РНК-интерференция в клетках человека, инфицированных рекомбинантным лентивирусом in vitro

Головин, Евгений Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
РНК-интерференция в клетках человека, инфицированных рекомбинантным лентивирусом in vitro
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "РНК-интерференция в клетках человека, инфицированных рекомбинантным лентивирусом in vitro"

005015980

На правах рукописи

__-V''

ГОЛОВИН Евгений Владимирович

РНК-интерференция в клетках человека, инфицированных рскомбипантным лентивнрусом in vitro

03.03.04- клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 МАЙ 2012

Казань - 2012

005015980

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении Высшего профессионального образования^ «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Анохин Владимир Алексеевич Научный консультант:

доктор биологических наук, доцент Рнзванов Альберт Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой медицинской биологии и генетики Исламов Рустем Робертович

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО ИГМА Минздравсоцразвития России, заведующий кафедрой биологии с экологией Чучкова Наталья Николаевна

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН, г. Москва.

0 >о

Защита состоится 18 мая 2012 года в ч/ часов на заседании диссертационного совета Д 208.034.01. при ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49 «б»).

Автореферат разослан 18 апреля 2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Л.Н. Залялютдинова

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Проблема лечения вирусных инфекций остается одной из самых актуальных и недостаточно разработанных в практической медицине. Актуальность обусловлена с одной стороны ростом заболеваемости вирусными инфекциями, а с другой стороны отсутствием методов эффективного лечения для многих из них. В рамках этой проблемы несомненный интерес представляют вопросы, связанные с инфекцией, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ, семейство К.ейчэушс1ае, роду Ьег^тгив), по причине которой ежегодно в мире умирают 1 800 ООО человек. Антиретровирусная терапия - современный стандарт лечения, не приводит к излечению ВИЧ-инфекции, что связано в 1 очередь со сложностью моделирования этого заболевания в лабораторных условиях для изучения механизмов воздействия вируса на СБ4+ и другие клетки человека.

Одним из возможных подходов к решению этой проблемы является применение РНК-интерференции - нового современного метода, открывающего новые возможности в исследовании особенностей межмолекулярных взаимодействий внутри клетки: РНК-интерференция позволяет избирательно подавлять синтез целевых белков в клетках, тогда как подбор химиопрепарата, избирательно блокирующего определенный белок, является сложной и трудоемкой задачей. РНК-интерференция в перспективе может стать методом воздействия на клеточные процессы с лечебной или профилактической целью.

Вместе с тем изучение клеток, инфицированных ретровирусами - одно из актуальных направлений медицинской науки, позволяющее выявить новые методы эффективного воздействия на инфицированные клетки. Поскольку применение инфекционных штаммов ВИЧ требует лаборатории 3 или 4 уровня биологической безопасности, для решения проблемы выявления особенностей процессов, происходящих в клетках человека при инфицировании их ретровирусами, в том числе, ВИЧ, в условиях культуральной лаборатории второго уровня биологической безопасности необходима разработка клеточной модели ретровирусной инфекции.

В данной работе разработана клеточная модель с применением рекомбинантного репликативно-дефектного лентивируса 2 поколения на основе вируса ВИЧ-1. Рекомбинантные лентивирусы используются обычно в качестве векторов для доставки в клетку генетических агентов, их применение для биологически более безопасного моделирования ВИЧ-инфекции является оригинальным подходом к решению поставленных задач. Белки оболочки рекомбинантного лентивируса заменены гликопротеином О вируса

везикулёзного стоматита (VSV), что позволило эффективно инфицировать не только CD4+ лимфоциты и макрофаги, но и работать с недорогими, легко культивируемыми культурами клеток человека, обеспечивая хорошую воспроизводимость результатов. Псевдовирусная РНК такого лентивируса может быть сформирована исходя из поставленных задач. Мы применяли лентивирус, геномная РНК которого несет только ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Преимуществом разработанной модели по сравнению с моделями на основе инфекционных вирусов является то, что отсутствие генов лентивируса в геномной РНК предотвращает сборку дочерних вирионов и обеспечивает большую биологическую безопасность рекомбинантного лентивируса по сравнению с инфекционными вирусами.

Все вышеизложенное определило цель и содержание работы.

Цель исследования: разработка клеточной модели для исследования влияния РНК-интерференции на внутриклеточные стадии жизненного цикла рекомбинантного репликационно-дефектного лентивируса in vitro.

Задачи:

1. Получение и исследование препаратов киРНК, специфичных к мРНК генов клеточных белков INI-1, MHGA-1 и PML, задействованных в жизненном цикле вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

2. Разработка клеточной модели, воспроизводящей внутриклеточные стадии жизненного цикла ретровирусов: обратную транскрипцию и интеграцию, в культуре клеток человека НЕК-293Т.

3. Оценка эффекта подавления экспрессии мРНК генов клеточных белков INI-1, MHGA-1 и PML, участвующих в функционировании преинтеграционного комплекса ВИЧ, на лентивирусную инфекцию в культуре клеток.

4. Исследование взаимодействия геномной РНК лентивирусов с компонентами системы РНК-интерференции в клетках человека.

Научная новизна исследования:

Используя адекватные поставленным задачам методы исследования были получены новые данные о снижении в клетке человека уровня мРНК генов клеточных белков MHGA-1, INI-1 и PML в ответ на трансфекцию соответствующих специфичных киРНК и о сохранении при этом жизнеспособности клеток человека in vitro.

Безусловной новизной обладают данные о сохранении инфицирования клеток человека рекомбинантным лентивирусом на фоне снижение уровня мРНК клеточных белков человека МНСА-1,1М-1 и РМЬ.

Для решения поставленных задач была впервые разработана биобезопасная модель ретровирусной инфекции на основе рекомбинантного репликационно-дефектного лентивируса и культуры клеток человека НЕК-293Т.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическую значимость работы обуславливают полученные в работе данные о процессах, происходящих в клетках человека, инфицированных лентивирусами (некритичность клеточных белков Ш1-1, МНОА-1 и РМЬ для внутриклеточного цикла лентивирусов, устойчивость геномной РНК лентивирусов на стадии проникновения в клетку хозяина к избирательной деградации посредством механизма РНК-интерференции).

Практическая значимость работы заключается в том, что предложенная модель лентивирусной инфекции может быть использована в условиях лаборатории культур клеток 2-го класса биологической безопасности для проведения исследований клеток человека инфицированных лентивирусами и для выявления и оценки антиретровирусной активности различных веществ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Специфичные киРНК снижают уровень мРНК генов клеточных белков МНОА-1, Ш1-1 и РМЬ, участвующих в функционировании преинтеграционного комплекса лентивирусов, но не влияют на эффективность инфицирования клеток лентивирусами в культуре клеток.

2. Инфицирование клеток человека рекомбинантным репликационно-дефектным лентивирусом позволяет воспроизводить внутриклеточные этапы жизненного цикла лентивирусов: обратную транскрипцию и интеграцию в геном клетки-хозяина.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практическую работу клеточной лаборатории ЦНИЛ ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России, разработанные методы используются для продолжения исследований по госконтрактам ФЦП Федерального Агентства по Науке и Инновациям и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, по грантам РФФИ, У.М.Н.И.К., молодёжному гранту АН РТ. Теоретические положения включены в учебный процесс на кафедре детских инфекций Казанского ГМУ при проведении занятий со

студентами, интернами и ординаторами на образовательном цикле «ВИЧ-инфекция».

Апробация и реализация работы. Основные материалы диссертации были представлены и обсуждались на конкурсе молодых ученых на II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (29 - 31 марта 2010 г., Москва), XIII и XIV Всероссийской конференции «Молодые ученые в медицине» (г. Казань, 2008 и 2009 гг.). Исследования поддержаны 7 грантами, 1 премией и 1 стипендией. Работа апробирована на расширенном заседании предметной проблемной комиссии Казанского государственного медицинского университета по специальности «клеточная биология, цитология, гистология».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах печатного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка (202 источника). Диссертация содержит 5 таблиц и 26 рисунков.

Личное участие диссертанта в получении научных результатов, изложенных в работе.

Планирование и проведение экспериментов в культурапьной, генетической и иммунологической лабораториях, обработка и расшифровка результатов экспериментов, создание и ведение базы данных исследования, статистическая обработка результатов проводились лично автором на всех этапах диссертационного исследования. К проведению лабораторных работ на добровольных началах привлекались сотрудники кафедры детских инфекций и ЦНИЛ ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России, сотрудники кафедры генетики ГБОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет». Лично диссертантом проведены 72,5% экспериментальных работ, представленных в работе. Изданные научные работы, в том числе написанные в соавторстве, представляют результат преимущественно личного научного вклада диссертанта. Общий объем публикаций 3,38 у.п.л., в том числе авторский вклад 2,0 у.п.л.

Публикация материалов исследования. По результатам исследования опубликовано 14 печатных работ, из них 4 в ведущих научных журналах, определенных Высшей аттестационной комиссией Рособрнадзора.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Работа выполнена на кафедре детских инфекций ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России, отдельные этапы работ проводились в условиях культуральной лаборатории ЦНИЛ ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России, генетической лаборатории ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», иммунологической лаборатории ГБУЗ «РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ» и культуральной лаборатории Университета Едитепе (Стамбул, Турция).

Исследование одобрено этическим комитетом Республики Татарстан. В исследовании не задействованы люди и лабораторные животные. Использование живых культур клеток сведено к минимуму за счёт рационального предварительного планирования.

Исследования проводились с применением клеточной модели лентивирусной инфекции. Культуру клеток человека трансфицировали препаратами коротких интерферирующих РНК методом электропорации или с применением трансфекционныых агентов. Оценивали сохранение жизнеспособности клеток после трансфекции. Фиксировали снижение уровня экспрессии соответствующих генов. В полученную генетически модифицированную культуру клеток человека добавляли рекомбинантный лентивирус. Через определенное время (24, 48 и 72 часа) в клетках, экспонировавшихся с лентивирусом, фиксировали концентрацию белка GFP, экспрессируемого с матрицы интегрировавшегося провируса рекомбинантного лентивируса. В качестве контроля выдерживали с лентивирусом культуру клеток не подвергавшуюся трансфекции (нетрансфекционный контроль).

Метод РНК-интерференции дает возможность избирательно подавлять экспрессию практически любого гена. Стабильному подавлению экспрессии генов ВИЧ методом РНК-интерференции препятствует их изменчивость по причине частых случайных мутаций. В генах человека значительно реже наблюдаются мутации, следовательно, избирательное подавление экспрессии генов клетки-хозяина будет более стабильным.

Во второй главе диссертации (Материалы и методы) дается подробное описание применяемых в работе методик.

Моделирование последовательностей и оценку специфичности коротких интерферирующих РНК (киРНК) проводили с помощью алгоритма BLAST в он лайн программном обеспечении The Whitehead siRNA Selection Web Server (http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA). Культивирование клеток человека HeLa и НЕК-293Т проводили в стерильном ламинарном боксе 2 го класса биобезопасности согласно общепринятым правилам работы в культуральной

лаборатории. Получение рекомбинантного репликационно-дефектного лентивируса проводили по протоколу TRONOLAB PROTOCOLS, EPFL 2007. Электропорация клеток человека малыми генетическими агентами проводили с использованием электропоратора GenePulser® II Electroporation System (BioRad) в соответствии с инструкциями фирмы производителя. Трансфекцию клеток малыми генетическими агентами с применением трансфекционного агента X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent проводили в соответствии с инструкциями фирмы производителя (Roche). Выделение общей РНК для ПЦР РВ проводили с использованием набора RNeasy MiniKit (Qiagen) и Omniscript Reverse Transcriptase Kit (Qiagen). Приготовление дуплексов киРНК осуществлялось по методике, приведенной на сайте http://www.protocol online.org/prot/Protocols/siRNA- RNA-Oligo-Annealing Protocol 3629.html. Для количественной оценки экспрессии генов мишеней применяли полимеразную цепную реакцию в реальном времени (ПЦР РВ) с использованием технологии TaqMan с использованием программного пакета Primer Express (Applied Biosystems, США). Оценку жизнеспособности клеток проводили с применением MTS-теста, с использованием набора CellTiter 96® A Queous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega).

Обработка результатов исследования проводилась с использованием статистического пакета STATISTICA (data analysis software system), version 8.0. StatSoft, Inc. (2007). www.statsoft.com. Формирование графического изображения и таблиц проводились в программе Microsoft® OfficeExcel® 2007 (12.0.4513.1014) HSO (12.0.4513.1014) Включено в Microsoft Office Enterprise 2007 ©Корпорация Майкрософт, 2007. В работе применены методы вариационной статистики: вычисление средних величин и средней ошибки средних величин. Достоверность различий средних сравниваемых величин определялась по коэффициенту Стьюдента. Определялись 95% доверительные интервалы для среднего с учётом нормальности распределения. Проверка на нормальность проводилась по критерию Шапиро Уилкса (Покровский В.И., 2009, Власов В.В. 2004).

Результаты собственных исследований

В результате систематического обзора периодической литературы выявлены 435 клеточных белков, участвующих в жизненном цикле ВИЧ-1. Каждый из этих белков может рассматриваться как потенциальная точка приложения антиретровирусной терапии. Среди известных этапов внутриклеточного жизненного цикла лентиврусов одним из необходимых для интеграции провируа, но в то же время малоизученным является этап транспорта преинтеграционного комплекса к ядру и через ядерную мембрану.

Что и обусловило выбор в качестве мишеней для РНК-интерференции 3 клеточных белков человека, участвующих в формировании и функционировании преинтеграционного комплекса ВНЧ-1.

На основании анализа нуклеотидных последовательностей генов-мишеней нами разработаны 6 оригинальных последовательностей киРНК, специфичных к генам трёх клеточных белков: MHGA-1, INI-1 и PML, участвующих в жизненном цикле ВИЧ-1. Анализ с применением программы BLAST и геномной библиотеки человека показал высокую специфичность выбранных последовательностей по отношению к целевым генам. Шесть препаратов киРНК: HMGA1-A, HMGA1-B, (nil-A, Inil-B, PML-A, PML-B, получены нами из однонитевых смысловых и антисмысловых РНК впервые.

Трансфекцию 6 препаратов киРНК в культуру клеток HeLa проводили электропорацией. Жизнеспособность клеток определяли через 24 часа после трансфекции с применением MTS-теста.

Жизнеспособность клеток, обработанных киРНК, составляла ог 84% до 120% по отношению к жизнеспособности клеток не подвергавшихся трансфекции киРНК, что находится в пределах ошибки распределения. Таким образом, трансфекция специфических киРНК, подавляющих экспрессию генов Inil, hmga и pml, не оказывала значимого влияния на жизнеспособность клеток HeLa по отношению с контролем (Рисунок 1, таблица 1).

Уровень мРНК целевых генов определяли методом ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) через 24 часа после трансфекции.

Электропорация клеток HeLa препаратами киРНК приводила к снижению уровня экспрессии мРНК соответствующего гена до 40-50% (Рисунок 2, таблица 1).

Жизнеспособность, %

О X 3 3 "U "О

о S 3 Zjt! 3

О о [ Г" i-

О > > > ГО > го

> го

Рисунок 1. Относительная жизнеспособность клеток HeLa после трансфекции киРНК. Control — жизнеспособность клеток, не подвергавшихся трансфекции, Ini-A, Ini-B, HMGA-A, HMGA-B, PML-A, PML-B - жизнеспособность клеток, трансфицированных соответствующим препаратом киРНК.

Относительная экспрессия мРНК целевого гена, %

46-

г39

X X

о >

го

> го

Рисунок 2. Уровень относительной экспрессии соответствующих генов клетки-хозяина после электропорации киРНК по сравнению с экспрессией того же гена в контрольных клетках, тансфецированных неспецифическим генетическим агентом.

Таким образом, на первом этапе исследования были разработаны и получены шесть препаратов киРНК, специфичных к генам mhga-l, т-1 и рт1, кодирующим белки клетки человека, участвующие в жизненном цикле ВИЧ-1. Электропорация полученных киРНК в клетки человека позволяла эффективно воспроизводить феномен РНК-интерференции при сохранении жизнеспособности и пролиферативной активности клеток.

Результаты, изложенные в первой главе диссертации, позволяют говорить об эффективном временном снижении уровня белков клетки человека, задействованных во внутриклеточном цикле лентивирусов: экспрессия соответствующего гена снижалась в среднем на 61,8%. Клетки человека при снижении уровня клеточных белков МНОА-1, 1141-1 и РМЬ сохраняли жизнеспособность и пролиферативную активность.

Получение рекомбинантного лентивируса

Для оценки эффекта РНК-интерференции на внутриклеточные процессы, происходящие в клетке человека, инфицированной лентивирусом, была разработана и апробирована клеточная модель лентивирусной инфекции.

Клетки НЕК-293Т трансформировали плазмидами рСМУ-УБУ-С, ряРАХ2 и р\¥РТ-ОРР одновременно, после чего клетки продуцировали рекомбинантный репликативно-дефектный лентивирус, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок ОБР.

Культуру клеток НЕК-293Т трансдуцировали раствором рекомбинантного лентивируса без разведения и в серийных разведениях 1/5, 1/25, 1/125, 1/625. Через 72 часа фиксировали долю флуоресцирующих клеток методом флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрией.

По данным проточной цитофлуориметрии доля инфицированных клеток составила менее 2% в разведении 1/125; 9,8% в разведении 1/25; 48,2% в разведении 1/5 и 89,3% при инфицировании раствором без разведения. С учетом возможности инфицирования несколькими вирусными частицами одной и той же клетки проведена оценка содержания вирусных частиц, способных к инфицированию, в исходном растворе: 12 400 частиц в 1 мкл.

Для апробации модели с целью определения этапов жизненного цикла лентивирусов, воспроизводимых моделью, клетки НЕК-293Т были обработаны антиретровирусными препаратами в различных концентрациях (0,1 *Стах, 1 *Стах и 10*Стах, где Стах - максимальная концентрация действующего вещества в плазме крови человека после однократного приёма препарата в терапевтической дозе) и трансдуцированы неразведенным раствором рекомбинантного лентивируса. Микрофотографии культуры клеток при флуоресцентной микроскопии через 72 часа после ретровирусной трансдукции представлены на Рисунке 3.

Концентрация препарата О.ГСтах__1*Стах 10*Стах

Рисунок 3. Флуоресцентная микроскопия клеток, обработанных различными антиретровирусными препаратами и инфицированных рекомбинантным лентивирусом. Препараты применялись в концентрациях 0,1*Стах, 1*Стах и 10*Стах. Наибольшее количество инфицированных СРР-позитивных клеток наблюдалось в неразведенном образце (около 80%). Количество вЯР-позитивных клеток уменьшалось по мере разведения раствора рекомбинантного лентивируса.

В лунках, содержавших нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы азидотимидин (ЮУ) в концентрации 0,15 мкг/мл (Рис. 4, сверху слева), наблюдались ¿^-позитивные клетки в количестве меньшем, чем при инфицировании контрольных клеток (без лечения) вирусным раствором без разведения, но в большем количестве, чем при инфицировании вирусным раствором в разведении 1/5. В лунках, содержавших азидотимидин в концентрациях 1,5 мкг/мл и 15 мкг/мл, наблюдалось эффективное подавление лентивирусной инфекции, ¿^-позитивные клетки отсутствовали (Рис. 4.сверху по центру и справа).

В лунках, содержавших ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы эфавиренз в концентрации 0,47 мкг/мл (Рис. 4 средний ряд, слева), наблюдались единичные ^-позитивные клетки в количестве сравнимом с числом флуоресцирующих клеток при инфицировании клеток без лечения вирусным раствором в разведении 1/25. В лунках, содержавших ЕГУв концентрациях 4,7 мкг/мл и 47 мкг/мл, наблюдалось эффективное подавление лентивирусной инфекции, ^-позитивные клетки отсутствовали (Рис. 4.5 средний ряд, по центру и справа).

В лунках, содержавших ингибитор протеазы атазнавир во всех концентрациях (0,32 мкг/мл, 3,2 мкг/мл, 32 мкг/мл), наблюдалось большое количество ¿^-позитивных клеток (Рис. 4.5, нижний ряд) сравнимое с числом флуоресцирующих клеток при инфицировании контрольных клеток (без лечения) неразведенным вирусным раствором.

Нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы в средне-терапевтической концентрации и выше прерывали цикл внутриклеточного развития лентивируса и предотвращали интеграцию, что выражалось в значительном снижении количества С/^Р-позитивных клеток. Ингибитор протеазы не оказывал влияния на внутриклеточные процессы при инфицирования рекомбинантным лентивирусом, поскольку апробируемая модель не воспроизводит поздние этапы внутриклеточного цикла лентивирусов.

При снижении концентрации ингибиторов обратной транскриптазы наблюдали увеличение количества (3 ^-позитивных клеток (с интеграцией провируса), что свидетельствует о дозозависимых эффектах этих препаратов.

Получение и использование рекомбинантного лентивируса при соблюдении общепринятых правил работы в лаборатории не представляет

опасности инфицирования для исследователей, поскольку вирионы рекомбинантного лентивируса не содержат генетической информации ВИЧ, необходимой для развития инфекционного процесса. Экспрессионная плазмида рзРАХ2 несёт информацию о 6 генах ВИЧ-1, но, во-первых, для её проникновения в клетку нужна процедура трансфекции, во-вторых, плазмида способна синтезировать белок, но не реплицироваться в клетках человека, в-третьих, этих шести генов недостаточно для сборки ВИЧ-1.

Таким образом, разработанная модель воспроизводит ранние этапы взаимодействия компонентов лентивируса и клетки человека, в т.ч. обратную транскрипцию и интеграцию. Клеточная модель позволяет наблюдать и фиксировать особенности межмолекулярных взаимодействий на этих этапах внутриклеточного цикла лентивирусов. Модель воспроизводима в условиях клеточной лаборатории 2-го уровня биобезопасности и относительно недорога.

Помимо исследования межмолекулярных взаимодействий в клетках человека, инфицированных лентивирусами, модель может быть использована в качестве доступного скринингового исследования при отборе препаратов, потенциально воздействующих на процессы обратной транскрипции и интеграции лентивирусов; для определения антиретровирусной активности известных лекарственных препаратов с целью контроля качества; для выявления эффектов новых способов воздействия на клетки человека, включая генную терапию.

Антиретровирусный эффект коротких интерферирующих РНК, специфичных к клеточным белкам МНСА1,1ш-1, РМЬ

Для оценки влияния избирательного снижения уровня белков человека МНС АI, Ш1-1 и РМЬ на процессы, происходящие в клетках, инфицированных лентивирусом, экспрессию мРНК соответствующих генов избирательно подавляли методом РНК-интерференции на клеточной модели лентивирусной инфекции.

Результаты показали, что количество копий гена в клетках, тансфецированных киРНК, специфичными к клеточным белкам МНСА1,1М-1, РМЬ, значимо не отличалось от количества копий гена в клетках, тансфецированных неспецифичной (контрольной) киРНК. Таким образом, избирательное снижение уровня клеточных белков МНОА1, Ш1-1, РМЬ не приводит к прерыванию процессов, происходящих в клетке человека, инфицированной лентивирусом (Рисунок 4, таблица 1).

Доля флуоресцирующих клеток, %

23,5 22 21 20 23 25

О X X з з U "О

О 2 S s s 2 §

3. О О г- I-

Я > > > ГО J

го

Рисунок 4. Относительное количество копий гена gfp в общей геномной ДНК клеток.

Control - клетки, трансфицированные неспецифическими киРНК.

Таблица 1.

Относительные показатели выживаемости клеток (через 24 ч.), эффективности избирательного снижения экспрессии мРНК (через 24 ч.) и интеграции в геном клетки рекомбинантного лентивируса (через 72 ч) после трансфекции в клетки определенных шРНК.

киРНК HMGA-1-А HMGA- Ini1-A Ini1-B PML -A PML -B Контроль

Относительная жизнеспособность клеток, % 84 107 120 93 84 95 100

Относ ительная экспрессия мРНК целевого гена, % 41 44 46 48 39 11 -

Доля флуоресцирующих клеток, % 22 21 31 20 23 25 23,5

На этапе планирования эксперимента мы осознавали, что при случайном выборе всего 3 молекулярных целей (МНОА1, ПчГП и РМЬ) из 435 вероятность значимого подавления какого-либо этапа жизненного цикла лентивируса невелика, но подтверждение основной гипотезы могло стать первым шагом в разработке принципиально нового метода в лечении и профилактике ретровирусных инфекции. К сожалению, как мы и предполагали, на фоне подавления каждой из 3 выбранных целей рекомбинантный лентивирус продолжает поражать клетки человека.

Устойчивость геномной РНК лентивируса к деградации посредством механизма РНК-интерференции

Во многих работах зарубежных и отечественных авторов показана возможность подавления экспрессии ВИЧ-1 введением киРНК, специфичных к генам вируса, включая кассетные конструкции, выбрасывающие в клетку киРНК сразу к нескольким генам. Практически во всех таких работах происходит направленное разрушение мРНК целевых генов. Ни в одной публикации не оценивается возможность направленной деградации вирусной геномной РНК до интеграции провируса, которая также является однонитевой «+» РНК, и теоретически может быть разрушена механизмом РНК-интерференции. Это предположение стало гипотезой 4-го этапа исследования, результаты которого показали, что геномная РНК лентивирусов до обратной транскрипции устойчива к механизму РНК-интерференции.

«-» киРНК «-» вирус («-» контроль)

«-» киРНК «+» вирус {«+» контроль)

Неспециф. киРНК «+» вирус

АпН-вРР киРНК «+» вирус

^ 1С* Ю* Ю" " К}1 ^

Рисунок 5. Трансфекция клеток НЕК-293Т анти-бРР-киРНК и трансдукция рекомбинантным лентивирусом. Показаны микрофотографии и данные проточной цитофлуориметрии слева направо: нетрансфицированные неинфицированные клетки (отрицательный контроль); инфицированные рекомбинантным лентивирусом клетки (положительный контроль); трансфицированные контрольной неспецифической киРНК инфицированные рекомбинантным лентивирусом клетки (контроль неспецифической РНК-интерференции); трансфицированные анти-бРР киРНК инфицированные рекомбинантным лентивирусом клетки НЕК-293Т (основная группа).

Клетки НЕК-293Т трансфицировали специфической анти-СТ^Р киРНК и через 24 часа инфицировали рекомбинантным лентивирусом. В качестве контроля эффекта неспецифической РНК-интерференции ту же культуру клеток трансфицировали неспецифической киРНК и через 24 часа

инфицировали рекомбинантным лентивирусом. Результаты оценивали через 72 часа после инфекции и сравнивали с положительным контролем (нетрансфицированные инфицированные клетки) и отрицательным контролем (нетрансфицированные неинфицированные клетки).

Через 72 часа после инфицирования клеток рекомбинантным лентивирусом зафиксировали отсутствие зеленой флуоресценции 99,76% клеток в группе отрицательного контроля, медиана (Л/) = 1,79 ед.

В группе положительного контроля зафиксировали 2 популяции клеток: первый пик на гистограмме с М=1,5 ед. (11,19% клеток - избежавшие инфицирования лентивирусом) и второй пик с М=222,67 ед. - 88,81% (клетки с успешной интеграцией провируса). Примерно такая же картина наблюдалась в группе контроля неспецифической РЖ-интерференции: 13,33% клеток не инфицированы; 86,77% - с интеграцией, М= 194,56 ед.

В основной группе зафиксировали 3 пика на гистограмме, соответствующие 3 популяциям клеток в группе:

- 1-й пик (М около 2 ед.) - неинфицированные клетки;

- 2-й пик (М около 11 ед.) - клетки со слабой экспрессией С^Р;

-3-й пик (М около 150 ед.) - клетки с экспрессией С-ГР на уровне положительного контроля (клетки, в которые не проникла киРНК при трансфекции).

2-й пик соответствует клеткам с успешной трансфекцией анти-(З^Р киРНК - в них наблюдается экспрессия гена С/^Р, но уровень белка в 20 раз ниже, чем в клетках без киРНК или с неспецифической киРНК.

Средний уровень зеленой флуоресценции клеток, успешно трансфицированных анти-СРТ киРНК и инфицированных рекомбинантным лентивирусом (медиана 2-го пика группы «В» около 11 ед.) в 20 раз меньше среднего уровня флуоресценции инфицированных клеток без РНК-интерференции (медиана 2-го пика группы «Б» = 222,67 ед.).

Следовательно, успешная трансфекция анти-С7^Р киРНК, в клетки, инфицированные рекомбинантным лентивирусом, приводит к снижению экспрессии гена в 20 раз по сравнению с положительным контролем и контролем неспецифической РНК-интерференции.

Это может объясняться только избирательной деградацией мРНК на стадии трансляции, поскольку, если бы механизм РНК-интерференции был способен разрушить однонитевую геномную РНК вируса до интеграции, не происходила бы интеграция провируса в геном клетки, и белок ОБР вообще не синтезировался бы в таких клетках, т.е. в клетках трансфицированных анти-

киРНК (40% клеток) мы наблюдали бы отсутствие флуоресценции.

Таким образом, геномная РНК лентивирусов устойчива к деградации посредством механизма РНК-интерференции.

Устойчивость геномной РНК лентивирусов может объясняться как экранированием белками комплекса обратной транскрипции, так и коротким временем жизни геномной РНК в клетке до формирования комплиментарной ДНК на стадии обратной транскрипции, или сочетанием обоих факторов.

Выводы:

1. Специфичные киРНК снижают уровень мРНК генов клеточных белков MHGA-1, INI-1 и PML, участвующих в функционировании преинтеграционного комплекса ВИЧ, на 57,5%, 55% и 75% соответственно.

2. Снижение уровня мРНК клеточных белков человека MHGA-1, IN1-1 и PML в ответ на трансфекцию специфичных киРНК достоверно не влияет на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток человека in vitro.

3. Разработана клеточная модель ретровирусной инфекции более биобезопасная, чем модели с инфекционными штаммами ВИЧ, позволяющая воспроизводить и исследовать межмолекулярные взаимодействия между компонентами (белками и нуклеиновыми кислотами) вируса и клеток человека на этапах от «раздевания» нуклеокапсида до интеграции провируса в геном клетки включительно.

4. Снижение уровня мРНК клеточных белков человека MHGA-1, INI-1 и PML в ответ на трансфекцию специфичных киРНК достоверно не снижает инфицирование клеток рекомбинантным лентивирусом in vitro.

5. Трансфекция клеток короткой интерферирующей РНК, специфичной к мРНК гена gfp (зеленого флуоресцентного белка), являющегося частью псевдовирусной геномной РНК, приводит к снижению уровня флуоресценции клеток после инфекции рекомбинантным репликационно-дефектным вирусом. Сохранение флуоресценции клеток свидетельствует об устойчивости геномной РНК лентивирусов к избирательной деградации посредством механизма РНК интерференции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бикмухаметов, Д.А. Факторы, влияющие на приверженность антиретровирусной терапии: распространенность среди пациентов в Республике Татарстан / Д.А. Бикмухаметов, Е.В. Головин, O.A. Назарова // Тезисы докладов XI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2006. - С. 74.

2. Головин, E.B. Модуляция экспрессии клеточных белков, задействованных в патогенезе ВИЧ-инфекции, с использованием РНК-интерференции / Е.В. Головин, Н.И. Ланник, В.А. Анохин, A.A. Ризванов // Сборник тезисов XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2007. — С. 85-86.

3. Головин, Е.В. Оценка роли белков клетки-хозяина в патогенезе ВИЧ-инфекции посредством РНК-интерференции / Е.В. Головин, В.А. Анохин, A.A. Ризванов // Неврологический вестник. - 2007. - Том XXXIX, Вып. 3. - С. 80-81.

4. Головин, Е.В. Препараты киРНК для подавления экспрессии клеточных генов, участвующих в патогенезе ВИЧ / Е.В. Головин, М. Муянгва, В.А. Анохин, A.A. Ризванов II Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии: Материалы II Международной научно-практической конференции. - Казань, 2008. - С.92.

5. Головин, Е.В. Оценка цитотоксичности коротких интерферирующих РНК, специфичных к клеточным белкам, задействованным в патогенезе ВИЧ-инфекции/ Е.В. Головин, М. Чибуйе, М. Муянгва, A.A. Ризванов // Сборник тезисов XIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2008. - С.71-72.

6. Головин, Е.В. Применение коротких интерферирующих РНК для снижения экспрессии клеточных белков, необходимых для репликации ВИЧ-1 / Е.В. Головин, В.А. Анохин, A.A. Ризванов, A.A. Абросимова, Е.В. Мартынова// Практическая медицина, Сборник материалов к V Региональной научно-практической конференции «Педиатрия и детская хирургия в Приволжском федеральном округе» - Казань, 2008 - №6 (30) - С. 36.

7. Головин, Е.В. Перспективы генной терапии в лечении и профилактике ВИЧ-инфекции / Е.В. Головин, В.А. Анохин, A.A. Ризванов, A.A. Абросимова// Сборник тезисов I Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в ХХГвеке», Казань, 30 октября 2008 г. - С. 206-208.

8. Анохин, В.А. Преинтеграционный комплекс вируса иммунодефицита человека — потенциальный объект генетической терапии ВИЧ-инфекции / В.А. Анохин, Е.В. Головин, A.A. Ризванов // Инфекционные болезни. - 2009. - Т.6, №4. - С. 46-50.

9. Головин, Е.В. Получение рекомбинантного ретровируса и моделирование ВИЧ-инфекции на клеточном уровне / Е.В. Головин, Е.В. Мартынова, A.A. Ризванов // XIV Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молодые ученые в медицине». — Казань, 2009. - С. 53.

Ю.Мартынова, Е.В: Влияние гипотонического шока на инфицирование клеток рекомбинантным лентивирусом in vitro / Е.В. Мартынова, Е.В. Головин,

H.JI. Блатт, М.Э. Ялвач, O.P. Галеев, В.А. Анохин, A.A. Ризванов // Материалы III Международного Симпозиума «Актуальные вопросы клеточных технологий». // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия - Москва, 2010 — Т.5, №3. - С. 39.

11.Степанова, E.IO. Вероятность развития апемин у больных ВИЧ-инфскциен / ЕЛО. Степанова, Г.Р. Хаеанова, В.А. Анохин, О.И. Биккннина, Е.В. Головин // Инфекционные болезни. - 2010. - Т.8, №3. - С. 9-12.

12.Мартынова, Е.В. Влияние препарата ифавиренц на инфицирование клеток репликационно-дефектным рекомбинантным лентивирусом / Е.В. Мартынова, Е.В. Головин, H.JI. Блатт, O.P. Галеев, A.A. Ризванов // 14 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «БИОЛОГИЯ Наука XXI века» - Пущино, 2010.-Т.1 -С. 157.

13.Головин Е.В. Биобезопасная клеточная модель ВИЧ-ннфскцпн на основе рскомбинантного лентивнруса / Е.В.Головин, Е.В.Мартынова, О.Р.Галеев, А.К.Шафигуллнна, В.А. Анохин, A.A. Ризванов // Врач-аспирант, Издательство «Научная книга» (Воронеж) — 2011. — №5.3(48). -С. 409-413.

14.Головин Е.В. Безопасная модель ВИЧ-инфекции для оценки антирстровпруснон активности лекарственных препаратов / Е.В. Головин, И.Г. Мустафнн, Е.В. Мартынова, O.P. Галеев, В.А. Анохин, A.A. Ризванов // Современные технологии в медицине. - 2012. — №1. — С. 55-60.

Список сокращении

ВИЧ -киРНК -RNA)

мРНК -ПЦР -ПЦРРВ-РНК -

вирус иммунодефицита человека

короткие интерферирующие РНК (siRNA, short interfering

матричная рибонуклеиновая кислота полимеразная цепная реакция ПЦР в реальном времени (газ/ time PCR) рибонуклеиновая кислота РЦПБ СПИД МЗ РТ - Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД Министерства здравоохранения Республики Татарстан GFP — зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent proteiri)

Головин Евгений Владимирович РНК-интерференция в инфицированных рекомбинантным лентивирусом клетках человека in vitro Автореф. диес. на соискание учёной степени кандидата мед. наук. Подписано в печать 17.04.2012. Бумага офсетная 60x84/16 Ризография. Объем 1,0 усл.-печ.л. Тираж 120 экз. Заказ №56

420012 г.Казань, Бутлерова, 49, типография КГМУ

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Головин, Евгений Владимирович

Введение.

Глава 1. Современное состояние исследования клеток, инфицированных ретровирусами, и примененния РНК-интерференции (обзор литературы).

1.1 Современные представления о процессах, происходящих в клетках человека, инфицированных лентивирусами.

1.2 Антиретровирусная терапия.

1.3 РНК-интерференция.

1.4 Моделирование инфекционного процесса.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1 Общие сведения о работе.

2.2 Разработка, оценка специфичности последовательностей и синтез коротких интерферирующих РНК.

2.3 Культивирование клеток человека.

2.4 Получение рекомбинантного лентивируса.

2.5 Приготовление растворов антиретровирусных препаратов.

2.6 Электропорация клеток человека генетическими агентами.

2.7 Трансфекция клеток человека малыми генетическими агентами с применением трансфекционного агента.

2.8 Трансдукция клеток рекомбинантным лентивирусом.

2.9 Выделение общей РЖ для ПЦР-РВ.

2.10 Приготовление дуплексов киРНК.

2.11 Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ).

2.12 Оценка жизнеспособности клеток.

2.13 Статистическая обработка данных и графическое представление результатов.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1. Подавление экспрессии минорных белков человека НМОА-1, 1М

1, РМЬ, участвующих во внутриклеточном цикле ВИЧ.

Белки клетки-хозяина, задействованные в репликации лентивирусов.

Опытные препараты киРНК и оценка их специфичности.

Оценка экспрессии генов-мишеней.

Жизнеспособность клеточной культуры НеЬа.

3.2. Разработка клеточной модели ретровирусной инфекции.

Получение рекомбинантного ретровируса.

Определение инфекционных свойств полученного лентивируса в серийных разведениях.

Определение антиретровирусной активности лекарственных препаратов с применением рекомбинантного лентивируса.

3.3. Антиретровирусный эффект коротких интерферирующих РНК, специфичных к клеточным белкам Н1УЮА-1,1№-1, РМЬ.

3.4. Устойчивость геномной и матричной РНК лентивирусов к деградации системой РНК-интерференции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "РНК-интерференция в клетках человека, инфицированных рекомбинантным лентивирусом in vitro"

Актуальность исследования

Проблема лечения вирусных инфекций остается одной из самых актуальных и недостаточно разработанных в практической медицине [33, 82]. Актуальность обусловлена с одной стороны ростом заболеваемости вирусными инфекциями, а с другой стороны отсутствием методов эффективного лечения для многих из них [35, 48, 107]. В рамках этой проблемы несомненный интерес представляют вопросы, связанные с инфекцией, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ, семейство Ке^оутс1ае, род ЬеМшгт), по причине которой ежегодно в мире умирают 1 800 ООО человек [34] (подробнее -эпидемиологические показатели в приложении А). Изучение межмолекулярных взаимодействий в клетках при ВИЧ-инфекции - одно из актуальных и наиболее востребованных направлений медицинской науки [4, 44]. Актуальность обусловлена также и социальной значимостью: преобладание молодых людей среди инфицирующихся ВИЧ отражается на экономике, обороноспособности и социальной сфере страны [38].

Эффективной терапевтической или профилактической вакцины при этой инфекции пока нет, что связано в первую очередь со сложностью моделирования этого заболевания в лабораторных условиях для изучения механизмов воздействия вируса не только на СБ4+, но и на другие клетки человека. Единственным способом продления жизни инфицированному пациенту является активная антиретровирусная терапия (АРВТ), которая подавляет репликацию вируса и сохраняет число СЭ4+ клеток, позволяя, таким образом, «удерживать» инфекцию в бессимптомной стадии годами, но, к сожалению, не освобождает организм от вируса [32]. Учитывая недостатки АРВТ (высокая стоимость химиопрепаратов, пожизненная терапия, побочные эффекты [79], сложный режим приема [144], формирование устойчивости возбудителя [30]), необходима разработка принципиально нового, более эффективного метода лечения и профилактики ВИЧ-инфекции.

В научной среде всё чаще высказывают мнения о возможности полного излечения ВИЧ-инфекции. Многие исследователи обращают при этом внимание на клеточные факторы и на возможность генной коррекции экспрессии отдельных белков [112]. С генной терапией учёные связывают надежду на излечение от ВИЧ-инфекции и возможность выработки у здорового организма невосприимчивости к ВИЧ [59, 119]. Объектом воздействия генной терапии, при этом, могут стать, как вирусные компоненты, так и белки клетки хозяина [80, 172].

Одним из возможных подходов к решению проблемы лечения вирусных инфекций является использование РНК-интерференции - перспективного современного метода, открывающего новые возможности в исследовании особенностей межмолекулярных взаимодействий внутри клетки, инфицированной вирусами, так как РНК-интерференция позволяет избирательно подавлять синтез выбранных белков в клетках, тогда как подбор химического препарата, избирательно подавляющего активность определенного белка, является сложной и трудоемкой задачей [91]. РНК-интерференция в перспективе может стать методом воздействия на клеточные процессы с лечебной или профилактической целью [201, 117].

Вместе с тем изучение клеток, инфицированных ретровирусами, - одно из основных направлений медицинской науки, позволяющее выявить новые методы эффективного воздействия на инфицированные клетки [44, 103]. Для решения проблемы исследования клеток, инфицированных ретровирусами, большое значение имеет подбор оптимальной клеточной модели вирусной инфекции [105]. При этом следует учитывать, что применение инфекционных штаммов ВИЧ требует лаборатории третьего или четвертого уровня биологической безопасности [156].

Для выявления особенностей процессов, происходящих в клетках человека при инфицировании их ретровирусами, в условиях культуральной лаборатории второго уровня биологической безопасности может быть применена клеточная модель ретровирусной инфекции на основе рекомбинантного лентивируса. В данной работе нами разработана клеточная модель с применением рекомбинантного репликативно-дефектного лентивируса второго поколения на основе вируса ВИЧ-1. Рекомбинантные лентивирусы используются обычно в качестве векторов для доставки в клетку генетических агентов, их применение для биологически более безопасного моделирования ВИЧ-инфекции является оригинальным подходом к решению поставленных задач [122]. Для этих целей белки оболочки рекомбинантного лентивируса заменяли гликопротеином G вируса везикулёзного стоматита (VSV), что позволило эффективно инфицировать не только CD4+ лимфоциты и макрофаги [5], но и работать с недорогими, легко культивируемыми культурами клеток человека, обеспечивая хорошую воспроизводимость результатов [76]. Псевдовирусная геномная РНК такого лентивируса может быть сформирована исходя из поставленных задач [81]. Мы применяли лентивирус, геномная РНК которого несет только ген зеленого флуоресцентного белка (GFP). Преимуществом разработанной модели по сравнению с уже используемыми на основе инфекционных вирусов является то, что отсутствие генов лентивируса в геномной РНК предотвращает сборку дочерних вирионов и обеспечивает большую биологическую безопасность рекомбинантного лентивируса по сравнению с инфекционными вирусами [16].

Не исключено, что дальнейшее изучение всего спектра межмолекулярных взаимодействий в зараженной клетке позволит обнаружить потенциально новую молекулярную мишень для воздействия на лентивирусы. Известно, что на ранних этапах внутриклеточного развития лентивирусов из комплементарной ДНК вируса, синтезированной при обратной транскрипции, и белков вируса и клетки формируется преинтеграционный комплекс (ПИК), который далее переносится в ядро клетки [2]. В случае нарушения данного этапа генетическая информация вируса не попадет в геном клетки человека и, соответственно, не реализуется весь последующий процесс репликации. На сегодняшний день формирование ПИК и его транспорт в ядро - один из наименее изученных этапов внутриклеточного цикла лентивирусов. В настоящее время нет препаратов, прерывающих внутриклеточный цикл лентивирусов именно на этом этапе.

Вышеизложенное определило цель и содержание работы.

Цель исследования: разработка клеточной модели, позволяющей исследовать влияние РНК-интерференции на внутриклеточные стадии жизненного цикла рекомбинантного репликационно-дефектного лентивируса in vitro.

Задачи:

1. Получение и исследование препаратов киРНК, специфичных к мРНК генов клеточных белков INI-1, HMGA-1 и PML, задействованных в жизненном цикле вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

3. Оценка эффекта подавления экспрессии мРНК генов клеточных белков INI-1, HMGA-1 и PML, участвующих в функционировании преинтеграционного комплекса ВИЧ, на лентивирусную инфекцию в культуре клеток.

Научная новизна исследования:

Используя адекватные поставленным задачам методы исследования, были получены новые данные о снижении в клетке человека уровня мРНК генов клеточных белков HMGA-1, INI-1 и PML в ответ на трансфекцию соответствующих специфичных киРНК и о сохранении при этом жизнеспособности клеток человека in vitro.

Безусловной новизной обладают данные о сохранении инфицирования клеток человека рекомбинантным лентивирусом на фоне снижение уровня мРНК клеточных белков человека НМЮА-1,1№-1 и РМЬ.

Для решения поставленных задач была впервые разработана биологически безопасная модель ретровирусной инфекции на основе рекомбинантного репликационно-дефектного лентивируса и культуры клеток человека НЕК-293Т.

Теоретическая и практическая значимость исследования:

Теоретическую значимость работы обуславливают полученные в работе данные о процессах, происходящих в клетках человека, инфицированных лентивирусами (некритичность клеточных белков БЧ1-1, НМОА-1 и РМЬ для внутриклеточного цикла лентивирусов, устойчивость геномной РНК лентивирусов на стадии проникновения в клетку-хозяина к избирательной деградации при активации механизма РНК-интерференции).

Практическая значимость работы заключается в том, что предложенная модель лентивирусной инфекции может быть использована в условиях лаборатории культур клеток второго класса биологической безопасности для проведения исследований клеток человека инфицированных лентивирусами и для выявления и оценки антиретровирусной активности различных веществ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Специфичные киРНК снижают уровень мРНК генов клеточных белков НМОА-1, 1М-1 и РМЬ, участвующих в функционировании преинтеграционного комплекса лентивирусов, но не влияют на эффективность инфицирования клеток лентивирусами в культуре клеток.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практическую работу клеточной лаборатории ЦНИЛ ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России, разработанные методы используются для продолжения исследований по госконтрактам ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, по грантам РФФИ, У.М.Н.И.К., молодёжному гранту Академии наук Республики Татарстан. Теоретические положения включены в учебный процесс на кафедре детских инфекций Казанского ГМУ при проведении занятий со студентами, интернами и ординаторами на образовательном цикле «ВИЧ-инфекция».

Апробация и реализация работы. Основные материалы диссертации были представлены и обсуждались на конкурсе молодых ученых на II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (29 - 31 марта 2010 г., Москва), XIII и XIV Всероссийской конференции «Молодые ученые в медицине» (г. Казань, 2008 и 2009 гг.). Исследования поддержаны 7 грантами, 1 премией и 1 стипендией. Работа апробирована на расширенном заседании предметной проблемной комиссии ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России по специальности «клеточная биология, цитология, гистология».

Личное участие диссертанта в получении научных результатов, изложенных в работе.

Планирование и проведение экспериментов в культуральной, генетической и иммунологической лабораториях, обработка и расшифровка результатов экспериментов, создание и ведение базы данных исследования, статистическая обработка результатов проводились лично автором на всех этапах диссертационного исследования. К проведению лабораторных работ на добровольных началах привлекались сотрудники кафедры детских инфекций и ЦНИЛ ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России, сотрудники кафедры генетики ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет». Лично диссертантом проведены 72,5% экспериментальных работ, представленных в работе. Изданные научные работы, в том числе написанные в соавторстве, представляют результат преимущественно личного научного вклада диссертанта. Общий объем публикаций 3,38 у.п.л., в том числе авторский вклад 2,0 у.п.л.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах печатного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы результатов собственных исследований, содержащей 4 раздела, заключения, выводов, библиографического списка (202 источника). Диссертация содержит 5 таблиц и 26 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Головин, Евгений Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Специфичные киРНК снижают уровень мРНК генов клеточных белков HMGA-1, INI-1 и PML, участвующих в функционировании преинтеграционного комплекса ВИЧ, на 57,5%, 55% и 75% соответственно.

2. Снижение уровня мРНК клеточных белков человека HMGA-1, INI-1 и PML в ответ на трансфекцию специфичных киРНК достоверно не влияет на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток человека in vitro.

4. Снижение уровня мРНК клеточных белков человека HMGA-1, INI-1 и PML в ответ на трансфекцию специфичных киРНК достоверно не снижает инфицирование клеток рекомбинантным лентивирусом in vitro.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа частично финансировалась Государственными контрактами ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере; грантами РФФИ, У.М.Н.И.К., молодёжным грантом Академии наук Республики Татарстан.

Работа частично выполнена на оборудовании регионального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (РЦКП ФХИ) ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».

Выражаю особую благодарность лично A.C. Созинову, В.А. Анохину,

A.A. Ризваннову, P.P. Исламову, А.П. Киясову, И.Г. Мустафину, C.B. Бойчуку,

B.В. Валиуллину, М.М. Миннебаеву, И.С. Рагинову, JI.3. Головиной, И.И. Салафутдинову, Е.В. Мартыновой, Д.А. Бикмухаметову, O.P. Галееву, H.JL Ланник, Н.Л. Блатт, Е.Ю. Степановой, Н.В. Штырлину, P.C. Павельеву, А.К. Шафигуллиной, Н.Х. Давлетовой, Р.З. Басыровой, А.К. Бикмухаметовой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

РНК-интерференция открывает широкие возможности в исследовании процессов, происходящих в клетках, инфицированных лентивирусами, в разработке новых методов лечения и профилактики вирусных инфекций [185, 202].

В данной работе нами представлен вариант решения вопроса проведения исследований лентивирусных заболеваний на молекулярном и клеточном уровнях в лабораторных условиях второго уровня биологической безопасности.

Результаты первого этапа исследования, позволяют говорить об эффективном временном снижении уровня белков клетки человека, задействованных во внутриклеточном цикле лентивирусов [137]: экспрессия соответствующего гена снижалась в среднем на 61,8%. Кроме того, в отношении избирательного снижения уровня мРНК исследуемых белков клетки (HMGA-1, INI-1 и PML) было показано, что клетка после электропорации сохраняет свою жизнеспособность и пролиферативную активность. Относительная жизнеспособность клеток на фоне снижения уровня мРНК каждого из указанных белков достоверно не отличается от жизнеспособности клеток с неизмененным уровнем мРНК тех же белков.

Исследования проводились одновременно в двух направлениях: эксперименты по разработке новых способов генной терапии культуры клеток человека и эксперименты по разработке клеточной модели ВИЧ-инфекции для определения противовирусной активности генной терапии. Объединив результаты этих направлений, мы получили возможность исследовать межмолекулярные процессы в трансдуцированных лентивирусом клетках с целью выявления новых особенностей внутриклеточного цикла развития лентивирусов, полезных для дальнейших разработок в области лечения и профилактики ВИЧ-инфекции.

Нами принимались во внимание следующие критерии эффективности применения модели в дальнейших исследованиях: модель должна воспроизводить определенные стадии взаимодействия компонентов ВИЧ и клетки человека; должна позволять наблюдать и фиксировать особенности межмолекулярных взаимодействий на этих этапах патогенеза; должна быть воспроизводима в условиях клеточной лаборатории второго уровня биобезопасности и не должна быть дорогой.

На первом этапе исследования были разработаны и получены шесть препаратов киРНК, специфичных к генам hmgal, in.il и рт1, кодирующим белки клетки человека, участвующие в жизненном цикле ВИЧ-1. Электропорация полученных киРНК в клетки человека позволяла эффективно воспроизводить феномен РНК-интерференции при сохранении жизнеспособности и пролиферативной активности клеток.

На втором этапе исследования был разработан и получен рекомбинантный лентивирус на основе известных плазмидных компонентов, используемых для сборки векторов для доставки генетических агентов в ядро клетки. Получение и использование рекомбинантного лентивируса при соблюдении общепринятых правил работы в лаборатории не представляет опасности инфицирования для исследователей, поскольку вирионы рекомбинантного лентивируса не содержат генетической информации ВИЧ, необходимой для развития инфекционного процесса [40]. Экспрессионная плазмида рзРАХ2 несёт информацию о шести генах ВИЧ-1, но, во-первых, для её проникновения в клетку нужна процедура трансфекции, во-вторых, плазмида способна синтезировать белок, но не реплицироваться в клетках человека, в-третьих, этих шести генов недостаточно для сборки ВИЧ-1 [45]. Таким образом, представленная модель биологически более безопасна, чем модели с применением инфекционных вирусов.

Апробация модели показала, что нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы в средне-терапевтической концентрации и выше прерывали цикл внутриклеточного развития лентивируса и предотвращали интеграцию, что выражалось в значительном снижении количества вБР позитивных клеток. Ингибитор протеазы не оказывал влияния на внутриклеточные процессы при инфицировании рекомбинантным лентивирусом, поскольку данная модель не воспроизводит поздние этапы внутриклеточного цикла лентивирусов.

При снижении концентрации ингибиторов обратной транскриптазы наблюдали увеличение количества ОБР позитивных клеток (с интеграцией провируса), что свидетельствует о дозозависимых эффектах этих препаратов.

Результаты позволяют применять разработанную модель лентивирусной инфекции для изучения взаимодействия лентивирусов с компонентами клетки человека на клеточном и молекулярном уровне на этапах от проникновения внутрь клетки до интеграции в геном: этапы формирования комплекса обратной транскрипции, обратной транскрипции, формирования преинтеграционного комплекса, транспорт ПИК к ядру, импорт ПИК через ядерную мембрану и интеграция кДНК в участок ДНК клетки с образованием провируса (Рис. 4.1). Эти этапы идентичны ранним событиям при поражении клетки человека вирусом иммунодефицита человека (Рис. 4.2).

Рисунок 4.1. Этапы патогенеза ВИЧ-инфекции, воспроизводимые при трансдукции клетки рекомбинантным лентивирусом, экспрессирующим р.

ВИЧ

Клетка человека

Рисунок 4.2 Этапы патогенеза при инфицировании клетки ВИЧ.

Таким образом, была предложена клеточная модель ВИЧ-инфекции на основе рекомбинантного лентивируса, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок, и, на этой основе, способ определения антиретровирусной активности лекарственных веществ и методов генетического воздействия. Оформлена заявка на патент (приоритетная справка об оформлении патента 8МПК вОШ 33/15А 61РА61Р 35/00 «Способ определения антиретровирусной активности веществ»).

Разработанная модель активно применяется в культуральной лаборатории Центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздравсоцразвития России для определения антиретровирусной активности как модификаций известных антиретровирусных препаратов, так и новых веществ, синтезированных впервые, в совместных исследованиях с кафедрой генетики и кафедрой органической химии ФГАОУ ВПО КФУ.

Внедренная в практику модель позволила нам также определить антиретровирусную активность разработанных нами препаратов коротких интерферирующих РНК, специфичных к белкам НМСА-1,1№-1 и РМЬ.

В ходе работы разработаны и получены шесть препаратов киРНК, специфичных к мРНК белков клетки человека Н1УЮА-1, 1№-1 и РМЬ, участвующих в жизненном цикле ВИЧ-1. Электропорация полученных киРНК в клетки человека приводила к активации РНК-интерференции, не нарушая жизнеспособность клеток.

Результаты позволяют говорить об эффективном временном снижении уровня белков клетки человека, задействованных во внутриклеточном цикле лентивирусов: экспрессия соответствующего гена снижалась в среднем на 61,8%. Клетки человека при снижении уровня клеточных белков НМСА-1, 1М-1 и РМЬ сохраняли жизнеспособность и пролиферативную активность.

На этапе планирования эксперимента мы осознавали, что при случайном выборе всего 3 молекулярных целей (HMGA-1, INI-1 и PML) из 435 вероятность значимого подавления какого-либо этапа жизненного цикла лентивируса невелика, но подтверждение основной гипотезы могло стать первым шагом к разработке принципиально нового метода в лечении и профилактике ретровирусных инфекций [111, 112]. К сожалению, как мы и предполагали, на фоне подавления каждой из трех выбранных целей рекомбинантный лентивирус продолжает поражать клетки человека.

Следует отметить, что область применения разработанной нами модели ретровирусной инфекции не ограничивается тестированием генетических агентов и препаратов на антиретровирусную активность. В доказательство того, что методика может применяться в фундаментальных исследованиях, мы разработали и осуществили эксперимент по изучению особенностей межмолекулярных взаимодействий между компонентами клетки и лентивирусов. В частности, мы попытались ответить на вопрос о возможности предупреждения интеграции генетической информации вируса в ДНК клетки человека методами, основанными на РНК-интерференции направленной против генов лентивирусов.

Во многих работах зарубежных и отечественных авторов показана возможность подавления экспрессии ВИЧ-1 введением киРНК, специфичных к генам вируса, включая кассетные конструкции, выбрасывающие в клетку киРНК сразу к нескольким генам [102]. Практически во всех таких работах происходит направленное разрушение мРНК целевых генов. Ни в одной публикации не оценивается возможность направленной деградации вирусной геномной РНК до интеграции провируса, которая также является однонитевой «+» РНК, и теоретически может быть разрушена механизмом РНК-интерференции [186]. Это предположение стало гипотезой четвертого этапа исследования, результаты которого показали, что геномная РНК лентивирусов до обратной транскрипции устойчива к механизму РНК-интерференции в отличие от матричной РЖ, которая подвергалась избирательной деградации при активации механизма РНК-интерференции.

Инфицирование рекомбинантным лентивирусом клеток человека после трансфекции короткими интерферирующими РНК, специфичными к гену ^р (псевдовирусной геномной РНК), приводило только к снижению, но не к отсутствию, экспрессии гена Это может объясняться только избирательной деградацией мРНК ^р на стадии трансляции, поскольку если бы механизм РНК-интерференции был способен разрушить однонитевую геномную РНК вируса до интеграции, не происходила бы интеграция провируса в геном клетки, и белок ОБР не синтезировался бы в таких клетках, т.е. в клетках трансфицированных анти-ОБР киРНК (40% клеток) мы наблюдали бы отсутствие флуоресценции.

Устойчивость геномной РНК лентивирусов может объясняться как экранированием белками комплекса обратной транскрипции [132], так и коротким временем жизни геномной РНК в клетке до формирования комплиментарной ДНК на стадии обратной транскрипции, или сочетанием обоих факторов [71].

Таким образом, результаты проведенной работы позволили предложить:

- базу данных белков человека, участвующих в жизненном цикле лентивирусов;

- шесть препаратов киРНК, специфичных к генам hmgal, in.il и рт1, кодирующим белки клетки человека, участвующие в жизненном цикле лентивирусов;

- клеточную модель ретровирусной инфекции на основе рекомбинантного лентивируса, экспрессирующего ген gfp;

- способ определения антиретровирусной активности лекарственных веществ (приоритетная справка об оформлении патента 8МПК G01N 33/15А 61РА61Р 35/00 «Способ определения антиретровирусной активности веществ»).

Вклад в фундаментальную науку определяют выявленные в результате исследования сведения об особенностях межмолекулярных взаимодействий компонентов лентивируса и клетки человека: экспрессия мРНК белков человека HMGA-1, INI-1 и PML, участвующих в жизненном цикле лентивирусов, эффективно избирательно подавляется при активации РНК-интерференции; при подавлении экспрессии мРНК генов hmgal, inil и pml посредством РНК-интерференции не изменяется жизнеспособность клеток человека; избирательное подавление экспрессии генов человека hmgal, inil и pml посредством РНК-интерференции не оказывает антиретровирусного эффекта; этапы внутриклеточного цикла рекомбинантного лентивируса идентичны процессам, происходящим при инфицировании клеток ВИЧ-1 на ранних стадиях (обратная транскрипция, интеграция провируса в геном клетки-хозяина); геномная РНК лентивирусов на этапах до интеграции в геном человека устойчива к деградации при активации механизма РНК-интерференции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Головин, Евгений Владимирович, Казань

1. Агапкина Ю.Ю. Структура и функции интегразы ВИЧ-1 / Ю.Ю. Агапкина, Т.А. Приказчикова, М.А. Смолов, М.Б. Готтих // Успехи биологической химии. Т. 45. - 2005. - С.87-122.

2. Анохин В.А. Преинтеграционный комплекс вируса иммунодефицита человека потенциальный объект генетической терапии ВИЧ-инфекции / В.А. Анохин, Е.В. Головин, A.A. Ризванов // Инфекционные болезни. - 2009. -Том 6, №4. - С. 46-50.

3. Беляков H.A. Половой путь передачи ВИЧ в развитии эпидемии. H.A. Беляков, Т.Н. Виноградова // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. 2011. -Т.З, № 4. - С.7-19.

4. Бойчук C.B. Роль интерлейкина 7 (IL-7) в патогенезе и терапии ВИЧ-инфекции / C.B. Бойчук, П.Д. Дунаев //Цитокины и воспаление: издание Северо-Западного отделения РАМН и Российского цитокинового общества. -СПб. 2008. - Т. 7, № 1. - С. 3-7.

5. Букринская А.Г. Степени созревания вируса иммунодефицита человека и роль протеолиза / А.Г. Букринская, В.Б. Григорьев, Е.В. Кораблина и др. // Вопросы вирусологии. 2010. - Том 55, № 1. - С. 10-15.

6. Введение в биохимию мембран. Под ред. А. А. Болдырева. Высшая школа. 1986.- 112с.

7. Власов В.В. Эпидемиология / В.В. Власов // ГЭОТАР-Медиа. -2004. 448с.

8. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - 589с.

9. Гудима Г.О. Клинические испытания анти-ВИЧ/СПИД-вакцин: современное состояние проблемы / Г.О. Гудима, И.Г. Сидорович, И.А. Николаева, Э.В. Карамов, C.B. Коробова, P.M. Хаитов // Цитокины и воспаление. 2005. - № 3, - С.23-28.

10. Гуттман Б., Гриффите Э., Сузуки Д., Куллис Т. Генетика / Бартон Гуттман, Энтони Гриффите, Дэвид Сузуки, Тара Куллис. Пер. с англ. О. Перфильева. -М.: ФАИР-ПРЕСС, 2004. - 448с.

11. Давидович Г.М. ВИЧ-инфекия: Учеб.-метод. пособие / Г.М. Давидович, И.А. Карпов, В.Ф. Еремин, H.A. РОССА. // Минск.: БГМУ, 2002.-23с.

12. Денисенко В.Б. Опыт применения ингибиторов вирусной протеазы у детей с ВИЧ-инфекцией / В.Б. Денисенко, Э.Н. Симованьян, Е.В. Бекетова // Педиатрическая фармакология: научно-практический журнал Союза педиатров России. 2010. - Том 7, № 1. - С.62-67.

13. Доценко M.JI. Антиретровирусные средства: учеб.-методическое пособие / M.JI. Доценко, Д.А. Рождественский, И.А. Карпов. Минск: БГМУ. -2008.-55с.

14. Евтушенков А.Н. Введение в биотехнологию: Курс лекций:/ А.Н. Евтушенков, Ю.К. Фомичев. Минск.:БГУ, 2002. - 105с.

15. Жданов Р.И. Реальности и надежды генной терапии/ Р.И. Жданов, Н.В. Семенова, А.И. Арчаков // Вопросы медицинской химии. 2000. - № 3. -С.3-7.

16. Зайхнер С. Молекулярная биология ВИЧ для клиницистов. Москва: EnRus-2006.-C.2-18.

17. Имянитов E.H. Фундаментальная онкология в 2010 году: обзор наиболее интересных открытий. // Практическая онкология. 2011. - Т. 12, №1. - С.1-5.

18. Исламов P.P. Генная и клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний / P.P. Исламов, A.A. Ризванов, Д.С. Гусева, А.П. Киясов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2007. - Том 2, №3. -С.29-37.

19. Исламов P.P. Боковой амиотрофический склероз: стратегия генно-клеточной терапии: обзор / P.P. Исламов, A.A. Ризванов, А.П. Киясов // Неврологический вестник. Журнал имени В.М.Бехтерева. 2008. - Т. 40,№4. -С.91-100.

20. Исламов P.P. РНК-интерференция в регуляции аксонного транспорта. / P.P. Исламов, A.A. Ризванов, Ю.А. Челышев и др. // Успехи физиологических наук. 2007. - Т.38, №3. - С.47 - 56.

21. Кайда И.В. Применение ретровирусных векторов для целенаправленного переноса генов у птиц / И.В. Кайда, A.B. Рындич // Биополимеры и клетка. Киев. 1997. - Т. 13,№1. - С.5 - 13.

22. Камышников B.C. Техника лабораторных работ в медицинской практике. / Камышников B.C. 2-е изд., перераб. и доп.- ООО «МЕДпресс-информ». - 2011. - 336с.

23. Клоц И.Н. Вирусы иммунодефицита и модели СПИДа на обезьянах: обзор / И.Н. Клоц // Вопросы вирусологии. 2009. - №3. - С.8-12.

24. Ковалев Г.И. Экспериментальная мышиная модель человеческого гемопоэза для изучения лимфотропных инфекций / Г.И. Ковалев // Гематология и трансфузиология. 2008. - Т. 53, № 6. - С.27-31.

25. Коломеец А.Н. Анализ распространённости лекарственной устойчивости ВИЧ-1 в регионах Сибирского федерального округа / А.Н. Коломец, Е.С. Довгополюк, И.В. Сергеева // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. 2011. - Т. 3, № 4. - С.51-55.

26. Костюк С.А. Новые технологии диагностики возбудителей инфекционных заболеваний полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (Real- time PCR) / С.А. Костюк // Медицина. - 2005. - №3. - С. 16-20.

27. Культура животных клеток, методы. Под ред. Р. Фрешни Мир; 1989.-333с.

28. Лечение и помощь при ВИЧ/СПИДе. Клинические протоколы для европейского региона ВОЗ (Ред. И. Ерамова, С. Матик, М. Мунз.) Phoenix Design Aid, Копенгаген, Дания. 2007. -311с.

29. Мировая статистика здравоохранения. 2010 год. / Под ред. Т. Waddel. Франция: ВОЗ, 2010.- 177 с.

30. Нестерова И.В. Особенности функционирования противовирусного иммунитета / И.В. Нестерова // Цитокины и воспаление. 2005. - Том 4, № 3. -С. 89-94.

31. Основные факты об эпидемии ВИЧ и достигнутом прогрессе в 2010 году. Доклад о глобальных ответных мерах на ВИЧ/СПИД ВОЗ, ЮНИСЕФ, ЮНЭЙДС. - 2011-С. 204.

32. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы — М.: Наука, 2005 — В 2 т. Т. 1 : Генная и белковая инженерия / отв. ред. А.И. Мирошников. 2004. - 525 с.

33. Покровский В.И. Инфекционные болезни и эпидемиология: учебник. 2-е изд. / В.И. Покровский, С.Г. Пак, Н.И. Брико, Б.К. Данилкин // ГЭОТАР-Медиа. 2009. - 816с.

34. Прасолов B.C. Ретровирусные векторы в генной терапии / B.C. Прасолов, Д.С. Иванов // Вопросы медицинской химии. -2000 №3. - С.8-21.

35. Регистр лекарственных средств России РЛС Энциклопедия лекарств. Выпуск 19. Под ред. Г. Вышковского. РЛС-МЕДИА, -2010. -1368с.

36. Рудницкая Г.Е. Микрочиповые устройства для полимеразной цепной реакции. Основные принципы ПЦР; конструкция и материалы микрочипов / Г.Е. Рудницкая, А.А. Евстрапов // Научное приборостроение. 2008. - Т. 18, № 3. - С.3-20.

37. Сидибе М. Выступление Исполнительного Директора ЮНЭЙДС. Третья Конференция по СПИДу в Восточной Европе и Центральной Азии (ЕЕСААС 2009) 28 октября 2009. Пленарное заседание. Москва.

38. Сологуб T.B. Патогенез вирусных инфекций / Т.В. Сологуб, М.Ю. Ледванов, В.П. Малый, Н.Ю. Стукова, М.Г. Романцов, М.Н. Бизенкова, Т.Д. Полякова. // Фундаментальные исследования. 2009. - №10 - С.55-60.

39. Спирин П.В. Лентивирусные векторы/ П.В. Спирин, А.Э. Вильгельм, B.C. Прасолов // Молекулярная биология. 2008. - Т.42, № 5. - С.913 - 926.

40. Стручкова И.В. Регуляция биосинтеза белка. Учебно-методическое пособие/ И.В. Стручкова, A.A. Брилкина, А.П. Веселов Нижний Новгород: ННГУ.-2010.- 100с.

41. Супотницкий М.В. К вопросу о месте ВИЧ/СПИД-пандемии среди других инфекционных, эпидемических и пандемических процессов // Эпидемия ВИЧ/СПИД в Украине. 2006. - № 2. - С. 163 - 196.

42. Торшхоева Л.Б. Принципы рациональной терапии острых респираторных вирусных инфекций у детей / Л.Б. Торшхоева, Н.С. Глухарева, А.Л. Заплатников // Русский медицинский журнал. 2010. - № 20. - С. 1237.

43. Шевелев А.Я. РНК-интерференция: система тестирования эффективности мишеней / А.Я. Шевелев, Н.М. Каширина, П.Н. Руткевич, и др. // Кардиологический вестник. 2010. - Т. V (XVII). - № 2. - С.22 - 30.

44. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия/ С.Н. Щелкунов -Новосибирск: Сиб. унив. изд-во. 2004. - 496с.

45. Ющук Н.Д. Эпидемиология: Учебное пособие / Н.Д. Ющук, Ю.В. Мартынов Медицина: 2003. - 448с.

46. Adler D.H. Inclusion of South African adolescents in HIV vaccine trials / D.H. Adler // Journal of AIDS and HIV Research. 2012. - Vol. 4(2). - P.30-35.

47. Agbottah E. Effect of SWI/SNF chromatin remodeling complex on HIV-1 Tat activated transcription. E. Agbottah, L. Deng, L.O. Dannenberg, A. Pumfery, F. Kashanchi //Retrovirology. 2006. - P.48.

48. Alvarez-Erviti L. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes / L. Alvarez-Erviti, Y. Seow, H. Yin et al. // Nature Biotechnology. 2011. - Vol. 29. - P.341-345.

49. Ao Z. et al. Contribution of Host Nucleoporin 62 in HIV-1 Integrase Chromatin Association and Viral DNA Integration. JBC Papers in Press. Published on February 3, 2012 as Manuscript Ml 11.317057.

50. Arenzana-Seisdedos F. Genetics of resistance to HIV infection: role of co-receptors and co-receptor ligands / F. Arenzana-Seisdedos, M. Parmentier // Semin Immunol. 2006. - Vol.18 (6). - P.387 - 403.

51. Asboe D. British HIV Association guidelines for the routine investigation and monitoring of adult HIV-1-infected individuals 2011./ D. Asboe, C. Aitken, M. Boffito, C. Booth et al. //HIV Medicine. 2012. - Vol.13. - P.l - 44.

52. Bai Y. Effective transduction and stable transgene expression in human blood cells by a third-generation lentiviral vector/ Y. Bai, Y. Soda, K. Izawa, T. Tanabe et al. // Gene Therapy. 2003. - Vol. 10. - P. 1446-1457.

53. Ben-Efraim I. Gradient of increasing affinity of importin beta for nucleoporins along the pathway of nuclear import / I. Ben-Efraim, L. Gerace // J. Cell Biol. 2001. - Vol. 152. - P.411-417.

54. Benson D.A. GenBank. / D.A. Benson, I.K. Clark, D.J. Lipman et al. // Nucleic Acids Res. -2010.-38 -P.46-51.

55. Berger E.A. Chemokine receptors as HIV-1 coreceptors: roles in viral entry, tropism, and disease / E.A. Berger, P.M. Murphy, J.M. Färber // Annu. Rev. Immunol. 1999. - Vol. 17. - P.657 - 700.

56. Biasco L. et al. Retroviral Integrations in Gene Therapy Trials. Molecular Therapy,2012/01/17/online-http://dx.doi.org/10.1038/mt.2011.289.

57. Boichuk S. Multiple DNA Damage Signaling and Repair Pathways Deregulated by Simian Virus 40 Large T Antigen / S. Boichuk, L.H. Jennifer, O.V. Gjoerup // J. Virol. 2010. - Vol. 84. - №16. - P.8007-8020.

58. Bouyac-Bertoia M. HIV-1 infection requires a functional integrase nls / M. Bouyac-Bertoia, J.D. Dvorin, R.A. Fouchier et al. // Mol. Cell. 2001. - №7. -P. 1025-3 5.

59. Brass A.L. Identification of host proteins required for HIV infection through a functional genomic screen / A.L. Brass, D.M. Dykxhoorn, Y. Benita, N. Yan et all. // Science. 2008. - Vol. 319 (5865). - P.921 - 926.

60. Bukrinskaya A. Establishment of a functional human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) reverse transcription complex involves the cytoskeleton / A. Bukrinskaya, B. Brichacek, A. Mann, M. Stevenson // J. Exp. Med. 1998 -№188. -P. 2113-25.

61. Bukrinsky M. A Hard Way to the Nucleus/ M. Bukrinsky //Mol Med. 2004,-№10(1-6).-P.l-5.

62. Bukrinsky M.I. A nuclear localization signal within HIV-1 matrix protein that governs infection of non-dividing cells / M.I. Bukrinsky, S. Haggerty, M.P. Dempsey et al. // Nature. 1993. - №365. - P.666-669.

63. Chabot S. Electrotransfer of RNAi-based Oligonucleotides for Oncology. / S. Chabot, S. Pelofy, A. Paganin-Gioanni et al. //Anticancer Research. 2011. -Vol. 31, №12. - P.4083 - 4089.

64. Chang T., Yee J.K. General principles of retrovirus vector design // Methods Enzymol. 2012. - № 507. - P. 1-14.

65. Cinkornpumin J.K. RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus / J.K. Cinkornpumin, R.L. Hong //J. Vis. Exp. 2011. - P.3791-3270.

66. Clifford A.L. The Role of Glycosphingolipids in HIV/AIDS / A.L. Clifford // Discovery Medicine. 2011. - Vol. 11(59). - P.303-313.

67. Coiras M. Understanding HIV-1 latency provides clues for the eradication of long-term reservoirs / M. Coiras, M.R. López-Huertas, M. Pérez-Olmeda, J. Alcami, // Nature Reviews Microbiology. 2009. - Vol. 7. - P.798-812.

68. Cooray S., Howe S.J., Thrasher A.J. Retrovirus and lentivirus vector design and methods of cell conditioning // Methods Enzymol. 2012. - № 507. -P. 29-57.

69. Crawford D.H. Viruses: A Very Short Introduction. Oxford: Oxford University Press, 2011. - 156 p.

70. Das A.T. Human immunodeficiency virus type 1 escapes from RNA interference-mediated inhibition. / A.T. Das, T.R. Brummelkamp, E.M. Westerhout et al. // J Virol. 2004 -№78(5). - P.2601-2605.

71. Davis M.E. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles /M.E. Davis, J.E.Zuckerman, C.H. Choi et all.// Nature. 2010. - Vol.464. - P. 1067-7107.

72. Dias A.S.P. Animal Models Used for the Evaluation of Antiretroviral Therapies. / A.S.P. Dias, M.J. Bester, R.F. Britz, Z. Apostolides // Current HIV Research. -2006 №4. - P.431-446.

73. Doyle A. Cell and tissue culture: laboratory procedures in biotechnology A. Doyle, J.B. Griffiths // Reprinted. 1999. - West Sussex. UK: John Wiley & Sons Ltd.-P.23.

74. Dragic T. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5/ T. Dragic, V. Litwin, G.P. Allaway et al. // Nature. 1996. -Vol. 381 - P.667 - 673.

75. Drozdzal P. Structure of an RNA/DNA dodecamer corresponding to the H3V-1 polypurine tract at 1.6 A resolution / P. Drozdzal, K. Michalska, R. Kierzek, L. Lomozik, M. Jaskolski // Acta Cryst. 2012. - №68. - 169-175.

76. Fackler O.T. Interactions of human retroviruses with the host cell cytoskeleton / O.T. Fackler, Hans-Georg Krausslich // Current Opinion in Microbiology. 2006 - Vol. 9. - P.409-415.

77. Fassati A. HIV infection of non-dividing cells: a divisive problem. / A. Fassati // Retrovirology. 2006. - P.74.

78. Fire A. RNA-triggered gene silencing // Trends in Genetics. 1999. -Vol. 15, №9.-P. 358-363.

79. Fouchier R.A. Interaction of the human immunodeficiency virus type 1 Vpr protein with the nuclear pore complex/ R.A. Fouchier et al. // J. Virol. 1998. -№72. - P.6004-6013.

80. Fu W. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI / W. Fu, E. Brigitte Sanders-Beer, S.K. Kenneth et al. // Nucl. Acids Res. 2009 - №37 - P.417^22.

81. Gallay P. HIV-1 infection of nondividing cells through the recognition of integrase by the importin/karyopherin pathway/ P. Gallay, T. Hope, D. Chin, D. Trono // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997 - №94 - P.9825-9830.

82. Gallo S.A. The HIV Env-mediated fusion reaction. / S.A. Gallo, C.M. Finnegan, M. Viard, Y. Raviv et al. // Biochim Biophys Acta. 2003. -№1614(1).-P.36-50.

83. Gartner S. The role of mononuclear phagocytes in HTLV-III/LAV infection/ S.Gartner, P. Markovits, D.M. Markovitz et al. //Science. 1986. -№233. -P.215-219.

84. Global HIV/AIDS response: epidemic update and health sector progress towards universal access: progress report 2011. Printed in Malta, World Health Organization: -2011. -225p.

85. Gonzalez-Scarano F. The neuropathogenesis of AIDS / F. Gonzalez-Scarano, J. Martin-Garcia// Nat Rev Immunol. 2005. - №5. P.69-81.

86. Gorina R. Astrocytes are very sensitive to develop innate immune responses to lipid-carried short interfering RNA./ R. Gorina, T. Santalucia, V. Petegnief, A. Ejarque-Ortiz // Glia. 2009. -№57 - P.93-107.

87. Han Q. Involvement of Activation of PKR in HBx-siRNA-Mediated Innate Immune Effects on HBV Inhibition/ Q. Han, C. Zhang, J. Zhang, Z. Tian // PLoS ONE. 2011. - № 6 (12). - P. 27931.

88. Handbook of molecular and cellular methods in biology and medicine / edited by Leland J. Cseke et al. CRC Press, LLC. - 2004. - 566p.

89. Hess R.D. Regulatory, biosafety and safety challenges for novel cells as substrates for human vaccines / R.D. Hess, F. Weber, K. Watson, S. Schmitt // Vaccine. 2012. - Vol. 30, № 17. - P. 2715-2727.

90. Hironori S. RNA viruses and mutations / S. Hironori, Y. Masaru // Virus. 2005. - Vol. 55, № 2. - P.221-229.

91. Hodge A.V., Field H.J. General Mechanisms of Antiviral Resistance // Genetics and Evolution of Infectious Disease / Edited by M. Tibayrenc. Montpellier: France Genetics and Infection of Infectious Diseases Laboratory, IRD Center, 2011. - P. 339-362.

92. Holz C.L. RNA interference against animal viruses: how morbilliviruses generate extended diversity to escape small interfering RNA control / C.L. Holz, E. Albina, C. Minet et al. // J Virol. -2012 №86(2) - P.786-95.

93. Hosseini I. Multi-Scale Modeling of HIV Infection in vitro and APOBEC3G-Based Anti-Retroviral Therapy / I. Hosseini, F. Mac Gabhann // PLoS Comput Biol 2012 - №8(2). - P. 1002.

94. Jäger S. Global landscape of HIV-human protein complexes / S. Jäger, P. Cimermancic, N. Gulbahce // Nature. -2011 №481(7381). - P.365-370.

95. Jäger S. Purification and characterization of HIV-human protein complexes / S. Jäger, N. Gulbahce, P. Cimermancic et al. // Methods. 2011. -№53(1). - P.13-19.

96. Joint United Nations Programme on HIV/AIDS, Global Report: UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. Geneva. - 2010. - 359p.

97. Jones P.L. Conformational changes in cell surface HIV-1 envelope glycoproteins are triggered by cooperation between cell surface CD4 and co-receptors / P.L. Jones, T. Körte, R. Blumenthal //J Biol Chem. 1998. -Vol. 273(1).-P.404-409.

98. Kariko K. Small Interfering RNAs Mediate Sequence-Independent Gene Suppression and Induce Immune Activation by Signaling through Toll-Like Receptor 31 / K. Kariko, P. Bhuyan, J. Capodici //The Journal of Immunology. 2004. -№172. -P.6545-6549.

99. Kitchen S.G. In Vivo Suppression of HIV by Antigen Specific T Cells Derived from Engineered Hematopoietic Stem Cells / S.G. Kitchen, B.R. Levin, G. Bristol, V. Rezek, S. Kim, et al. // PLoS Pathog. 2012. - № 8 (4). - P. el002649.

100. Klatt N.R. CD4+ T Cells and HIV: A Paradoxical Pas de Deux / N.R. Klatt, G. Silvestri //Sei. Transl. Med. 2012 - Vol. 4. - P. 123-124.

101. Kuy A.C. HIV infection and HERV expression: a review /A.C. Kuy // Retrovirology. 2012. - P.9-6.

102. Kwong P.D. Structure of an HIV gpl20 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody /P.D. Kwong, R. Wyatt, J. Robinson et al. //Nature. 1998. - Vol. 393 (6686). - P.648-659.

103. Kyungsook H. Comparative analysis of the interaction networks of HIV and Human proteins / H. Kyungsook, P. Byungkyu // Computational science, 7th international conference, Beijing. 2007. - P.339-346.

104. Leath A., Cornetta K. Developing novel lentiviral vectors into clinical products // Methods Enzymol. 2012. - № 507. - P. 89-108.

105. Lech P. Isolation and characterization of human cells resistant to retrovirus infection/ P. Lech, N.V. Somia // Retrovirology. 2007. - P.4-45.

106. Lee K. Flexible use of nuclear import pathways by HIV-1 / K. Lee, Z. Ambrose, T.D. Martin et al. // Cell Host Microbe. 2010. - №7. - P.221-233.

107. Lekas H.M. Challenges Facing Providers Caring for HIV/HCV-Coinfected Patients Qual / H.M. Lekas, K. Siegel, J. Leider // Health Res. 2011 P.221-233.

108. Li J.Z. Relationship between minority nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance mutations, adherence, and the risk of virologic failure / J.Z. Li, R. Paredes, H.J. Ribaudo et al. //AIDS. 2012. - Vol. 26. - P.185-192.

109. Li M. Virology: HIV goes nuclear / M. Li, R. Craigie // Nature. 2006. -Vol.1(441). - P.581-582.

110. Li Z. Efficient and high-throughput electroporation chips / Z. Li, Z. Wei, X. Li et al. // Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS). -5-9 June 2011. P. 1825-1828.

111. Lim R.Y. From the trap to the basket: getting to the bottom of the nuclear pore complex / R.Y. Lim, U. Aebi, D. Stoffler //Chromosoma. 2006 - № 115 -P. 15-26.

112. Limon A. Wild-type levels of nuclear localization and human immunodeficiency virus type 1 replication in the absence of the central DNA flap / A. Limon, N. Nakajima, R. Lu et al. // J. Virol. 2002. - №76. - P. 12078-12086.

113. Lingwood D. Lipid rafts as a membrane-organizing principle / D. Lingwood, K. Simons // Science.-2010. Vol. 327 (5961). - P.46-50.

114. Liu Y.P. Combinatorial RNAi Against HIV-1 Using Extended Short Hairpin RNAs / Y.P. Liu, J.E. Karin, C.T. Schopman et al. // Molecular Therapy. -2009. Vol. 17( 10). - P. 1712-1723.

115. Logue E.C. The Cargo-Binding Domain of Transportin 3 Is Required for Lentivirus Nuclear Import / E.C. Logue, K.T. Taylor, H.P. Goff et al. // J. Virol.2011. Vol. 85. - №24. - P.12950-12961.

116. Long B.R. Alpha Interferon and HIV Infection Cause Activation of Human T Cells in NSG-BLT Mice/ B.R. Long, C.A. Stoddart //J. Virol. 2012. -Vol.86. - №6. - P.3327 - 3336.

117. Low J.T. SHAPE-directed Discovery of Potent shRNA Inhibitors of HIV-1. / J.T. Low, S.A. Knoepfel, J.M. Watts et al. // Molecular Therapy, 7 February2012,- doi: 10.103 8/mt.2011.299

118. Ma Y. RNA interference and antiviral therapy / Y. Ma, C.Y. Chan, M.L. He // World Journal of Gastroenterology. 2007. -Vol. 13 (39). - P.5169-5179.

119. Macara I.G. Transport into and out of the nucleus / I.G. Macara // MicrobiolMolBiol Rev. 2001. - №65. - P.570-594.

120. Maier P. Retroviral Vectors for Gene Therapy: Lentiviral Vectors / P. K. Maier, L.S. Christof// Future Microbiology. 2010. - Vol.5 (10). - P.1507-1523.

121. Mangeat B. Broad antiretroviral defense by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts/ B.Mangeat et al. //Nature. 2003. -№424. - P.99-103.

122. Marathe J.G. Is gene therapy a good therapeutic approach for HIV-positive patients? / J.G. Marathe, D.P. Wooley // Genet Vaccines Ther. 2007.- №5. P.5.

123. Margus H. Cell-penetrating Peptides as Versatile Vehicles for Oligonucleotide Delivery/ H. Margus, K. Padari, M. Pooga //Molecular Therapy. -2012. -doi: 10.1038/mt.2011.284.

124. Marty S.C. Rapid Screening of Antiretroviral Combinations / S.C. Marty, K.N. Pennington, J. Rooney, D.W. Barry // Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Relrovirology. 1995. - 10 (Suppl. 1):S24 S27.

125. Mastrobattista E. Polymers for gene delivery: Charged for success. / E. Mastrobattista, W.E. Hennink //Nature Materials. 2012. - Vol. 11. - P. 10-12.

126. Mattaj I.W. Nucleocytoplasmic transport: the soluble phase / I.W. Mattaj, L. Englmeier // Annu Rev Biochem. 1998.-№67. - P.265-306.

127. McDonald D. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells / D. McDonald, M.A.Vodicka, G. Lucero et al. // J. Cell Biol. 2002. - № 159.- P.441-452.

128. Medina G.N. Sprouty 2 Binds ESCRT-II Factor Eap20 and Facilitates HIV-1 Gag Release. / G.N. Medina, L.S. Ehrlich, M.H. Chen et al. // J. Virol. 2011.- Vol.85, №14. P.7353-7362.

129. Mehandru S. Primary H3V-1 infection is associated with preferential depletion of CD4+ T lymphocytes from effector sites in the gastrointestinal tract. / S. Mehandru, M.A. Poles, K. Tenner-Racz, et al. //J Exp Med. 2004.- №200. -P.761-770.

130. Miller M.D. Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition/ M.D. Miller, C.M. Farnet, F.D. Bushman // J. Virol. 1997. -№71. P.5382-5390.

131. Milloy M.J. Dose-response Effect of Incarceration Events on Nonadherence to HIV Antiretroviral Therapy Among Injection Drug Users / M.J. Milloy, T. Kerr, J. Buxton et al. // J. Infect. Dis. 2011. - Vol. 203 (9). -P.1215-1221.

132. Molloy S. HIV: Successful protection / S. Molloy // Nature Reviews Microbiology. 2012. - Vol.10. -P.82.

133. Moore J.P. New targets for inhibitors of HIV-1 replication / J.P. Moore, M. Stevenson // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2000. - Vol.1. - P.40^19.

134. Murashov A.K. RNAi pathway is functional in peripheral nerve axons /

135. A.K. Murashov, V. Chintalgattu, R.R. Islamov, et al. // The FASEB Journal. 2007. - Vol. 21. - №3. - P.656-670.

136. Murphy B. FIV establishes a latent infection in feline peripheral blood CD4+ T lymphocytes in vivo during the asymptomatic phase of infection /

137. B. Murphy, N. Vapniarsky, C. Hillman et al. // Retrovirology. 2012. - № 9. - P. 12.

138. Myhr A.I., Traavik T. Genetically Engineered Virus-Vectored Vaccines -Environmental Risk Assessment and Management Challenges // Genetic Engineering

139. Basics, New Applications and Responsibilities / edited by H.A. Barrera-Salda. Tromso: University of Tromso, 2012. - P. 199 - 224.

140. Nadler S.G. Differential expression and sequence-specific interaction of karyopherin alpha with nuclear localization sequences / S.G. Nadler, D. Tritschler, O.K. Haffar et al. // J. Biol. Chem. Vol. 2011. - P.357-367.

141. Naldini L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. / L. Naldini, U. Blomer, P. Gallay et al. // Science. -1996.-№272.-P. 263-267.

142. Neff C.P. An Aptamer-siRNA Chimera Suppresses HIV-1 Viral Loads and Protects from Helper CD4+ T Cell Decline in Humanized Mice/ C.P. Neff, J. Zhou, L. Remling et al. // Science Translational Medicine. 2011. -Vol. 3. - P.66.

143. Nick S. Deep sequencing of virus-infected cells reveals HIV-encoded small RNAs / S. Nick, W. Marcel, P.L. Ying et al. // Nucl. Acids Res. 2012. -№ 40 (1).-P.414-427.

144. Patience C. Packaging of Endogenous Retroviral Sequences in Retroviral Vectors Produced by Murine and Human Packaging Cells / C. Patience, Y. Takeuchi, F.L. Cosset et al. //J. Virol. 1998. - Vol. 72, №4. - P. 2671-2676.

145. Philipp S. (2010) The Polycomb group protein EED couples TNF receptor 1 to neutral sphingomyelinase / S. Philipp, M. Puchert, S. Adam-Klages et al. // PNAS.-2010.-Vol. 107, №3.-P. 1112-1117.

146. Rambaut A. The causes and consequences of HIV evolution / A. Rambaut, D. Posada, K.A. Crandall et al. // Nature Reviews Genetics. 2004. -Vol.5.-P.52-61.

147. Reil H. Efficient HIV-1 replication can occur in the absence of the viral matrix protein/ H. Reil, A.A. Bukovsky, H.R. Gelderblom //EMBO J. -1998. №17. - P.2699-2708.

148. Rerks-Ngarm S. Vaccination with ALVAC and AIDS VAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N Engl / S. Rerks-Ngarm, P. Pitisuttihum, S. Nitayaphan et al. // J Med. 2009. -Vol. 361(23). -P 2209-2220.

149. Ribbeck K. The permeability barrier of nuclear pore complexes appears to operate via hydrophobic exclusion / K. Ribbeck, D. Gorlich // EMBO J. 2002. -Vol.21.-P.2664-2671.

150. Rizvanov A.A. RNA interference and amyotrophic lateral sclerosis / A.A. Rizvanov, S. Gulluoglu, M.E. Yalva?, A. Palotas, R.R. Islamov // Curr. Drug. Metab. 2011. - № 12 (7). - P.679 - 683.

151. Ross A.J. Factors that positively influence adherence to antiretroviral therapy by HIV and/or AIDS patients and their caregivers. Afr / A.J. Ross, M. Aung, L. Campbell, G.A.Ogunbanjo //J Prm Health Care Fam Med. 2011.-Vol. 3(1). -P. 196-201.

152. Rossi J.J. Genetic therapies against HIV/ J.J. Rossi C.H. June, D.B. Kohn // Nature Biotechnology. -2007. Vol.5. - P. 12.

153. Sadelain M. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome/ M. Sadelain, E.P. Papapetrou, D.F. Bushman, //Nature Reviews Cancer. -2012.-Vol. 12. P.51- 58.

154. Salahuddin S.Z. Human T lymphotropic virus type III infection of human alveolar macrophages/ S.Z. Salahuddin, R.M. Rose, J.E. Groopman et al. // Blood. -1986. -№68-P.281-284.

155. Sayers E.W. Database resources of the National Center for Biotechnology Information / E.W. Sayers, T. Barrett, D.A. Benson et al. // Nucl. Acids Res. 2012-Vol. 40. -P. 13-25.

156. Scaramuzza S.B. Preclinical Safety and Efficacy of Human CD34+ Cells Transduced With Lentiviral Vector for the Treatment of Wiskott-Aldrich Syndrome /

157. S.B. Scaramuzza, A. Ripamonti, M.C. Castiello et al. // Molecular Therapy. 2012. -doi: 10.103 8/mt.2012.23.

158. Schopman N. Directed HIV-1 Evolution of Protease Inhibitor Resistance by Second-Generation Short Hairpin RNAs. Agents/ N. Schopman, A.B. Berkhout //Chemother. 2012. - Vol. 56. - №1. - P.479-486.

159. Sebastian L. Value for Money in Donor HIV Funding/ L. Sebastian W.R.Gery, L. Jenny, P. Kartika //RAND Health Quarterly. -2012. -Vol. 1 (4). -P.2.

160. Shah P.S. HIV Develops Indirect Cross-resistance to Combinatorial RNAi Targeting Two Distinct and Spatially Distant Sites / P.S. Shah, N.P. Pham, D.V. Schaffer //Mol Ther. -2012 .-doi: 10.1038/mt.2012.3.

161. Shah V.B. HIV Nuclear Entry: Clearing the Fog / V.B. Shah, C. Aiken // Viruses. 2010. -№2(5): -P. 1190-1194.

162. Simon V. HIV-1 dynamics in vivo: implications for therapy / V. Simon, D.D. Ho // Nature Reviews Microbiology. -2003. -Vol. 1.-181-190.

163. Sodeik B. Microtubule-mediated transport of incoming herpes simplex virus 1 capsids to the nucleus / B. Sodeik, M.W. Ebersold, A. Helenius // J. Cell Biol. -1997.-Vol. 136.-P.1007- 1021.

164. Soejitno A. The therapeutic potential of RNA interference in controlling HIV-1 replication / A. Soejitno D.M., Wihandani, T. Kuswardhani // Acta Med. Indones. -2009. -№41(4) -P.215-221.

165. Stevenson M. Dissecting ШУ-1 through RNA interference / M. Stevenson // Nature Reviews Immunology. 2003. -Vol. 3. -P. 851-858.

166. Thakur N. VIRsiRNAdb: a curated database of experimentally validated viral siRNA/shRNA./ N. Thakur, A. Qureshi, M. Kumar // Nucl. Acids Res. 2012. -Vol.40. -P. 230-236.

167. Tremblay M.J. HIV-1 and pattern-recognition receptors: a marriage of convenience / M.J. Tremblay // Nature Immunology. -2010. -Vol. 11. -P.363-365.

168. Ugolini S. HIV-1 attachment: another look / S.Ugolini, I. Mondor, Q.J. Sattentau //Trends Microbiol. -1999. -Vol. 7 (4). P. 144 - 149.

169. Vidal 2011. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. АстраФармСервис, - 2010. - 1728 с.

170. Walkup J.T. Bipolar Medication Use and Adherence to Antiretroviral Therapy Among Patients With HIV-AIDS and Bipolar Disorder. / J.T. Walkup,

171. A. Akincigil, S. Chakravarty et al. //Psychiatric Services. -2011. -Vol. 62. -P.3.

172. Wang B. Cationic liposomes as carriers for gene delivery: Physico-chemical characterization and mechanism of cell transfection. / B. Wang, J. Zhou, S. Cui et al. //African Journal of Biotechnology 2012 - Vol. 11 (11) - P.2763 -2773.

173. Waninger S. Identification of Cellular Cofactors for Human Immunodeficiency Virus Replication via a Ribozyme-Based Genomics Approach / S.Waninger, K. Kuhen, X. Hu, J.E. Chatterton // J Virol. -2004. -78(23). P. 1282912837.

174. Weinberg J.B. Productive human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection of nonproliferating human monocytes / J.B. Weinberg, T.J. Matthews,

175. B.R. Cullen, M.H. Malim //J Exp Med. -1991.- 174. -P. 1477-1482.

176. Westerhout E.M. HIV-1 can escape from RNA interference by evolving an alternative structure in its RNA genome / E.M. Westerhout, M. Ooms, M.Vink, A.T. Das, B. Berkhout // Nucleic Acids Res. -2005. -№33(2). -P.796-804.

177. Wyl V. Incidence of HIV-1 Drug Resistance Among Antiretroviral Treatment-Naive Individuals Starting Modern Therapy Combinations / V. Wyl, S. Yerly, S. Boni et al. // Clin Infect Dis. -2012.-№54 (1). P.131-140.

178. Yoshii H. CD4-Independent Human Immunodeficiency Virus Infection Involves Participation of Endocytosis and Cathepsin/ H. Yoshii, H. Kamiyama, K. Goto et al. //PLoS ONE-2011. -№6(4) doi:10.1371/journal.pone.0019352.

179. Zhanga Z. The immunostimulatory activity of CpG oligonucleotides on microglial N9 cells is affected by a polyguanosine motif / Z. Zhanga, K. Guob, H.J. Schluesenera // Journal of Neuroimmunology. -2005.-№161. -P.68-77.

180. Zhong Yu. HIV-1 Tat Triggers Nuclear Localization of ZO-1 via Rho Signaling and cAMP Response Element-Binding Protein Activation / Yu Zhong,

181. B. Zhang, S.Y.Eum, M.Toborek // The Journal of Neuroscience. -2012. -№32(1). -P.143-150.

182. Zhou J. Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice/ J. Zhou,

183. C.P. Neff, X. Liu et al. // Mol. Ther. 2011. -Vol. 19(12). -P.2228-2238.

184. Zhou J. Current progress in the development of RNAi-based therapeutics for HIV-1. / J. Zhou, J.J. Rossi // Gene Therapy. 2011. - № 18. - P. 1134-1138.

Информация о работе

Головин, Евгений Владимирович
кандидата медицинских наук
Казань, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

РНК-интерференция в клетках человека, инфицированных рекомбинантным лентивирусом in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы