Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование иммуногенности полиэпитопных ВИЧ-1 антигенов с использованием разных систем доставки
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Исследование иммуногенности полиэпитопных ВИЧ-1 антигенов с использованием разных систем доставки"
На правах рукописи
Некрасова Надежда Александровна
ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ ПОЛИЭПИТОПНЫХ ВИЧ-1 АНТИГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗНЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ
03.00.03 — молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Кольцове — 2006
Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей п благополучия человека Мнпэдравсоцразвптия России.
Научный руководитель:
кандидат биологических наук Карпенко Лариса Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович кандидат биологических наук Ильичева Татьяна Николаевна
Ведущая организация:
Институт цитологи и и генетпкн СО РАН, г, Новосибирск
Защита состоится «28 декабря» 2006 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии н биотехнологии «Вектор» по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559, тел.(383) 336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан 24 ноября 2006 года.
Ученый секретарь диссертационного совета
Малыгнн Э.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемый вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), стая известен более 20 лет назад. На сегодняшний день СПИД является одним из наиболее серьезных инфекционных заболеваний, занимая четвертое место по количеству смертельных исходов.
Начавшаяся в 80-ых годах эпидемия ВИЧ-инфекции, по оценочным данным ВОЗ, к настоящему времени унесла жизни 14 млн. жителей Земли. Еще 40,3 млн. человек к концу 2005 года были инфицированы ВИЧ. Причем Россия занимает одно из лидирующих мест по темпам роста инфицирования.
Учитывая стремительное распространение эпидемии СПИДа, как во всем мире, так и в России, задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение. В разработке вакцины против ВИЧ-1 были задействованы различные формы вирусного антигена, включая инактивированный вирус, модифицированный вирус, аттенуированный вирус, нативные и генноинженерные белки, синтетические пептиды, а также различные способы представления целевого иммуногена иммунной системе человека [Spearman Р. 2006, Bulgers W.A. et al. 2006, Young K.R. et al, 2006]. Однако проблема создания анти-ВИЧ вакцины до сих пор не решена.
Весьма перспективное направление создания новой генерации эффективных и безопасных вакцин основано на идентификации в вирусных белках Т- и В-клеточных эпигонов и конструирование на их основе синтетических полиэпитопных вакцин.
В ГНЦ ВБ «Вектор» данный подход использовался при конструировании четырех-а-спирального искусственного белка TBI (Т and В cell epitopes containing immunogen) и поли-ЦТЛ-эшпопного белка TCI (Т cell immunogen) [Eroshkin A.M. et al. 1995, Bazhan S.I. et al. 2004]. При иммунизации искусственным белком TBI происходила индукция ВИЧ-специфического иммунного ответа, однако для этого требовалось применение адъювантов. Иммунизация «голой» ДНК вакциной, кодирующую белок TCI, вызывает слабую индукцию иммунитета. Во всем мире проводятся интенсивные исследования по повышению эффективности ДНК вакцинации. Прежде всего, эти исследования направлены на разработку схем иммунизации и систем доставки вакцины.
Одним из требований, предъявляемых к создаваемым анти-ВИЧ вакцинам, является способность индуцировать му ко зальный иммунный ответ. Известно, что при парентеральном введении вакцинных препаратов обычно не происходит стимуляции иммунитета на слизистых оболочках или он очень низок [Robinson H.L. et al. 1999, Kozlowski P.A. et al. 2003]. Поэтому получение конструкций, вводимых через слизистые и способных эффективно активировать их иммунитет, на сегодняшний день является актуальной задачей.
Цель работы.
Разработка средств доставки полиэгпггопных имму но генов TBI и TCI и исследование иммупогениых свойств созданных кандидатных вакцин против ВИЧ-1.
Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
• Получить и исследовать имму ноге иные свойства искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ), экспонирующих на своей поверхности рекомбинантный белок GST-TBI.
• На основе аттенуироваиных штаммов сальмонелл получить реком-бииантные штаммы, продуцирующие белок TBI, Оценить стабильность плазмиды pGEX-TBI в клетках сальмонелл. Исследовать иммуногенные свойства ре ком 5 и нантных сальмонелл, включая мукозальный ответ.
• Сконструировать ДНК вакцину, обеспечивающую синтез белка TBI в эукариотических клетках. Исследовать ее иммуногенность в составе ВПЧ и аттенуироваиных штаммов сальмонелл.
• Получить ВПЧ и аттенуированные штаммы сальмонелл, несущие ДНК вакцину pcDNA-TCI. Изучить иммуногенные свойства полученных конструкций.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Вирусоподобные частицы, экспонирующие на своей поверхности рекомбинантный белок GST-TBI, при иммунизации лабораторных животных стимулируют специфический иммунный ответ, который по величине сопоставим с эффектом использования полного адьюванта Фрейнда,
2. Введение мышам рекомбинантных штаммов сальмонеллы Salmonella mteritidis Е-23 и Salmonella typhimurium SL 7207, продуцирующих белок GST-TBI, приводит к индукции как системного, так и мукозальнош ВИЧ-специфического иммунитета.
3. При ДНК вакцинации конструкицей pcDNA-TCI регистрируется специфический иммунный ответ. Использование систем доставки ДНК вакцины (ВГТЧ и аттенуированных штаммов сальмонелл) способствует развитию более выраженного иммунного ответа.
4. ВПЧ-TCI и рекомбинантный штамм сальмонеллы Salmonella typhimurhtm SL 7207/ pcTCI являются эффективными системами доставки полиэтггопного ЦТЛ иммуногена.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В данной работе впервые были получены вирусоподобные частицы, экспонирующие на своей поверхности рекомбинантный белок TBI. Были исследованы иммуногенные свойства полученных частиц (ВПЧ-ТВ1). Было показано, что использование ВПЧ способствует пролонгации иммунного ответа и вызывает адью ватный эффект сравнимый с эффектом, вызываемым введением полного адъюванта Фрейнда.
Получена ДНК вакцина, содержащая ген TBI под контролем цитоме-галовирусного промотора. Сконструированы вирусоподобные частицы, несущие ДНК вакцину, покрытую полисахаридной оболочкой. Показано, что оболочка из полиппокина защищает ДНК вакцину от действия ДНКаз. Применение частиц в качестве средства доставки ДНК вакцины увеличивает уровень иммунного ответа (как гуморального, так и клеточного) и способствует его пролонгации.
На основе аттенуированных штаммов Salmonella enieritidis Е-23 И Salmonella typhimur 'mm SL 7207 были получены рекомбинаытные штаммы сальмонеллы, продуцирующие белок GST-TBI, а также рекомби-нантные штаммы, несущие ДНК вакцину pcDNA-TBI. Показано, что рекомбинантны е штаммы сальмонелл при ректальной иммунизации, способны стимулировать как системный, так и мукозальный гуморальный иммунный ответ.
ВПЧ и аттенуированные штаммы сальмонелл были использованы в качестве систем доставки ДНК вакцины, кодирующей полиэгштопный Т-клеточный иммуноген TCI. Было показано, что введение кандидат-ных вакцинных конструкций вызывает стимуляцию ВИЧ • специфического гуморального и клеточного ответа, причем образующиеся антитела обладали нейтрализующей активностью в отношении трех штаммов ВИЧ-1.
В результате проделанной работы впервые была показана возможность использования вирусоподобных частиц и аттенуированного
штамма сальмонеллы в качестве систем доставки полиэпитопных ВИЧ-1 иммуногенов.
Полученные конструкции яегаи в основу кандидатных вакцин против ВИЧ-1, которые разрабатываются в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»,
Апробация работы и публикации.
Материалы исследований по теме диссертации были представлены на следующих российских и международных конференциях: Международной школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», 2002г., Санкт-Петербург, Россия; «Sixth John Humphrey advanced summer programme in immunology», 2002, Pushino, Russia; Международном мультидисциплинарном конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека», 2003 г., Феодосия, Украина; «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», 2004г., Томск, Россия; «13th International symposium on HIV and emerging infectious diseases», 2004, Toulon, France.
По материалам диссертации опубликовано S статей, оформлено 2 патента и получено 1 положительное решение о выдаче авторского свидетельства.
Структура it объем работы.
Диссертация состоит из 7 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 134 страницах машинописного текста и включает 12 рисунков, 11 таблиц, и список литературы, содержащий 206 ссылок.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Получение вирусоподобных частиц, несущих полиэпитопный белок TBI
Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» был получен искусственный полиэпитоп-ный белок TBI (Т and В cell epitopes containing immunogen) [Eroshkin A.M. et al. 1995]. При иммунизации мышей TBI индуцировал относительно низкий уровень иммунного ответа,- поэтому для усиления иммуноген-мости использовали полный адъювант Фрейнда. Применять адъювант Фрейнда для человека запрещено, поэтому необходимо было разработать другие способы повышения иммуногенности целевого белка.
В качестве системы доставки искусственного белка TBI мы выбрали вирусоподобные частицы. Технология получения вирусоподобных частиц была предложена JI. Р. Лебедевым с соавторами [Лебедев Л.Р. и др. 2000], Препарат представляет собой микрочастицы, в центре которых находится полинуклеотндный комплекс (дсРНК), окруженный по-лисахаридной матрицей, а на поверхности экспонирован белок GST-TBI. Внешняя оболочка частиц образована полимером глюкозы - полиппоки-ном. В нашей работе мы использовали полнпвдкин с молекулярной массой бОкДа, который разрешен к применению в медицинской практике. Путем периодатного окисления осуществляли активацию полнглюкина с дальнейшим присоединением по активным группам молекул шута-тиона и спермидина. Спермиднн (H2N(CH2)4NH(CH^NHj) относится к природным полиаминам, в его присутствии происходит конденсация нуклеиновых кислот и считается, »по комплекс ДНК - спермшшн обладает повышенной устойчивостью к действию нуклеаз [Bloomfield, V. А. et aL 1996, Dunlap D. P. et a). 1997]. Глутатион служит субстратом для фермента глутатион-5-трансферазы и выступает для аффинного связывания с гибридным белком GST-TBI. Полинуклеотидный комплекс представляет собой дсРНК штамма Saccharomyces cerevisiae М437 Y116 и является основным компонентом лекарственного препарата «Ридос-тин», применяемого на практике в качестве стимулятора неспецифической резистентности [ВФС 42-2457-94 Ридостин для инъекций]. Схематично строение ВПЧ представлено на рисунке 1.
Конструкция ВПЧ имела соотношение компонентов: на 1 молекулу нуклеотидного материала приходилось в среднем 48 молекул полнса-харидной вставки и 100 молекул гибридного белка. По данным электронной микроскопии, препарат содержал шарообразные частицы, име-
* 1-дсРНК
2 - конъюгат по л игл юкин-сперм идии
Рис. 1. Схематичное строение вирусе подобно и частицы.
3 - рекомбинантный белок
ющие в основном диаметр от 10 до 25 им. Электронно-микроскопическое исследование препаратов было проведено с использованием метода негативного контрастирования с помощью насыщенного спиртового раствора ураиил ацетата на сеточках с формваровой подложкой. Препараты нсслсдовали с использованием электронного микроскопа Н-600 (Хитачи, Япония).
Предыдущие исследования полиэпитопного белка TBI были проведены на рекомбинантиом белке, синтезируемом в нрокариотической клетке. Представлялось весьма любопытным исследовать антигенные и иммуногенные свойства белка TBI, синтезируемого в эукариотичес-кой клегке. Технически, наиболее простой способ решить эту задачу
- использовать активно развивающуюся в настоящее время технологию ДНК вакцин. Для получения конструкции pcDNA-TBI EcoRI-Salf
- фрагмент длиной 445 п.н., включающий последовательность гена TBI, был вырезан из плазмилы pRS III и встроен в эукариотический вектор pcDNA3.1. («Invitrogen») по сайтам рестрикции EcoRI-XhoI (рис. 2). Правильность встраивания гена была подтверждена рестрикционным анализом и секвенированием.
Одна из проблем ДНК вакцинации заключается в том, что при внутримышечной инъекции наблюдается быстрая деградация плазмидной ДНК нуклеазами. Поэтому для достижения достаточно напряженного иммунного ответа, необходимо вводить большие количества плазмидной ДНК [н. Wcintraub et. al. 1986, М.Е. Barry et.al. 1999]. Предотвратить разрушение плазмидной ДНК можно'путем ее инкапсулирования в бно-совместимые н биодеградируемые полимеры.
Для доставки ДНК вакцины, кодирующей ген TBI, было решено использовать технологию получения ВПЧ, описанную выше. В центральной части частиц находилась гшазмида pcDNA-TBI, окруженная поли-сахаридной оболочкой. Мы предполагали, что оболочка из полиглюкина позволит решить проблему разрушения ДНК.
Рис,2. Генетическая карта ДНК вакцины, кодирующий ген белка ТВ1
Для анализа полноты упаковки нуклеотидного материала и сохранности плазмиды в полученной конструкции проводили обработку ВПЧ раствором ДНКазы (0,05 мг/мл). Было показано, что если полная деградация исходной плазмидной ДНК рсОМА-ТС1 происходила уже через 30 мин инкубации, то внутри ВПЧ ДНК сохранялась интактной в течение 24 часов.
По данным агомно-силовой микроскопии, препарат ВПЧ-рсОКА3.1.-ТВ1 содержит шарообразные частицы, диаметром от 40 до 100 нм (рис.3). Исходя из молекулярных масс компонентов, эти размеры соответствуют теоретически рассчитанным оценкам.
Исследование иммуногенных свойств препаратов ВПЧ- ТВ1 и ВНЧ-рс1ЖАЗ. 1 .-ТВ1.
Дня оценки иммунологической активности полученных вакцинных конструкций проводили иммунизацию мышей линии ВАЬВ/с. В качестве группы сравнения использовали мышей, иммунизированных рекомбинант-ным белком, введенным совместно с полным адьювантом Фрейнда (ПАФ).
Рис. 3. Лтомн»-силовая микроскопия ВПЧ, несущих ДНК-вакинну pcDNA-TBI
Схема иммунизации включала в себя Зх-кратиое введение иммуноге-нов с интервалом 2 недели, доза составляла 45 мкг/ по белку GST-TBI и 50 мкг/ по плазмиде pcDNA3.1.-TBI.
В сыворотке крови иммунизированных животных определяли содержание антител против белка GST-TBI и рекомбинантных белков ВИЧ-1 (gp 120, gp41, р24) с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Введение вакцинных конструкций приводило к появлению специфических антител в сыворотке иммунизированных животных. Сыворотка животных контрольных групп не реагировала ни с одним из использованных антигенов на протяжении всего эксперимента. Результаты иммунизации представлены на рисунке 4. При введении полнэпитопного белка TBI в виде различных конструкций наблюдается статистически достоверное различие между группами, проявляющиеся как в разной динамике появления антител, так и в уровне их продукции. Наиболее высокие значения специфически антител были зарегистрированы в группах мышей, вакцинированных ВПЧ-ТВ1 и очищенным белком GST-TBI, введенным совместно с адъювантом. Между собой эти группы отличались динамикой накопления иммуноглобулинов. При введении белка в составе ВПЧ, значения антител практически не изменялись вплоть
Рис. 4, Уровень продукции антител в сыворотке крови иммунитрованных животных по данным ИФА. В качестве антигенов использовали гибридный белок вЗТ-ТВ! и ре комбинат ные белки ВИЧ-1. Группа 1- животные, иммунизированные ВПЧ-ТВ1
Группа 2- животные, иммунизированные вЭТ-ТШ+полный адъювант Фрейнда
до окончания эксперимента (62 сутки). В группе животных, иммунизированных ОЭТ-ТЫ+ПАФ с течением времени наблюдалась тенденция к снижению выраженности гуморального НО и начиная с 55 суток после иммунизации титры антител становятся ниже соответствующих показателей группы ВПЧ-ТВ1.
Введение экспериментальной ДНК вакцины, несущей ген белка ТВ1, как в составе вирусоподобных частиц, так и в «голой» форме (внутримышечная инъекция плазмиды рсОМА-ТВ1), также стимулировало наработку специфических (рис. 5). Это говорит о том, что антигенность
и конформация белка TBI, сшгтезированного в эукариотической системе, значительно не щменяется, по сравнению с рекомбннантным белком, полученным в E.coli. Сыворотки контрольных мышей, которым вводили векторную плазмиду pcDNA 3.1, не взаимодействовали с ВИЧ-антигенами.
Между показателями групп животных, иммунизированных «голой» ДНК вакциной и ДНК вацнной, заключенной в поли сахар цдную оболочку, также были выявлены достоверные отличия. Введение ДНК вакцины без использования защиты индуцировало появление специфических антител, значения которых достигали максимума на 28 сутки после начала эксперимента. При иммунизации мышей ДНК вакциной в составе ВПЧ происходило более раннее по сравнению с группой pcDNA-TBI появление антител в сыворотке животных. Важно отметить, что значения титров антител оставались на высоком уровне вплоть до конца эксперимента (62 сут). Из литературных данных известно, что введение полимерных микрочастиц приводит к появлению воспалительных реакций вместе введения [O'Hagan D. etat. 2001, J.-H. Jang andL.D. Shea2006],
too
BTH-pcONA-TBl I ' pcDNA-TR]
-*- ВЛЧ-рсОМИ-ТШ -ö-pcoNA-та
г» 35 л9 га сутки после иимутшднн
Рис, 5, Клеточный (значения представлены в виде гистограммы) и гуморальный (значения представлены в виде графиков) ответ у мышей, иммунизированных ДНК вакциной рсОНА3.1.-ТВ1. Для стимуляции сплело цитов в реакции бластгрансформации использовали лизаг ВИЧ-1. Белок ОЗТ-ТВ1 применяли в качестве антигена при постановки ИФА.
что возможно способствует более раннему появлению ИО на вводимую в составе частиц ДНК вакцину.
Качественную оценку клеточного иммунитета проводили с использованием теста бласттрансформации лимфоцитов. Клеточный ответ оценивали по показателю индекса стимуляции, который характеризует отношение пролиферации спленоцнтов, индуцированных специфическими антигенами к спонтанной пролиферации спленоцнтов. Результаты теста свидетельствуют о том, что иммунизация рекомбинантным белком GST-TBI и ДНК вакциной pcDNA-TBI (рис.5) вызывала формирование клона клеток памяти. Индекс стимуляции клеток in vitro специфическими белками ВИЧ-1 достоверно увеличивался после каждого введения экспериментальных вакцинных препаратов, при этом не наблюдалась пролиферация спленоцнтов иммунизированных животных при использовании гетерологич ного антигена (инактивированный вирус энтери-рита норок). Следует отметить, что спленоциты иммунизированных животных отвечали повышенной пролиферацией при использовании митогена (конканавалин А) на всем сроке наблюдения. Это достоверная характеристика того, что иммунизация не вызывала супрессивного действия на организм животных.
Наряду со значениями титров антител, индуцируемых в ходе иммунизации, очень важным показателем эффективности вакцинации является вируснейтрализующая активность сывороток иммунизированных животных. Вируснейтрализующую активность сывороток иммунизированных животных оценивали на 35 день после начала вакцинации на культуре клеток МТ-4 с использованием штамма ВИЧ-1 ГКВ 4046 (рис.6). Доза вируса составляла 100ТСГОЮ. В качестве положительного контроля использовали сыворотку ВИЧ-инфицированного пациента. В качестве отрицательных контролей были использованы нормальная человеческая сыворотка и нормальная мышиная сыворотка. Результаты учитывали на четвертые сутки, определяя содержание вирусного белка р24 в каждом образце методом иммуноферментного анализа. Проценты вирусной репликации в опыте рассчитывали по отношению концентрации белка р24 при использовании сыворотки иммунизированного животного к концентрации белка р24 при использовании нормальной мышиной сыворотки. Реакцию учитывали при жизнеспособности клеток МТ-4 не менее 80%. Было установлено, что сыворотки животных опытных групп проявляли вируснейтрализующую активность: при раз-велении сыворотки 1:50 процент вирусной репликации составлял около
ЛИП)
KMC ВИЧ-TBI BIllprDNA ргИЦТИ
ТЧ
Рис. 6, Реакция нейтрал ma ци и вируса ВИЧ-1 (штамм ГКВ 4046) сыворотками животных, иммунизированных экспериментальными вакцинными препаратами искусственного белка TBI. В качестве положительного контроля использовали сыворотку реконвалесцента (СБ ВИЧ-1), В качестве отрицательных контролен использовали нормальную человеческую сыворотку (НЧС) и нормальную мышиную сыворотку (НМС).
45%, при этом не было выявлено достоверно значимых отличий между сыворотками крови животных опытных групп.
Таким образом, при использовании ВПЧ в качестве системы доставки рекомбинантного белка GST-TBI показатели гуморального и клеточного иммунного ответа практически не отличались от таковых при введении белка с адъювантом ФреЙнда. Использование микрочастиц для доставки ДНК позволило повысить иммуногенность вакцинной конструкции, при этом к основным эффектам иммунизации ВПЧ-рсDNA-TBI следует отнести пролонгацию ПО, что выражалось в высоких показателях клеточного и гуморального ИО на 62 сутки наблюдения. Препараты ВПЧ не были токсичны и не вызывали других побочных эффектов в организме подопытных животных. Это говорит о том, что ВПЧ могут быть использованы в качестве системы доставки вакцинных конструкций.
Получение н исследование свойств рекомбинантных штаммов сальмонеллы, несущих полиэпитопный белок ТВ1.
Помимо системного ответа, эффективная вакцина против ВИЧ-инфекции должна индуцировать местный (мукозальный) ответ, поскольку вирус попадает в организм как парентерально, так и половым путем. Весьма перспективным в этом плане представляется создание вакцин на основе живых аттенуированных штаммов сальмонелл, продуцирующих целевой белок. Такие вакцины представляют интерес в связи с возможностью непарентерального способа их введения и способностью индуцировать секреторный иммунный ответ [Рои^ Т.К. е1 а1.1995,8ЬаШ М. е! а1.2001].
В нашей работе нами были использованы два аттенуироваиных штамма сальмонеллы; & ЪрЬтшгшт $Ь7207 и еп/егШсНз Е-23. Штамм 5. ¡урЫтигтт 8Ь7207 является представителем ауксотроф-ных мутантов агоА, разработанных проф. Б. Стокером. АгоА мутант IурЫтипит 5Ь7207 хорошо охарактеризован и часто используется в качестве штамма-переносчика гетерогенных антигенов [Д.А. СЬаЬо^о)1у е1 а1.1995, Т.Я. РоиЬа & а1.1995, В. СосЫоушк е1 а1.2002].
Штамм 5". еШегШЖ'я Е-23 (мутант по генам суа, сгр) был получен на кафедре микробиологии Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова проф.М.Н. БоЙченко. Независимые мутации в генах суа и сгр приводят к ограниченной перснстенцни бактерии в лимфоид-ной ткани с сохранением инвазирующей способности. [Бойченко М.Н, и Ел кипа С.И. 1920]. |
Для получения рекомбинантных штаммов сальмонеллы, продуцирующих белок ТВ1, клетки Ж (урЫтипит 5Ь7207 и 5. ей(егШсИз Е-23
• 66 ■ 45
30
20 14
^Рис. 7. Электрофореграмма (12,5 % ДСН ПААГ) клеток сальмонелл S. typhimurtum SL7207
1. лизэт клеток S. typhi murium SL7207
2. лизат клеток решмбинантного штамма сальмонелл S typhimurtum SL7207, продуцирующего белок ТШ
3. маркер молекулярною веса белков, кДа
трансформировали плазмидой pGEX-TBI. Продукцию белка GST-TBI исследовали с помощью SDS-электрофореза (рис. 7). Молекулярная масса полипептида составляла 45 кДа, что соответствовало молекулярной массе белка GST-TBI. Было показано, что уровень продукции белка TBI в штаммах сальмонеллы сшюсительно высокий и составляет примерно 10% от суммарного клеточного белка, по продуктивности полученные штаммы практически не отличались,
Рекомбинантные штаммы сальмонелл, несущие ДНК вакцину, кодирующую ген ТВ! (пяазмида pcDNA-TBI), также были получены путем трансформации исходных штаммов сальмонеллы.
Рекомбинантные штаммы сальмонелл были протестированы на способность сохранять исходные биохимические признаки, характеризующие их аттенуацию. Определение биохимического профиля позволяло контролировать однородность культур сальмонелл и выявлять контаминацию вакцинных штаммов бактериями других таксономических групп. Исследование способности утилизировать цитрат в качестве единственного источника углерода показало, что полученные рекомбинантные штаммы не реверсировали в сторону штамма дикого типа (S. enteritiäis 1791). Отсутствие роста на агаре Симмонса и начало продукции сероводорода только через 48 часов при посеве на среду Клиплера также являлись важными признаками аттенуации бактерий. Таким образом, установлено, что ни одна плазмидная конструкция не оказывает влияния на биохимические свойства аттенуированных штаммов.
Исследование антигенных свойств показало, что вакцинные штаммы однородны по своему составу и достоверно определяются как представители рода Salmonella. Гибридные штаммы не обладают способностью к спонтанной агглютинации и по антигенной структуре соответствуют серовару исходного бесплазмидного штамма.
Была проведена оценка стабильности плазмидных конструкций pGEX-2T-TBI и pcDNA-TBI в клетках сальмонелл. Стабильность плаз-мнд в составе бактериальных клеток оценивалась путем подсчета колоний бактерий при многократных пересевах культуры на твердых средах. Оказалось, что количество клеток сальмонелл, несущих гшазмиды pGEX-2T-TBI и pcDNA-TBI, при многократных пересевах (10 раз) достоверно не уменьшается, что позволяет говорить о стабильности сохранения плазмид в составе бактериальных клеток in vitro.
Определение ЛД^ аттенуированных штаммов сальмонеллы при ректальном введении
Ранее для каждого штамма сальмонеллы было определено ЛДМ при внутрибрюшинном введении животным [Рыжова С.А. и Бойченш М.Н. 1997]. В наших экспериментах мы планировали использовать рекомби-нантные штаммы для перректальной иммунизации. Поэтому перед началом иммунизации необходимо было провести дополнительные эксперименты по определению ЛДМ для каждого штамма при ректальном способе введения сальмонеллы. Мыши линии ВАЬВ/с были разделены на несколько групп по 10 животных в каждой. Животным ректаль-но вводили по 30 мкл клеток сальмонелл штаммов £ еп1егШс11$ Е-23 и
¡урЬтигшт 81,7207 в различных дозах: от 101 до 10'°. Наблюдали за состоянием мышей в течение 50 сут. Результат эксперимента учитывали по гибели животных. ЛД50 определяли по методу Рида и Менча. В результате экспериментов было установлено, что ЛДЮ для еШегШЖэ £-23 при перректальном введений бактерий составляет 7,5 КОЕ, а для 5. Ь'рЫтиНит БЬ7207 составляет 8,5 КОЕ. Учитывая полученные результаты, для иммунизации лабораторных животных были выбраны дозы Ю7 н 10" клеток сальмонеллы/мышь соответственно,
Иммуногенные свойства вакцинных штаммов сальмонеллы
Для исследования иммуногенных свойств рекомбинантных штаммов сальмонеллы, выступающих в качестве систем доставки белка 08Т-ТВ1 и ДНК вакцины рсВМА-ТВ1, была проведена однократная перректальная иммунизация мышей линии ВАЬВ/с. Выбор перректального способа введения был сделан на основании сравнительного анализа результатов ранее проведенных экспериментов по изучению эффективности орального и ректального способов введения нммуногенов [Карпенко Л.И. и др. 2003].
Показатели клеточного иммунитета оценивали в реакции бласттран-сформации лимфоцитов. Было выявлено, что спленоциты иммунизированных животных отвечают повышенной пролиферацией на оба используемые в реакции специфических антигена (белок 05Т-ТВ1 и лизат ВИЧ-1), начиная с 14 суток, Пролиферативная активность спленоцитов мышей, иммунизированных 5, ГурЫтипит 5Ь 7207/рСЕХ-ТВ1, достоверно не отличалась от показателей клеток животных, которым вводили X еЫегШсИз Е-23/рОЕХ-ТВ1 на каждый из наблюдаемых сроков. В группах животных, иммунизированных ДНК вакциной в составе клеток сальмонеллы, были зафиксированы наиболее высокие значения индек-
са пролиферации. Не отмечено снижения иролиферативной активности спленоцитов при их стимулировании м иго геном (конканавалином А). Эти результаты позволяют предположить, что иммунизация рекомбинантными штаммами сальмонелл, несущими полнэпитопный белок TBI, не вызывает супрессирующего действия на организм мышей.
Системный гуморальный ответ оценивался по выявлению специфических IgG в сыворотке крови иммунизированных животных. Результаты эксперимента представлены на рисунке 8. Введение сальмонелл, продуцирующих белок GST-TBI, приводило к индукции гуморального ответа у иммунизированных животных. Следует отметить, что на 14 сутки после иммунизации значения выявляемых антител в опытных и контрольных группах не отличались. Это, возможно, свидетельствует о наработке антител, специфичных к антигенам введенных бактериальных клеток. К 28 суткам тигр специфических антител в опытных группах возрастает, в то время как титр антител в сыворотках крови животных контрольных групп уменьшается. Задержку в появлении антител можно объяснить фактом наличия процесса незавершенного фагоцитоза сальмонелл в АПК (макрофагах, дендритных клетках кишечника), вследствие чего презентация целевого антигена происходит не сразу после введения, а только после завершения процесса полного лизиса клеток носителя.
Иммунизация рекомбинантными штаммами S.typhimurium SL 7207 /pcDNA-TBI и S.enteritidis E-23/pcDNA-TBI также приводила к появлению в сыворотке крови иммунизированных животных специфических антител.
При сравнении результатов иммунизации двумя штаммами сальмонеллы (S.typhimurium SL 7207 ti S.enteritidis E-23) были выявлены различия в значениях тигров антител, В то же время, по данным SDS-электро-фореза продукция белка GST-7BI в клетках сальмонелл этих штаммов находилась на одинаковом уровне. Учитывая этот факт, к наиболее вероятным причинам различий в индуцируемом иммунном ответе можно отнести особенности существования бактерий в макроорганизме, такие как инвазнрующая способность, время перснстенции в органах иммунной системы и др.
Мукозальный иммунный ответ оценивался по выявлению специфических IgA в слизистой тонкого кишечника иммунизированных животных (Рис. 8). Исследование смывов кишечника животных, вакцинированных рекомбинантными штаммами сальмонелл показало наличие специфических IgA. Максимальный уровень специфических антител
2500
2000
о
О) 1500
&
s t— 1000
—.
500
■ :
ÍÍ fífcfa ' ÍÍ ít
IílflHt-^ш , I п
14
23 35
сутки после иммунизации
42
mS.typhimurium SL 7207 /pGEX-TBI □ S.enteriMis Е-23 /pGEX-TBI OS.lyphifrmrium SL 7207(контрояь) ■S enteritidis Е-23{контроль)
Рис, 8. Гуморальный иммунный ответ у мышей, иммунизированных ре-комбнпантнымн штаммами сальмонеллы. В качестве антигена использовали белок GST-TBI, Антитела класса IgA в смывах кишечника (А), а}щггела класса IgG в сыворотке крови мышей(В).
!
наблюдался на 35 сутки после иммунизации. Значимость индукции секреторного иммунитета особенно высока при создании вакцинных препаратов, направленных против инфекций, передающихся половым путем, таких как ВИЧ-инфекция
Таким образом, использование аттенуированных штаммов сальмонеллы способствует развитию системного и мукозального иммунного ответа на целевой иммуноген. Полученные результаты позволяют сделать вывод о перспективности использования аттенунроваиных штаммов сальмонелл как систем доставки вакцинных конструкций.
Изучение иммуногенных свойств полн-ЦТЛ эпитопного белка TCI.
Наряду с разработкой вакцинных препаратов, стимулирующих наработку нейтрализующих антител, в последнее время появилось много работ, посвященных созданию конструкций, направленных на стимуляцию клеточного ответа [Thomson S. et al. 1996, Hanke T. et. al. 1998, Livingston B.D. et.al.2001]. В качестве T - клеточного иммуногена в рамках работы было проведено исследование белка TCI, представляющего собой поли-ЦТЛ-эпитопную конструкцию [Bazhan S.I. et al. 2004].
При конструировании белка TCI (Т cell immunogen) были выбраны эпитопы, которые индуцируют как CD8MJTJI, так и CD4+ (Т-хелперы), и включают в себя последовательности из основных вирусных белков-антигенов Eiiv, Gag, Pol и Nef. В результате белок TCI имеет 80 оптимально отобранных ЦТЛ-эпитопов и состоит из 392 аминокислотных остатков. Последовательность полиэп итопного иммуногена включает в себя ряд B-клеточных эпигонов, которые перекрываются с Т-клеточными эпитопами.
В состав гена TCI были включены дополнительные последовательности, кодирующие эпитопы способные представляться совместно с МНС I мышей и Macaque rhesus. Это дает возможность использовать указанные виды животных в качестве экспериментальных моделей при изучении иммуногенности вакцин на основе TCI.
Помимо введения «голой» ДНК вакцины, мы также использовали две системы доставки: ВПЧ и атгенуированный штамм сальмонеллы S typhimurium SL7207.
Группы животных, иммунизированных векторной плазмцдой pcDNA3.1„ а также исходным штаммом сальмонеллы S. typhimurium SL7207 выступали в качестве отрицательного контроля. В рамках исследования иммуногенных свойств ДНК вакцины pcDNA-TCI было проведено тестирование гуморального и клеточного иммунного ответа у иммунизированных животных.
Клеточный цитотокснческий ответ оценивали по выявлению IFN-y-продуцирующих лимфоцитов в реакции ELISPOT. Полученные в результате теста показатели представлены на рисунке 9. Прежде всего, необходимо отметить, что введение полиэпитопной конструкции (как в виде «голой» ДНК, так и в составе вирусоподобных частиц и клеток сальмонелл) индуцировало появление у иммунизированных животных клона специфических клеток, продуцирующих IFN-y. Успешное нспользова-
в
iK
к
в 7 14 J1 30 48
CyiKH ПОСЛА иьп*ЦИ34ци4 DOIP НОИфОЛЬ (ЕНЕС)И f О Q N1
is
IE
—J
-J'-
0 Jfc.life
7 н IT зо
□афшпп* г' c^a та фн
О 7 10 14 31 30 4в CytnH ГЮСЛв XVMyHH»tf*H
Пагр «очтрогъ {FMQ3 Ш TCi ttNti-WIS
Рис. 9. КлеточмыП иммунный ответ у животных, и ммуииэн ронянных различными вариантами конструкций ДНК вакцины рсО№-ТС1.
Спленоциты стимулировали: смссыо пептидов N15 (ОЮЛЕУУОй АУ1Ъ\111. - 834-848 а.о, ВИЧ-1111В) и N16 (К<311КМ\У<}ЕУСКАМУА- 428-443 а о. ВИЧ-1И1В), рскомбинантным белком С8Т-ТС1, белком Е11ЕС (выделен из неинфекциошюго штамма Е.соИ).
пне для рестимуляции спленоцитов m vitro, как полноразмерного белка TCI, так и отдельных пептидов, входящих в его состав, указывает на то, что происходит экспрессия гена TCI, процессннг целевого белка и представление детерминант CD8+- лимфоцитам вместе с МНС I класса. При использовании в качестве неспецифического стимулятора иономицнна количество IFN-y-продуцирующих клеток составляло порядка 400-600 кл ето к/10'спленоци тов.
В группах животных, иммунизированных комбинированными препаратами Bn4-(pcDNA-TCI/TCI-GST), содержащими одновременно плазмиду pcDNA-TCl (внутри) и белок GST—TCI (на поверхности), было отмечено, что уже на 7 сутки после введения можно обнаружить
специфические лимфоциты, отвечающие продукцией IFN-y в ответ на стимуляцию специфическими антигенами. Это указывает на то, что оба компонента вакцинной конструкции (ДНК и белок) вносят вклад в индукцию цитотоксических лимфоцитов.
При иммунизации препаратом вирусоподобных частиц, содержащих только ДНК вакцину, клеточный ответ был примерно на том же уровне, что и при иммунизации плазмидной ДНК. Однако, в отличие от иммунизации «голой» плазмидной ДНК, вакцинация плазмидой в составе ВПЧ приводила к более пролонгированному ответу. Максимальный ответ достигался на 14-21 дни после иммунизации и сохранялся до конца периода наблюдения. Можно предположить, что пролонгированный ЦТЛ ответ при иммунизации ВПЧ-ipcDNA-TCI) по сравнению с pcDNA-TCI связан с тем, что в составе ВПЧ ппазмидная ДНК защищена от действия ДНКаз и, следовательно, может функционировать более длительный период, обеспечивая экспрессию белка TCI.
Следует отметить, что при иммунизации животных S.typhimwium SL7207/pcDNA-TCI наблюдается самая длительная задержка в клеточном ответе, хотя в этой группе животных на 30 сутки наблюдения был выявлен самый значительный ответ со стороны лимфоцитов. Возможно, в данном случае эффект задержки развития иммунного ответа обусловлен тем, что плазмида pcDNA—TCI находится в составе сальмонеллы, которая, попадая в макрофаги, может некоторое время жить в них, не подвергаясь полному лизису. При этом задерживается и экспрессия целевого гена, поскольку ДНК вакцина проникает в ядро макрофагов только после разрушения бактерий.
Гуморальный иммунный ответ оценивали по обнаружению специфических антятел в сыворотке иммунизированных животных в реакции непрямого ИФА. Полученные результаты позволяют сделать заключение, что при иммунизации мышей плазмидой pcDNA-TCI как в чистом виде, так и в составе вирусоподобных частиц, и клеток сальмонелл, происходит наработка специфических антител, которые связываются как с белком TCI, так и с рекомбинантными белками ВИЧ-1 (Env, Gag) и ли-затом ВИЧ-1. Следует, отметить, что титры антител к белкам Env и Gag, а также лнзату ВИЧ-I оказались относительно невысокими (не выше, чем 1:80), что является вполне закономерным, т.к. проектирование белка TCI было проведено в форме полиэпитопного Т-клеточного имму-ногена. Наиболее высокие титры антител были обнаружены в группе животных иммунизированных S. typhimurium SL7207/ pcDNA-TCI.
Оценка нейтрализующей активности сывороток иммунизированных животных была проведена с использованием трех штаммов вируса ВИЧ-1: ГКВ 899А, ПСВ 4005 (ВИЧ-1 еук) и ПСВ 4046, полученными из коллекции НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского.
В результате проведенных экспериментов было установлено, что все сыворотки животных опытных групп проявляли нейтрализующую активность. Наиболее высокий титр нейтрализующих антител был зафиксирован в группе животных, иммунизированных £ (урШтигЫт 8Ь7207/рсПИА-ТС1. Реципрокный титр составлял 1:640 при 52%-ой нейтрализации штамма ВИЧ-1-899А. Эффективность подавления двух других штаммов ВИЧ-1 (ГКВ 4046 и ГКВ 4005) сывороткой крови животных этой группы была достоверно ниже и составляла 1:150и 1:200 соответственно (Р<0,01). Показатели ингибирования р24 сыворотками крови мышей, иммунизированных ДНК вакцинной, инкапсулированной в вирусоподобные частицы, также приводила к стимуляции вирусней-трализующих антител, однако тигры не превышали значений 1:100. При этом не было отмечено зависимости показателей теста вирусной нейтрализации от используемого штамма вируса (0,01<Р<0,05). Отмечено значительное снижение вируснейгралнзующей активности сывороток крови мышей, иммунизированных «голой» ДНК вакциной: 50% подавление накопления белка ¿24 при разведениях сыворотки 1:50.
Таким образом, наименьший уровень гуморального (включая ви-рус-нейтрализующую активность антител) и клеточного иммунного ответа был отмечен у животных,1 иммунизированных «голой» рсБМА-ТС1, введенной в/м. В результате наших исследований было показано, что используемые способы доставки (ВПЧ и клетки аттенуированного штамма сальмонеллы) позволяют повысить эффективность ДНК иммунизации.
выводы
1. Показано, что иммунизация лабораторных животных искусственными вирусоподобными частицами (ВПЧ), экспонирующими на своей поверхности полиэпитопный белокв8Т-ТВ1, обеспечивает специфический клеточный ответ и образование антител, обладающих вируснейтра-лизующей активностью. При этом адьювантеые свойства конструкции не уступают эффекту адьюванта ФреЙнда.
2. Впервые показано, что перректальная иммунизация лабораторных животных рекомбинантными штаммами Б.фрЫтипит БЬ 7207/рСЕХ-ТВ1 и Я.еЫегШсИх Е23/рОЕХ-ТВ1, продуцирующими белок ТВ1, стимулирует системный и мукозальный иммунный ответ против ВИЧ-1.
3. Продемонстрирована способность ТВ1 в формате ДНК вакцины индуцировать специфический гуморальный и клеточный ответы. При этом, в сравнении с «голой» ДНК, и ВПЧ, и рекомбинактные штаммы сальмонелл обеспечивают более выраженный уровень иммунного ответа.
4. Сконструированы ВПЧ и рекомбинантный штамм сальмонелл, несущие ДНК вакцину рсОКА-ТС1, кодирующую полиэпитопный ЦТЛ иммуноген. Сравнительный анализ иммуногенности полученных конструкций продемонстрировал, что интенсивность клеточного и гуморального ответов возрастает в ряду: «голая» ДНК вакцина, ДНК вакцина в составе ВПЧ (ВПЧ-рсВКА-ТС1), рекомбинантная сальмонелла Б.гурЬтипит 7207/рсША-ТС1.
Основные результаты опубликованы в следующих работах:
1. Л.И.Карпенко, С.И.Бажан, Н.А.Некрасова, О.С.Юдина, Б.П.Ключ, Т.А.ВеремсЙко, П.А.Белавин, С.В .Серегин, Н.К.Даннлюк, Л.Р.Лебедев, Т.А.Терещенко, Г.М.Левагина, В.И.Масычева, Т.А.Чекалова, М.Н. Расщепкина, М.С.Воробьева, А.А.Ильичев. Инъекционная и суппозиторная формы канди-датных вакцин против ВИЧ/СПИД на основе полиэпитопных иммуногенов. // Физиология и патология иммунной системы.- 2005,- N8. - С.90-95.
2. Ильичев АА., Карпенко Л,И., Некрасова H.A., Лебедев Л.Р., Игнатьев Г.М., Агафонов А.Л., Белавин ПА., Серегин С.С., Дан клюк Н.К., Бажал С. И. Использование различных систем доставки ВИЧ-1 ДНК-вакцины, кодирующей поли-ЦТЛ -эпитопный иммуноген.//Вестник РАМН. - 2005, -N1.-С. 41-44.
3. Некрасова НА., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Ильичев A.A., Карпенко Л.И, Исследование системного и мукозального иммунного ответа при иммунизации мышей кандидатной ВИЧ-1 вакциной. // Сибирский медицинский журнал. - 2004. -Т. 19, N2. - С.60-62.
4. Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Ilyichev A.A., Lebedev L.R., Ignatyev O.M., Agafonov A.P., Zaitsev B.N., Belavin PA., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Bazhan S.I. Comparative analysis of the immunogenicity of artificial VLPand attenuated Salmonella strain carrying a DNA-vaccine encoding H1V-1 polyepitope CTL-immunogen. // Vaccine. - 2004.- V. 22, N13-14.-P. 1692-1699.
5. Карпенко Л.И., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Порываева В.А., Лебедев Л.Р., Веремейко Т.А., Некрасова H.A., Ильичев A.A. Конструирование н исследование аттенуированных штаммов сальмонелл, продуцирующих белок TBI. // Вопросы вирусологии. - 2002. - N2 - С.25-28,
6. Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Веремейко Т.А., Левагина Г.М., Терещенко Т.А., Малахова Т.В., Ильичев A.A., Масычева В.И., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П. Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций. Положительное решение о выдаче патента 26.09.06
7. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Некрасова H.A., Белавин П.А., Данишок Н.К., Серегин С.В., Бабкина И.Н., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Бойчеико М.Н., Воробьев A.A., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С. Рекомбинантная плазмидная ДНК pcDNA-TCI, обеспечивающая экспрессию искусственного гена TCI в клетках эукариот, и рекомбннантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI как кандидат для конструирования живой ДНК-вакцины против вируса иммунодефицита человека Патент РФ № 2248396. Опубликован в бюллетене по изобретениям №8 от 20.03.05.
8. Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Игнатьев Г.М., Ильичев A.A., Бойчей-ко М.Н., Воробьев A.A. Рекомбннантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis E23/pGEX-2T-TBI как кандидат для конструирования живой вакцины против вируса иммунодефицита человека. Патент РФ №2237089. Опубликован в бюллетене по изобретениям №27 от 27.09.04 г:
Тезисы конференций:
.. 1. Некрасова Н.А., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Ильичев А.А., Карпенко Л.И, Исследование системного и му|созального иммунного ответа при иммунизации кандидатной ВИЧ-1 вакциной. // Материалы конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунологических и фармацевтических препаратов», посвященная 100-летию со дня основания Томского НПО «Вирион» (16-17 июня 2004, Томск, Россия). -2004. - С.58.
2. Некрасова НА., Карпенко Л.И., Ключ Б.П., Лебедев Л.Р., Юдина О.С., Чеканова Т.А., Расщепхлна М.Н., Воробьева М.С., Бажан С,И., Ильичев А.А. Конструирование и исследование иммуногенных свойств «КомбнВичВак » • кандидатной вакцины против ВИЧ/СПИД. // I международная конференция «Молекулярная медицина и биобезоггашостъ», (26-28 октября 2004 , Москва, Россия): Сб. тезисов. - 2004. - С. 139.
3. Некрасова НА., Карпенко Л.И„ Бажан СИ., БелавннП.А, Игнатьев Г.М., Ильичев АЛ. Использование аггенуированного штамма сальмонеллы S. typhtmurium SL7207 для доставки ДНК вакцины против ВИЧ-1. // Материалы международного мультндисциплинарного конгресса «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (8-19 июня 2003 г. Кара-Дат, Феодосия, Украина). - С. 109.
4. Н.А. Некрасова, Л.И. Карпенко, А.А. Ильичев Конструирование и исследование иммуногенных свойств рекомбинзнтных штаммов сальмонелл, несущих различные антигены ВИЧ-1. // Материалы международной научно-практической школы-конференции "Цитокнны. Воспаление. Иммунитет" —2002.-Т. 1, №2, С. 162
5. Karpenko L.I., Veremciko Т.А-, Nekrasova N. A., ChikaevN.A., Ignat'ev G.M., Poiyvaeva УЛ., Ilyichev АЛ. Recombinant attenuated Salmonella for delivery of HIV-l and HBV antigens. // Workshop "Virus-like particles as vaccines" September 26-29,2001 Berlin, Germany. Abstract book-P.34.
6. Bazhan S.I., Ilyichev A.A., Pokrovsky A.G., Ignayiev G.M., Belavin P.A., Seregin S. V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Karpenko L.I., Lebedev L.R., Shchelkunov S.N., Ryzankin I.V., Nesterov A.E., Nekrasova N.A., Bachinsky A.G., Maksytov A.Z., Eroshkin A.M. The current approaches to development of an effective abd safe vaccine against HTV-1. t! IV ISTC scientific advisory committee seminar on basic science in ISTC activities (Akademgorodok, Novosibirsk, 23-27 April, 2001). - P. 19.
7. Ilyichev AA, Nekrasova N.A., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Karpenko L.I, Rectal and oral immunization with recombinant attenuated Salmonella carrying H1V-DNA vaccine. // DNA vaccines (23-25 October 2002, Edinburgh, Scotland, UK), -P.49.
8. Nekrasova N.A., Murashev B.V., RomanovichA-E., Ignat'ev G.M., Agafonov A.P., Pronyaeva T.R. and Karpenko L.I. Anti-HIV DNA vaccine delivering by attenuated strain Salmonella typhimurium SL 7207. // Sixth John Humphrey advanced summer programme in immunology. September 15-22, 2002, Pushcbirto. Abstract book - P. 130
9. Karpenko L.I., Nekrasova NA, Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Bazhan S.L, Ilyichev A.A. Delivery of artificial HTV-1 multi-epi tope proteins and DNA vaccine by
attenuated Salmonella strains. //XII Intern. Congress of Virology ( Paris, 9-13 August 2002): - Abstr, -V.807.
10. Nekrasova N. A., Ignatyev G. M„ Agafonov A. P., Lebedev L.R., IlyichevA. A., Karpenko L.I. Different delivery systems for artificial polyepitopcHlV-1 antigen. // 13th symposium on HIV infection. June 3-5, 2004 Toulon, Prance, Abstract book -B.14.
Подписано в печать 21.11.06. Бумага офсетная. Формат 60*84/16 Усл. печ. л. 1,7. Уч-изд. л. 1,75. Тираж 100. Отдел оперативной печати ЗАО «Вектор-Бест». 630559 Новосибирская обл., пгг, Кольцово, а/я 125.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Некрасова, Надежда Александровна
Список принятых сокращений
Введение
Научная новизна и практическая ценность работы
Основные положения, выносимые на защиту
Публикации и апробация работы
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Вирус иммунодефицита человека первого типа
1.1. Строение вириона. Жизненный цикл вирус
1.2. Анти-ВИЧ иммунный ответ
1.2.1. Гуморальный иммунитет
1.2.2. Клеточный иммунитет
1.2.3. Мукозальный иммунитет
II. Вакцины против ВИЧ/СПИД
2.1. Вакцины на основе аттенуированных вирусов
2.2. Субъединичные вакцины
2.3. Полиэпитопные иммуногены в качестве кандидатных ВИЧ-1 иммуногенов
2.4. ДНК-вакцины
III. Способы доставки вакцинных препаратов
3.1. Микросферы
3.2. Вакцины на основе рекомбианантных вирусных векторов
3.3. Аттенуированные штаммы сальмонелл в качестве системы доставки антигенов
Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование иммуногенности полиэпитопных ВИЧ-1 антигенов с использованием разных систем доставки"
Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызываемый вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), стал известен более 20 лет назад. На сегодняшний день СПИД является одним из наиболее серьезных инфекционных заболеваний, занимая четвертое место по количеству смертельных исходов. Главная опасность ВИЧ-инфекции, определяющая ее социальное значение -практически неизбежная гибель инфицированных в среднем через 10 лет после заражения. Начавшаяся в конце 70-ых годов эпидемия ВИЧ-инфекции, по оценочным данным Всемирной Организации Здравоохранения, к настоящему времени унесла жизни 14 млн. жителей Земли. Еще 40,3 млн. человек к концу 2005 года были инфицированы ВИЧ. Важно отметить, что Россия занимает одно из лидирующих мест по темпам роста инфицирования.
Ведущий фактор, обеспечивающий биологическое «процветание» ВИЧ -инфекции - многолетнее малосимптомное носительство вируса. В силу этого обстоятельства ВИЧ инфицированный человек в течение многих лет остается источником распространения инфекции (чаще всего нераспознанным).
Учитывая стремительное распространение эпидемии СПИДа как во всем мире, так и в России, задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение. В разработке вакцины против ВИЧ-1 в последние годы были использованы различные формы вирусного антигена, включая инактивированный вирус, модифицированный вирус, аттенуированный вирус, нативные и генноинженерные белки, синтетические пептиды, а также различные способы представления целевого иммуногена иммунной системе макроорганизма [Spearman Р. 2006, Burgers W.A. et al. 2006, Young K.R. et al. 2006]. Однако проблема создания анти-ВИЧ вакцины до сих пор не решена. Можно выделить несколько факторов, которые сдерживают прогресс в разработке вакцины.
Во-первых, ВИЧ обладает высокой генетической изменчивостью, в результате чего он меняет свою антигенную структуру быстрее, чем исследователи успевают создать вариант вакцины.
Во-вторых, недостаточность наших знаний о биологии вируса. До сих пор идет дискуссия, какое звено иммунного ответа более важно для предотвращения инфекции: индукция антител или цитотоксических Т-лимфоцитов, или же обоих б звеньев вместе. Отсутствуют знания о корелляции уровня иммунного ответа и степенью протекции от заражения.
В-третьих, вирусные белки ВИЧ-1 содержат районы, которые обладают способностью ингибировать протективный иммунитет и индуцировать развитие иммунопатологии.
Наконец, для изучения патогенеза ВИЧ-инфекции фактически отсутствуют экспериментальные модели животных. Только шимпанзе могут быть инфицированы ВИЧ-1, однако, высокая стоимость экспериментов с участием этих животных и различия в патогенезе заболевания затрудняет их широкое использование. Все это, несомненно, тормозит создание эффективного профилактического препарата.
Несмотря на перечисленные проблемы, исследования по созданию вакцины против ВИЧ-инфекции должны быть продолжены, потому что нет другого пути блокировать, или по крайне мере ослабить быстрое распространение СПИДА. В настоящее время наблюдается растущий оптимизм среди ученых, которые считают, что создание эффективной и безопасной вакцины является вполне осуществимой задачей [McMichael and Hanke Т. 1999, Nelson R. 2003, Matano Т. et al. 2004J. Несомненно, что для решения задачи весьма важным направлением исследований является разработка новых подходов к конструированию ВИЧ иммуногенов и систем их доставки.
Весьма перспективное направление в создании новой генерации эффективных и безопасных вакцин основано на идентификации в вирусных белках Т- и В-клеточных эпитопов и конструирование на их основе синтетических полиэпитопных вакцин. Такие вакцины должны быть свободны от недостатков, которые свойственны вакцинам, создаваемым на основе аттенуированного или инактивированного вирусов или же на основе нативных и рекомбинантных вирусных белков. В частности они не будут содержать нежелательных эпитопов, которые индуцируют иммунопатологию или ингибируют протективный иммунитет.
В ГНЦ ВБ «Вектор» данный подход использовался при конструировании четырех-а-спирального искусственного белка TBI (Т and В cell epitopes containing immunogen), кандидата молекулярной полиэпитопной вакцины [Eroshkin A.M. et al. 1995]. Белок содержит четыре Т-клеточных эпитопа и пять В-клеточных нейтрализующих эпитопа из белков Env и Gag ВИЧ-1. У мышей, иммунизированных белком TBI, формировался как гуморальный, так и клеточный ответ к ВИЧ-1. Анти7
TBI-антитела обладали ВИЧ-нейтрализующей активностью [Eroshkin A.M. et al. 1995]. Основной недостаток белка TBI заключается в том, что он обладает относительно небольшой молекулярной массой и для индукции эффективного иммунного ответа требует использования адъюванта.
Для стимуляции ВИЧ-специфического цитотоксического ответа был проведен дизайн другого искусственного белка - поли-ЦТЛ-эпитопного Т-клеточного иммуногена (TCI, Т cell immunogen), состоящего из 392 аминокислотных остатков и содержащего около 80 оптимально отобранных ЦТЛ-эпитопов. В состав TCI были включены эпитопы, которые индуцируют как CD8+ ЦТЛ, так CD4+ Тх и включают последовательности из основных вирусных белков Env, Gag, Pol и Nef [Bazhan S.I., 2004]. Доставку ЦТЛ-иммуногенов целесообразно проводить с использованием ДНК вакцин, поскольку именно при использовании генной вакцинации происходит эффективная индукция клеточного ответа [Donnelly J.J. 1997] Для этой цели ген TCI был клонирован в составе плазмиды pcDNA 3.1. Известно, что иммунизация голой ДНК вакциной стимулирует очень слабый иммунный ответ, поэтому во всем мире проводятся интенсивные исследования по повышению эффективности ДНК вакцинации. Прежде всего, эти исследования направлены на разработку схем вакцинации и систем доставки вакцины.
Была разработана оригинальная система доставки ДНК вакцин с использованием искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ) [Лебедев Л.Р. и др. 2000]. Это могло бы позволить решить проблему сохранения ДНК до того момента, как ВПЧ будет поглощена антигенпрезентирующими клетками и, таким образом, уменьшить эффективную дозу вакцины [Karpenko L.I. et al. 2003].
Другим перспективным способом представления ДНК вакцин иммунокомпетентным клеткам могут быть аттенуированные штаммы сальмонелл [Schoen С. et al. 2004, Du A. et al. 2005, Haga T. et al. 2006]. Преимущество доставки ДНК вакцин с помощью сальмонелл заключается, во-первых, в непарентеральном способе введения, а во-вторых, в том, что помимо системного гуморального и клеточного ответов активируется специфический мукозальный иммунитет, создающий на слизистых барьер для проникновения вируса в организм. Значимость мукозального иммунитета особенно высока для инфекций, передающихся через слизистые оболочки, именно к таким инфекциям и относится СПИД.
Цель работы заключалась в разработке средств доставки полиэпитопных иммуногенов TBI и TCI и исследование их свойств.
Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
• Получить и исследовать иммуиогеиные свойства искусственных вирусоподобных частиц (ВПЧ), экспонирующих на своей поверхности рекомбинантный белок GST-TBI.
• На основе аттенуированных штаммов сальмонелл получить рекомбинантные штаммы, продуцирующие белок TBI. Оценить стабильность плазмиды pGEX-TBI в клетках сальмонелл. Исследовать иммуногенные свойства рекомбинантных сальмонелл, включая мукозальный ответ.
• Сконструировать ДНК вакцину, обеспечивающую синтез белка TBI в эукариотических клетках. Исследовать ее иммуногенность в составе ВПЧ и аттенуированных штаммов сальмонелл.
• Получить ВПЧ и аттенуированные штаммы сальмонелл, несущие ДНК вакцину pcDNA-TCI. Изучить иммуногенные свойства полученных конструкций.
Научная новизна и практическая ценность.
В данной работе впервые были получены вирусоподобные частицы, экспонирующие на своей поверхности рекомбинантный белок TBI. Были исследованы иммуногенные свойства полученных частиц (ВПЧ-ТВ1). Было показано, что использование ВПЧ способствует пролонгации иммунного ответа и вызывает адъювантный эффект сравнимый с эффектом, вызываемым введением полного адъюванта Фрейнда.
Получена ДНК вакцина, содержащая ген TBI под контролем цитомегаловирусного промотора. Сконструированы вирусоподобные частицы, несущие ДНК вакцину, покрытую оболочкой из полиглюкина. Показано, что оболочка из полиглюкина защищает ДНК-вакцину от действия нуклеаз сыворотки крови. Применение частиц в качестве средства доставки ДНК вакцины увеличивает уровень иммунного ответа (как гуморального, так и клеточного) и способствует его пролонгации.
На основе аттенуированных штаммов Salmonella enteritidis Е-23 и Salmonella lyphimurium SL 7207 были получены рекомбинантные штаммы сальмонеллы, продуцирующие белок GST-TBI, а также рекомбинантные штаммы, несущие ДНК вакцину pcDNA-TBI. Показано, что рекомбинантные штаммы сальмонелл при ректальной иммунизации, способны стимулировать как системный, так и мукозальный гуморальный иммунный ответ.
ВПЧ и аттенуированные штаммы сальмонелл были использованы в качестве систем доставки ДНК вакцины, кодирующей полиэпитопный Т-клеточный иммуноген TCI. Было показано, что введение кандидатных вакцинных конструкций вызывает стимуляцию ВИЧ - специфического гуморального и клеточного ответа, причем образующиеся антитела обаладали нейтрализующей активностью в отношении трех штаммов ВИЧ-1 субтипа В.
В результате проделанной работы впервые была показана возможность использования вирусоподобных частиц и аттенуированного штамма сальмонеллы в качестве систем доставки полиэпитопных ВИЧ-1иммуногенов.
Полученные конструкции легли в основу кандидатных вакцин против ВИЧ-1, которые разрабатываются в ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Основные положения, выносимые на защиту.
• Вирусоподобные частицы, экспонирующие на своей поверхности рекомбинантный белок GST-TBI, при иммунизации лабораторных животных стимулируют специфический иммунный ответ, который по величине соответствует эффекту, наблюдаемом при использовании полного адъюванта Фрейнда.
• Введение мышам рекомбинантных штаммов сальмонеллы Salmonella enteritidis Е-23 и Salmonella typhimurium SL 7207, продуцирующих белок GST-TBI, приводило к индукции как системного, так и мукозального иммунитета.
• При ДНК вакцинации плазмидной ДНК pcDNA-TCI регистрировался специфический иммунный ответ. Использование систем доставки ДНК вакцины (ВПЧ и аттенуированных штаммов сальмонелл) способствовало развитию более выраженного иммунного ответа.
• ВПЧ и рекомбинантный штамм сальмонеллы Salmonella typhimurium SL 7207/ pcDNA-TCI показали эффективность использования для доставки полиэпитопного искусственного белка TCI.
Апробация работы и публикации.
Полученные результаты представлены на двенадцати международных конференциях. По материалам диссертации было опубликовано пять статей, два патента и получено одно пололсительное решение о выдаче авторского свидетельства.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Некрасова, Надежда Александровна
выводы
1. Показано, что иммунизация лабораторных животных искусственными вирусоподобными частицами (ВПЧ), экспонирующими на своей поверхности полиэпитопный белок в8Т-ТВ1, обеспечивает специфический клеточный ответ и образование антител, обладающих вируснейтрализующей активностью. При этом адьювантные свойства конструкции не уступают эффекту адьюванта Фрейнда.
2. Впервые показано, что перректальная иммунизация лабораторных животных рекомбинантными штаммами 5.1урЫтигшт 7207/рСЕХ-ТВ1 и З.еМегШсИя Е23/рОЕХ-ТВ1, продуцирующими белок ТВ1, стимулирует системный и мукозальный иммунный ответ против ВИЧ-1.
3. Продемонстрирована способность ТВ1 в формате ДНК вакцины индуцировать специфический гуморальный и клеточный ответы. При этом в сравнении с «голой» ДНК, и ВПЧ, и рекомбинантные штаммы сальмонелл обеспечивают более выраженный уровень иммунного ответа.
4. Сконструированы ВПЧ и рекомбинантный штамм сальмонелл, несущие ДНК вакцину рсВЫА-ТО, кодирующую полиэпитопный ЦТЛ иммуноген. Сравнительный анализ иммуногенности полученных конструкций продемонстрировал, что интенсивность клеточного и гуморального ответов возрастает в ряду: «голая» ДНК вакцина, ДНК вакцина в составе ВПЧ (ВПЧ-рсБМА-ТС1), рекомбинантная сальмонелла Б^рЫтипит 7207/рсБЫА-ТС1.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
Статьи:
1 .Л.И.Карпенко, С.И.Бажан, Н.А.Некрасова, О.С.Юдина, Б.П.Ключ, Т.А.Веремейко, П.А.Белавин, С.В.Серегин, Н.К.Данилюк, Л.Р.Лебедев, Т.А.Терещенко, Г.М.Левагина, В.И.Масычева, Т.А.Чеканова, М.Н. Расщепкина, М.С.Воробьева, А.А.Ильичев. Инъекционная и суппозиторная формы кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД на основе полиэпитопных иммуногенов. // Физиология и патология иммунной системы,- 2005,- N8. - С.90-95.
2. Ильичев A.A., Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Лебедев Л.Р., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Белавин П.А., Серегин С.С., Данилюк Н.К., Бажан С.И. Использование различных систем доставки ВИЧ-1 ДНК-вакцины, кодирующей поли-ЦТЛ -эпитопный иммуноген // Вестник РАМН. - 2005. - N1. - С. 41-44.
3. Некрасова H.A., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Ильичев A.A., Карпенко Л.И. Исследование системного и мукозального иммунного ответа при иммунизации мышей кандидатной ВИЧ-1 вакциной // Сибирский медицинский журнал. - 2004. -Т.19, N2. - С.60-62.
4. Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Ilyichev A.A., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Zaitsev B.N., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Bazhan S.I. Comparative analysis of the immunogenicity of artificial VLP and attenuated Salmonella strain carrying a DNA-vaccine encoding HIV-1 polyepitope CTL-immunogen // Vaccine. - 2004,- V. 22, N13-14.-P.1692-1699.
5. Карпенко Л.И., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Порываева В.А., Лебедев Л.Р., Веремейко Т.А., Некрасова H.A., Ильичев A.A. Конструирование и исследование аттенуированных штаммов сальмонелл, продуцирующих белок TBI // Вопросы вирусологии. - 2002. - N2 - С.25-28.
Патенты:
1. Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Веремейко Т.А., Левагина Г.М., Терещенко Т.А., Малахова Т.В., Ильичев A.A., Масычева В.И., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П. Суппозитории для иммунопрофилактики вирусных инфекций. Положительное решение о выдаче патента 26.09.06
2. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Некрасова H.A., Белавин П.А., Данилюк Н.К.,
Серегин C.B., Бабкина И.Н., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Бойченко М.Н.,
108
Воробьев A.A., Ильичев A.A., Сандахчиев JI.C. Рекомбинантная плазмидная ДНК pcDNA-TCI, обеспечивающая экспрессию искусственного гена TCI в клетках эукариот, и рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis E-23/pcDNA-TCI как кандидат для конструирования живой ДНК-вакцины против вируса иммунодефицита человека. Патент РФ № 2248396. Опубликован в бюллетене по изобретениям №8 от 20.03.05. 3. Карпенко Л.И., Некрасова H.A., Игнатьев Г.М., Ильичев A.A., Бойченко М.Н., Воробьев A.A. Рекомбинантный аттенуированный штамм бактерий Salmonella enteritidis E23/pGEX-2T-TBI как кандидат для конструирования живой вакцины против вируса иммунодефицита человека. Патент РФ №2237089. Опубликован в бюллетене по изобретениям №27 от 27.09.04 г.
Доклады и тезисы конференций:
1. Некрасова H.A., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Ильичев A.A., Карпенко Л.И. Исследование системного и мукозального иммунного ответа при иммунизации кандидатной ВИЧ-1 вакциной // Материалы конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунологических и фармацевтических препаратов», посвященная 100-летию со дня основания Томского НПО «Вирион» (16-17 июня 2004, Томск, Россия). -2004. - С.58.
2. Некрасова H.A., Карпенко Л.И., Ключ Б.П., Лебедев Л.Р., Юдина О.С., Чеканова Т.А., Расщепкина М.Н., Воробьева М.С., Бажан С.И., Ильичев A.A. Конструирование и исследование иммуногенных свойств «КомбиВичВак» -кандидатной вакцины против ВИЧ/СПИД// I международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», (26-28 октября 2004 , Москва, Россия): Сб. тезисов. - 2004. - С.139.
3. Некрасова H.A., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Белавин П.А., Игнатьев Г.М., Ильичев A.A. Использование аттенуированного штамма сальмонеллы S. typhimurium SL7207 для доставки ДНК вакцины против ВИЧ-1 // Материалы международного мультидисциплинарного конгресса «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (8-19 июня 2003 г., Кара-Даг, Феодосия, Украина). - С. 109.
4. H.A. Некрасова, Л.И. Карпенко, A.A. Ильичев Конструирование и исследование иммуногенных свойств рекомбинантных штаммов сальмонелл,
109 несущих различные антигены ВИЧ-1 // Материалы международной научно-практической школы-конференции "Цитокины. Воспаление. Иммунитет" -2002.-Т.1, №2, С.162
5. Карпенко Л.И., Веремейко Т.А., Некрасова H.A., Мурашев Б.В., Романович
A.Е., Игнатьев Г.М., Бойченко М.Н., Воробьев A.A., Климов H.A., Козлов А.П., Ильичев A.A. Экспрессия и иммуногенность антигенов ВИЧ-1 и вируса гепатита
B, продуцируемых вакцинными штаммами сальмонелл // Вакцины и иммунизация: Пятый международный форум по глобальной вакцинологии (15-16 сентября 2001 г., Минск, Беларусь): Тез. докл. - Минск.- 2001. - С.36-37.
6. ICarpenko L.I., Ignat'ev G.M., Agafonov А.Р., Murashev B.V., Nekrasova N.A., Veremeiko T.A., Boichenko M.N., Vorob'ev A.A., Klimov N.A., Kozlov A.P., Ilyichev A.A. Delivery of HBV and HIV-1 proteins using attenuated Salmonella strains.// Russian Journal of HIV/AIDS and Related Problems.- 2001,- V.5, N1.- P.l 14.
7. Karpenko L.I., Veremeiko T.A., Nekrasova N.A., Chikaev N.A., Ignat'ev G.M., Poryvaeva V.A., Ilyichev A.A. Recombinant attenuated Salmonella for delivery of HIV-1 and HBV antigens // Workshop "Virus-like particles as vaccines" September 26-29, 2001 Berlin, Germany. Abstract book-P.34.
8. Bazhan S.I., Ilyichev A.A., Pokrovsky A.G., Ignayiev G.M., Belavin P.A., Seregin S.V., Danilyuk N.K., Babkina I.N., Karpenko L.I., Lebedev L.R., Shchelkunov S.N., Ryzankin I.V., Nesterov A.E., Nekrasova N.A., Bachinsky A.G., Maksytov A.Z., Eroshkin A.M. The current approaches to development of an effective abd safe vaccine against HIV-1 // IV ISTC scientific advisory committee seminar on basic science in ISTC activities (Akademgorodok, Novosibirsk, 23-27 April, 2001). - P.19.
9. Nekrasova N.A., Murashev B.V., Romanovich A.E., Ignat'ev G.M., Agafonov A.P., Pronyaeva T.R. and Karpenko L.I. Anti-HIV DNA vaccine delivering by attenuated strain Salmonella typhimurium 7207 // Sixth John Humphrey advanced summer programme in immunology. September 15-22, 2002, Pushchino. Abstract book -P.130
10. Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Bazhan S.I., Ilyichev A.A. Delivery of artificial HIV-1 multi-epitope proteins and DNA vaccine by attenuated Salmonella strains // XII Intern. Congress of Virology ( Paris, 9-13 August 2002): - Abstr. -V.807.
11. Ilyichev A.A., Nekrasova N.A., Ignatyev G.M., Agafonov A.P., Karpenko L.I. Rectal and oral immunization with recombinant attenuated Salmonella carrying HIVDNA vaccine // DNA vaccines (23-25 October 2002, Edinburgh, Scotland, UK). - P.49.
12. Nekrasova N. A., Ignatyev G. M„ Agafonov A. P., Lebedev L.R., Ilyichev A. A., Karpenko L.I. Different delivery systems for artificial polyepitope HIV-1 antigen // 13th symposium on HIV infection. June 3-5, 2004 Toulon, France. Abstract book - B.14.
Благодарности
Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю Карпенко Ларисе Ивановне за организацию работы и помощь в интерпретации полученных результатов.
Белавина П.А., Гилеву И.П. и Каргинову Е.А. автор благодарит за предоставленные для изучения плазмидные конструкции.
Бойченко М.Н. и Stocker В.А. автор благодарит за любезно предоставленные аттенуированные штаммы сальмонелл
Лебедева Л.Р. автор благодарит за большой вклад в получение препаратов ВИЧ.
Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам лаборатории иммунологической безопасности и лично Георгию Михайловичу Игнатьеву и Александру Петровичу Агафонову за обучение иммунологическим методам и большую помощь в проведении иммунизаций животных.
Плясунову O.A. и Проняеву Т.Р. автор благодарит за постановку реакций вирус-нейтрализации.
Зайцева Б.Н. автор благодарит за проведение микроскопических исследований.
Автор приносит благодарность соавторам, благодаря которым стало возможным опубликование результатов проделанной работы: Бажану С.И., Белавину П.А., Данилюк Н.К., Серегину C.B., Бабкиной И.Н., Юдиной О.С., Нестерову А.Е., Игнатьеву Г.М., Агафонову А.П.
Считаю приятным долгом поблагодарить заведующего отделом иммунотерапевтических препаратов Ильичева Александра Алексеевича за организационные и воспитательные моменты.
Рецензентам, Татьяне Николаевне Ильичевой и Александру Борисовичу Рыжикову, хочу выразить глубокую признательность за внимательное рецензирование диссертационной работы.
Отдельную благодарность за помощь и поддержку выражаю сотрудникам лаборатории разработки средств иммунопрофилактики, в которой была выполнена данная работа.
Заключение
Учитывая продолжающееся распространение эпидемии СПИДа во всем мире, задача создания вакцины против ВИЧ-инфекции имеет чрезвычайно актуальное значение и требует создания новых подходов к разработке эффективных анти-ВИЧ вакцин. Один из перспективных подходов связан с созданием синтетических полиэпитопных вакцин [HankeT. et al. 1998, Woodberry Т. et al. 1999, Firat FI. et al. 2001, Bazhan S. et al. 2004, Lorin C. et al. 2005]. Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» были сконструированы два полиэпитопных иммуногена TBI и TCI для стимуляции гуморального и клеточного иммунного ответа [Eroshkin A.M. et al. 1995, Bazhan S.I. et al. 2004]. В данной работе были разработаны оригинальные способы доставки этих искусственных антигенов и исследованы их иммуногенные свойства.
В качестве системы доставки белка TBI были использованы вирусоподобные частицы (ВПЧ), экспонирующие на своей поверхности белок GST-TBI. Использование ВПЧ для доставки белка TBI способствовало пролонгации иммунного ответа на целевой иммуноген, при этом было показано, что ВПЧ проявляют адъювантный эффект сравнимым с эффектом, вызываемым введением полного адъюванта Фрейнда. Эти результаты позволяют рассматривать вирусоподобные частицы как перспективную систему представления вирусных и бактериальных антигенов иммунной системе.
Для экспрессии белка TBI в эукариотической системе клеток была получена экспериментальная ДНК вакцина pcDNA-TBI. Серьезной проблемой ДНК вакцинации является быстрая деградация плазмидной ДНК нуклеазами. Предотвратить разрушение ДНК можно путем ее инкапсулирования в биосовместимые и биодеградируемые полимеры. Нано- и микрочастицы, созданные на основе таких полимеров рассматриваются в настоящее время как один из перспективных способов доставки ДНК вакцин [Z. Cui et. al. 2003, J. Panyam and V. Labhasetwar 2003]. В нашей работе мы использовали вирусоподобные частицы для доставки ДНК вакцины. Мы предполагали, что оболочка из полиглюкина позволит защитить ДНК от быстрой деградации. Иммунизация лабораторных животных конструкцией БПЧ-pcDNA-TBI вызывала более эффективную стимуляцию ИО (как клеточного, так и гуморального звеньев) по сравнению с использованием "голой" ДНК вакцины. Следует отметить, что основным эффектом применения ВПЧ для доставки ДНК вакцины, как и в случае использования ВПЧ для доставки рекомбинантного белка, является пролонгация ИО. Полученный результат является важным показателем эффективности вакцинной конструкции.
При парентеральном введении иммуногенов удается активировать в основном только системный ИО, в то время как местный иммунитет очень важен для предотвращения проникновения вируса через слизистые оболочки. Для создания кандидатной вакцины, способной активировать мукозальный иммунитет были получены рекомбинантные штаммы сальмонеллы, продуцирующие белок GST-TBI. Мы показали, что перректальная иммунизация мышей рекомбинантными сальмонеллами приводила к формированию как системного, так и местного гуморального ответа.
Другой полиэпитопный иммуноген - белок TCI был спроектирован как Т~ клеточный иммуноген. На наш взгляд, применение белка TCI в форме ДНК вакцины является одним из наиболее перспективных путей применения этого иммуногена. ДНК вакцинная конструкция pcDNA-TCI была получена сотрудником ГНЦ ВБ "Вектор" П.А. Белавиным и любезно нам предоставлена для дальнейшего исследования.
С целью повышения иммуногенности ДНК вакцины pcDNA-TCI в качестве систем доставки использовали вирусоподобные частицы и аттенуированный штамм сальмонеллы S.typhimurium SL7207. Наиболее высокий уровень ИО был зарегистрирован в группе животных, иммунизированных клетками сальмонеллы, несущих ДНК вакцину.
В ходе работы были выбраны конструкции, при иммунизации которыми был зафиксирован наиболее высокий уровень иммунного ответа. На основе ВПЧ-TBI и рекомбинантного штамма сальмонеллы, несущей ДНК вакцину pcDNA-TCI, были созданы экспериментальные образцы кандидатных вакцин против ВИЧ-1.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Некрасова, Надежда Александровна, Кольцово
1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Гос. изд. Медицинской литературы. JI. 1962г.
2. Бойченко M. Н., Воробьев А. А. Использование сальмонелл в качестве вектора при создании рекомбинантных вакцин. // Вестн. РАМН. 1997. - N 3. - С. 43-46.
3. Бойченко M. Н., Елкина С. И. Изучение вирулентности и иммуногенных свойств у мутантов S.typhimurium по цАМФ. // Журнал микробиологии. 1980. -N12.-С. 47-49.
4. Бойченко М.Н., Воробьев A.A., Тымчук С.Н. Перспектива получения мутантов суа и сгр сальмонелл для использования в качестве вакцинных штаммов. // Вестн. РАМН. 1995.- N 10. - С. 37-39.
5. Карпенко Л.И., Бажан С.И., Игнатьев Г.М., Лебедев Л.Р., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С. Искусственные анти-ВИЧ иммуногены и методы их доставки. // Вест.Рос. акад. Наук.- 2003. N1. - С. 24-30
6. Лебедев Л.Р., Карпенко Л.И., Порываева В.А., Азаев М.Ш., Рябчикова Е.И., Гилева И.П., Ильичев A.A. Конструирование вирусоподобных частиц, экспонирующих эпитопы ВИЧ-1. // Молекул, биология.- 2000.- Т. 34, N3.- С. 480485
7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984
8. Остерман Л.А. Методы исследований белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М., "Наука", 1981.
9. Хоробых В.В., Пронин А.В., Киркин А.Ф., Санин А.В. Методы постановки реакции бласттрансформации в микромодификации. // Иммунология. 1983. - N3. - С.76-79.
10. Amerongen H.M., Weltzin R., Farnet C.M., Michetti P., Haseltine W.A., Neutra M.R. Transepithelial transport of HIV-1 by intestinal M cells: a mechanism for transmission of AIDS. // J Acquir Immune Defic Syndr. -1991- V. 4(8) P. 760-765.
11. Anderson J., Clark R.A., Watts D.H., Till M., Arrastia C., Schuman P. Idiopathic genital ulcers in women infected with human immunodeficiency virus. // J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. -1996. V. 13(4). - P.343-7.
12. Anderson R.M., May R.M. The population biology of the interaction between HIV-1 and HIV-2: coexistence or competitive exclusion? // AIDS. 1996. - V.10 (14). -P.1663-73.
13. Asakura Y., Mohri H., Okuda K. Perinatal transmission of HIV-1. // JAMA. -1996- V. 23-30,276(16)-P. 1300 1301.
14. Berzofsky J.A., Ahlers J.D., Belyakov I.M. Strategies for designing and optimizing new generation vaccines. //Nat Rev Immunol.- 2001.- V.1.-N3.- P. 209-19.115
15. Bloomfield V. A. DNA condensation. // Curr. Opin. Struct. Biol. -1996.- V.6(3).-P.334-41.
16. Bomsel M. Transcytosis of infectious human immunodeficiency virus across a tight human epithelial cell line barrier. // Nat Med. -1997- V. 3(1) V. 42-47.
17. Borras-Cuesta F., Petit-Camurdan A., Fedon Y. Engineering of immunogenic peptides by co-linear synthesis of determinants recognized by B and T cells. // Eur J Immunol.-1987-V. 17(8)-P. 1213-1215.
18. Brander C., Walker B.D. T lymphocyte responses in HIV-1 infection: implications for vaccine development. // Curr Opin Immunol. -1999- V. 11(4) P. 451459.
19. Brandtzaeg P., Farstad I.N., Johansen F.E., Morton H.C., Norderhaug I.N., Yamanaka T. The B-cell system of human mucosae and exocrine glands. // Immunol Rev.-1999- V. 171-P. 45-87.
20. Burton D. R. A vaccine for HIV type 1: the antibody perspective. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94 (19). - P.10018-23.
21. Calarota S., Bratt G., Nordlund S., Hinkula J., Leandersson A.C., Sandstrom E., Wahren B. Cellular cytotoxic response induced by DNA vaccination in HIV-1-infected patients. // Lancet. -1998- V. 2,351(9112) P. 1320-1325.
22. Cattozzo E.M., Stacker B.A., Radaelly A., De Giuli Morghen C., Tognon M. Expression and immunogenicity of V3 loop epitopes of HIV-1, isolates SC and WMJ2, inserted in Salmonella flagellin. // J Biotechnol. 1997. - Vol. 56.-P. 191-203.
23. Chanh T.C., Kennedy R.C., Alderete B.E., Kanda P., Eichberg J.W., Dreesman G.R. Human immunodeficiency virus gpl20 glycoprotein detected by a monoclonal antibody to a synthetic peptide. // Eur J Immunol. 1986. - V.16.- N11.- P.1465-8.
24. Chatfield S.N, Roberts M, Dougan G, Hormaeche C., Khan C.M. The development of oral vaccines against parasitic diseases utilizing live attenuated Salmonella.// Parasitology.-1995,- 110 Suppl.-P.17-24.
25. Chong C, Bost K.L, Clements J.D. Differential production of interleukin-12 mRNA by murine macrophages in response to viable or killed Salmonella spp. // Infect Immun. 1996. - V. 64(4).- P. 1154-60.
26. Cicala C, Arthos J., Rubbert A., Selig S., Wildt K, Cohen O,J„ Fauci A.S. HIV-1 envelope induces activation of caspase-3 and cleavage of focal adhesion kinase in primary human CD4(+) T cells. // Proc Natl Acad Sci USA. -2000- V. 97 (3) P. 11781183.
27. Clements J.D, El-Morshidy S. Construction of a potential live oral bivalent vaccine for typhoid fever and cholera-Escherichia coli-related diarrheas.// Infect. Immun.- 1984.- V. 46(2).- P.564-9.
28. Cochlovius B., Stassar M.J., Schreurs M.W., Benner A., Adema G.J. Oral DNA vaccination: antigen uptake and presentation by dendritic cells elicits protective immunity.// Immunol. Lett. 2002. - V.80 (2).- P.89-96.
29. Cohen H., Levy R.J., Gao J., Fishbein I., Kousaev V., Sosnowski S., Slomkowski S., Golomb G. Sustained delivery and expression of DNA encapsulated in polymeric nanoparticles. // Gene Ther. 2000. - V.7(22).- P. 1896-905.
30. Cohen S., Powell C.J., Dubois D.R., Hartman A., Summers P.L., Eckels K.H. Expression of the envelope antigen of dengue virus in vaccine strains of Salmonella. // Res. Microbiol.-1990. V.141 (7-8). - P.855-8.
31. Collins K.L., Chen B.K, Kalams S.A., Walker B.D., Baltimore D. HIV-1 Nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes. // Nature. -1998- V. 22,391(6665)-P. 397-401.
32. Cui Z., Mumper R.J. Microparticles and nanoparticles as delivery systems for DNA vaccines. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. -2003- V. 20(2-3) P. 103-137.
33. Cui Z., Mumper R.J. Microparticles and nanoparticles as delivery systems for DNA vaccines. // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 2003.-20(2-3). - P.103-37.
34. Curtiss R. 3rd, Goldschmidt R.M., Fletchall N.B., Kelly S.M. Avirulent Salmonella typhimurium delta cya delta crp oral vaccine strains expressing a streptococcal colonization and virulence antigen.// Vaccine.-1988.- V.6(2).- P.155-60.
35. Curtiss R. 3rd, Kelly S.M. Salmonella typhimurium deletion mutants lacking adenylate cyclase and cyclic AMP receptor protein are avirulent and immunogenic. // Infect. Immun.-1987. V.55(12).- P.3035-43.
36. Dalla Pozza T., Yan H., Meek D., Guzman C.A., Walker M.J. Construction and characterisation of Salmonella typhimurium aroA simultaneously expressing the five pertussis toxin subunits. //Vaccine. 1998. - V.16 (5). - P.522-9.
37. Daniel M.D., Kirchhoff F., Czajak S.C., Sehgal P.K., Desrosiers R.C. Protective effects of a live attenuated SIV vaccine with a deletion in the nef gene. // Science. -1992-V. 18,258(5090)-P. 1938-1941.
38. Darji A., Guzman C.A., Gerstel B., Wachholz P., Timmis K.N., Wehland J., Chakraborty T., Weiss S. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium. // Cell. 1997.- V. 12,91(6).- P.765-75.
39. Deck R.R., DeWitt C.M., Donnelly J.J., Liu M.A., Ulmer J.B. Characterization of humoral immune responses induced by an influenza hemagglutinin DNA vaccine. // Vaccine.-1997-V. 15(1)-P. 71-78.
40. Desrosiers R.C. Prospects for an AIDS vaccine. // Nat Med. -2004- V. 10(3) P. 221-223.
41. Dhiman N., Dutta M., Khuller G.K. Poly (DL-lactide-co-glycolide) based delivery systems for vaccines and drugs. // Indian J Exp Biol. -2000-V. 38(8) P. 746752.
42. Dietrich G., Gentschev I., Hess J., Ulmer J.B., Kaufmann S.H., Goebel W. Delivery of DNA vaccines by attenuated intracellular bacteria. // Immunol. Today. -1999.-V.20 (6).- P.251-3.
43. Donnelly J.J., Liu M.A., Ulmer J.B. Antigen presentation and DNA vaccines. Am // J Respir Crit Care Med. -2000- V. 162, N 2. P. 190-193.
44. Donnelly J.J., Martinez D., Jansen K.U., Ellis R.W., Montgomery D.L., Liu M.A. Protection against papillomavirus with a polynucleotide vaccine. // J Infect Dis. -1996-V. 173(2)-P. 314-320.
45. Donnelly J.J., Ulmer J.B., Shiver J.W., Liu M.A. DNA vaccines. // Annu. Rev. Immunol.-1997.- V.15.- P.617-48.
46. Donnelly J.J., Wahren B., Liu M.A. DNA vaccines: progress and challenges. // J. Immunol.- 2005.- V.175(2).- P.633-9.
47. Du A., Wang S. Efficacy of a DNA vaccine delivered in attenuated Salmonella typhimurium against Eimeria tenella infection in chickens. //Int. J. Parasitol. 2005.-V.35.-N7.- P. 777-85.
48. Dunn D.T., Newell M.L., Ades A.E., Peckham C.S. Risk of human immunodeficiency virus type 1 transmission through breastfeeding. // Lancet. -1992- V. 5,340(8819)-P. 585-588.
49. Dunstan S.J., Simmons C.P., Strugnell R.A. Comparison of the abilities of different attenuated Salmonella typhimurium strains to elicit humoral immune responses against a heterologous antigen.// Infect. Immun.-1998. V.66(2).- P.732-40.
50. Eroshkin A.M., ICarginova E.A., Gileva I.P., Lomakin A.S., Lebedev L.R., Kamyinina T.P., Pereboev A.V., Ignat'ev G.M. Design of four-helix bundle protein as a candidate for HIV vaccine. // Protein Eng. 1995. - V. 8(2). - P. 167-173.
51. Eroshkin A.M., Zhilkin P.A, Shamin V.V., Korolev S, Fedorov B.B. Artificial protein vaccines with predetermined tertiary structure: application to anti-HIV-1 vaccine design. // Protein Eng. -1993- V. 6(8) P. 997-1001.
52. Fairweather N.F., Chatfield S.N., Charles I.G., Roberts M., Lipscombe M., Li L.J., Strugnell D., Comerford S., Tite J., Dougan G. Use of live attenuated bacteria to stimulate immunity. //Res. Microbiol.-1990. V.141 (7-8). - P.769-73.
53. Forthal D.N., Landucci G., Keenan B. Relationship between antibody-dependent cellular cytotoxicity, plasma HIV type 1 RNA, and CD4+ lymphocyte count.// AIDS Res Hum Retroviruses.-2001.-V. 10 (6).-P. 553-561.
54. Fouts T.R, Lewis G.K, Hone D.M. Construction and characterization of a Salmonella typhi-based human immunodeficiency virus type 1 vector vaccine.// Vaccine. 1995. - V.13 (6).- P. 561-9.
55. Fowler M.G. Update: transmission of HIV-1 from mother to child. // Curr Opin Obstet Gynecol. -1997- V. 9(6) P. 343-348.
56. Frankel A.D., Bredt D.S., Pabo C.O. Tat protein from human immunodeficiency virus forms a metal-linked dimer.// Science. 1988. - V.240 (4848). - P. 70-73.
57. Gilman R.H., Hornick R.B, Woodard W.E, DuPont H.L, Snyder M.J, Levine M.M, Libonati J.P. Evaluation of a UDP-glucose-4-epimeraseless mutant of Salmonella typhi as a liver oral vaccine.// J. Infect. Dis. 1977. - V. 136(6).- P.717-23.
58. Goebel F.D., Mannhalter J.W, Belshe R.B, Eibl M.M, Grob P.J, de Gruttola V, Griffiths P.D., Erfle V, Kunschak M, Engl W. Recombinant gpl60 as a therapeutic vaccine for HIV-infection: results of a large randomized, controlled trial. European
59. Multinational IMMUNO AIDS Vaccine Study Group. // AIDS. -1999- V.13(12) P. 1461-1468.
60. Gonzalo R.M., Rodriguez D., Garcia-Sastre A., Rodriguez J.R., Palese P., Esteban M. Enhanced CD8+ T cell response to HIV-1 env by combined immunization with influenza and vaccinia virus recombinants. // Vaccine. 1999.- V.17(7-8).- P.887-92.
61. Goulder P.J., Rowland-Jones S.L., McMichael A.J., Walker B.D. Anti-HIV cellular immunity: recent advances towards vaccine design. // AIDS. -1999- V. 13 P. 121-136.
62. Grillot-Courvalin C., Goussard S., Huetz F., Ojcius D.M., Courvalin P. Functional gene transfer from intracellular bacteria to mammalian cells. // Nat. Biotechnol. 1998.- V.16(9).- P.862-6.
63. Gulig P.A., Curtiss R. 3rd. Plasmid-associated virulence of Salmonella typhimurium.//Infect. Immun. 1987,- V.55(12).- P.2891-901.
64. Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. DNA vaccines: immunology, application, and optimization. // Annu Rev Immunol. -2000- V. 18 P. 927-974.
65. Hackett J. Use of Salmonella for heterologous gene expression and vaccine delivery systems.// Curr Opin Biotechnol. 1993. - V.4(5).- P.611-5.
66. Hanke T, Schneider J, Gilbert SC, Hill AV, McMichael A. DNA multi-CTL epitope vaccines for HIV and Plasmodium falciparum: immunogenicity in mice. // Vaccine. 1998. - V.16 (4).- P. 426-35.
67. Hasan U.A., Abai A.M., Harper D.R., Wren B.W., Morrow W.J. Nucleic acid immunization: concepts and techniques associated with third generation vaccines. // J Immunol Methods. -1999- V. 29,229(1-2) P. 1-22.
68. Ho D.D. HIV-1 dynamics in vivo. // J Biol Regul Homeost Agents. -1995- V. 9(3) -P. 76-77.
69. Hoiseth S.K., Stocker B.A. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines.// Nature. 1981. - V. 291(5812).- P.238-9.
70. Jang J.-H. and Shea L.D. Intramuscular delivery of DNA releasing microspheres: microsphere properties and transgene expression. // J. Control. Release. -2006. V.l 12(1).- P.120-8.
71. Katare Y.K., Muthukumaran T., Panda A.K. Influence of particle size, antigen load, dose and additional adjuvant on the immune response from antigen loaded PLA microparticles. // Int. J. Pharm. 2005. - V. 301(1-2).- P.149-60.
72. Kaufmann S.H. and Hess J. Immune response against Mycobacterium tuberculosis: implications for vaccine development. // J. Biotechnol. 2000. - V. 83(1-2).- P.13-7.
73. Kozlowski PA, Neutra MR. The role of mucosal immunity in prevention of HIV transmission. // Curr Mol Med. 2003. - V. 3(3).-P.217-28.
74. Kushibiki T, Tomoshige R, Fukunaka Y, Kakemi M, Tabata Y. In vivo release and gene expression of plasmid DNA by hydrogels of gelatin with different cationization extents. // J. Control Release. 2003,- V.90(2).- P.207-16.
75. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assemly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - v.227. - N 5259. - P. 680-685.
76. Lehner T, Bergmeier L.A, Wang Y, Tao L, Sing M, Spallek R, van der Zee R. Heat shock proteins generate beta-chemokines which function as innate adjuvants enhancing adaptive immunity. // Eur J Immunol. -2000- V. 30(2) P. 594-603.
77. Letvin N.L. Progress in the development of an HIV-1 vaccine.// Science. 1998. -V. 19;280(5371). -P.1875-1880.
78. Letvin N.L. What immunity can protect against HIV infection. // J Clin Invest. -1998- V. 1,102(9)-P. 1643-1644.
79. Levine M.M, Kaper J.B, Black R.E, Clements M.L. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development.// Microbiol Rev.- 1983,- Dec;47(4).- P.510-50.
80. Lohman B.L., Miller C.J., McChesney M.B. Antiviral cytotoxic T lymphocytes in vaginal mucosa of simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques. // J Immunol.-1995- V. 155(12)-P. 5855-5860.
81. Lunsford L., McKeever U., Eckstein V., Hedley M.L. Tissue distribution and persistence in mice of plasmid DNA encapsulated in a PLGA-based microsphere delivery vehicle. // J Drug Target. -2000- V. 8(1) P. 39-50.
82. Lutsiak C.M., Sosnowski D.L., Wishart D.S., Kwon G.S., Samuel J. Use of a liposome antigen delivery system to alter immune responses in vivo, // J Pharm Sei. -1998- V. 87(11)-V. 1428-1432.
83. Mazanec M.B., Kaetzel C.S., Lamm M.E., Fletcher D., Nedrud J.G. Intracellular neutralization of virus by immunoglobulin A antibodies. // Proc Natl Acad Sci US A,-1992- V. 89(15)-P. 6901-6905.
84. McMichael A.J., Hanke T. Is an HIV vaccine possible? // Nat Med. 1999. - V. 5(6).-P. 612-616.
85. McMichael A.J., Phillips R.E. Escape of human immunodeficiency virus from immune control. // Annu Rev Immunol. -1997- V. 15 P. 271-296.
86. Medina E., Guzman C.A. Modulation of immune responses following antigen administration by mucosal route.// FEMS Immunol. Med. Microbiol.- 2000. V. 27(4).-P.305-11.
87. Meyer H., Sutter G., Mayr A. Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence. // J Gen Virol. -1991-V. 72, N5-P. 1031-1038.
88. Montgomery D.L., Ulmer J.B., Donnelly J.J., Liu M.A. DNA vaccines. // Pharmacol Ther. -1997- V. 74(2) P. 195-205.
89. Mor G., Singla M„ Steinberg A.D., Hoffman S.L., Okuda K., Klinman D.M. Do DNA vaccines induce autoimmune disease? // Hum Gene Ther. -1997- V. 10;8(3)-P. 293-300.
90. Moss D.J., Schmidt C., Elliott S., Suhrbier A., Burrows S., Khanna R. Strategies involved in developing an effective vaccine for EBV-associated diseases. // Adv Cancer Res.-1996- V. 69-P. 213-245.
91. Nathanson N., Mathieson B.J. Biological considerations in the development of a human immunodeficiency virus vaccine. // J Infect Dis. -2000-V. 182(2) P. 579-589. Epub 2000 Jul 28.
92. Nelson R. New HIV vaccine shows promising results in preclinical studies. //Lancet. 2003,- V. 10;361(9369).- P. 1627.
93. Neutra M.R., Frey A., Kraehenbuhl J.P. Epithelial M cells: gateways for mucosal infection and immunization. // Cell. -1996- V. 86(3) P. 345-348.
94. Newton S.M., Jacob C.O., Stacker B.A. Immune response to cholera toxin epitope inserted in Salmonella flagellin. // Science. -1989- V. 7, 244(4900) P. 70-72.
95. O'Hagan D.T., Ugozzoli M., Barackman J., Singh M., Kazzaz J., Higgins K., Vancott T.C., Ott G. Microparticles in MF59, a potent adjuvant combination for a recombinant protein vaccine against FIIV-1. // Vaccine. -2000- V. 18(17) P. 17931801.
96. Pantaleo G, Fauci A.S. Tracking HIV during disease progression. // Curr Opin Immunol. -1994- V. 6(4) P. 600-604.
97. Panyam J. and Labhasetwar V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2003,- V. 55(3).- P.329-47.
98. Pascual D.W, Powell R.J, Lewis G.K, Hone D.M. Oral bacterial vaccine vectors for the delivery of subunit and nucleic acid vaccines to the organized lymphoid tissue of the intestine. // Behring. Inst. Mitt.-1997. V.98. - P. 143-52.
99. Rizzuto C, Sodroski J. Fine definition of a conserved CCR5-binding region on the human immunodeficiency virus type 1 glycoprotein 120. // AIDS Res Hum Retroviruses. 2000. - V. 16(8). - P. 741-750.
100. Roberts M, Chatfield S.N, Dougan G. Salmonella as carries of heterologous antigens. P.27-58 In D.T. O Hagan (ed.), Novel delivery system for oral vaccines. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla
101. Robinson H.L. DNA vaccines for immunodeficiency viruses. // AIDS. -1997- V. 11 Suppl A P. 109-119.
102. Rollman E., Hinkula J., Arteaga J., Zuber B., Kjerrstrom A., Liu M., Wahren B., Ljungberg K. Multi-subtype gpl60 DNA immunization induces broadly neutralizing anti-HIV antibodies. // Gene Ther. -2004- V. 11(14) P. 1146-1154.
103. Rowland-Jones S., Tan R. Control of HIV co-receptor expression: implications for pathogenesis and treatment.// Trends Microbiol. 1997. - V. 5(8). - P. 300-302.
104. Rowland-Jones S.L., McMichael A. Immune responses in HIV-exposed seronegatives: have they repelled the virus? // Curr Opin Immunol. -1995- V. 7(4) P. 448-455.
105. Ruprecht R.M. Live attenuated AIDS viruses as vaccines: promise or peril? // Immunol. Rev.-1999. -N170.-P. 135-49.
106. Sandstrom E., Wahren B. Therapeutic immunisation with recombinant gpl60 in HIV-1 infection: a randomised double-blind placebo-controlled trial. Nordic VAC-04 Study Group. // Lancet. -1999- V. 353(9166) P. 1735-1742.
107. Saporito-Irwin SM, Geist RT, Gutmann DH. Ammonium acetate protocol for the preparation of plasmid DNA suitable for mammalian cell transfections. Biotechniques. -1997.-V. 23(3).-P. 424-7.
108. Schoen C., Stritzker J., Goebel W., Pilgrim S. Bacteria as DNA vaccine carriers for genetic immunization. // Int. J. Med. Microbiol.- 2004.- V. 294,- N5.- P. 319-35.
109. Schwartz O., Marechal V., Le Gall S., Lemonnier F., Heard J.M. Endocytosis of major histocompatibility complex class I molecules is induced by the HIV-1 Nef protein. // Nat Med. -1996- V. 2(3) P. 338-342.
110. Shata M.T, Reitz M.S. Jr, DeVico A.L, Lewis G.K, Hone D.M. Mucosal and systemic HIV-1 Env-specific CD8(+) T-cells develop after intragastric vaccination with a Salmonella Env DNA vaccine vector. // Vaccine. 2001. - V.20(3-4).- P.623-9.
111. Sidney J, Grey H. M, Kubo R.T. Practical, biochemical and evolutionary implications of the discovery of HLA class I supermotifs. // Immunol. Today. 1996. -V. 17.-P. 261-266
112. Singh M, Kazzaz J, Ugozzoli M, Malyala P, Chesko J, O'Hagan D.T. Polylactide-co-glycolide microparticles with surface adsorbed antigens as vaccine delivery systems. // Curr. Drug. Deliv. 2006. - V.3(l).- P.l 15-20.
113. Spearman P. Current progress in the development of HIV vaccines. // Curr Pharm Des. -2006.-V. 12. N9,- P. 1147-67.
114. Staats HF, Jackson RJ, Marinaro M, Takahashi I, Kiyono H, McGhee JR. Mucosal immunity to infection with implications for vaccine development. // Curr Opin Immunol. 1994. - V.6(4).-P. 572-83.
115. Stocker B.A. Aromatic-dependent salmonella as anti-bacterial vaccines and as presenters of heterologous antigens or of DNA encoding them. // J. Biotechnol. 2000. -V. 83(1-2).-P.45-50.
116. Stocker BA. Auxotrophic Salmonella typhi as live vaccine.//Vaccine.- 1988. V. 6(2).- P.141-5.
117. Sturesson C, Degling Wikingsson L. Comparison of poly(acryl starch) and poly(lactide-co-glycolide) microspheres as drug delivery system for a rotavirus vaccine. // J Control Release. -2000- V.3, 68(3) P. 441-450.
118. Tavegp T. Cellular and humoral immune responses to a canarypox vaccine containing human immunodeficiency virus type 1 Env, Gag, and Pro in combination with RGP120. // J Infect Dis. 2001-V.18 - P.563-570
119. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding current status and outlook. // J. Immunol. Meth. - 1984. - V. 12.- p. 313-340.
120. Townsend A., Bodmer H. Antigen recognition by class I-restricted T lymphocytes. Annu Rev Immunol. -1989- V. 7 P. 601-624.
121. Truong-Le V.L., August J.T., Leong K.W. Controlled gene delivery by DNA-gelatin nanospheres. // Hum. Gene Ther. 1998.- V. 9(12).- P.1709-17.
122. Van Heyningen WE, Van Heyningen S, King CA. The nature and action of cholera toxin. // Ciba Found Symp.-1976. V.42.-P. 73-88.
123. Velin D., Hopkins S., Kraehenbuhl J.P. 1998. Delivery systems and adjuvants for vaccination against HIV. // Pathobiology. V.66, N3-4. - P. 170-175.
124. Walker C.M., Moody D.J., Stites D.P., Levy J.A. CD8+ lymphocytes can control HIV infection in vitro by suppressing virus replication.// Science. -1986- V. 234(4783)-P. 1563-6.
125. Walker G.T., Fraiser M.S., Schram J.L., Little M.C., Nadeau J.G., Malinowski D.P. Strand displacement amplification-an isothermal, in vitro DNA amplification technique.//Nucleic Acids Res. 1992.- V.ll;20.-P.1691-6.132
126. Walter E, Merkle H.P. Microparticle-mediated transfection of non-phagocytic cells in vitro. // J Drug Target. -2002- V. 10(1) P. 11-21.
127. Wange R.L, Samelson L.E. Complex complexes: signaling at the TCR.// Immunity. -1996- V. 5(3) P. 197-205.
128. Weber J. The pathogenesis of HIV-1 infection. // Br Med Bull. 2001. - V.58. -P. 61-72.
129. Weintraub H, Cheng P.F, Conrad K. Expression of transfected DNA depends on DNA topology. // Cell.-1986. V. 46(1). - P.l 15-22.
130. Weiss A, Littman D.R. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors.// Cell. -1994- V. 76(2) P. 263-74.
131. Whatmore A.M., Cook N, Hall G.A, Sharpe S, Rud E.W, Cranage M.P. Repair and evolution of nef in vivo modulates simian immunodeficiency virus virulence. // J Virol.-1995-V. 69(8)-P. 5117-5123.
132. Wyatt R, Sodroski J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. // Science.-1998. V. 280(5371). - P. 1884-8.
133. Yahi N, Fantini J, Mabrouk K, Tamalet C, de Micco P, van Rietschoten J, Rochat H, Sabatier J.M. Multibranched V3 peptides inhibit human immunodeficiency virus infection in human lymphocytes and macrophages. //J Virol.- 1994.- V.68.-N9.-P. 5714-20.
134. Young K.R., McBurney S.P., Karkhanis L.U., Ross T.M. Virus-like particles: Designing an effective AIDS vaccine. //Methods.- 2006- V. 40.-N1.- P. 98-117
-
Некрасова, Надежда Александровна
-
кандидата биологических наук
-
Кольцово, 2006
-
ВАК 03.00.03
- Исследование специфической активности полиэпитопных T-клеточных ВИЧ-1 иммуногенов, полученных с использованием различных стратегий проектирования
- Теоретическое исследование механизмов противовирусного иммунитета
- Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев
- Полиэпитопные рекомбинантные вакцины против вируса гепатита B и ВИЧ-1
- Разработка методических подходов к рациональному дизайну полиэпитопных T-клеточных антигенов
