альтернативных путей доставки ДНК-вакцин, способных обеспечить высокий специфический иммунный ответ при малой дозе вводимой ДНК.

Рядом авторов показано, что одним из перспективных способов доставки ДНК-вакцин могут служить аттенуированные штаммы сальмонелл. Множество работ в этом направлении объясняется хорошей изученностью аттенуированных штаммов, полученных при создании живых мукозальных вакцин перорального применения против сальмонеллеза и брюшного тифа.

Актуальность создания мукозальной вакцины против СПИДа обусловлена тем, что значительная часть новых случаев инфицирования ВИЧ-1 происходит при половом контакте, поэтому вакцина против вируса должна обеспечивать защиту одновременно как в слизистых в области проникновения вируса, так и при передаче

вируса через кровь. Преимущество непарентерального способа ДНК-вакцинации с использованием аттенуированных сальмонелл по сравнению с инъекционным заключается в том, что при непарентеральном введении ДНК-вакцины в составе бактериального вектора, помимо системного гуморального и клеточного ответа, активируется и специфический мукозальный иммунитет, создающий барьер для проникновения вируса в организм. При использовании данного подхода не требуется проведения дорогостоящей стадии очистки ДНК-вакцины или антигена Кроме того, инъекционный способ введения технически более сложен, что особенно важно при планировании массовых иммунизации, охватывающих группы риска.

Если сравнивать пероральный и перректальный способы введения вакцины, то перректальный способ предпочтителен по двум причинам. Первая заключается в том, что слизистая кишечника является местом проникновения ВИЧ-1, а также начальным и преимущественным местом репликации вируса. Следовательно, перректальное введение ДНК-вакцины обеспечивает развитие иммунной реакции непосредственно в «воротах» инфекции. Кроме того, перректальная вакцинация не требует антацидов, нейтрализующих кислый pH желудка, либо других способов защиты действующего начала, как это необходимо в случае перорального введения.

В данной работе в качестве вектора доставки ДНК-вакцины был использован штамм Salmonella enteritidis Е23, созданный в Московской медицинской академии им.И.М. Сеченова (Бойченко и др., 1994). Штамм был аттенуирован путем введения делеций в генах аденилатциклазы и цАМФ-рецепторного белка. В результате таких модификаций патогенность S. enteritidis Е23 была снижена по сравнению с родительским штаммом более, чем в 105 раз.

Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» была получена рекомбинантная плазмида pcDNA-TCI (анти-ВИЧ-1 ДНК-вакцина). Плазмида содержит искусственный ген, кодирующий полиэпитопный белок TCI, состоящий из 80 ЦТЛ эпитопов, входящих в состав белков вируса ВИЧ-1 субтипов А, В и С. С помощью трансформации плазмидой pcDNA-TCI клеток штамма S. enteritidis Е23 был получен рекомбинантный штамм enteritidis E23/pcDNA-TCI. На основе этого штамма разработана кандидатная анти-ВИЧ-1 вакцина СалВИЧ «Д» в виде ректальных суппозиториев.

В то же время ряд вопросов, касающихся биологических свойств S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, остался неизученным, в связи с чем потребовались дальнейшие углубленные исследования в этом направлении. К ним относятся вопросы, связанные с наличием у рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI вирулентных, токсических и токсигенных свойств, исследование иммуногенности и персистенции штамма в организме лабораторных животных при его введении в виде ректальных суппозиториев.

Цель данной работы заключалась в характеризации рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследовании его иммуногенных свойств при перректальном введении в составе суппозиториев.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить влияние плазмиды pcDNA-TCI на биохимические и антигенные свойства штамма S. enteritidis Е23.

2. Изучить сохранность плазмиды pcDNA-TCI в клетках аттенуированного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.

3. Изучить вирулентность, токсичность и токсигенность штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI для теплокровных животных.

4. Изучить длительность персистенции аттенуированного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных после введения суппозиториев, содержащих рекомбинантный штамм.

5. Исследовать возможность экспрессии гена TCI в клетках пейеровых бляшек при введении суппозиториев, содержащих рекомбинантный штамм S. enteritidis Е23/ pcDNA-TCI.

6. Изучить интенсивность ВИЧ-специфического клеточного, гуморального и мукозального иммунного ответа у лабораторных животных после введения суппозиториев, содержащих S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.

Научная новизна и практическая ценность

1. Впервые установлено, что штаммы S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI являются невирулентными, малотоксичными и нетоксигенными для теплокровных животных.

2. В ходе исследования персистенции рекомбинантного штамма S. enteritidis £23/pcDNA-TCI показано, что данный штамм, также как и штамм S. enteritidis Е23, обладает ограниченной способностью к персистенции в организме млекопитающих. Установлено, что бактерии обоих исследованных штаммов не обнаруживаются в селезенке иммунизированных животных через 63 дня после однократного и через 70 дней после двукратного введения суппозиториев.

3. Впервые показано, что перректальное введение лабораторным мышам суппозиториев, содержащих лиофилизированные клетки штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, обеспечивает доставку плазмиды pcDNA-TCI и экспрессию гена TCI в клетках пейеровых бляшек.

4. Впервые показано, что после иммунизации лабораторных мышей штаммом

5. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев происходит формирование как системного Т-клеточного иммунного ответа, так и гуморального иммунного ответа, что выражалось в появлении специфических IgG и IgA в сыворотке крови против белков ВИЧ-лизата и рекомбинантного белка TCI. Схема иммунизация, основанная на двукратном введении S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, была более эффективной, чем на однократном введении.

Результаты настоящих исследований могут представлять интерес с точки зрения практического применения. Был получен ряд дополнительных характеристик, которые позволяют утверждать, что аттенуированный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI пригоден для дальнейшей разработки кандидатной вакцины против ВИЧ-1 СалВИЧ «Д». На основании полученных данных можно рекомендовать штамм S. enteritidis Е23 в качестве вектора доставки других ДНК-вакцин против вирусных, бактериальных инфекций, онкологических заболеваний. Возможно также рекомендовать использование штамма S. enteritidis Е23 для доставки биологически активных белков (например, цитокинов) в случаях, когда необходимо активировать местный иммунитет слизистой.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Введение плазмиды pcDNA-TCI в клетки аттенуированного штамма S. enteritidis Е23 не влияет на биохимические и антигенные свойства штамма.

2. Штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI невирулентен, малотоксичен и нетоксигенен для теплокровных животных.

3. Суппозитории, содержащие рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, при перректальном введении лабораторным мышам обеспечивают доставку плазмиды pcDNA-TCI и экспрессию гена TCI в клетках пейеровых бляшек.

4. Иммунизация мышей штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев вызывает формирование системного Т-клеточного иммунного ответа и появление специфических IgG и IgA антител в сыворотке крови против антигена TCI.

5. Повторное введение лабораторным мышам суппозиториев, содержащих S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, приводит к усилению иммунного ответа на антиген TCI.

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации опубликованы 3 статьи, две из которых - в журналах, рекомендованных ВАК для защиты диссертаций. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: на Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний», Санкт-Петербург, 2008 г; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств проф илактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008 г; Keystone Symposia Global Health Series. HIV Vaccines: Progress and Prospects, Banff, Alberta, Canada, 2008 г; 3-ей конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, 2009 год; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири», Красноярск, 2010 г.

Объем и crpyicrypa диссертации

Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста, включая 14 рисунков и 5 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (216 наименований).

Лнчный вклад автора

Все основные эксперименты, включая исследование биохимических, антигенных и иммуногенных свойств штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, оценку стабильности ДНК-вакцины in vitro и vivo, исследование длительности персистенции в организме животных, иммунизированных S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев, а также анализ полученных результатов выполнены автором лично. Постановка ELISpot была проведена совместно с с.н.с. ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Каплиной О.Н. Исследования патогенности штаммов S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI проводились совместно с сотрудниками Научно-исследовательского центра токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (НИЦ ТБП) ФМБА РФ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI

Ранее в ФБУН ГНЦ ВБ Вектор была создана ДНК-вакцина pcDNA-TCI (рис. 1), которая кодирует полиэпитопный белок TCI, объединяющий в своей структуре более 80-ти ЦТЛ-эпитопов из белков ВИЧ-1 субтипов А, В и С (Bazhan et al., 2004).

Рис. 1. Структура ДНК-вакцины рсОЫА-ТС1 (ВагИап ею1., 2004).

ТС1 - ген, кодирующий белок ТО;

СМУрг - эукариотический промотор цитомегаловируса;

ВвН ро1уА - сигнал полиаденилирования;

Ыа- ген устойчивости к ампициллину;

Указано положение сайтов узнавания для эндонукпеаз рестрикции.

Вакцинный векторный аттенуированный штамм 5. еШегШсИз Е23 был получен профессором Бойченко М.Н. (Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова) из штамма дикого типа 5. егиегШ/Ия 1791. Данный штамм несет делеционные мутации в генах суа и сгр. Ранее на мышах, телятах и обезьянах показано, что патогенность штамма 5. еМегШсИз Е23 снижена в 100 тыс. раз по сравнению с родительским диким штаммом, причем, при многократных пассажах

Ыа

CMVpr

BGH polyA

Pst I (3544)

Smo I (3304)

15". еЫегШсИх Е23 через организм животных его вирулентность не изменяется (Рыжова и Бойченко, 1997).

Плазмида рсГЖЛ-ТС1 была введена в состав 5'. еп1егШсИ$ Е23 с помощью электропорации, в результате чего был получен рекомбинантный штамм & еЫегШсИй Е23/рсЭЫА-ТС1 (Карпенко и др., 2005). Полученный штамм задепонирован в музее ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (регистрационный номер В-883).

Чтобы убедиться в том, что введение плазмиды pcDNA-TCI в состав клеток аттенуированного штамма сальмонеллы £ еМегШсИБ Е23 не повлияло на степень аттенуации, а также другие микробиологические и биохимические его свойства, нами было проведено всестороннее исследование свойств рекомбинантного штамма £ еШегШсИя Е23/ рсОЫА-ТС1.

Прежде всего, было изучено влияние плазмиды рсЭЫА-ТСЛ на биохимический фенотип рекомбинантного штамма, так как он составляет основу дифференциации мутантных штаммов от штаммов дикого фенотипа.

Для определения спектра биохимической активности бактериальные штаммы 5. еМегШсИй Е23 и 5. еп1егШсИ$ Е23/рсОКА-ТС1 исследовали с помощью систем мультимикротестов для биологической идентификации энтеробактерий: ММТ-Е1 и ММТ-Е2 (производства Центра клинической фармакологии и фармакотерапии, г. Ставрополь) согласно инструкции по применению производителя. Бактериальные клетки вносили в 96-луночный планшет с горизонтальными и вертикальными рядами лунок, в которых находились субстратно-индикаторные среды. Системы позволяют определить 12 ключевых показателей ферментативной активности энтеробактерий: образование сероводорода, индола, наличие активности лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, фенилаланиндезаминазы, способность к утилизации цитрата натрия, малоната натрия, маннита, сахарозы, лактозы, сорбита. В результате было показано, что плазмида не влияет на биохимические свойства рекомбинантного штамма. Как еМегШсИз Е23, так и Я. еШегШсИз Е23/рсОКА-ТС1 отличались от штамма дикого типа отсутствием способности утилизировать цитрат.

При производстве вакцины на основе еМегШсИя Е23/рсОЫА-ТС1 необходимо отработать короткую и надежную схему идентификации вышеуказанного штамма, позволяющую отличить его от дикого штамма сальмонеллы, а также других

энтеробактерий (прежде всего, от штаммов E.coli как наиболее вероятных контаминантов). В результате анализа литературных данных и проведенных экспериментов было предложено использовать для идентификации штамма следующие компоненты: среда эндо, минимальный цитратный агар, агар Клиглера, агар Симонса, а также определение антигенной структуры с использованием специфических агглютинирующих сывороток (О: 1, 4, 5, 9, 12, ABCDE и Н: i, g, m, 1, 2).

Согласно разработанной схеме была проведена сравнительная характеристика следующих энтеробактерий: E.coli BL, E.coli DH5aF', дикий штамм S. typhymurium 415 и аттенуированные штаммы S. typhymurium SL7207, S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI. Было показано, что сероводород продуцируют только штаммы сальмонелл, причем как рекомбинантный штамм S.enteritidis Е23/ pcDNA-TCI, так и аттенуированные штаммы (S. typhymurium SL 7207, 5. enteritidis Е23) начинали продуцировать сероводород после 18 часов инкубации, что вызывало почернение агара Клиглера. Это свойство является одним из дифференциальных признаков диких и аттенуированных штаммов сальмонелл. Рост штаммов Е. coli на среде Клиглера происходил без ее окрашивания, так как жизненный цикл Е. coli проходит без выделения сероводорода.

Было показано, что как аттенуированные, так и рекомбинантный штаммы сальмонелл были неспособны к росту и изменению цвета на агаре Симонса в течение 48 часов инкубации. В отличие от аттенуированных штаммов, дикий штамм S. typhimurium 415 хорошо рос на агаре Симонса и вызывал почернение агара Клиглера. Штаммы S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI различались по скорости роста в питательной среде YTx2. Если оптическая плотность суспензии штамма 5. enteritidis Е23 повышалась до значений, равных 1 o.e., за 2,5 часа культивирования, то в случае S. enteritidis E23/pcDNA-TCI этот показатель составлял 4 часа. Кроме того, исследуемые штаммы отличались чувствительностью к антибиотику. Рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI обладал способностью к росту на среде с ампициллином, что объясняется наличием в составе плазмиды pcDNA-TCI гена Ыа, кодирующего b-лактамазу и обеспечивающего тем самым устойчивость рекомбинантного штамма к антибиотику

в концентрации 100 мкг/мл. В отличие от рекомбинантного, исходный штамм S. enteritidis Е23 не рос на среде с ампициллином.

В отдельной серии экспериментов было проведено определение антигенной структуры штамма S. enteritidis Е23 и рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI. Исследуемые штаммы высевали на среду эндо для получения отдельных колоний. Полученные колонии исследовали в реакции агглютинации на стекле с использованием адсорбированной поливалентной О-сыворотки к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е согласно антигенно-диагностической схеме Кауфмана-Уайта. Каждый индивидуальный штамм испытывали также с О-сывороткой каждой группы отдельно. Было показано, что исследуемые штаммы относятся к D группе. После этого определяли полную структуру О-антигенов с помощью агглютинирующих моновалентных сывороток, содержащих антитела к Oi_ 04 05 09 О12 антигенам, присущим представителям указанной группы сальмонелл. При определении Н- антигенов штаммы сначала типировали наборами (пулами) Н-антисывороток. После этого штаммы типировали индивидуальными сыворотками, входящими в тот набор (пул), с которым наблюдался положительный результат. В результате проведенных экспериментов было установлено, что бактериальная культура исследуемого штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI имела антигенную формулу О: 1, 9, 12, Н: g, т., и таким образом, по антигенным характеристикам соответствовала культуре штамма S. enteritidis Е23.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что рекомбинантный штамм Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI достоверно определяется как представитель рода Salmonella, и по антигенной структуре соответствует серовару исходного бесплазмидного штамма Salmonella enteritidis Е23. Рекомбинантный штамм отличается от исходного по скорости роста в жидкой питательной среде и чувствительности к антибиотику ампициллину.

Оценка патогенности S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI

В ходе оценки вирулентности исходного и рекомбинантного штаммов было показано, что клинические симптомы заражения и гибель животных наблюдались в течение первых 15 дней у мышей, которым оба исследованных штамма вводили внутрибрюшинно в дозах от 106 до 109 микробных клеток/животное. Гибели мышей

при внутрижелудочном способе введения, а также крыс при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении бактериальных препаратов в вышеуказанных дозах не наблюдалось. Показатель ЛД50 штамма 5. еп1егй1сИ$ Е23 при внутрибрюшинном заражении составил для белых мышей (6,8 ± 0,3)х10б микробных клеток/животное, для штамма 5. еи/еп7н/и Е23/рсОЫЛ-ТС1 - (2,9 ± 0,4)х108 м.к./животное. В соответствии с общепринятой классификацией (МУ № 1743-77, МУК № 4.2.260210.4.2.26) бактериальные препараты, значение ЛД50 которых (в ^ на животное) при внутрибрюшинном способе введения мышам и крысам превышает, соответственно, 6 ^ и 7 а при внутрижелудочном введении - 9 относятся к невирулентным штаммам. Следовательно, можно заключить, что как вакцинный штамм еп1егИ'иИв Е23/рсОМА-ТС1, так и исходный штамм 5. еп¡егШсИз Е23 являются невирулентными штаммами, вместе с тем, значение ЛД50 для рекомбинантного штамма было выше, чем для исходного.

Анализ динамики гибели животных в течение 15 дней после внутрибрюшинного введения культур, подвергнутых термической обработке, показал, что ЛД50 для 5. еМегШсИз Е23 составила (4,7±0,2)х108 микробных клеток /животное, для еп1еп1кй$ Е23/рсОЫА-ТС1- (5,2±0,5)х108 клеток/животное. То есть, согласно классификации (МУ № 1743-77, МУК № 4.2.2602-10.4.2.), оба штамма могут быть отнесены к малотоксичным (ЛД50 - 7 - 9 ^ на животное).

В эксперименте по оценке токсигенности исследуемых штаммов сальмонелл в течение 15 дней после введения фильтратов клеточных культур гибели животных в опытных и контрольных группах не зарегистрировано. Показатель ЛД50 для обоих штаммов составил более 1,6 мл/животное при внутрибрюшинном и более 2 мл/животное при внутрижелудочном введении для 3-7-суточных культур, что позволяет охарактеризовать исследуемые штаммы сальмонелл как нетоксигенные.

Анализ данных, полученных в ходе комплексной оценки патогенности исследованных штаммов, позволил заключить, что рекомбинантный штамм 5. еп1егШсИ5 E23/pcDNA-TCI, также как штамм-реципиент 5. еШегШсИя Е23, являются невирулентными, малотоксичными, нетоксигенными и могут быть отнесены к штаммам, непатогенным для теплокровных животных. Более того, показано, что по уровню вирулентности штамм 5. етегШсИ.ч Е23/рсОЫА-ТС1 является менее патогенным, чем штамм 5. еМегШсИз Е23. Одной из гипотез,

объясняющих вышеуказанный факт, является присутствие в клетках рекомбинантного штамма плазмиды pcDNA-TCI. Поскольку бактериальная клетка вынуждена тратить свои ресурсы на репликацию плазмиды, это приводит к уменьшению скорости деления бактерии, что, в свою очередь, вероятно, позволяет организму легче справиться с плазмидсодержащей сальмонеллой. Следствием этого является уменьшение жизнеспособности, а значит, и патогенности бактериального штамма в клетках млекопитающих.

Оценка стабильности плазмиды pcDNA-TCI в составе S. enteritidis E23/pcDNA-TCI in vitro

Стабильность рекомбинантной плазмиды pcDNA-TCI в составе рекомбинантных клеток Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI определяли стандартным способом путем пересева на чашку с агаром, содержащим ампициллин (100 мкг/мл) или не содержащим антибиотик. Исследование показало, что плазмида стабильно сохраняется в составе клеток аттенуированного штамма S. enteritidis Е23. Не обнаружено статистически значимого уменьшения количества клеток, несущих плазмиду, в течение 10 пересевов. После последнего пересева было проведено сравнение генетической идентичности плазмиды pcDNA-TCI, выделенной из клеток рекомбинантной сальмонеллы S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, со стандартным образцом. Плазмидная ДНК pcDNA-TCI была проанализирована с помощью рестрикционного анализа. На рисунке 2 приведена электрофореграмма продуктов реакции гидролиза pcDNA-TCI. В качестве положительного контрольного образца был использован образец плазмидной ДНК pcDNA-TCI, задепонированной под номером № 2342 в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Показано, что исследуемый образец плазмидной ДНК pcDNA-TCI по рестрикционному профилю соответствует музейному образцу.

М 1 2

3000 —>

2000 —>

1500 —>

юоо—>

П.н.

500

S /1Q Л 290

Рис. 2. Электрофореграмма в 1 %-ном агарозном геле ДНК- фрагментов, полученных гидролизом плазмиды pcDNA-TCI эндонуклеазами рестрикции Bglll и Psil: дорожка М- 1 кЬ ДНК-маркер, длины фрагментов составляют 10000, 9000, 8000, 7000, 6000, 5000, 4000, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 и 250 п.н., дорожка 1-плазмида pcDNA-TCI (из Коллекции микроорганизмов ГНЦ ВБ «Вектор»), дорожка 2-плазмида pcDNA-TCI, выделенная из культуры клеток S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.

Персистенция штаммов S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных, иммунизированных указанными штаммами в составе суппозиториев. Оценка стабильности плазмиды pcDNA-TCI в составе S. enteritidis E23/pcDNA-TCI in vivo

Для определения длительности нахождения штаммов 5. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме животных эксперимент проводили следующим образом. Лабораторных мышей иммунизировали перректально штаммами 51. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев массой 100 мг каждый, содержащих 108 клеток, однократно или двукратно. Суппозитории были изготовлены по технологии, разработанной в ИМБТ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Через 6 часов и на 2, 4, 5, 10, 16, 28, 35, 63, 70 сутки животных подвергали эвтаназии, после чего забирали образцы крови и внутренних органов животных (легкие, печень, селезенка, тонкий кишечник, пейеровы бляшки). Гомогенаты органов высевали на чашки с агаризованной питательной средой LB. После 18 часов инкубации при 37°С подсчитывали выросшие на чашках колонии.

Проведенные эксперименты показали, что ни в один из сроков наблюдения после однократной и двукратной перректальной иммунизации мышей не удалось обнаружить бактерий штаммов 5. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в легком и крови иммунизированных животных. Было показано, что исследуемые

штаммы высевались из печени, селезенки, тонкого кишечника и пейеровых бляшек. На рисунке 3 приведены графики, отражающие персистенцию сальмонеллы в селезенке при однократном и двукратном введении штаммов З.егйегШсИй Е23 и Ъ.еЫегШсИх Е23/рсОЫА-ТС1.

10 16 28 35

дни после иммунизации

- З.ег^егШсйз Е23, высев на среде без Ар, однократно

- 3.еп1егШ(1|з Е23/рсОЫА-ТС1, высеа на среде с Ар, однократно

Рис. 3. Длительность нахождения клеток 51. еШегШсИз Е23 и £ еМегШсНь E23/pcDNA-ТС1 в селезенке иммунизированных мышей при однократном (а) и двукратном (б) перректальном введении соответствующих штаммов сальмонелл в виде суппозиториев. Различия в значениях показателя между исходным и рекомбинантным штаммами недостоверны (р>0,05).

дни после иммунизации

- Э ег№гШс1|& Е23, высев на среде без Ар, двукратно

- Э. ещег|Чс1]5 Е23/рсОПЛ-ТС1, высев на среде с Ар, двукратно

Видно, что единичные клетки сальмонелл штаммов ■1>.еМегШсИх Е23 и 5\enteritidis Е23/рсОЫА-ТС1 появляются в селезенке на 5 сутки, максимальное количество клеток в органе обнаружено на 16 сутки в количестве 400±300 и 1200±400 КОЕ/селезенку соответственно. Штаммы сальмонелл продолжали высеваться из селезенки до 63 суток после однократного введения. После второй

иммунизации на 28 сутки наблюдается повторное повышение количества клеток сальмонелл штаммов З.еМегШсИз Е23 и Б.еМегШсИх Е23/рсОХА-ТС1 в органе до уровня 100±70 и 400±100 КОЕ/селезенку соответственно, однако в этом случае более высоких значений показателя не наблюдалось. После двукратного введения сальмонелл на 70-ый день от начала иммунизации клетки обоих штаммов в селезенке не обнаруживаются. Различия между группами мышей, иммунизированных Б.еШегШсИБ Е23 и З.еМегйкИь Е23/рсОМА-ТС1, были статистически недостоверны (при уровне значимости р>0,05).

В ткани тонкого кишечника бактерии штаммов Б.еШегШсИз Е23 и еМегИкИп Е23/рсОЫА-ТС1 выявлялись уже через 6 часов после иммунизации и продолжали регистрировать в дальнейшем в течение 4 дней. В пейеровых бляшках штаммы 5. еМегШсЧй Е23 и 5. епЬегШсИз Е23/рсОНА-ТС1 обнаруживались со 2 по 15 день после однократного введения.

Таким образом, показано, что введение плазмиды рсОЫА-ТС1 не повлияло на свойство рекомбинантного штамма, связанное со способностью персистировать в организме животных только ограниченное время.

Для проверки фенотипической подлинности бактерии, выделенные из селезенки, печени и пейеровых бляшек, высевали на чашки с агаром, затем выращивали в жидкой питательной среде ЕВ. Было показано, что колонии бактерий по культуральным и биохимическим характеристикам соответствовали штаммам еп1егШсИв Е23 и 51. еМегШсИз E23/pcDNA-TCI. Полученные данные подтверждают данные авторов штамма (Рыжова и Бойченко, 1997), которые показали, что 5. еМегШсИя Е23 сохраняет свой авирулентный фенотип при многократном пассировании через организм мышей.

Из бактериальных клеток сальмонелл, полученных после высевов из исследуемых органов, была выделена плазмидная ДНК для проведения рестрикционного анализа. Анализ показал, что плазмида была идентична музейному варианту плазмиды рсОЫА-ТС1 (Коллекция бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ЕНЦ ВБ «Вектор», №2342) (рис. 4).

М 1 2 3 4

Рис.4. Электрофореграмма в 1%-ном агарозном геле ДНК- фрагментов, полученных гидролизом плазмиды pcDNA-ТС1 эндонуклеазами рестрикции В§111 и РэН: дорожка /-плат ми да рсГЖЛ-ТС1 (Коллекция бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»), дорожка 2-плазмида рсОЫА-ТСЛ, выделенная из печени мышей, иммунизированных еМегШсИя Е23/рсОЫА-ТС1 на 35 день после иммунизации, дорожка 3- плазмида рсОМА-ТО, выделенная из селезенки мышей, иммунизированных 5. enterШdis Е23/рсОЫА-ТС1 на 35 день после иммунизации, дорожка 4- плазмида рсОКА-ТС1, выделенная из пейеровых бляшек мышей, иммунизированных еШег^Ма Е23/рсОЫА-ТС1 на 15 день после иммунизации, дорожка М- Х/81у1, длины фрагментов составляют 19329, 7743, 6223, 4254, 3472, 2690, 1882, 1489, 925, 421 и 74 п.н.

Доказательство экспрессии гена, кодируемого pcDNA-TCI, in vivo

Как известно, пейеровы бляшки являются одним из основных органов расселения сальмонелл и иммунологически важной структурой в отношении формирования мукозального иммунного ответа. Для проверки эффективности доставки плазмиды pcDNA-TCI in vivo с использованием аттенуированной сальмонеллы из пейеровых бляшек мышей на 3 день после иммунизации 51. enteritidis E23/pcDNA-TCI была выделена тотальная клеточная РНК. Предполагаемая транскрипция гена TCI была исследована с помощью реакции ОТ-ПЦР. Как показано на рисунке 5, фрагмент ДНК с длиной 1191 пар оснований был амплифицирован только с РНК мыши, иммунизированной S. enteritidis E23/pcDNA-TCI. В то же время не было обнаружено ДНК- фрагментов, амплифицированных в ОТ-ПЦР с РНК контрольной мыши, иммунизированной S. enteritidis Е23. Полученный ДНК- фрагмент соответствует по длине гену TCI.

Рис. 5. Электрофореграмма ОТ-ПЦР-продуктов в 1 %-ном агарозном геле: дорожка М - маркер Х/51у1-гидролизат, длина фрагментов 19 329, 7743, 6223, 4254, 3472, 2690, 1882, 1489, 925, 421 и 74 п.о.; дорожка 1-продукт ОТ-ПЦР, полученный с использованием РНК мышей, иммунизированных 5. еп¡егШсИз Е23/рсОЫА-ТС1; дорожка 2 - продукт ОТ-ПЦР, полученный с использованием РНК мышей, иммунизированных 5. еШегШсИя Е23 (контрольный образец).

Иммуногенные свойства S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиторной формы.

Т-клеточный иммунный ответ, индуцированный штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI

Как известно, ДНК-вакцина pcDNA-TCI кодирует полиэпитопный иммуноген TCI, который был сконструирован с учетом ЦТЛ-эпитопов, рестриктированных молекулами HLA человека. Поэтому для представления иммунной системе человека основная часть эпитопов может адекватно процессироваться только в клетках человека. Для оценки специфической активности вакцины на стадии доклинического изучения на животных (мышах и обезьянах) в последовательность белка TCI были введены несколько эпитопов мыши (H-2d) и обезьяны Macaca mulatto (Mamu).

Т-клеточный иммунный ответ был проанализирован методом ELISpot по наличию ИНФ-у-продуцирующих лимфоцитов в селезенках иммунизированных мышей с использованием рекомбинантного белка TCI, а также пептидов из белка Env ВИЧ-1, рестриктированных молекулами МНС I класса (пептид N15-DRVIEVVQGAYRAIR и пептид N16 -KQIINMWQEVGKAMYA).

Результаты ELISpot представлены на рисунке 6. Полученные данные свидетельствуют о появлении IFN-y- продуцирующих клеток при стимуляции ВИЧ-специфическими антигенами уже на 16 сутки от начала иммунизации. Их уровень превышает в 2,5 (в случае специфических пептидов) и в 4 раза (в случае рекомбинантного белка TCI) количество клеток, стимулированных

неспецифическим пептидом ЕНЕС. Максимальный Т-клеточный иммунный ответ наблюдали на 35 сутки от начала иммунизации, далее на 63 день (на 35-е сутки от второй иммунизации) происходило его некоторое снижение.

Эти результаты подтверждают тот факт, что после иммунизации мышей штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI происходит экспрессия целевого гена и синтез белка TCI, который процессируется и представляется соответствующему клону CD8+ лимфоцитов, являющихся продуцентами IFN-y. На основании полученных данных можно утверждать, что рекомбинантный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущий ДНК-вакцину, введенный в организм животных в составе ректальных суппозиториев, обеспечивает антиген-специфическую активацию цитотоксических Т-лимфоцитов у иммунизированных мышей.

250

□ S. enteritidis Е23 (контроль)

Ш S. enteritidis Е23/ pcD NATO I

Рис. 6. Количество IFN-y- продуцирующих спленоцитов у мышей, двукратно иммунизированных штаммами S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев, содержащих 108 клеток сальмонелл. Для обеих групп животных спленоциты были рестимулированы пептидами DRVIEVVQGAYRAIR, KQIINMWQEVGKAMYA, белком TCI и полипептидом ЕНЕС в качестве отрицательного контроля. Результаты представлены как среднее значение IFN-y- продуцирующих клеток на 5х105 спленоцитов ± стандартное отклонение (л = 5). ""-Различия между показателями опытной и контрольной групп достоверны, р<0,05.

Гуморальный иммунный ответ, индуцированный штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI

Следует отметить, что при конструировании белка TCI (Т- cell immunogen) были выбраны эпитопы из основных белков ВИЧ-1 Env, Gag, Pol и Nef (субтипов А, В и С), которые индуцируют как CD8+ ЦТЛ, так и CD4+ Т-хелперы (Бажан и др., 2004). В последовательностях нативных вирусных белков эти эпитопы локализованы в нескольких непрерывных областях как частично, а иногда и полностью перекрывающиеся пептиды. Эти непрерывные районы содержат ряд В-клеточных эпитопов, которые перекрываются с Т-клеточными эпитопами. Именно поэтому иммунизация мышей плазмидой pcDNA-TCI, кодирующей белок TCI, способна индуцировать как Т-клеточный, так и B-клеточный иммунные ответы против ВИЧ-1.

Следующей задачей нашей работы была оценка возможности индукции гуморального иммунного ответа у мышей, иммунизированных штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев. Для исследования иммуногенных свойств рекомбинантного штамма была проведена однократная и двукратная перректальная иммунизация мышей линии BALB/c штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев, содержащих 108 клеток сальмонелл. Способность рекомбинантной S. enteritidis E23/pcDNA-TCI индуцировать системный гуморальный иммунный ответ у лабораторных животных оценивали путем измерения уровня антител к рекомбинантному белку TCI в образцах сывороток с помощью ИФА. Получение рекомбинантного белка TCI проводили по методике, описанной в работе (Лебедев и др., 2008). Чистота и гомогенность белка TCI, определенная методом электрофореза в 13% полиакриламидном геле, составляла 95%. ИФА проводили в соответствии с СОП №4-006/01-12. Было показано, что иммунизация мышей индуцирует продукцию специфических IgG антител к белку TCI (рис. 7).

После однократной иммунизации специфические антитела в крови мышей появлялись уже на 16 день (рис. 7а). Максимальный титр антител наблюдался на 35 сутки после иммунизации и составлял 1:245. Повторная иммунизация на 28 сутки после первой вызывала усиление продукции специфических антител. Максимальных значений титр антител (1:4050) достигал на 35 сутки после первой инъекции (7 день после повторной иммунизации), после чего наблюдалось его снижение в течение 28 суток до уровня 1:470 (рис. 76).

Дополнительное подтверждение специфичности сывороток крови мышей, иммунизированных штаммом 5. еМегШсЧя Е23/рсВЫА-ТС1 в виде суппозиториев, было получено при использовании метода иммуноблотинга (рис. 8). Анализ проводили с использованием коммерческой тест-системы «Ке\у-Ьау-В1о11» (ВюЯас!), на стрипах которой нанесен лизат белков ВИЧ-1, предназначенный для выявления наличия специфических антител к нативным белкам вируса.

16 35 63

дни после иммунизации

5000

4500

4000

3500

1- 3000

л 2500

О. 2000

1500

1000

500

дни после иммунизации

Рис. 7. Титры анти-ТС1 после иммунизации мышей 5. еп¡егШсНь Е23/рсОЫА-ТС1 и 5. еМегШсИз Е23 в виде суппозиториев, содержащих 108 клеток сальмонеллы (а, однократная иммунизация и б, двукратная иммунизация). [] - анти-ТС1 Гцв в группе контрольных животных, иммунизированных еЫегШйгз Е23; Ц- анти-ТС1 в группе мышей, иммунизированных еи/егШг/и Е23/рсОЫА-ТС1. Данные представлены как средний титр антител ± стандартное отклонение (л = 5). *-Различия между показателями опытной и контрольной групп достоверны, р<0,05.

Рис. 8. Анализ специфичности сывороток мышей, иммунизированных S. enteritidis E23/pcDNA-TCI и S. enteritidis Е23 в виде суппозиториев, содержащих 108 клеток, методом иммуноблотинга с использованием тест-системы "New-Lav-Blotl "(Bio-Rad).

А - Объединенная сыворотка мышей, иммунизированных штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев, получена на 35 сутки (двукратная иммунизация).

В — К+ (положительный контроль сыворотка ВИЧ-положительного человека из набора "New-Lav-Blotl").

С - объединенная сыворотка мышей, иммунизированных штаммом S. enteritidis Е23 в составе суппозиториев, получена на 35 сутки (двукратная иммунизация).

Антитела, продуцируемые в ответ на иммунизацию мышей S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в виде суппозиториев, содержащих 108 клеток, специфически распознавали вирусные белки ВИЧ-1 на стрипах из набора "New-Lav-Blotl ", в то же время на стрипе, инкубированном с контрольной сывороткой, окрашивания не наблюдалось. Таким образом, была показано, что суппозитории, содержащие S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, индуцируют наработку антител, специфично узнающих природные белки ВИЧ-1.

Мукозальный иммунный ответ, индуцированный штаммом S.enteritidis E23/pcDNA- TCI

Сыворотки, полученные после иммунизации лабораторных мышей штаммом S. enteritidis E23/pcDNA-TCl в виде суппозиториев, были исследованы на наличие специфичных IgA против TCI.

В результате было показано, что при однократном введении рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI лабораторным мышам максимальный титр сывороточных IgA против TCI наблюдался на 35 сутки и составлял 1:100 (рис.9а). На 63 сутки он снижался до уровня 1:50.

Gp 160 Gp 110/120

Р68/66

Р55

Р52/51

Gp41

Р40

Р34/31

Р24/25

Р18/17

ABC

16 35 63

сутки после иммунизации

Рис. 9. Титры анти-ТС1 IgA после иммунизации мышей S. enteritidis

E23/pcDNA-TCI и

S. enteritidis Е23 в виде суппозиториев, содержащих 10s клеток сальмонеллы (а, однократная иммунизация и б, двукратная иммунизация).

анти-TCI IgA в группе контрольных животных, иммунизированных S. enteritidis Е23Ц] - анти-TCI IgA в группе мышей, им мунизированных S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.

Данные представлены как средний титр антител ± стандартное отклонение (п = 5). *-Различия между показателями опытной и контрольной групп

достоверны, р<0,05.

16 35 63

сутки после иммунизации

Максимальный титр 1§А против ТС1 при двукратном введении наблюдался на 35 сутки (7 сутки после повторной иммунизации) и составлял 1:400, на 63 сутки происходило его снижение до 1:100 (рис. 96).

Согласно имеющимся литературным данным, титры специфических ^А антител в сыворотке могут косвенно свидетельствовать о наличии и специфических секреторных ^А (Ветагк е/ а!., 2012).

Таким образом, в ходе проделанной работы был подробно охарактеризован аттенуированный штамм елгеп'/гсй.? Е23/рсВНА-ТС1, подтверждена его способность индуцировать как системный Т- клеточный и гуморальный, так и

мукозальный иммунный ответ при введении в виде суппозиториев. Показано, что штамм обладает ограниченной персистенцией и безвреден для организма теплокровных животных. Полученные данные позволяют утверждать, что аттенуированный штамм еп1егШс11$ Е23/рсОЫА-ТС1 пригоден для разработки кандидатной вакцины против ВИЧ-1 СалВИЧ «Д».

выводы

1. Показано, что клетки штамма S. enteritidis Е23 и рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, содержащего плазмиду, имеют одинаковые биохимические свойства и антигенные маркеры, при этом рекомбинантный штамм устойчив к ампициллину и растет в 1,6 раза медленнее.

2. Установлено, что плазмида pcDNA-TCI стабильно сохраняет свою структуру в клетках 5. enteritidis Е23 в условиях in vitro и in vivo.

3. Показано, что штаммы S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI имеют показатель ЛД50 при внутрибрюшинном заражении белых мышей (6,8±0,3)х106 и (2,9±0,4)х108 микробных клеток/животное, соответственно, что позволяет отнести их к невирулентным. Термически инактивированные культуры S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI являются малотоксичными и имеют показатели ЛДз0, равные (4,7±0,2)х108 и (5,2±0,5)х108 микробных клеток/животное, соответственно. Показатель ЛД50 для фильтратов клеточных культур обоих штаммов составил более 1,6 мл/животное, что позволяет сделать вывод об отсутствии у бактериальных штаммов токсигенных свойств.

4. Установлено, что штаммы S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI обладают ограниченной способностью к персистенции в организме мышей при введении суппозиториев, содержащих 108 клеток соответствующего штамма. Клетки

5. enteritidis E23/pcDNA-TCI обнаруживаются в селезенке иммунизированных мышей вплоть до 63-го дня после однократного и до 70 дня после двукратного введения суппозиториев. В пейеровых бляшках как рекомбинантный, так и исходный штаммы обнаруживаются со 2-го по 15-ый день после однократного введения. В крови и легких иммунизированных животных сальмонелл не обнаружено в течение всего срока наблюдения.

5. Показано, что препарат суммарной РНК из клеток пейеровых бляшек мышей, иммунизированных S. enteritidis Е23/ pcDNA-TCI в составе суппозиториев, содержит специфическую РНК, соответствующую гену TCI, что свидетельствует об экспрессии гена TCI в данных клетках лабораторных животных.

6. Показано, что введение мышам S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев вызывает индукцию ВИЧ-специфического клеточного, гуморального

и мукозального иммунного ответа. Схема иммунизации, основанная на двукратном введении еп1егШсИя [{23/рс[ЖА-ТС1, является более эффективной, чем на однократном.

Публикации в отечественных и зарубежных журналах

1. Karpenko L.I., Danilenko А.У.. Bazhan S.I., Danilenko E.D., Sysoeva G.M., Kaplina O.N., Volkova O.Y., Oreshkova S.F, Ilyichev A.A. Attenuated Salmonella enteritidis E23 as a vehicle for the rectal delivery of DNA vaccine coding for HIV-1 polyepitope CTL immunogen // Microbial Biotechnology. - 2012 - T.5, №2. - P.241-250.

2. Даниленко A.B.. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Даниленко Е.Д., Бабенко O.A., Батенева A.B., Каплина О.Н., Ильичев A.A.. Иммуногенные свойства ДНК вакцины, кодирующей ВИЧ-1 полиэпитопный CTL иммуноген в составе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis Е23 // Сиб. мед. журн. - 2009. - Т.24, №4, вып. 1. -С.67-72.

3. Даниленко A.B.. Карпенко Л.И., Даниленко Е.Д., Бабенко O.A., Батенева A.B., Акулова Н.И., Ильичев А.А, Каплина О.Н. Изучение гуморального иммунного ответа у лабораторных животных на рекомбинантный аттенуированный штамм сальмонеллы, несущий ДНК-вакцину pcDNA-TCI, при различных схемах иммунизации // Достижения современной биотехнологии: сб. науч.тр. / Под ред. проф. И. Г. Дроздова.-Новосибирск - 2008. - С. 147-156.

Публикации в материалах всероссийских и международных конференций

1. Даниленко A.B., Карпенко Л.И., Даниленко Е.Д., Каплина О.Н., Бабенко O.A., Батенева A.B., Ильичев A.A. Изучение гуморального иммунного ответа и различных аспектов персистенции CYA, CRP-аттенуированного рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных при перректальном способе иммунизации // «Дни иммунологии в Сибири»: Всерос. науч.-практ. конф с международным участием, Красноярск, 1-3 марта 2010 г.: сб. тез.- Крас., 2010., С.18-19.

2. Даниленко A.B., Карпенко Л.И., Даниленко Е.Д., Бабенко O.A., Батенева A.B., Каплина О.Н., Ильичев A.A. Исследование гуморального иммунного ответа и длительности персистенции аттенуированного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных при различных способах введения // Конференция по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, (3; 2009; Москва): сб. тез. - М., 2009. - Т.2. - С.93

3. Даниленко A.B., Даниленко Е.Д., Бабенко O.A., Батенева A.B., Акулова Н.И., Каплина О.Н., Карпенко Л.И. Кандидатная ВИЧ-1 вакцина на основе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI. Исследование гуморального иммунного ответа и длительности персистенции // «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней»: Всерос. науч.-практ. конф., -Москва, 11-12 нояб. 2008 г.: сб. тез.-М., 2008.-С.46

4. Даниленко A.B., Карпенко Л.И., Батенева A.B., Даниленко Е.Д., Бабенко O.A., Акулова Н.И., Ильичев A.A. Исследование длительности персистенции аттенуированного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных при различных способах введения // «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний»: Всерос. науч. конф.: сб. тез. - СПб., 2008,- С.ЗО.

5. Karpenko L.I., Veremeiko Т.А., Danilenko A.V., Levagina G.M., Danilenko E.D., Bazhan S.I., Ilyichev A.A. HIV-polyepitope DNA vaccine in suppositories. Results of Preclinical study // HIV Vaccines: Progress and Prospects, March 27 - April 1, 2008, Banff, Alberta (Canada). Abstr. Book.-2008.-(A 223).-P.102.-Keystone Symposia Global Health Ser.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность сотрудникам отдела биоинженерии ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор": Каплиной О.Н. за помощь в проведении ИФА и ELISPOT, Слесаренко Л.В. за техническую помощь в работе и дружеское участие, и всем остальным сотрудникам отдела за ценные советы и помощь в экспериментальной работе и оформлении диссертации. Автор также благодарит сотрудников Института медицинской биотехнологии Терещенко Т.А., Левагину Г.М. за помощь в получении суппозиториев, Лебедева Л.Р. за помощь в получении рекомбинантного белка TCI.

Подписано в печать 14.11.2012 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. Заказ № 124.

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Даниленко, Алексей Валерьевич

Введение

Основные положения, выносимые на защиту

Научная новизна и практическая ценность

Личный вклад автора

Публикации и апробация работы

Публикации по теме диссертации

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Вирус иммунодефицита человека первого типа

1.1. Строение вириона. Жизненный цикл вируса

1.2. Вакцины против ВИЧ/СПИДа

1.2.1 Живые аттенуированные вакцины

1.2.2. Инактивированные вакцины и вирусоподобные частицы

1.2.3. Субъединичные вакцины

1.2.3.1. Нативные Env вакцины

1.2.3.2. Вакцины на основе модифицированного белка Env

1.2.3.3. Вакцины на основе Tat- белка

1.2.4. Полиэпитопные иммуногены для индукции Т- и В-клеточного 27 иммунного ответа против ВИЧ

1.2.5. ДНК-вакцины как способ доставки Т- клеточных полиэпитопных 28 иммуногенов

1.2.6. Обоснование перспективности создания мукозальной вакцины 31 против ВИЧ

1.2.7. Доставка иммуногенов с помощью аттенуированных штаммов 33 сальмонелл

1.2.8. Суппозитории для доставки лекарственных средств и 38 микроорганизмов

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы

2.1.2 Ферменты

2.1.3. Плазмиды

2.1.4. Бактериальные штаммы

2.1.5. Культуральные и питательные среды

2.2. Методы

2.2.1. Трансформация клеток аттенуированного штамма S. enteritidis Е23 44 методом электропорации

2.2.2. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса

2.2.3. Гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.2.4. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле

2.2.5. Культивирование и идентификация аттенуированных штаммов 45 сальмонелл на дифференциальных агаризованных питательных средах

2.2.6. Серотипирование аттенуированных штаммов сальмонелл с 46 помощью агглютинирующих сывороток

2.2.7. Оценка стабильности плазмиды pcDNA-TCI в составе S. enteritidis 46 E23/pcDNA-TCI in vitro

2.2.8. Метод оценки патогенности S. enteritidis Е23 и S. enteritidis 47 E23/pcDNA-TCI

2.2.9. Приготовление суппозиториев, содержащих лифилизированные 48 клетки аттенуированного рекомбинантного штамма S. enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI

2.2.10. Изучение персистенции штаммов штаммов S.enteritidis Е23 и 49 S enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных

2.2.11. Анализ экспрессии гена TCI по уровню синтеза специфической 50 мРНК после иммунизации мышей суппозиториями, содержащими Salmonella enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI

2.2.12. Получение рекомбинантного белка TCI

2.2.13. Определение количества специфических цитотоксических 51 лимфоцитов в селезенке иммунизированных животных с помощью реакции ELISPOT

2.2.14. Иммуноферментный анализ сывороток иммунизированных 52 животных на наличие специфических IgG антител к TCI

2.2.15. Иммуноблотинг с использованием тест-системы «New-Lav-blotl»

2.2.16. Иммуноферментный анализ сывороток иммунизированных 53 животных на наличие специфических IgA антител к TCI

2.2.17. Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 55 3.1. Характеристика рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA- 55 TCI

Список сокращений

А.о. - аминокислотный остаток

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВИО-вирус иммунодефицита обезьян

ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека 1 типа

ВПЧ - вирусоподобная частица

ИФА -иммуноферментный анализ

КОЕ - колониеобразующие единицы

ЛД50 - доза, вызывающая 50% летальность

МАТ - моноклональное антитело

М.к. -микробные клетки

ОП -оптическая плотность

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией П.о. - пары оснований ПХ - пероксидаза хрена

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита человека УФ-ультафиолетовый цАМФ - циклический аденозинмонофосфат ЦТЛ - цитотоксические Т- лимфоциты ЭДТА -этилендиаминтетрауксусная кислота сгр - ген цАМФ рецепторного белка суа - ген аденилатциклазы

ELISPOT - enzyme-linked immunosorbent spot assay

FBS (fetal bovine serum) - фетальная бычья сыворотка

HLA (human leukocyte antigen) - лейкоцитарный антиген человека

IgA - иммуноглобулины класса А

IgG - иммуноглобулины класса G

IFN-y (interferon gamma)- интерферон гамма

МНС (major histocompatibility complex) - главный комплекс гистосовместимости

MPER (membrane-proximal external region) - мембрано-проксимальный внешний регион gp41 ВИЧ

PBS (phosphate-buffered solution) - фосфатно-солевой буферный раствор SHIV(simian-human immunodeficiency virus) - вирус иммунодефицита обезьяны-человека

Для достижения поставленной дели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить влияние плазмиды pcDNA-TCI на биохимические и антигенные свойства штамма S. enteritidis Е23.

2. Изучить сохранность плазмиды pcDNA-TCI в клетках аттенуированного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI.

3. Изучить вирулентность, токсичность и токсигенность штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI для теплокровных животных.

Основные положения, выносимые на защиту:

2. Штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI невирулентен, малотоксичен и нетоксигенен для теплокровных животных.

Научная новизна и практическая ценность

2. В ходе исследования персистенции рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI показано, что данный штамм, также как и штамм S. enteritidis Е23, обладает ограниченной способностью к персистенции в организме млекопитающих. Установлено, что бактерии обоих исследованных штаммов не обнаруживаются в селезенке иммунизированных животных через 63 дня после однократного и через 70 дней после двукратного введения суппозиториев.

4. Впервые показано, что после иммунизации лабораторных мышей штаммом

Результаты настоящих исследований могут представлять интерес с точки зрения практического применения. Был получен ряд дополнительных характеристик, которые позволяют утверждать, что аттенуированный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI пригоден для дальнейшей разработки кандидатной вакцины против ВИЧ-1 СалВИЧ «Д». На основании полученных данных можно рекомендовать штамм S. enteritidis Е23 в качестве вектора доставки других ДНК-вакцин против вирусных и бактериальных инфекций, онкологических заболеваний. Возможно также рекомендовать использование штамма S. enteritidis Е23 для доставки биологически активных белков (например, цитокинов) в случаях, когда необходимо активировать местный иммунитет слизистой.

Личный вклад автора овные эерименты, проведенные в работе, включая ледование биохимичих, антигенных и иммуногенныхов штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, оценкаабильни ДНК-вакцины in vitro и vivo, ледование длительни пестенции в организме животных, иммунизированных S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в видеппозиториев, а также анализ полученных результатов, выполнены автором лично. Пановка ELISPOT была проведенавмнос.н ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Каплиной О.Н. ледования патогенни штаммов S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI проводилвмносотрудниками Научно-ледователого центра токологии и гигиеничой регламентации биопрепаратов (НИЦ ТБП) ФМБА РФ.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликованы 3 статьи, две из которых - в журналах, рекомендованных ВАК для защиты диссертаций. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: на Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний», Санкт-Петербург, 2008 г; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2008 г; Keystone Symposia Global Health Series. HIV Vaccines: Progress and Prospects, Banff, Alberta, Canada, 2008 г; 3-ей конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, 2009 год; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири», Красноярск, 2010 г.

Публикации по теме диссертации

Публикации в отечественных и зарубежных журналах

1. Karpenko L.I., Danilenko A.V., Bazhan S.I., Danilenko E.D., Sysoeva G.M., Kaplina O.N., Volkova O.Y., Oreshkova S.F, Ilyichev A.A. Attenuated Salmonella enteritidis E23 as a vehicle for the rectal delivery of DNA vaccine coding for HIV-1 polyepitope CTL immunogen // Microbial Biotechnology. - 2012 - T.5, №2. - P.241-250.

2. Даниленко A.B., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Даниленко Е.Д., Бабенко O.A., Батенева A.B., Каплина О.Н., Ильичев A.A. Иммуногенные свойства ДНК-вакцины, кодирующей ВИЧ-1 полиэпитопный CTL иммуноген, в составе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis Е23 // Сиб. мед. журн. - 2009. - Т.24, №4, вып. 1. -С.67-72.

3. Даниленко A.B., Карпенко Л.И., Даниленко Е.Д., Бабенко O.A., Батенева A.B., Акулова Н.И., Ильичев А.А, Каплина О.Н. Изучение гуморального иммунного ответа у лабораторных животных на рекомбинантный аттенуированный штамм сальмонеллы, несущий ДНК-вакцину pcDNA-TCI, при различных схемах иммунизации // Достижения современной биотехнологии: сб. науч.тр. / Под ред. проф. И. Г. Дроздова.-Новосибирск - 2008. - С. 147-156.

Публикации в материалах всероссийских и международных конференций

1. Даниленко A.B., Карпенко Л.И., Даниленко Е.Д., Каплина О.Н., Бабенко O.A., Батенева A.B., Ильичев A.A. Изучение гуморального иммунного ответа и различных аспектов персистенции CYA, CRP-аттенуированного рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных при перректальном способе иммунизации // «Дни иммунологии в Сибири»: Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием, Красноярск, 1-3 марта 2010 г.: сб. тез.-Крас., 2010, С.18-19.

4. Даниленко А.В., Карпенко Л.И., Батенева А.В., Даниленко Е.Д., Бабенко О.А., Акулова Н.И., Ильичев А.А. Исследование длительности персистенции аттенуированного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных при различных способах введения // «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний»: Всерос. науч. конф.: сб. тез. - СПб., 2008,- С.30.

5. Karpenko L.I., Veremeiko Т.A., Danilenko A.V., Levagina G.M., Danilenko E.D., Bazhan S.I., Ilyichev A.A. HIV-polyepitope DNA vaccine in suppositories. Results of Preclinical study // HIV Vaccines: Progress and Prospects, March 27 - April 1, 2008, Banff, Alberta (Canada). Abstr. Book.-2008.-(A 223).-P.102.-Keystone Symposia Global Health Ser.

Глава 1. Обзор литературы

1. Вирус иммунодефицита человека первого типа 1.1. Строение вириона. Жизненный цикл вируса.

Первыми официальными научными сообщениями о СПИД стали две статьи о необычных случаях развития пневмоцистной пневмонии и саркомы Капоши у мужчин-гомосексуалистов, опубликованные в 1981. В июле 1982 впервые для обозначения новой болезни был предложен термин СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита). В сентябре того же года на основе ряда оппортунистических инфекций, диагностированных у мужчин-гомосексуалистов, наркопотребителей, больных гемофилией А и гаитян, СПИД впервые было дано полноценное определение как болезни. В 1982 году развитие СПИД были впервые ассоциировано с инфекционным агентом (Hanrahan et al., 1982). Несколько независимых групп исследователей идентифицировало вирус, вызывающий иммунодефицит, который был отнесен к семейству Retroviridae, роду Lentivirus (Barresinoussi et al., 1983; Gallo étal., 1983; Levy et al., 1984). env—gpl20\ env-gp4T vpx-pl

Рис. 1. Схема строения вириона ВИЧ-1 (www.microbiologybytes.com).

Вирион ВИЧ-1 имеет сферическую форму, диаметром 100-150 нм. Основные черты строения сходны с другими представителями рода лентивирусов. Наружная оболочка вируса состоит из бислоя липидов, который имеет происхождение из клеточной мембраны клетки хозяина. В эту мембрану встроены поверхностные молекулы ВИЧ-

§р160. Так как мембрана имеет клеточное происхождение, то на ее поверхности и внутри нее сохраняется множество клеточных белков. Под наружной оболочкой располагается сердцевина вируса (кор), которая имеет форму усеченного конуса и образована белком р24. Промежуток между наружной вирусной мембраной и сердцевиной вируса заполнен матриксным белком р17. Внутри сердцевины располагаются две молекулы вирусной РНК, связанные с низкомолекулярными белками (р9 и р7) (рис. 1).

Геном ВИЧ-1 представлен двумя позитивными копиями РНК размером около 10000 нуклеотидов, кодирующими 15 белков (рис. 2) (Hahn et al, 1984). из RU5 790 1186 S' LT|R

34 PI

MA CA H рб

634 PBS

5559 5970(

PR RT RH IN

U3 RU

3'LTR

8653 PPT

Рис. 2. Схематическое представление генома ВИЧ-1. Геном ВИЧ-1 содержит три структурных гена - gag, pol и env, а также шесть вспомогательных генов (vif vpr, tat, rev, vpu, nef). Структурные гены кодируют белки матрикса (MA), капсида (СА), нуклеокапсида (NC), рб, р2 и pi (gag); протеазу (PR), обратную транскриптазу (RT), РН полипептид (РН), интегразу (IN) (pol); поверхностный (SU, gpl20) и трансмембранный (TM, gp41) белки оболочки (env). Гены расположены в одном ряду в соответствии с рамкой считывания. На конце генома обозначены длинные концевые повторы - LTR, подразделенные на U3, R и U5 последовательности, а также прилежащие к ним сайт инициации репликации (PBS) и полипуриновый тракт (РРТ). Цифры сверху и снизу каждого прямоугольника соответствуют координатам начала и окончания структурной единицы, соответственно. Приведенная нумерация соответствует штамму HXB2CG ВИЧ-1 (www.hiv.lanl.gov'). Линейка, определяющая масштаб, расположена внизу рисунка.

Три района генома env, pol и gag поставляют структурные белки и ферменты, критичные для вирусной репликации; остальные гены vif vpr, tat, rev, vpu и nef кодируют белки, выполняющие дополнительные функции, которые также имеют огромное значение для жизненного цикла вируса.

Ген env кодирует белки оболочки, которые необходимы для связывания с клеткой хозяина. Гликопротеин-предшественник gpl 60 разрезается клеточной протеазой на функциональные белки оболочки: поверхностный gpl20 и трансмембранный gp41 (Allan et al., 1985; Robey et al., 1985; Veronese et al., 1985), которые нековалентно связываются между собой, формируя тримеры (Earl et al., 1990). Начало инфекции обусловлено координированным действием этих белков, когда gpl 20 связывается с рецептором на поверхности лимфоцита, затем претерпевает конформационное изменение, которое экспонирует вторичный сайт связывания с корецептором на поверхности клетки хозяина. Вторичное связывание с корецептором приводит к диссоциации gp41 из комплекса и его последующему внедрению в клеточную мембрану, что, таким образом, создает сайт для вхождения вируса в клетку. После вхождения в клетку белки, кодируемые генами gag и pol, продолжают процесс. Вирусная обратная транскриптаза преобразует одноцепочечный РНК- геном в двуцепочечную ДНК (Goff et al., 1990), которая встраивается в клеточный геном с помощью вирусной интегразы (Lafemina et al., 1992). Белки, продуцируемые с вирусного генома, которые впоследствии процессируются вирусной протеазой, вместе с вирусной РНК формируют новые вирусные частицы, высвобождаемые в межклеточное пространство или заражающие соседние клетки. Вирус в полной мере использует для своих нужд клеточную систему хозяина и инициирует патогенный механизм апоптоза (Stevenson et al., 2003).

После идентификации инфекционного агента ожидалось, что эффективная вакцина против СПИДа будет создана в течение ближайших 3-10 лет, но ее нет и по сей день. Эпидемия ВИЧ/СПИД продолжает распространяться в России и в мире. Так, по данным Федерального научно-методического Центра по профилактике и борьбе со СПИДом (www.hivrussia.ru) в 2011 году в РФ число инфицированных ВИЧ-1 выросло на 7 % и составило 660 тысяч человек. В мире ежедневно инфицируется вирусом 7400 человек.

Одной из причин сложившейся ситуации является то, что ВИЧ-1 отличается от других вирусов, вызывающих инфекционные заболевания, против которых были успешно разработаны вакцины в прошлом. Эти отличия порождают проблемы, с которыми сталкиваются ученые в попытках создать вакцину (Chhatbar et al., 2011).

Первой проблемой является гипервариабельность ВИЧ-1. ВИЧ-1 характеризуется крайней изменчивостью как на уровне зараженных индивидов, так и на уровне популяции.

Второй проблемой является способность ВИЧ-1 уклоняться от действия нейтрализующих антител.

Это возможно по ряду причин:

• внешняя белковая оболочка вируса покрыта плотной сеткой углеводов;

• места прикрепления вируса к клеточным рецепторам (СБ4) защищены от нейтрализующих антител;

• высокое генетическое разнообразие «уводит» иммунную реакцию в сторону от производства нейтрализующих антител широкого спектра действия.

Нейтрализующие антитела широкого спектра действия не вырабатываются в большинстве случаев естественной ВИЧ-инфекции, поэтому обычная вакцинологическая стратегия «подражания» естественной инфекции для индуцирования нейтрализующих антител может оказаться неэффективной против ВИЧ-1. Чтобы успешно решить этот вопрос, в настоящее время разрабатываются новые способы индукции нейтрализующих антиВИЧ-1 антител.

Третьей проблемой является то, что ВИЧ-1 встраивает свой генетический материал в человеческий геном и создает пожизненную инфекцию. После такого встраивания ВИЧ-инфицированные клетки не отличаются от неинфицированных клеток, что приводит к невосприимчивости и неэффективности механизмов иммунной защиты.

Четвертой проблемой является отсутствие в настоящее время идеальной модели инфекции на животных, на которой можно было бы проверить эффективность вакцины против ВИЧ-1. Использование для моделирования инфекции человекообразных обезьян очень дорого и, кроме того, патогенез заболевания, вызванного ВИЧ-1 и вирусом иммунодефицита обезьян (ВИО), а также основные антигены гистосовместимости у обезьян и человека отличаются. Исследователям вакцин против ВИЧ-1 приходится полагаться на трансгенные животные модели, но прогностическая ценность таких моделей будет оставаться неопределенной до тех пор, пока не будет продемонстрирована способность кандидатной вакцины защитить человека против СПИДа в рамках клинических испытаний.

Пятой проблемой является отсутствие сведений о том, какой силы должен быть индуцируемый вакциной протективный иммунный ответ. При многих других вирусных инфекциях можно выявить лиц, которые инфицируются патогеном, отвечают на него спонтанной иммунной реакцией и побеждают инфекцию. Исследование таких лиц приводит к выявлению параметров иммунного ответа организма, необходимого и достаточного для борьбы с инфекцией, что облегчает создание вакцины. Для ВИЧ-1 не существует задокументированного случая выздоровления от инфекции, и параметры протективного иммунного ответа остаются неизвестными. В отсутствии таких сведений у ученых нет достоверных маркеров для определения того, насколько одна кандидатная вакцина лучше другой. Неясно, сколько - одна или более - врожденных, клеточно-опосредованных, мукозальных иммунных реакций или гуморальных реакций необходимо, чтобы обеспечить защитный иммунитет. В частности, мукозальный иммунитет может потребоваться для профилактики ВИЧ-инфекции на самых ранних стадиях.

Шестой проблемой является отсутствие знаний об антигенах ВИЧ-1, которые необходимы для индуцирования защитной реакции, поэтому разработчики создают кандидатные вакцины для проверки ряда антигенов ВИЧ-1 в различных комбинациях. Однако пока систематически в клинических или доклинических исследованиях не были проверены различные антигены ни одного из векторов. До тех пор, пока не будет достигнута некоторая эффективность вакцин в клинических испытаниях и/или не будут выполнены системные исследования на приматах, этот вопрос останется нерешенным (Haut et al., 2009).

Хотя задача разработки вакцины против ВИЧ-1 является крайне сложной, считается, что это принципиально возможно. К тому же нет другого пути справиться с эпидемией или ограничить ее масштабы (Picker et al., 2012). Это убеждение основано в определенной мере и на практических наблюдениях. Известно, что:

• небольшое число лиц не подвергается заражению, несмотря на многократные контакты с ВИЧ-инфекцией. Можно предположить, что исследование ВИЧ-1-специфического иммунного ответа таких людей позволит выявить и исследовать механизмы защиты, что может быть использовано при создании вакцины;

• мощные клеточные иммунные реакции против ВИЧ-1 у небольшого числа лиц могут подавлять вирусную нагрузку до невыявляемых уровней;

• при обычном течении ВИЧ-инфекции клеточный иммунитет подавляет вирусную нагрузку в течение длительного периода времени, часто в течение десятилетия;

• обезьяны, иммунизированные живой ослабленной вакциной, полностью защищены против вируса иммунодефицита обезьян (ВИО), который обычно вызывает СПИД у обезьян;

• нейтрализующие антитела широкого спектра действия против ВИЧ-1 могут полностью защитить обезьян от инфицирования гомологичным гибридным вирусом иммунодефицита обезьяны/человека.

1.2. Вакцины против ВИЧ/СПИДа

Работы по созданию вакцины против ВИЧ-инфекции активно ведутся и в России, и за рубежом В России такие работы ведутся в следующих крупных центрах

ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России и НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН (Гудима и др 2007, Гудима и др, 2008), авторы вакцины «ВИЧРЕПОЛ», первой российской вакцины, успешно прошедшей первую фазу клинических испытаний,

Санкт-Петербургский консорциум, разработавший ДНК-вакцину на основе российского варианта ВИЧ-1 субтипа А - «ДНК-4»,

ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», разработавший вакцину «КомбиВИЧвак», на основе полиэпитопных B-клеточного и Т-клеточного иммуногенов (Karpenko et al, 2010) В 2011 г была завешена первая фаза клинических испытаний вакцины «КомбиВИЧвак» и показана ее безвредность

Среди зарубежных разработок следует выделить три вакцины, которые дошли до третей фазы клинических испытаний

В США, Канаде и Нидерландах была запущена плацебо-контролируемая 3 фаза клинических испытаний gpl20 субъединичной кандидатной вакцины производства фирмы VaxGen, которая вовлекла 5400 добровольцев с высоким риском половой передачи ВИЧ, в основном, гомосексуалистов (Graham et al, 1998) Это была первая ВИЧ- вакцинная конструкция, поступившая на 3 фазу клинических испытаний Вакцинная конструкция содержала смесь двух рекомбинантных gpl20 белков из вирусов ВИЧ-1 субтипа В, один из штамма MN, другой из первичного изолята GNE8 (Gilbert et al, 2005, Flynn et al, 2005) Вакцина индуцировала высокий титр Env-специфичных нейтрализующих антител против ВИЧ-1 MN и SF162, но низкий титр широконейтрализующих антител против остальных штаммов вирусов ВИЧ-1 и -2 (Gilbert et al, 2010)

Третья фаза клинических испытаний похожей вакцины, представляющей собой смесь рекомбинантных белков, gpl20 из штамма MN субтипа В и gpl20 из первичного изолята-штамма А244 субтипа Е (AIDSVAX В/Е), началась в Таиланде примерно в то же самое время Испытания проводили на 2500 добровольцах-наркоманах (Pitisuttithum et al, 2006)

В результате было показано, что ни одно из этих исследований не установило статистически значимого уменьшения частоты инфицирования ВИЧ-1 у вакцинируемых, несмотря на повторявшиеся через 2 года бустерные иммунизации (Gilbert et al., 2005, Gilbert et al., 2005). Наблюдаемое уменьшение частоты инфицирования ВИЧ-1 в определенных этнических группах в исследовании коррелировало с высоким титром антител против gpl20, но количество таких случаев было слишком мало для статистической достоверности результатов (Cohen et al., 2003).

Еше один вакцинный кандидат, дошедший до третьей фазы клинических испытаний, был создан на основе репликационно-некомпетентного аденовируса 5 серотипа, экспрессирующего гены белков ВИЧ-1: Gag, Pol, Nef. Целью этой вакцинной стратегии была индукция ВИЧ-1 специфического клеточного иммунного ответа. Эта фаза клинических испытаний показала, что вакцина на основе вектора Ad5 индуцирует клеточный иммунный ответ у большинства испытуемых, хотя у некоторых добровольцев персистенция вирусного вектора в организме была ограничена за счет наличия собственных Аё5-специфичных нейтрализующих антител. Исследования, проводимые в рамках 2Ь фазы клинических испытаний, спонсируемых фирмой Merck и Национальным институтом здоровья США, были прерваны после того, как стали известны промежуточные результаты, которые показали, что вакцина не может предотвратить заражение ВИЧ-1 или снизить вирусную нагрузку после инфицирования, а также то, что наличие предшествующих нейтрализующих антител к аденовирусу у вакцинируемых приводит к повышению риска заражения ВИЧ-1.

Наиболее успешной из всех разработанных и прошедших третью стадию клинических испытаний вакцин против ВИЧ-1 явилась кандидатная вакцина, концепция которой строилась на основе прайм-бустерного введения двух субъединичных вакцин ALVAC-HIV и AIDSVAX В/Е, разработанных фирмами Sanofi Pasteur и VaxGene. Результаты испытаний ВИЧ-1 вакцины, проводившихся в Таиланде в 2003-2006 годах, в которых участвовало 16000 добровольцев, показали, что прайм-бустерная стратегия иммунизации уменьшает уровень заражения ВИЧ-1 на 26,1-31,4 %, но не снижает вирусную нагрузку у тех добровольцев, кто стал ВИЧ-1- инфицированным после вакцинации. Надо сказать, что в этом случае впервые клинические испытания ВИЧ-1- вакцинного кандидата показали определенную эффективность в предотвращении передачи вируса (Robb et. al., 2012).

В следующих

главах будут более подробно рассмотрены концепции, на основе которых разрабатывались вакцины против ВИЧ-1.

1.2.1. Живые аттенуированные вакцины

Действующим началом живых аттенуированных вакцин является аттенуированный ВИЧ-1. Эксперименты по созданию аттенуированных вакцин проводились с использованием модели инфекции обезьян. Рядом экспериментаторов получены мутанты SIV (Simian Immunodeficiency Virus - вирус иммунодефицита обезьян) с делецией гена nef. Было показано, что такие мутанты могут служить живыми вакцинами, которые вызывают защиту от заражения патогенным SIV у обезьян (Wyand et al., 1999, Cranage et al., 1997, Joag et al., 1998). Параметры защиты животных, иммунизированных 'с помощью штамма SIV с делетированным геном nef остаются пока до конца неизученными (Koff et al., 2006), несмотря на доказательство индукции продолжительного ЦТЛ ответа (Johnson et al., 1997, Gauduin et al., 1999). Было обнаружено, что SIV вызывает иммунный ответ, который защищает обезьян от заболевания при заражении патогенным вирусом, но не защищает от заражения при повторной встрече с возбудителем. В работе Genesca с соавторами было показано, что непатогенный штамм SHIV 89.6 может вызывать продолжительный иммунный ответ у обезьян, который не обеспечивает защиту против повторной инфекции SIV, но препятствует неконтролируемой репликации вируса. В эксперименте была продемонстрирована роль Т-клеточного звена иммунитета в такой защите (Genesca et al., 2009, Genesca et al., 2008). Однако из соображений безопасности живые аттенуированные вакцины не испытываются на людях, поэтому сделать заключение о перспективности дальнейших работ не представляется возможным.

1.2.2. Инактивированные вакцины и вирусоподобные частицы

В попытках создания вакцины против ВИЧ-1 использовались инактивированные вирусные частицы. Инактивированные SIV (simian immunodeficiency virus) или SHIV (simian-human immunodeficiency virus) вакцины получали путем мягкого окисления с алдитриол-2 для удаления ионов цинка из белков Gag и IN или алкилирования с помощью N-этиленимина или через инактивацию вирусной РНК с помощью УФ и псоралена. Иммуногенность полученных препаратов была низкой (Lifson et al., 2004). Такой результат, возможно, являлся следствием наличия небольшого количества гликопротеинов в составе данной вирусной частицы (Zhu et al., 2006).

В экспериментах на культурах клеток насекомых с помощью бакуловирусных векторов было показано, что белки Gag и Env ВИЧ-1 и SIV спонтанно собираются, образуя так называемые вирусоподобные частицы (ВПЧ) (Doan et al., 2005, Zanotto et al., 2005). Эти ВПЧ использовали в экспериментах по исследованию иммуногенности данных белков. ВПЧ на основе белков Gag и Env SIV были протестированы на человекообразных обезьянах с использованием нескольких путей введения, включая назальный путь. Их иммуногенность оказалась низкой даже при использовании холерного токсина в качестве адыованта. Было показано отсутствие образования широко нейтрализующих антител при введении ВПЧ на основе белка Env ВИЧ-1 мышам и морским свинкам (Kim et al., 2007). Однако использование прайм-буст стратегии, когда для праймирующей иммунизации использовали ДНК-вакцину, позволило усилить иммуногенность вакцины ВПЧ (Buonaguro et al., 2007). Было показано, что ВПЧ, включающая модифицированный белок Env в его нативной форме и бактериальный флагеллин как адыовант, может эффективно стимулировать клеточный ответ и, следовательно, этот подход может быть перспективным для создания антиВИЧ-1 вакцины (Vassilieva et al., 2011).

1.2.3. Субъединичные вакцины

1.2.3.1. Нативные Env вакцины

Белковые субъединичные вакцины разрабатывались на основе мономерного белка gpl60 ВИЧ-1 (Dolin et al., 1991, Belshe et al., 1993, Keefer et al., 1994). В дальнейшем для создания кандидатных вакцин стали использовать белки gpl20 и gpl40. Эти антигены вводили в организм в растворимой форме с использованием такого адъюванта, как окись алюминия. Показано, что субъединичные вакцины на основе белка Env индуцировали нейтрализующие антитела, которые, в основном, были направлены на гипервариабельную V3 петлю белка gpl20 и были способны защищать обезьян против гомологичного или близкородственного штамма ВИЧ-1, но не защищали от заражения гетерологичным штаммом вируса (Girard et al., 1991, Fultz et al., 1992, Girard et al., 1995, Berman et al., 1996). Аналогично на модели SHIV/обезьяна было показано, что вакцины, основанные на gpl20, были способны обеспечивать защиту против заражения гомологичным SHIV (Mooij et al., 1998), но не против заражения гетерологичным штаммом вируса (Stott et al., 1998).

В результате пассивной иммунизации с помощью моноклинального антитела, направленного на нейтрализующий эпитоп, расположенный в V3 петле gpl20 ВИЧ-1, была продемонстрирована защита обезьян от заражения гомологичным лабораторно-адаптированным Illb изолятом вируса (Emini et al, 1990). Однако в других исследованиях было показано, что большинство первичных изолятов ВИЧ-1 являлись устойчивыми к нейтрализации (Moore et al., 1995). Не было показано индукции нейтрализующих антител к первичным ВИЧ-1 изолятам у более, чем 2000 добровольцев, которые были провакцинированы в период между 1988 и 1996 годами кандидатной вакциной Env с использованием таких адъювантов, как оксид алюминия или оксид алюминия и деоксихолат (McElrath et al, 1996, Burton et al, 1998). Попытка повысить эффективность иммунизации с помощью введения белка gpl20 SIV в комплексе с различными адъювантами, липосомами или иммуностимулирующими комплексами не дала существенного результата (Browning et al, 1992), поскольку было показано, что эти способы недостаточно эффективны для формирования протективного иммунного ответа у обезьян при их заражении SIV (Hulskotte étal., 1995).

1.2.3.2. Вакцины на основе модифицированного белка Env

В попытках улучшить иммуногенность белка Env, а также его способность индуцировать образование ВИЧ-1 широконейтрализующих антител было разработано несколько новых подходов (Girard et al, 2006, Vaine et al, 2010).

Эти подходы состоят в следующем.

1. Были использованы тримерные gpl40 молекулы, стабилизированные добавлением гетерологичного тримеризационного домена на С-конце последовательности gp41 (Yang et al, 2002), a также gpl40 тримеры с делецией 30 аминокислот в участке гипервариабельной V2 петли для лучшего экспонирования нейтрализующих эпитопов, перекрывающихся с С04-связывающим сайтом (Barnett et al, 2001, Srivastava et al, 2003, Srivastava et al, 2003). Тримерные deltaV2 gpl40 молекулы сами по себе и в смеси с адъювантами индуцировали высокий титр гомологичных Env связывающих антител, но низкий титр гетерологичных нейтрализующих антител (Lian et al, 2005, Li et al, 2006). Было показано, что системная иммунизация или комбинация системной и мукозальной иммунизации вакциной на основе белка deltaV2 Env BH4-1sfi62 защищает самок обезьян против интравагинального заражения гомологичным вирусом (Barnett et al, 2008), но не защищает против заражения гетерологичным вирусом (Xu et al., 2006).

2. Тримерные gpl 60 молекулы были внутренне стабилизированы дисульфидной связью между gpl20 и gp41 (так называемые SOS белки). Их иммуногенность на лабораторных животных была исследована с использованием прайм-буст схемы. В качестве прайм-иммунизации вводилась ДНК, кодирующая SOS белок, а в качестве буст-иммунизации вводился рекомбинантный белок. В результате был получен высокий титр нейтрализующих антител против штаммов вируса того же субтипа, но с низким уровнем нейтрализующих антител против штаммов вируса других субтипов (Beddows et al., 2005).

3. Были получены олигомерные gpl40 молекулы, ковал ентно соединенные с синтетическими имитаторами CD4 рецептора (Devico et al, 1996, Fouts et al., 2002). При использовании таких антигенов было показано, что у обезьян появляются нейтрализующие антитела к эпитопам ВИЧ-1, «открытие» которых для нейтрализации антителами индуцируется связыванием gpl 60 с CD4 рецептором при вхождении вируса в клетку (Fouts et al., 2000). Использование таких белков способствовало уменьшению вирусной нагрузки (DeVico et al., 2007).

4. Была протестирована смесь Env иммуногенов из основных штаммов ВИЧ-1 (Nabel et al., 2005, Hurwitz et al., 2005, Seaman et al., 2005), циркулирующих в мире, в надежде, что мультивалентная Env вакцина будет способствовать расширению спектра образующихся в организме нейтрализующих антител (Lu et al., 2010). И действительно, было показано, что вакцина на основе белка Env из разных субтипов ВИЧ-1 вызывала у макак резус более интенсивный иммунный ответ, чем моновалентная Env вакцина.

5. Синтетические гены, созданные на основе теоретически определенной консенсусной последовательности белка оболочки ВИЧ-1 (Gao et al., 2005, Doria-Rose et al., 2005, Thomson et al., 2005) использовали для индукции T- и В- клеточного иммунного ответа, и в частности, нейтрализующих антител (Gao et al., 2007). В результате было показано, что антитела хорошо нейтрализуют ВИЧ-1 Env псевдовирусы и лишь частично нейтрализуют спектр Env 2 tier псевдовирусов. В другой работе было показано, что ВПЧ, содержащая консенсусную последовательность белка Env субтипов В или С, введенная через слизистую легких мышей, вызывала значительный клеточный системный и мукозальный иммунный ответ против эпитопов белка штаммов вируса ВИЧ-1 субтипов В и С и была более эффективна при индукции иммунного ответа в сравнении с ВПЧ, содержащей моновалентный белок Env субтипа С (McBurney et al., 2009).

Однако, несмотря на все попытки имитировать структуру белка оболочки или модифицировать белок Env (Pantophlet et al., 2006), задача создания на основе оболочечных белков иммуногенов, вызывающих высокий титр широконейтрализующих антител, не решена до сих пор (Schief et al., 2010, Burton et al., 2010, Hoxie etal., 2010, Lewis etal., 2010).

Попытка индуцировать 2F5 и 4E10 широконейтрализующие антитела, блокирующие слияние вируса с клеткой, посредством иммунизации рекомбинантными олигомерными gp41 молекулами или последовательностями gp41 MPER также оказалась неудачной. 2F5 эпитоп в составе различных белковых последовательностей индуцировал высокий титр антител против первичной аминокислотной последовательности эпитопа, но не был способен индуцировать нейтрализующие антитела против первичных изолятов ВИЧ-1 (Kim et al., 2007, Joyce et al., 2002, Ho et al, 2005), что подтверждает необходимость адекватно имитировать нативную конформацию эпитопа (Shi et al, 2010, Ingale et al., 2010). Кроме того, очень важно учитывать липидное окружение эпитопа в оболочке и его гидрофобный состав для связывания антител с соответствующими эпитопами (Lenz et al., 2005).

1.2.3.3. Вакцины на основе Tat-белка

Субъединичные вакцины на основе белка Tat были разработаны в надежде, что иммунный ответ, направленный на антигены, экспрессирующиеся на ранних стадиях репликации вируса, может привести к сдерживанию инфекции (Goldstein et al., 1996, Caputo et al., 2004). В результате действительно было показано, что наличие антител против белка Tat коррелирует с пониженной вирусной нагрузкой (Zagury et al., 1998, Re et al., 2001). Белок Tat способствует иммуносупрессии путем индукции апоптоза неинфицированных лимфоцитов (Li et al., 1995). Однако результаты, полученные после иммунизации обезьян с помощью полноразмерного белка Tat, или белка Tat, инактивированного формалином, или пептидов из белка Tat, носили неоднозначный характер. В одних исследованиях эти вакцины не защищали от заражения различными вариантами вируса SHIV (Goldstein et al., 2000, Allen et al., 2002, Liang et al, 2005), в то время как в других исследованиях был показано снижение титров вируса у иммунизированных обезьян (Pauza et al., 2000, Cafaro et al., 1999, Maggiorella et al., 2004, Borsetti et al., 2009). Вероятно, причиной такой неоднозначности могут быть неконтролируемые генетические факторы врожденного иммунитета хозяина (Florese et al., 2009, Florese et al., 2008). Вакцина на основе нативного Tat- белка была испытана в ходе 1-ой фазы клинических испытаний, и было показано, что белок хорошо переносился и был иммуногенным у ВИЧ-инфицированных (Ensoli et al., 2009, Bellino et al., 2009). В настоящее время проводится 2-я фаза клинических испытаний вакцины на основе белка Tat на ВИЧ-инфицированных добровольцах, получающих антиретровирусную терапию.

Применение комбинации химерного белка Tat-Nef и субъединичной вакцины на основе gpl20 с адъювантом AS02 предотвращало развитие заболевания у макак резус в течение, по меньшей мере, 2,5 лет после заражения вирусом SHIV (Voss et al., 2003). Та же комбинация с применением различных адъювантов была исследована в 1 фазе клинических испытаний (Goepfert et al., 2007). Было показано, что происходит индукция сильного и продолжительного CD4+ -Т- клеточного ответа (Leroux-Roels et al., 2010). При исследовании белка Tat на мышах было показано, что он обладает синергическим действием, направленным на усиление Т- клеточного ответа против белков Gag и Env (Gaviolli et al., 2008). Таким образом, вакцины на основе белка Tat ВИЧ-1 демонстрируют повышенную эффективность в комбинации с другими антигенами ВИЧ-1 (Caputo et al., 2008, Caputo et al., 2009).

1.2.4. Полиэпитопные иммуногены для индукции Т- и В- клеточного иммунного ответа против ВИЧ

В 1987 году впервые было предложено использовать Т- и В-клеточные эпитопы для создания искусственных полиэпитопных вакцин (Borras-Cuesta et.al., 1987). Вскоре появились первые работы по созданию полиэпитопных иммуногенов на основе антигенов ВИЧ-1 (Palker et al., 1989; Ahlers et al., 1993). В дальнейшем Ханке с соавторами усовершенствовали технологию, объединив в одной молекуле 20 частично перекрывающихся ЦТЛ- эпитопов из белков ВИЧ-1, рестриктированных по нескольким HLA аллелям I класса. При исследовании иммуногенных свойств конструкции на мышах в составе ДНК-вакцины и модифицированного аденовируса Анкара было установлено появление клонов специфических ЦТЛ, отвечающих продукцией IFN-y в реакции ELISPOT (Hanke et al., 1998а; Hanke et al., 1998b).

В настоящее время технология полиэпитопных иммуногенов используется для разработки средств для терапии рака (Bei et al., 2010) и болезни Альцгеймера (Cribbs et al., 2010), при разработке вакцин против гепатита В (Bayard et al., 2010), против хантавирусов (Zhao et al., 2012) и ряда других вирусных заболеваний, в том числе, против ВИЧ-1 (Strbo et al, 2011).

Технология полиэпитопных иммуногенов была использована и в ГНЦ ВБ «Вектор» для создания искусственного белка TCI (Т- cell immunogen) (Bazhan et al., 2004). Искусственный полиэпитопный иммуноген TCI был сконструирован как кандидатная ДНК- вакцина против ВИЧ-1 с целью стимуляции цитотоксических Тлимфоцитов, которые играют важную роль в предотвращении ВИЧ-1-инфекции и прогрессии СПИДа. Иммуноген включает фрагменты из основных белков ВИЧ-1, которые содержат эпитопы, индуцирующие как ЦТЛ, так и Т-хелперы (Bazhan et al., 2004). Все включенные эпитопы являются высококонсервативными для трех основных субтипов ВИЧ-1 А, В и С. Для обеспечения возможности детекции ЦТЛ-ответа у экспериментальных животных в иммуноген были включены дополнительные эпитопы, рестриктированные молекулами МНС I класса мыши и макаки. В итоге искусственный белок длиной 392 а.о. содержит более 80 ЦТЛ эпитопов, многие из которых перекрываются и все они рестриктированы 10 видами молекул HLA I класса (HLA-A, В, Cw) (Рис. 3). Ген, кодирующий полиэпитопный иммуноген TCI, был вставлен в плазмиду pcDNA3.1., и таким образом получена ДНК- вакцина pcDNA-TCI (Bazhan et al, 2004).

A3 1 "A

A 2 4 B3S """

J —B35 — A9 д. -tf ÜÍ2(A19)tf

-ВЧ — ДЭЗ ( А19 ) — ВЗ S К?'"9' №

-Cw3 - Th А24 —• — с*» t2'— (В8) — Th —(BIS) (ES) — (B8) (BS2) — (B27) - (Bw62)

B35 ■ B35 (All) lH-2d,p,u,q

I H-2a,b,£ m Hamu-A*01 (5HIV) B35 ■B35,

42,43,(411,B27) - B3J

All) — <B8 )

•gpM-gQ

B3S-B*270S" (B18T (B377— (BS7^ (B57 f

Рис. 3. Структура белка TCI (Bazhan et al, 2004). На рисунке представлены перекрывающиеся эпитопы, входящие в состав белка TCI. В прямоугольниках обозначены белки ВИЧ-1, эпитопы которых были учтены при конструировании иммуногена TCI.

1.2.5. ДНК-вакцины как способ доставки Т-клеточных полиэпитопных иммуногенов

Главным преимуществом подхода с использованием ДНК-вакцин является возможность синтеза иммуногена in vivo, что позволяет избежать сложностей производства и очистки субъединичных вакцинных препаратов in vitro и обеспечить правильный протеасом-опосредованный процессинг. При этом обеспечивается долговременная экспрессия антигена в организме и правильная его презентация иммунной системе. Имитируя вирусную инфекцию, данный вакцинный препарат индуцирует развитие полноценного иммунного ответа, характерного для живых вакцин, но при этом не используется живой вирус, который может вызывать побочные эффекты.

До появления ДНК-вакцинного подхода для доставки иммуногенов (в том числе ВИЧ-1 иммуногенов) использовались различные покс- и аденовирусы, например, такие как венесуэльский вирус энцефалита лошадей (Davis et al., 2000, Johnston et al., 2005, Perri et al,, 2003), вирус Sendai (Takeda et al., 2003), вирус везикулярного стоматита (Publicover et al., 2005) и т.д.

Для разрабатываемых ДНК-вакцин характерно отсутствие реактогенности, присущей гибридным вирусным системам, остаточной патогенности и генетической нестабильности, являющихся проблемами аттенуированных вакцин, а также низкая аллергенность вследствие высокой степени очистки (в отличие от белковых субъединичных вакцин) и низкой антигенной загруженности (1-2 целевых белка-антигена, в отличие от вирусных систем). Кроме того, при вакцинации с использованием вирусных систем доставки антигена формируется полноценный иммунный ответ не только на целевой антиген, но и на все антигены вируса, поэтому повторное использование этого вирусного вектора для вакцинации может быть затруднено. Более того, вирус, используемый в качестве реплицирующегося вирусного вектора, может быть условно патогенным в странах с высокой вирусной нагрузкой по данному вирусу и более вирулентным в странах, где это заболевание встречается реже, особенно в среде индивидов с ослабленным иммунитетом (новорожденных детей и т.д.). Одним из серьезных недостатков живых вирусных вакцин является возможность их контаминации другими вирусами в процессе культивирования и в результате инфицирования клеток, производящих целевой вирус.

Еще одним достоинством ДНК- вакцин является возможность экспрессии генов, кодирующих белковые иммуногены в эукариотической клетке, где происходит их правильный фолдинг и гликозилирование. При этом ДНК- вакцина может кодировать очень большой иммуноген. В одной из работ была показана доставка цитомегаловирусного генома с помощью S. typhimurium в клетки мышей, в результате чего была получена вирусная репликация и индуцирован антивирусный иммунный ответ (Cicin-Sain et al., 2003). При использовании ДНК- вакцин доставляемый иммуноген индуцирует иммунный ответ по Тх1-клеточному пути, что важно для создания вакцины против BH4-l(Wang et ai, 1995, Wang et ai, 1993, Yasutomi et ai, 1996, Rosa et al, 2011, Spearman et al., 2009).

Следует отметить и экономические преимущества ДНК- вакцин при сравнении с классическими вакцинами на основе целых вирусных частиц или их субъединиц: относительная простота и дешевизна крупномасштабного производства, повышенная температурная стабильность, облегчающая хранение и транспортировку, необходимые для широкой иммунизации населения.

Однако следует отметить, что иммуногенный потенциал ДНК- вакцин у людей и человекообразных обезьян низок. Известно, что ДНК-вакцины вызывают слабую активацию Т- хелперов, индукцию синтеза антител (Vasan et ai, 2010) и активацию цитотоксических Т- лимфоцитов (Macgregor et ai, 1998). В связи с этим, экспериментаторы начали поиск способов усиления иммуногенности ДНК- вакцин. В частности, увеличение иммуногенности ДНК- вакцины было показано при использовании генов с оптимизированными ко донами (Graham et ai, 2006), а также при параллельном введении генетических конструкций, экспрессирующих цитокины, такие как ИЛ-12, ИЛ-15 или ГМ-КСФ (Barouch et ai, 2000, Kutzler et al., 2005, Schadeck et ai, 2006, Boyer et ai, 2007, Xu et ai, 2008).

Стратегиями дальнейшего улучшения иммунного потенциала ДНК-вакцин является технология нанесения плазмидной ДНК на микрочастицы (Robinson et ai, 1999, Dileo et ai, 2003), a также использование устройств для электропорации (Luckay et ai, 2007, Hirao et ai, 2008, Brave et ai, 2010, van Drunen Little-van der Hunk étal., 2010).

Так, было показано, что оптимизированная плазмидная ДНК, кодирующая белки SIV и доставляемая при помощи электропорации, вызывает сильный клеточный и гуморальный иммунный ответ, в отличие от вакцины на основе антигенов, и уменьшает содержание вируса в крови как в острой, так и хронической фазе инфекции, вызванной заражением вирусом SIV (Rosati et ai, 2009). Аналогичные результаты были получены при использовании электропорации для доставки ДНК- вакцины, содержащей гены белков Gag, Pol SIV и Env ВИЧ-1 (Yin et ai, 2010). Комбинированное использование цитокинов, например, ИЛ-12, и электропорации, усиливает потенциал ДНК-вакцинации (Hirao et ai, 2008). Иммунизация плазмидой, кодирующей белок Gag ВИЧ-1, и плазмидой, кодирующей ИЛ-15, значительно усиливает индукцию Gag- специфичных Т-клеток памяти (Calarota et ai, 2008).

Для усиления иммуногенности используют различные схемы введения препаратов на основе ДНК- вакцин (Jiao et al., 2011). Надо сказать, что самое значительное повышение иммуногенных свойств ДНК-вакцины было получено с помощью прайм-буст- стратегии вакцинации, когда ДНК-вакцина вводится как прайм- иммунизация, а живая гибридная вирусная вакцина - как буст- иммунизация (Ramshaw et al., 2000, 490 Letvin et al., 2005, Belyakov et al., 2008).

Кроме того, повышение иммуногенности и эффективности ДНК-вакцин может быть обеспечено адекватным способом ее доставки. Для решения проблемы доставки ДНК-вакцины разрабатываются подходы, связанные с использованием вирусных (аденовирусы, MVA) или бактериальных переносчиков {Salmonella, Shigella) (Belyakov et al., 2008; Brave et al., 2010; Pan et al., 2010).

Выбирая способ доставки ДНК-вакцин в случае создания вакцины против ВИЧ-1, необходимо учитывать особенности этой инфекции. Как известно, центральную роль в передаче ВИЧ-инфекции и патогенезе СПИДа играет мукозальная иммунная система. Многочисленные исследования показали, что, используя парентеральную иммунизацию, трудно получить тотальную защиту от проникновения ВИЧ-1 через вагинальный или ректальный путь. Следовательно, более адекватным способом вакцинации, по-видимому, является мукозальный.

1.2.6. Обоснование перспективности создания мукозальной вакцины против ВИЧ

Известно, что большая часть новых случаев инфицирования ВИЧ-1 происходит при половом контакте. Согласно современным данным, ВИЧ-1 способен проникать через интактный эпителиальный барьер, инфицируя клетки Лангерганса, локализованные в многослойном эпителии влагалища и дендритные клетки ректальной слизистой (Карамов и др., 2008).

Антиретровирусная терапия, по-видимому, не влияет на экспрессию ВИЧ-1 в ректальной слизистой в отличие от его экспрессии в клетках крови. Поэтому слизистая кишки является резервуаром ВИЧ-1. Другим важным местом накопления вируса является слизистая влагалища. Показано, что бессимптомные носители ВИЧ-1 в Таиланде имеют р24-позитивные клетки в эпителии или в собственной пластинке слизистой влагалища. Почти все такие клетки в эпителии и половина в собственной пластинке слизистой являются клетками Лангерганса (Карамов и др., 2008).

Таким образом, слизистая является основным местом проникновения и главным резервуаром вируса. Следовательно, любая вакцина, предотвращяющая развитие ВИЧ-1- инфекции, должна обеспечивать сильный мукозальный иммунный ответ.

Мукозальные антитела, особенно ^А, играют огромную роль в защите организма от патогенов, проникающих через слизистую оболочку. Существует достаточно доказательств того, что антитела класса О и А способны защитить от ВИЧ-инфекции.

§А антитела могут блокировать трансцитолиз через слизистый монослой, нейтрализовать ВИЧ-1 и индуцировать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность АБСС. Мукозальные цитотоксические Т-лимфоциты обладают вирусспецифической цитолитической активностью, и частота встречаемости антигенспецифичных ЦТЛ собственной пластинки слизистой кишечника коррелирует со степенью защиты от вируса (Карамов и др., 2008).

Таким образом, мукозальный иммунный ответ может являться одним из наиболее важных факторов для формирования иммунного ответа против ВИЧ-1 при перректальном введении вакцины. Основной мишенью воздействия антиВИЧ-вакцины при этом способе введения и местом формирования иммунной реакции является лимфоидная система слизистых оболочек кишечника.

Известно, что слизистые оболочки представляют собой важный компонент иммунной системы млекопитающих. Лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистыми оболочками, - это высокоспециализированная система, состоящая из организованной ткани и рассеянных лимфоцитов (Карамов и др., 2008).

Лимфоидная ткань слизистых оболочек (ЛТС) представляет собой не окруженные капсулой островки лимфоидной ткани, расположенные большей частью в слизистых оболочках. Скопления бескапсульной лимфоидной ткани можно обнаружить в собственной пластинке слизистых оболочек и подслизистой ткани желудочно-кишечного тракта, дыхательных и мочеполовых путей. Лимфоидные клетки образуют в них одиночные или агрегированные скопления с центрами размножения (вторичные фолликулы).

Скопления лимфоидной ткани, расположенные в собственной пластинке слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, часто распространяются в подслизистый слой. Они имеют форму одиночных фолликулов или сгруппированных узелков. Пейеровы бляшки обычно встречаются в нижней части подвздошной кишки. Покрывающий их эпителий кишечника способен транспортировать антигены в лимфоидную ткань. Эту специализированную функцию выполняют особые эпителиальные клетки, рассеянные среди энтероцитов -М- клетки. В базолатеральной области М-клеток имеются глубокие инвагинации плазматической мембраны - карманы, в которых располагаются В- и Т-лимфоциты, дендритные клетки и макрофаги. М-клетки встречаются не только в участках пейеровых бляшек, но и в других лимфоидных образованиях слизистых оболочек.

Дополнительно к организованной лимфоидной ткани, образующей единую систему J1TC, в слизистой оболочке желудка, кишечника и дыхательных путей присутствует множество рассеянных лимфоцитов и плазматических клеток. Лимфоциты обнаруживаются в соединительной ткани собственной пластинки и в эпителиальной выстилке.

Среди лимфоцитов собственной пластинки преобладают активированные Т-клетки, но в значительном количестве присутствуют также активированные В-клетки и плазмоциты. Эти плазматические клетки секретируют IgA антитела, транспортируемые через клетки эпителия и высвобождаемые в просвет органа.

Лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистыми оболочками, отличается как система от других лифоидных органов тем, что лимфоциты ЛТС возвращаются в процессе рециркуляции главным образом в эту ткань. Данное явление называется хомингом. Так, лимфоциты, стимулированные в пейеровых бляшках, проходят через регионарные лимфатические узлы в кровоток и затем возвращаются «домой», в собственную пластинку слизистой оболочки кишечника. Такая специфическая рециркуляция объясняется тем, что эти лимфоциты экспрессируют молекулы хоминга- HML-1 (human mucosal lymphocyte antigen-1), которые связываются со специфическими молекулами адгезии адрессинами на поверхности эндотелиоцитов (Карамов и др., 2008).

Таким образом, наличие лимфоидной системы слизистых оболочек, содержащих клетки, способные захватывать, процессировать и презентировать антигены, а также активированные Т- и В-лимфоциты, позволяет говорить о возможности формирования специфического антиВИЧ- иммунного ответа, как системного, так и мукозального, при перректальной иммунизации.

1.2.7. Доставка иммуногенов с помощью аттенуированных штаммов сальмонелл

Одним из наиболее перспективных векторов доставки ДНК-вакцин с использованием мукозальных путей введения являются аттенуированные штаммы сальмонелл (Darji et al., 1997; Ning et. al., 2004). Механизм доставки ДНК-вакцины с помощью аттенуированных бактерий может быть следующим. После пересечения кишечного барьера слизистой оболочки (главным образом, через М-клетки) клетки рекомбинантной сальмонеллы захватываются антигенпрезентирующими клетками (АПК) в местных лимфатических тканях, таких как пейеровы бляшки. В этих клетках бактерии размножаются и разрушаются вследствие воздействия клеточных лизосомальных ферментов. В результате это должно приводить к высвобождению ДНК-вакцины и трансфекции in vivo антигенпрезентирующих клеток, которые в свою очередь представят антиген Т-хелперным и цитотоксическим клеткам (Darji et al„ 1997).

Важной характеристикой вакцин на основе сальмонелл является их способность стимулировать как системный (гуморальный и клеточный), так и местный иммунитет слизистых (Jazayeri et al, 2012). Так как основными способами введения препаратов на основе сальмонелл являются назальный, пероральный, ректальный, то развитие местного иммунного ответа зачастую связано со слизистыми дыхательной, пищеварительной и мочеполовой систем. При этом применительно к штаммам Salmonella, основными объектами инфицирования являются клетки слизистого эпителия желудочно-кишечного тракта и лимфоидных органов, ассоциированных с ним (Spreng et al., 2006). Иммунная система слизистых (в частности слизистого эпителия желудочно-кишечного тракта) характеризуется наличием схожих с системным иммунитетом механизмов защиты, представленных гуморальным и клеточным звеньями. Гуморальный иммунитет обеспечивается действием иммуноглобулинов, преимущественно класса А, которые селективно транспортируются в секреты слизистой. Следует отметить, что именно IgA, а не IgG, как в случае системного гуморального ответа, являются более значимыми для защиты слизистых. Такое отличие обусловлено тем, что, во-первых, иммуноглобулины класса А являются более устойчивыми к действию протеолитических ферментов, присутствующих в секретах слизистых. Во-вторых, молекула IgA является димерной и имеет четыре антигенсвязывающих сайта, что в 2 раза увеличивает вероятность связывания антигенов по сравнению с молекулой IgG. В работе Hocini с соавт. показано, что анти-gplöO IgA-антитела являются более эффективными по сравнению с анти-gplöO IgG по их способности предотвращать проникновение ВИЧ через эпителиальный барьер (Hocini et al., 1997).

Множество работ по получению аттенуированных мутантов сальмонелл связано с попытками создать живую вакцину против сальмонеллеза и брюшного тифа. Были получены штаммы, аттенуированные по генам, входящих в систему метаболизма, энергетическую систему, гены островков патогенности, например, такие как:

• мутанты сальмонелл (aroA, aroB, aroC) по генам, кодирующим белки, участвующие в метаболизме ароматических кислот (Hoiseth and Stocker, 1981/ Dougan et al, 1987);

• аттенуированные штаммы сальмонелл, которые содержали мутации в генах ssa, sse, spt, sop, sip, входящих в кластеры генов SPI-I и SPI-II (Raupach and Kaufmann, 2001); в аттенуированный штамм сальмонеллы, который содержал мутации в гене репликазы ruvB (Choi et al., 2011), и мутант S. choleraesuis, содержащий мутации в rpoS, phoP регуляторных генах (Bartolome et al., 2010);

• мутант по суа и сгр генам (Рыжова и Бойченко, 1997);

• штамм S. typhimurium с мутациями в гене ДНК- аденинметилазы dam. Впоследствии он был использован для разработки вакцины против сальмонеллеза овец (Möhler et al, 2011).

Первые работы по использованию аттенуированных штаммов сальмонелл в качестве вакцин были связаны с доставкой рекомбинантных белков (Carrier et. al, 1992, Stabel et. al, 1990, Brett et. al, 1993, Бойченко и др., 1997). Примеры успешного использования сальмонелл для доставки как бактериальных, так и вирусных антигенов приведены в следующих работах. Рядом авторов было показано, что цитоплазматическая экспрессия гетерологичных белков в штамме S. typhimurium может вызывать протективный иммунный ответ к столбняку (антиген: белковый фрагмент С столбнячного токсина) (Fairweather et al, 1990), Streptococci pyogenes (антиген: М5 белок) (Poirier et al., 1988), Plasmodium berghii (антиген: белок CSP) (Tite et al, 1990) и гриппу (антиген: гемагглютинин вируса гриппа) (Sadoff et al, 1988). Исследования, проведенные на человеке, также подтверждают, что бактериальные антигены, экспрессирующиеся в цитоплазме векторного штамма, могут быть иммуногенными (Nardelli-Haefliger et.al., 1996)

Использование сальмонелл в качестве средства доставки ДНК-вакцин было впервые продемонстрировано в работе Дарджи с коллегами (Darji et al, 1997). В этой работе исследователями был создан рекомбинантный штамм аттенуированной сальмонеллы, содержащий плазмиду с геном листериолизина, экспрессирующимся в клетках эукариот. При иммунизации мышей был получен специфический гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ, который обеспечивал защиту иммунизированных животных при заражении патогенным штаммом Listeria monocytogenes.

В работе других исследователей было показано, что аттенуированная шигелла способна доставлять ДНК- вакцину, кодирующую белок Lac Z под контролем CMV промотора, в клетки мышей. Конструкция индуцировала Lac Z- специфические антитела и Т-клеточный ответ (Sizemore et al., 1997). В исследовании Паглия с соавторами была показана экспрессия гена, кодирующего белок GFP под контролем эукариотического промотора, дендритными клетками после иммунизации рекомбинантной сальмонеллой (Paglia et al., 1998). Аттенуированные штаммы сальмонелл также использовались при разработке средств для иммунотерапии опухолей (Paglia et al., 1998, Shata et al., 2000). Эти ранние исследования продемонстрировали возможность использования этого подхода для доставки ДНК-вакцин.

В дальнейшем последовала целая серия работ по разработке способов доставки ДНК- вакцин с помощью аттенуированных бактерий (Dietrich et al., 2003; Galen et al., 2004; Schoen et al., 2004; Daudel et al., 2007, Woo et al., 2001, Zheng et al., 2002). В частности, в одной из работ было показано, что ДНК- вакцина в составе аттенуированной сальмонеллы эффективнее стимулирует иммунный ответ против поверхностного антигена вируса гепатита В по сравнению с «голой» ДНК- вакциной (Woo et al., 2001). Эффективность этой ДНК- вакцины была оценена на трансгенных мышах, постоянно экспрессирующих HBsAg в клетках печени и почек (Zheng et al., 2002). Рекомбинантная сальмонелла более эффективно подавляла экспрессию гена HBsAg гепатоцитами животных, по сравнению с вакциной на основе «голой» ДНК или субъединичной вакциной. При этом в организме мышей происходит индукция цитотоксических лимфоцитов, Т- хелперов и антител, что говорит о том, что иммунная толерантность к вирусному белку может быть преодолена (Woo et al., 2001).

В настоящее время этот подход продолжает развиваться и появляются все новые данные, подтверждающие его перспективность (Cao et al., 2011, Bai et al., 2011, Yang et al., 2010, Pan et al., 2010, Wan et al, 2011, Huang et al, 2010). Из наиболее интересных работ по использованию сальмонелл в качестве вектора доставки ДНК- вакцин можно упомянуть следующие. •

Пан с соавторами показал, что иммунизация цыплят аттенуированной S. typhimurium, несущей ДНК- вакцину с геном гемагглютинина вируса гриппа, в качестве прайм-иммунизации и убитым вирусом гриппа в качестве бустерной иммунизации, дает 100 % защиту от заражения высокопатогенным штаммом вируса гриппа A/H5N1 (Pan et al., 2010).

В работе Wan с соавторами было показано, что иммунизация птиц ДНК-вакциной против реовируса с помощью аттенуированного штамма S. typhimurium приводит через две недели к появлению в сыворотке крови специфических антител. После заражения патогенным штаммом вируса выживаемость иммунизированных животных составила 67 % (Wan et al, 2011).

Сальмонелла в качестве вектора доставки ВИЧ-1- антигенов.

В литетратурных источниках встречаются данные об использовании сальмонелл в качестве векторов доставки антигенов ВИЧ либо ДНК-вакцин против ВИЧ. Было показано, что рекомбинантные аттенуированные сальмонеллы, продуцирующие антигены ВИЧ-1, индуцируют высокий системный (гуморальный и клеточный) иммунитет и секреторный иммунитет. В частности, авторами было показано, что рекомбинантные аттенуированные штаммы Salmonella enteritidis Е-23/ВМС120 (Козлов и др., 2002) и Salmonella typhimurium Т-10/ВМС 160 (Козлов и др., 2002) обеспечивают синтез белков gp 120 и gp 160 ВИЧ-1 в клетках млекопитающих. Авторами работы (Paglia et. al., 1998) была получена живая вакцина против ВИЧ-1 на основе аттенуированного штамма Salmonella typhimurium SL-3261 для перорального введения, которая в качестве иммуногенов несет белок обратной транскриптазы и трансактивирующий белок ВИЧ-1.

Было установлено, что рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis E-23/pGEX-2T-TBI способен продуцировать искусственный белок TBI, содержащий девять Т- и В- клеточных эпитопов ВИЧ, в клетках млекопитающих (Некрасова и др., 2004). Способность к продукции белка TBI была установлена для рекомбинантного аттенуированного штамма бактерий Salmonella typhimurium SL 7202/pGEX-TB (Карпенко и др., 2002).

Все описанные штаммы при введении животным индуцировали выраженный специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ к ВИЧ-1 и следовательно, могут быть использованы для конструирования живой ДНК-вакцины против ВИЧ-1.

В 2006 году была опубликована работа Мурашева и др., в которой авторы использовали аттенуированный штамм S. typhimurium Т10 для доставки лабораторным мышам ДНК-вакцины против ВИЧ-1 (Мурашев и др., 2006). После введения мышам была показана индукция цитотоксического и Т-хелперного иммунного ответа, при этом индукция специфических антител против антигенов ВИЧ-1 была незначительна.

Следует отметить, что в настоящее время уже существуют и успешно применяются в клинической практике ряд мукозальных вакцин против вирусных инфекций. В качестве примера можно привести вакцины против полиомиелита, гриппа. Применяются разные способы введения мукозальных вакцин (пероральный, назальный, перректальный и т.д.), при которых активируется иммунная система слизистых и формируются специфические иммунные реакции, но согласно литературным данным, исследователи используют, в основном, пероральный способ введения. В случае создания вакцины против ВИЧ-1, по-видимому, предпочтительным является перректальный способ введения. Это связано с тем, что слизистая кишечника является местом проникновения ВИЧ-1, а также начальным и преимущественным местом репликации вируса. Следовательно, перректальное введение ДНК-вакцины обеспечивает развитие иммунной реакции непосредственно в «воротах» инфекции. Кроме того, перректальная вакцинация не требует антацидов, нейтрализующих кислый рН желудка, либо других способов защиты действующего начала, как это необходимо в случае пероралыюго введения. Наиболее адекватным способом перректального введения вакцины является использование суппозиторных лекарственных форм.

1.2.8. Суппозитории для доставки лекарственных средств и микроорганизмов

Интерес к суппозиторным лекарственным формам обусловлен тем, что используя различные типы и состав основы можно обеспечить быструю, массированную или постепенную доставку лекарственного вещества в кровоток (Кгоу^упзкт еГ а1, 1968).

Существуют литературные данные по использованию суппозиториев для введения различных лекарственных веществ (ЬоеЬг еГ а1, 2001, Ро1шап е/ а1, 1981, СишеИт е( а1, 1993). Суппозиторные лекарственные формы используются для профилактики и лечения вирусных и бактериальных инфекций. Данные об их эффективности получены как в экспериментах на животных, так и в клинических исследованиях

Так, на овцах была продемонстрирована доставка ДНК- вакцины, содержащей гликопротеин Э вируса герпеса 1 типа, в клетки при интравагинальном введении суппозиториев (ЬоеЬг е/ а1, 2001). Результатом этого воздействия являлось появление специфических ^О и в крови и выделениях слизистой носовой полости животных.

Существует значительный массив данных клинического исследования лекарственных веществ, вводимых в виде суппозиториев. Так, группой исследователей (Ро1шап е( а!., 1981) показано, что диклофенак натрия (вольтарен) при введении в виде суппозиториев детям в возрасте 2-10 лет обладает противолихорадочным эффектом в острой фазе инфекции.

Суппозиторная форма жаропонижающего препарата нумелизида (200 мг/суппозиторий) приводила к купированию аномально сильной лихорадки у пациентов, вызываемой инфекциями как вирусного, так и бактериального происхождения. В проведенном исследовании была показана большая эффективность суппозиториев, содержащих нумелизид, по сравнению с суппозиториями, содержащими парацетамол в концентрации 500 мг (СишеШ а!., 1993).

Опубликован ряд работ, в которых продемонстрировано успешое использование суппозиториев для доставки различных цитокинов. Показано, что рекомбинантный альфа-2 интерферон при введении в составе ректальных суппозиториев взрослым пациентам, страдающим острой формой гепатита В, способен сдержать развитие заболевания (МаНпоУэкша а1, 1994).

Рекомбинантный альфа 2Ь интерферон в сочетании с иммуномоделирующими комплексами, введенный в виде ректальных суппозиториев детям, способен улучшать клинические показатели течения заболевания хронических больных вирусными гепатитами В и С (ис1шкт е/^ а1., 2000).

Итальянскими исследователями была показана эффективность применения ректальных суппозиториев Ргохе1ап совместно с антибиотикотерапией против бактериальной инфекции, вызывающей хронический простатит. В это йработе были исследованы две группы пациентов. Пациенты из первой группы принимали стандартную антибиотикотерапию, применяемую в таких случаях, пациенты из второй антибиотикотерапию+Ргохе1ап. Клинические показатели пациентов из второй группы испытуемых были лучше, хотя контрольные микробиологические высевы у пациентов обеих групп не различались (Оа1еопе & а1, 2012).

Российскими исследователями была доказана эффективность препарата «Витапрост плюс, суппозитории ректальные» для предотвращения инфекционных воспалительных процессов у пациентов после операции по удалению части простаты (ЫогёгасЬеу еГ а1, 2011).

Помимо этого, есть данные о разработке вакцинных препаратов в виде суппозиториев на основе инактивированных микроорганизмов. Такого рода суппозиторная вакцина против урогенитальных инфекций, действующим началом которой являются инактивированные уропатогенные бактерии видов Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus morganii и Streptococcus faecalis, описана в патенте РФ № 2224542, выданном американской фирме Протеин Экспресс (Хертеленди и др., 2004). Показано, что суппозиторная форма вакцины способствует равномерному распределению клеток микроорганизмов в лекарственной форме и обеспечивает стабильность активной субстанции в течение длительного времени.

В настоящее время созданы и используются в медицинской практике суппозитории, содержащие живые микроорганизмы. Это суппозитории, содержащие микроорганизмы нормальной микрофлоры человека, которые применяются при лечении дисбактериозов, воспалительных процессов дистальных отделов кишечника и полости влагалища (Кузнецова и др., 2002, Холодков и др., 2004). Препараты суппозиториев содержат микробную массу живых бифидобактерий или лактобактерий в количестве клеток на одну дозу (Сорокин и др., 1997), либо сухую лиофилизованную биомассу микроорганизмов (Холодков и др., 2004) и фармацевтически разрешенные добавки. В России производятся свечи Ацилакт, Бифидин, Лактобактерин (производство ОАО «Биохиммаш»), которые представляют собой микробную массу живых микроорганизмов, высушенную в среде культивирования с добавлением сахарозо-желатино-молочной среды и сформированную в медицинские суппозитории.

Таким образом, существует значительное количество данных, подтверждающих возможность получения эффективных лекарственных препаратов и вакцин, в том числе, бактериальных, в форме суппозиториев, что позволяет говорить о возможности создания такой лекарственной формы вакцины против ВИЧ для перректального введения.

Преимуществом мукозальных вакцин с использованием вакцинных штаммов сальмонеллы, несущих антигены ВИЧ-1 или ДНК-вакцин против ВИЧ, в виде суппозиториев может быть то, что они могут обеспечивать безболезненность, простоту введения и способствовать более стабильной и длительной индукции местного иммунитета, поскольку, размножаясь в организме хозяина, вакцинный штамм может стимулировать длительную выработку антител с развитием резистентности у входных ворот инфекции.

На основании анализа литературных данных, представленных в обзоре, можно заключить, что одним из перспективных направлений в разработке вакцин против ВИЧ является конструирование искусственных полиэпитопных антигенов в составе ДНК-вакцин. Для обеспечения доставки ДНК-вакцины м повышения ее иммуногенности могут быть использованы аттенуированные штаммы сальмонелл и наиболее адекватным способом введения рекомбинантных бактерий является перректальный способ введения в виде суппозиториев, позволяющий обеспечить формирование как системного, так и мукозального специфического иммунного ответа.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Даниленко, Алексей Валерьевич

выводы

2. Установлено, что плазмида pcDNA-TCI стабильно сохраняет свою структуру в клетках S. enteritidis Е23 в условиях in vitro и in vivo.

3. Показано, что штаммы S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI имеют показатель ЛД5о при внутрибрюшинном заражении белых мышей (6,8±0,3)х106 и о

2,9±0,4)х10 микробных клеток/животное, соответственно, что позволяет отнести их к невирулентным. Термически инактивированные культуры S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI являются малотоксичными и имеют показатели ЛД5о, о о равные (4,7±0,2)х10 и (5,2±0,5)х10 микробных клеток/животное, соответственно. Показатель ЛД50 для фильтратов клеточных культур обоих штаммов составил более 1,6 мл/животное, что позволяет сделать вывод об отсутствии у бактериальных штаммов токсигенных свойств.

4. Установлено, что штаммы S. enteritidis Е23 и S. enteritidis E23/pcDNA-TCI обладают ограниченной способностью к персистенции в организме мышей при о введении суппозиториев, содержащих 10 клеток соответствующего штамма. Клетки

6. Показано, что введение мышам S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе суппозиториев вызывает индукцию ВИЧ-специфического клеточного, гуморального и мукозального иммунного ответа. Схема иммунизации, основанная на двукратном введении S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, является более эффективной, чем на однократном.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность сотрудникам отдела биоинженерии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»: Каплиной О.Н. за помощь в проведении ИФА и ЕЫБРОТ, Слесаренко Л.В. за техническую помощь в работе и дружеское участие, и всем остальным сотрудникам отдела за ценные советы и помощь в экспериментальной работе и оформлении диссертации. Автор также благодарит сотрудников Института медицинской биотехнологии Терещенко Т.А., Левагину Г.М. за помощь в получении суппозиториев, Лебедева Л.Р. за помощь в получении рекомбинантного белка ТС1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительная часть новых случаев инфицирования ВИЧ-1 происходит при половом контакте, поэтому вакцина против вируса должна обеспечивать защиту одновременно как в слизистых в области проникновения вируса, так и при передаче вируса через кровь. Считается, что рекомбинантные штаммы сальмонелл, несущие антигены ВИЧ-1 или их ген-эквиваленты в составе ДНК вакцины - это один из наиболее перспективных путей создания мукозальной антиВИЧ- вакцины (Fouts et. al., 1995/ Hopkins et. al., 1995). В частности, такого же мнения придерживается первооткрыватель ВИЧ-1 Роберт Галло (Gallo et. al., 2006).

Преимущество непарентерального способа ДНК-вакцинации с использованием аттенуированных сальмонелл, по сравнению с инъекционным, заключается в том, что при непарентеральном введении ДНК-вакцины в составе бактериального вектора, помимо гуморального и клеточного, активируется и специфический мукозальный иммунитет, создающий барьер для проникновения вируса в организм (Shata et. al., 2002). При использовании данного подхода не требуется проведения дорогостоящей стадии очистки ДНК-вакцины или антигена. Кроме того, непарентеральный способ введения технически менее сложен, что особенно важно при планировании массовых иммунизаций, охватывающих группы риска.

Как уже отмечалось в литературном обзоре, в настоящее время создан ряд кандидатных вакцин против ВИЧ-1 на основе сальмонеллы в качестве вектора. Однако все они использовались для перорального введения. В частности, рекомбинантная вакцина, сконструированная на основе бактерии Salmonella, была предложена в качестве кандидатной вакцины для оральной иммунизации против ВИЧ-1 в США (Fouts et al., 2003, Institute for Human Virology University, Maryland, USA) и вышла на первую фазу клинических испытаний. В России также проводятся работы по созданию пероральной вакцины против ВИЧ-1 на основе аттенуированного штамма сальмонеллы, несущего ДНК-вакцину, кодирующую оболочечный белок ВИЧ-1 gpl 20 (Мурашев, и др., 2006).

Если сравнивать пероральный и перректальный способы введения, то перректальный способ предпочтителен по двум причинам. Первая заключается в том, что слизистая кишечника служит одними из главных «ворот» инфекции - местом проникновения ВИЧ-1, а также начальным и преимущественным местом репликации вируса, следовательно, перректальное введение ДНК-вакцины обеспечивает развитие иммунной реакции непосредственно в «воротах» инфекции. Кроме того, перректальная вакцинация не требует антацидов, нейтрализующих кислый pH желудка, как это необходимо в случае перорального введения.

В настоящей диссертационной работе приведены результаты дополнительных исследований по характеризации ранее разработанной кандидатной вакцины против ВИЧ-1, представляющей собой ректальные суппозитории, содержащие лиофилизированную биомассу клеток аттенуированного штамма Salmonella enteritidis Е23, трансформированных ДНК-вакциной pcDNA-TCI, несущей ген искусственного белка TCI.

Прежде всего, были проведены исследования, связанные с доказательствами безопасности и безвредности полученной кандидатной вакцины.

В результате этих работ было показано, что введение плазмиды ДНК-вакцины в состав S. enteritidis Е23 не повлияло на фенотип аттенуированого рекомбинантного штамма. П£ биохимическим и антигенным характеристикам штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI полностью соответствует родительскому.

Исследование персистенции рекомбинантного штамма S. enteritidis i?25/pcDNA-TCI показало, что штамм обладает пониженной способностью к размножению в организме млекопитающих. Среди мышей, которым клетки сальмонеллы вводили перректально, не наблюдали гибели животных. Рекомбинантный штамм, также как исходный, не был выделен из крови и легких иммунизированных животных. В ткани тонкого кишечника микробные клетки обнаруживались 4 дня, в пейеровых бляшках-в течение 15 дней. Наиболее длительно штаммы сальмонеллы сохранялись в селезенке мышей, однако и из этого органа штамма S. enteritidis .E2.?/pcDNA-TCI элиминировался через 63 дня после однократного и через 70 дней после двукратного введения. Этот факт указывает на то, что аттенуированный штамм S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, также как исходный, в конечном итоге удаляется из организма под действием иммунной системы.

Исследования патогенности штаммов Salmonella enteritidis Е-23 и Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI, проведенные совместно с сотрудниками НИЦ ТБП Минздрава РФ, показали, что оба штамма являются невирулентными, малотоксичными и нетоксигенными для теплокровных животных. На основании полученных данных эксперты НИЦ ТБП сделали заключение о том, что данные штаммы Salmonella не представляют опасности для здоровья человека, т.е. относятся к первой категории риска

Федеральный закон «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности» №86-ФЗ от 5 июля 1996 года, ст. 7).

Кроме того, было показано, что ректальные суппозитории, содержащие вмешанную в суппозиторную основу лиофилизированную биомассу клеток штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущих антиВИЧ-ДНК-вакцину, обеспечивают формирование специфического иммунного ответа.

Закономерным является вопрос о механизме доставки ДНК-вакцины с помощью аттенуированных бактерий при перректальном способе введения и механизме активации под действием ДНК-вакцины иммунного ответа. На наш взгляд, механизм попадания рекомбинантной сальмонеллы в организм и реализации ее иммуногенной активности может быть следующим (гипотетическая схема приведена на рисунке 14).

После перректальной иммунизации сальмонелла проникает в организм через М-клетки кишечника, которые представлены в слизистой как тонкого, так и толстого кишечника, захватывается макрофагами и по лимфатической системе переносится этими клетками в региональные органы иммунной системы, включая пейеровы бляшки. Далее происходит лизис сальмонеллы в макрофагах (в частности, благодаря аттенуации), в результате которого плазмида попадает в ядр макрофага, где обеспечивает экспрессию целевого гена, синтез целевого белка и как следствие, индукцию специфического клеточного, гуморального и мукозального иммунного ответа.

В данном исследовании, при использовании аттенуированной S. enteritidis Е23 в качестве вектора для доставки pcDNA-TCI, была показана экспрессия гена TCI в пейеровых бляшках с помощью ОТ-ПЦР. Эти результаты подтверждают правильность вышеуказанной гипотезы и демонстрируют, что сальмонелла способна доставлять плазмиду в антигенпрезентирующие клетки кишечника при перректальной иммунизации. ген TCI

Ар

Клетки Salmonella, несущие плазмиду pcDNA-TCI

Ч.

Проникновение клеток Salmonella в ткани

Гастроинтерстициональный тракт ftmw^^jmmim

Трансформация клеток

Salmonella

Бактериальный лизис

Перректальная иммунизация

Индукция плазматических Т-хелперных клеток а TCR

Антиген

Индукция цитотоксического, гуморального и мукозального иммунного ответа

Рис. 14. Гипотетическая схема доставки и экспрессии плазмидной ДНК, несущей ген TCI, при использовании в качестве вектора доставки сальмонеллы

Перректальное введение мышам суппозиториев, содержащих 108 клеток Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, индуцирует у иммунизированных животных:

1) клеточный иммунный ответ, оцениваемый по увеличению количества спленоцитов иммунизированных животных, продуцирующих IFN-y при их стимуляции in vitro специфическими пептидами и белком TCI. Это в свою очередь, предполагает антигенспецифическую активацию CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов.

2) гуморальный иммунный ответ, определяемый по наличию антител класса IgG и IgA к лизату нативных белков ВИЧ-1, а также к рекомбинантному белку TCI.

Приведенные выше результаты свидетельствуют о том, что при ДНК-иммунизации с использованием суппозиториев, содержащих клетки Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, реализуются все стадии, необходимые для доставки целевого иммуногена иммунной системе, а именно экспрессия гена TCI, процессинг и представление целевого белка и его отдельных эпитопов Т- и В-лимфоцитам.

Таким образом, в результате проделанной работы получены новые данные, подтверждающие безвредность и эффективность кандидатной вакцины против ВИЧ-1 в виде суппозиториев, содержащих лиофилизированную биомассу клеток штамма 5. еМегШсИз Е23/рсЭКА-ТС1. Полученные данные позволяют предполагать, что кандидатная вакцина может быть эффективна в клинической практике для вакцинации против ВИЧ-1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Даниленко, Алексей Валерьевич, Кольцово

1. Бойченко М.Н., Воробьев A.A., Гусев В.В., Тымчук С.Н. Возможность использования мутантов суа и сгр сальмонелл в качестве векторов рекомбинантной вакцины орального применения. // Вестн. РАМН. 1994 - №4 - С.62-63.

2. Бойченко М.Н., Воробьев A.A., Тымчук С.Н. Перспектива получения мутантов суа и сгр сальмонелл для использования в качестве вакцинных штаммов // Вестн. РАМН. 1995 - №10 - С.37-39.

3. Бойченко, М.Н., Воробьев, A.A. Использование сальмонелл в качестве вектора при создании рекомбинантных вакцин // Вестник РАМН 1997 - №23 - С.43-46.

4. Бондаренко В.М., Воробьев A.A., Белявская В.А. Векторные мукозальные бактериальные вакцины: проблемы и перспективы // ЖМЭИ 2002 - №6 - С.5-9.

5. Гудима Г.О., Сидорович И.Г., Карамов Э.В., Решетников A.B., Хаитов P.M. Опыт клинических испытаний анти-ВИЧ/СПИД-вакцин // Иммунология 2008 - Т. 29. - №5-С.252-263.

6. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Некрасова H.A., Белавин П.А., Данилюк Н.К., Серегин C.B., Бабкина И.Н., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Бойченко М.Н., Воробьев

7. Карамов Э.В., Гарманова A.B., Хаитов P.M. Мукозный иммунитет и его особенности // Иммунология. 2008 - №6. - С.377-384.

8. Карпенко, Л.И., Игнатьев, Г.М., Кожина, Е.М. и др. Получение и исследование рекомбинантных штаммов Salmonella typhimurium SL 7207, продуцирующих HbcAg HbcAg-HBs. // Вопр. вирусологии 2000 - №2 - С.43-46.

9. Кузнецова Т.Н., Хазиев А.Ф., Кунягина О.В. Лекарственный препарат для профилактики и лечения урогенитальных инфекций. Патент РФ № 2185842, опубл. 27.07.02. Бюл №21.

10. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Даниленко Е.Д., Рыжиков А.Б., Бажан С.И., Масычева В.И., Ильичев A.A. Молекулярные конструкции нанобиочастиц для вакцинологии // Российский иммунологический журнал.-2008. Т.2 (11).- №2-3- С. 337.

11. Некрасова, H.A., Игнатьев, Г.М., Агафонов, А.П., Ильичев, A.A., Карпенко Л.И. Исследование системного и мукозального иммунного ответа при иммунизации мышей кандидатной ВИЧ-1 вакциной // Сибирский медицинский журнал. 2004 - Т. 19 - N. 2 -С.60-62.

12. Рыжова С.А. Получение авирулениного мутанта S. enteritidis и изучение его биологических свойств. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Москва -1997 г.

13. Сорокин C.B., Аваков А.Э. Лекарственный препарат и способ профилактики и лечения урогенитальных инфекций. Патент РФ № 2073520, опубл. 20.02.97. Бюл. № 5

14. Хертеленди Жольт Иштван, Вейнер Муррэй. Вакцина против урогенитальных инфекций на основе вагинального суппозитория. Патент РФ № 2224542, опубл. 27.02.04. Бюл № 6

15. Холодков С.В., Холодкова Т.П., Вайншток И.П., Литвинов В.В. Суппозитории бактериальных препаратов и способ их получения. Патент РФ № 2228738, опубл. 20.05.04. Бюл № 15.

16. Allen, Т., Mortara, L., Mothe, В., Liebl, M., Jing, P., Calore, В. et al. Tat-vaccinated macaques do not control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication // J. Virol. -2002 N. 76 - P. 4108^-112.

17. Bachtiar, EW, Coloe, PJ, Smooker, PM. Construction and immunogenicity of Salmonella vaccine vector expressing HIV-1 antigen and MCP3 // Acta Microbiol. Immunol. Hung. 2009 - V. 56 - N. 4 - P. 403-415.

18. Barnett, S., Srivastava, I., Kan, E., Zhou, F., Goodsell, A., Cristillo, A. et al. Protection of macaques against vaginal SHIV challenge by systemic or mucosal and systemic vaccinations with HIV-envelope // AIDS 2008 - N. 22 - P.339-348.

19. Barouch, D., Santra, S., Schmitz, J., Kuroda, M., Fu, Т., Wagner, W. et al. Control of viremia and prevention of clinical AIDS in rhesus monkeys by cytokineaugmented DNA vaccination // Science 2000 - N. 290 - P. 486-492.

20. Bayard, F., Malmassari, S., Deng, Q., Lone, Y., Michel, M. Hepatitis B virus (HBV)-derived DRB1 *0101-restricted CD4 T-cell epitopes help in the development of HBV-specific CD8+ T cells in vivo. // Vaccine. 2010 V. 14 - N. 28 - P. 3818-3826.

21. Bei, R., Scardino, A. TAA polyepitope DNA-based vaccines: a potential tool for cancer therapy. //J. Biomed. Biotechnol. 2010 - N. 2010 - P. 102758.

22. Bellino, S., Francavilla, V., Longo, O., Tripiciano, A., Paniccia, G., Arancio, A. et al. Parallel conduction of the phase I preventive and therapeutic trials based on the Tat vaccine candidate // Rev. Recent Clin. Trials 2009 - N. 4 - P. 195-204.

23. Belyakov, I.M, Ahlers, J.D, Nabel, G.J, Moss, B., Berzofsky, J.A Generation of functionally active HIV-1 specific CD8+ CTL in intestinal mucosa following mucosal, systemic or mixed prime-boost immunization// Virology 2008 -N. 381 - P. 106-115.

24. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. // Ann. NY Acad. Sci. 2012 - N. 1247 - P. 97116.

25. Bergey s Manual of Determinative Bacteriology / Eds G.J. Holt et al. 9 th ed. Baltimore, USA, 1994.

26. Borras-Cuesta, F., Petit-Camurdan, A., Fedon, Y. Engineering of immunogenic peptides by co-linear synthesis of determinants recognized by B and T cells // Eur. J. Immunol. 1987 -V. 17-N. 8-P. 1213-1215.

27. Brandtzaeg, P. Mucosal immunity: induction, dissemination, and effector functions // Scand J Immunol. 2009 - V. 70 - N.6 - P. 505-515.

28. Brett, S., Rhodes, J., Liew, F., Tite, J. Comparison of antigen presentation of influenza A nucleoprotein expressed in attenuated AroA- Salmonella typhimurium with that of live virus.//J Immunol. 1993 -V. 150-N. 7-P. 2869-2884.

29. Browning, M., Reid, G., Osborne, R., Jarrett, O. Incorporation of soluble antigens into ISCOMs: HIV gpl20 ISCOMs induce virus neutralizing antibodies//Vaccine 1992 -N. 10 -P. 585-590.

30. Burton, D., Moore, J. Why do we not have an HIV vaccine and how can we make one? // Nat. Med. 1998 - N. 4 - P. 495^198.

31. Burton, D., Weiss, R. AIDS/HIV. A boost for HIV vaccine design // Science 2010 -N. 329-P. 770-773.

32. Cafaro, A., Caputo, A., Fracasso, C., Maggiorella, M., Goletti, D., Baroncelli, S. et al. Control of SHIV-89.6P-infection of cynomolgus monkeys by HIV-1 Tat protein vaccine // Nat. Med. 1999 - N.5 - P. 643-650.

33. Calarota, S., Dai, A., Trocio, J., Weiner, D., Lori, F., Lisziewicz, J. IL-15 as memory Tcell adjuvant for topical HIV-1 DermaVir vaccine // Vaccine 2008 - N. 26 - P. 5188-5195.

34. Caputo, A., Gavioli, R., Bellino, S., Longo, O., Tripiciano, A., Francavilla, V. et al. HIV-1 Tat-based vaccines: an overview and perspectives in the field of HIV/AIDS vaccine development // Int. Rev. Immunol. 2009 - N. 28 - P. 285-334.

35. Caputo, A., Gavioli, R., Ensoli, B. Recent advances in the development of HIV-1 Tat-based vaccines // Curr. HIV Res. 2004 - N. 2 - P. 357-376.

36. Chhatbar C, Mishra R, Kumar A, Singh SK. HIV vaccine: hopes and hurdles. // Drug Discov Today. 2011 - V.16 - N.21-22 - P. 948-956.

37. Choi, J., Shin, D., Ryu, S. Salmonella enterica serovar Typhimurium ruvB mutant can confer protection against salmonellosis in mice. // Vaccine 2010 - V. 28 - N. 39 - P. 64366444.

38. Cicin-Sain, L., Brune, W., Bubic, I., Jonjic, S., Koszinowski, UH. Vaccination of mice with bacteria carrying a cloned herpesvirus genome reconstituted in vivo. // J Virol. 2003 -V. 77-N. 15 - P. 8249-8255.

39. Cohen, J. Public health. AIDS vaccine trial produces disappointment and confusion // Science 2003 -N. 299-P. 1290-1291.

40. Corey, L., McElrath, M. HIV vaccines: mosaic approach to virus diversity //Nat. Med. 2010-N. 16-P. 268-270.

41. Cranage, M., Whatmore, A., Sharpe, S., Cook, N., Polyanskaya, N., Leech, S., et al. Macaques infected with live attenuated SIVmac are protected against superinfection via the rectal mucosa // Virology 1997-N. 229 - P. 143-154.

42. Cribbs, D. Abeta DNA vaccination for Alzheimer's disease: focus on disease prevention. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 2010 - V. 9 - N. 2 - P. 207-216.

43. Czerkinsky, C., Nilsson, L., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. "A solidphase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells//J. Immunol. Methods 1983 - V.65 -N.l-2 - P. 109-121.

44. Darji, A., Guzman, C.A, Gerstel, B., Wachholz, P., Timmis, K.N, Wehland, J., Chakraborty T., Weiss, S. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium //Cell 1997 -N. 91 - P. 765-775.

45. Davis, N., Caley, I., Brown, K., Betts, M., Irlbeck, D., McGrath, K. et al. Vaccination of macaques against pathogenic simian immunodeficiency virus with Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles // J. Virol. 2000 - N. 74 - P. 371-378.

46. Devico, A., Fouts, T., Shata, M., Kamin-Lewis, R., Lewis, G., Hone, D. Development of an oral prime-boost strategy to elicit broadly neutralizing antibodies against HIV-1. // Vaccine. 2002 - V. 20 - N. 15 - P. 1968-1974

47. Dileo, J., Miller, T., Chesnoy, S., Huang, L. Gene transfer to subdermal tissues via a new gene gun design // Hum. Gene Ther. 2003 - N. 14 - P. 79-87.

48. Doan, L., Li, M., Chen, C., Yao, Q. Virus-like particles as HIV-1 vaccines // P^ev. Med. Virol. 2005 - N. 15 - P.75-88.

49. Dougan, G., Maskell, D., Pickard, D., Hormaeche, C. Isolation of stable aroA mutants of Salmonella typhi Ty2: properties and preliminary characterisation in mice // Mol. Gen. Genet. 1987 - V. 207 - N. 2-3 - P. 402-405.

50. Emini, E., Nara, P., Schleif, W., Lewis, J., Davide, J., Lee, D. et al. Antibodymediated in vitro neutralization of human immunodeficiency virus type 1 abolishes infectivity for chimpanzees // J. Virol. 1990 - N. 64 - P. 3674-3678.

51. Ensoli, B., Fiorelli, V., Ensoli, F., Lazzarin, A., Visintini, R., Narciso, P. et al. The preventive phase I trial with the HIV-1 Tat-based vaccine // Vaccine 2009 - N. 28 - P. 371378.

52. Eroshkin A.M., Karginova E.A., Gileva I.P. et al. Design of four-helical protein as a candidate for HIV vaccine. // Protein Engeneering-1995- 8- p. 167-173.

53. Fischer, W., Perkins, S., Theiler, J., Bhattacharya, T., Yusim, K., Funkhouser, R. et al. Polyvalent vaccines for optimal coverage of potential T-cell epitopes in global HIV-1 variants //Nat. Med. 2007 -N. 13 - P. 100-106.

54. Flynn, N., Forthal, D., Harro, C., Judson, F., Mayer, K., Para, M. Placebocontrolled phase 3 trial of a recombinant glycoprotein 120 vaccine to prevent HIV-1 infection // J. Infect. Dis. 2005 - N. 191 - P. 654-665.

55. Fultz, P., Nara, P., Barre-Sinoussi, F., Chaput, A., Greenberg, M., Muchmore, E. et al. Vaccine protection of chimpanzees against challenge with HIV-1-infected peripheral blood mononuclear cells // Science 1992 - N. 256 - P. 1687-1690.

56. Gahan, ME., Webster, DE., Wijburg, OL., Wesselingh, SL., Strugnell, RA. Impact of prior immunological exposure on vaccine delivery by Salmonella enterica serovar Typhimurium // Vaccine. 2008 - V. 26 - N. 49 - P. 6212-6220.

57. Gallo, R.C. A reflection on HIV/AIDS research after 25 years // Retrovirology. -2006.-V.20-P.3-72.

58. Gao, F., Liao, H., Hahn, B., Letvin, N., Korber, B., Haynes, B. Centralized HIV-1 envelope immunogens and neutralizing antibodies // Curr. HIV Res. 2007 - N 5 - P. 572577.

59. Gao, F., Weaver, E., Lu, Z., Li, Y., Liao, H., Ma, B. et al. Antigenicity and immunogenicity of a synthetic human immunodeficiency virus type 1 group m consensus envelope glycoprotein // J. Virol. 2005 - N. 79 - P. 1154-1163.

60. Gauduin, M., Glickman, R., Ahmad, S., Yilma, T., Johnson, R. Immunization with live attenuated simian immunodeficiency virus induces strong type 1 T helper responses and beta-chemokine production//Proc. Natl. Acad. Sci. 1999 - N. 96 - P. 14031-14036.

61. Girard, M., Kieny, M., Pinter, A., Barre-Sinoussi, F., Nara, P., Kolbe, H., et al. Immunization of chimpanzees confers protection against challenge with human immunodeficiency virus // Proc. Natl. Acad. Sei. 1991 - N. 88 - P.542-546.

62. Girard, M., Meignier, B., Barre-Sinoussi, F., Kieny, M., Matthews, T., Muchmore, E., et al. Vaccine-induced protection of chimpanzees against infection by a heterologous human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 1995 - N. 69 - P. 6239-6248.

63. Girard, MP., Osmanov, SK., Kieny, MP. A review of vaccine research and development: the human immunodeficiency virus (HIV) // Vaccine. 2006 - V. 24 - N. 19 -P. 4062-4081.

64. Goldstein, G. HIV-1 Tat protein as a potential AIDS vaccine // Nat. Med. 1996 - N.2 - P. 960-964.

65. Graham, B., Koup, R., Roederer, M., Bailer, R., Enama, M., Moodie, Z. et al. Phase 1 safety and immunogenicity evaluation of a multiclade H1V-1 DNA candidate vaccine // J. Infect. Dis. 2006 - N. 194-P. 1650-1660.

66. Gregg MR, Jack DB, Smith SR, Kendall MJ. The pharmacokinetics of oxprenolol following oral and rectal dosing—a comparison of delivery systems and routes of administration. Iii Clin Pharm Ther. 1987 - V. 12 - N. 2 - P. 91-99.

67. Hanke, T„ Schneider, J., Gilbert, S., Hill, A., McMichael, A. DNA multi-CTL epitope vaccines for HIV and Plasmodium falciparum: immunogenicity in mice // Vaccine 1998 -V.16-N. 4-P. 426-435.

68. Hanrahan, J., Wormser, G., Maguire, G., Delorenzo, L., Gavis G. Opportunistic infections in prisoners. // N. Engl. J. Med. 1982. - V. 19 - N. 307 (8) - P. 498.

69. Haut, L., Ertl, H. Obstacles to the successful development of an efficacious T cell-inducing HIV-1 vaccine. // J Leukoc Biol. 2009 - V.86 - N.4 - P. 779-793.

70. Hirao, L., Wu, L., Khan, A., Hokey, D., Yan, J., Dai, A. et al. Combined effects of IL-12 and electroporation enhances the potency of DNA vaccination in macaques // Vaccine -2008 -N. 26 -P. 3112-3120.

71. Hirao, L., Wu, L., Khan, A., Satishchandran, A., Draghia-Akli, R., Weiner, D. Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques // Vaccine 2008 - N. 26 - P. 440-448.

72. Ho, J., Uger, R., Zwick, M., Luscher, M., Barber, B., MacDonald, K. Conformational constraints imposed on a pan-neutralizing HIV-1 antibody epitope result in increased antigenicity but not neutralizing response // Vaccine 2005 - N. 23 - P. 1559-1573.

73. Hoiseth, SK, Stacker, BA Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are nonvirulent and effective as live vaccines //Nature. 1981 - V. 291 - N. 5812 - P. 238-239.

74. Hoxie, J. Toward an antibody-based HIV-1 vaccine // Annu. Rev. Med. 2010 - N. 61 -P. 135-152.

75. Hurwitz, J., Slobod, K., Lockey, T., Wang, S., Chou, T., Lu, S. Application of the polyvalent approach to HIV-1 vaccine development // Curr Drug Targets Infect Disord 2005 -N. 5 - P. 143-156.

76. Ingale, S., Gach, J., Zwick, M., Dawson, P. Synthesis and analysis of the membrane proximal external region epitopes of HIV-1 Hi. Pept. Sci.-2010-N. 16 P. 716-722.

77. Jepson, MA, Clark, MA. The role of M cells in Salmonella infection. // Microbes Infect.-2001 V.3-N. 14-15-P. 1183-1190.

78. Joag, S., Liu, Z., Stephens, E., Smith, M., Kumar, A., Li, Z., et al. Oral immunization of macaques with attenuated vaccine virus induces protection against vaginally transmitted AIDS//J. Virol. 1998 -N. 72-P. 9069-9078.

79. Johnson, R., Glickman, R., Yang, J., Kaur, A., Dion, J., Mulligan, M., et al. Induction of vigorous cytotoxic T-lymphocyte responses by live attenuated simian immunodeficiency virus// J. Virol. 1997 - N. 71 - P. 7711-7718.

80. Kim, J., Rerks-Ngarm, S., Excler, J., Michael, N. HIV vaccines: lessons learned and the way forward. Curr Opin HIV AIDS. 2010 - V. 5 -N. 5 - P. 428-434

81. Kim, M., Qiao, Z., Yu, J., Montefiori, D., Reinherz, E. Immunogenicity of recombinant human immunodeficiency virus type 1 -like particles expressing gp41 derivatives in a pre-fusion state//Vaccine-2007-N. 25-P. 5102-5114.

82. Koff, W., Johnson, P., Watkins, D., Burton, D., Lifson, J., Hasenkrug, K., et al. HIV vaccine design: insights from live attenuated SIV vaccines // Nat. Immunol. 2006 - N. 7 - P. 19-23.

83. Lenz, O., Dittmar, M., Wagner, A., Ferko, B., Vorauer-Uhl, K., Stiegler, G. et al. Trimeric membrane-anchored gp41 inhibits HIV membrane fusion. J. Biol. Chem. 2005 - N. 280 -P. 4095-4101.

84. Letvin, N. Progress toward an HIV vaccine // Annu. Rev. Med. 2005 - N. 56 - P. 213-223.

85. Lewis, G. Challenges of antibody-mediated protection against HIV-1 // Expert Rev. Vaccines 2010 - N. 9 - P. 683-687.

86. Li, C., Friedman, D., Wang, C., Metelev, V., Pardee, A. Induction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 Tat protein // Science 1995 - N. 268 - P. 429-431.

87. Lian, Y., Srivastava, I., Gomez-Roman, V., Zur Megede, J., Sun, Y., Kan, E. et al. Evaluation of envelope vaccines derived from the South African subtype C human immunodeficiency virus type 1 TV 1 strain // J. Virol. 2005 - N. 79 - P. 13338-13349.

88. Lu, S., Grimes Serrano, J., Wang, S. Polyvalent AIDS vaccines // Curr HIV Res -2010-N. 8 P. 622-629.

89. Maggiorella, M., Baroncelli, S., Michelini, Z., Fanales-Belasio, E., Moretti, S., Sernicola, L. et al. Long-term protection against SHIV89.6P replication in HIV-1 Tat vaccinated cynomolgus monkeys // Vaccine 2004 - N. 22 - P. 3258-3269.

90. McBurney, S., Ross, T. Human immunodeficiency virus-like particles with consensus envelopes elicited broader cell-mediated peripheral and mucosal immune responses than polyvalent and monovalent Env vaccines // Vaccine 2009 - N.27 - P. 4337-4349.

91. McGhee, JR., Kiyono, H. New perspectives in vaccine development: mucosal immunity to infections // Infect Agents Dis. 1993 - V.2 - N. 2 - P. 55-73.

92. Nabel, G. Immunology. Close to the edge: neutralizing the HIV-1 envelope // Science -2005 -N. 308 P. 1878-1879.

93. Pantophlet, R., Burton, D. GP120: target for neutralizing HIV-1 antibodies // Annu. Rev. Immunol. 2006 - N. 24 - P.739-769.

94. Pauza, C., Trivedi, P., Wallace, M., Ruckwardt, T., Le Buanec, H., Lu, W. et al. Vaccination with tat toxoid attenuates disease in simian/HIV-challenged macaques // Proc. Natl. Acad. Sci. -2000-N. 97 P. 3515-3519.

95. Picker, L., Hansen, S., Lifson, J. New paradigms for HIV/AIDS vaccine development. // Annu Rev Med. 2012 - V. 63 - P. 95-111.

96. Publicover, J., Ramsburg, E., Rose, J. A single-cycle vaccine vector based on vesicular stomatitis virus can induce immune responses comparable to those generated by a replication-competent vector // J. Virol. 2005 - N. 79 - P. 13231-13238.

97. Qu, D., Wang, S., Cai, W., Du, A. Protective effect of a DNA vaccine delivered in attenuated Salmonella typhimurium against Toxoplasma gondii infection in mice. // Vaccine -2008-N. 26- P. 4541-4548.

98. Ramshaw, 1., Ramsay, A. The prime-boost strategy: exciting prospects for improved vaccination//Immunol. Today 2000-N. 21 - P. 163-165.

99. Raupach, B., Kaufmann, S. Bacterial virulence, proinflammatory cytokines and host immunity how to choose the appropriate Salmonella vaccine strain? // Microbes Infcct. 2001 -N. 3 - P. 1261-1269.

100. Reed, L. and Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints.// Am. J. Hygiene. 1938. - №27. - P.493-497.

101. Robinson, H. DNA vaccines: basic mechanism and immune responses // Int. J. Mol. Med. 1999 - N. 4 - P. 549-555.

102. Rosa, D., Ribeiro, S., Almeida, R., Mairena, E., Postol, E., Kalil, J. et al. A DNA vaccine encoding multiple HIV CD4 epitopes elicits vigorous polyfunctional, long-lived CD4 and CD8 T cell responses. // PLoS One 2011 - N. 6 - P. e 16921.

103. Ryzhova, S., Boichenko, M. Study of stability of the avirulent phenotype and ability to the limited persistence in the mice of the avirulent mutant of Salmonella enteritidis // Biull. Eksp. Biol. Med. 1997-V. 124-N.10 - P. 429-431.

104. Schadeck, E., Sidhu, M., Egan, M., Chong, S., Piacente, P., Masood, A. et al. A dose sparing effect by plasmid encoded 1L-12 adjuvant on a SIVgag-plasmid DNA vaccine in rhesus macaques // Vaccine 2006 - N. 24 - P. 4677^1687.

105. Schief, W., Ban, Y., Stamatatos, L. Challenges for structure-based HIV vaccine design // Curr. Opin. HIV AIDS 2009 - N. 4 - P. 431^140.

106. Seaman, M., Xu, L., Beaudry, K., Martin, K., Beddall, M., Miura, A. et al. Multiclade human immunodeficiency virus type 1 envelope immunogens elicit broad cellular and humoral immunity in rhesus monkeys // J. Virol. 2005 N. 79 - P. 2956-2963

107. Shata, M., Hone, D. Vaccination with a Shigella DMA vaccine vector induces antigen-specific CD8(+) T cells and antiviral protective immunity. // J. Virol. 2001 - V. 75 - N. 20 -P. 9665-9670.

108. Shata, M., Reitz, M., DeVico, A., Lewis, G., Hone, D. Mucosal and systemic HIV-1 Env-specific CD8(+) T-cells develop after intragastric vaccination with a Salmonella Env DNA vaccine vector. // Vaccine 2001 - V. 20 - N.3-4 - P. 623-629.

109. Shata, MT., Stevceva, L., Agwale, S., Lewis, GK., Hone, DM. Recent advances with recombinant bacterial vaccine vectors // Mol Med Today. 2000 - V.6 - 2 - P. 66-71.

110. Shi, W., Bohon, J., Han, D., Habte, H., Qin, Y., Cho, M. et al. Structural characterization of HIV gp41 with the membrane-proximal external region // J. Biol. Chem. -2010 -N. 285 P. 24290-24298

111. Spearman, P., Kalams, S., Elizaga, M., Metch, B., Chiu, Y.L, Allen, M. et al. Safety and immunogenicity of a CTL multiepitope peptide vaccine for HIV with or without GM-CSF in a phase I trial // Vaccine 2009 - N. 27 - P. 243-249.

112. Spreng, S., Dietrich, G., Weidinger, G. Rational design of Salmonella-based vaccination strategies. //Methods. 2006 - V. 38 -N. 2 - P. 133-143.

113. Thomson, S., Jaramillo, A., Shoobridge, M., Dunstan, K., Everett, B., Ranasinghe, C. et al. Development of a synthetic consensus sequence scrambled antigen HIV-1 vaccine designed for global use. Vaccine 2005;23:4647-57.

114. Tijssen P., Practice and theory of enzyme immunoassays. 1985, Amsterdam; New York: Elsevier ; New York, USA : Sole distributors for the USA and Canada, Elsevier Science Pub. Co. 502.

115. Vasan, S., Schlesinger, S., Chen, Z., Hurley, A., Lombardo, A., Than, S. et al. Phase 1 safety and immunogenicity evaluation of ADMVA, a multigenic, modified vaccinia Ankara-HI V-l B'/C candidate vaccine // PLoS One 2010 - N. 5 - P. e 8816.

116. Vassilieva, E., Wang, B., Vzorov, A., Wang, L., Wang, Y., Bozja, J. et al. Enhanced Mucosal Immune Responses to HIV Virus-Like Particles Containing a Membrane-Anchored Adjuvant //MBio- 2011 V.2-N. 1 -e00328-10. doi: 10.1128.

117. Veazey, R., Marx, P., Lackner, A. The mucosal immune system: primary target for HIV infection and AIDS. // Trends Immunol. 2001 - V. 22 - N. 11 - P. 626-633.

118. Wan, J., Wang, C., Wen, X., Huang, X., Ling, S., Huang, Y., Cao, S. Immunogenicity of a DNA vaccine of Avian Reovirus orally delivered by attenuated Salmonella typhimurium. // Res. Vet. Sci. 2011 - V. 91 - N. 3 - P. 382-383.

119. Wang, B., Ugen, K., Srikantan, V., Agadjanyan, M., Dang, K., Refaeli, Y. et al. Gene inoculation generates immune responses against human immunodeficiency virus type 1 // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993 - N. 90 - P. 4156^1160.

120. Woo, PC., Wong, LP., Zheng, BJ., Yuen, KY. Unique immunogenicity of hepatitis B virus DNA vaccine presented by live-attenuated Salmonella typhimurium // Vaccine. 2001 -V. 19 - N. 20-22 - P. 2945-2954.

121. Wyand, M., Manson, K., Montefiori, D., Lifson, J., Johnson, R., Desrosiers, R. Protection by live, attenuated simian immunodeficiency virus against heterologous challenge Hi. Virol. 1999-N. 73 - P. 8356-8363.

122. Xu, R., Megati, S., Roopchand, V., Luckay, A., Masood, A., Garcia-Hand, D. et al. Comparative ability of various plasmid-based cytokines and chemokines to adjuvant the activity of HIV plasmid DNA vaccines // Vaccine 2008 - N. 26 - P. 4819-4829.

123. Yasutomi, Y., Robinson, H., Lu, S., Mustafa, F., Lekutis, C., Arthos, J. et al. Simian immunodeficiency virus-specific cytotoxic T-lymphocyte induction through DNA vaccination of rhesus monkeys // J. Virol. 1996 - N. 70 - P. 678-681.

124. Yin, J., Dai, A., Lecureux, J., Arango, T., Kutzler, M., Yan, J. et al. High antibody and cellular responses induced to HIV-1 clade C envelope following DNA vaccines delivered by electroporation // Vaccine 2010

125. Zhao, C., Sun, Y., Zhao, Y., Wang, S., Yu, T., Du, F., Yang, X., Luo, E. Immunogenicity of a multi-epitope DNA vaccine against hantavirus // Hum. Vaccin. Immunother. 2012-V. 1 -N. 8(2).

126. Zhu, P., Liu, J., Bess, Jr., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H. et al. Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes // Nature 2006 - N. 441 - P. 847852.

Информация о работе

Даниленко, Алексей Валерьевич
кандидата биологических наук
Кольцово, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы